CN111568916A - LncRNAGAS5在治疗原发性骨质疏松症的作用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了长链非编码RNAGAS5在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用。应用GAS5腺病毒进行骨质疏松症的治疗，其药理作用与特立帕肽类似，都是促进骨质形成类药物。所不同的是，GAS5在体内各类细胞中自然表达，无特定腺体分泌，不会对人体自身的内分泌腺造成相应抑制；GAS5在体内只促进MSCs向成骨细胞分化，对破骨细胞无明显影响。因此，其抗骨松能力更强，且不存在特立帕肽类似的剂量范围较小问题。除此之外，因腺病毒独特的作用方式，GAS5只需体外注射一次，即可发挥抗骨质疏松症的作用效果，病人的接受度和舒适度会大大提升。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及LncRNAGAS5在治疗原发性骨质疏松症的作用。
背景技术
骨质疏松症是最常见的骨骼疾病，是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。2001年美国国立卫生研究院将其定义为以骨强度下降和骨折风险增加为特征的骨骼疾病，提示骨量降低是骨质疏松性骨折的主要危险因素，但还存在其他危险因素。骨质疏松症可发生于任何年龄，但多见于绝经后女性和老年男性。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症(Ⅰ型)、老年骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松症(包括青少年型)。早期流行病学调查显示:我国50岁以上人群骨质疏松症患病率女性为20.7％，男性为14.4％；60岁以上人群骨质疏松症患病率明显增高，女性尤为突出。据估算2006年我国骨质疏松症患者近7000万，骨量减少者已超过2亿人。骨质疏松性骨折的危害巨大，是老年患者致残和致死的主要原因之一。据2015年预测，我国2015、2035和2050年用于主要骨质疏松性骨折(腕部、椎体和髋部)的医疗费用将分别高达720亿元、1320亿元和1630亿元。骨骼的完整性由不断重复、时空偶联的骨吸收和骨形成过程维持，此过程称为“骨重建”。骨重建由成骨细胞、破骨细胞和骨细胞等组成的骨骼基本多细胞单位实施。随年龄增加，骨形成与骨吸收呈负平衡，骨重建失衡造成骨丢失。破骨细胞占骨骼细胞的1％～2％，由单核巨噬细胞前体分化形成，主司骨吸收。成骨细胞由间充质干细胞分化而成，主司骨形成，并可随骨基质的矿化而成为包埋于骨组织中的骨细胞或停留在骨表面的骨衬细胞。成骨细胞分泌富含蛋白质的骨基质，包括Ⅰ型胶原和一些非胶原的蛋白质(如骨钙素)等；再经过数周至数月，羟基磷灰石沉积于骨基质上完成矿化。
原发性骨质疏松症的病理过程中，都具有成骨细胞介导的骨形成不能代偿破骨细胞造成的骨吸收的病理情况，因此，市面上主要存在两类针对骨质疏松症治疗的药物：抑制破骨细胞药物和促进成骨细胞药物。如下表1：
表1.防治骨质疏松症主要药物
对上述药物的研究均证明其对骨质疏松症具有治疗效果。其中甲状旁腺激素类似物作为唯一一类骨形成促进剂，因其特殊的治疗机制，在骨质疏松症的治疗及预后中均具有较好效果。这提示我们，根据此机制研制药物进行骨质疏松症的治疗具有重要意义。
目前针对骨质疏松症治疗，应用促进骨形成药理机制从而达到治疗目的的药物尚且只有甲状旁腺激素类似物——特立帕肽。其是一种合成的多肽激素，为人甲状旁腺素的1-34氨基酸片段，该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素具有生物活性的N-末端区域。已有的研究表明，特立帕肽对骨质疏松症的治疗具有相对较好的效果。但因其免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素完全相同，其在体内除了促进骨形成以外，还可能会引发甲状旁腺素对人体的其他功能作用，例如长期应用后可能会抑制自身甲状旁腺素的分泌，导致甲状旁腺腺体萎缩，进而可能引起停药后自身甲状旁腺素的分泌不足导致的骨质疏松症治疗效果下降。另外，特立帕肽同时促进成骨和破骨，剂量范围需控制在一定程度才可发挥骨形成作用。其剂量可应用范围较小，无法通过提高剂量以适应不同严重程度病人的需求。并且，特立帕肽目前只有针剂，病人应用时需每日进行注射，较长时间应用才有效果。由此可能带来皮肤长时间注射后的不良反应，例如瘢痕增生、注射处皮肤吸收下降、病人舒适度较差等问题。除此之外，在一些报道中，还发现特立帕肽偶会引起个别病人的不良反应，例如血压降低、腿痛性痉挛、关节痛、恶心、腹部痛性痉挛等。
因此，寻求一种副作用较小，不受剂量范围控制的新型促进骨质形成类药物成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供LncRNAGAS5在治疗原发性骨质疏松症的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：LncRNAGAS5在治疗原发性骨质疏松症的应用。
