CN112004577A - 用于降低毒性的免疫细胞修饰以及其在过继细胞疗法中的用途 - Google Patents

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Abstract

一种免疫细胞群，所述免疫细胞群包括具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞，其中此类经修饰免疫细胞可以具有降低的产量的一种或多种炎性细胞因子(例如，白细胞介素2)和/或表达一种或多种炎性细胞因子(例如，白细胞介素6)的一种或多种拮抗剂。本文还提供了产生包括所述经修饰免疫细胞的此类免疫细胞群的方法以及在细胞疗法中使用此类免疫细胞群(例如，以用于治疗癌症、感染性疾病或免疫疾病)的方法。

Description

用于降低毒性的免疫细胞修饰以及其在过继细胞疗法中的 用途
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119要求于2018年3月14日提交的美国临时申请序列号62/642,821的提交日权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
过继细胞转移疗法是一种涉及自体或同种异体免疫细胞的离体扩增以及随后输注到患者中的免疫疗法的类型。可以离体对免疫细胞进行修饰以特异性靶向恶性细胞。过继细胞转移疗法的前景通常受到毒性(例如，细胞因子相关的毒性)的限制。例如，过继细胞转移免疫疗法可能触发细胞因子水平的非生理升高(细胞因子释放综合征)，这可能导致接受者死亡(参见，例如，Morgan等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》18(4):843-851,2010)。
因此，开发用于降低与过继细胞转移免疫疗法相关的毒性同时维持功效的方法具有重大意义。
发明内容
本公开至少部分地基于开发用于减少在过继免疫细胞疗法中使用的免疫细胞的炎性性质和与过继免疫细胞疗法相关的毒性的方法。此类方法可以包括敲除对炎性蛋白进行编码的内源性基因、敲入此类炎性蛋白的拮抗剂和免疫抑制性细胞因子或其组合。因此，本公开的一方面的特征在于免疫细胞群，其包括：(i)第一多个经修饰免疫细胞，所述第一多个经修饰免疫细胞在相同条件下与同一类型的野生型免疫细胞相比产生的一种或多种炎性蛋白的水平降低；以及(ii)第二多个经修饰免疫细胞，所述第二多个经修饰免疫细胞表达所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或表达一种或多种免疫抑制性细胞因子。在一些实施例中，在所述第一多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，所述一种或多种炎性蛋白的至少一个内源性等位基因被敲除。在一些实施例中，所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者是T细胞或自然杀伤细胞。
在一些实施例中，所述炎性蛋白包括一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体、一种或多种炎性生长因子、一种或多种细胞毒性分子或其组合。示例性炎性细胞因子或其可溶性受体包含但不限于IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF。示例性炎性生长因子包含但不限于TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF。示例性细胞毒性分子包含但不限于穿孔素、颗粒酶和铁蛋白。
在一些实施例中，所述第二多个经修饰免疫细胞包括对一种或多种炎性蛋白的所述一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种外源性核酸。所述外源性核酸中的至少一种外源性核酸可以被并入所述第一多个经修饰免疫细胞的基因组中。
在一些实施例中，引入所述第二多个经修饰免疫细胞中任一个经修饰免疫细胞中的所述一种或多种炎性蛋白的所述一种或多种拮抗剂包括所述炎性蛋白的可溶性受体和/或对所述炎性蛋白具有特异性的抗体。
在其它实施例中，将免疫抑制性细胞因子引入所述第二多个经修饰免疫细胞中。示例性免疫抑制性细胞因子包含但不限于TGFβ、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35和IL-37。
在一些实施例中，本文所述的任何所述免疫细胞群的所述第一多个经修饰免疫细胞和所述第二多个免疫细胞可以属于同一类型。可替代地或另外，所述第一多个经修饰免疫细胞与所述第二多个免疫细胞重叠。
在另一方面，本公开提供了一种免疫细胞群，其包括第一多个经修饰免疫细胞，所述第一多个经修饰免疫细胞在相同条件下相对于同一类型的野生型免疫细胞产生更少的白细胞介素2(IL-2)。例如，在所述第一多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，至少一个内源性IL-2等位基因被敲除。在一些情况下，所述第一多个经修饰免疫细胞当被活化时，相对于在相同条件下活化的所述野生型免疫细胞产生更少的IL-2。
在一些情况下，所述免疫细胞群的总IL-2产量在相同条件下比野生型对应物少约30-95％。例如，所述免疫细胞群的所述总IL-2产量是所述野生型对应物的总IL-2产量的约50％。
在一些实施例中，以上所述的免疫细胞群可以进一步包括第二多个经修饰免疫细胞，当与同一类型的野生型免疫细胞相比时，所述第二多个经修饰免疫细胞产生的如本文所述的一种或多种炎性蛋白的水平降低。例如，所述免疫细胞群产生的所述一种或多种炎性蛋白的总水平在相同条件下比野生型对应物的总水平低至少10％。在一些实例中，在所述第二多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，所述一种或多种炎性蛋白的至少一个内源性等位基因被敲除。
在一些实施例中，所述第一多个经修饰免疫细胞和所述第二多个经修饰免疫细胞属于同一类型。在其它实施例中，所述第一多个经修饰免疫细胞和所述第二多个经修饰免疫细胞重叠。
可替代地或另外，以上所述的免疫细胞群可以进一步包括第三多个经修饰免疫细胞，所述第三多个经修饰免疫细胞表达所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种外源性拮抗剂或如本文所述的一种或多种免疫抑制性细胞因子。在一些特定实例中，所述一种或多种炎性蛋白包括IL6，并且IL6的拮抗剂是托珠单抗或西鲁库单抗(sirukumab)或其抗原结合片段(例如，源自托珠单抗或西鲁库单抗的单链抗体片段(scFv))。
所述第三多个经修饰免疫细胞可以包括对所述一种或多种细胞因子的所述一种或多种拮抗剂进行编码的一种或多种外源性核酸。所述外源性核酸中的至少一种外源性核酸可以被并入所述第三多个经修饰免疫细胞的基因组中。在一些实例中，所述第三多个经修饰免疫细胞与所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者属于同一类型。在一些实例中，所述第三多个经修饰免疫细胞与所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者重叠。
在本文所述的任何或免疫细胞群中，所述免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞、其前体或其组合。在一些实施例中，所述免疫细胞可以被进一步修饰成表达嵌合抗原受体(CAR)和/或外源性T细胞受体。CAR可以包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实例中，所述胞外配体结合结构域可以包括对细胞表面蛋白具有特异性的单链抗体片段、细胞因子受体的胞外结构域或共刺激受体的胞外结构域。可替代地或另外，所述一个或多个一个或多个胞内信号传导结构域可以包括(i)CD3ζ的信号传导结构域和(ii)来自一种或多种共刺激蛋白或细胞因子受体的一个或多个信号传导结构域。在其它实例中，CAR可以包括来自CD28、4-1BB、2B4、KIR、CD27、OX40、ICOS、MYD88、IL2受体和/或SynNotch的一个或多个刺激结构域(例如，共刺激结构域)。
在又另一个实施例中，本公开提供了一种产生具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞群的方法，所述方法包括：(i)提供免疫细胞群；以及(ii)修饰所述免疫细胞以由此减少IL-2产量。这种方法可以进一步包括(iii)修饰所述免疫细胞以减少如本文所述的一种或多种炎性蛋白的产量，以及任选地(iv)将对还如本文所述的一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种核酸引入所述免疫细胞中，其中所述一种或多种核酸与用于在所述免疫细胞中表达所述一种或多种拮抗剂的一个或多个启动子可操作地连接。
可替代地，本文提供了一种产生具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞群的方法，所述方法包括：(i)提供免疫细胞群；(ii)修饰所述免疫细胞以减少如本文所述的一种或多种炎性蛋白的产量；以及(iii)将对还如本文所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种核酸引入所述免疫细胞中，其中所述一种或多种核酸与用于在所述免疫细胞中表达所述一种或多种拮抗剂的一个或多个启动子可操作地连接。
在本文所述的任何方法中，所述修饰步骤包括在所述免疫细胞的靶蛋白(例如，IL-2或炎性蛋白)的内源性等位基因处进行基因编辑。所述基因编辑可以包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)、核酸内切酶、大范围核酸酶、mega-TALS或其组合。在一些情况下，IL-2产量可以通过基因减少约30-95％(例如，约50％)。
在本文所述的任何方法中，所述免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、其前体或其组合。任何免疫细胞可以进一步表达在本文中也有描述的嵌合抗原受体(CAR)和/或外源性T细胞受体。
