CN110656087B - 一种manf基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。本发明公开了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，所述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞为过表达MANF的脐带间充质干细胞。MANF基因修饰的脐带间充质干细胞能有效促进UCMSC转化成神经干细胞，将MANF基因修饰的UCMSC移植在大鼠体内，能够促进脊髓组织的修复和大鼠的运动功能的恢复，解决了现有的间充质干细胞移植体内后分化成神经干细胞的能力有限，治疗脊髓损伤的效果差的技术问题。

Description

一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢神经系统损伤，是造成人体截瘫的主要原因。由于其高致残率，给家庭和社会带来沉重的负担。脊髓损伤主要包括脊髓原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是受伤当时造成的不可逆的神经细胞死亡。继发性损伤则是患者受伤后因血液循环障碍、生物活性物质改变、炎症反应和能量代谢障碍等多个方面造成的神经细胞死亡，由于原发性损伤是不可逆的，所以减少继发性损伤是目前促进脊髓功能恢复、改善患者预后、降低脊髓损伤后致残率的关键。
近年来的研究发现，继发性神经细胞的死亡有16-50％是神经细胞的凋亡，而脊髓损伤后神经细胞凋亡的关键是局部组织的缺血缺氧，以及神经营养因子缺乏造成的微环境障碍。所以如果能够增强受损神经细胞抵抗低氧能力和给予神经营养因子改善受损细胞的微环境，就能够阻断神经细胞凋亡的级联反应，抑制或减少脊髓损伤后神经细胞凋亡，减轻脊髓的继发性损伤，改善神经功能，达到有效治疗的目的。
脊髓损伤传统的治疗主要依靠药物和外科手术，虽然可在一定程度上缓解，但疗效有限。近年来随着组织工程技术的飞速发展，为脊髓损伤的再生与修复提供了新的思路和方法。脐带间充质干细胞(UCMSC)是存在于脐带组织中的一种非造血干细胞，具有多向分化潜能，与神经干细胞、胚胎干细胞等其他可用于移植的干细胞比较，具有取材方便、易于体外扩增、免疫排反应弱、可进行基因技术加工等优点。UCMSC移植治疗脊髓损伤，使损伤轴突再生、突触重建和恢复脊髓部分功能成为可能。但由于间充质干细胞移植体内后分化成神经干细胞的能力有限，治疗效果始终难以达到预期目的。
因此，能够有效促进移植到体内的间充质干细胞分化成神经干细胞，对脊髓损伤达到预期的治疗效果，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用，解决了现有的间充质干细胞移植体内后分化成神经干细胞的能力有限，治疗脊髓损伤的效果差的技术问题。
其具体技术方案如下：
本发明提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，所述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞为过表达MANF的脐带间充质干细胞。
本发明中，上述脐带间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
优选地，所述MANF基因的序列具有如SEQ ID NO：1所示序列，或 SEQ ID NO：1替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列。
优选地，MANF基因修饰的脐带间充质干细胞由以下方法制得：
1)构建MANF基因重组质粒载体；
2)将所述MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF 基因修饰的脐带间充质干细胞。
本发明中，MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞后，得到过表达MANF蛋白的脐带间充质干细胞，即为MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
优选地，MANF基因重组质粒载体的载体为慢病毒载体。
更优选地，慢病毒载体载体为pWPXL质粒。
优选地，慢病毒载体的包装质粒为pMD2.G质粒，慢病毒载体的包膜质粒为psPAX2质粒。
本发明还提供了一种上述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)构建MANF基因重组质粒载体；
2)将所述MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF 基因修饰的脐带间充质干细胞。
