CN116036242A - Tnfsf15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途，属于医药技术领域。在所述用途中，TNFSF15蛋白促进了髓系源周细胞向肿瘤血管的募集并促进了肿瘤血管正常化，抑制了肿瘤血管新生与肿瘤血管出血渗漏，最终抑制了肿瘤的生长，可为肿瘤的抗血管治疗与血管正常化治疗肿瘤提供新的思路和理论基础。

Description

TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途。

背景技术

由于肿瘤细胞的恶性增殖，使肿瘤组织处于低氧和营养不足的状态，造成了肿瘤血管的高度异质性，既包含高血管密度区又有低血管密度区，且由于血管壁细胞的不充分包被与血管本身的不成熟，肿瘤血管展现出一种扩张弯曲和无序的畸形混乱的不成熟与渗漏的功能异常的血管，这种结构与功能异常的肿瘤血管又造成了恶性肿瘤的迁移与恶性的维持。

这种处于紊乱混沌状态的具有高度渗漏特性的畸变的肿瘤血管，导致血液输送的营养物质和氧气的不足，进而导致肿瘤缺氧，处于低氧状态，而低氧肿瘤对传统的靶向积极分裂细胞的化学治疗和放射治疗常常会产生耐药性和抗性，这也是现今肿瘤治疗效果不佳和不良预后的主要原因。虽然抗肿瘤血管新生治疗在临床上已经取得一些成功，但在促结缔组织增生的硬纤维瘤和少血管的肿瘤中，抗血管新生治疗由于肿瘤本身的固有耐药性而不是一直有效，反而促进了肿瘤的增生和转移的特性。

在抗VEGF治疗的过程中，肿瘤血管出现暂时正常化，血管周细胞包被增多，在Lewis肺癌、RIP-Tag-2肿瘤和其他肿瘤模型中，阻断VEGF信号可以通过触发肿瘤中血管生成素-1(Ang-1)的增加来促进周细胞的招募。在贝伐单抗(Bevacizumab)治疗胶质母细胞瘤时，由于血管的正常化而引起的脑水肿的减少是治疗效果较好的一个重要的原因，西地尼布(Cediranib)单一疗法治疗复发性脑胶质瘤时，发现肿瘤血管大小和渗透性的减少的血管正常化现象，病人对放射治疗更敏感出现了六个月无进展生存期；在动物实验中，通过促进血管周细胞包被使肿瘤血管正常化，Angiopoietin-1(Ang1)治疗的HT29肿瘤生长得到了抑制。KRAS突变型胰腺导管腺癌小鼠模型中，MEK和CD4/6抑制治疗后导致了肿瘤的血管重塑和药物输送效率的提高及T细胞的浸润。

肿瘤的免疫治疗会通过促进肿瘤血管的正常化而促进肿瘤的放疗疗效，肿瘤血管正常化与肿瘤血管的抗血管生成治疗与肿瘤的免疫治疗具有不同的反应靶点，药物联用可以达到增强治疗效果的作用，因此，肿瘤血管正常化在以后治疗肿瘤的过程种会发挥重要的作用。

TNFSF15是肿瘤坏死超家族中的一员，能显著抑制多种动物移植瘤的生长且在免疫炎症，抑制肿瘤血管新生等方面发挥抗癌抑癌的作用。在抗肿瘤血管治疗中，作为血管新生抑制因子，TNFSF15可以促进内皮细胞凋亡，抑制内皮祖细胞向肿瘤部位的募集抑制其向内皮细胞分化而发挥了抑制血管新生的作用，作为抗血管新生治疗的靶点。但目前尚未有TNFSF15对肿瘤血管正常化影响的相关研究。

发明内容

有鉴于此，针对上述现有技术的不足，本发明提出了一种TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途。所述TNFSF15蛋白能促进髓系源周细胞向肿瘤血管的募集与包被，可促进肿瘤血管正常化，抑制肿瘤血管新生与肿瘤血管出血渗漏，进而抑制肿瘤的生长，可为肿瘤的抗血管治疗与血管正常化治疗肿瘤提供新的思路和治疗手段。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一方面提供了TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途。

优选地，所述TNFSF15蛋白通过增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集促进肿瘤血管正常化。

