CN113663056A - Tnfsf15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法 - Google Patents
Tnfsf15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种TNFSF15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法,属于医药技术领域,在该用途中,TNFSF15蛋白能够作为淋巴细胞免疫增强剂,促进B细胞、CD8+T细胞等淋巴免疫细胞浸润肿瘤,促进抗肿瘤免疫应答、抑制肿瘤生长;TNFSF15还通过激活NF‑κB信号,促进B细胞的增殖、活化表达ICOSL,进而促进CD8+T细胞分泌GZB发挥肿瘤杀伤作用;同时,PI3K信号通路参与TNFSF15促进CD8+T细胞分泌GZB;本发明对免疫疗法的体外扩增和T细胞杀伤性激活有显著的作用,为肿瘤的免疫疗法提供了更多的可能。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,特别是涉及一种TNFSF15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法。
背景技术
肿瘤的发生、发展和转移是受多种因素调控的复杂过程,因此,肿瘤的治疗成为极大的难题。肿瘤的治疗方式中,免疫疗法因其治愈效率高、无明显的毒副作用、患者耐受性好、促进机体免疫系统恢复等方面的显著优势而在肿瘤治疗中备受青睐。免疫疗法中的抗体常在血清中发挥抗肿瘤作用,但所有由B细胞产生的抗体都可以改变其抗原靶标在癌细胞上的功能,通过树突状细胞呈递和交叉呈递肿瘤抗原调节肿瘤细胞以激活补体级联,帮助NK细胞介导的肿瘤杀伤或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。B细胞在不同类型的肿瘤中所占的比例可能高达25-40%。B细胞生物学的研究多关注于在免疫方面的体液免疫,参与抗原提呈和产生抗体,而其在免疫治疗中的作用往往被忽视。但实际上B细胞在功能上既可以是效应细胞,也可以是调控细胞。目前,在肿瘤方面B细胞的研究也还极具争议性,它可以促进肿瘤发展,也可以促进免疫治疗。因此,更好地了解B细胞和B细胞相关通路对于发展有效的癌症控制是必要的。然而,对在不同实体肿瘤中被发现的肿瘤浸润B细胞(tumor-infiltrating B lymphocytes,TIBs)的功能还并不清晰,主要原因是肿瘤浸润B细胞的定位受肿瘤微环境内的信号或刺激高度控制。
肿瘤坏死因子超家族成员15(Tumor necrosis factor superfamily-15,TNFSF15,又称TL1A),是一种主要由成熟血管内皮细胞分泌的血管生长抑制因子。研究发现它不仅是一种血管负调控因子,能够抑制肿瘤内血管新生和肿瘤生长;还可作为一种免疫激活剂,促进T细胞活化和树突状细胞成熟。目前,尚未有关于TNFSF15调控B细胞和T细胞发挥抗肿瘤效应方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种TNFSF15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法,以解决上述现有技术存在的问题,通过TNFSF15精准调控B细胞的功能,激活T细胞促进肿瘤免疫发挥抗肿瘤效应。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种TNFSF15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地,所述淋巴细胞包括B细胞和T细胞。
进一步地,将治疗有效量的TNFSF15蛋白与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物。
本发明还提供一种体外调控骨髓细胞分化淋巴细胞的方法,包括骨髓细胞在含有TNFSF15蛋白的培养基中进行培养的步骤。
进一步地,所述TNFSF15蛋白在培养基中的浓度为3μg/mL。
进一步地,所述方法具体包括如下步骤:将骨髓细胞于孵育培养箱中培养1h后,培养条件为37℃,5%CO2,加入含TNFSF15蛋白的培养基中,培养72h。