优选地，所述MANF基因的序列具有如SEQ ID NO：1所示序列，或 SEQ ID NO：1替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列。
优选地，步骤2)MANF基因重组质粒载体的载体为慢病毒载体。
更优选地，慢病毒载体载体为pWPXL质粒。
优选地，慢病毒载体的包装质粒为pMD2.G质粒，慢病毒载体的包膜质粒为psPAX2质粒。
优选地，MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备方法具体为：
1)取pWPXL质粒和MANF基因PCR产物，进行BamHI/MluI双酶切，纯化回收后用T4DNA连接酶连接双酶切后的pWPXL质粒和MANF基因 PCR产物，将MANF基因整合进pWPXL质粒，构成重组的pWPXL-MANF 质粒；
2)目的质粒pWPXL-MANF、包装质粒pMD2.G和包膜质粒psPAX2转染培养至P3代的脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
本发明还提供了一种上述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或上述制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞在促进间充质干细胞分化成神经干细胞中的应用。
优选地，包括以下步骤：
1)构建MANF基因重组质粒载体；
2)MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰脐带间充质干细胞；
3)诱导MANF基因修饰脐带间充质干细胞分化成神经干细胞。
优选地，所述MANF基因的序列具有如SEQ ID NO：1所示序列，或 SEQ ID NO：1替换一个或多个核苷酸得到的核苷酸序列。
优选地，步骤1)MANF基因重组质粒载体的载体为慢病毒载体。
优选地，慢病毒载体载体为pWPXL质粒。
优选地，慢病毒载体的包装质粒为pMD2.G质粒，慢病毒载体的包膜质粒为psPAX2质粒。
优选地，步骤3)诱导具体为：先进行预诱导，再进行诱导。
更优选地，预诱导的时间为24h，诱导的时间为7d。
优选地，MANF基因修饰脐的带间充质干细胞在促进间充质干细胞分化成神经干细胞中的应用具体为：
1)取pWPXL质粒和MANF基因PCR产物，进行BamHI/MluI双酶切，纯化回收后用T4DNA连接酶连接双酶切后的pWPXL质粒和MANF基因 PCR产物，将MANF基因整合进pWPXL质粒，构成重组的pWPXL-MANF 质粒；
2)目的质粒pWPXL-MANF、包装质粒pMD2.G和包膜质粒PSPAX2转染培养至P3代的脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰脐带间充质干细胞；
3)MANF基因修饰脐带间充质干细胞先进行预诱导24h，预诱导培养基：L-DMEM+10％胎牛血清+100μg/L碱性成纤维生长因子，然后改用诱导培养基诱导7d，诱导培养基：L-DMEM+0.1％二甲基亚砜+2mmol/L维甲酸+100μg/L碱性成纤维生长因子+100μg/L表皮生长因子+100μg/L脑源性神经营养因子，得到MANF基因修饰脐带间充质干细胞。
本发明还提供了一种上述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或上述制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞在制备脊髓损伤药物中的应用。
本发明还提供了一种药物，包括：上述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或上述制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
上述药物优选为治疗脊髓损伤药物。
中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derivedneurotrophic factor，MANF)是一种分泌型蛋白，分子量约为20KD，在内质网应激时特异性表达上调(如缺血、癫痫等)，可在多种病理条件下发挥神经保护作用。因内质网应激可上调其表达，故又被称为内质网应激蛋白。利用MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，提高脐带间充质细胞分化成神经干细胞的能力，此种方法国内外尚未报道，该方法为脊髓损伤修复提供了全新的方法。
