CN116200343A - 一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程改造干细胞的技术领域，具体涉及一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和用途。所述骨髓间充质干细胞特异性表达TH和DDC以及GCH1基因，所述TH、DDC以及GCH1基因的NCBI登录号依次为NM_199292、NM_001082971和NM_001024024。本发明提供的骨髓间充质干细胞在帕金森大鼠脑微环境中可长期存活，可显著上调脑移植区域和血清中的多巴胺和5‑羟色胺水平，并对大鼠运动功能障碍具有明显的修复效应，为用干细胞移植治疗如帕金森病和阿尔茨海默症等神经退行性疾病奠定了基础。

Description

一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及基因工程改造干细胞的技术领域，具体涉及一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞及其制备方法和用途。
背景技术
帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一类重要的中枢神经系统退行性疾病，因脑中路易小体的聚集引起中脑黑质-纹状体通路的多巴胺能神经元变性大量死亡，导致脑内多巴胺(Dopamine，DA)神经递质释放的下降而引起的一系列神经功能障碍，现已成为神经系统疾病治疗的热点之一。目前，临床上以左旋多巴(L-DOPA)为代表的常规药物治疗手段，或辅以多巴胺受体激动剂，多是通过补充左旋多巴在剩余的多巴胺神经元中生成多巴胺发挥作用。然而，这类以消耗剩余的多巴胺神经元的治疗方式只能在一定时间内延缓症状，不能彻底治愈病症，且后期副作用大。而手术治疗的神经核毁损术(针对间接通路亢奋，丘脑底核或苍白球内侧投射纤维)和脑深部电刺激术(丘脑底核或苍白球)虽能缓解症状，但无法使受损的神经元再生，也就无法从根本上上治疗PD。作为PD治疗研究方向之一的细胞移植治疗，主要是通过移植干细胞或者干细胞来源的神经前体细胞替代凋亡的多巴胺能神经元以恢复神经传递发挥功能，同时保护剩余的DA神经元，已成为治疗PD的重要途径。
随着PD致病机制深入研究，通过基因治疗重建缺失的多巴胺神经元并提升DA的合成功能来根治PD成为可能。作为脑内重要神经递质的多巴胺，其合成主要由酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、多巴胺脱羧酶(dopamine decarboxylase，DDC)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GTP cyclihydrolase l，GCH1)这3种限速酶所调控。多巴胺神经元内的TH在四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)辅助因子的作用下催化脑内的游离L-酪氨酸转化为左旋多巴，左旋多巴又可被DDC催化为神经递质多巴胺释放到体内，而辅助因子BH4是由GTP经GCH1催化生成的。因此，过表达TH、DDC、GCH1这3种DA合成的关键酶被认为能增加DA递质的合成，而且携带人TH、DDC和GCH1基因的腺病毒对帕金森动物模型和临床患者均取得明显的治疗效果。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有低免疫排斥反应，无畸胎瘤和伦理问题，易于获取等优点，并且MSCs还具有旁分泌作用和抗凋亡作用，能够释放细胞因子，改善周围微环境，迁移到损伤区域并参与修复能力，因此，MSCs已成为干细胞治疗帕金森病的热点细胞之一。然而，MSCs虽然具有分化为神经细胞的能力，却无法大量定向分化为能够合成和分泌DA的多巴胺神经元，并在体内发挥功能。通过基因治疗联合MSCs，获得大量稳定合成和分泌DA的MSCs细胞，可能从根本上治疗PD产生积极疗效。
发明内容
鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞，所述骨髓间充质干细胞特异性表达TH和DDC以及GCH1基因。
进一步的，所述TH和DDC以及GCH1基因的NCBI登录号依次为NM_199292、NM_001082971和NM_001024024。
更进一步的，所述骨髓间充质干细胞选自大鼠骨髓间充质干细胞。
第二方面，本发明提供所述骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1、分别构建携带有TH基因的重组慢病毒载体LV-TH-mCherry、携带有DDC和GCH1的重组慢病毒载体LV-DDC-GCH1-ZsGreen；
