RU2777371C2 - Клетка-естественный киллер, содержащая экзогенную митохондрию, и фармацевтическая композиция, включающая такую клетку - Google Patents
Клетка-естественный киллер, содержащая экзогенную митохондрию, и фармацевтическая композиция, включающая такую клетку Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777371C2 RU2777371C2 RU2019118070A RU2019118070A RU2777371C2 RU 2777371 C2 RU2777371 C2 RU 2777371C2 RU 2019118070 A RU2019118070 A RU 2019118070A RU 2019118070 A RU2019118070 A RU 2019118070A RU 2777371 C2 RU2777371 C2 RU 2777371C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- cells
- mitochondria
- natural killer
- exogenous mitochondria
- Prior art date
Links
- 210000003470 Mitochondria Anatomy 0.000 title claims abstract description 110
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 title claims abstract description 107
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 title claims abstract description 81
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 31
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 206010000880 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 208000007046 Leukemia, Myeloid, Acute Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 8
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000006572 Human Influenza Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010022000 Influenza Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010038683 Respiratory disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000001616 Monocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000004409 Osteocytes Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 20
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims description 12
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 201000000582 retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 10
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 10
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 abstract description 5
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002147 killing Effects 0.000 abstract description 2
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract 1
- 210000004693 NK cell Anatomy 0.000 description 18
- URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N [(1R)-1-phenylethyl] N-(2-aminoethyl)-N-[(3-methoxy-4-phenylmethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound C1([C@@H](C)OC(=O)N(CCN)CC=2C=C(C(=CC=2)OCC=2C=CC=CC=2)OC)=CC=CC=C1 URRBLVUOXIGNQR-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 11
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 description 10
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 10
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 10
- 230000002438 mitochondrial Effects 0.000 description 10
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 8
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 6
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 101700048185 LAMP1 Proteins 0.000 description 4
- 102100005918 LAMP1 Human genes 0.000 description 4
- 102100015262 MYC Human genes 0.000 description 4
- 102100019730 TP53 Human genes 0.000 description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000003211 malignant Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 4
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-Aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 3
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 3
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 3
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 3
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 3
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 3
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 3
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 210000000867 Larynx Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 2
- 210000003819 Peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000502 Poloxamer Drugs 0.000 description 2
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 210000000400 T-Lymphocytes, Cytotoxic Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay method Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceuticals Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- -1 polyoxypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000000612 Antigen-Presenting Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N DATI Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003283 T-Lymphocytes, Helper-Inducer Anatomy 0.000 description 1
- 229940014598 TAC Drugs 0.000 description 1
- 101700044055 acc-3 Proteins 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 210000003509 immature NK cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и медицины, в частности к цитотоксическим клеткам-естественным киллерам (NK), содержащим экзогенные митохондрии, а также к композиции и способу для лечения злокачественной опухоли, такой как рак желудка, рак печени, рак лёгких, колоректальный рак, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак щитовидной железы, рак гортани, острый миелоидный лейкоз, опухоль головного мозга, нейробластома, ренинобластома, рак головы и шеи, рак слюнных желез и лимфома, или инфекционного заболевания, такого как гепатит B, гепатит C, HPV, инфекция цитомегаловирусом, вирусные респираторные заболевания и грипп. Указанные экзогенные митохондрии могут быть получены из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, стволовых клеток или клеток слизистых оболочек. Настоящее изобретение позволяет повысить цитотоксичность NK-клеток, способствующую усилению иммунной системы организма человека для улучшения их терапевтического воздействия. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 13 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к продуктам для клеточной терапии, и, более конкретно, к клетке-естественному киллеру (далее в настоящем документе, обозначаемой как NK) или мононуклеарным клеткам периферической крови (далее в настоящем документе, обозначаемым как PBMC), которые содержат экзогенные митохондрии, и к фармацевтическим композициям, включающим такие клетки в качестве активного ингредиента.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время разработаны биофармацевтические препараты для лечения различных неизлечимых заболеваний. Биофармацевтические препараты включают белковые лекарственные средства, лекарственные средства с антителами и препараты для клеточной терапии. В настоящем документе, препараты для клеточной терапии относятся к фармацевтическим препаратам, применяемым с целью лечения, диагностики и профилактики заболеваний, и препараты для клеточной терапии можно получать через серию действий, таких как проведение выделения ex vivo и пролиферации или путем изменения биологических характеристик клеток другими способами. Препараты для клеточной терапии можно получать из аутологичных, аллогенных или ксеногенных клеток. В зависимости от типа клеток, препараты для клеточной терапии можно классифицировать на препараты для терапии соматическими клетками и препараты для терапии стволовыми клетками.