优选地，所述周细胞为髓源性周细胞。

优选地，TNFSF15蛋白还促进髓系CD11b⁺细胞向肿瘤微环境中的募集，并促进髓系CD11b⁺细胞在肿瘤中向周细胞的分化。

TNFSF15蛋白可促进髓源性细胞在肿瘤中向周细胞的分化，同时可增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集，促进肿瘤血管正常化，抑制肿瘤血管新生与肿瘤血管出血渗漏，最终抑制肿瘤的生长。

本发明的第二方面提供了TNFSF15蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途，所述TNFSF15蛋白作为增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集的细胞因子，促进肿瘤血管正常化，进而抑制肿瘤生长。

优选地，TNFSF15蛋白与抗血管新生治疗和/或免疫治疗药物联用，可提高肿瘤治疗效果，减弱治疗肿瘤过程中的耐药性。

本发明的第三方面提供了TNFSF15蛋白在制备提高骨髓移植效率的药物中的用途。

优选地，所述骨髓移植为骨髓移植治疗白血病。

优选地，TNFSF15提高荷瘤小鼠骨髓移植效率，给药浓度为5mg/kg。

TNFSF15蛋白可提高荷瘤小鼠骨髓移植效率，对治疗白血病等疾病具有重要的意义。

本发明的第四方面提供了一种建立荷瘤小鼠的骨髓移植以追踪细胞分化发育的动物模型的方法，包括1)对受体小鼠进行全身γ射线照射；2)进行供体小鼠的骨髓移植，受体小鼠尾静脉注射供体骨髓细胞；3)骨髓移植完成后，给予受体小鼠移植荷瘤；4)对荷瘤小鼠进行TNFSF15蛋白给药处理。

优选地，受体小鼠的γ射线全身照射条件为：先进行4Cs¹³⁷ 4.5Gry全身照射5min，6h后再次进行全身γ射线照射，照射剂量为4Cs¹³⁷ 5.0Gry，5min。

优选地，受体小鼠为C57BL/6J小雌鼠，10周龄，体重大于20g；供体小鼠为8周龄红色B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-Tdtomato)HZE}/J小雄鼠。

优选地，受体小鼠全身γ射线照射完成六小时后进行骨髓移植。

优选地，受体小鼠尾静脉注射1×10⁷个供体骨髓细胞。

优选地，骨髓移植两周后进行荷瘤。

优选地，TNFSF15蛋白的给药浓度为5mg/kg。

优选地，肿瘤为小鼠Lewis肺癌(LLC)和小鼠结直肠癌(MC38)。

具体的，将受体C57BL/6J小雌鼠(10周龄，体重需大于20g)进行全身γ射线照射，照射条件为，先进行4Cs¹³⁷ 4.5Gry全身照射5分钟，六小时后再次进行全身γ射线照射，照射剂量为4Cs¹³⁷ 5.0Gry，5分钟；

照射完成六小时后，进行供体为8周龄红色B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG -Tdtomato)HZE}/J小雄鼠的骨髓移植，每只受体小鼠尾静脉注射1×10⁷个供体骨髓细胞；

骨髓移植完成两周后，给予受体小鼠后背臀部皮下注射移植荷瘤，每只小鼠注射的细胞量为1×10⁶个LLC细胞/200μL或1×10⁷个MC38细胞/200μL。

小鼠肿瘤体积约50mm³时，对小鼠进行接受TNFSF15重组蛋白给药处理，5mg/kgTNFSF15瘤旁皮下注射给药，隔天给药，期间测量观察小鼠肿瘤生长大小与小鼠体重，给药21天后收取肿瘤组织样品。

本发明的第五方面提供了通过所述方法建立的荷瘤小鼠的骨髓移植以追踪细胞分化发育的动物模型。

相对于现有技术，本发明所述的TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途具有以下优势：

(1)本发明所述的TNFSF15蛋白能促进髓系源细胞向肿瘤微环境中的募集，促进髓源性细胞在肿瘤中向周细胞的分化，同时可增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集，促进肿瘤血管正常化，提高肿瘤血管的灌注能力，抑制肿瘤血管新生与肿瘤血管出血渗漏；与抗血管新生治疗和/或免疫治疗的联合用药进而提高肿瘤的放化疗的治疗效果、减弱治疗肿瘤过程中的耐药性，达到治疗肿瘤的目的提供新的治疗思路和治疗方案；

