CN115845030A - 神经生长因子诱导蛋白或其基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经生长因子诱导蛋白或其基因在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。本发明通过细胞实验以及动物实验证实了过表达神经生长因子诱导蛋白基因的慢病毒能够促进少突胶质细胞的再生，进而能够有效改善脊髓损伤动物模型运动功能的恢复。

Description

神经生长因子诱导蛋白或其基因的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及神经生长因子诱导蛋白或其基因的应用。

背景技术

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，可导致患者的感觉和运动功能受损，给患者的家庭和社会带来严重负担。在临床中，手术或康复训练对脊髓损伤患者的疗效有限，不能有效促进神经再生和功能恢复。基因编辑作为一种治疗手段，在脊髓损伤修复中具有较好的应用潜力。

神经内分泌调节多肽VGF(神经生长因子诱导型)最早在PC12细胞中快速诱导神经生长因子时发现的。VGF广泛表达于多种神经组织，人类下丘脑中的VGF mRNA表达量最高，此外，VGF在额叶内侧和外侧回以及许多神经内分泌组织，包括垂体和各种胃肠道和胰腺神经内分泌细胞中也有高表达。VGF参与多种生理过程，如食物摄入和能量平衡、水和电解质平衡、生殖、疼痛、肿瘤、学习和记忆。VGF还与抑郁症、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和其他神经疾病的发病机制密切相关。

慢病毒是逆转录病毒的一种，基因组为单链RNA。重组慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础，使用疱疹病毒VSVG外壳蛋白发展起来的工具载体。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒可有效地感染包括神经细胞在内的多种类型的细胞，并具有表达时间长、安全性高和免疫原性低等优势，为科学研究与临床治疗提供了强有力的基因操作工具。

截止目前，未见研究VGF在脊髓损伤中的相关报道，也未见利用慢病毒载体过表达VGF应用于脊髓损伤修复。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供神经生长因子诱导蛋白或其基因的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供神经生长因子诱导蛋白或其基因在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

本发明的第二方面是提供一种过表达神经生长因子诱导蛋白基因的慢病毒，用于治疗脊髓损伤，或用于制备治疗脊髓损伤的药物。

本发明的第三方面是提供一种如上所述慢病毒的制备方法，步骤包括：

对所述神经生长因子诱导蛋白基因进行PCR扩增后，将PCR扩增产物克隆至CSII-EF质粒中，将克隆产物CSII-EF-VGF与psPAX以及pMD2.G转染至野生型293T细胞中，一段时间后，依次进行细胞碎片去除、病毒沉淀、重悬以及鉴定，即得所述慢病毒。

优选地，所述PCR扩增中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述细胞碎片去除包括：收集含有所述慢病毒的培养基，离心后取上清并经过滤，即可去除细胞碎片。

优选地，所述重悬包括：收集沉淀的病毒并于4℃下搅拌孵育45min，离心后于培养液中重悬，即可。

优选地，所述鉴定包括：测定所述慢病毒的滴度。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明通过细胞实验以及动物实验证实了过表达神经生长因子诱导蛋白基因的慢病毒能够促进少突胶质细胞的再生，进而能够有效改善脊髓损伤动物模型运动功能的恢复。

附图说明

图1为qPCR检测不同剂量的慢病毒在少突胶质细胞前体细胞中过表达后VGF的表达水平；

图2中图A为使用10⁸TU/mL慢病毒处理后成熟少突胶质细胞标记物MBP(绿色)的免疫荧光染色，细胞核使用DAPI(蓝色)标记；比例尺，10μm；

图2中图B为不同组间细胞平均树突长度的定量；

图3中图A为使用慢病毒治疗脊髓损伤小鼠为期8周的BMS行为学评分；

图3中图B为免疫印迹检测VGF慢病毒治疗脊髓损伤小鼠后VGF、MBP和OLIG2等蛋白在损伤脊髓处的表达；

图4为VGF和MBP在不同处理组中脊髓的免疫荧光染色；比例尺，1000μm；以及脊髓损伤部位的放大图像；比例尺，100μm。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。