С другой стороны, в терапии злокачественных опухолей обратили внимание на иммунотерапию с использованием иммунной функции пациента. В иммунотерапии используют свойства иммунных клеток с разнообразными функциями, и злокачественные клетки уничтожаются путем сложных взаимодействий иммунных клеток. PBMC в крови человека представляют собой клетки крови с круглым ядром, такие как лимфоцит или моноцит, и включают B-клетки, T-клетки, макрофаги, дендритные клетки (DC), и NK-клетки. Среди них NK-клетки и цитотоксические T-лимфоциты (ЦТЛ) непосредственно уничтожают злокачественные клетки. Антиген-презентирующие клетки, которые презентируют антигены этим эффекторным клеткам, включают дендритные клетки или B-клетки. Кроме того, в иммунных ответах участвуют хелперные T-клетки и регуляторные T-клетки, которые секретируют различные цитокины, и т.п. Среди них, перспективными и многообещающими иммунными клетками для иммунотерапии являются NK-клетки.
В частности, поскольку было показано, что NK-клетки способны уничтожать злокачественные клетки неспецифическим образом, на NK-клетках было проведено много исследований. На основании этих исследований, терапия NK-клетками при злокачественной опухоли, является перспективным способом для лечения злокачественных клеток. В частности, опубликовано, что NK-клетки играют важную роль во врожденных и приобретенных иммунных ответах за счет секреции цитокинов против патогенов, которые заражают хозяина, или злокачественной опухоли.
Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли усилия для того чтобы найти новый способ для улучшения силы цитотоксичности NK-клеток и PBMC. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили способ повышения цитотоксичности NK и PBMC, и, таким образом, создали способ лечения злокачественной опухоли с использованием такой цитотоксичности, и, таким образом, завершили настоящее изобретение.
Техническая проблема
Целью настоящего изобретения является получение NK-клетки с повышенной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, включающей такую клетку.
Другой целью настоящего изобретения является получение PBMC с повышенной цитотоксичностью и фармацевтической композиции, включающей такую клетку.
Решение проблемы
Для достижения вышеуказанных целей настоящее изобретение относится к NK-клеткам, содержащим экзогенные митохондрии, и к фармацевтической композиции для профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающей такие клетки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к PBMC, содержащим экзогенные митохондрии, и к фармацевтической композиции для профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающей такие клетки.
Полезные эффекты изобретения
NK-клетка и PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии, не только имеют повышенную цитотоксичность, которая приводит к повышенным специфическим цитотоксическим противопухолевым эффектам, но также не демонстрируют побочных эффектов, как иммунные клетки, существующие in vivo. Кроме того, NK-клетка и PBMC улучшены в отношении способности самой клетки, и, таким образом, их можно широко применять для различных заболеваний, в которые вовлечены NK-клетка и PBMC. В результате, ожидается, что фармацевтические композиции, включающие NK-клетку и PBMC, будут иметь высокую коммерческую применимость.
Краткое описание рисунков
ФИГ. 1 показывает результат, полученный путем анализа при помощи ПЦР, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки.
ФИГ. 2 показывает результат, полученный путем анализа при помощи FACS, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека, в NK-клетки.
ФИГ. 3 показывает результаты, полученные путем флуоресцентной микроскопии, для того чтобы локализовать митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов человека и доставленные в NK-клетки.
ФИГ. 4A и 4B иллюстрируют результаты анализа дегрануляции CD107a, показывающие противоопухолевую активность NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии.
ФИГ. 5 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты NK-клетки, в которые были введены экзогенные митохондрии.
ФИГ. 6 показывает результат, полученный путем анализа при помощи FACS, для того чтобы исследовать, доставлены ли митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC), в NK-клетки.
ФИГ. 7 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты NK-клетки, в которые были введены митохондрии, полученные из UC-MSC.
ФИГ. с 8A по 8C иллюстрирует результаты, показывающие терапевтические эффекты NK-клеток, в которые были введены митохондрии, полученные из UC-MSC, на животной модели острого миелогенного лейкоза, в отношении массы тела и коэффициента выживаемости мышей.
ФИГ. 9 показывает результаты распределения экспрессии маркеров опухолей крови на животной модели острого миелогенного лейкоза, которой были введены NK-клетки с митохондриями, полученными из UC-MSC.
ФИГ. 10 иллюстрирует результат анализа цитотоксичности по отношению к K562, показывающий цитотоксические эффекты PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии.
Подробное описание изобретения
Далее в настоящем документе настоящее изобретение будет описано подробно.
В аспекте настоящего изобретения, предлагается NK-клетка, обогащенная экзогенными митохондриями.
Как применяют в настоящем документе, термин «экзогенные митохондрии» относится к митохондриям, введенным экзогенно, а не к митохондриям, присутствующим в NK-клетке. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать от того же индивидуума, от которого получают NK-клетку, но можно получать от другого индивидуума. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать от млекопитающего, и предпочтительно можно получать от человека. Например, экзогенные митохондрии можно получать из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов или клеток слизистой, и предпочтительно можно получать из мышечных клеток с превосходной митохондриальной активностью клетки. Кроме того, митохондрии можно получать из клеток, культивируемых ex vivo.
С другой стороны, экзогенные митохондрии можно получать, разрушая клетки и проводя центрифугирование, или культивируя клетки, разрушая клетки и проводя центрифугирование. Для способа получения митохондрий можно использовать общепринятый способ, применяемый для сбора органеллы.