(2)本发明所述的TNFSF15蛋白可以提高荷瘤小鼠骨髓移植效率，为骨髓移植治疗白血病提供了一定的理论基础，具有很广的应用前景。

附图说明

图1为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，肿瘤的生长情况；其中，A为动物模型设计与实验操作模式图，B为Vehicle组与TNFSF15组的肿瘤样品图，C为LLC肿瘤体积的折线统计图，D为LLC肿瘤重量的柱形统计图，E为小鼠体重的折线统计图；

图2为TNFSF15蛋白处理骨髓移植MC38荷瘤小鼠后，肿瘤的生长情况；其中，A为动物模型设计与实验操作模式图，B为Vehicle组与TNFSF15组的肿瘤样品图，C为小鼠体重的折线统计图，D为MC38肿瘤重量的柱形统计图，E为MC38肿瘤体积的折线统计图；

图3为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，骨髓中td-tomato⁺细胞与CD11b⁺细胞的增殖情况；其中，A为流式检测骨髓中td-tomato⁺细胞与CD11b⁺细胞的比例与数量，B为A图数据的柱状统计图；

图4为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，LLC肿瘤中CD11b⁺细胞的增殖情况；其中，A为流式检测肿瘤中td-tomato⁺CD11b⁺细胞的增殖情况，B为A图数据的柱状统计图；

图5为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，LLC肿瘤中血管新生的情况；其中，A为流式检测Vehicle组与TNFSF15组的肿瘤中CD31⁺细胞的比例与数量，B为A图数据的柱状统计图，C为Vehicle组与TNFSF15组的肿瘤切片HE染色，D为Vehicle组与TNFSF15组的肿瘤切片中CD31的免疫荧光染色；

图6为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，LLC肿瘤中td-tomato⁺PDGFR-β⁺细胞的增殖情况；其中，A为流式检测LLC肿瘤中td-tomato⁺PDGFR-β⁺细胞的比例与数量，B为A图数据中td-tomato⁺PDGFR-β⁺细胞比例的柱状统计图，C为A图数据中td-tomato^-PDGFR-β⁺细胞比例的柱状统计图；

图7为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，免疫荧光检测LLC肿瘤血管中周细胞的包被情况；肿瘤的冰冻切片中，周细胞Marker PDGFR-β与血管内皮Marker CD31的免疫荧光共染色

图8为TNFSF15蛋白处理骨髓移植LLC荷瘤小鼠后，HE染色检测肿瘤血管的出血渗漏情况；其中，A为肿瘤的冰冻切片HE染色的全片扫描结果，B为代表肿瘤细胞组织结构形态和肿瘤细胞数量的肿瘤组织的冰冻切片HE染色的全片扫描结果的局部放大结果。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1TNFSF15对骨髓移植荷瘤小鼠的肿瘤生长的影响

1.骨髓移植小鼠的动物模型构建

(1)动物中心购买10周龄C57BL/6J受体小雌鼠，体重大于20g。

(2)受体小鼠检疫适应一周后进行γ射线全身照射，条件为：先进行4Cs1374.5Gry全身照射5min，6h后再次进行全身γ射线照射，照射剂量为4Cs137 5.0Gry，5min。

(3)用受体小鼠全身γ射线照射完成六小时后进行骨髓移植。

(4)供体小鼠为8周龄红色B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-Tdtomato)HZE/J小雄鼠。

(5)取供体小鼠的骨髓细胞，并稀释成1 108/mL的细胞浓度备用。

(6)受体小鼠尾静脉注射1 107个供体小鼠骨髓细胞。

(7)骨髓移植两周后进行荷瘤实验。

2.骨髓移植小鼠的荷瘤前准备

(1)用剃毛器剃去荷瘤部位的鼠毛以显示裸露的小鼠皮肤。

(2)用75％酒精擦拭已剃完毛准备荷瘤的部位。

3.骨髓移植小鼠的LLC荷瘤

(1)LLC细胞培养：LLC细胞在1640培养基(10％FBS+1％PS)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养扩养。

(2)LLC细胞悬液制备：LLC细胞数量培养至足够荷瘤实验时，胰酶消化细胞30s，用含血清1640培养基中和消化处理细胞，200×g，3min，PBS重悬以清洗细胞，200×g，3min，弃上清，PBS重悬细胞并计数，将LLC细胞重悬为1×10⁶个LLC细胞/100μL的细胞浓度。