本发明还提供一种用于体外分化骨髓细胞的培养基,所述培养基中包括TNFSF15蛋白。
进一步地,所述培养基中TNFSF15蛋白的浓度不高于5μg/mL。
进一步地,所述培养基的组成为:RPMI 1640+10%FBS+3μg/mL TNFSF15蛋白。
进一步地,所述培养基中还含有1%青链霉素混合液。
本发明公开了以下技术效果:
1.本发明通过TNFSF15激活B细胞和T细胞抑制肿瘤生长。具体如下:
1)TNFSF15能够促进B细胞、CD8+T细胞等免疫细胞浸润肿瘤,促进抗肿瘤免疫应答、抑制肿瘤生长。本发明对肿瘤的免疫治疗和过继治疗提供了更多的可能和指导意义。
2)TNFSF15通过激活NF-κB信号,促进B细胞的增殖、活化表达ICOSL,进而促进CD8+T细胞分泌GZB发挥肿瘤杀伤作用。同时,PI3K信号通路参与TNFSF15促进CD8+T细胞分泌GZB。本发明对免疫疗法的体外扩增和T细胞杀伤性激活有显著的作用,为肿瘤的免疫疗法提供了更多的可能。
2.本发明通过构建骨髓移植荷瘤小鼠模型分析了TNFSF15调控骨髓细胞参与肿瘤的发展的作用及机制。具体如下:
1)TNFSF15上调荷瘤小鼠骨髓中的淋巴细胞,这对骨髓细胞浸润肿瘤发挥免疫效应具有调控作用。
2)促进红色荧光(td-Tomato+)骨髓源B细胞、T细胞浸润肿瘤组织。
3)TNFSF15通过NF-κB引起的骨髓细胞向B细胞的分化及其ICOSL的表达。
4)TNFSF15促进骨髓细胞分化为CD8+T细胞和CD4+T细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为TNFSF15刺激淋巴细胞基因的表达;(A-B)qPCR检测淋巴细胞增殖基因ccnb1和bub1的mRNA水平;(C-E)qPCR检测淋巴细胞免疫促进基因fasl、icos和icosl的mRNA水平;数据为mean±SD,n=3;*P<0.05,**P<0.01,统计学方法为双尾Student’s t-test;
图2为TNFSF15对B细胞的增殖(A,B220&CD19)和激活(B,B220&ICOSL)的调控;数据为mean±SD,n=3;***P<0.001(TNFSF15处理组与Vehicle对照组相比较);###P<0.001(抑制剂+TNFSF15组与Medium+TNFSF15组相比较);统计学方法为双尾Student’s t-test;PDTC:NF-κB抑制剂;
图3为TNFSF15在不同抗体或抑制剂中激活T细胞(CD8&GZB)的比例;数据为mean±SD,n=3;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(TNFSF15处理组与Vehicle对照组相比较);#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001(抑制剂+TNFSF15组与Medium+TNFSF15组相比较);统计学方法为双尾Student’s t-test;α-ICOSL:ICOSL中和抗体;Wortmannin:PI3K抑制剂;GZB:颗粒酶B;
图4为TNFSF15促进B细胞和CD8+T细胞浸润LLC肿瘤并抑制肿瘤生长;(A)肿瘤中B细胞的浸润及B细胞在肿瘤中的比例统计;(B)检测CD8+T细胞浸润肿瘤及CD8+T细胞浸润肿瘤的比例统计;(C)肿瘤体积监测曲线;(D)第19天肿瘤的重量;数据为mean±SD,n=5;*p<0.05,**p<0.01,统计学方法为双尾Student’s t-test;
图5为TNFSF15促进肿瘤组织中的B细胞和T细胞的活化;(A)对照组和TNFSF15处理组中的B细胞表达ICOSL;(B)统计ICOSL+B细胞在肿瘤组织中的比例;(C)对照组和TNFSF15处理组中的CD8+T细胞表达GZB;(D)统计CD8+GZB+T细胞在肿瘤组织中的比例;(E)对照组和TNFSF15处理组肿瘤中的CD4+T细胞表达T-bet;(F)统计CD4+T-bet+T细胞在肿瘤组织中的比例;(G)对照组和TNFSF15处理组肿瘤中的CD8+T细胞表达IFN-γ;(H)统计CD8+IFN-γ+T细胞在肿瘤组织中的比例;数据为mean±SD,n=5;*P<0.05,**P<0.01,统计学方法为双尾Student’s t-test;