В настоящем документе, NK-клетку, содержащую экзогенные митохондрии, можно получать введением митохондрий в количестве от 0,01 до 500 мкг, от 0,1 до 450 мкг, от 0,5 до 300 мкг, от 1 до 100 мкг, или от 2 до 10 мкг на 105 NK-клеток. В настоящем документе, NK-клетка может содержать от 1 до 103 или от 10 до 102 экзогенных митохондрий. Конкретно, число экзогенных митохондрий может быть таким, что приблизительно 1, 10, 100, или 500 экзогенных митохондрий содержатся в одной NK-клетке. В настоящем документе, число экзогенных митохондрий, содержащихся в NK-клетках, можно регулировать путем контроля количества экзогенных митохондрий, вводимых в NK-клетки. Каждая отдельная NK-клетка может содержать различное число экзогенных митохондрий.
Кроме того, NK-клетки можно получать у млекопитающего или человека. Предпочтительно, NK-клетки можно получать от индивидуума, которому предполагается проводить терапию NK-клетками. В настоящем документе, NK-клетки можно прямо выделять из крови индивидуума и применять, или можно получать путем дифференцировки незрелых NK-клеток или стволовых клеток, полученных от индивидуума, и применять.
Между тем, для того чтобы вводить экзогенные митохондрии в NK-клетки, экзогенные митохондрии и NK-клетки можно смешивать, а затем смесь можно центрифугировать и, таким образом, эффективно доставлять митохондрии в NK-клетки. Условия во время проведения центрифугирования можно регулировать соответствующим образом для эффективного введения митохондрий без повреждения клеток. В настоящем изобретении, центрифугирование можно проводить при комнатной температуре, и температуру выбирают соответствующим образом для стабильности клеток. В настоящем документе, во время введения экзогенных митохондрий NK-клетки и экзогенные митохондрии можно смешивать в присутствии поверхностно-активного вещества, чтобы повысить проницаемость мембран для проникновения экзогенных митохондрий в NK-клетки, таким образом, повышая эффективность введения экзогенных митохондрий.
В настоящем документе, центрифугирование можно проводить при 100×g, 300×g, 500×g, 800×g, 1000×g, 1200×g, 1500×g, 1800×g, 2000×g, 2400×g, 3000×g, 5000×g или 10000×g. Кроме того, время центрифугирования может составлять от 0,1 минуты до 60 минут, но не ограничивается этим. Конкретно, время центрифугирования может составлять 1 минуту, 2 минуты, 3 минуты, 5 минут, 10 минут, 20 минут или 30 минут. Кроме того, центрифугирование можно проводить при температуре от 0°C до 40°C, от 20°C до 38°C или от 30°C до 37°C.
Таким образом, с применением силы центрифугирования к NK-клеткам и экзогенным митохондриям, можно доставлять митохондрии в NK-клетки с высокой эффективностью с меньшим повреждением NK-клеток.
Кроме того, можно использовать поверхностно-активное вещество для улучшения проникновения экзогенных митохондрий через клеточную мембрану в NK-клетки. Момент времени, в который добавляют поверхностно-активное вещество, может быть до, во время или после смешивания NK-клеток с экзогенными митохондриями. Кроме того, после того как поверхностно-активное вещество добавляют к NK-клеткам, NK-клетки можно инкубировать в течение определенного периода времени для того чтобы повысить проникновение экзогенных митохондрий через клеточную мембрану в NK-клетки. Время инкубации может составлять от 0,1 до 60 минут. Конкретно, время инкубации может составлять 1 минуту, 5 минут, 10 минут, 20 минут или 30 минут, но не ограничивается этим.
Конкретно, поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество, и может быть полоксамером. В настоящем документе, полоксамер представляет собой триблок-сополимер, состоящий из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена, фланкированной двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена. Кроме того, поверхностно-активное вещество в смеси может иметь концентрацию от 1 до 100 мг/мл, от 3 до 80 мг/мл, или от 5 до 40 мг/мл, и может составлять предпочтительно от 10 до 30 мг/мл.
Кроме того, способ может дополнительно включать этап инкубирования смеси при предопреденном времени и температуре. Инкубацию можно проводить при температуре от 0°C до 40°C, от 20°C до 38°C или от 30°C до 37°C. Кроме того, инкубацию можно проводить в течение периода от 0,1 до 4 часов, от 0,5 до 3,8 часов или от 0,8 до 3,5 часов. Кроме того, инкубацию можно проводить в течение предопределенного времени после проведения центрифугирования, чтобы доставить экзогенные митохондрии в NK-клетки. Кроме того, время инкубации можно выбирать соответствующим образом в зависимости от типа клеток и количества митохондрий.
В другом аспекте настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, которая содержит в качестве активного ингредиента NK-клетку с экзогенными митохондриями.
В настоящем документе, злокачественная опухоль может быть любой опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.
Кроме того, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в жидкой или замороженной форме. Даже в случае повторного оттаивания после замораживания фармацевтическая композиция не проявляет нарушения клеточной функции и может поддерживать высокую жизнеспособность клеток и способность уничтожать клетки. Таким образом, фармацевтическую композицию можно легко хранить и поставлять в жидком или замороженном виде без дополнительной обработки.