本发明提供了一种MANF基因修饰的UCMSC，该脐带间充质干细胞为过表达MANF的UCMSC，由实验数据可知，MANF基因修饰的UCMSC较未修饰的UCMSC能有效促进UCMSC转化成神经干细胞，将MANF基因修饰的UCMSC移植在大鼠体内，能够促进脊髓组织的修复和大鼠的运动功能的恢复。本发明为制备促进脊髓修复药物提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例一提供的MANF基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例一提供的pWPXL质粒和重组pWPXL-MANF质粒电泳图；
图3为本发明实施例二中培养的P3代UCMSC荧光显微镜结果图；
图4为本发明实施例二提供的Western blot检测P3代UCMSC中MANF 蛋白表达的电泳图；
图5为本发明实施例三提供的MANF基因修饰的UCMSC体外神经诱导分化荧光显微镜结果图；
图6为本发明实施例四提供的免疫荧光检测UCMSC体外神经诱导分化后Nestin蛋白表达的荧光图；
图7为本发明实施例四提供的免疫荧光检测UCMSC体外神经诱导分化后NeuN蛋白表达的荧光图；
图8为本发明实施例六提供的大鼠BBB评分结果图；
图9为本发明实施例七提供的大鼠脊髓HE染色病理图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的MANF基因修饰脐带间充质干细胞及其应用试剂均可由市场购得。
以下就本发明所提供的一种MANF基因修饰脐带间充质干细胞及其应用做进一步说明。
实施例一重组质粒的构建
1、采集16例(28.3±10.5岁)正常健康人外周抗凝血各2ml，将血液全部混合均匀。取2ml混合均匀的外周血，于4h内加入12ml红细胞裂解液， 1000rpm离心5min，弃上清，用PBS重悬清洗，加入1ml Trizol裂解液，抽提RNA。根据Takara
Figure BDA0001717078360000061
RT MasterMix逆转录试剂盒操作说明，取 500ng总RNA进行反转录，反应体系为1μl，反应条件为37℃15min，85℃ 15s，反应产物-20℃保存备用。反应体系如下：
Template RNA 1μl
RT enzyme Master Mix 2μl
DEPC ddH2O 7μl
2、采用引物Forward：5’-cgcggatccgcgatgaggaggatg-3’，Reverse： 5’-cgacgcgtcg ctacaaatcgg-3’，以步骤1所获得的cDNA为模板，进行常规PCR 扩增。50μl反应体系，含有premix Extaq 25μl，上下游引物各50pmol/L， cDNA模板0.1μg，补水至50μl。反应按以下程序进行：预变性94℃3min， 94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环30次，72℃延伸5min。 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3、取5μg pWPXL质粒和上述PCR产物，进行BamHI/MluI双酶切。纯化回收后用T4DNA连接酶连接双酶切后的pWPXL质粒和PCR产物，即把 MANF基因整合进pWPXL质粒，构成重组的pWPXL-MANF质粒。经1％琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定后，用于慢病毒的包装。
如图1所示，产物长度约570bp，与MANF基因长度一致。
如图2所示，重组的pWPXL-MANF质粒比pWPXL大约570bp，表明 MANF已整合进pWPXL质粒中。
实施例二MANF基因修饰脐带间充质干细胞的获取
1、取对数生长期293T细胞5×106个接种于100mm细胞培养皿中，24h 后待细胞融合度达80％-90％时，更换为6ml新鲜的DMEM完全培养基，4h 后加入0.5ml目的质粒pWPXL-MANF 10μg、包装质粒pMD2.G 6.5μg和包膜质粒psPAX2 3.5μg混合液，并缓慢加入50μlCaCl2，轻轻混匀，用于慢病毒的包装。收集包装48h和72h后的病毒液，浓缩后-80℃保存备用。
2、从医院采集废弃的脐带组织，将脐带组织转移到无菌采集瓶中， 2-8℃保存，12h内分离华通氏胶。将分离的华通氏胶用
Figure BDA0001717078360000071
hMSC SFM培养液贴壁培养于T75培养瓶中，置37摄氏度、5％CO2的培养箱中培养。第二天进行全量换液，以后每2-3天进行半量换液，第9天时刮除组织块。细胞继续培养至细胞融合度达80％-90％时，去除培养瓶中培养基，用生理盐水冲洗2次，加入0.25％EDTA-胰酶进行消化，待细胞变圆时加入等体积完全培养基终止消化，收集离心后，用适量完全培养基重悬，调整细胞密度为0.5×105/ml进行传代。当P1代细胞融合度达到90％以上时，调整细胞密度为0.5×105/ml进行传代，后续按此标准进行传代培养至P3代。
