CN115212231A - 调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂 - Google Patents

调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种调节间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells,MSCs)免疫调节功能方法和试剂。鉴于MSCs在科研领域及临床上所体现的免疫调节的复杂性，其在临床应用上仍然存在瓶颈。本发明人致力于改进MSCs的免疫调节功效，在深入研究的基础上首次证实，糖皮质激素可以调控MSCs产生VEGF‑C，从而调控CD8+T细胞增殖；TNF‑α可与Dex协同发挥调控VEGF‑C的作用。鉴于CD8+T细胞的多少或活性的变化必然关系到免疫作用的变化，本发明为调节免疫的药物的设计提供了新的途径。

Description

调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于机体大部分组织基质中的干细胞，可以从多种组织中分离获得，如骨髓、脂肪、脐带等。MSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的多向分化潜能。研究发现体外培养MSCs具有向损伤组织迁移的特性，参与调节损伤修复，其中损伤组织中的炎症与MSCs的相互作用在决定MSCs的修复特性中发挥不可或缺的作用。以MSCs调节炎症反应和参与组织修复再生特性为基础的细胞治疗的发现将干细胞在炎症性疾病治疗中的应用带入了新纪元。目前，关于MSCs的研究主要集中在体外扩增MSCs的分化潜能和免疫调节功能。研究认为MSCs不仅为组织重构提供所需的细胞来源，更重要的是通过调节炎症反应“赋能”其他细胞促进组织修复。尽管以MSCs为基础的细胞替代方式在某些特定疾病治疗中占重要作用，但是最近研究发现，MSCs的治疗作用主要归因于其在炎症环境调控下发挥的免疫调节功能。在炎症因子刺激下，MSCs产生大量免疫调节因子、趋化因子和生长因子，调节组织炎症微环境和组织干细胞或组织前体细胞，并促进组织修复。MSCs具有强大的免疫抑制作用，既可以抑制固有免疫应答，也能影响适应性免疫应答，但这种免疫调节功能并非先天具有，而需要炎症因子诱导。
MSCs的免疫调节能力取决于其所处微环境中各种炎症分子的种类和浓度。不同的炎症状态极大地影响MSCs对疾病的治疗作用，提示MSCs免疫调节的可塑性。研究发现，在强炎症状态下，MSCs可以有效地治疗移植物抗宿主病(Graft versus-host disease，GvHD)，但是若将MSCs在骨髓移植同一天输注，即炎症反应尚未开始时，MSCs的治疗效果不显著。此外，MSCs对于处于缓解期的实验性自身免疫性脑脊髓炎几乎没有疗效。由此可见，MSCs免疫调节能力具有很强的可塑性且与炎症状态密切相关。
在炎症性疾病的病理进程中，高水平炎症因子浓度往往与疾病急性期密切相关，而在疾病的慢性或缓解期，炎症因子呈现相对较低浓度，可能是机体的自我修复阶段。以“棋盘式梯度”浓度检测MSCs在不同炎症因子(IFN-γ和TNF-α)浓度下的免疫调节功能，发现炎症因子水平的动态变化可以影响MSCs的免疫调节功能，使其发挥免疫抑制或免疫促进作用，由此奠定了MSCs免疫调节可塑性的研究基础。究其原因，主要是低水平的炎症因子不足以诱导MSCs表达高水平诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)或吲哚胺-2，3-双加氧酶(indoleamine2,3dioxygenase,IDO)发挥免疫抑制作用，反而会在MSCs分泌大量趋化因子的作用下招募淋巴细胞至其周围，加剧炎症反应。因此，一氧化氮(nitric oxide,NO)和IDO是调控MSCs免疫调节功能的“开关”。在低剂量刀豆蛋白A激活的T细胞和MSCs共培养体系中，MSCs同样表现出类似的免疫增强功能。以上研究提示，高炎症水平刺激MSCs发挥免疫抑制功能，而低炎症环境水平刺激MSCs发挥免疫促进作用。然而，不同炎症环境中调控MSCs活性的机制网络尚未明确。
MSCs免疫调控功能受炎症环境中多种因素的影响，而免疫抑制剂常用于治疗免疫系统相关疾病，这引发一个重要的科学问题：免疫抑制剂是否影响MSCs的免疫调控功能？免疫抑制剂治疗作用与MSCs类似，都是通过抑制效应性T细胞，下调炎症反应。基于此，一些研究将MSCs与常用免疫抑制剂环孢霉素A或地塞米松(Dex)联合治疗。环孢霉素A可阻断T细胞活化，常用于治疗器官移植排斥或自身免疫性疾病。MSCs也可以在移植小鼠中诱导耐受，但合用环孢霉素A会逆转MSCs的治疗效果。此外，TGF-β也能使MSCs失去免疫抑制功能。总的来说，这些发现对指导MSCs临床应用有重要意义。
利用异体同单倍型骨髓来源的MSCs治疗环孢霉素和类固醇抵抗的IV级急性GvHD(aGvHD)患者标志着MSCs临床应用的开端。随后，其他如系统性红斑狼疮等药物抵抗性炎症疾病都有被MSCs成功治愈的例子。在这种免疫抑制剂抵抗患者中，持续炎症可能激发了MSCs的免疫抑制功能。相反，在免疫抑制剂敏感患者中，MSCs和环孢霉素或类固醇联合治疗反而没有治疗效果。这些研究都提示，MSCs的免疫抑制功能需要较强炎症因子诱导，而低浓度的炎症因子则会使其发挥免疫促进作用。
如何有效提高MSCs的免疫抑制功能以开发更多基于MSCs的临床治疗新方案是本领域亟待研究的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂
在本发明的第一方面，提供VEGF-C、其下游信号通路的或它们的调节剂在制备调节MSCs的免疫调节作用的药物组合物中的用途；较佳地，所述的免疫调节作用基于调节CD8+T细胞的增殖发挥作用。
在一个优选例中，所述的药物组合物中，还包括：糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
在另一优选例中，VEGF-C或其下游信号通路的调节剂是下调剂，所述的免疫调节为免疫抑制；所述免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；较佳地包括(但不限于)：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括(但不限于)：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化。
在另一优选例中，所述的VEGF-C或其下游信号通路的下调剂包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调(包括敲除)VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为抑制VEGF-C受体(VEGFR3)酪氨酸激酶活性的小分子化合物MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体。
在另一优选例中，VEGF-C或其下游信号通路的调节剂是VEGF-C或其上调剂，所述的免疫调节为免疫增强；较佳地，所述的免疫增强包括促进CD8+T细胞增殖；较佳地，所述的免疫增强包括(但不限于)：抑制肿瘤，抑制病原体(如病毒或细菌)。
在另一优选例中，所述的VEGF-C上调剂包括：外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
在本发明的另一方面，提供一种经修饰的MSCs(或MSCs培养物)，其中引入了外源的VEGF-C或其下游信号通路的调节剂。
在一个优选例中，所述调节剂为VEGF-C或其下游信号通路的下调剂，包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调(包括敲除)VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述的PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体。
在另一优选例中，所述调节剂为VEGF-C或其上调剂，包括外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
在另一优选例中，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
在本发明的另一方面，提供所述的经修饰的MSCs(或MSCs培养物)的应用，用于制备免疫调节的药物组合物；其中，引入或添加VEGF-C或其下游信号通路的下调剂的MSCs用于免疫抑制；引入或添加VEGF-C或其上调剂的MSCs用于免疫增强。
在本发明的另一方面，提供一种用于免疫抑制的药物组合物或药盒，其中包括MSCs，以及促进MSCs的免疫抑制作用的物质，所述物质为VEGF-C或其下游信号通路的下调剂；较佳地，所述免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；更佳地包括(但不限于)：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括(但不限于)：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化。
在本发明的另一方面，提供一种用于免疫抑制的药物组合物或药盒，其中包括所述的经修饰的MSCs且其中引入或添加了VEGF-C或其下游信号通路的下调剂；较佳地，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
在一个优选例中，所述的药物组合物或药盒中还包括：糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
在另一优选例中，所述的VEGF-C或其下游信号通路的下调剂包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调(包括敲除)VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为抑制VEGF-C受体(VEGFR3)酪氨酸激酶活性的小分子化合物MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于免疫增强的药物组合物或药盒，包括MSCs，以及促进MSCs的免疫增强作用的物质；所述物质为VEGF-C上调剂；较佳地，所述的免疫增强包括：抑制肿瘤，抑制病原体(如病毒或细菌)；较佳地，所述的VEGF-C上调剂包括；外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