В другом аспекте настоящего изобретения, предлагается способ профилактики или лечения заболевания, включающий этап введения индивидууму фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента NK-клетки с экзогенными митохондриями.
Такой способ включает этап введения эффективного количества NK-клетки по изобретению индивидууму с заболеванием или индивидууму, у которого подозревают наличие заболевания. Например, клетку, в которую были введены экзогенные митохондрии, можно вводить индивидууму, предпочтительно млекопитающему, в виде терапевтического препарата. Клетку можно вводить путем внутривенного или подкожного введения. В случае, когда композиция по настоящему изобретению предоставляется парентерально, таким путем введения как внутривенный, подкожный, глазной, интраперитонеальный, или внутримышечный пути, композиция предпочтительно находится в водной форме, или предпочтительно, что композиция включает физиологически применимую биологическую жидкость, суспензию или раствор. Таким образом, носитель является физиологически приемлемым, и его, таким образом, можно добавлять к композиции и доставлять пациенту. Такой носитель не влияет отрицательно на электролиты пациента. Таким образом, как правило, в качестве носителя для препаратов может быть использован физиологический раствор.
Способ для профилактики или лечения заболевания с использованием клетки по настоящему изобретению может также включать введение другого лекарственного средства или физиологически активного вещества с эффектом профилактики или лечения заболевания, в комбинации с клеткой по настоящему изобретению. Путь введения, время и дозу для комбинированного введения можно определять в зависимости от типа заболевания, течения заболевания пациента, цели лечения или профилактики, и другого лекарственного средства или физиологически активного вещества, применяемого в комбинации.
Кроме того, заболевание может быть злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием. В настоящем документе, злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения, предлагается PBMC, содержащая экзогенные митохондрии.
Как применяют в настоящем документе, термин «мононуклеарная клетка периферической крови» относится к клетке со сферическим ядром, присутствующей в периферической крови, которая обозначается как моноцит периферической крови или PBMC. Такие PBMC могут включать иммунные клетки, такие как B-клетки, T-клетки, макрофаги, дендритные клетки и NK-клетки. PBMC можно получать из крови индивидуума. В настоящем документе, экзогенные митохондрии можно получать из тканей или клеток индивидуума, как описано выше.
В настоящем документе, PBMC, содержащую экзогенные митохондрии, можно получать путем введения митохондрий в количестве от 0,01 до 500 мкг, от 0,1 до 450 мкг, от 0,5 до 300 мкг, от 1 до 100 мкг, или от 2 до 10 мкг, на 105 PBMC. В настоящем документе, одна PBMC может содержать экзогенные митохондрии в количестве от 1 до 103 или от 10 до 100. Кроме того, способ введения экзогенных митохондрий в PBMC можно проводить путем центрифугирования, как описано выше. Еще в одном аспекте настоящего изобретения, предлагается фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, которая содержит в качестве активного ингредиента PBMC с экзогенными митохондриями.
В настоящем документе, как описано выше, злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рак гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы. Кроме того, инфекционное заболевание может быть любым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.
Далее в настоящем документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на последующие примеры. Однако следующие примеры приведены только для иллюстрации настоящего изобретения, и не ограничивают объем настоящего изобретения.
I. Получение NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии, и определение их функций
Пример 1. Получение NK-клеток, в которые были введены экзогенные митохондрии
Здоровые гепатоциты человека (WRL-68) (CRL 1458, ATCC) высевали в модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM), дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл ампициллина, и культивировали в течение 72 часов. После завершения культивирования клетки отмывали дважды фосфатно-солевым буфером по Дульбекко (DPBS; Gibco). Отмытые клетки обрабатывали 0,25% трипсином-ЭДТА (TE; Gibco) для получения клеток. Для клеток, полученных для выделения митохондрий, использовали гемоцитометр для измерения числа клеток, и собирали клетки в количестве приблизительно 3×106 клеток/мл.
После этого проводили первичное центрифугирование клеточной линии при температуре приблизительно 4°C в течение 10 минут со скоростью 350×g. Полученный осадок собирали, ресуспендировали и гомогенизировали в буферном растворе от 10 до 15 минут. Проводили вторичное центрифугирование композиции, содержащей осадок, при температуре приблизительно 4°C в течение 3 минут со скоростью 1100×g для получения супернатанта. Затем проводили третье центрифугирование супернатанта при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 12000×g для выделения митохондрий из клеточной линии.
Выделенные митохондрии вводили в количестве 1×105 в тестовую пробирку, содержащую отдельные NK-клетки человека (NK92mi) (CRL2408; ATCC), и проводили центрифугирование при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 2500×g. После удаления супернатанта проводили отмывание при помощи PBS и центрифугировали при температуре приблизительно 4°C в течение 5 минут. Отмывание проводили дважды в тех же условиях. В настоящем документе, выделенные митохондрии добавляли в массе 0,05, 0,05, 0,5, и 5 мкг на 1×105 реципиентных клеток.