3、取P3代UCMSC以每瓶1×106个细胞接种于T175培养瓶中，待细胞生长融合到70-80％时，以MOI＝60IU/ml的病毒滴度转染UCMSC，8h后去除病毒液，更换为新鲜培养液，继续培养96h。提取转染和未转染的UCMSC 蛋白，用Western blot的方法检测MANF在蛋白水平的表达情况。
如图3所示，P3代脐带间充质干细胞培形态为长梭型，类似于成纤维细胞。
如图4所示，慢病毒介导MANF基因转染的UCMSC中人MANF蛋白的表达量明显高于未转染的UCMSC中的表达量，说明转染的MANF基因在 UCMSC中成功表达。
实施例三UCMSC体外神经诱导分化
实验分2组：MANF基因修饰UCMSC组和UCMSC正常对照组。将上述两组细胞按照5×104/孔接种于预先铺有细胞爬片的24孔板中，补齐培养液至1mL进行培养，24h后待细胞完全贴壁进行体外神经诱导。先进行预诱导24h，预诱导培养基：L-DMEM+10％胎牛血清+100μg/L碱性成纤维生长因子，然后改用诱导培养基诱导7d，诱导培养基：L-DMEM+0.1％二甲基亚砜+2mmol/L维甲酸+100μg/L碱性成纤维生长因子+100μg/L表皮生长因子+100μg/L脑源性神经营养因子。
如图5所示，UCMSC正常对照组经过神经诱导后数量轻微减少，少许细胞形态变为细长形。MANF基因修饰UCMSC组经神经诱导后细胞大量减少，且多数细胞呈现椎形样，出现细长突起样延伸，细胞与细胞间类似发生了联系，诱导7d后细胞突起样长度较正常UCMSC组长，且出现较明显的突起样延伸，表明MANF基因修饰UCMSC分化为神经干细胞的能力更强。实施例四免疫荧光检测诱导分化后Nestin、NeuN的表达
诱导第7天后，每孔细胞用PBS清洗，4％多聚甲醛固定，再加入0.1％ Triton X-100透化，然后用5％BSA封闭，加Nestin抗体(Abcam Mouse monoclonal)、NeuN抗体(AbcamRabbit polyclonal)，按照1︰100稀释，每孔 300μL，4℃孵育过夜。第2天室温放置30min复温，PBS洗3次，去除非特异结合的一抗。加入荧光二抗Alexa Fluro 594(Goat Anti-MouseIgG(H+L))、Alexa Fluor(594Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L))，按照1︰500稀释，每孔300μL，避光孵育30min，PBS洗3次，去除未结合游离的二抗。取出细胞爬片，轻轻倒扣于滴加DAPI封固剂(Southern Biotect DAPI Fluoromount-G)的载玻片上，完成封固后可进行荧光检测。
尽管实施例三中经神经诱导后细胞形态发生了较明显的变化，但仍不能说明细胞形态改变是由诱导剂中添加的化学因子引起的，于是进行了免疫荧光技术检测诱导后细胞中是否表达了神经相关标记。
如图6所示，诱导第7天后，可在MANF基因修饰UCMSC组的细胞中检测到较强的Nestin表达，而在UCMSC正常对照组只在少数细胞内检测到较弱的荧光信号。Nestin蛋白的表达能说明体外神经诱导UCMSC已向神经前体细胞分化。
如图7所示，MANF基因修饰UCMSC组和UCMSC正常对照组均能检测到NeuN蛋白的荧光信号，但MANF基因修饰UCMSC组的荧光信号明显更强，表明MANF基因修饰UCMSC组的UCMSC大多数已成功分化为成熟的神经元，经MANF基因修饰后，UCMSC分化为成熟神经元的能力得到增强。
实施例五大鼠脊髓损伤模型的建立及细胞移植治疗
1、脊髓损伤模型制作：取健康成年SPF级雌性大鼠21只，体重 250-280g，麻醉后以第11胸椎为中心，切开皮肤和肌肉，以刀柄向两侧钝性分离肌肉，小弯钳拉开软组织，无菌纱布擦去棘突和椎板附着的肌肉，暴露第10-12胸椎棘突和椎板，用止血钳咬除第11胸椎棘突和椎板以及部分胸 10、12棘突和椎板，充分暴露脊髓，质量5g的祛码在17cm高度处通过玻璃试管自由一下落，(打击头面积约3.0mm2)向下对大鼠脊髓进行定量打击，打击能量为5g x 17cm。打击后可见大鼠双后肢抽动、甩尾，随后完全松弛，大鼠脊髓硬脊膜下可见充血。致伤后迅速移去祛码，生理盐水冲洗伤口后，覆以明胶海绵局部止血(可防止脊髓组织与周围组织粘连从而为细胞移植或取脊髓组织时造成困难)，逐层缝合肌肉、皮肤，碘伏消毒后放入笼中。
2、于脊髓受损1周后移植P3代UCMSC，将模型鼠随机分为3组，分别是MANF基因修饰UCMSC组、UCMSC组和空白对照组，用1ml注射器抽取细胞悬液(浓度为1×106个/ml)1ml经尾静脉缓慢注入，空白对照组用等体积的生理盐水代替。
实施例六行为学观察