S2、将所述慢病毒载体分别联合病毒包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞，获得重组慢病毒LV-TH和LV-DDC-GCH1；
S3、利用构建的重组慢病毒对骨髓间充质干细胞进行转染改造，获得所述骨髓间充质干细胞。
进一步的，所述携带有TH基因的重组慢病毒载体是将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-mCherry-T2A-puro的EcoR I和BamH I之间的DNA小分子替换成所述TH基因获得；
所述携带有DDC和GCH1的重组慢病毒载体是将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-EF1-ZsGreen-P2A-BSD的Xho I和BamH I之间的DNA小分子替换成融合基因获得，所述融合基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
更进一步的，所述转染是在6μg/mL助转剂Polybrene的作用下，将LV-TH和LV-DDC-GCH1感染骨髓间充质干细胞，所述LV-TH和LV-DDC-GCH1的感染复数分别为7.5和5.0。
第三方面，本发明提供所述骨髓间充质干细胞所述骨髓间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
进一步的，所述神经退行性疾病是由脑中神经元缺失引发。
更进一步的，所述神经退行性疾病为帕金森病。
第四方面，本发明提供所述骨髓间充质干细胞在制备治疗神经紊乱的药物中的用途，所述神经紊乱是由5-羟色胺水平降低引起。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明成功构建了一种能稳定高效合成DA递质的BMSCs细胞系，该细胞系不仅具有普通BMSCs的特征，如分化为神经元，分泌细胞因子，改善局部微环境的作用，向受损部位迁移参与修复作用等功能，还具有稳定合成和分泌多巴胺神经递质的能力。
2、本发明提供的构建稳定合成DA递质的BMSCs细胞系的方法，为神经元损伤缺失后的补充来源提供了保障，获得的细胞系可用于治疗帕金森病效应的评价。
3、本发明通过脑切片HE染色、免疫组化法检测酪氨酸羟化酶表达，有效验证了移植的DA-BMSCs在宿主脑内存活、迁移和分化；使用阿扑吗啡(APO)诱导旋转实验、旷场实验、和疲劳转棒实验，有效表明移植的DA-BMSCs对帕金森病大鼠具有显著疗效。通过ELISA检测了移植区域的炎症因子，有效证明了BMSCs参与炎症修复效应；HPLC检测表明移植的DA-BMSCs显著上调脑移植区域和血清中的DA和5-羟色胺(5-HT)水平。帕金森病大鼠体内的利用本发明提供的方法得到的神经前体细胞在帕金森大鼠脑微环境中可长期存活，并对大鼠运动功能障碍具有明显的修复效应，为用干细胞移植治疗如帕金森病和阿尔茨海默症等神经退行性疾病奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例中过表达TH慢病毒载体构建示意图；CMV promoter：CMV启动子；EcoRI:EcoRI限制性内切酶识别序列；LV-h-TH:h-TH基因序列；BamHI:BamHI限制性内切酶识别序列；3xFLAG：3xFLAG标签序列；EF1promoter：EF1启动子；mCherry：mCherry荧光基因序列；T2A:T2A自剪切多肽基因序列PuroR:嘌呤霉素耐药基因序列；WRPE:转录后调控元件；3’dLTR：3’长末端重复序列；SV40 poly(A)signal:SV40 poly(A)signal加尾信号序列；ori：ori的复制区序列；AmpR:氨苄抗性基因序列；AmpR promoter:AmpR启动子；5’dLTR：5’长末端重复序列HIV-1Ψ:HIV长末端重复序列；RRE:RRE元件。
图2为本实验实施例中过表达DDC和GCH1慢病毒载体构建示意图；CMV promoter：CMV启动子；XhoI:XhoI限制性内切酶识别序列；LV-h-DDC-T2A-GCH1:LV-h-DDC-T2A-GCH1基因序列；T2A:T2A自剪切多肽基因序列；BamHI:BamHI限制性内切酶识别序列；3xFLAG：3xFLAG标签序列；EF1promoter：EF1启动子；ZsGreen：ZsGreen荧光基因序列；P2A:P2A自剪切多肽基因序列；Blast:灭瘟素耐药基因序列；WRPE:转录后调控元件；3’dLTR：3’长末端重复序列；SV40 poly(A)signal:SV40 poly(A)signal加尾信号序列；ori：ori的复制区序列；AmpR:氨苄抗性基因序列；AmpR promoter:AmpR启动子；5’dLTR：5’长末端重复序列HIV-1Ψ:HIV长末端重复序列；RRE:RRE元件。