图6为TNFSF15促进骨髓细胞浸润肿瘤;(A)红色荧光td-Tomato+骨髓源细胞浸润肿瘤的比例;(B)统计图红色荧光td-Tomato+骨髓源细胞在肿瘤中的比例;数据为mean±SD,n=7;*P<0.05,**P<0.01,统计学方法为双尾Student’s t-test;
图7为骨髓移植荷瘤小鼠的肿瘤组织,免疫荧光共定位骨髓源细胞和B细胞;绿色:B220(TNFSF15处理促进数量增多);红色:td-BMC(TNFSF15处理促进数量增多);蓝色:DAPI(TNFSF15处理促进merge数量增多);比例尺:20μm;td-BMC:td-Tomato+骨髓细胞;
图8为肿瘤组织内部、肿瘤边缘组织、肿瘤外周组织中CD8+T细胞和td-Tomato+骨髓源细胞的共定位情况;绿色:CD8(TNFSF15处理促进肿瘤内部和边缘数量增多);红色:td-BMC(TNFSF15处理促进肿瘤内部和边缘数量增多);蓝色:DAPI(TNFSF15处理促进肿瘤内部和边缘merge数量增多);比例尺:20μm;td-BMC:td-Tomato+骨髓细胞;
图9为骨髓细胞分化为B细胞及ICOSL+B细胞;(A)在Vehicle或TNFSF15作用下,骨髓细胞分化为B细胞;(B)在含NF-κB抑制剂的Vehicle或TNFSF15条件下,骨髓细胞分化为B细胞;(C)在Vehicle或TNFSF15作用下(NF-κB抑制剂刺激或不刺激细胞),骨髓细胞分化为B细胞的统计;(D)在Vehicle或TNFSF15作用下,骨髓细胞分化为ICOSL+B细胞;(E)在含NF-κB抑制剂的Vehicle或TNFSF15条件下,骨髓细胞分化为ICOSL+B细胞;(F)在Vehicle或TNFSF15作用下(NF-κB抑制剂刺激或不刺激细胞),骨髓细胞分化为ICOSL+B细胞的统计;数据为mean±SD,n=3;*P<0.05,**P<0.01(TNFSF15处理组与Vehicle对照组相比较);#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001(抑制剂+TNFSF15组与Medium+TNFSF15组相比较);统计学方法为双尾Student’s t-test;PDTC:NF-κB抑制剂;
图10为骨髓细胞分化为CD8+T细胞和CD4+T细胞;(A)在TNFSF15或Vehicle作用下,骨髓细胞分化为CD8+T细胞;(B)骨髓细胞分化为CD8+T细胞的比例统计;(C)在Vehicle或TNFSF15作用下,骨髓细胞分化为CD4+T细胞;(D)骨髓细胞分化为CD4+T细胞的比例统计;数据为mean±SD,n=3;*P<0.05,**P<0.01;统计学方法为双尾Student’s t-test。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明提供了TNFSF15在肿瘤浸润B、T细胞中的调控影响,特别是B、T细胞的共激活、迁移、浸润及其来源分化在促进肿瘤免疫应答中的用途。
TNFSF15由专利CN107541536A公开,本发明从大肠杆菌中成功纯化得到重组蛋白TNFSF15(TNFSF15-192a),蛋白分子量大小约为23kDa。经过纯化、透析复性等过程,提取纯度非常高的目的蛋白。MTT方法证明TNFSF15能显著抑制内皮细胞的生长存活,证明TNFSF15具有良好的生物活性。
通过淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞,经TNFSF15的体外刺激后,分析淋巴细胞。
实施例1TNFSF15能够促进淋巴细胞的增殖和活化
将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板,每孔5×106个细胞,3mL培养基(含15%FBS,1%青链霉素混合液(100X)(Penicillin-Streptomycin Solution)双抗的RPMI 1640)。3μg/mL TNFSF15刺激细胞,对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。qPCR检测淋巴细胞的增殖(细胞周期素B1基因ccnb1;有丝分裂检测点丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BUB1基因bub1)和活化(Icos、Icosl和Fasl基因)情况。流式细胞术分析,结果如图1所示,表明TNFSF15刺激显著促进淋巴细胞增殖基因ccnb1和bub1,以及淋巴细胞免疫促进基因fasl、icos和icosl的mRNA表达的升高。