通过本文所述的方法制备的任何免疫细胞群也在本公开的范围内。
进一步地，本文提供了一种细胞疗法的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的任何免疫细胞群。所述受试者可以是患有本文所述的靶疾病(例如，癌症、感染性疾病或免疫病症)的人类患者。
还在本公开的范围内的是如本文所述的用于治疗还如本文所述的靶疾病的免疫细胞群，以及此类免疫细胞群在制备用于治疗靶疾病的药物中的用途。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求书中将变得显而易见。
附图说明
图1包含使用基因编辑以中和炎性细胞因子途径的示例性方案的示意图。左图示出了敲入基因盒和敲除基因编辑的组合(方案I)。右图描绘了通过同时整合转基因敲入和基因破坏而与方案I等效的一步策略(方案II)。
图2包含显示从Jurkat E6-1细胞表达的抗IL6R scFv(源自托珠单抗(tocilizumab))在阻断IL6-IL6R信号传导方面的效率的图。敲入抗IL6R scFv盒。用于比较的阴性对照是用培养基处理的IL6报告细胞。抗IL6抗体用作阳性对照。
图3是显示与对照细胞(无修饰)相比，使用CRISPR/CAS9系统在Jurkat细胞中靶向人GM-CSF基因的各种sgRNA候选物的基因编辑效率的图表。
图4是显示与对照细胞(无修饰)相比，使用CRISPR/CAS9系统在Jurkat细胞中靶向人IL-2的各种sgRNA候选物的基因编辑效率的图表。
图5是显示与对照细胞(无修饰)相比，使用CRISPR/CAS9系统在Jurkat细胞中靶向人TNF基因的各种sgRNA候选物的基因编辑效率的图表。
图6A-6D是显示了仅注射有Nalm6白血病细胞(CTRL，n＝4)或随后用CD19/IL6/IL1RA TCR-CART细胞(图中的1，n＝5)或抗CD19/IL6/IL1RA TCR/GM-CSF-CART细胞(图中的2，n＝6)处理的NSG小鼠中的体重变化、存活率、血液Nalm6白血病细胞和人T细胞的存在的图表。
图7是显示在用靶向IL-2的sgRNA 1、3和5响应于抗CD3/CD28刺激进行基因编辑之后，IL-2的产量减少的T细胞的细胞扩增率的图表。仅用Cas9修饰的T细胞用作对照。
具体实施方式
过继细胞转移免疫疗法依赖于免疫细胞活化和细胞因子分泌以消除疾病细胞。然而，细胞因子的系统性过量产生引起安全问题，并且有时对接受者可能是致命的。Morgan等人,《分子疗法》18(4):843-851,2010。本公开旨在部分地通过开发具有降低的炎性性质的免疫细胞来克服这种限制。如本文所述，这可以通过敲除免疫细胞中的一种或多种细胞因子或其受体以减少由待移植到接受者的免疫细胞在活化后产生的不期望的细胞因子(例如，炎性细胞因子)和/或通过敲除免疫细胞的一种或多种细胞因子拮抗剂来实现，所述细胞因子拮抗剂可以在被施用于接受者的免疫细胞活化后中和由接受者的宿主免疫细胞产生的细胞因子介导的炎性信号传导。敲入与敲除设计的组合将减少用于过继疗法的免疫细胞和宿主免疫细胞两者对不期望的细胞因子(例如，炎性细胞因子)的产量和/或信号传导，由此显著降低由于细胞因子危机由免疫细胞过继疗法引起的毒性。
在一些实例中，白细胞介素2(IL-2)可以在免疫细胞中敲除以用于过继免疫细胞疗法。IL-2已经被表征为对T细胞增殖/活化至关重要的T细胞丝裂原。(参见，例如，Morgan等人,《科学(Science)》,193(4257):1007-8,1976；Smith,《科学》,240(4856):1169-76,1988)。令人惊讶的是，本文所述的研究显示，免疫细胞(例如，T细胞)中IL2产量的减少抑制细胞过度增殖，同时维持这些免疫细胞在体外的健康繁殖速率(propagation rate)。这些结果指示IL-2可以是用于敲除以减少与过继细胞疗法相关的毒性的靶细胞因子。
包括一种或多种炎性蛋白(例如，炎性细胞因子或其可溶性受体、炎性生长因子或细胞毒性分子)的敲除、一种或多种炎性蛋白的拮抗剂或免疫抑制性细胞因子的敲入或其组合的如本文所述的经修饰免疫细胞将会有益于在过继细胞转移免疫疗法中限制与细胞因子相关的毒性并且将会可用于有效地治疗包含癌症、感染性疾病和免疫病症在内的疾病，而具有较小的副作用。
因此，本文提供了免疫细胞群、产生这种细胞群的方法及其用于降低与免疫细胞过继疗法相关的炎症的用途，所述免疫细胞群包括如本文所述的具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞。
I.经修饰免疫细胞
本公开的一方面提供了与同一类型的野生型免疫细胞相比具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞。这种经修饰免疫细胞可以包括敲除一种或多种炎性蛋白(例如，炎性细胞因子或其可溶性受体、炎性生长因子或细胞毒性分子)、敲入一种或多种炎性蛋白或免疫抑制性细胞因子的拮抗剂或其组合。野生型细胞是指不具有这种敲入和敲除修饰的细胞。
(i)炎性蛋白和免疫抑制性细胞因子
如本文所使用的，炎性蛋白是指能够直接或间接促进炎症的蛋白质。炎性蛋白可以是炎性细胞因子或炎性细胞因子的可溶性受体、炎性生长因子或细胞毒性分子。
在一些实施例中，炎性蛋白是促进炎症的炎性细胞因子或炎性细胞因子的可溶性受体。在一些情况下，这种炎症细胞因子是由炎性反应的上调产生并且参与炎性反应的上调。在自然界中，炎性细胞因子通常由免疫细胞分泌，如辅助T细胞、巨噬细胞或某些其它类型的免疫细胞。
示例性炎性细胞因子或其可溶性受体包含白细胞介素1α(IL1α)、白细胞介素1β(IL1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素(IL-12)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素21(IL-21)、白细胞介素23(IL-23)、sIL-1RI、sIL-2Rα、可溶性IL-6受体(sIL6R)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、巨噬细胞炎性蛋白(例如，MIPα和MIPβ)、巨噬细胞集落刺激因子1(CSF1)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)、趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)、嗜酸性粒细胞趋化因子、肿瘤坏死因子(TNF)、单核细胞化学引诱物蛋白1(MCP1)、γ干扰素诱导的单核因子(MIG)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE)、C反应蛋白(CRP)、血管生成素-2和血管性血友病因子(VWF)。
IL1α也被称为促红细胞生成素1，并且是细胞因子的白细胞介素1家族的成员。这种细胞因子由活化巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞产生，并且通过白细胞介素-1受体进行信号传导。人IL1α(例如，基因库(GenBank)登录号NP_000566.3)由IL1A基因编码。
IL1β是细胞因子的白细胞介素1家族的成员，并且通过IL1B受体进行信号传导。IL1β已经涉及促进在包含1型糖尿病和类风湿性关节炎的各种疾病中的炎症。例如，IL1β信号传导能够通过诱导环氧酶-2(PTGS2/COX2)表达来促进炎性疼痛超敏反应。人IL1β(例如，基因库登录号NP_000567.1)由IL1B基因编码。
白细胞介素1I型受体(亦称，IL-1RI)由人的IL1R1基因编码。sIL-1RI是指可溶性形式的IL-1RI受体。在基因库登录号NP_001307910.1、NP_001275635.1、NP_001307912.1、NP_001307913.1、NP_001307914.1和NP_001307915.1下提供了示例性人IL-1RI序列。
IL-2是细胞因子的IL-2家族的成员，并且在刺激淋巴细胞增殖(例如，T细胞和B细胞)中起着关键作用(参见例如，Morgan等人,《科学》,193(4257):1007-8,1976；Smith,《科学》,240(4856):1169-76,1988；以及Mingari等人,《自然(Nature)》,312(5995):641-3,1984)。IL-2主要由T细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)在通过抗原活化T细胞后产生，并且还已经报道由树突状细胞和肥大细胞表达(参见例如，Granucci等人,《自然免疫学(NatureImmunol.)》,2(9):882-8,2001；以及Hershko等人,《免疫(Immunity)》,35(4):562-71,2011)。通过结合高亲和力三聚体或低亲和力二聚体
IL-2受体(IL-2R)复合物，IL-2可以作用于多种细胞类型以触发免疫应答。Taniguchi等人,《细胞(Cell)》,73(1):5-8,1993。CD122和CD132形成二聚体IL-2受体(IL-2R)，而三聚体IL-2R还包含CD25。人IL-2(例如，基因库登录号：NP_000577.2)由IL-2基因编码。
可溶性IL2受体α亚基(sIL2Ra)是可溶性形式的CD25。sIL2Ra通常由活化T细胞和B细胞分泌(参见例如，Rubin等人,《免疫学杂志(J Immunol.)》,135(5):3172-7,1985)。升高的sIL2Ra水平已经与血液系统恶性肿瘤和自身免疫病症相关(参见例如，Rubin等人,《内科医学年鉴(Ann Intern Med.)》,113(8):619-27,1990)。在一个实例中，sIL2Ra是人sIL2Ra。
IL-5是离散细胞因子家族的成员，其还包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-3。IL-5通过白细胞介素-5受体进行信号传导，并且可以刺激B细胞生长。在基因库登录号NP_000870.1下提供了示例性人IL-5序列。