(3)移植鼠荷瘤：取100μL LLC细胞悬液，注射于小鼠皮下组织，荷瘤部位会有鼓包出现，该步骤注意要点是鼓包要圆，各鼠之间鼓包大小无差异。

4.骨髓移植小鼠的MC38荷瘤

(1)MC38细胞培养：MC38细胞在DMEM培养基(10％FBS+1％PS)，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养扩养。

(2)细胞悬液制备：MC38细胞数量培养至足够荷瘤实验时，胰酶消化细胞30s，用含血清DMEM培养基中和消化处理细胞，400×g，3min，PBS重悬以清洗细胞，400×g，3min，弃上清，PBS重悬细胞并计数，将MC38细胞重悬为5×10⁶个MC38细胞/100μL的细胞浓度。

(3)移植鼠荷瘤：取200μL MC38细胞悬液，注射于小鼠皮下组织，荷瘤部位会有鼓包出现，该步骤注意要点是鼓包要圆，各鼠之间鼓包大小无差异。

5.骨髓移植荷瘤鼠肿瘤样品收取

(1)小鼠处死：100μL 4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，颈椎脱臼法处死小鼠，收取每只小鼠的骨髓与肿瘤样品，将样品置于冰上操作。

(2)肿瘤样品收取：将收取的肿瘤样品用PBS清洗至少三次，剔除周围结缔组织、脂肪组织、血液等，并按组整理拍照，观察记录肿瘤体积大小，称量记录各个肿瘤样品的重量。

6.结果分析：

由图1可知，相比于Vehicle对照组，TNFSF15可显著延迟td-tomato骨髓移植C57小鼠LLC移植瘤的生长；由图2可知，相比于Vehicle对照组，TNFSF15显著移植了td-tomato骨髓移植C57小鼠MC38移植瘤的生长。由此可知，TNFSF15蛋白能够抑制肿瘤的生长。

实施例2TNFSF15对骨髓移植荷瘤小鼠骨髓与肿瘤中td-tomato⁺细胞与CD11b⁺细胞增殖的影响。

1.骨髓单细胞悬液样品制备

(1)将骨髓样品制成单细胞悬液。

(2)将骨髓样品用IC Fixation Buffer进行固定，置于4℃冰箱待检测。

2.肿瘤组织样品单细胞悬液制备

(1)将剪碎后的肿瘤样品置于15mL离心管儿中，视组织块大小加入三倍0.25％胰酶，置于37℃水浴锅中孵育消化30min，每隔10分钟轻轻震荡样品，使细胞分离，注意消化时间不可超过30min，因过度消化会导致细胞表面蛋白的破坏从而影响检测，甚至会使细胞破裂粘连成团。

(2)加入二倍胰酶液体积的含10％FBS的培养基以终止组织消化。

(3)将细胞悬液用200目不锈钢筛网研磨过滤后，移入新的15mL离心管儿中，400×g，5min离心；弃上清，每管加入10mL PBS重悬清洗细胞，400×g，5min离心。

(4)弃上清，加入三倍细胞体积的ACK红细胞裂解液，用1mL枪头轻轻吹匀细胞，冰上裂解5min；加入二倍ACK红细胞裂解液体积的含10％FBS的培养基终止裂解，5min离心。

(5)弃上清，加入5mL PBS重悬清洗细胞，两次。

(6)将单细胞悬液制成1×10⁶个肿瘤细胞/100μL PBS细胞浓度的检测样品，若不能立即进行流式检测，可先用用IC Fixation Buffer进行固定，置于四度冰箱待检测，放置时间不应超过一周。

3.肿瘤单细胞悬液样品/骨髓细胞中流式染色检测细胞表面蛋白(CD11b/td-tomato)的表达情况

(1)一抗染色：向1×10⁶个肿瘤细胞/100μL PBS单细胞悬液中按照说明书分别加入相应的一抗及相对应同型对照抗体，用1mL移液枪小心缓慢吹匀，冰上孵育30min，期间每隔10min用移液枪小心缓慢吹匀一次，染色完成后加入400μL PBS，混匀离心，400×g，5min。

(2)二抗染色：离心完成后，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞，轻缓混匀离心，400×g，5min，离心完成后，弃上清，加入100μL PBS，轻缓吹匀重悬细胞，分别加入相应二抗，此后步骤注意全程锡箔纸避光，吹匀后置于冰上25min，期间每隔10min用移液枪小心缓慢吹匀一次，染色完成后，加入400μL PBS，混匀离心，400×g，5min。