图3为构建的慢病毒载体的琼脂糖凝胶电泳图；左图为构建的过表达DDC和GCH1慢病毒载体和对应空载病毒载体，右图为构建的过表达TH基因慢病毒载体和对应空载病毒载体。
图4为构建稳定表达DA递质的BMSCs细胞系的时间流程图。
图5为BMSCs的分离培养和标志物鉴定；A1为原代培养的BMSCs；A2为培养的第三代BMSCs；A3为培养的第六代BMSCs(A1-A3为100×明场细胞形态)；A4为第四代BMSCs形成的克隆团结晶紫染色(200×)；B为流式细胞术检测BMSCs表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90以及造血谱系细胞标志物CD34和CD45；C为RT-PCR检测BMSCs表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、S100A4和COL1A1，造血谱系细胞标志物CD34和CD45以及上皮细胞标志物CDH1和MUC1；D为免疫荧光检测BMSCs表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90，干细胞标志物SOX2和OCT4，以及造血谱系细胞标志物CD34和CD45。
图6为经抗生素筛选后的双慢病毒感染的BMSCs；A为BMSCs表达慢病毒携带的红色荧光蛋白图；B为BMSCs表达慢病毒携带的绿色荧光蛋白图；C为DAPI标记细胞核；D为前三图的叠加。
图7为经慢病毒感染后的BMSCs中TH，DDC和GCH1的表达情况；A为Westernblotting检测感染细胞的TH，DDC和GCH1蛋白表达情况；B为RT-PCR检测感染细胞的TH，DDC和GCH1基因表达情况；C为RT-qPCR检测感染细胞的TH，DDC和GCH1基因相对表达情况。
图8为感染细胞的培养上清液DA水平检测；A为ELISA法检测感染细胞培养上清液DA水平；B为HPLC法检测感染细胞培养上清液DA水平。
图9为DA-BMSCs立体定位移植PD大鼠和行为学检测；A为矢状面和冠状面的细胞移植的两个位点坐标图(①AP-4.4mm，ML-1.2mm，DV-7.8mm；②AP-4.0mm，ML-0.8mm，DV-8.0mm)；B为大鼠固定于脑立体定位仪进行脑定位损伤或移植；C为移植大鼠疲劳转棒试验；D为移植大鼠APO-诱导旋转试验；E为旷场实验。
图10为各组大鼠行为学检测统计图；A为APO-诱导旋转试验统计图；B为旷场实验统计图；C为疲劳转棒试验统计图。
图11为在宿主移植区域检测DA-BMSCs分化能力的免疫荧光图(200×)；第一列和第二列分别为DA-BMSCs中mCherry、ZsGreen的荧光；第一排为移植物中的TH(多巴胺能神经元标志物)表达情况；第二排为移植物中的GABA(γ氨基丁酸能神经元标志物)表达情况；第三排为移植物中的GFAP(星形胶质细胞标志物)表达情况；第四排为移植物中的PSD95(谷氨酸能神经元标志物)表达情况。
图12为移植细胞在宿主脑内迁移以及突触联系的检测；A为移植细胞在移植4周(200×)和8周(100×)时的迁移情况(白色虚线为迁移方向)；B为移植细胞的Synapsin(突触蛋白标志物)表达情况，并与周围的宿主细胞发生突触联系(第一排为100×荧光染色细胞形态；第二排为第一排的放大图，200×荧光染色细胞形态)，白色箭头所指的方向为移植细胞迁移到周围区域，分化为神经元样细胞，并与周围宿主细胞或移植细胞发生突触联系。
图13为移植8周后，脑移植区域的炎症因子检测；从左到右分别为ELISA检测的脑移植区域的抗炎因子IL-10，促炎因子IL-6和TNF-α水平的统计图；
图14为移植8周后，分别在脑移植区域和血浆中DA和5-HT水平；A为HPLC检测脑移植区域和血浆中的DA水平统计图；B为HPLC检测脑移植区域和血浆中的5-HT水平统计图；C为DA和5-HT的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中涉及的慢病毒载体信息：
pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-mCherry-T2A-Puro，商品货号：LV006，购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