IL-6是通常由抗原呈递细胞(包含树突状细胞)、巨噬细胞和B细胞响应于组织损伤和感染而产生并且在调节细胞生长和分化中具有另外的作用的多效性细胞因子(参见例如，Kamimura等人,《生理学生物化学与药理学评论(Rev Physiol Biochem Pharmacol.)》149:1-38,2003)。IL6涉及诱导B细胞分化、促进肝细胞中的急性期蛋白合成、增强浆细胞和骨髓瘤融合细胞的生长，并且涉及具有干扰素抗病毒活性。鉴于IL6的各种功能，IL6也被称为B细胞刺激因子2(BSF2)、肝细胞-刺激因子(HSF)、杂交瘤生长因子(HGF)和IFN-β2(Kishimoto,《血液(Blood.)》74(1):1-10,1989)。作为一个实例，在基因库登录号NP_000591.1下提供了人IL6的氨基酸序列。
IL-6通过包括膜糖蛋白gp130和IL-6受体(IL6R)的复合物进行信号传导(参见例如，Hibi等人,《细胞》,63(6):1149-57,1990)。IL-6与靶细胞上的IL6R结合促进gp130同源二聚化和随后的信号转导。如本文所使用的，IL6R包含膜结合和可溶性形式的IL6R(sIL6R)两者。当与IL-6结合时，可溶性IL6R(sIL6R)充当激动剂并且还可以促进gp130二聚化和信号传导。可能发生反式信号转导(Transsignaling)，由此特定细胞类型的sIL-6R分泌诱导仅表达gp130的细胞对IL-6作出应答(参见例如，Taga等人,《免疫学年度评论(Annu RevImmunol.)》,15:797-819,1997；以及Rose-John等人,《生物化学杂志(Biochem J.)》,300(Pt2):281-90,1994)。在一个实例中，sIL6R包括人IL6R的胞外结构域(参见例如，Peters等人,《实验医学杂志(J Exp Med.)》,183(4):1399-406,1996)。
IL-7是涉及B细胞和T细胞发育的细胞因子。IL7可以通过与肝细胞生长因子形成异二聚体而用作前-原B细胞生长刺激因子。在基因库登录号NP_000871.1、NP_001186815.1、NP_001186816.1和NP_001186817.1下提供了示例性人IL-7序列。
IL-8是化学引诱物细胞因子(chemoattractant cytokine)，并且由包含白细胞、单核细胞和内皮细胞的多种细胞类型分泌(参见例如，Baggiolini等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》84:1045-1049,1989)。虽然IL-8的初级靶细胞是中性粒细胞，但是已经报道了IL-8也可充当其它细胞类型(包含嗜碱粒细胞和T细胞)的趋化因子。IL-8可以通过两种G蛋白偶联受体，人的CXCR1和CXCR2进行信号传导(参见例如，Wu等人,《科学》261(5117):101-3,1993；以及Damaj等人,《生物化学杂志)》,271(22):12783-9,1996)。作为一个实例，人的CXCL8基因编码至少两种IL-8同种型。人IL-8同种型1的长度比同种型2的长度长，并且通常在非免疫细胞中表达，而同种型2主要在单核细胞和巨噬细胞中表达。在基因库登录号NP_001341769.1下提供了示例性人IL-8同种型2。
IL-9是被认为是造血细胞的调节剂的细胞因子，并且可以刺激细胞增殖。IL-9通过白细胞介素9受体进行信号传导，并且可以使信号转导及活化(STAT)蛋白活化。在基因库登录号NP_000581.1下提供了示例性人IL-9序列。
IL-12是细胞因子的白细胞介素12家族的成员，其包含IL-12、IL-23、IL-27和IL-35。响应于抗原，IL-12可以由中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生。IL12主要作用于原初CD4+T细胞。这种细胞因子由两个亚基构成。作为异二聚体，IL-12由IL-12亚基α(IL-12p35)和IL-12亚基β(IL-12p40)构成。在人中，每个亚基由不同的基因编码。例如，人IL-12亚基α(例如，基因库登录号NP_000873.2、NP_001341511.1和NP_001341512.1)由IL12A基因编码，而人IL-12亚基β(例如，基因库登录号NP_002178.2)由IL12B基因编码。
IL-15是细胞因子的4-α螺旋束家族的成员，并且已经涉及促进B细胞、T细胞和自然杀伤细胞的分化和增殖(参见例如，Mishra等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》,20(8):2044-50,2014)。IL-15可以通过结合异源三聚体IL-15受体复合物作用于抗原呈递树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞。IL-15受体复合物具有三个亚基，其包含IL15Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ(参见例如，Mishra等人,《临床癌症研究》,20(8):2044-50,2014)。IL15Rα亚基对IL-15具有高亲和力，并且以可溶性和膜形式存在。作为一个实例，在基因库登录号NP_751915.1中提供了人IL-15的氨基酸序列。
白细胞介素17(亦称，IL17A、CTLA8或IL-17)是细胞因子的IL17家族的成员，Gu等,《细胞因子(Cytokine)》,64(2):477-85,2013。IL-17主要由辅助T细胞17(Th17细胞)产生。通过IL17RA/IL17RC的异二聚体受体复合物进行信号传导，IL-17可以诱导基质细胞表达炎性细胞因子和趋化因子(参见例如，Toy等人,《免疫学杂志》,177(1):36-9,2006)。作为一个实例，人IL17A基因编码IL-17(例如，基因库登录号NP_002181.1)。
IL-18是细胞因子的白细胞介素1超家族的成员。IL-18由包含巨噬细胞的各种细胞产生，并且通过白细胞介素-18受体进行信号传导。在基因库登录号NP_001553.1和NP_001230140.1下提供了示例性人IL-18序列。
IL-21是细胞因子的共用γ链家族的成员，其包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。IL-21由活化CD4+T细胞产生，并且可以通过与IL-21受体相互作用而作用于T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。在基因库登录号NP_068575.1和NP_001193935.1下提供了示例性人IL-21序列。
IL-23是由IL12β亚基(IL-12p40)亚基和IL23A(IL-23p19)亚基构成的异二聚体细胞因子。IL-23通过由IL12的β1亚基(IL12RB1)和IL23特异性亚基(IL23R)构成的IL23受体进行信号传导。与IL-12类似，IL-23可以参与STAT4信号传导，但是IL23主要作用于记忆CD4+T细胞。在基因库登录号NP_057668.1下提供了示例性人IL-23A序列。干扰素(IFN)是涉及宿主细胞的先天免疫和抵御病毒感染的细胞因子家族。存在至少两种类型的干扰素(参见例如，Le Page等人,《免疫遗传学评论(Rev.Immunogenet.)》,2(3):374-86,2000)。I型干扰素(包含IFNα和IFNβ)通常由感染病毒的细胞产生。相比之下，II型干扰素(例如，IFNγ)通常由巨噬细胞、T细胞和自然杀伤细胞(NK)产生。例如，人基因IFNA1、IFNB1和IFNG分别编码IFNα(例如，基因库登录号NP_076918.1)、IFNβ(例如，基因库登录号NP_002167.1)和IFNγ(例如，基因库登录号NP_000610.2)。
巨噬细胞炎性蛋白(MIP或也被称为MIP-1CC蛋白)是趋化细胞因子，并且存在此亚家族的至少四个成员。MIP家族的成员包含CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL9(MIP-1δ或先前也称为CCL10)和CCL15(MIP-1γ)(参见例如，Maurer等人,《国际生物化学细胞生物学杂志(Int J Biochem Cell Biol.)》,36(10):1882-6,2004)。这些蛋白质可以由包含巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞的不同的细胞类型产生(Driscoll,《实验肺脏研究(Exp LungRes.)》,20(6):473-90,1994)。MIP通过包含CCR1、CCR3和CCR5的G蛋白偶联细胞表面受体进行信号传导。这些受体通常由单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞表达。示例性MIP包含但不限于人CCL3(MIP-1α)(例如，基因库登录号NP_002974.1)、人CCL4(MIP-1β)(例如，基因库登录号NP_002975.1)和人CCL15(MIP-1γ)(例如，基因库登录号NP_116741.2)。
CSF1(亦称，巨噬细胞集落刺激因子或M-CSF)是参与造血干细胞分化成巨噬细胞的细胞因子。CSF1与集落刺激因子1受体结合。在基因库登录号AAA52117.1、NP_000748.3、NP_757349.1和NP_757350.1下提供了示例性人CSF1序列。
LIF是涉及骨髓和正常白血病细胞中的造血分化、神经元细胞分化和肾脏发育的多效性细胞因子。LIF作用于LIF受体(LIFR-α)。在基因库登录号NP_002300.1和NP_001244064.1下提供了示例性LIF序列。
G-CSF是参与粒细胞的产生、功能和分化的细胞因子。G-CSF由包含内皮细胞和巨噬细胞的多种细胞产生。G-CSF与G-CSF受体结合。在基因库登录号NP_000750.1、NP_757373.1、NP_757374.2和NP_001171618.1下提供了示例性G-CSF序列。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是集落刺激因子超家族的成员，并且由许多包含巨噬细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞和T细胞的不同免疫细胞表达。作为细胞因子，GM-CSF可以充当造血生长因子(Metcalf,《自然》,339(6219):27-30,1989)。GM-CSF可以通过使GM-CSF受体(GM-CSFR)活化来促进包含粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞和巨噬细胞的各种造血前体细胞的生长和分化(参见例如，Martinez-Moczygemba等人,《过敏症与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol.)》112(4):653-65,2003)。作为一个实例，人GM-CSF(例如，基因库登录号：NP_000749.2)由CSF2基因编码。