长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200nt，不编码蛋白质的RNA。在以往，人们发现其在细胞中转录甚多，但却未发现其具体功能，因此一直以基因“垃圾”的观念对待lncRNA。近几年，随着研究技术的不断进步，越来越多的研究发现，lncRNA在肿瘤、免疫、细胞生长分化等领域扮演着重要角色。例如，lncRNA MALAT1在癌症组织中高表达，并可以促进肝癌、胰腺癌等癌细胞的生长侵袭，发挥促进肿瘤生长的作用；lnc-DC可以调控树突状细胞的分化，调控体内的免疫反应。而骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能和自我调节能力的干细胞，其可以分化为成骨细胞，成脂细胞等。在以往的研究中发现，MSCs分化在骨质疏松症的病理过程中扮演重要角色，其骨代谢的平衡可以由MSCs成骨及成脂分化两个方向进行调控。以往已有文献报道，lncRNA可以影响MSCs的分化，例如H19可以通过miR-675进而分别调控MSCs的成骨和成软骨分化，可能参与骨关节炎的发病。在我们的前期研究中，发现了lncRNA GAS5在MSCs成骨和成脂分化中的关键作用。其中GAS5可以通过miR-18a/CTGF轴调控MSCs成脂分化，其成果已经发表在SCI杂志CellDeath&Disease中。而对GAS5进行成骨方面的研究后，我们发现，GAS5可以通过不同机制调控MSCs的成骨分化，其在MSCs的成骨成脂平衡中扮演重要角色。而应用GAS5的基因敲除鼠，我们发现GAS5敲除的杂合子小鼠，其骨量下降明显，并表现出骨质疏松症的表型。应用骨缺损模型，我们发现GAS5杂合子小鼠骨修复能力下降。构建小鼠骨质疏松症模型后，我们应用GAS5过表达腺病毒进行小鼠尾静脉注射，发现与对照组相比，注射GAS5后的小鼠，其骨质含量明显增高，具有治疗骨质疏松症的良好效果。
进一步地，所述骨骼系统疾病为原发性骨质疏松症。
本发明还提供了长链非编码RNAGAS5过表达质粒在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用。
进一步地，长链非编码RNAGAS5过表达质粒在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
进一步地，所述过表达质粒为重组病毒Adeno-GAS5-EGFP-3FLAG。
本发明还提供了一种治疗骨骼系统疾病的分子标志物，所述标志物为长链非编码RNAGAS5。
本发明还提供了一种骨质疏松症的诊断试剂盒，包括如上所述的分子标志物。
本发明的有益效果：相对与特立帕肽，应用GAS5腺病毒进行骨质疏松症的治疗，其药理作用与特立帕肽类似，都是促进骨质形成类药物。所不同的是，GAS5在体内各类细胞中自然表达，无特定腺体分泌，不会对人体自身的内分泌腺造成相应抑制；GAS5在体内只促进MSCs向成骨细胞分化，对破骨细胞无明显影响。因此，其抗骨松能力更强，且不存在特立帕肽类似的剂量范围较小问题。除此之外，因腺病毒独特的作用方式，GAS5只需体外注射一次，即可发挥抗骨质疏松症的作用效果，病人的接受度和舒适度会大大提升。
附图说明
图1为骨松小鼠进行GAS5过表达腺病毒注射前后骨质变化情况示意图(NS：生理盐水；OV：卵巢去势；Vector：对照病毒载体；GAS5-OE：GAS5过表达腺病毒)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1构建GAS5过表达质粒的腺病毒
将目的穿梭质粒pAdeno-mCMV-GAS5-EGFP-3FLAG与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒Adeno-GAS5-EGFP-3FLAG，经大量扩增后纯化，检测滴度和目的基因表达水平后备用。实验具体步骤如下：
一、病毒包装与鉴定
1、转染前一天，将细胞接种到6孔板中，控制细胞转染时的密度为70％-80％。
2、转染前一小时取出细胞培养板，取出原有细胞培养基，加入1.5ml的Opit-MEM培养基，总体积为250ul，轻轻混匀。
3、制备转染试剂盒质粒的复合物：
A、将待转染的病毒载体质粒4ug(骨架质粒：穿梭质粒＝1:1)溶于Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。
B、将包装转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为250ul，轻轻混匀。
C、将包装转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
D、取出细胞培养板，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。
E、6h后吸取培养基，PBS洗一次，加入2ml新鲜完全培养基培养。
F、每三天换液一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，待完全病变后收集上清液。
二、病毒大量扩增与纯化：
将HEK293细胞铺于30-40个10cm dish，待细胞长至70％-80％，每块板加入合适滴度的病毒(约107-108PFU/ml)10ul，感染细胞，带细胞全部病变后(2-3天)，每块板中加入约500ul 10％Nonidet P 40(NP40)以裂解细胞。收集细胞裂解物，12000rpm离心10min，弃去细胞碎片后收集上清。每100ml上清加入50ml病毒沉淀液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，冰上放置1h以沉淀病毒。12000rpm离心上述混合物20min，弃去上清，将沉淀物悬浮在10ml密度为1.10g/ml的CsCl溶液中(溶剂为20mM Tris-HCl，pH值8.0)4℃7000rpm离心5min，收集病毒悬浮液。
在超速离心管中加入2.0ml的1.4g/ml CsCl溶液(溶剂同上)。再加入3.0ml1.30g/ml的CsCl溶液。最后加入5ml的病毒悬浮液。22800rpm，4℃离心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10mM的EDTA Na2煮沸10min)。在透析缓冲液(50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1000ml)中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集病毒，与-80℃保存。三种密度的CsCl溶液配制如下(溶于灭菌20mM Tris，pH 8.0)，4℃保存。