pHBLV-CMV-EF1-ZsGreen-P2A-BSD，商品货号：LV-060，购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
实施例1：过表达TH基因的慢病毒和过表达DDC和GCH1基因的慢病毒的构建
参考NCBI基因库中的人源的酪氨酸羟化酶TH的全长RNA序列(Gene ID:NM_199292)，全序列长度为1587bp，将编码TH的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)插入到慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-mCherry-T2A-puro的CMV启动子之后，构建好的载体pHBLV-CMV-TH-3flag-EF1-mCherry-T2A-puro(LV-TH)，如图1所示。
参考NCBI基因库中的人源的多巴胺脱羧酶(DDC)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)的全长RNA序列(Gene ID:NM_001082971和NM_001024024)，将编码DDC(1443bp)的核苷酸序列的尾端通过T2A(60bp)与GCH1(753bp)的编码核苷酸序列相连，构成h-DDC-T2A-GCH1融合基因，该融合基因全序列长度为2319bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将该序列插入pHBLV-CMV-EF1-ZsGreen-P2A-BSD的CMV启动子之后，构建好的载体pHBLV-CMV-DDC-T2A-GCH1-3xflag-ZsGreen-P2A-BSD(LV-DDC-GCH1)，如图2所示。
慢病毒构建流程分为两个阶段：
第一阶段是慢病毒载体的构建：确定目的基因序列信息；表达载体酶切后进行琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；引物设计；PCR扩增目的片段；目的基因与载体片段同源重组后转化DH5ɑ感受态细胞；用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序；测序无误的克隆进行质粒抽提。
第二阶段是慢病毒的包装：慢病毒包装、浓缩纯化和滴度检测。
第一阶段所用到的主要试剂与仪器设备见表1和表2。
表1实验试剂
Figure BDA0004105510210000091
表2实验仪器
Figure BDA0004105510210000092
具体构建流程如下：
1、根据NCBI的基因数据库，确定目的基因序列信息。
2、用相应的限制性内切酶对工具载体上的酶切位点进行酶切，酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；
表3载体酶体系
Figure BDA0004105510210000101
注：限制性内切酶使用的量及酶切的时间可根据酶活性进行调整；若是单酶切，则进行相应体系的调整。
3、设计引物用于扩增h-TH的序列，引物序列设计如下：
h-TH-E/B-F(SEQ ID NO.3)：TAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGCCCACCCCCGACGC；
h-TH-R(SEQ ID NO.4)：CTTAAGCTTGGTACCGAGGATCCGCCAATG GCACTCAGCGCATGGGC；
设计引物用于扩增h-DDC-T2A-GCH1的序列，扩增的模板为人工合成的h-DDC-T2A-GCH1核苷酸序列，引物设计如下：
h-DDC-T2A-GCH1-X/B-F(SEQ ID NO.5)：GATCTATTTCCGGTGAATTCCTCGAGGCCACCATGAACGCAAGTGAATT；
h-DDC-T2A-GCH1-X/B-R(SEQ ID NO.6)：GAATTCGAAGCTTGTCCGGATCCTTATTTGTCGTCATCATCCTTATAGT。
4、PCR扩增目的片段配制片段PCR扩增体系，轻轻混匀，置于PCR仪中进行反应；
表4PCR扩增体系
Figure BDA0004105510210000111
表5反应程序
Figure BDA0004105510210000112
注：1)退火温度为引物Tm值，退火温度直接决定扩增特异性；2)如果发现扩增特异性差，可适当提高退火温度，每次+2℃；2)适当延长延伸时间有助于提高扩增产量。