Пример 2. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (способ ПЦР-анализа)
Использовали набор для очистки ДНК (NucleoSpin; MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) для выделения полного генома из NK-клеток, собранных в примере 1. Выделенную ДНК соразмерно смешивали с праймерами, специфичными для идентификации митохондрий из WRL-68 (F: 5'-CTA TTC TCT GTT CTT TCA TGG-3' (SEQ ID NO: 1), R: 5'-AAG TAT TTA TGG TAC CGT ACG-3' (SEQ ID NO: 2)). Затем добавляли 2× мастермикс для ПЦР (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) и трижды дистиллированную воду таким образом, что общий объем полученной смеси составил 10 мкл, и использовали 96-луночный термоциклер Veriti (Applied Biosystems) для амплификации желаемой части ДНК.
Для получения амплицированной ДНК проводили реакцию ПЦР. Для выявления амплифицированной ДНК проводили электрофорез на 1,5% агарозном геле, а затем окрашивание Loading Star (DYNEBIO INC., Seongnam, Korea). Для выявления полос амплифицированной ДНК использовали УФ-спектрометр (Chemi-Doc XRS; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). В качестве гена домашнего хозяйства выбирали GAPDH. Для этого использовали праймеры, способные амплифицировать GADPH (F- 5'-GGA AGG TGA AGG TCG GAG-3' (SEQ ID NO: 3), R- 5'-GGC AAC AAT ATC CAC TTT ACC-3' (SEQ ID NO: 4)). Этот результат показан на ФИГ. 1.
ФИГ. 1 указывает на то, что количество экзогенных митохондрий, доставленных в NK-клетки, повышается с увеличением количеств митохондрий (0,005, 0,05, 0,5, и 5 мкг), которые смешивают с NK-клетками.
Пример 3. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (способ анализа при помощи FACS)
Проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS) для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из гепатоцитов, в NK-клетки. Митохондрии, выделенные из здоровых гепатоцитов человека, обрабатывали 500 нМ красителя Green mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C, и промывали. Флуоресценцентно-меченные митохондрии, полученные из гепатоцитов, доставляли в иммунные клетки с использованием способа центрифугирования, а затем иммунные клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Затем, доставку митохондрий выявляли и анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur (BDBiosciences, San Jose, CA, USA). Результат показан на ФИГ. 2.
Из ФИГ. 2, было выявлено, что NK-клетки можно отличать в зависимости от количества (0,005, 0,05, 0,5, и 5 мкг) митохондрий, доставленных в NK-клетки.
Пример 4. Определение доставки митохондрий, полученных из здоровых гепатоцитов человека (WRL68), в NK-клетки (наблюдение путем флуоресцентной микроскопии)
Для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из здоровых гепатоцитов (WRL-68), в человеческие NK-клетки (NK92mi), митохондрии NK-клеток обрабатывали 500 нМ красителя Green mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) и оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Митохондрии, выделенные из гепатоцитов, обрабатывали 500 нМ красителя red mitotracker. Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 10 минут в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C, а затем доставляли в NK-клетки. После доставки 5 мкг митохондрий, клетки высевали в 24-луночный планшет и инкубировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Затем использовали флуоресцентную микроскопию для выявления внутриклеточной доставки в течение 24 часов. В качестве реагента для контроля окрашивания использовали реагент DAPI для окрашивания ядер. Результаты показаны на ФИГ. 3.
Из ФИГ. 3, было выявлено, что экзогенные митохондрии были доставлены в NK-клетки.
Пример 5. Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии (анализ дегрануляции CD107a)
Для того чтобы выявить экспрессию CD107a при помощи дегрануляции, которая является указателем активности NK-клеток, у человеческих NK-клеток (NK92mi) с введенными экзогенными митохондриями, собранных в примере 1, человеческие NK-клетки и клетки-мишени (K562) смешивали в соотношении 10:1, а затем смесь обрабатывали антителом к CD107a, которое было конъюгировано с флуоресцентным веществом. Полученную смесь инкубировали в течение 4 часов. После конъгации смесь обрабатывали антителом к CD56 для окрашивания поверхности и оставляли для проведения реакции в течение 30 минут. Затем проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результаты показаны на ФИГ. 4A и 4B.
Из ФИГ. 4A и 4B, было выявлено, что противоопухолевая активность NK-клеток повышается с количеством (0,05, 0,5, и 5 мкг) экзогенных митохондрий.
Пример 6: Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии (анализ цитотоксичности по отношению к K562)
Для того чтобы выявить противоопухолевую активность NK-клеток, собранных в Примере 1, собранные NK-клетки смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 5.
Из ФИГ. 5, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышается с количеством (0,05, 0,5, и 5 мкг) доставленных экзогенных митохондрий.
Пример 7. Получение NK-клеток, в которые были введены митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из плаценты (предоставленные медицинским центром CHA bundang, IRB No. 1044308-201511-BR-022-02) высевали в минимальную поддерживающую среду-Альфа (Альфа-MEM), дополненную 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS; Gibco), 100 мкгг/мл стрептомицина, и 100 Ед/мл ампициллина, и культивировали в течение 72 часов.