(3)分析型流式细胞仪检测蛋白表达情况：离心完成后，弃上清，加入200μL PBS重悬细胞，如染色完成后不能立即上机检测，则可先用IC Fixation Buffer进行固定，置于四度冰箱待检测，放置时间不应超过一周。

3.结果分析：

由图3可知，TNFSF15促进了LLC荷瘤小鼠骨髓中td-tomato⁺细胞与CD11b⁺细胞的增多，结果显示，TNFSF15提高了骨髓移植动物模型实验小鼠中骨髓移植的效率，这是首次发现的TNFSF15的另一新的生物学功能，提高骨髓移植的效率对治疗白血病等疾病具有重要的意义；由图4可知，TNFSF15促进了骨髓移植LLC荷瘤小鼠肿瘤中髓系源CD11b⁺细胞的增多，说明，TNFSF15促进了髓系td-tomato⁺CD11b⁺细胞向肿瘤微环境的募集。由此可知，在骨髓移植荷瘤的动物模型中，TNFSF15促进了骨髓和肿瘤中td-tomato⁺细胞与CD11b⁺细胞的增多。

实施例3TNFSF15对骨髓移植荷瘤小鼠动物模型中肿瘤血管的影响

1.LLC肿瘤样品单细胞悬液流式染色检测分子表型Marker蛋白(CD31/PDGFR-β/α-SMA/Desmin/)的表达情况

(1)细胞固定：将2×IC Fixation Buffer用无菌PBS稀释至1×备用，用1×ICFixation Buffer重悬1×10⁶个肿瘤细胞，室温静置固定10min。固定完成后加入400μLPBS，混匀离心，400×g，5min。

(2)细胞破膜：离心完成后，弃上清，加入500μL PBS清洗细胞，混匀离心，400×g，5min。将10×permeabilization Buffer用无菌PBS稀释至1×备用，用1×permeabilization Buffer重悬肿瘤细胞，室温静置破膜10min。破膜完成后加入400μLPBS，混匀离心，400×g，5min。

(3)细胞染色及流式检测：细胞染色全程在1×permeabilization Buffer中完成，染色完成后在分析型流式细胞仪中检测蛋白表达。

2.肿瘤样品冰冻切片制备

(1)将在4％多聚甲醛中4℃固定24h后的组织取出，用PBS清洗组织两次。

(2)取一个OCT包埋盒，底部加入适量O.C.T.Compound，将组织放在O.C.T.Compound上，继续加入O.C.T.Compound直至将组织完全浸没，全程注意无气泡产生。

(3)将包埋好组织的OCT包埋盒缓缓平放入盛有液氮的保温杯中，当包埋盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，保持包埋盒原位，不浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

(4)在制成冻块后，可将组织放入负八十冰箱保存或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

(5)提前将冰冻切片机打开预冷至刀片刀头及箱体温度为负20℃，将冰冻组织放入箱体，将样品放于加上OCT包埋剂的样品托上，置于冷台上固定。

(6)样品固定在样品托上以后，放入样品头上固定好，先用50μm片厚厚度修片，找到组织最大面并将组织面修平后，改为5μm片厚厚度切片；切片完成后可将切片放入负八十冰箱保存或继续染色。