在本发明的另一方面，提供一种用于免疫增强的药物组合物或药盒，包括所述的经修饰的MSCs且其中引入了VEGF-C或其上调剂；较佳地，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
在本发明的另一方面，提供一种筛选免疫调节药物(包括潜在药物)的方法，所述方法包括：(1)提供MSCs细胞与CD8+T细胞共存的体系，所述MSCs细胞表达VEGF-C，所述CD8+T细胞表达VEGFR3；(2)以候选物质处理权利要求1所述的体系，并测定VEGF-C表达或活性、VEGF-C与VEGFR3相互作用情况或CD8+T细胞增殖情况；(3)分析(2)的测定结果，若VEGF-C表达或活性降低、VEGF-C与VEGFR3相互作用降低和/或CD8+T细胞增殖受抑制，则该候选物质为免疫抑制的药物；若VEGF-C表达或活性提高、VEGF-C与VEGFR3相互作用增强和/或CD8+T细胞增殖被促进，则该候选物质为免疫增强的药物。
在另一优选例中，所述方法步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述体系中；和/或，步骤(2)包括：检测测试组的体系中VEGF-C表达或活性、VEGF-C与VEGFR3相互作用情况或CD8+T细胞增殖情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的体系。
在另一优选例中，所述的体系中还包括添加糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，酸氟替卡松。
在另一优选例中，所述的免疫调节包括免疫抑制或免疫增强。
在另一优选例中，所述的免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；更佳地包括(但不限于)：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括(但不限于)：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化；
在另一优选例中，所述的免疫增强包括：抑制肿瘤，抑制病原体(如病毒或细菌)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Dex通过CD8+T细胞逆转MSCs的免疫抑制作用。(A)aGvHD小鼠存活曲线；8W左右的C57BL/6×C3H F1小鼠接受致死辐照(13Gry)；24小时后，将C57BL/6小鼠全骨髓细胞(5×106)和脾细胞(5×107)混合经尾静脉移植至F1小鼠体内；在骨髓移植的第5天和7天，小鼠接受尾静脉输注BM-MSCs(5×105)、皮下注射Dex(2mg/kg，每周三次)或者二者联合处理；每天观察小鼠状态，统计小鼠存活时间，绘制小鼠存活曲线；n＝12或者16。(B)第21天肝脏H&E染色；在第21天，取材肝脏进行固定，并进行H&E染色分析，观察淋巴细胞在肝脏的浸润情况；标尺长度为50μm。(C)脾细胞增殖情况；将anti-CD3活化的小鼠脾脏淋巴细胞(Spl，2×105)单独或者与小鼠骨髓来源MSCs(1×104)共培养于96孔板中，同时加入不同浓度梯度的Dex，培养结束前6小时加入3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-Tdr)，检测脾细胞增殖情况。(D)淋巴细胞绝对数；将淋巴细胞与MSCs共培养48小时后，吹出共培养体系内悬浮的淋巴细胞，进行计数。(E)流式分析共培养体系中CD4+和CD8+T细胞亚群变化；将淋巴细胞与MSCs共培养48小时后，将共培养体系内的悬浮淋巴细胞染色，分析CD8+T和CD4+T细胞的比例与Dex浓度的变化关系。(F-G)CD8+T细胞增殖和总数；将MSCs与naive CD8+T细胞共培养，在体系内加入不同浓度的Dex，利用3H-Tdr掺入法检测T细胞的增殖情况。(H-I)CD4+T细胞增殖和总数。将MSCs与naive CD4+T细胞共培养，在体系内加入不同浓度的Dex，利用3H-Tdr掺入法检测T细胞的增殖情况。统计分析采用学生t检验(双尾)和Log-rank检验(Mantel-Cox)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05和**p<0.01。
图2、Dex诱导MSCs产生VEGF-C促进CD8+T细胞增殖。(A)CD8+T细胞增殖情况。将MSCs与anti-CD3/CD28活化的CD8+T细胞共培养，并分为四组。G1：正常MSCs(G1)；G2：Dex处理组(1ng/ml)；G3：CD8+T细胞共培养组；G4：Dex处理和CD8+T细胞共培养组。利用Affymetrix 3表达谱芯片分析以上四组细胞的两两比较，获取以下组：G4 vs G1、G4 vs G2和G4 vs G3的上调基因(这里上调基因的初选标准是2倍上调)。随后，利用韦恩集(Venny)分析法找出以上三组上调基因的交集及对应的序列。(B)Venny分析。将需要分析的基因ID号输入MAS生物功能注释系统，进行GO分析，以便于详细了解目标基因的功能、亚细胞分布和信号通路联系等。根据表达量变化排序，列举了韦恩集分析得到的22个基因中表达上调较高的基因，并注释了基因名、亚细胞分布和基因ID号。(C)热图。选取上调和下调显著的部分基因制作用热图。红色表示上调，绿色表示下调。(D)差异基因表达列表。(E)Vegfc表达水平。用anti-CD3刺激新鲜分离的脾细胞，48小时后离心收取脾细胞培养上清液。将脾细胞培养上清按照1∶1的比例加入MSCs培养体系，同时加入不同浓度的Dex。继续培养24小时，抽取RNA用RT-PCR检测MSCs中mRNA表达量变化。(F)Vegfa mRNA表达水平。(G)Vegfb mRNA表达水平。(H)VegfdmRNA表达水平。(I)敲低MSCs Vegfc表达抑制Dex诱导的CD8+T细胞增殖。统计分析采用学生t检验(双尾)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05。
图3、VEGF-C加剧aGvHD。(A)VEGF-C治疗示意图。提前两天给小鼠饮水中添加新霉素(0.5mg/ml)。将8W左右的C57BL/6×C3H F1小鼠致死辐照13Gry(为减轻肠毒性辐照分成两次间隔4小时，第一次7Gry，第二次6Gry)。次日，后将C57BL/6小鼠全骨髓细胞(5×106)；或者全骨髓细胞(5×106)与总脾细胞(5×107)混合后经尾静脉移植至F1小鼠体内。(B)aGvHD小鼠存活曲线。骨髓移植7到10天后，皮下注射VEGF-C(10μg/mice/day)，持续7至10天。每天观察小鼠状态，计算存活曲线。(C)第21天aGvHD小鼠肺肝脏和结肠H&E染色。(D)VEGF-C处理对aGvHD小鼠外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例的影响。(E-F)VEGF-C处理对aGvHD小鼠肝脏淋巴细胞和CD8+T细胞数量的影响。在骨髓移植20～21天，对小鼠实行安乐死，用小鼠淋巴细胞分离液分离外周血中的单核细胞、用Percoll密度梯度离心分离肝脏中的单核细胞、用研磨和裂解红细胞的方法获得小鼠脾脏中的淋巴细胞。计数各组中上述组织中的淋巴细胞总数，根据比例计算各个组织中CD8+T细胞的绝对数。n＝4～6。(G-H)VEGF-C处理对aGvHD小鼠外周血中淋巴细胞和CD8+T细胞数量的影响。(I-J)VEGF-C处理对aGvHD小鼠脾细胞和CD8+T细胞数量的影响。(K)VEGF-C处理对aGvHD小鼠肝脏CD8+T细胞EdU掺入的影响。统计分析采用学生t检验(双尾)和Log-rank检验(Mantel-Cox)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
图4、VEGF-C通过VEGFR3促进CD8+T细胞增殖。(A)VEGF-C促进T细胞增殖。MLR反应：将(Stimulator)Balb/C小鼠的脾脏取出，获得单细胞悬液，之后进行20Gry辐照抑制其中T细胞的增殖。将(Responder)C57BL/6小鼠脾脏单细胞悬液，通过磁珠分选方法获得的纯化的CD8+T细胞。将Stimulators(8×105)与Responders(2×105)共培养，在共培养体系中加入不同浓度的VEGF-C，培养72小时后加入3H标记的胸腺嘧啶核苷，检测T细胞增殖情况。(B)VEGF-C促进anti-CD3/28激活的CD8+T细胞增殖。将anti-CD3(2.5μg/ml)过夜包被在96孔板上，之后每孔加入的纯化分离的
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CD8+T细胞(2×105)。同时，在悬液中加入anti-CD28(1μg/ml)用于激活T细胞。在培养体系中加入不同浓度的VEGF-C因子，培养48小时后用3H-Tdr检测T细胞增殖情况。(C)VEGF-C对CD8+T细胞CD69和CD25表达的影响。细胞分离纯化CD8+T细胞，利用antiCD3/28激活，并加入不同浓度VEGF-C。用anti-CD69和anti-CD25抗体及isotype染色，流式检测表达量变化。(D)VEGF-C对CD8+T细胞凋亡的影响。(E)VEGF-C对CD8+T细胞IFN-γ表达的影响。(F)CD8+T细胞表面VEGFR2和VEGFR3的表达情况。利用磁珠分选的方式获得纯化的CD8+T细胞，分别用anti-VEGFR2-PE和anti-VEGFR3-APC抗体及对应的isotype进行染色，流式检测细胞表面受体的表达情况。(G)MLR检测CD8+T细胞增殖。其中，以Stat3fl/fl和Stat3fl/flCD8Cre小鼠中分离的CD8+T细胞为Responder细胞。(H)aGvHD小鼠存活曲线。利用Stat3fl/fl和Stat3fl/flCD8Cre骨髓细胞和脾细胞诱导小鼠aGvHD。(I)CD8+T细胞增殖情况。将anti-CD3/28活化的小鼠CD8+T细胞(2×105)单独或者与小鼠骨髓来源MSCs(1×104)共培养于96孔板中。然后，利用Dex(10ng/ml)、VEGF-C(800ng/ml)和MAZ51(10μM)处理42小时。(J)小鼠存活时间。构建小鼠aGvHD模型。第5天，小鼠接受注射MSCs(5×106)和Dex(2mg/kg)或MAZ51(15mg/kg/d)治疗(n＝7)。统计分析采用学生t检验(双尾)和Log-rank检验(Mantel-Cox)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