实施例1

VGF[Homo sapiens]NCBI Reference Sequence:NP_003369.2：

BLAST结果表明，人VGF的蛋白序列与小鼠VGF的蛋白序列具有84％的同源性和88％的相似性，这表明VGF序列在人与小鼠间较为保守，相似性较高，故以小鼠实验对其治疗效果进行验证。

实施例2

神经生长因子诱导蛋白基因的全长编码序列以小鼠(mus musculus，雌性C57BL/6，上海斯莱克实验动物有限责任公司)的脑部cDNA为模板，采用Platinum SuperFi II DNA扩增试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司，货号12361010)进行PCR扩增而得的，其中正向引物为CGGAATTCTGGCAGCCCGTTGGTCAT(SEQ ID NO：3)，反向引物为GTTAACCTGAGAGGGAGGAGGAGCGACA(SEQ ID NO：4)；

将PCR扩增产物经限制性内切酶EcoRI(New England Biolabs公司，货号R0101S)以及限制性内切酶HpaI(New England Biolabs公司，货号R0105S)酶切后，采用Anza T4DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific公司，货号IVGN2108)克隆至CSII-EF质粒(Addgene公司，货号80007)中；

采用Lipofectamine 3000试剂(Thermo Fisher Scientific公司，货号L3000015)，将克隆产物CSII-EF-VGF与慢病毒包装载体psPAX(Addgene公司，货号12260)以及pMD2.G(Addgene公司，货号12259)共同转染到野生型293T细胞(中国科学院细胞库，货号SCSP-502)中；

转染24小时后以及52小时后，收集含有慢病毒颗粒的培养基，3000g离心10分钟，取上清并经过0.45μm的过滤器过滤，以去除细胞碎片；加入5×慢病毒沉淀液(北京全式金生物，货号FV101-01)进行病毒沉淀，并于4℃搅拌孵育45min，7000g离心45分钟后，将病毒颗粒在DMEM/F12培养液(Thermo Fisher Scientific公司，货号A4192001)中重新悬浮，测定病毒滴度后分装于-80℃保存。

实施例3

从出生后第1天的大鼠幼崽(Rattus norvegicus，雌性Sprague Dawley，上海斯莱克实验动物有限责任公司)中分离出少突胶质细胞前体细胞。首先迅速取出皮层组织并分割成小块，在37℃水浴中用木瓜蛋白酶(worthington公司，ls003126)溶液消化。消化后，用新鲜培养基中和细胞悬液，用100μm的细胞过滤器过滤，并在1000rpm下离心5分钟。将沉淀物重新悬浮在含有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司，16000044)和1×双抗的DMEM/F12培养液中，将其放入细胞培养瓶中。培养4-7天后，对细胞进行消化，然后通过差速贴壁法对细胞进行纯化，以去除其中的小胶质细胞，收集未贴壁的少突胶质细胞前体细胞。以1×10⁵/孔的密度将少突胶质细胞前体细胞铺板于12孔板中，加入分化培养液以促进少突胶质细胞前体细胞向少突胶质细胞分化，分化7天。

配制含有不同浓度慢病毒的培养液，浓度分别为10⁴TU/mL、10⁶TU/mL和10⁸TU/mL，在细胞分化的第3天加入不同浓度的慢病毒进行处理，于第7天收集细胞并提取总RNA，反转获得cDNA，通过qPCR检测VGF基因的表达。图1的结果表明，10⁸TU/mL的慢病毒处理与对照组相比，可以促进VGF的表达增加98倍，说明成功地构建了慢病毒。