CXCL10(亦称，干扰素γ诱导的蛋白10或IP-10)是由各种细胞类型(如成纤维细胞、内皮细胞和单核细胞)响应于干扰素γ而分泌的细胞因子。CXCL10已经涉及粘附到内皮细胞的趋化作用和T细胞，并且作用于趋化因子受体CXCR3。在基因库登录号NP_001556.2下提供了示例性人CXCL10序列。
CCL5(亦称，D17S136E、RANTES、SCYA5、SIS-δ、SISd、TCP228、eoCP或C-C基序趋化因子配体5)是血液单核细胞、记忆T辅助细胞和嗜酸性粒细胞的化学引诱物。CCL5可以结合趋化因子受体CCR5。在基因库登录号NP_002976.2和NP_001265665.1下提供了示例性人CCL5序列。
嗜酸性粒细胞趋化因子形成嗜酸性粒细胞趋化蛋白的CC趋化因子亚家族。此家族的成员包含CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)和CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)。在基因库登录号CCL11(NP_002977.1)、(NP_002977.1)、CCL24(NP_002982.2)和CCL26(NP_006063.1)下提供了示例性人嗜酸性粒细胞趋化因子。
肿瘤坏死因子(TNF，例如TNFα)是细胞因子的肿瘤坏死因子超家族的成员。TNF主要由巨噬细胞和活化T细胞分泌，并且可以通过两种不同的受体(TNFR1和TNFR2)进行信号传导，以调节各种细胞功能，包含凋亡、细胞存活和分化(Liu,《细胞研究(Cell Res.)》,15(1):24-7,2005)。作为一个实例，人TNFα(例如，基因库登录号：NP_000585.2)由TNF基因编码。
单核细胞趋化蛋白1(MCP1或CCL2)是细胞因子的趋化因子家族的成员。MCP1可以充当化学引诱物，并且在感染或损伤后通过G蛋白偶联受体CCR2进行信号传导以募集树突状细胞、记忆T细胞和单核细胞(参见例如，Deshmane等人,《干扰素细胞因子研究杂志(JInterferon Cytokine Res.)》,29(6):313-26,2009)。在一个实例中，MCP1是人MCP1(例如，基因库登录号NP_002973.1)。
MIG(亦称，CXCL9、CMK、Humig、MIG、SCYB9、crg-10或C-X-C基序趋化因子配体9)是CXC趋化因子家族的成员。MIG是T细胞的化学引诱物，并且其表达被IFNγ上调。在基因库登录号NP_002407.1下提供了示例性人MIG序列。
晚期糖基化终产物受体(RAGE或AGER)属于细胞表面受体的免疫球蛋白超家族。RAGE可以结合包含晚期糖基化终产物的多种配体，并且涉及先天免疫。在基因库登录号NP_001127.1、NP_001193858.1、NP_001193861.1、NP_001193863.1、NP_001193865.1、NP_001193869.1、NP_751947.1和NP_001193883.1下提供了示例性人RAGE蛋白。
C反应蛋白(CRP)是正五聚蛋白(pentraxin)家族的成员，其还包含血清淀粉样蛋白P组分(SAP)。急性期蛋白CRP的循环水平通常响应于组织损伤、感染和炎症而升高。存在多种CRP配体，但是CRP对含磷酸胆碱的配体具有最高亲和力，所述配体通常发现于坏死细胞和凋亡细胞的表面上。与受损和凋亡细胞的表面的溶血磷脂结合的CRP募集C1q并且随后活化补体系统(参见例如，Thompson等人,《结构(Structure)》2月15日；7(2):169-77,1999；Pepys等人,《临床研究杂志》111(12):1805-1812,2003)。作为一个实例，可以在基因库登录号NP_000558.2下找到人CRP的氨基酸序列。
血管生成素-2(Ang2)是血管生成素家族的成员，其包含血管生成素-1、血管生成素-2和血管生成素-4。Ang2已经涉及内皮细胞连接的调节、血管的去稳定化以及增加的血管通透性(参见例如，Zheng等人,《基因发育(Genes Dev.)》,28(14):1592-603,2014；以及Ziegler等人,《临床研究杂志》pii:66549,2013)。作为Tie2受体配体，Ang2还可以通过调节Tie2信号传导来调节血管重塑(参见例如，Thurston等人,《冷泉港医学展望(Cold SpringHarb Perspect Med.)》,2(9):a006550,2012)。作为一个实例，可以在基因库登录号NP_001138.1下找到人Ang2的氨基酸序列。
血管性血友病因子(VMF)是参与止血调节的糖蛋白。这种蛋白质通常存在于血浆、内皮下结缔组织和血小板α颗粒中。为了介导止血，VWF可以促进血小板粘附到内皮下结缔组织，并且还可以结合因子VIII，所述因子是凝血因子(blood clotting factor)(Sadler,《生物化学年度评论(Annu Rev Biochem.)》67:395-424,1998)。VWF缺乏会引起血管性血友病，这是遗传性出血性病症。作为一个实例，可以在基因库登录号NP_000543.2下找到人VMF的氨基酸序列。
在一些实施例中，炎性蛋白是炎性生长因子。如本文所使用的，炎性生长因子是在炎性信号传导途径中起着一些作用(直接地或间接地)的生长因子。在一些情况下，炎性生长因子可以与一种或多种细胞因子相互作用以促进炎症。示例性炎性生长因子包含转化生长因子α(TGFα)、血管内皮因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF TGFα是涉及细胞增殖、细胞发育和分化的生长因子。其可以通过表皮生长因子受体(EGFR)进行信号传导。在基因库登录号NP_003227.1、NP_001093161.1、NP_001295087.1和NP_001295088.1下提供了示例性人TGFα序列。
VEGF(亦称，血管通透性因子或VPF)是参与血管形成的蛋白质家族。在哺乳动物中，存在至少五个VEGF家族成员，包含VEGF-A、胎盘生长因子(PGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。在基因库登录号NP_001165097.1下提供了示例性人VEGF序列。
EGF是促进细胞生长、存活和分化的生长因子。EGF是受体EGFR的配体。在基因库登录号NP_001954.2、NP_001171601.1、NP_001171602.1和NP_001343950.1下提供了示例性人EGF序列。
HGF是涉及细胞运动、细胞生长和形态发生的调节的生长因子。HGF与c-MET受体结合，并且由间充质细胞产生。在基因库登录号NP_000592.3、NP_001010931.1、NP_001010932.1、NP_001010933.1和NP_001010934.1下提供了示例性人HGF序列。
FGF是涉及包含发育的多种过程的信号传导分子家族。在人中，存在至少22个FGF家族的成员。例如，人FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9和FGF10与FGF受体结合。在基因库登录号NP_000791.1、NP_001997.5和NP_005238.1下提供了示例性人FGF。
在一些实施例中，炎性蛋白是细胞毒性分子。如本文所使用的，细胞毒性分子是由如巨噬细胞等免疫细胞分泌的用于杀死疾病细胞的分子。示例性细胞毒性分子包含穿孔素、颗粒酶和铁蛋白。
穿孔素是定位于细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的颗粒的细胞溶解蛋白(cytolytic protein)。在分泌细胞溶解颗粒时，穿孔素与靶细胞的膜接合并且在质膜中形成孔(参见例如，Liu等人,《免疫学杂志》156(9):3292-300,1996)。在人中，穿孔素(例如，基因库登录号NP_001076585.1)由PRF1基因编码。
颗粒酶是由细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞颗粒分泌的丝氨酸蛋白酶，并且涉及诱导靶细胞(例如，已经感染病原体或已经变成恶性的细胞)中的凋亡。在人中，存在至少五种类型的颗粒酶(参见例如，Bots等人,《细胞科学杂志(J.Cell Sci.)》,119(Pt 24):5011-4,2006)。人基因GZMA、GZMB、GZMH、GZMK和GZMM分别编码颗粒酶A(例如，基因库登录号NP_006135.1)、颗粒酶B(例如，基因库登录号NP_004122.2)、颗粒酶H(例如，基因库登录号NP_219491.1)、颗粒酶K(例如，基因库登录号NP_002095.1)和颗粒酶M(例如，基因库登录号NP_005308.1)。
铁蛋白是参与铁储存的球状蛋白。在动物中，铁蛋白是铁蛋白轻链(FTL)和铁蛋白重链(FTH)亚基的复合物。虽然在给定的铁蛋白复合物中通常存在24个亚基，但是FTL与FTH的比率因细胞类型而异。FTH已经涉及造血、肝细胞凋亡、细胞分化和免疫功能的调节(参见例如，Recalcati等人,《自身免疫杂志(J Autoimmun.)》2008 30(1-2):84-9,2008)。在基因库登录号NP_002023.2中提供了人FTH的示例性序列。在基因库登录号NP_000137.2中提供了人FTL的示例性序列。在包含癌症的多种恶性肿瘤中，循环铁蛋白的水平通常会增加(参见例如，Hazard等人,《自然》265(5596):755-6,1977)。
如本文所使用的，免疫抑制性细胞因子是抗炎细胞因子。抗炎细胞因子包含TGFβ、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35和IL-37。