表2：CsCl溶液配制
三、病毒滴定测定：
A、选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5.0×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，37℃、5％CO2培养。
B、准备好10倍梯度稀释的病毒样品，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100ul。
C、37℃、5％CO2感染48h。轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓慢加入预冷的甲醇500ul，-20℃固定20min。
D、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
E、加入200ul 1％BSA 37℃封闭1h。
F、加入200ul的一抗溶液至每个孔中，37℃孵育1h。
G、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
H、加入200ul的二抗至每孔，37℃孵育1h。
I、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
J、加入200ul新配置的工作液至每孔，室温孵育5-10min。
K、弃去工作液，使用PBS清洗2次，每孔每次加入1ml PBS。
L、每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10X物镜下计算阳性细胞个数。
M、计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。
四、GAS5基因表达检测：
腺病毒感染工具细胞-293T，qPCR检测病毒表达情况(24孔板为例)
第一天：细胞准备：
将长势良好的293T细胞接种到24孔板，消化好细胞后把细胞浓度调为1×105个/ml，按500ul/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30-50％之间。
第二天：病毒感染：
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加。病毒液10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值一次为100，10和1，每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，终浓度为5ug/ml。中间每隔15-20min摇晃一次培养板，增加感染效果。感染过程尽量使用无血清培养基。感染293T细胞无需Polybrene，无需无血清处理，直接按照MOI＝1-10感染。
第二天：换液：
感染实验同一天，1.5-2h后(中间每半小时均匀摇晃一次，增加感染效率)，弃去上清，换5％血清的培养基，500ul/孔。
第三天：检测GAS5表达情况
应用RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA，逆转录后进行qPCR检测，分析GAS5过表达效率。GAS5腺病毒构建及表达确认无误后进行后续动物实验注射。
实施例2动物实验
1、构建原发性骨质疏松症小鼠模型
取C57雌性小鼠30只，分为3组，正常生长+对照病毒组；骨质疏松症小鼠模型+对照病毒组；骨质疏松症小鼠模型+GAS5过表达腺病毒组。在12周龄时对后两组应用卵巢去势手术，切除其卵巢，构建原发性骨质疏松症小鼠模型。
2、应用GAS5过表达腺病毒及对照进行体内注射。
2月后，应用微量注射器通过尾静脉注射含有GAS5过表达质粒的腺病毒。每只小鼠5×1011的病毒颗粒溶于200ul生理盐水注射入尾静脉。
3、检测各组小鼠成骨指标及骨质情况
2月及5月后进行眼球取血，收集血清，检测血清成骨标志物OCN；2月及5月对小鼠进行麻醉后，进行micro CT扫描，分析其骨质改变情况。结果如下表3：
表3：注射GAS5过表达腺病毒2月后小鼠成骨指标及骨质情况
表4.注射GAS5过表达腺病毒5月后小鼠成骨指标及骨质情况
以上实验结果发现，骨质疏松症模型小鼠构建成功，其血清OCN含量及骨量均较对照组降低。进行GAS5过表达腺病毒注射后，血清OCN含量上升，骨量丢失延缓。证实GAS5对骨质疏松症具有治疗作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.长链非编码RNAGAS5在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨骼系统疾病为原发性骨质疏松症。
3.长链非编码RNAGAS5过表达质粒在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用。
4.长链非编码RNAGAS5过表达质粒在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
5.如权利要求3或4中的应用，其特征在于，所述过表达质粒为重组病毒Adeno-GAS5-EGFP-3FLAG。
6.一种治疗骨骼系统疾病的分子标志物，其特征在于，所述标志物为长链非编码RNAGAS5。
7.一种骨质疏松症的诊断试剂盒，其特征在于，其包括权利要求6所述的分子标志物。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200825 |