После завершения культивирования клетки отмывали дважды фосфатно-солевым буфером по Дульбекко (DPBS; Gibco). Отмытые клетки обрабатывали 0,25% трипсином-ЭДТА (TE; Gibco) для получения клеток. Для клеток, полученных для выделения митохондрий, использовали гемоцитометр для измерения числа клеток, и собирали клетки в количестве приблизительно 2×107 клеток/мл.
После этого проводили первичное центрифугирование клеточной линии при температуре приблизительно 4°C в течение 10 минут со скоростью 350×g. Полученный осадок собирали, ресуспендировали и гомогенизировали в буферном растворе от 10 до 15 минут. Проводили вторичное центрифугирование композиции, содержащей осадок, при температуре приблизительно 4°C в течение 3 минут со скоростью 1100×g для получения супернатанта. Затем проводили третье центрифугирование супернатанта при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 12000×g для выделения митохондрий из клеточной линии.
Выделенные митохондрии вводили в количестве 1×105 в тестовую пробирку, содержащую отдельные NK-клетки человека (NK92mi) (CRL2408; ATCC), и проводили центрифугирование при температуре приблизительно 4°C в течение 15 минут со скоростью 2500×g. После удаления супернатанта проводили отмывание при помощи PBS и центрифугировали при температуре приблизительно 4°C в течение 5 минут. Отмывание проводили дважды в тех же условиях. В настоящем документе, выделенные митохондрии добавляли в массе 0,3, 1, 3, 5 и 10 мкг на 1×105 реципиентных клеток.
Пример 8. Определение доставки митохондрий, полученных из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC), в NK-клетки (способ анализа при помощи FACS)
Проводили анализ с клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS), для того чтобы определить, доставлены ли митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, в NK-клетки. Митохондрии, выделенные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, обрабатывали 500 нМ красителя Red mitotracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Полученную смесь оставляли для прохождения реакции на 30 минут в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C и промывали. Флуоресценцентно-меченные митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, доставляли в иммунные клетки с использованием способа центрифугирования, а затем клетки ресуспендировали в 1 мл PBS. Затем, доставку митохондрий выявляли и анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur (BDBiosciences, San Jose, CA, USA). Результаты показаны на ФИГ. 6.
Из ФИГ. 6, было выявлено, что NK-клетки можно отличать при помощи количества (0,3, 1, 3, 5, и 10 мкг) митохондрий, полученных из UC-MSC и доставленных в NK-клетки.
Пример 9. Анализ изменений противоопухолевой активности NK-клеток, в которые были доставлены митохондрии, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика (UC-MSC) (анализ цитотоксичности по отношению к K562)
Для того чтобы выявить противоопухолевую активность NK-клеток, собранных в Примере 7, собранные NK-клетки смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 7.
Из ФИГ. 7, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышается с количествами (0,5, 1, 3, 5, и 10 мкг) доставленных экзогенных митохондрий.
Пример 10. Определение терапевтической оценки на остром миелогенном лейкозе при помощи изменения массы тела и коэффициента выживаемости
Самцов мышей NOD.cg-Prkdcscid IL2rgtm1Sug/JicKoat в возрасте 6-8 недель приобретали у Koatech Co., Ltd. (Gyeonggi-do, Korea). Приобретенные мыши проходили период адаптации в чистой зоне в центре подопытных животных университета CHA, а затем проводили эксперимент. Во время периода адаптации, окружение, в котором находились мыши, имело периоды дня и ночи с интервалом в 12 часов и комнатную температуру 23±2°C, и влажность от 40% до 60%. Мыши проходили такой период адаптации в течение 7 суток, а затем участвовали в эксперименте. Подготовленным таким образом мышам вводили в хвостовую вену (внутривенной (в/в) инъекцией) клетки K562 в количестве 2×105 клеток/100 мкл для того чтобы получить модель острого миелогенного лейкоза.
В настоящем изобретении мышам с индуцированным острым миелогенным лейкозом вводили в хвостовую вену (внутривенной (в/в) инъекцией) NK-клетки (NK92mi), приготовленные в соответствии с примером 7, в количестве 2×106 клеток/100 мкл, для того чтобы получить экспериментальную группу. Таким же образом получали контрольную группу, вводя здоровые NK-клетки (NK92mi), в которые не доставляли митохондрии, в количестве 2×106 клеток/100 мкл. Анализировали изменение массы тела и коэффициент выживаемости в экспериментальной и контрольной группе в течение 24 суток от момента введения клеточной линии с острым миелогенным лейкозом (K562). Результаты показаны на ФИГ. с 8A по 8C.
Из ФИГ. с 8A по 8C, было выявлено, что группа, которой вводили NK-клетки с митохондриями из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, демонстрирует приблизительно 5% увеличение массы тела и приблизительно 40% или большее увеличение коэффициента выживаемости по сравнению с группой, которой вводили здоровые NK-клетки без митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика.