实施例2TNFSF15通过NF-κB促进B细胞的增殖和激活
将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板,每孔5×106个细胞混合癌细胞2×105个,3mL培养基(2mL含15%FBS,1%双抗的RPMI 1640+15%FBS,1%双抗的高糖DMEM)。3μg/mLTNFSF15刺激细胞,对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。
共培养用的癌细胞(LLC)在混合淋巴细胞前,37℃CFSE孵育10min,加入40%FBS冰浴10min,终止反应。加PBS洗两次,弃上清,培养基重悬细胞。
抑制剂NF-κB(1μM)、PI3K(1μM)提前刺激免疫细胞1h后,加入含3μg/mL TNFSF15或Vehicle的癌细胞。
ICOSL中和抗体(10μg/mL),37℃预孵育淋巴细胞2h,加入含3μg/mL TNFSF15或缓冲液的癌细胞。
细胞置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养72h。
收集细胞,PBS洗一次,加PI染色死细胞。PBS洗涤,PBS重悬细胞,过300目细胞筛网,流式分析检测癌细胞的死亡情况和淋巴细胞增殖、活化。
结果如图2所示,表明TNFSF15显著促进B220+CD19+双阳性B细胞以及B220+ICOSL+双阳性B细胞的百分比,表明TNFSF15促进了B细胞增殖和活化;当用NF-κB的抑制剂PDTC处理时,显著抑制B220+CD19+双阳性B细胞以及B220+ICOSL+双阳性B细胞的百分比,表明TNFSF15通过NF-κB信号促进B细胞增殖和活化。
实施例3TNFSF15通过ICOSL和PI3K激活T细胞发挥肿瘤杀伤作用
将分离出的脾脏淋巴细胞加入6孔板,每孔5×106个细胞混合癌细胞2×105个,3mL培养基(2mL含15%FBS,1%双抗的RPMI 1640+15%FBS,1%双抗的高糖DMEM)。3μg/mLTNFSF15刺激细胞,对照组加入相应体积的缓冲液作为Vehicle。
共培养用的癌细胞(LLC)在混合淋巴细胞前,37℃CFSE孵育10min,加入40%FBS冰浴10min,终止反应。加PBS洗两次,弃上清,培养基重悬细胞。
抑制剂NF-κB(1μM)、PI3K(1μM)提前刺激免疫细胞1h后,加入含3μg/mL TNFSF15或Vehicle的癌细胞。
ICOSL中和抗体(10μg/mL),37℃预孵育淋巴细胞2h,加入含3μg/mL TNFSF15或缓冲液的癌细胞。
细胞置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中培养72h。
收集细胞,PBS洗一次,加PI染色死细胞。PBS洗涤,PBS重悬细胞,过300目细胞筛网,流式分析检测淋巴细胞增殖、活化。
结果如图3所示,表明TNFSF15能显著促进CD8+GZB+双阳T细胞的百分比,表明TNFSF15促进了CD8+T细胞增殖和活化;当用ICOSL中和抗体或PI3K的抑制剂Wortmannin处理时,显著抑制CD8+GZB+双阳性T细胞的百分比,表明TNFSF15通过ICOSL和PI3K激活T细胞。
实施例4TNFSF15体内调控B细胞和T细胞抗肿瘤
LLC(Lewis Lung Cancer)荷瘤小鼠模型:在培养皿中的汇合度达到80%时,进行传代处理。消化成单悬细胞后,离心收集细胞,10倍体积PBS洗两次。最后弃去PBS,加无血清无双抗的基础培养基,浆细胞重悬至3×106mL-1的细胞悬液。在6-8周的C57BL/6小鼠右后腿的皮下接种细胞,每只小鼠100μL上述细胞悬液。
肿瘤接种时间第四天,肿瘤能够被肉眼观察到时,将小鼠随机分配成两组,进行瘤旁给药。每隔两天给一次药并监测小鼠体重和肿瘤体积(游标卡尺测量最长和最短直径)。分别于肿瘤接种后的第19天和第30天收取肿瘤组织。
实验组:每只鼠瘤旁注射5mg/kg TNFSF15;对照组:每只鼠瘤旁注射等体积的缓冲液(Vehicle)。