TGFβ家族中存在至少30个成员，包含TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。TGFβ已经涉及通过抑制细胞因子产量来抑制巨噬细胞和Th1细胞活性。示例性TGF包含人TGFβ1(例如，基因库登录号NP_000651.3)、人TGFβ2(例如，基因库登录号NP_001129071.1)和人TGFβ3(例如，基因库登录号NP_003230.1)。
IL-4是已经涉及通过脂多糖(LPS)活化的人单核细胞抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β的产量的细胞因子。在基因库登录号NP_000580.1、NP_758858.1和NP_001341919.1下提供了示例性人IL4序列。
IL-10是涉及免疫调节和炎症的多效性细胞因子。IL-10主要由单核细胞产生，但是也可以由淋巴细胞产生，并且能够调节B细胞存活、抗体产量和增殖。IL-10可以作用于由两种IL-10受体1和两种IL-10受体2蛋白构成的受体复合物。在基因库登录号NP_000563.1下提供了示例性人IL-10序列。
IL-13是已经涉及抑制LPS活化的人单核细胞中的炎性细胞因子产量的免疫调节细胞因子。在基因库登录号NP_002179.2和NP_001341920.1下提供了示例性人IL-13序列。IL-33属于细胞因子的白细胞介素1超家族，其还包含IL-1α、IL-1β、IL-1RA和IL-18。IL-33与IL1RL1/ST2受体结合。先前已经显示IL-33在脂肪组织炎症中具有抗炎作用，并且已经显示其在心血管疾病中具有保护作用。在基因库登录号NP_001300974.1、NP_001186569.1、NP_001186570.1、NP_001300975.1、NP_001300977.1和NP_001340731.1下提供了示例性人IL-33序列。
IL-35是IL-12家族细胞因子。IL-35主要由调节T细胞产生，并且涉及免疫系统的抑制。IL-35是由IL-27β和IL12α亚基构成的异二聚体蛋白。人IL-27β(例如，基因库登录号NP_005746.2)由EBI3基因编码。如上所述，人IL12α亚基由IL12A基因编码。
IL-37是细胞因子的IL-37家族的成员，并且涉及炎症的减少。IL-37能够抑制许多促炎性细胞因子的产量，所述促炎性细胞因子包含IL-8、IL-6和TNFα。在基因库登录号NP_055254.2、NP_775294.1、NP_775295.1、NP_775296.1和NP_775297.1下提供了示例性人IL-37序列。
(ii)敲除修饰
在一些实施例中，本文所述的经修饰免疫细胞可以包括靶向如本文所述的一种或多种内源性炎性蛋白的一种或多种“敲除”修饰。敲除修饰是指对宿主细胞(例如，如本文所述的免疫细胞)的任何类型的基因修饰，与缺少这种基因修饰的同一类型的野生型宿主细胞(即，野生型对应物)相比，所述敲除修饰导致靶内源性蛋白(例如，如本文所述的细胞因子或其它靶蛋白)的产量减少。可以通过将所关注细胞群的所关注蛋白质的产量水平与对照细胞群(例如，如本文所述的经修饰免疫细胞群相对于野生型对应物群)的所关注蛋白质的产量水平进行比较来确定如本文所述的所关注蛋白质的降低或升高的产量，所述产量水平是在相同条件下使用相同数量的细胞进行测量的(例如，通过使用相同实验条件的同一测定)。在一些情况下，与在相同条件下活化的野生型对应物相比，当活化(例如，用抗原、受体激动剂或用细胞因子刺激)时，经修饰免疫细胞因此可以产生更低水平的靶细胞因子。可替代地，可以在不使免疫细胞活化的情况下测量细胞因子产量的水平。在一些情况下，可能无法通过常规测定来检测由经修饰细胞产生的特定细胞因子的水平。可以使用本领域已知的常规方法来测量细胞因子水平。例如，使用细胞因子特异性抗体的ELISA型测定可以适用于细胞因子水平的测量。
敲除修饰可以包含靶炎性蛋白的至少一个内源性等位基因的基因编辑，包含但不限于在内源性等位基因的编码区或内源性等位基因的非编码调节区内的插入、缺失或置换，以破坏靶细胞因子的表达。如本文所使用的，内源性等位基因是在细胞内天然发现的基因等位基因(即，对于细胞而言是天然的)。
可替代地，敲除修饰可以包含引入抑制如本文所述的靶炎性蛋白的表达的外源性核酸(例如，反义寡核苷酸，如干扰RNA)。外源性核酸是指在修饰之前不是由宿主细胞产生并且通过转染方法(例如，本文所述的方法)递送到宿主细胞中的核酸。
经受如本文所述的敲除修饰的靶炎性蛋白包含但不限于炎性细胞因子或其可溶性受体(例如，IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF)、炎性生长因子(例如，TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF)和细胞毒性分子(例如，穿孔素、颗粒酶和铁蛋白)。
具有本文所述的敲除修饰的经修饰免疫细胞的如上所述的靶细胞因子/蛋白质中的一种或多种靶细胞因子/蛋白质可以被敲除。在一些情况下，对靶细胞因子/蛋白质进行编码的内源性基因在编码区或非编码调节区中经受基因编辑，使得来自所述内源性基因的靶细胞因子/蛋白质的表达被破坏，从而降低经修饰免疫细胞对这种靶细胞因子/蛋白质的产量水平。在其它情况下，可以使用对靶细胞因子/蛋白质的编码区具有特异性的外源性反义核酸(例如，靶向对靶细胞因子/蛋白质进行编码的mRNA的合适区域)来修饰免疫细胞，以减少靶细胞因子/蛋白质的表达。
经修饰免疫细胞可以含有如本文所述的一种类型的基因修饰或不同基因修饰的组合(例如，一种靶细胞因子/蛋白质的内源性基因的破坏和外源性反义核酸的递送的组合，以下调另一种靶细胞因子/蛋白质的表达)。
(iii)敲入修饰
在其它实施例中，本文所述的经修饰免疫细胞可以包括一种或多种“敲入”修饰，以表达免疫抑制性细胞因子或以表达靶向一种或多种炎性蛋白(靶蛋白)的拮抗剂，例如由过继免疫细胞疗法的接受者的免疫系统产生的炎性蛋白。靶蛋白包含炎性细胞因子、其可溶性受体、炎性生长因子和细胞毒性分子。敲入修饰可以包括向宿主细胞(例如，如本文所述的免疫细胞)递送对免疫抑制性细胞因子和/或细胞因子拮抗剂进行编码的外源性核酸。外源性核酸与合适的启动子有效连接，使得经过编码的蛋白质(例如，细胞因子拮抗剂和/或免疫抑制性细胞因子)可以在宿主细胞中表达。在一些情况下，对拮抗剂和/或免疫抑制性细胞因子进行编码的外源性核酸可以整合到宿主细胞的基因组中。在其它情况下，外源性核酸可以保持在染色体外(未整合到基因组中)。
靶炎性蛋白的实例包含但不限于炎性细胞因子或其可溶性受体(例如，IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF)、炎性生长因子(例如，TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF)和细胞毒性分子(例如，穿孔素、颗粒酶和铁蛋白)。
包括一种或多种敲入修饰的经修饰免疫细胞可以包括用于表达如本文所述的免疫抑制性细胞因子和/或一种或多种靶炎性蛋白的拮抗剂的一种或多种外源性核酸(例如，外源性表达盒)。出于本公开的目的，将明确理解的是术语“拮抗剂”涵盖所有先前鉴定的术语、标题和功能状态和特点，由此靶蛋白本身、靶蛋白的生物活性或生物活性的结果在任何有意义的程度上(例如至少20％、50％、70％、85％、90％或以上)被基本上无效、降低或中和。
在一些实施例中，本文所述的细胞因子拮抗剂可以是对靶蛋白具有特异性的抗体、对靶蛋白的受体具有特异性的抗体或针对参与细胞因子及其受体的复合物的辅助蛋白的抗体。此类抗体(拮抗性抗体)还干扰靶细胞因子与其免疫细胞上的同源受体的结合，由此抑制由靶蛋白介导的细胞信号传导。在本公开的范围内的拮抗性抗体包含但不限于能够与炎性蛋白的活性结合并中和炎性蛋白的活性的抗体(例如，炎性细胞因子，包含IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF、炎性生长因子，包含TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF以及细胞毒性分子，包含穿孔素、颗粒酶和铁蛋白)以及在适用的情况下能够与任何靶蛋白的受体结合的抗体。示例性拮抗性抗体包含克拉扎珠单抗(clazakizumab)、奥洛珠单抗(olokizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、西鲁库单抗(抗IL6R)、托珠单抗(抗IL6R)和沙利鲁单抗(sarilumab)(抗IL6R)或其抗原结合片段、其经过基因修饰的形式(例如，源自参考抗体的scFv)。已知抗体(例如，scFv抗体)的经过基因修饰的形式包括与参考抗体相同的重链和轻链互补决定区，并且任选地包括与参考抗体相同的重链和轻链可变区。
如本文所使用的抗体(以复数形式可互换地使用)是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点来与靶蛋白(例如，本文所述的IL6和其它蛋白)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体”不但涵盖完整(即，全长)抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，所述经修饰构型包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和经共价修饰抗体。抗体包含任何类的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同类。存在五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的若干类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
在一些实施例中，本文所述的抗体可以特异性结合靶蛋白或其受体。与靶标或表位“特异性结合”(在本文中可互换地使用)的抗体是本领域中所熟知的术语，并且用于确定这种特异性结合的方法也是本领域中所熟知的。如果分子与特定靶抗原比其与替代性靶标更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为展现出“特异性结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合性更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶细胞因子“特异性地结合”。例如，与IL6表位特异性地(或优先地)结合的抗体是比其结合其它IL6表位或非IL6表位亲和力更大地、亲合性更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合这个IL6表位的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶抗原特异性地结合的抗体可以或可以不与第二靶抗原特异性地结合或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他结合。通常，但不是必然地，提及结合意指优先结合。