图5、VEGF-C通过PI3K/AKT通路促进CD8+T细胞增殖。(A)GO分析。在有或没有Dex的情况下，与MSCs共培养的CD8+T细胞中富集的信号通路。(B)热图。在有或没有Dex的情况下，与MSCs共培养的CD8+T细胞中与细胞周期相关的基因表达。(C)VEGF-C对anti-CD3/CD28活化的CD8+T细胞Cyclin D1、Cdk2、Cdk4和Cdk6表达的影响。(D)VEGF-C对PMA+Inomycin活化的CD8+T细胞中p-p85/p55、Cdk2、Cdk4和Cdk6表达的影响。(E)VEGF-C对anti-CD3/CD28活化的CD8+T细胞中p-p85/p55和p-Akt表达的影响。(F)VEGFR3在CD4+T细胞上的表达情况。(G)Dex不影响共培养体系中CD4+T细胞Cyclin D1表达。(H)VEGF-C不影响anti-CD3/CD28活化的CD4+T细胞表达p-p85/p55、p-Akt和Cyclin D1。(I)免疫印迹分析VEGFR3fl/fl和VEGFR3fl/ flCD8Cre小鼠中CD8+T细胞裂解液中p85/p55、Akt及其磷酸化情况。(J)抑制PI3K/AKT信号通路废除VEGF-C对CD8+T细胞增殖的促进作用。利用anti-CD3/CD28刺激CD8+T细胞，利用LY294002(20μM)或Afuresertib(1μM)处理CD8+T细胞，分析二者对VEGF-C所诱导的CD8+T细胞增殖的影响。统计分析采用学生t检验(双尾)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05和**p<0.01。
图6、TNF-α协同Dex促进VEGF-C表达。(A)aGvHD进展过程中指定时间点小鼠血浆中VEGF-C水平。(B)糖皮质激素治疗敏感或者不敏感aGvHD患者血浆VEGF-C水平。aGvHD患者(敏感)病程前/后(n＝12)，aGvHD患者(不敏感)病程前/后(n＝16)，aGvHD患者(不敏感)病程中血浆VEGF-C水平。(C)MSCs培养上清中VEGF-C浓度。利用LPS(100ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)处理MSCs，并检测培养上清中VEGF-C水平。(D)MSCs培养上清中VEGF-C水平。利用TNFα(10ng/ml)处理MSCs，利用ELISA检测MSCs培养上清中VEGF-C水平。(E)Vegfd mRNA表达水平。利用Dex(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)及Dex(10ng/ml)和TNFα(10ng/ml)二者联合处理(Combo)MSCs 24小时，利用RT-PCR检测Vegfd mRNA表达。(F-G)VEGF-C表达水平。利用Dex(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)及二者联合处理MSCs 24小时，利用RT-PCR和WB检测VEGF-CmRNA和蛋白水平。(H)Vegfc表达水平。使用siRNA敲低MSCs中Tnfr1表达，利用TNFα(10ng/ml)刺激并检测MSCs中Vegfc mRNA表达水平。(I)敲低MSCs Tnfr1表达抑制Dex诱导的CD8+T细胞增殖。将anti-CD3/CD28活化的CD8+T细胞与Ctrl-MSCs或siRNA-Tnfr1 MSCs共培养。观察Dex对CD8+T细胞增殖的影响。(J-K)VEGF-C表达水平。利用TNFα(3ng/ml)、Dex(50ng/ml)和RU486(1μM)处理MSCs，检测MSCs中VEGF-C mRNA和蛋白表达水平。(L)VEGF-C表达水平。以不同浓度Dex(1、10、100ng/ml)和TNFα(5ng/ml)联合处理MSCs，检测MSCs中VEGF-C mRNA水平。统计分析采用学生t检验(双尾)和Log-rank检验(Mantel-Cox)。统计结果以mean±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。
图7、地塞米松与MSCs共用抑制黑色素瘤生长。将5×105的B16黑色素瘤细胞单独或者与2.5×105的MSCs共混，通过肌肉注射于C57BL/6小鼠大腿外侧。5天后，对荷瘤小鼠腹腔注射1mg/kg的Dex，Dex每隔3天注射一次。肿瘤生长第12天后，对肿瘤进行剥离称重并分析。统计学显著性表示为：**p<0.01；三次独立实验重复，n＝7。
图8、Dex与MSCs联用组肿瘤部位和外周血中有更多的CD8+T细胞。(A)利用Percoll密度梯度离心将肿瘤组织中的白细胞分离，经流式检测分析肿瘤组织中的T细胞亚群。(B)统计分析在CD45+细胞中的CD4+和CD8+T细胞亚群。(C)总淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞的绝对计数。在Dex与MSCs公用组中，CD8+T细胞比例和总数有明显上升，然而CD4+T细胞没有明显变化。(D)分离外周血中的淋巴细胞，分析CD4+和CD8+T细胞亚群。(E)总淋巴细胞和CD8+T细胞计数。统计学显著性表示为：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图9、Dex与MSCs共用的抑制肿瘤生长的作用依赖于免疫系统和MHC-1限制的CD8+T细胞。将5×105的B16黑色素瘤细胞单独或者与2.5×105的MSCs共同，通过肌肉注射于(A)NOD-SCID小鼠和(B)β2M-/-小鼠的大腿外侧。5天后，对荷瘤小鼠腹腔注射1mg/kg的Dex，Dex每隔三天注射一次。肿瘤生长第12天后，对肿瘤进行剥离称重并分析。n＝7(A)，n＝5～7(B)三次独立实验重复。
具体实施方式
鉴于MSCs在科研上及临床上所体现出的免疫调节复杂性，其在临床应用上仍然存在瓶颈。本发明人致力于改进MSCs的免疫调节功效，在深入研究的基础上首次证实，糖皮质激素(如地塞米松)可以调控MSCs产生VEGF-C，从而调控CD8+T细胞增殖；TNF-α可与Dex协同发挥调控VEGF-C的作用。鉴于CD8+T细胞的多少或活性的变化必然关系到免疫作用的变化，本发明为调节免疫的药物的设计提供了新的途径。
术语
如本文所用，所述的“自身免疫性疾病”是其中免疫系统针对自身(例如，一个或多个自身抗原)发动一种所不希望的免疫应答的任何疾病。例如，自身免疫性疾病包含作为自身靶向免疫应答的一部分的对身体细胞的异常破坏。又例如，自身破坏表现为一个器官(例如，结肠或胰腺)的功能失常。本发明中，尤其关注CD8+T细胞过度增殖相关的“自身免疫性疾病”。
如本文所用，所述的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、蛋白/蛋白、蛋白/基因(或基因转录本)相互作用抑制剂等。
如本文所用，所述的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂、增强剂、稳定剂、蛋白/蛋白、蛋白/基因(或基因转录本)相互作用促进剂等。
如本文所用，术语“上调”、“增强、“提高”、“增加”、“促进”、“强化”等是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与“对照”或普通/常规状态相比较，呈现具有统计学意义的(或显著的)上调，如至少有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、50％、80％、100％或更显著的上调(如但不限于基因表达上调、蛋白水平上调、蛋白之间相互作用上调等)。
如本文所用，术语“下调”、“减少”、“降低”、“抑制”、“弱化”、“阻滞”等是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与“对照”或普通/常规状态相比较，呈现具有统计学意义的(或显著的)下调，如至少有2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、50％、80％、100％或更显著的下调(如但不限于基因表达下调、蛋白水平下调、蛋白之间相互作用下调等)。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者不同来源的核酸或蛋白与宿主之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
基于T细胞的免疫调节
人类免疫系统已经进化出精密的调控机制，它既能对微生物入侵者作出快速而具有破坏性的反应，同时又不伤害宿主自身组织。研究显示，这种微妙平衡的调节主要取决于免疫系统中的CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4和CD8是T淋巴细胞上的抗原蛋白。其中，CD4+T细胞被称为辅助性T细胞，CD8+T细胞被称为细胞毒性T细胞。
主要组织相容性复合物I类和II类蛋白(MHC或者人的HLA)结合肽抗原，并将它们呈递到细胞表面，用于被表达与特异性MHC-肽组合体匹配的特殊的T细胞受体(TCR)之T淋巴细胞识别。跨膜糖蛋白CD8和CD4是其抗原反应分别受I类和II类MHC分子限制的T淋巴细胞不同种群的特征。在胸腺发育以及在成熟T淋巴细胞受抗原呈递细胞作用而活化的过程中，CD8和CD4在T细胞的分化和选择中都起主要作用。因此，认为CD8和CD4是T细胞受体的主要辅助分子。尽管CD8和CD4是免疫球蛋白超家族蛋白质，并且通过与MHC分子而不是抗原肽结合来决定抗原限制，它们相似功能的结构基础表现非常不同。它们的序列相似性低，而且CD4作为单体在细胞表面表达，而CD8作为αα同源二聚体或αβ异源二聚体表达。成熟细胞毒淋巴细胞中，CD8的免疫学作用是复杂的。目前本领域中推定的CTL功能包括：第一，CD8在T细胞信号传递中发挥作用。第二，CD8的一个明显的功能可能是辅助细胞-细胞粘附，通过增加相互作用的亲合力粘连T细胞和抗原呈递细胞。第三，CD8可作为参与两种受体与MHC/肽配体协同结合机制的TCR的共同受体。