根据Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分标准对大鼠后肢运动功能进行评价。采用盲法评分，由2名熟悉BBB评分的非实验人员观察。3组大鼠分别于损伤后第1d、3d、1周以及移植后1周、2周、4周采用BBB评分法对行为学进行评价。具体方法为：将大鼠置于一个边高约15cm底部平坦的塑料盘中，光线保持充足，先让大鼠在其中适应行走2-3min后进行评价。
所有动物术前BBB评分均为21分，术后第1天为0分，在平滑光地自由活动时后肢无可见运动。
如表1和图8所示，随时间推移，3组实验动物后肢运动功能皆有不同程度的恢复，MANF基因修饰细胞移植1周后移植组动物后肢出现两个关节轻微运动和第3个关节的广泛运动，BBB评分为5.8±0.6，UCMSC组和对照组动物也出现了类似的2-3个关节的运动，其BBB评分分别为5.3±0.6和 5.2±0.7，3组之间无统计学差异(P>0.5)。移植2周后MANF基因修饰 UCMSC组和UCMSC组的动物可以用后肢站立，能够保持频繁甚至持续的负重足底步态，偶尔可出现后肢的交替运动，其BBB评分为分别为12.3±0.7和 10.9±0.6，对照组动物的运动功能也较前有所恢复，能够出现后肢3个关节的广泛运动但不能用后肢站立，前后肢也不能出现交替运动，其BBB评分分别为6.6±0.8，在统计学上有明显差异。5周后MANF基因修饰UCMSC组、 UCMSC组和对照组评分分别为15.2±0.8、13.1±0.8、8.5±0.6，移植组大鼠运动功能的恢复明显优于对照组，而MANF基因修饰UCMSC组大鼠运动功能的恢复又要明显优于未经修饰的UCMSC组。
表1BBB评分结果
Figure BDA0001717078360000101
注：*p＜0.05,**p＜0.01
实施例七组织学观察
于移植后5周，取各组大鼠，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，4％多聚甲醛心脏灌注后室温固定2h，以损伤平面为中心点，上下2cm处取一段脊髓，固定于4％多聚甲醛溶液中，过夜后取出脱水，石蜡包埋。脊髓纵行连续石蜡切片，切片厚8μm，HE染色观察病理学变化。
如图9所示，黑点处为损伤中心区域，对照组冠状面切片可见灰质几乎全部被破坏溶解，并形成巨大的空腔，瘢痕组织形成比细胞移植组增多，完整的细胞结构较少，其白质区较2个细胞移植组范围窄，结构较紊乱。同时发现对照组脊髓组织内细胞数目较细胞移植治疗组偏少。而相对于UCMSC 组，MANF基因修饰UCMSC组的脊髓组织结构较清晰，白质部分保持更为完整，灰质中坏死区形成的空洞更小，瘢痕组织更少。
以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 李陶
<120> 一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
<141> 2018-06-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 558
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgaggagga tgaggaggat gtgggccacg caggggctgg cggtggcgct ggctctgagc 60
gtgctgccgg gcagccgggc gctgcggccg ggcgactgcg aagtttgtat ttcttatctg 120
ggaagatttt accaggacct caaagacaga gatgtcacat tctcaccagc cactattgaa 180
aacgaactta taaagttctg ccgggaagca agaggcaaag agaatcggtt gtgctactat 240
atcggggcca cagatgatgc agccaccaaa atcatcaatg aggtatcaaa gcctctggcc 300
caccacatcc ctgtggagaa gatctgtgag aagcttaaga agaaggacag ccagatatgt 360
gagcttaagt atgacaagca gatcgacctg agcacagtgg acctgaagaa gctccgagtt 420
aaagagctga agaagattct ggatgactgg ggggagacat gcaaaggctg tgcagaaaag 480
tctgactaca tccggaagat aaatgaactg atgcctaaat atgcccccaa ggcagccagt 540
gcacggaccg atttgtag 558
<210> 1