在一些实施例中，如本文所述的靶蛋白的拮抗性抗体对靶蛋白(例如，IL6或GM-CSF)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所使用的，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的拮抗性抗体对于靶抗原或抗原表位的结合亲和力(KD)可以为至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低。增大的结合亲和力对应于减小的KD。抗体相对于第二抗体对第一抗体的更高亲和力结合可以通过比用于结合第二抗体的KA(或数值KD)更高的用于结合第一抗体的KA(或更小的数值KD)来指示。在这种情况下，所述抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白质；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。在一些实施例中，与对处于前体形式的靶蛋白或另一种蛋白(例如，与靶蛋白处于同一家族的炎性蛋白)的结合亲和力相比，本文所述的拮抗性抗体对处于成熟形式的靶蛋白具有更高的结合亲和力(更高的KA或更小的KD)。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或105倍。
可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，所述各种方法包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件为处于HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(Bound)])通常通过以下方程与游离靶蛋白([游离(Free)])的浓度相关：
[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])
尽管，并不总是需要对KA进行精确测定，因为有时例如通过功能测定(例如，体外或体内测定)中的活性足以获得对亲和力的定性测量、获得对亲和力的定性测量或获得对亲和力的推断，所述亲和力例如是使用如ELISA或FACS分析等方法确定的、与KA成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。
在一些实例中，本文所述的拮抗性抗体是人抗体或人源化抗体。可替代地或另外，拮抗性抗体是单链抗体(scFv)。
在其它实施例中，本文所述的炎性蛋白拮抗剂可以是能够结合靶蛋白的可溶性受体。此类可溶性受体可以包括靶蛋白的受体的胞外结构域，但是缺乏受体的跨膜结构域，使得可溶性受体不显示在细胞表面上。可溶性受体可以与细胞表面受体竞争与靶蛋白结合，由此抑制由靶蛋白介导的信号传导。用于本公开的示例性可溶性受体包含可溶性IL-6受体(IL6R)、可溶性IL1受体II型(sIL-1RII)、可溶性gp130、可溶性RAGE、可溶性IL15Rα(sIL-15Rα，参见例如Mortier等人,《免疫学杂志》173(3):1681-8,2004)，以及可溶性CCR2受体(参见例如，例如Izhak等人,《免疫学杂志》,183(1):732-9,2009)。白细胞介素-1受体2型(亦称，IL-1RII)由人的IL1R2基因编码，并且被认为是诱饵受体，并且充当其配体的抑制剂。在基因库登录号NP_004624.1和NP_001248348.1下提供了示例性人IL-1RII序列。如本文所使用的，sIL-1RII是指IL-1RII受体的可溶性形式。包括敲入修饰的经修饰免疫细胞包括对如本文所述的一种或多种炎性蛋白拮抗剂进行编码的一种或多种外源性核酸。在一些情况下，外源性核酸包括表达盒，其中编码序列与合适的启动子可操作地连接(在免疫细胞中起作用以驱动拮抗剂的表达)。任选地，表达盒可以包括一个或多个调节元件，例如增强子、polyA调节序列等。在一些实例中，表达盒可以是病毒载体(例如，逆转录病毒载体或AAV载体)的一部分，用于将外源性核酸递送到免疫细胞中和/或用于将其整合到宿主基因组中。
(iv)包括经修饰免疫细胞的细胞群
本文还提供了一种免疫细胞群，其包括具有如本文所述的敲入修饰、敲除修饰或其组合的经修饰细胞。免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞、其前体或其组合。在一些情况下，免疫细胞群被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体可以对疾病细胞的抗原，例如肿瘤抗原具有特异性。典型的CAR构建体可以包括能够结合所关注抗原(例如，肿瘤抗原)的胞外抗原结合片段(例如，scFv片段)、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和CD3ζ。这种CAR构建体可以进一步含有铰链结构域。
可替代地或另外，免疫细胞可以被进一步修饰以表达外源性细胞因子、嵌合抗原受体(例如，嵌合synNotch受体、嵌合免疫受体、嵌合共刺激受体、嵌合杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR))、外源性T细胞受体(TCR)和/或使内源性TCR被敲除。嵌合抗原受体(CAR)通常包括(i)能够与靶蛋白结合的胞外配体结合结构域(例如，scFv片段或受体(如细胞因子受体、共刺激受体(例如，CD28)或检查点受体(例如，PD-1))的胞外结构域；(ii)用于将CAR锚定在细胞膜上的跨膜结构域；以及(iii)用于信号传导转导的一个或多个胞内信号传导结构域，例如CD3z、KIR、2B4、CD28、4-1BB、CD27、OX40、ICOS、MYD88、IL2受体、SynNotch等的信号传导结构域。嵌合细胞因子受体是指包括细胞因子受体的胞外结构域的CAR。嵌合共刺激受体是指包括共刺激受体的胞外结构域的CAR。嵌合KIR受体和嵌合SynNotch受体分别是指包括来自KIR和SynNotch的信号传导结构域的CAR。
在一些实施例中，本文所述的免疫细胞群可以包括至少(i)第一多个经修饰免疫细胞，其包括本文所述的敲除修饰中的一种或多种敲除修饰；以及(ii)第二多个经修饰免疫细胞，其包括也如本文所述的敲除修饰中的一种或多种敲除修饰。
所述第一多个经修饰免疫细胞可以产生的如在本文中结合敲除修饰所述的细胞因子/蛋白质中的一种或多种的水平降低，例如IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2、VWF、TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF、穿孔素、颗粒酶和铁蛋白。所述第一多个经修饰免疫细胞中的一些或所有成员可能具有一种敲除修饰，以减少所关注炎性蛋白的产量。可替代地，所述第一多个中的一些或所有成员可能具有多于一种敲除修饰，以减少多于一种所关注细胞因子的产量。所述第一多个经修饰免疫细胞的不同成员可能具有不同的敲除修饰或不同的敲除修饰组合。例如，一个成员可能具有IL-2的敲除，另一个成员可能具有GM-CSF的敲除，并且第三成员可能具有两者。所述第一多个经修饰免疫细胞的所有成员共同地具有所有所关注敲除修饰，使得所有所关注细胞因子的产量水平降低。
所述第二多个经修饰免疫细胞可以表达如在本文中结合敲入修饰所述的一种或多种靶蛋白的拮抗剂中的一种或多种拮抗剂，例如IL2的拮抗剂、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2、VWF、TGFα、VEGF、EGF、HGF、FGF、穿孔素、颗粒酶、铁蛋白或其组合。所述第二多个经修饰免疫细胞中的一些或所有成员可以具有一种敲入修饰，即携带一个外源性核酸，所述外源性核酸可以被设计成表达一种所关注细胞因子拮抗剂、一种所关注免疫抑制性细胞因子、多种所关注拮抗剂、多种所关注免疫抑制性细胞因子或其组合。可替代地，所述第二多个中的一些或所有成员可以具有多于一种敲入修饰，即携带多于一种外源性核酸，每种外源性核酸可以被设计成表达一种细胞因子拮抗剂、一种免疫抑制性细胞因子、多于一种细胞因子拮抗剂、多于一种免疫抑制性细胞因子或其组合。所述第二多个经修饰免疫细胞的不同成员可能具有不同的敲入修饰或不同的敲入修饰组合。例如，一个成员可能具有IL6拮抗剂的敲入，另一个成员可能具有IL15拮抗剂的敲入，并且第三成员可能具有两者。所述第二多个经修饰免疫细胞的所有成员共同地具有所有所关注敲入修饰，使得所有所关注拮抗剂被表达。
在包括第一多个经修饰免疫细胞和第二多个经修饰免疫细胞的免疫细胞群中，由此产生的此类细胞因子/蛋白质中的一种或多种细胞因子/蛋白质的总水平相对于如在相同条件下(例如，使用同一测定和相同实验条件)确定的野生型对应物(具有相同细胞数)产生的一种或多种相同细胞因子/一种或多种蛋白质的总水平降低了至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。细胞因子/蛋白质产量的总水平可以表示免疫细胞在活化时的细胞因子/蛋白质的产量水平。可替代地，细胞因子/蛋白质产量的总水平可以表示去活化免疫细胞的细胞因子/蛋白质的产量水平。在一些情况下，可能无法通过常规测定来检测由免疫细胞群产生的特定细胞因子的水平。
进一步地，免疫细胞群可以产生处于合适水平的一种或多种细胞因子拮抗剂，用于以有意义的水平抑制由靶细胞因子介导的信号传导，从而减少或消除过继免疫细胞疗法中由这种细胞因子引起的副作用。
如本文所述的免疫细胞群中的第一多个经修饰免疫细胞和第二多个经修饰免疫细胞可以是同一免疫细胞类型(例如，T细胞或NK细胞)。在一些情况下，所述第一多个经修饰免疫细胞和第二多个经修饰免疫细胞可以重叠，即具有拥有敲入修饰和敲除修饰两者的成员。在其它情况下，所述第一多个经修饰免疫细胞和第二多个经修饰免疫细胞不具有重叠成员。