本发明中，本发明人比较了Dex作用于MSCs作用、导致VEGF-C上调后引起的对于CD4+T细胞以及CD8+T细胞的影响作用。结果显示，VEGF-C上调后CD4+T细胞细胞并没有显著的影响，而CD8+T细胞的增殖则发生显著的增加，从而使得总淋巴数量发生上调。
根据本领域知识，CD8+T细胞具有识别以及杀伤肿瘤细胞的能力，其还能杀死被病原体(如病毒或细胞)感染的细胞，并摧毁外来或异常的细胞。因此，以杀伤肿瘤以及抗病原体等作为治疗目标时，提升机体的CD8+T细胞是有效的途径。
另一方面，CD8+T细胞的过度增殖导致免疫过度，由此，若以免疫抑制(如缓解自身免疫性疾病)为治疗目标时，降低机体的CD8+T细胞数量是有效的途径。
免疫抑制方面的应用
本发明人发现，糖皮质激素(如地塞米松)通过促进MSCs产生VEGF-C，后者促进CD8+T细胞增殖，从而抑制MSCs的免疫抑制效果(例如抑制其对aGvHD的治疗效果)；进一步地也发现，TNF-α协同Dex促进VEGF-C表达。从而，靶向下调VEGF-C及其参与的相关通路的物质可被应用于促进MSCs的免疫抑制作用，有利于免疫性疾病(如自身免疫性疾病，移植物抗宿主病，多发性硬化)的治疗。所述的免疫性疾病一般为免疫过度、免疫紊乱相关的疾病。
基于本发明人的这一发现，提供了VEGF-C或其下游信号通路(包括PI3K/AKT通路，其受体相关的信号通路)的下调剂在制备促进MSCs的免疫抑制作用的药物组合物中的用途。
本发明所述的免疫抑制作用基于抑制CD8+T细胞增殖起作用。因此所述的免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；此类疾病包括(但不限于)：抑制自身免疫性疾病，炎症等；更具体地包括(但不限于)：抑制移植物抗宿主病等。CD8+T细胞增多也出现在多发性硬化症患者。因此，本发明的方案也可应用于多发性硬化症的缓解或治疗。
本发明也提供了用于免疫抑制的药物组合物，包括MSCs以及促进MSCs的免疫抑制作用的物质，所述物质为VEGF-C或其下游信号通路的下调剂。
作为本发明的优选方式，所述免疫抑制的药物组合物中，还包括糖皮质激素，包括地塞米松(Dex)等。
本发明中，所述的VEGF-C(包括其下游信号通路)或TNFR1基因或蛋白(包括其下游信号通路)的下调剂是指任何可降低VEGF-C或TNFR1蛋白的活性、降低VEGF-C或TNFR1基因或蛋白的稳定性、下调VEGF-C或TNFR1蛋白的表达、减少VEGF-C或TNFR1蛋白有效作用时间、或抑制VEGF-C或TNFR1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调VEGF-C或TNFR1有用的物质，从而可用于抑制免疫。例如，所述的下调剂是：特异性干扰VEGF-C或TNFR1基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性与VEGF-C或TNFR1基因编码的蛋白结合的抗体或配体，等等。
也可以通过影响VEGF-C的上游通路，来下调进VEGF-C的表达。
作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂是针对VEGF-C或TNFR1的小分子化合物。本领域技术人员可以采用本领域的常规筛选方法，来进行这类小分子化合物的筛选。
作为本发明的一种选择方式，所述的下调剂是一种VEGF-C或TNFR1特异性的干扰RNA分子(shRNA)，采用干扰RNA分子，可显著地下调MSCs中VEGF-C或TNFR1，对于免疫抑制具有作用。本发明对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的另一种选择，可采用CRISPR/Cas9系统进行靶向的基因编辑，从而在MSCs中敲除VEGF-C或TNFR1基因。常见的敲除VEGF-C或TNFR1基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。
免疫增强方面的应用
本发明人也发现，利用糖皮质激素(如地塞米松)促进MSCs产生VEGF-C，后者促进CD8+T细胞增殖，也有利于促进MSCs的免疫增强作用，有利于需要进行免疫增强的疾病的治疗，例如肿瘤的治疗。本发明人的研究已显示，CD8+T细胞的增殖被促进后，可使得机体总淋巴细胞数显著增加，这有利于机体对肿瘤的杀伤作用。
基于本发明人的这一发现，提供了VEGF-C或其上调剂在制备促进MSCs的免疫增强作用的药物组合物中的用途；较佳地，所述的免疫增强作用通过促进CD8+T细胞增殖起作用；较佳地，所述的免疫增强包括但不限于：抑制肿瘤，抑制病原体(如病毒或细菌)等。
作为本发明的优选方式，所述免疫增强的药物组合物中，还包括糖皮质激素，包括地塞米松(Dex)等。
本发明中，所述的VEGF-C上调剂包括：外源的VEGF-C或含有VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
本发明中，所述的VEGF-C上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高VEGF-C的活性、提高VEGF-C的稳定性、上调目的的表达、增加VEGF-C有效作用时间的物质、调节VEGF-C的磷酸化水平而促进蛋白激活，这些物质均可用于本发明，作为对于上调VEGF-C有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
在本发明的一种实施方式中，可以利用VEGF-C蛋白本身的或其上调剂来提高VEGF-C蛋白的表达。例如，所述的上调剂是：过表达VEGF-C蛋白的表达载体等。
也可以通过影响VEGF-C的上游通路，来上调VEGF-C的表达。
细胞、组合物及试剂盒
MSCs是一群源于中胚层的具有高度自我更新能力和多分化潜能的成体干细胞。其相对容易获得，体外扩增培养技术成熟。
基于本发明人的新发现，本发明提供了经修饰的MSCs(包括MSCs培养物)。所述修饰方法包括但不限于本发明中使用的方法。在一些实施方案中，所述细胞在体外或离体进行修饰。
藉由下调VEGF-C或其下游信号通路的方法，所述经修饰的MSCs中引入所述VEGF-C下调剂。
藉由上调VEGF-C的方法，所述经修饰的MSCs中引入所述VEGF-C或其上调剂。
本发明中，可将编码过表达VEGF-C或其下游信号通路的调节剂的多核苷酸序列插入到重组表达载体中，转化MSCs。只要能在MSCs内复制和稳定，多种质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体可以包括：病毒载体，非病毒载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含VEGF-C或其下游信号通路的调节剂的多核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
在一些优选的方式中，所述的表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体等。在更为优选的方式中，所述的VEGF-C或其调节剂修饰的MSCs是通过将VEGF-C或其调节剂过表达的病毒转染MSCs获得的。例如，可采用腺病毒载体进行目的基因的过表达，腺病毒转染MSCs后在MSCs中高表达VEGF-C或其调节剂，可实现较高的感染率。其他病毒载体或非病毒载体也是可应用的。
作为本发明的优选方式，所述的经修饰的MSCs或其培养物，还包括以糖皮质激素处理，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)等。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如104-109个细胞/ML；较佳的105-108个细胞/ML；更佳的，106-107个细胞/ML)的所述的经修饰的MSCs，以及药学上可接受的载体。
通常，可将所述细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
药学上可接受的载体可包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的经修饰的MSCs的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的经修饰的MSCs的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，根据治疗状况的要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
作为本发明的一种优选方式，本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物(如鼠)的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的。本领域中，已经存在一些常用于剂量换算的实验动物及人的体表面积比例关系的示例，例如以下表1中所列举的。
表1
Figure BDA0003031548960000151
作为表1的查表方法的一种示例，例如：狗剂量为10毫克/公斤，12公斤的狗总剂量为12×10毫克＝120毫克；查上表70公斤人与12公斤狗相交处为3.1，所以人(70公斤)的剂量＝120毫克×3.1＝372毫克。应理解，其它物种与人之间的换算方式可以依此类推。
实际应用时，所述的药物组合物可被置于药盒中。因此，本发明还提供了用于调节免疫的药盒/试剂盒，含有：容器，以及置于容器中的重组间充质干细胞或细胞培养物。
所述的药盒/试剂盒中还可以含有糖皮质激素等。
此外，所述的药盒/试剂盒中还可以含有一些辅助用药的材料，例如注射用针管等。