5、将扩增的目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA片段，并与回收的线性化载体进行重组连接反应，使用HB infusionTM一步克隆连接体系，于冰水浴中配制反应体系，连接反应液在50℃反应30min后，置于冰上5min，立即转化。
表6连接反应体系
Figure BDA0004105510210000121
注：1)建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02～0.5pmols(一般使用时，加入的片段量在100-150ng，载体量在50-100ng)，4～6片段连接时加入的DNA总量为0.2～1.0pmols。DNA拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低。
取一支感受态细胞(每管50μL，-80℃保存)于冰上，待溶解后加入5μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒(这个时间非常严格)；热激完快速将管转移至冰浴中冰浴2-3min；每管加入500μL无抗的LB培养基，轻柔上下颠倒3-5次，置于37℃摇床230rpm震荡60min；取适量菌液均匀涂于含有相应抗生素的固体平板上，倒置平板37℃恒温培养箱培养16h。
7、挑取平板上的菌落重悬于10μL LB培养基，取1μL做为模板进行菌落PCR鉴定。
表7PCR反应体系
Figure BDA0004105510210000122
Figure BDA0004105510210000131
表8PCR反应程序
Figure BDA0004105510210000132
8、将筛选出来的阳性克隆，选择两个克隆进行测序，测序结果与预期的目的基因序列一致，表明该目的质粒构建成功。安排菌液扩增，进行质粒抽提纯化(图3)。
第二阶段所需的实验材料和仪器
实验材料：293T细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)，大肠杆菌菌株DH5-α，三质粒系统：pSPAX2(病毒包装辅助质粒)、pMD2G(病毒包装辅助质粒)和穿梭质粒(上述构建的慢病毒载体)。
表9实验试剂
Figure BDA0004105510210000133
表10实验仪器
Figure BDA0004105510210000141
具体包装流程如下：
提前准备好用于转染的293T细胞，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养，当细胞密度达70-80％进行转染，配制脂质体转染complex，，混匀后在室温静置15min后缓慢滴加至293T细胞中，继续培养箱培养，16h更换新鲜培养基。转染后48h和72h分别收集两次病毒上清(48h收集后置换新鲜完全培养基)。将收集的病毒上清，4℃，2000×g，离心10min，收集上清，再次置于超速离心管中，4℃，82700×g，离心120min，完全培养基重悬沉淀，最后将超离重悬液分装到灭菌处理的病毒管中，-80℃冰箱保存。
表11脂质体转染complex反应体系
Figure BDA0004105510210000142
获得的病毒液进行滴度检测，采用稀释计数测定法，将293T细胞稀释至1×105/mL,加入96孔板培养，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。第三天，先吸去含病毒培养基，加入100μL含1.5μg/mL puromycin或1μg/mL Blasticidin的10％FBS完全培养基筛选两天。第五天，吸取80μL培养基，加入80μL新鲜培养基继续培养，6h后荧光显微镜下计算病毒滴度。滴度(TU/mL)＝细胞数×阳性克隆百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103TU/mL，测定LV-TH的滴度为1×108TU/mL，LV-DDC-GCH1的滴度为1×108TU/mL。
实施例2：稳定合成多巴胺递质的骨髓间充质干细胞系的构建
本发明所述的通过基因改造大鼠BMSCs的方法得到的稳定合成DA递质的BMSCs细胞系是临床级别的，可用于临床研究及未来的临床治疗，整个构建过程如图4所示。
骨髓间充质干细的DF-12培养基组成为：基础培养基DMEM：F12(Gibco)+10％胎牛血清(FBS，Gibco)+1％ L-谷氨酰胺(Glutamax，Gibco)+1％非必需氨基酸(NEAA，Gibco)+20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(FGF2，R&D)+1％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin Solution,Gibco)，百分比为体积百分比。