在另一个实施例中，本文提供了一种免疫细胞群，其包括具有IL-2的敲除修饰的多个经修饰免疫细胞。在一些情况下，由这种免疫细胞群产生的IL-2的总水平相对于如在相同条件下确定的野生型对应物可以降低至少10％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高)。例如，本文所述的免疫细胞群产生的IL-2的总水平与如在相同条件下确定的野生型对应物相比可以低约30-95％。在一个特定实例中，免疫细胞群产生的IL-2的总水平可以是野生型对应物的IL-2的总水平的约50％。
免疫细胞群可以进一步包括如本文所述的具有另外的敲除修饰和/或敲入修饰的经修饰细胞，使得敲除细胞因子/蛋白质的总水平相对于野生型对应物降低，和/或免疫细胞群表达合适水平的细胞因子拮抗剂。在一些情况下，免疫细胞群进一步包括具有GM-CSF敲除、具有TNFα敲除和/或具有IL6拮抗剂敲入的经修饰细胞。类似地，免疫细胞群的成员可以具有所述敲入修饰和/或敲除修饰中的一种或多种敲入修饰和/或敲除修饰，并且不同成员可以具有不同的敲入修饰/敲除修饰或不同的敲入修饰/敲除修饰组合。免疫细胞群的所有成员共同地具有所有所关注敲入修饰/敲除修饰。
II.制备经修饰免疫细胞的方法
可以将任何敲入修饰和敲除修饰通过本文所述的常规方法和/或方法引入合适的免疫细胞中。通常，这种方法将涉及将基因物质递送到合适的免疫细胞中，以下调靶内源性炎性蛋白的表达、表达所关注细胞因子拮抗剂或表达所关注免疫抑制性细胞因子。
(i)敲除修饰
可以使用本领域已知的用于下调宿主细胞中的内源性基因表达的任何方法来降低本文所述的靶内源性细胞因子/蛋白质的产量水平。
在一些情况下，可以执行基因编辑方法以修饰靶细胞因子/蛋白质的基因的内源性等位基因(例如，在编码区或非编码调节区中)，从而降低靶内源性细胞因子的表达。基因编辑方法可能涉及使用能够切割内源性等位基因中的靶区的核酸内切酶。在模板核酸不存在的情况下，非同源性末端连接可以修复基因组中的双链断裂，并且将突变(例如，插入、缺失和/或移码)引入靶位点中。基因编辑方法通常基于参与靶核酸中产生双链断裂的核酸内切酶的类型来分类。实例包含但不限于，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/核酸内切酶系统、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、核酸内切酶(例如，ARC归巢核酸内切酶)、大范围核酸酶(例如，mega-TAL)或其组合。
基因区的切割可以包括通过核酸内切酶来切割靶等位基因的位置处的一条或两条链。在一些实施例中，切割事件之后可以通过与外源性模板多核苷酸同源性重组来修复切割的靶多核苷酸，从而导致靶核苷酸序列的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。这种基因编辑可以导致靶基因的转录减少(例如，IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2、VWF、TGFα、VEGF、EGF、HGF、FGF、穿孔素、颗粒酶、铁蛋白或其组合)。
免疫细胞群中的靶内源性细胞因子/蛋白质的降低水平可以通过引入细胞群中的基因编辑事件的水平来调节。例如，引入宿主免疫细胞群中的大量的一种或多种基因编辑组分将会导致大部分宿主免疫细胞具有经过编辑的靶内源性等位基因。如此，将会高水平地降低靶内源性细胞因子/蛋白质的总产生水平。可替代地，引入宿主免疫细胞群中的少量的一种或多种基因编辑组分将导致小部分宿主免疫细胞具有经过编辑的靶内源性等位基因。如此，靶内源性细胞因子/蛋白质的总产量水平将降低低水平。因此，控制待递送到细胞群的一种或多种基因编辑组分的量可以控制靶内源性细胞因子/蛋白质的总降低水平。如本领域技术人员已知的，其它合适的方法也可以适用于控制靶细胞因子/蛋白质的降低水平。
在一些情况下，使用本领域已知的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/核酸内切酶技术进行如本文所述的免疫细胞的基因修饰。CRISPR/核酸内切酶系统已经适用于原核细胞和真核细胞。使用CRISPR的基因编辑通常依赖于至少两种组分的表达：识别靶核酸序列的引导RNA序列和核酸内切酶(例如，包含Cpf1和Cas9)。引导RNA帮助将核酸内切酶引导到靶位点，所述靶位点通常含有与gRNA或其一部分互补(部分地或完全地)的核苷酸序列。在一些情况下，引导RNA是包括与靶核酸序列互补的原型间隔片段和支架RNA片段的两件RNA复合物(two-piece RNA complex)。在一些情况下，需要支架RNA帮助将核酸内切酶募集到靶位点。在一些情况下，引导RNA是包括原型间隔序列和支架RNA序列两者的单引导RNA(sgRNA)。支架RNA的示例性序列可以是：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:31)。一旦在靶位点处，核酸内切酶就可以产生双链断裂。本领域技术人员已知的是，RNA分子的核苷酸序列包含残基“U”。本文所公开的任何RNA序列的对应DNA序列也在本公开的范围内。这种DNA序列将包含“T”替代对应RNA序列中的“U”。
用于与CRISPR系统一起使用的靶核酸在3'侧上由原型间隔相邻基序(PAM)侧接，所述原型间隔相邻基序可以与核酸内切酶相互作用并且进一步参与将核酸内切酶活性靶向靶核酸。通常认为，侧接靶核酸的PAM序列取决于核酸内切酶和所述核酸内切酶源自的来源。例如，对于源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NGG。对于源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNGRRT。对于源自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNNNGATT。对于源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NNAGAA。对于源自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的Cas9核酸内切酶，PAM序列是NAAAAC。对于Cpf1核酸酶，PAM序列是TTN。
与内源性细胞因子基因座中的靶序列杂交的CRISPR/核酸内切酶系统可以用于敲除所关注细胞因子。gRNA与宿主细胞基因组中的靶核酸序列(例如，细胞因子的内源性基因座)杂交(部分地或完全地互补)。与靶核酸杂交的gRNA或其部分的长度可以介于15-25个核苷酸、18-22个核苷酸或19-21个核苷酸之间。在一些情况下，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。在一些实例中，与靶核酸杂交的gRNA序列的长度介于10-30个或介于15-25个核苷酸之间。
在一些实例中，gRNA序列与靶核酸至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％互补(还参见美国专利8,697,359，所述美国专利以其gRNA序列与靶多核苷酸序列的互补性的教导通过引用并入)。已经证明，CRISPR引导序列与靶核酸的3'端附近的靶核酸之间的错配可以消除核酸酶切割活性(参见例如，Upadhyay等人,《基因、基因组、遗传学(Genes Genome Genetics)》(2013)3(12):2233-2238)。在一些实例中，gRNA序列与靶核酸的3'端(例如，靶核酸的3'端的最后5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或至少100％互补。
使用Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:2264-68,1990的算法测定两种核酸的“一致性百分比”，所述算法如Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊》90:5873-77,1993中那样进行修改。此类算法并入Altschul等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用NBLAST程序(得分＝100，字长-12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以利用如Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402,1997中描述的带空位的BLAST(GappedBLAST)。当利用BLAST程序和带空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些情况下，与不具有所述一种或多种引导RNA或sgRNA的野生型群相比，引入细胞群中的一种或多种引导RNA或sgRNA的量使所述群对一种或多种炎性蛋白(例如，IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2、VWF、TGFα、VEGF、EGF、HGF、FGF、穿孔素、颗粒酶、铁蛋白或其组合)的总产量降低至少10％(至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。例如，靶向IL-2基因座的CRISPR/CAS系统中的sgRNA的量可以导致总群体产生减少约30-95％的IL-2。在一个实例中，IL-2产量减少约50％。CRISPR/核酸内切酶系统可以任选地用于修饰内源性GM-CSF基因座和/或TNF基因座，以减少这些细胞因子的产量。
各种CRISPR/核酸内切酶系统是本领域已知的，并且修饰是有规律的，并且许多参考文献描述了用于引导CRISPR/核酸内切酶系统(例如，包含Cas9靶选择工具)的设计的规则和参数。参见例如，Hsu等人,《细胞》,157(6):1262-78,2014。