此外，所述的药盒/试剂盒中还可含有使用说明书，说明基于本发明的化合物组合调节免疫的方法。
筛选方法
基于本发明人的新发现，还提供了一种筛选免疫调节药物(包括潜在药物)的方法，包括：(1)提供MSCs细胞与CD8+T细胞共存的体系，所述MSCs细胞表达VEGF-C，所述CD8+T细胞表达VEGFR3；(2)以候选物质处理权利要求1所述的体系，并测定VEGF-C表达或活性、VEGF-C与VEGFR3相互作用情况或CD8+T细胞增殖情况；(3)分析(2)的测定结果，若VEGF-C表达或活性降低、VEGF-C与VEGFR3相互作用降低和/或CD8+T细胞增殖受抑制(显著降低/抑制，如降低/抑制10％、20％、30％、50％以上或更低)，则该候选物质为免疫抑制的药物；若VEGF-C表达或活性提高、VEGF-C与VEGFR3相互作用增强和/或CD8+T细胞增殖被促进(显著提高/增强/促进，如提高/增强/促进10％、20％、30％、50％以上或更高)，则该候选物质为免疫增强的药物。
尽管上述方法中，以VEGF-C作为筛选的靶点，应理解的是，针对VEGF-C上游/下游信号通路、上游/下游基因/蛋白而进行的筛选也被包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，所述的体系中还包括添加糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松(Dex)等。
此外，还可以设置对照组，来实现定性、定量的分析。
当进行筛选时，可以采用本领域熟知的各种技术来确定蛋白或其编码基因的变化情况以及相互作用情况。
可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的转录或蛋白表达情况。这些技术包括但不限于：寡核苷酸杂交技术(如探针)，多聚酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印迹(如Western印迹)等。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于影响MSCs的免疫调节真正有用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、细胞培养及其他溶液配制
完全培养基：DMEM或者RPMI1640培养液中加入10％FBS(体积比)，100U/mlPenicillin、100U/ml Streptomycin、2mM L-Glutamine、50μMβ巯基乙醇。
流式用缓冲液(4-8℃保存)：2％FBS+PBS。
细胞冻存液：10％DMSO+50％FBS+40％DMEM。
2、细胞或动物模型
小鼠黑色素瘤B16/F0细胞：ATCC。
iNOS-/-MSCs细胞：Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppressionoccurs via concerted action of chemokines and nitric oxide(PMID:18371435)。
β2M-/-小鼠：购自美国Jackson实验室。
C57BL/6×C3H小鼠：由C3H和C57BL/6交配获得。
C3H小鼠：获自上海南方模式动物中心。
C57BL/6(H2b)小鼠：获自中国科学院上海实验动物中心。
Balb/C(H2d)小鼠：获自中国科学院上海实验动物中心。
2、小鼠骨髓来源间充质干细胞分离
小鼠的MSCs分离、培养和冻存：小鼠在安乐死之后首先分离大腿骨，再用DMEM培液将骨髓完全冲出至腿骨呈白色。骨髓细胞离心后以2×106/ml的浓度重悬于DMEM完全培养液中。贴壁培养24h后换液，此后每3天换一次培养液，MSCs会逐渐形成克隆。在形成克隆之后，挑取单个克隆MSCs并种植于96孔板单孔中，得到单克隆来源的MSCs。在细胞增殖到80％融合时及时传代。接着加入用于细胞传代的0.25％胰酶在37℃消化，按照1∶3-5比例传代或冻存。
3、小鼠脾脏单细胞悬液制备
首先安乐死6-8周C57BL/6小鼠，浸没于75％的乙醇消毒。然后用无菌手术剪次第剪开小鼠腹部表皮皮以及腹膜，鼠体左侧暴露脾脏，用镊子分离取出脾脏。将脾脏放在70μm筛网中，用无菌的1ml注射器活塞轻柔研磨，并用RPMI1640完全培养基冲洗得到单个细胞悬液。通过400g×5min离心，去除培养基，加入2-5ml红细胞裂解液并颠倒混匀，1min左右见裂解液澄清后，加入RPMI1640完全培养基终止反应。最后通过400g×5min离心，去除上清，重复洗涤3次后，使用RPMI1640重悬后，计数待用。
4、3H-Tdr淋巴细胞增殖实验
胸腺嘧啶核苷(3H-Tdr)标记的增殖实验：淋巴细胞培养终止前6h，将3H标记的胸腺嘧啶以每孔0.5μCi加入细胞培养液中，继续培养6h之后将孔板冷冻至-80℃终止。融化后通过真空细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上，用β液闪计数仪测定各孔CPM值。
5、小鼠移植物抗宿主病模型
在骨髓移植前两天，小鼠饮用水中添加0.5mg/ml的新霉素(neomycin)。骨髓移植前一天，将8-10W的C57BL/6×C3H F1小鼠辐照13Gry。24h后尾静脉输注C57BL/6的5×106全骨髓细胞和5×107的脾脏细胞。在骨髓移植的5-7天后尾静脉输注MSCs。每天观察小鼠状态，计算小鼠的存活曲线。在骨髓移植14和21天，取材脾脏、肝脏、小肠、肺脏，进行H&E染色和流式细胞分析。
6、小鼠黑色素瘤研究模型
将5×105个小鼠黑色素瘤B16/F0细胞单独或者和2.5×105MSCs一起重悬于50μLHBSS体系中，经肌肉注射于C57BL/6小鼠大腿内侧，每天观察肿瘤生长情况至肿瘤大小影响小鼠活动时(约2至3周)通过安乐死处死小鼠并剥取黑色素瘤称量重量。肿瘤长出后，开始注射Dex(1mg/kg)，每周三次。
7、组织化学染色/HE染色
实验小鼠麻醉后打开小鼠胸腔，通过心脏进行生理盐水灌注并随后用4％多聚甲醛灌注进行内固定。之后将肺脏、肝脏、结肠、脾脏等放入装有4％多聚甲醛的管子中后再次固定。将固定后的组织依次按如下步骤处理：(1)脱水：75％酒精1h；95％酒精2h，两次；100％酒精2h，重复一次。(2)透明：将脱水好的组织放入二甲苯中，60℃，20min，重复一次。(3)浸蜡：将透明好的组织放入融化的石蜡中，60℃，2h，重复一次。(4)包埋。(5)切片：将包埋好的组织块切成5μm厚的薄片。(6)展片：将切好的5μm厚度组织片铺在40℃水面上，让组织充分展平。(7)捞片：待组织展平后，将组织片捞起展平于处理好的玻片上。(8)烘片：将玻片放在37℃的烘台上烘干。
HE染色：按照本领域常规方法。
8、实时荧光定量PCR检测
进行RNA抽提(TIANGEN细胞RNA抽提试剂盒)；按照TIANGEN TIANScript cDNA第一链生成试剂盒获得逆转录产物cDNA；之后进行定量PCR。小鼠Realtime-PCR引物见表2。
表2
Figure BDA0003031548960000191
9、蛋白样品处理与免疫印迹检测
按照本领域常规方法进行蛋白样品处理与免疫印迹检测，其中所用抗体浓度如下：
一抗：anti-β-actin(1∶3000)；anti-STAT1(1∶3000)；anti-p-STAT1(1∶3000)；
二抗：HRP-anti-rabbit(1∶5000)；HRP-anti-mouse(1∶5000)。
10、慢病毒转染
(1)转染前24小时将细胞接种至12孔板，各孔加1mL完全培养基，接种密度需保证次日达到50％。
(2)转染前将病毒颗粒融化至室温并轻轻混匀后放在冰上待用。将培养基换成含有5μg/mL polybrene的完全培养基，并加入病毒颗粒，摇匀孵育过夜。
(3)加入病毒12小时后将培养基换成新鲜完全培养基，孵育过夜。
(4)待细胞接近完全融合时，按1∶3至1∶5消化传代，继续培养24-48小时。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。
(5)待细胞接近完全融合时，加入Puromycin(3-5μg/mL)进行筛选。之后每3-4天更换培养基。获得的细胞即稳定转染株。
11、CD4+T和CD8+T细胞分离
将小鼠脾脏单细胞悬液计数，之后按Miltenyi Biotec以及StemCells公司的小鼠CD4+T和CD8+T细胞分离试剂盒操作，获取纯化的细胞备用。
12、MLR混合淋巴细胞培养
MLR是检测T淋巴细胞功能的体外实验体系。将(Stimulator)Balb/C小鼠的脾脏取出进行20Gry的辐照抑制其中T细胞的增殖。同时将(Responder)C57BL/6小鼠脾脏单细胞悬液，通过磁珠分选方法获得的纯化的CD8+T细胞。将responder与stimulator以1∶1，1∶2，1∶4，1∶8的比例混合培养找出合适的培养浓度。同时加入不同浓度的VEGFC，3-4天后用3H-Tdr法检测淋巴细胞的增殖。
13、流式细胞分析
表面染色：取细胞0.5-1×106重悬于10-20μl左右FACS缓冲液中用于染色。首先将细胞用anti-CD16/CD32进行孵育，以阻断Fc受体可能带来的非特异结合。接着进行表面抗体染色，在冰上孵育30分钟，用PBS清洗两次，固定或再次用PBS重悬，进行流式分析或进行胞内染色。
胞内染色：(1)先进行细胞表面分子的染色。(2)FACS液洗一遍后，每管各加入Fixation/Permeabilization buffer 100μl，放4℃固定过夜或者室温固定30min。(3)固定后细胞比重变小，需要加大转速，使用600g转速离心5min，加入1×Permeabilizationbuffer 200μl，洗两遍。(4)600g，离心5min，加入胞内细胞因子抗体，放冰上避光染色1小时。(5)直接加入1×Permeabilization buffer 200μl，洗两次。(6)弃上清后，用4％PFA固定。(7)离心后细胞沉淀用FACS buffer 200μl重悬，即可用流式细胞仪检测分析。
实施例1、地塞米松(Dex)抑制MSCs对aGvHD的治疗效果