高纯度的稳定合成DA递质的BMSCs细胞系的制备过程分为三部分：
1、大鼠原代BMSCs培养
颈椎脱臼法处死4周龄大小的SD大鼠，完整剥离大鼠股骨和胫骨，经PBS清洗去除碎骨和碎肉后，剪去两端软骨，5mL注射器吸取DF-12培养基从骨中缓慢冲洗出细胞悬液，直至骨腔发白。细胞悬液经200目筛网过滤后转入T25培养瓶中，置于37℃，5％ CO2的培养箱中贴壁培养。
2、慢病毒感染BMSCs
采用半量体积感染法进行感染。将培养至P3-P4代的大鼠BMSCs作为被感染细胞，将生长状态良好的待感染的BMSCs以5×104接种于24孔板，保证第二天感染时细胞汇合率为40-50％。感染前从冰箱取出病毒在冰上慢慢融化，在添加有6μg/mL助转剂聚凝胺的DF-12培养基，加入LV-TH(感染复数MOI:7.5)和LV-DDC-GCH1(感染复数MOI:5.0)的过表达慢病毒，吸去旧培养基，加入半量培养体积的含慢病毒培养基感染4h，然后补足培养基至培养体积继续培养，感染24小时后吸去含慢病毒培养基，换新鲜培养基继续培养2天。
3、抗生素筛选慢病毒感染的BMSCs
将上述细胞在含有2μg/mL的嘌呤霉素(PURO)的DF-12培养基进行筛选培养2天，换成1μg/mL的嘌呤霉素(PURO)的DF-12培养基继续筛选培养2天，随后换成新鲜DF-12培养基稳定培养3天。接着继续在含有1.5μg/mL的灭瘟素(BSD)的DF-12培养基进行筛选培养2天，在0.75μg/mL的灭瘟素(BSD)的DF-12培养基进行筛选培养2天，最后在新鲜DF-12培养基稳定培养3天，即可获得纯化的稳定合成DA递质的BMSCs细胞系。
原代培养的BMSCs经过一夜贴壁培养，粘附于培养瓶底部，将未粘附的骨髓造血系统细胞洗去，贴壁细胞呈成纤维细胞样的短梭形或者双极状，部分呈旋涡状(图5A1)，旁边还残存一些其他细胞。经过连续传代，可获得纯化的BMSCs(图5A2，图5A3)，具有较强的克隆团形成能力(图5A4)。
流式细胞术，免疫荧光和RT-PCR检测表明(图5B-5D)，培养的细胞显著表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90，而不表达造血谱系细胞标志物CD34和CD45。同时细胞还表达干细胞标志物SOX2和OCT4，间充质干细胞标志物S100A4和COL1A1，不表达上皮细胞标志物CDH1和MUC1，证实分离培养的细胞是纯化的BMSCs。
慢病毒感染BMSCs，48h后开始出现荧光，72h达到荧光表达高峰，感染效率达到50％左右。经过抗生素筛选2周，几乎所有细胞均强烈表达慢病毒携带的荧光蛋白(图6)。Western blotting结果表明(图7A)，在双病毒感染的细胞中(LV-TH+DDC-GCH1)强烈表达TH，DDC和GCH1蛋白，RT-PCR和RT-qPCR分析(图7B，7C)也证实了TH，DDC和GCH1基因在感染细胞中显著过表达，而在未改造的BMSCs中未发现TH，DDC和GCH1的表达。
为了检测慢病毒感染的BMSCs的DA合成功能，采用ELISA和HPLC法对细胞培养上清液中的DA浓度进行分析(图8A，8B)。收集培养3d的细胞培养上清液，转移至无菌离心管中，4℃、3 000r/min离心20min，收集上清。考虑到培养基中可能存在血清等干扰成分，我们对所有样本数据去除培养基背景值处理。结果表明，相对于未改造的BMSCs，双病毒感染的BMSCs的DA水平上升11倍以上，并在传代后依旧保持稳定高表达状态。综上所述，本发明成功构建能稳定过表达DA递质的BMSCs细胞系(DA-BMSCs)。
实施例3：DA-BMSCs的体内功能检测
1、PD模型的构建
3％戊巴比妥腹腔注射麻醉180～220g左右的SPF级的SD大鼠，待充分麻醉后，固定于立体定位仪平台上，对脑部皮肤常规消毒，切开皮肤，剥离骨膜暴露大鼠颅骨，通过脑立体定向仪确定注射位置(图9B)。参考Paxinos等人所著的第六版大鼠脑定位图谱，以前囟为标准参考点，确定右侧前脑内侧束注射位点(图9A)：①AP-4.4mm，ML-1.2mm，DV-7.8mm；②AP-4.0mm，ML-0.8mm，DV-8.0mm。使用牙科颅骨钻孔，Hamilton微量注射器在每点以1μL/2min缓慢注射4μL的4μg/μL的6-OHDA，注射时间为8min，留针8min，缓慢退针，缝合颅顶伤口，术后连续3天腹腔注射30kU青霉素，预防感染，并每天观察恢复情况。