Пример 11. Определение терапевтической оценки на остром миелогенном лейкозе при помощи анализа опухоль-ассоциированных маркеров
Для того чтобы выявить распределение экспрессии опухоль-ассоциированных маркеров, p53 и c-Myc, собирали кровь экспериментальной группы и контрольной группы, на которых проводили эксперимент согласно примеру 10, а затем центрифугировали при 12000×g в течение 15 минут для выделения сыворотки. Выделенную сыворотку анализировали на распределение экспрессии p53 и c-Myc при помощи набора для Вестерн-блоттинга (WB; Bio-Rad Laboratories, Inc.). Результаты показаны на ФИГ. 9.
Из ФИГ. 9 было выявлено, что группа, которой вводили NK-клетки с митохондриями из мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика, демонстрирует сниженную экспрессию c-Myc и повышенную экспрессию p53, при этом c-Myc и p53 являются маркерами опухолей крови.
II. Получение PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии, и определение их функций
Пример 12. Получение PBMC, в которые были введены экзогенные митохондрии
Периферическую кровь автора изобретения, взятую врачом (с медицинском центре CHA), обрабатывали Фиколл-Пак (Amersham Biosciences) в соотношении 1:1 в пробирке фирмы Falcon, а затем смесь центрифугировали при 400×g в течение 35 минут длясбора осадка с PBMC. Собранные PBMC отмывали дважды PBS. Затем, полученные из человеческих гепатоцитов (WRL-68) митохондрии, которые были выделены в соответствии с примером 1, доставляли в PBMC в массе 0,05, 0,05, 0,5 и 5 мкг на 1×105 реципиентных клеток.
Пример 13. Выявление изменений противоопухолевой активности PBMC, в которые были доставлены митохондрии (анализ цитотоксичности по отношению к K562)
Для того чтобы выявить противоопухолевую активность PBMC, собранных в Примере 12, собранные PBMC смешивали в соотношении 10:1 с клетками-мишенями (K562), меченными зеленым флуоресцентным красителем (CFSE; Invitrogen), а затем смесь инкубировали в течение 4 часов в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. После инкубации для анализа клеток-мишеней, уничтоженных NK-клетками, смесь обрабатывали красным флуоресцентным красителем (7-AAD; Invitrogen), а затем оставляли для проведения реакции в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции убитых клеток-мишеней анализировали клеточным сортером с активацией флуоресценции (FACS). Результат показан на ФИГ. 10.
Из ФИГ. 10, было выявлено, что цитотоксичность против K562 повышалась с количествами (0,005, 0,05, и 0,5 мкг) введенных экзогенных митохондрий.
--->
<110> Paean Biotechnology Inc.
<120> КЛЕТКА-ЕСТЕСТВЕННЫЙ КИЛЛЕР, СОДЕРЖАЩАЯ ЧУЖЕРОДНЫЕ МИТОХОНДРИИ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ТАКУЮ КЛЕТКУ
<130> PCB711058PBT
<150> KR 10-2016-0151411
<151> 2016-11-14
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для выявления митохондрий WRL-68
<400> 1
ctattctctg ttctttcatg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для выявления митохондрий WRL-68
<400> 2
aagtatttat ggtaccgtac g 21
<210> 3
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для выявления гена GAPDH
<400> 3
ggaaggtgaa ggtcggag 18
<210> 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для выявления гена GAPDH
<400> 4
ggcaacaata tccactttac c 21
<---
Claims (13)
1. Цитотоксическая клетка-естественный киллер, содержащая экзогенные митохондрии и по меньшей мере одну эндогенную интактную митохондрию,
где экзогенные митохондрии получены из мышечных клеток, гепатоцитов, фибробластов, эпителиальных клеток, нейронов, адипоцитов, остеоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, стволовых клеток или клеток слизистых оболочек.
2. Клетка-естественный киллер по п. 1, где экзогенные митохондрии содержатся в количестве от 1 до 103 на клетку-естественного киллера.
3. Клетка-естественный киллер по п. 1, где экзогенные митохондрии доставляют в клетку-естественного киллера путем центрифугирования композиции, при котором смешиваются экзогенные митохондрии и клетка-естественный киллер.
4. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающая в качестве активного ингредиента эффективное количество цитотоксической клетки-естественного киллера по п. 1,
где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы,
где инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где композиция находится в жидкой или замороженной форме.
6. Способ профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, включающий этап введения фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента цитотоксическую клетку-естественного киллера по п. 1, нуждающемуся в этом индивидууму,
где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелогенного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы,
где инфекционное заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита B, гепатита C, инфекции вирусом папилломы человека (HPV), инфекции цитомегаловирусом, вирусного респираторного заболевания и гриппа.
7. Способ по п. 6, где композицию вводят путем, выбранным из группы, состоящей из внутривенного, подкожного, глазного, интраперитонеального или внутримышечного путей.