为了研究Dex与MSCs对急性移植物抗宿主病(aGvHD)病理进程的影响，本发明人建立了模拟人GvHD发生的小鼠骨髓移植aGvHD模型。将C57BL/6小鼠骨髓及淋巴细胞移植给经致死剂量辐照的C57BL/6×C3H F1小鼠，建立半相合混合骨髓移植造血重建aGvHD模型。aGvHD小鼠接受尾静脉输注MSCs治疗、皮下注射Dex治疗以及MSCs和Dex共同输注。结果显示，MSCs和Dex单独治疗可以显著延长小鼠的存活时间，这说明Dex和MSCs都能有效控制aGvHD病程发展(图1A)。然而，值得注意的是，Dex与MSCs共输注小鼠不仅没有延长小鼠存活，反而明显加重小鼠aGvHD病情(图1B)。组织学检测结果显示，Dex和MSCs单独治疗都能明显抑制炎症细胞浸润到肝门脉区域。相反，Dex与MSCs共输注非但不能显著改善炎症浸润，反而促进肝组织炎症细胞浸润(图1B)。以上结果提示，Dex阻断了MSCs的治疗效果。
为了更好地研究Dex与MSCs之间的相互作用，本发明人引入MSCs与T细胞共培养体外模型。将MSCs与anti-CD3激活的脾细胞共培养，并且在体系中加入不同浓度的Dex，分别检测MSCs、Dex和MSCs与Dex共同存在时对体系内脾细胞增殖的影响。结果显示，Dex对脾细胞的增殖有显著的抑制作用，而且这种抑制是剂量依赖的。MSCs对T细胞增殖也有很强的免疫抑制作用。然而，当T细胞和MSCs共培养体系中存在Dex时，MSCs对脾细胞的抑制作用随着Dex浓度的升高而被解除，在0.1-5ng/ml Dex的浓度条件下，脾细胞的增殖程度甚至超过了脾细胞对照组(图1C)。除了使用3H-Tdr方法检测脾细胞增殖外，本发明人还进行了淋巴细胞总数计数(图1D)。本发明人发现，当Dex浓度在0.5至1ng/ml区间时，共培养体系内的淋巴细胞绝对数量亦显著增加。
接下来，本发明人利用流式细胞术对共培养体系中的淋巴细胞进行亚细胞群分析。可以看到，在加入不同梯度的Dex后，活化的脾细胞中CD8+T细胞亚群被明显抑制，而CD4+T细胞则影响不大；同样，MSCs也可以显著抑制CD8+T细胞亚群增殖。然而，当共培养体系中存在Dex时，尤其在0.5-1ng/ml浓度窗口，共培养体系中的CD8+T细胞比例明显恢复，而CD4+T细胞比例始终无明显变化。流式细胞数据表明，CD8+T细胞变化趋势与淋巴细胞增殖趋势一致(图1E)。
接下来，为了明确Dex主要通过促进CD8+T细胞增殖逆转MSCs免疫抑制，本发明人利用磁珠分选纯化了
Figure BDA0003031548960000211
CD8+T细胞和CD4+T细胞并研究了Dex对二者增殖的作用。首先，利用anti-CD3/28激活共培养体系中的T细胞。同时，在共培养体系中加入不同浓度的Dex以评估Dex对T细胞增殖的影响。结果显示，Dex只能逆转MSCs对CD8+T细胞的抑制作用(图1F-G)，而对CD4+T细胞增殖无显著影响(图1H-I)。
实施例2、Dex促进MSCs产生VEGF-C
为了鉴定Dex逆转MSCs免疫抑制的关键分子，本发明人利用体外共培养系统来模拟MSCs和CD8+T细胞之间的相互作用。本发明人前期研究表明，在低浓度IFN-γ和TNF-α、TGF-β、CsA或类固醇存在情况下，MSCs可发生免疫促进作用。在这种情况下，iNOS是MSCs免疫抑制或免疫促进的开关。通过利用iNOS-/-MSCs，本发明人发现iNOS缺失的MSCs在Dex存在时依然可以逆转MSCs对CD8+T细胞的抑制作用(图2A)，这一数据表明MSCs可能通过其他因子促进CD8+T细胞增殖。
接下来，利用RNA-seq分析了Dex和共培养处理对MSCs基因表达的影响。本发明人将MSCs分为四个组，正常MSCs(G1)；Dex处理组(G2)；CD8+T细胞共培养组(G3)；Dex和CD8+T细胞共培养组(G4)。结果发现，相比于G1、G2和G3，G4组分别有1770、1765和200个基因发生上调(图2B)。通过利用Venny集筛选，本发明人鉴定出22个上调基因(三个集合的交集)。通过研究分析，本发明人定位到内皮细胞生长因子C(Vascular Endothelial Growth FactorC，VEGF-C)。数据显示，Vegfc基因发生明显上调(图2C-D)。
VEGF家族有多个成员，本发明人对VEGF家族中的Vegfa、Vegfb、Vegfc和Vegfd基因表达变化都进行了分析。本发明人用anti-CD3活化刺激过的淋巴细胞上清液代替共培养的T细胞。结果显示，Dex和T细胞培养上清对Vegfc基因表达具有协同作用(图2E)，但是，这二者对其他VEGF家族基因表达不存在协同效应(图2F-H)。
随后，本发明人构建了Vegfc敲低MSCs细胞系(shVegfc-MSCs)并研究了MSCs中VEGF-C对CD8+T细胞增殖的影响。其中，该Vegfc敲低采用的序列为：(LV3-Vegfc-mus-1400):5’-GCGAATCGACTGAAGCATTGT-3’(SEQ ID NO:11)。
本发明人发现，在Dex存在的条件下，在MSCs中敲低Vegfc显著抑制Dex对CD8+T细胞的免疫促进作用(图2I)。说明所述Vegfc敲低序列LV3-Vegfc-mus-1400效果优异。
这些结果证明，Dex通过诱导MSCs表达VEGF-C促进CD8+T细胞增殖。
实施例3、VEGF-C加剧aGvHD进展
本发明人在体内验证了VEGF-C对aGvHD进程的影响。利用高剂量辐射对C57BL/6×C3H F1小鼠清髓之后，本发明人分别进行了单纯骨髓移植(BMT组)和混合骨髓与脾脏淋巴细胞移植构建aGvHD(aGvHD组)。结果显示，VEGF-C可以显著加剧aGvHD进展，缩短小鼠存活时间(图3A-B)。
本发明人对小鼠进行组织学染色以观察肝脏、肺脏和结肠中的淋巴细胞浸润情况。由图可见，在BMT对照组中，VEGF-C几乎没有任何促进淋巴细胞浸润的作用。然而，在aGvHD组中，VEGF-C注射组小鼠肝脏胆小管及导管处浸润的淋巴细胞浸润明显增多，肝细胞水肿变性加剧；小鼠肺部表现出明显的炎性细胞浸润增加；在下结肠，显示出肠隐窝(crypt)的缩短和数量减少、粘膜上皮细胞的侵蚀、固有层(lamina propria)中淋巴细胞浸润增加，提示肠道损伤加剧(图3C)。
本发明人分析了小鼠外周血中CD8+T和CD4+T细胞的比例变化。本发明人发现，相较于BMT组，aGvHD组外周血中的CD8+T和CD4+T细胞比例均有显著上升，这提示aGvHD病程开展(图3D)。输注VEGF-C后，小鼠外周血中CD8+T细胞的比例显著上调(图3D)。此外，本发明人对外周血中的总淋巴细胞数、肝脏中浸润的总淋巴细胞数、外周血中CD8+T细胞数、肝脏中浸润的CD8+T细胞数进行了计数。结果发现，VEGF-C能上调各个组织中淋巴细胞和CD8+T细胞总数(图3E-J)。另外，aGvHD组的脾细胞相较与BMT组有所下降，而VEGF-C可以逆转这一趋势(图3I-J)。本发明人利用EdU掺入法检测了aGvHD小鼠T细胞在肝脏中的增殖情况。结果发现，VEGF-C主要促进CD8+T细胞增殖(图3K)。
以上数据表明，VEGF-C通过促进CD8+T细胞增殖加剧aGvHD进展。
实施例4、VEGF-C促进CD8+T细胞增殖
本发明人分析了VEGF-C在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中的免疫促进作用。在MLR中，C57BL/6(H2b)来源的CD8+T细胞为反应细胞，经辐照去除刺激细胞群体内T细胞增殖能力的Balb/C(H2d)脾细胞为刺激细胞。由于反应细胞和刺激细胞主要组织相容性抗原不同，刺激细胞可同时提供T细胞激活的第一信号和第二信号。由结果可以看出，VEGF-C以浓度依赖的方式促进MLR体系中T细胞增殖(图4A)。在anti-CD3和anti-CD28刺激条件下，VEGF-C也可以剂量依赖地促进CD8+T细胞的增殖(图4B)。此外，VEGF-C处理的CD8+T细胞表达更高水平的活化标志物CD69和CD25(图4C)，但是对CD8+T细胞凋亡和IFN-γ表达无显著影响(图4D-E)。
前期研究表明，VEGFR2和VEGFR3是VEGF-C的天然受体。因此，本发明人使用流式细胞术检测了CD8+T细胞上VEGFR2和VEGFR3的表达情况。结果显示，CD8+T细胞高表达VEGFR3，但低表达VEGFR2(图4F)。为了进一步分析VEGF-C是否通过VEGFR3促进CD8+T细胞增殖，本发明人使用Cre-Loxp系统在T细胞中特异性敲除VEGFR3。在MLR系统中，VEGFR3缺陷的CD8+T细胞不响应VEGF-C(图4G)。将VEGFR3fl/flCD8Cre小鼠或VEGFR3fl/fl小鼠的骨髓细胞和脾细胞转移到C57BL/6×C3H F1小鼠中诱导aGvHD时，携带VEGFR3缺陷T细胞的小鼠诱导aGvHD能力更弱，小鼠存活时间比对照组更长(图4H)。这些结果表明，VEGF-C通过VEGFR3促进CD8+T细胞增殖并促进aGvHD。
接下来，本发明人分析了VEGFR3抑制剂对CD8+T细胞增殖的作用。MAZ51是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以阻断VEGFR3激酶活性。在CD8+T细胞和MSCs共培养体系中，本发明人发现，利用MAZ51阻断VEGFR3信号通路可消除MSCs和Dex所引起的CD8+T细胞增殖(图4I)。结果显示，MAZ51处理可以延长MSCs和Dex共给药aGvHD小鼠存活时间(图4J)。
以上数据表明，Dex通过VEGF-C-VEGFR3轴促进CD8+T细胞增殖。
实施例5、VEGF-C通过PI3K/AKT通路促进CD8+T细胞增殖
为了阐明VEGF-C促进CD8+T细胞增殖的分子机制，本发明人首先对共培养体系中的CD8+T细胞进行RNA-seq。在Dex存在下，与MSCs共培养的CD8+T细胞“粘着斑”、“细胞因子-细胞因子受体相互作用”以及“肌动蛋白细胞骨架”调控相关的通路高度富集(图5A)。鉴于VEGF-C可以促进CD8+T细胞增殖，本发明人重点关注于细胞增殖相关基因。本发明人发现，在T细胞和MSCs共培养体系中添加Dex后，CD8+T细胞中有12个细胞增殖相关基因差异表达。在这些基因中，Cyclin D1表达水平最高(图5B)。本发明人进一步证实，在anti-CD3和anti-CD28刺激条件下，VEGF-C促进CD8+T细胞表达Cyclin D1和Cyclin依赖性蛋白激酶(CDKs)，包括CDK2、CDK4和CDK6的表达(图5C)。这些结果表明，VEGF-C通过诱导G1-S期相关蛋白的表达促进CD8+T细胞增殖。