2、行为学检测
(1)APO诱导旋转实验：脑立体定位建模两周后腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kg)，注射后的建模大鼠表现出嗅探、压尾巴、僵硬和以健侧后肢作为支撑点，身体向健侧弯曲和头尾相接的旋转行为(图9D)，旋转圈数超过210r/30min视为建模成功。
(2)疲劳转棒实验
设置转棒速度为10r/min，时间为30min，系统测试记录大鼠在30min内的在棒时间(图9C)。每只大鼠测试3次以确保实验数据准确。
(3)旷场实验：旷场箱100×100×40(长×宽×高，cm)，在正中格上方安置摄像头。启动电脑，打开旷场实验追踪记录系统，将待测大鼠放置于旷场箱正中，摄像头会自动捕获并记录大鼠在旷场箱内5min内的活动情况(图9E)。
3、DA-BMSCs立体定向移植帕金森模型大鼠治疗
DA-BMSCs移植前处理：生长状态良好的细胞加胰酶消化后，血清中止消化，收集细胞至离心管中，离心去除胰酶溶液，加入PBS溶液吹打单细胞后计数，确保细胞悬液的细胞浓度为1.25x104-1.5x104/μL，模型组大鼠以PBS溶液代替。
DA-BMSCs立体定向移植帕金森模型大鼠治疗：选取建模成功的PD大鼠模型，采用与建模相同的方法，将细胞移植入PD大鼠脑前脑内侧束(MFB)区。
4、组织取材
细胞移植治疗8周后，用3％戊巴比妥腹腔注射麻醉PD大鼠，固定于大鼠解剖板上，常规消毒后打开腹腔、胸腔，用止血钳扩大手术空间，完全暴露心脏，用灌注针从左心室插入主动脉弓，迅速剪开右心房，出口尽可能大，不可破坏主动脉，灌注生理盐水200mL左右，再用约200mL 4％多聚甲醛灌注固定，大鼠逐渐进入僵硬状态。在冰上剥离完整脑组织，4％多聚甲醛内继续固定约4h，25％蔗糖4℃充分脱水，-80℃环境冻存。使用OCT包埋剂(Sakura)包埋脑组织，冰冻切片机在12-20μm切片厚度连续冠状切片，-20℃保存。
5、免疫荧光
将切片在室温复温10min。然后进行免疫荧光染色(自带红绿色荧光的细胞)观察移植细胞在体内存活、分化和迁移能力。
6、ELISA检测炎症因子
使用多巴胺酶联免疫吸附测定(ELISA)测定试剂盒(Bioss)检测抗炎因子IL-10和促炎因子IL-6，TNF-α水平。将细胞移植8周的大鼠脱颈椎致死，剥离脑组织，取移植区域脑组织称重，加入9倍体积的PBS溶液，冷冻研磨机进行破碎研磨，4℃、14 000r/min离心10min，留取上清进行检测。
7、HPLC检测DA和5-HT
使用HPLC检测大鼠脑移植区域和血浆中的DA和5-HT，将细胞移植8周的大鼠脱颈椎致死，剥离脑组织，取移植区域脑组织50mg，加入250μL的高氯酸沉淀剂(含0.35M高氯酸和1.5mM半胱氨酸)，冷冻研磨机进行破碎研磨，4℃、14 000r/min离心10min，留取上清经0.22μm过滤器过滤。收集的血浆样本50μL中加入250μL高氯酸沉淀剂，充分混匀后静置10min，18 000r/min，离心10min，吸取上清再次离心，取上清待测。流动相由50mM KH2PO4和0.08mM EDTA组成的A相，以及甲醇组成B相构成。C18柱(YMC-Triart,4.6×100mm,5μm)为色谱柱，柱温箱温度40℃。采用15％B相，1mL/mL的等量洗脱程序。每个样本进样量20μL，分析10min。高效液相分析仪为岛津LC-20。
8、结果
移植的DA-BMSCs显著改善了帕金森模型大鼠的认知与运动行为障碍。移植DA-BMSCs后第8周，APO诱导旋转行为学检测结果显示，移植组大鼠的转圈行为明显减少(P<0.05)(图10A)。而且，移植组大鼠比模型组大鼠旷场运动总距离明显增加，而且更活跃、更兴奋(P<0.05，图10B及图9E)。此外，与模型组相比，在疲劳转棒实验中，移植组大鼠在棒时间明显增加(P<0.05，图10C及图9D)。
免疫荧光染色发现，移植的DA-BMSCs细胞可以在宿主脑内分化出多种功能性神经元，表达多巴胺神经元标志物TH、GABA能神经元标志物GABA、谷氨酸能神经元突触后膜标志物PSD95和星型胶质细胞标志物GFAP，得到神经前体细胞体内分化能力鉴定图(图11)。以上结果表明移植的DA-BMSCs可以在宿主脑内分化为多种功能性神经元和星形胶质细胞发挥损伤修复作用。
移植细胞能在宿主脑内存活并发生远距离迁移(图12A)，且移植4周后发生明显的迁移，8周后从移植部位可迁移2.5-3.0mm；表达神经突触前膜标记蛋白Synapsin(图12B)，并与自体神经元产生突触连接并发挥作用，并在白色箭头所指能明显发现迁移分化的呈神经元样细胞，相互连接产生联系。