肿瘤体积(mm3)=L×W×W/2;其中,L代表肿瘤最长的直径,W代表肿瘤最短的直径。
流式检测分析细胞
为获取单悬细胞,我们均匀地取肿瘤组织的一半,尽可能剪碎,加入提前配置好放置在4℃冰箱的肿瘤组织消化液(1:5,g:mL)。
肿瘤组织消化液:20mg胶原酶Ⅳ(1mg/mL),2mg/mL透明质酸酶(0.1mg/mL),0.1μLDNaseⅠ(5μU/mL)溶于20mL含钙镁的Hank缓冲液中。37℃水浴锅加热,30min;或4℃,过夜(约16h),中间不断摇晃消化液使组织尽可能充分被消化成单悬细胞。加10%FBS终止消化,4℃,400g离心5min。加入含2%FBS和1%双抗的培养液重悬组织。注射器橡胶头在200目细胞筛网上研磨组织,注意避免组织长时间脱水。将细胞液转移至离心管中,4℃,400g离心5min,收集细胞。含2%FBS、1%双抗和0.5μM EDTA(pH 8.0)的培养液重悬细胞,4℃存放备用。
将准备好的肿瘤单悬细胞,均分到1.5mL EP管中,每管约含5×106个细胞,PBS洗一次,400g,5min,离心弃上清。加入100μL稀释好的抗体。冰上30min,加十倍体积的PBS洗一次,400g,5min,离心弃上清。加流式200μL固定液(4%多聚甲醛)重悬混匀细胞。上机分析前过300目的细胞筛网。
如果抗体无荧光,需要在一抗孵育完,PBS洗过后,加相应的荧光二抗,室温,20min。
抗体ICOSL的流式染色,先孵育ICOSL的荧光二抗后,再孵育其他荧光直标的抗体。
胞内抗体流式染色:流式固定剂(PBS稀释至1×)在室温下固定细胞20-60min,PBS洗一次,弃上清。将抗体使用透膜剂(蒸馏水稀释至1×),室温染色20min,PBS洗一次,弃上清。PBS重悬细胞,上机分析前过300目的细胞筛网。
核内抗体流式染色:流式核膜固定剂(固定透膜剂+稀释液,1:3)在室温下固定细胞20-60min,PBS洗一次,弃上清。将抗体使用固定剂透膜剂(蒸馏水稀释至1×),室温染色20min,PBS洗一次,弃上清。PBS重悬细胞,上机分析前过300目的细胞筛网。
结果如图4-5所示,表明TNFSF15能够促进LLC肿瘤内B220+CD19+双阳性B细胞以及CD8+CD45+双阳T细胞的百分比,并显著抑制LLC肿瘤体积和重量,表明TNFSF15促进B细胞和CD8+T细胞浸润肿瘤并抑制LLC肿瘤生长;TNFSF15也能促进LLC肿瘤内B220+ICOSL+双阳性B细胞、CD8+GZB+双阳T细胞、CD4+T-bet+双阳T细胞和CD8+GFN-B+双阳T细胞的百分比,表明TNFSF15能通过促进肿瘤中B细胞和T细胞的活化,发挥抗肿瘤作用。
实施例5TNFSF15促进骨髓源B、T细胞浸润肿瘤
1)在无菌条件下,取6~8周的C57BL/6雄鼠的胫骨和股骨,无菌纱布剥离肌肉组织,将骨头放在PBS中。
1mL无菌注射器将骨髓冲到含2%FBS的PBS中,反复吹打使细胞尽可能分散为单悬细胞。过300目无菌细胞筛网,400g,离心5min,弃上清。
十倍体积PBS洗一次,400g,离心5min,弃上清。
两只鼠的骨髓细胞加1mL ACK红细胞裂解液,吹打混匀,冰上5min。加入十倍体积的含10%FBS的PBS,400g,离心5min,弃上清。含10%FBS的RPMI 1640重悬细胞,备用。
2)构建td-Tomato+骨髓细胞移植模型小鼠,具体如下:
选择8-10周(体重为20-22g)的C57BL/6雌鼠作为骨髓移植模型受体小鼠。9.0GyCs137放射(时间约10min)。放射六小时后,尾静脉注射6-8周td-Tomato+荧光C57BL6雄鼠的红色荧光(td-Tomato+)骨髓细胞。受体小鼠需td-Tomato+骨髓细胞约5×106个细胞。随后观察两周,如果小鼠体重都在18g以上且状态良好,即骨髓移植模型构建成功。
流式分析td-Tomato+骨髓细胞在外周血和骨髓中的比例。td-Tomato在流式中的通道为PE(激发光:488nm;发射光:561nm)。
3)皮下移植瘤LLC模型小鼠的构建
LLC细胞的完全培养基是含有10%胎牛血清,1%双抗的高糖DMEM。培养条件:37℃,5%CO2的恒温孵育培养箱。