配制浓度为10⁸TU/mL的慢病毒培养液，在细胞分化的第3天加入慢病毒进行处理，于第7天对细胞使用4％的多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司，货号P1110)进行固定10分钟，然后使用0.3％Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司，货号T8200)通透10分钟，然后用5％山羊血清(北京索莱宝科技有限公司，货号SL038)封闭1小时，MBP一抗4℃孵育过夜，PBS(北京索莱宝科技有限公司，P1020)洗涤后室温孵育相应的荧光二抗1小时，PBS洗涤后室温孵育细胞核染料DAPI(北京索莱宝科技有限公司，C0065)，荧光显微镜下观察并拍照。根据图2的结果可知，慢病毒显著促进了少突胶质细胞的成熟，增加了少突胶质细胞的平均树突长度，说明慢病毒可以促进少突胶质细胞前体细胞分化为成熟少突胶质细胞。

实施例4

选取的小鼠为雌性C57BL/6小鼠，年龄6-8周，体重18-22克。采用脊髓吸除横断模型，对手术部位进行消毒，然后在显微镜下对T8-T9脊柱段进行椎体切除。打开硬膜后，吸除脊髓组织，形成一个2毫米长的空腔。小鼠分为两组，分别为损伤组(SCI)和慢病毒包裹于纤维蛋白胶组(VGF Lentivirus，剂量为10⁶TU)。对脊髓损伤小鼠进行不同处理后，对其进行缝合。手术后，每天给小鼠进行两次膀胱按摩以帮助排尿。

BMS评分：对两组小鼠每周记录一次体重，并由两名不知道组别的独立观察者根据Basso小鼠量表(BMS)的评分标准每周对损伤小鼠运动功能的恢复情况进行评分。图3结果表明慢病毒组在手术后8周BMS评分显著高于对照组，这意味着慢病毒处理可以促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。

Western blot检测损伤脊髓VGF，MBP和OLIG2的蛋白表达：对小鼠进行处死取材，收集获得损伤节段脊髓组织。使用蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，KGP2100)提取组织蛋白并进行蛋白定量检测，进行聚丙烯凝胶电泳，转膜后进行封闭。一抗二抗孵育后，利用ECL发光液对其进行曝光和拍照。根据图3的结果，在脊髓损伤部位观察到VGF、MBP和OLIG2蛋白的明显上调，说明慢病毒处理可以促进少突胶质细胞的再生。

免疫荧光染色检测慢病毒处理对脊髓VGF和MBP表达的影响：对小鼠脊髓进行灌注取材，蔗糖脱水OCT包埋后制作冰冻切片。将切片置于PBS中洗净，随后使用0.3％Triton X-100通透10分钟，然后用5％山羊血清封闭1小时，VGF或MBP一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤后室温孵育相应的荧光二抗1小时，PBS洗涤后室温孵育细胞核染料DAPI，荧光显微镜下观察并拍照。通过图4免疫染色的结果发现慢病毒处理可显著增加VGF和MBP在脊髓损伤部位的表达，说明慢病毒可以促进损伤脊髓的少突胶质细胞的再生。

综上所述，本发明通过细胞实验以及动物实验证实了过表达神经生长因子诱导蛋白基因的慢病毒能够促进少突胶质细胞的再生，进而能够有效改善脊髓损伤动物模型运动功能的恢复。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.神经生长因子诱导蛋白或其基因在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

2.一种过表达神经生长因子诱导蛋白基因的慢病毒，用于治疗脊髓损伤，或用于制备治疗脊髓损伤的药物。

3.一种如权利要求2所述慢病毒的制备方法，其特征在于，步骤包括：

对所述神经生长因子诱导蛋白基因进行PCR扩增后，将PCR扩增产物克隆至CSII-EF质粒中，将克隆产物CSII-EF-VGF与psPAX以及pMD2.G转染至野生型293T细胞中，一段时间后，依次进行细胞碎片去除、病毒沉淀、重悬以及鉴定，即得所述慢病毒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述细胞碎片去除包括：收集含有所述慢病毒的培养基，离心后取上清并经过滤，即可去除细胞碎片。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述重悬包括：收集沉淀的病毒并于4℃下搅拌孵育45min，离心后于培养液中重悬，即可。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述鉴定包括：测定所述慢病毒的滴度。

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