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Arg Met Arg Arg Met Trp Ala Thr Gln Gly Leu Ala Val Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Ser Val Leu Pro Gly Ser Arg Ala Leu Arg Pro Gly Asp
20 25 30
Cys Glu Val Cys Ile Ser Tyr Leu Gly Arg Phe Tyr Gln Asp Leu Lys
35 40 45
Asp Arg Asp Val Thr Phe Ser Pro Ala Thr Ile Glu Asn Glu Leu Ile
50 55 60
Lys Phe Cys Arg Glu Ala Arg Gly Lys Glu Asn Arg Leu Cys Tyr Tyr
65 70 75 80
Ile Gly Ala Thr Asp Asp Ala Ala Thr Lys Ile Ile Asn Glu Val Ser
85 90 95
Lys Pro Leu Ala His His Ile Pro Val Glu Lys Ile Cys Glu Lys Leu
100 105 110
Lys Lys Lys Asp Ser Gln Ile Cys Glu Leu Lys Tyr Asp Lys Gln Ile
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Val Asp Leu Lys Lys Leu Arg Val Lys Glu Leu Lys
130 135 140
Lys Ile Leu Asp Asp Trp Gly Glu Thr Cys Lys Gly Cys Ala Glu Lys
145 150 155 160
Ser Asp Tyr Ile Arg Lys Ile Asn Glu Leu Met Pro Lys Tyr Ala Pro
165 170 175
Lys Ala Ala Ser Ala Arg Thr Asp Leu
180 185

Claims (7)

1.一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，其特征在于，所述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞
为过表达MANF的脐带间充质干细胞，所述MANF基因的序列为SEQ ID NO： 1所示序列。
2.根据权利要求1所述的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，其特征在于，由以下方法制得：
1) 构建MANF基因重组质粒载体；
2) 将所述MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
3.权利要求1至2任意一项所述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建MANF基因重组质粒载体；
2）将所述MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
4.权利要求1至2任意一项所述的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或权利要求3所述的制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞在制备促进间充质干细胞分化成神经干细胞药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建MANF基因重组质粒载体；
2）将所述MANF基因重组质粒载体转染脐带间充质干细胞，得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
3）诱导所述MANF基因修饰的脐带间充质干细胞分化成神经干细胞。
6.权利要求1至2任意一项所述的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或权利要求3所述的制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞在制备脊髓损伤药物中的应用。
7.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1至2任意一项所述的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞或权利要求3所述的制备方法制得的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞。
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