(7)切片完成后，将切片机打扫干净后，关机。

3.肿瘤样品冰冻切片HE染色

(1)将在负八十冰箱保存的切片取出，室温静置30min复温。

(2)以下步骤均在通风橱中完成：

(3)95％乙醇固定30s-1min。

(4)流水水洗30s-1min。

(5)苏木精染色30s。

(6)流水水洗30s，可于显微镜下观察染色效果；TBST洗两次，每次10min返蓝；流水水洗30s。

(7)伊红染色30s-1min。

(8)流水水洗1min。

(9)脱水透明：80％乙醇30s→95％乙醇30s→无水乙醇Ⅰ30s→无水乙醇Ⅱ30s→二甲苯Ⅰ30s→二甲苯Ⅱ30s。

(10)封片儿：将组织从二甲苯中取出，注意避免组织干片儿，在组织上滴加适量中性树胶，盖上盖玻片儿，此过程应注意避免气泡产生。

(11)晾片儿及显微镜观察：封片儿完成后，在通风橱中通风晾片儿，至切片儿干燥固定好以后，于显微镜下观察及拍照。

4.肿瘤样品冰冻切片免疫荧光染色

(1)将在负八十冰箱保存的切片取出，室温静置30min复温。

(2)复温完成后，将切片放入提前4℃预冷好的甲醇中，4℃冰箱固定15min。

(3)PBST洗片儿三次，每次5min。

(4)用免疫组化油笔将待染组织圈好，画好防水圈儿后，将组织在溶于PBS中的0.25％ Triton X-100中室温透化1h。

(5)PBST洗片儿三次，每次5min。

(6)溶于PBST中的5％BSA室温封闭1h。

(7)按照相应一抗的抗体说明书，将一抗稀释于2％BSA中，4℃过夜染色。

(8)PBST洗片儿三次，每次5min。

(9)按照相应二抗的说明书用PBST稀释，室温避光染色1h。

(10)DAPI(1：500)室温10min避光染色。

(11)PBST洗片儿三次，每次5min。

(12)用水溶性放淬灭封片剂封片儿，封片过程中注意不要干片及不要产生气泡；封片儿完成后可于荧光显微镜下观察及拍照。

5.结果分析：

由图5可知，TNFSF15能抑制LLC肿瘤中CD31⁺细胞的生成，显著减少肿瘤微环境中肿瘤血管的数量、血管的长度、血管密度与血管的出芽分支点，同时使弥散渗漏在肿瘤微环境中的红细胞数量显著少于Vehicle组；由图6可知，TNFSF15促进了肿瘤微环境中髓系源周细胞的增多；由图7可知，TNFSF15促进了髓系源周细胞向肿瘤微环境中的募集及增加了周细胞对肿瘤血管的包被；由此可知，TNFSF15抑制了骨髓移植荷瘤小鼠中LLC肿瘤的血管新生，同时，促进了肿瘤血管的正常化。

实施例4TNFSF15对肿瘤血管功能的影响

1.HE染色切片图像收集：使用全视野数字切片扫片仪对HE染色切片进行全片扫描，并收集图像数据。

2.结果分析：

由图8可知，TNFSF15给药组的肿瘤组织结构弥散疏松呈凋亡状态，而Vehicle组的肿瘤血管出血渗漏严重，渗透在肿瘤微环境组织中的红细胞数量显著多于TNFSF15给药组，由此可知，TNFSF15蛋白抑制了肿瘤血管的出血渗漏。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.TNFSF15蛋白在制备促进肿瘤血管正常化的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述TNFSF15蛋白通过增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集促进肿瘤血管正常化。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述周细胞为髓源性周细胞。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：TNFSF15蛋白还促进髓系CD11b⁺细胞向肿瘤微环境中的募集，并促进髓系CD11b⁺细胞在肿瘤中向周细胞的分化。

5.TNFSF15蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：所述TNFSF15蛋白作为增强周细胞向肿瘤血管的包被与募集的细胞因子，促进肿瘤血管正常化，进而抑制肿瘤生长。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：TNFSF15蛋白与抗血管新生治疗和/或免疫治疗药物联用，提高肿瘤治疗效果。

7.TNFSF15蛋白在制备提高骨髓移植效率的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述骨髓移植为骨髓移植治疗白血病。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：TNFSF15提高荷瘤小鼠骨髓移植效率，给药浓度为5mg/kg。

10.一种建立荷瘤小鼠的骨髓移植以追踪细胞分化发育的动物模型的方法，其特征在于：包括1)对受体小鼠进行全身γ射线照射；2)进行供体小鼠的骨髓移植，受体小鼠尾静脉注射供体骨髓细胞；3)骨髓移植完成后，给予受体小鼠移植荷瘤；4)对荷瘤小鼠进行TNFSF15蛋白给药处理；

优选地，受体小鼠的γ射线全身照射条件为：先进行4Cs¹³⁷ 4.5Gry全身照射5min，6h后再次进行全身γ射线照射，照射剂量为4Cs¹³⁷ 5.0Gry，5min；

优选地，受体小鼠为C57BL/6J小雌鼠，10周龄，体重大于20g；供体小鼠为8周龄红色B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-Tdtomato)HZE}/J小雄鼠；

优选地，受体小鼠全身γ射线照射完成六小时后进行骨髓移植；

优选地，受体小鼠尾静脉注射1×10⁷个供体骨髓细胞；

优选地，骨髓移植两周后进行荷瘤；

优选地，TNFSF15蛋白的给药浓度为5mg/kg。

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