显微镜下观察细胞,待LLC细胞在培养皿中的汇合度达80%时进行传代(1:3)。自细胞株复苏后,传代3-10次间的细胞可用于实验或冻存。传代细胞时,首先,移除培养皿中的培养基,无菌的PBS(10cm细胞培养皿加4mL)洗细胞进行清洗一次,弃去PBS。加入胰酶消化液(10cm细胞培养皿加2mL),将加入胰酶的培养皿置于37℃培养箱2min,10%FBS培养基将消化成单悬细胞的肿瘤细胞在10倍体积PBS中洗三次,200g,5min,弃上清,加入无血清无双抗的培养基重悬细胞至5×106mL-1。每只小鼠(接受骨髓细胞移植两周后)皮下接种100μL上述重悬的细胞。
肿瘤接种时间第四天,肿瘤能够被肉眼观察到时,将小鼠随机分配成两组,进行瘤旁给药。每隔两天给一次药并监测小鼠体重和肿瘤体积(游标卡尺测量最长和最短直径)。分别于肿瘤接种后的第19天和第30天收取肿瘤组织。
实验组:每只鼠瘤旁注射5mg/kg TNFSF15;对照组:每只鼠瘤旁注射等体积的缓冲液(Vehicle)。
肿瘤体积(mm3)=L×W×W/2;其中,L代表肿瘤最长的直径,W代表肿瘤最短的直径。
4)流式检测分析
为获取单悬细胞,均匀地取肿瘤组织的一半,尽可能剪碎,加入提前配置好放置在4℃冰箱的肿瘤组织消化液(1:5,g:mL)。
肿瘤组织消化液:20mg胶原酶Ⅳ(1mg/mL),2mg/mL透明质酸酶(0.1mg/mL),0.1μLDNaseⅠ(1μU/mL)溶于20mL含钙镁的Hank缓冲液中。37℃水浴锅加热,30min;或4℃,过夜(约16h),中间不断摇晃消化液使组织尽可能充分被消化成单悬细胞。加10%FBS终止消化,4℃,400g离心5min。加入含2%FBS和1%双抗的培养液重悬组织。注射器橡胶头在200目细胞筛网上研磨组织,注意避免组织长时间脱水。将细胞液转移至离心管中,4℃,400g离心5min,收集细胞。含2%FBS、1%双抗和0.5μM EDTA(pH 8.0)的培养液重悬细胞,4℃存放备用。
将准备好的肿瘤单悬细胞,均分到1.5mL EP管中,每管约含5×106个细胞,PBS洗一次,400g,5min,离心弃上清。加入100μL稀释好的抗体。冰上30min,加十倍体积的PBS洗一次,400g,5min,离心弃上清。加流式200μL固定液(4%多聚甲醛)重悬并混匀细胞。上机分析前过300目的细胞筛网。
如果抗体无荧光,需要在一抗孵育完,PBS洗过后,加相应的荧光二抗,室温,20min。
抗体ICOSL的流式染色,先进行,孵育ICOSL的荧光二抗后,再孵育其他荧光直标的抗体。
胞内抗体流式染色:流式固定剂(PBS稀释至1×)在室温下固定细胞20-60min,PBS洗一次,弃上清。将抗体使用透膜剂(蒸馏水稀释至1×),室温染色20min,PBS洗一次,弃上清。PBS重悬细胞,上机分析前过300目的细胞筛网。
核内抗体流式染色:流式核膜固定剂(固定透膜剂+稀释液,1:3)在室温下固定细胞20-60min,PBS洗一次,弃上清。将抗体使用固定剂透膜剂(蒸馏水稀释至1×),室温染色20min,PBS洗一次,弃上清。PBS重悬细胞,上机分析前过300目的细胞筛网。
5)用于组织形态、免疫荧光、免疫组化分析细胞的表达
将肿瘤组织置于10倍体积的4%多聚甲醛中,4℃固定24h。自来水轻轻地冲洗5min,将组织置于30%蔗糖水溶液中,4℃脱水12h。避免过度固定和过度脱水而影响组织样本的蛋白和结构。冰冻切片OCT包埋剂完全包埋组织后,于液氮表面快速冷冻组织样本。冰冻后的样本置于-80℃超低温冰箱保存、备用。
切片恢复至室温。-20℃下,冰甲醇(-20℃预冷)固定切片组织20min。自来水缓慢水流冲洗5min,注意避免破坏组织切片。
PAP笔画防水圈,为后续孵育抗体做准备。注意防水圈不能太小,以免抗体挥发。每个防水圈内的组织内需要大约30-50μL液体。
PBST稀释Triton-X100(0.25%),室温,30min。PBST洗3次,每次5min。
轻甩片子,滤纸吸走多余液体。防水圈明显成闭合的包围组织时,向防水圈内滴加5%BSA(PBST稀释)封闭非特异性抗原,置于湿盒内,室温,1h。
甩干,勿洗。向防水圈内滴加稀释好的抗体,使组织被完全覆盖。置于湿盒内,4℃,过夜(或者37℃,1h)。
PBST洗三次,每次5min。
向防水圈内滴加稀释好的荧光二抗,室温孵育,2h。PBST洗三次,每次5min。
封片:滤纸吸走多余液体,滴加抗荧光淬灭封片剂(每张片子约20μL),轻压盖玻片,注意避免气泡出现和组织完全干裂。
共聚焦显微镜镜下观察目标抗体在组织中的表达及定位。