在移植8周时，与模型组相比，移植组PD大鼠脑移植区域炎症因子包括抗炎因子IL-10和促炎因子IL-6，TNF-α水平明显下调(P<0.05，图13)，表明DA-BMSCs保留了BMSCs修复的能力，抑制炎症因子表达，并对创伤后的炎症过程发挥了良好的功效。
HPLC分析结果表明，相对于模型组，移植细胞组在宿主体内能显著上调中脑和血浆中DA和5-HT水平(图14A，14B)。
上述结果显示本发明成功构建过表达TH，DDC和GCH1这三个多巴胺合成路径关键酶基因的慢病毒载体，进而获得表达TH，DDC和GCH1基因的BMSCs细胞系，这种细胞系能够稳定大量合成DA递质，移植体内能大量存活，并迁移到周围损伤区域分化为功能性神经元和星形胶质细胞，抑制炎症因子的产生，参与创伤后的炎症修复过程，此外，还显著上调体内的DA和5-HT水平，促进神经系统退行性疾病的修复和行为学的改善。
本发明的潜在应用说明：
DA-BMSCs体内可明显促进5-羟色胺(5-Hydroxy Tryptamine,5-HT)分泌，而5-羟色胺对于神经系统疾病治疗具有重要的应用潜能。5-羟色胺，又称血清素(Serotonin)，是一种主要来源于脑干中缝背核(Dorsal Raphe Nucleus,DRN)的抑制性单胺类神经递质，可参与调节情感、摄食、体温和睡眠等一系列中枢神经系统行为。5-HT可在抑郁症的发病机制中发挥抗抑郁的关键作用而备受关注，而且对其他的神经系统疾病也有重要作用，如帕金森病、阿尔兹海默病、脑卒中、癫痫和偏头痛等伴随的抑郁焦虑症状，提高中枢5-HT水平能有效改善这些神经系统疾病的伴随症状。此外，5-HT递质系统紊乱是阿尔兹海默病的显著神经化学变化，上调5-HT水平可以显著缓解阿尔兹海默病的脑神经病理学以及认知行为等临床症状。位于中脑腹侧被盖区(VTA)的多巴胺能神经元还能通过与5-HT神经元组成的神经环路调控进食行为以及神经性厌食症。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞特异性表达TH、DDC以及GCH1基因。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述TH、DDC以及GCH1基因的NCBI登录号依次为NM_199292、NM_001082971和NM_001024024。
3.根据权利要求2所述的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞选自大鼠骨髓间充质干细胞。
4.权利要求3所述骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别构建携带有TH基因的重组慢病毒载体LV-TH-mCherry、携带有DDC和GCH1的重组慢病毒载体LV-DDC-GCH1-ZsGreen；
S2、将所述慢病毒载体分别联合病毒包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞，获得重组慢病毒LV-TH和LV-DDC-GCH1；
S3、利用构建的重组慢病毒对骨髓间充质干细胞进行转染改造，获得所述骨髓间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述携带有TH基因的重组慢病毒载体是将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-mCherry-T2A-puro的EcoR I和BamH I之间的DNA小分子替换成所述TH基因获得；
所述携带有DDC和GCH1的重组慢病毒载体是将慢病毒载体质粒pHBLV-CMV-EF1-ZsGreen-P2A-BSD的Xho I和BamH I之间的DNA小分子替换成融合基因获得，所述融合基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述转染是在6μg/mL助转剂Polybrene的作用下，将LV-TH和LV-DDC-GCH1感染骨髓间充质干细胞，所述LV-TH和LV-DDC-GCH1的感染复数分别为7.5和5.0。
7.权利要求1所述骨髓间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病是由脑中神经元缺失引发。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病。
10.权利要求1所述骨髓间充质干细胞在制备治疗神经紊乱的药物中的用途，其特征在于，所述神经紊乱是由5-羟色胺水平降低引起。
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