接下来，本发明人研究了VEGFR3是否影响近端TCR信号。首先，评估了VEGF-C对由phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)和ionomycin诱导的CD8+T细胞增殖的影响。这一激活方式可以直接作用于T细胞激活通路的PKB和钙离子信号而绕开上游近端TCR信号。在PMA和ionomycin激活体系中，VEGF-C不影响与T细胞活化增殖密切相关的p-p85/p-p-55和CDKs的表达，这提示VEGF-C可能影响近端TCR信号(图5D)。在anti-CD3和anti-CD28 T细胞激活体系中，PI3K/AKT信号对于起始T细胞增殖至关重要。本发明人发现，VEGF-C处理可以增强CD8+T细胞中PI3K/AKT的活性(图5E)。同时，本发明人分析了VEGF-C对CD4+T细胞的影响。本发明人发现，CD4+T细胞几乎不表达VEGFR3(图5F)。与CD8+T细胞不同，在共培养系统中，Dex不能促进CD4+T细胞表达Cyclin D1增强(图5G)。外源性VEGF-C对CD4+T细胞中p-p85/p-p55、p-Akt和Cyclin D1的表达无显著影响(图5H)。在VEGFR3fl/fl和VEGFR3fl/flCD8Cre小鼠中，CD8+T细胞缺失VEGFR3几乎完全抑制VEGF-C诱导的p-p85、p-p55和p-Akt表达(图5I)。此外，本发明人发现pan-PI3K抑制剂LY294002和AKT抑制剂Afuresertib来处理CD8+T细胞均可阻断VEGF-C诱导的CD8+T细胞增殖(图5J)。该结果表明，MSC中过表达(例如由Dex诱导高表达)的VEGFC能够被pan-PI3K抑制剂下调，从而进一步抑制CD8+T细胞增殖。
实施例6、TNF-α协同Dex促进VEGF-C表达
为了探讨糖皮质激素在体内诱导VEGF-C表达增强的机制，首先，本发明人检测了对糖皮质激素治疗敏感或不敏感的aGvHD小鼠和aGvHD患者血浆中VEGF-C的动态变化。结果发现，aGvHD小鼠血浆中VEGF-C的浓度逐渐升高(图6A)。更重要的是，抵抗类固醇治疗(治疗不敏感)的aGvHD患者血浆中VEGF-C的水平远高于aGvHD恢复患者，无论这些患者是否对糖皮质激素治疗敏感(图6B)。这一显著变化表明，VEGF-C在体内可被炎症诱导并与患者糖皮质激素抵抗有关。
随后，本发明人研究了几种不同的炎症细胞因子和TLR激动剂对VEGF-C表达的影响。结果显示，LPS显著上调MSCs中VEGF-C表达(图6C)；TNFα单独处理也可以达到类似的效果(图6D)；然而，IFN-γ无法诱导VEGF-C上调(图6D)。本发明人发现，TNFα和Dex(Combo)可以协同诱导Vegfc表达，但不能协同诱导Vegfd表达(图6E-G，图6L)。鉴于TNFα能够诱导Vegfc表达，本发明人利用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低MSCs中的Tnfr1表达。siRNA序列(Tnfrsf1a-mus-894(siRNA2))：
Sense:5’-CCGCUUGCAAAUGUCACAATT-3’(SEQ ID NO:12)；
Antisense:5’-UUGUGACAUUUGCAAGCGGTT-3’(SEQ ID NO:13)。
结果显示，敲低Tnfr1抑制TNFα诱导的Vegfc表达(图6H)。此外，Tnfr1敲低抑制Dex诱导的CD8+T细胞增殖(图6I)。为了验证Dex诱发的反应是否通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)的作用，本发明人利用GR拮抗剂RU486以评估GR在这一过程中的作用。本发明人发现，RU486完全逆转了Dex诱导的VEGF-C表达(图6J-K)。
这些数据表明，Dex和TNFα可以协同诱导MSCs表达VEGF-C。
实施例7、Dex与MSCs共用能抑制黑色素瘤的生长
研究以B16黑色素瘤模型为研究对象，将B16 F0单独或者与MSCs混合通过肌肉注射于C57BL/6小鼠腿部，在肿瘤生长第5天开始给小鼠腹腔注射Dex或者PBS对照。约12天后对肿瘤进行称重分析。
本发明人发现，单独注射PBS、Dex及单独MSCs组肿瘤的生长没有显著性改变。然而当用Dex处理MSCs肿瘤混合造模组，B16黑色素瘤的生长被显著地抑制(图7)。
实施例8、Dex与MSCs共用的抑制肿瘤作用是通过CD8+T细胞介导
为了进一步研究Dex与MSCs对抗肿瘤免疫的影响，本发明人分离了小鼠外周血与肿瘤部位的淋巴细胞，并对其中的细胞亚型进行详细分析。流式细胞分析发现，相比于单独肿瘤组、单独Dex处理组和单独MSCs组，在Dex与MSCs共用组中，CD8+T细胞比例有明显上升，然而CD4+T细胞没有明显变化(图8A，B，D)；同时，通过计数总淋巴细胞数、总CD4+T和CD8+T细胞绝对数，本发明人也发现，总淋巴细胞数的上升主要是由CD8+T细胞而非CD4+T细胞的增加引起的(图8C，E)。
为了验证免疫系统是否参与到“Dex与MSCs抑制黑色素瘤”这一过程，本发明人使用了严重免疫缺陷的NOD/SCID小鼠作为受体，该小鼠为T、B细胞缺陷且NK细胞功能低下。将B16F0单独或者与MSCs混合通过肌肉注射于NOD/SCID小鼠腿部，同样在肿瘤生长第5天开始给小鼠腹腔注射Dex或者PBS对照。结果发现，虽然Dex与MSCs共用能极大地抑制野生型C57/BL6小鼠的肿瘤生长(图7)，但在NOD/SCID小鼠中肿瘤生长没有被抑制(图9A)。因此，提示免疫系统中的T、B及NK细胞参与了这一过程。
为了验证是否CD8+T细胞参与这一过程，研究使用了β2M-/-小鼠作为肿瘤接种的受体小鼠，并进行了相同的实验。β2微球蛋白(β2M)是第一类主要组织相容性抗原复合体(MHC-I)的组成部分之一，如果敲除β2M，所有MHC-I类分子都不能表达。在T细胞胸腺发育的过程中，MHC-I类分子限制CD8+T细胞的成熟。因此，在β2M-/-小鼠中，几乎所有的CD8+T细胞都无法发育成熟。研究发现，Dex与MSCs共用后抑制肿瘤的效果在β2M-/-小鼠中被阻断(图9B)。因此，CD8+T细胞介导了上述抗肿瘤过程。
实施例9、药物筛选
1、筛选免疫抑制的潜在物质
筛选体系：如实施例2中记载的实验体系：MSCs胞与CD8+T细胞共培养，并以Dex处理，此时VEGF-C表达增加。
测试组：向该筛选体系给予候选物质；
对照组：不向该筛选体系给予候选物质。
测定VEGF-C表达或活性、VEGF-C与VEGFR3相互作用情况或CD8+T细胞增殖情况；分析测定结果，若VEGF-C表达或活性降低、VEGF-C与VEGFR3相互作用降低和/或CD8+T细胞增殖受抑制，则该候选物质为免疫抑制的药物；若VEGF-C表达或活性提高、VEGF-C与VEGFR3相互作用增强和/或CD8+T细胞增殖被促进，则该候选物质为免疫增强的药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海营养与健康研究所
<120> 调节间充质干细胞免疫调节功能方法和试剂
<130> 212086
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer
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gctctggctc ctagcaccat 20
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<212> DNA
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<211> 23
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> shVegfc
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<212> DNA/RNA
<213> siRNA
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<212> DNA/RNA
<213> siRNA
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Claims (15)

1.VEGF-C、其下游信号通路的或它们的调节剂在制备调节MSCs的免疫调节作用的药物组合物中的用途；较佳地，所述的免疫调节作用基于调节CD8+T细胞的增殖发挥作用。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，还包括：糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，VEGF-C或其下游信号通路的调节剂是下调剂，所述的免疫调节为免疫抑制；所述免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；较佳地包括：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的VEGF-C或其下游信号通路的下调剂包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为抑制VEGF-C受体酪氨酸激酶活性的小分子化合物MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，VEGF-C或其下游信号通路的调节剂是VEGF-C或其上调剂，所述的免疫调节为免疫增强；较佳地，所述的免疫增强包括促进CD8+T细胞增殖；较佳地，所述的免疫增强包括：抑制肿瘤，抑制病原体。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的VEGF-C上调剂包括：外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
7.一种经修饰的MSCs，其中引入了外源的VEGF-C或其下游信号通路的调节剂；
其中，所述调节剂为VEGF-C或其下游信号通路的下调剂，包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述的PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体；或