8. Способ по п. 6, где способ включает введение другого лекарственного средства или физиологически активного вещества с эффектом профилактики или лечения злокачественной опухоли или инфекционного заболевания в комбинации с клеткой.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20160151411 | 2016-11-14 | ||
| KR10-2016-0151411 | 2016-11-14 | ||
| PCT/KR2017/012883 WO2018088875A2 (ko) | 2016-11-14 | 2017-11-14 | 외래 미토콘드리아를 포함하는 자연살해세포 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021134402A Division RU2021134402A (ru) | 2016-11-14 | 2017-11-14 | Клетка-естественный киллер, содержащая экзогенную митохондрию, и фармацевтическая композиция, включающая такую клетку |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019118070A RU2019118070A (ru) | 2020-12-14 |
| RU2019118070A3 RU2019118070A3 (ru) | 2021-08-13 |
| RU2777371C2 true RU2777371C2 (ru) | 2022-08-02 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013094988A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Mogam Biotechnology Research Institute | Method for producing natural killer cells, natural killer cells produced thereby, and composition for treating cancers and infectious diseases containing the same |
| RU2536242C2 (ru) * | 2007-09-28 | 2014-12-20 | Антродженезис Корпорейшн | Угнетение опухолей с помощью плацентарного перфузата человека и выделенных из плаценты человека вспомогательных натуральных клеток-киллеров |
| WO2015067089A1 (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-14 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 |
| WO2016008937A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the intercellular transfer of isolated mitochondria in recipient cells |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2536242C2 (ru) * | 2007-09-28 | 2014-12-20 | Антродженезис Корпорейшн | Угнетение опухолей с помощью плацентарного перфузата человека и выделенных из плаценты человека вспомогательных натуральных клеток-киллеров |
| WO2013094988A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Mogam Biotechnology Research Institute | Method for producing natural killer cells, natural killer cells produced thereby, and composition for treating cancers and infectious diseases containing the same |
| WO2015067089A1 (zh) * | 2013-11-08 | 2015-05-14 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法 |
| WO2016008937A1 (en) * | 2014-07-16 | 2016-01-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the intercellular transfer of isolated mitochondria in recipient cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KITANI T et al., Internalization of isolated functional mitochondria: involvement of micropinocytosis, J. Cell. Mol. Med., 2014, Vol. 18, No. 8, pp. 1694-1703. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220000930A1 (en) | Natural killer cell containing exogenous mitochondrium and pharmaceutical composition comprising same | |
| CN106659742B (zh) | 表达免疫应答刺激细胞因子以吸引和/或激活免疫细胞的基因修饰间充质干细胞 | |
| KR20170121178A (ko) | 보편적인 살해 t-세포 | |
| ES2886483T3 (es) | Métodos de rastreo para dianas para la terapia contra el cáncer | |
| US20210179687A1 (en) | Targeting lilrb4 with car-t or car-nk cells in the treatment of cancer | |
| KR101415039B1 (ko) | 자기유래 활성화 림프구의 대량 증식을 위한 배지 조성물 및 배양방법 | |
| CN106754723B (zh) | 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用 | |
| Huang et al. | Class II transactivator knockdown limits major histocompatibility complex II expression, diminishes immune rejection, and improves survival of allogeneic bone marrow stem cells in the infarcted heart | |
| Kwan et al. | Macrophages mediate the antitumor effects of the oncolytic virus HSV1716 in mammary tumors | |
| JP2021167345A (ja) | Ｇｖｈｄ又は腫瘍を治療するための骨髄系由来サプレッサー細胞のインフラマソーム活性化の調節 | |
| Jung et al. | Stimulatory effect of HGF‐overexpressing adipose tissue‐derived mesenchymal stem cells on thymus regeneration in a rat thymus involution model | |
| JP2017520582A (ja) | 関節リウマチ治療のための間葉系間質細胞 | |
| US20150272992A1 (en) | Treatment of Tumors with Activated Mesenchymal Stem Cells | |
| US10155024B2 (en) | Composition for preventing or treating B-cell lymphoma comprising IL-21 expressing mesenchymal stem cells | |
| Shin et al. | Cytokine engineered NK-92 therapy to improve persistence and anti-tumor activity | |
| RU2777371C2 (ru) | Клетка-естественный киллер, содержащая экзогенную митохондрию, и фармацевтическая композиция, включающая такую клетку | |
| Khaleafi et al. | Reovirus infection of tumor cells reduces the expression of NKG2D ligands, leading to impaired NK-cell cytotoxicity and functionality | |
| US20230346901A1 (en) | Methods and vaccine compositions to treat cancers | |
| RU2420307C2 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИРУЮЩИХ TGF-бета1 ПЕПТИДОВ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МОДУЛИРУЮЩЕГО ИММУННЫЙ ОТВЕТ АГЕНТА | |
| US20220257709A1 (en) | P21 Expressing Monocytes for Cancer Cell Therapy | |
| WO2024044628A2 (en) | Oncolytic virus-infected immune cells and methods of use | |
| CN118406718A (zh) | 一种提高nk细胞功能的方法 | |
| CN115212231A (zh) | 调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂 | |
| Yamaoka et al. | WS/PP-024b-11 Spatiotemporal regulation of heat shock protein 90-chaperoned self-DNA and CpG-oligodeoxynucleotide for type-I interferon induction via targeting to static early endosome Y. Tamura, K. Saito, K. Okuya, T. Torigoe, N. Sato. Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan | |
| Smith | Exploiting the Glioblastoma Tumor Microenvironment for Enhanced Oncolytic Herpes Simplex Virus Therapy |