结果如图6-8所示,表明TNFSF15促进td-Tomato+骨髓源细胞在肿瘤中的比例;TNFSF15也能促进B220+B细胞及td-Tomato+骨髓源B细胞浸润肿瘤;TNFSF15促进CD8+T细胞及td-Tomato+骨髓源CD8+T细胞浸润肿瘤。
实施例6TNFSF15在调控骨髓细胞分化B细胞和活化中的作用
培养基:RPMI 1640+10%FBS+1%双抗。
培养条件:37℃,5%CO2的恒温孵育培养箱。
12孔板,每孔加入106个细胞,TNFSF15(3μg/mL)刺激72h。
抑制剂组:抑制剂NF-κB(1μM)和细胞预孵育1h,37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15),37℃,72h。
中和抗体组:ICOSL中和抗体(10μg/mL)和细胞预孵育2h,37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15),37℃,72h。
收取细胞,PBS洗涤,流式染色分析B220+和ICOSL+B220+细胞。
结果如图9所示,表明TNFSF15能促进骨髓细胞分化B220+的B细胞的百分比,以及促进骨髓细胞分化为B220+ICOSL+双阳性活化B细胞的百分比,表明TNFSF15促进了骨髓细胞向B细胞的分化和活化;当用NF-κB的抑制剂PDTC处理时,显著抑制骨髓细胞向B220+阳性B细胞以及B220+ICOSL+双阳性B细胞分化的百分比,表明TNFSF15通过NF-κB信号促进骨髓细胞向B细胞分化和活化。
实施例7TNFSF15在调控骨髓细胞分化T细胞的作用
培养基:RPMI 1640+10%FBS+1%双抗。
培养条件:37℃,5%CO2的恒温孵育培养箱。
12孔板,每孔加入106个细胞,TNFSF15(3μg/mL)刺激72h。
抑制剂组:抑制剂NF-κB(1μM)和细胞预孵育1h,37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15),37℃,72h。
中和抗体组:ICOSL中和抗体(10μg/mL)和细胞预孵育2h,37℃。之后加入相应的培养基(含Vehicle或TNFSF15),37℃,72h。
收取细胞,PBS洗涤,流式染色分析CD4+和CD8+细胞比例。
结果如图10所示,表明TNFSF15增加了骨髓细胞CD8+T细胞和CD4+T细胞的百分比,表明TNFSF15能促进骨髓细胞向CD8+和CD4+T细胞的分化。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.TNFSF15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述淋巴细胞包括B细胞和T细胞。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,将治疗有效量的TNFSF15蛋白与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物。
4.一种体外调控骨髓细胞分化淋巴细胞的方法,其特征在于,包括骨髓细胞在含有TNFSF15蛋白的培养基中进行培养的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述TNFSF15蛋白在培养基中的浓度为3μg/mL。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述方法具体包括如下步骤:将骨髓细胞于孵育培养箱中培养1h后,培养条件为37℃,5%CO2,加入含TNFSF15蛋白的培养基中,培养72h。
7.一种用于体外分化骨髓细胞的培养基,其特征在于,所述培养基中包括TNFSF15蛋白。
8.根据权利要求7所述的用于体外分化骨髓细胞的培养基,其特征在于,所述培养基中TNFSF15蛋白的浓度不高于5μg/mL。
9.根据权利要求7所述的用于体外分化骨髓细胞的培养基,其特征在于,所述培养基的组成为:RPMI 1640+10%FBS+3μg/mL TNFSF15蛋白。
10.根据权利要求7所述的用于体外分化骨髓细胞的培养基,其特征在于,所述培养基中还含有1%青链霉素混合液。
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