其中，所述调节剂为VEGF-C或其上调剂，包括外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子。
8.如权利要求7所述的经修饰的MSCs，其特征在于，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
9.权利要求7或8所述的经修饰的MSCs的应用，用于制备免疫调节的药物组合物；其中，引入或添加VEGF-C或其下游信号通路的下调剂的MSCs用于免疫抑制；引入或添加VEGF-C或其上调剂的MSCs用于免疫增强。
10.一种用于免疫抑制的药物组合物或药盒，其特征在于，其中包括MSCs，以及促进MSCs的免疫抑制作用的物质，所述物质为VEGF-C或其下游信号通路的下调剂；较佳地，所述免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；更佳地包括：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化；或
其中包括权利要求7或8所述的经修饰的MSCs且其中引入或添加了VEGF-C或其下游信号通路的下调剂；较佳地，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
11.如权利要求10药物组合物或药盒，其特征在于，所述的药物组合物或药盒中还包括：糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松；或
所述的VEGF-C或其下游信号通路的下调剂包括PI3K/AKT通路抑制剂，TNFR1下调剂，糖皮质激素受体下调剂，特异性抑制VEGF-C或其受体的小分子化合物，特异性抑制TNFR1的小分子化合物；特异性干扰VEGF-C基因或TNFR1基因表达的干扰分子；特异性下调VEGF-C或TNFR1的基因编辑试剂；特异性与VEGF-C蛋白或TNFR1蛋白结合的抗体或配体，或特异性阻断VEGF-C与其受体VEGFR3结合的试剂；更佳地，所述PI3K/AKT通路抑制剂包括：pan-PI3K抑制剂LY294002或AKT抑制剂Afuresertib，所述特异性抑制VEGF-C受体的小分子化合物为抑制VEGF-C受体酪氨酸激酶活性的小分子化合物MAZ51，SAR131675；特异性抑制VEGFR3的抗体。
12.一种用于免疫增强的药物组合物或药盒，其特征在于，包括MSCs，以及促进MSCs的免疫增强作用的物质；所述物质为VEGF-C上调剂；较佳地，所述的免疫增强包括：抑制肿瘤，抑制病原体；较佳地，所述的VEGF-C上调剂包括；外源的VEGF-C或含有该VEGF-C的编码基因的表达构建物或载体；较佳地，所述表达构建体包括增强型启动子、组织特异性启动子或增强子；或
其中包括权利要求7或8所述的经修饰的MSCs且其中引入了VEGF-C或其上调剂；较佳地，所述MSCs是以糖皮质激素处理的MSCs，较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，丙酸氟替卡松。
13.一种筛选免疫调节药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供MSCs细胞与CD8+T细胞共存的体系，所述MSCs细胞表达VEGF-C，所述CD8+T细胞表达VEGFR3；
(2)以候选物质处理权利要求1所述的体系，并测定VEGF-C表达或活性、VEGF-C与VEGFR3相互作用情况或CD8+T细胞增殖情况；
(3)分析(2)的测定结果，若VEGF-C表达或活性降低、VEGF-C与VEGFR3相互作用降低和/或CD8+T细胞增殖受抑制，则该候选物质为免疫抑制的药物；若VEGF-C表达或活性提高、VEGF-C与VEGFR3相互作用增强和/或CD8+T细胞增殖被促进，则该候选物质为免疫增强的药物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的体系中还包括添加糖皮质激素；较佳地所述糖皮质激素包括：地塞米松，甲基强的松龙，倍他米松，氢化可的松，泼尼松，甲泼尼松，丙酸倍氯米松，布地奈德，酸氟替卡松。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的免疫调节包括免疫抑制或免疫增强；
较佳地，所述的免疫抑制包括缓解或治疗CD8+T细胞过度增殖相关疾病；更佳地包括：抑制自身免疫性疾病，炎症；更佳地，所述CD8+T细胞过度增殖相关疾病包括：移植物抗宿主病，多发性硬化，炎症性肠病，硬皮病，I型糖尿病，类风湿性关节炎，桥本甲状腺炎，银屑病，系统性红斑狼疮，器官损伤如肝损伤、肺损伤、消化道损伤；更佳地，所述肝损伤包括肝纤维化或肝硬化，所述肺损伤包括非纤维化；
较佳地，所述的免疫增强包括：抑制肿瘤，抑制病原体。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154395A (zh) * 2015-09-28 2015-12-16 丛秀丽 一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法
WO2016146819A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 Apceth Gmbh & Co. Kg Hypoxia-induced expression of therapeutic proteins in mesenchymal stem cells
CN106754726A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 溯源生命科技股份有限公司 一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法
CN108148865A (zh) * 2018-01-15 2018-06-12 中国药科大学 一种稳定表达vegf120的间充质干细胞株及其体外应用
WO2018153936A1 (en) * 2017-02-21 2018-08-30 Servicio Andaluz De Salud Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells for use in the treatment of graft- versus-host disease
CN112004577A (zh) * 2018-03-14 2020-11-27 细胞编辑有限责任公司 用于降低毒性的免疫细胞修饰以及其在过继细胞疗法中的用途
US20210052776A1 (en) * 2019-07-02 2021-02-25 Nevin Witman Mesenchymal stem cells or stromal cells harboring modified rnas encoding vegf and bmp polypeptides

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016146819A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 Apceth Gmbh & Co. Kg Hypoxia-induced expression of therapeutic proteins in mesenchymal stem cells
CN105154395A (zh) * 2015-09-28 2015-12-16 丛秀丽 一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法
CN106754726A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 溯源生命科技股份有限公司 一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法
WO2018153936A1 (en) * 2017-02-21 2018-08-30 Servicio Andaluz De Salud Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells for use in the treatment of graft- versus-host disease
CN108148865A (zh) * 2018-01-15 2018-06-12 中国药科大学 一种稳定表达vegf120的间充质干细胞株及其体外应用
CN112004577A (zh) * 2018-03-14 2020-11-27 细胞编辑有限责任公司 用于降低毒性的免疫细胞修饰以及其在过继细胞疗法中的用途
US20210052776A1 (en) * 2019-07-02 2021-02-25 Nevin Witman Mesenchymal stem cells or stromal cells harboring modified rnas encoding vegf and bmp polypeptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINGFEN LI 等: "Mesenchymal stem cells suppress CD8+ T cell-mediated activation by suppressing natural killer group 2, member D protein receptor expression and secretion of prostaglandin E2, indoleamine 2, 3-dioxygenase and transforming growth factor-β", 《CLIN EXP IMMUNOL.》, vol. 178, no. 3, 23 July 2014 (2014-07-23), pages 49 *
李振彬等: "《抗风湿中药学》", 河北科学技术出版社, pages: 49 *

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