在一些情况下，使用本领域已知的TALEN技术进行如本文所述的免疫细胞的基因修饰。TALEN是可以特异性地结合和切割期望的靶DNA分子的工程化限制酶。TALEN通常含有与DNA切割结构域融合的转录激活因子样效应子(TALE)DNA结合结构域。DNA结合结构域可以含有高度保守的33-34个氨基酸序列，其中在位置12和13处具有趋异的2个氨基酸RVD(重复可变二肽基序)。RVD基序确定对核酸序列的结合特异性，并且可以根据本领域技术人员已知的方法进行工程化，以特异性地结合期望的DNA序列(参见例如，Juillerat等人,《科学报告(Scientific reports)》,5:8150,2015；Miller等人,《自然生物技术(NatureBiotechnology)》29(2):143–8,2011；Zhang等人,《自然生物技术》29(2):149–53,2011；Geiβler等人,《公共科学图书馆：综合(PLoS ONE)》6(5):e19509,2011；Boch,《自然生物技术》29(2):135–6,2011；Boch等人,《科学》326(5959):1509–12,2009；以及Moscou等人,《科学》326(5959):1501,2009。DNA切割结构域可以源自FokI核酸内切酶，其在许多不同的细胞类型中均具有活性。FokI结构域充当二聚体，从而使靶基因组中具有适当朝向和间隔的位点需要具有独特DNA结合结构域的两个构建体。TALE DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基的数量两者似乎是用于实现高活性水平的重要参数。参见例如，Miller等人,《自然生物技术》29:143-8,2011。
可以使用本领域已知的任何方法来构建对所关注靶基因中的序列具有特异性的TALEN(例如，IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2、VWF、TGFα、VEGF、EGF、HGF、FGF、穿孔素、颗粒酶、铁蛋白或其组合)，所述方法包含使用模块化组分的各种方案。参见例如，Zhang等人,《自然生物技术》29,2011:149-53；以及Geibler等人,《公共科学图书馆：综合》6:e19509,2011。
可以在细胞内部使用对所关注靶基因具有特异性的TALEN以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制通过非同源性末端连接不适当地修复断裂，则可以在断裂位点处引入突变。例如，不适当的修复可以引入移码突变。
在一些实例中，本领域已知的锌指核酸酶(ZFN)可以用于产生本文所述的经修饰免疫细胞群。锌指核酸酶(ZFN)是包含与II型核酸内切酶FokI的催化结构域连接的工程化锌指DNA结合结构域的限制酶。每个ZFN的锌指DNA结合结构域将连接的FokI核酸内切酶靶向基因组中的特异性位点。由于FokI仅充当二聚体，所以一对ZFN通常被工程化成与相对DNA链上的同源靶“半位点”序列结合。靶“半位点”序列通常是间隔开的，使得催化活性的FokI二聚体可以在其之间形成。在FokI结构域二聚化后，在ZFN半位点之间产生DNA双链断裂。如上所述，非同源性末端连接可以引入突变，而同源定向修复可以用于引入外源性核酸。
已经描述了使用ZFN的许多基因编辑系统和设计ZFN的考虑；参见例如，Segal等人,《美国国家科学院院刊》96(6):2758-63(1999)；Dreier B等人,《分子生物学杂志》303(4):489-502,2000；Liu Q等人,《生物化学杂志》277(6):3850-6,2002；Dreier等人,《生物化学杂志》280(42):35588-97,2005；以及Dreier等人,《生物化学杂志》276(31):29466-78,2001。
还可以使用本领域已知的任何方法引入大范围核酸酶(或归巢核酸内切酶)，以对本文所述的任何经修饰细胞进行基因工程化，所述大范围核酸酶是识别长DNA靶(通常介于14个与40个碱基对之间)的序列特异性核酸内切酶。存在至少六个大范围核酸酶家族，并且所述至少六个大范围核酸酶家族通常基于结构基序进行分类，包含LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys box、PD-(D/E)XK和Vsr样。大范围核酸酶的非限制性实例包含PI-SceI、I-CreI和I-TevI。
在本领域中已经描述了使用大范围核酸酶(包含经修饰大范围核酸酶)的各种基因编辑系统；参见例如，Steentoft等人,《糖生物学(Glycobiology)》24(8):663-80,2014；Belfort和Bonocora,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》1123:1-26,2014；Hafez和Hausner,《基因组(Genome)》55(8):553-69,(2012)；以及本文中引用的参考文献的综述。
还可以使用包含MegaTAL的杂交核酸酶。MegaTAL是TALE DNA结合结构域与催化活性的大范围核酸酶的融合体。此类核酸酶利用TALE的DNA结合特异性和大范围核酸酶的序列切割特异性。参见例如，Boissel等人,《NAR》,42:2591-2601,2014。
可替代地，可以通过本领域已知的方法使用反义寡核苷酸或核酶来实现任何敲除修饰。对靶细胞因子/蛋白质具有特异性的反义寡核苷酸是指与细胞因子的内源性基因或对此类内源性基因进行编码的mRNA的靶区互补或部分地互补的寡核苷酸。
反义寡核苷酸可以包含小干扰RNA(siRNA或RNAi)，其可以通过RNA干扰下调靶细胞因子的表达。RNA干扰(RNAi)是其中dsRNA指导信使RNA的同源性序列特异性降解的过程。在哺乳动物细胞中，RNAi可以由小干扰RNA(siRNA)的21个核苷酸双链体触发而不使宿主干扰素应答活化。在本文所公开的方法中使用的dsRNA可以是siRNA(含有两条分离且互补的RNA链)或短发夹RNA(即，形成紧密发夹结构的RNA链)，所述两者均可以基于靶基因的序列来设计。可替代地，其可以是微RNA。
可以将任何反义寡核苷酸或用于产生此类反义寡核苷酸的表达盒通过常规方法递送到免疫细胞中，以下调如本文所述的一种或多种靶细胞因子/蛋白质的产量。
(ii)敲入修饰
为了产生本文所述的一种或多种细胞因子拮抗剂的敲入，可以将本文所述的任何拮抗剂和/或免疫抑制性细胞因子的编码序列克隆到合适的表达载体(例如，包含但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、PiggyBac转座子载体和SleepingBeauty转座子载体)中，并且使用常规重组技术将其引入宿主免疫细胞中。Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Mannual)》,第3版,冷泉港实验室出版社。结果，本公开的经修饰免疫细胞可以包括对至少一种细胞因子拮抗剂或至少一种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种外源性核酸。在一些情况下，将一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子的编码序列整合到细胞的基因组中。在一些情况下，一种或多种拮抗剂的编码序列未整合到细胞的基因组中。
包括所关注细胞因子拮抗剂或免疫抑制性细胞因子的编码序列的外源性核酸可以进一步包括合适的启动子，所述启动子可以与编码序列可操作地连接。如本文所使用的，启动子是指核酸上的RNA聚合酶可以与其结合的核苷酸序列(位点)，以启动编码DNA(例如，对于细胞因子拮抗剂)转录成mRNA，然后将其翻译成对应的蛋白质(即，基因的表达)。当启动子相对于编码序列处于正确的功能位置和朝向以控制(“驱动”)所述编码序列的转录起始和表达(以产生对应的蛋白质分子)时，所述启动子被认为与编码序列“可操作地连接”。在一些情况下，本文所述的启动子可以是组成型的，其启动独立于其它调节因子的转录。在一些情况下，本文所述的启动子可以是诱导型的，其依赖于用于转录的调节因子。示例性启动子包含但不限于泛素、RSV、CMV、EF1α和PGK1。在一个实例中，可以通过常规方法将与一个或多个合适的启动子可操作地连接的对如本文所述的一种或多种炎性细胞因子的一种或多种拮抗剂进行编码的一个或多个核酸引入免疫细胞中，以驱动一种或多种拮抗剂的表达。
另外，本文所述的外源性核酸可以进一步含有例如，以下中的一些或全部：可选择标志物基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适方法是本领域熟知的且可获得的。Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第3版,冷泉港实验室出版社。
(iii)包括经修饰免疫细胞的免疫细胞群的制备
可以通过将所述敲除修饰中的一种或多种敲除修饰、所述敲入修饰中的一种或多种敲入修饰或其组合引入宿主免疫细胞群中来制备包括本文所述的任何经修饰免疫细胞或其组合的免疫细胞群。可以以任何顺序将敲入修饰和敲除修饰引入宿主细胞中。
在一些情况下，在先前的修饰事件之后和在下一个修饰事件之前，以顺序的方式将一种或多种修饰引入宿主细胞中而无需分离和/或富集经修饰细胞。在那种情况下，所得免疫细胞群可以是异质的，所述免疫细胞群包括具有不同的修饰或不同的修饰组合的细胞。这种免疫细胞群还可以包括未经修饰免疫细胞。相对于宿主免疫细胞的总数，可以通过诱导这种修饰的遗传物质的量来控制免疫细胞群中发生的每个修饰事件的水平。还参见以上讨论。
在其它情况下，在第一修饰事件之后在进行第二修饰事件之前，可以分离并富集经修饰免疫细胞。此方法将导致产生基本上同质的免疫细胞群，所述基本上同质的免疫细胞群具有引入细胞中的所有敲入修饰和/或敲除修饰。
在一些实例中，将一种或多种敲入修饰和一种或多种敲除修饰分别引入宿主免疫细胞中。例如，通过基因编辑进行敲除修饰以敲除靶细胞因子的内源性基因，并且通过将用于产生一种或多种细胞因子拮抗剂的单独的外源性表达盒递送到宿主免疫细胞中来进行敲入修饰。图1的左图中提供了示例性示意图。
可替代地，如图1的右图所展示的，可以同时执行敲入修饰和敲除修饰。例如，可以通过同源性供体模板连同上述基因编辑系统引入对一种或多种细胞因子拮抗剂进行编码的外源性核酸，以敲入一种或多种所关注细胞因子拮抗剂并且同时敲除内源性基因等位基因以减少如本文所述的内源性细胞因子/蛋白质的产量。当使用CRISPR/核酸内切酶系统时，引导RNA可以被设计成靶向所关注细胞因子的内源性基因座，并且此时引入用于产生一种或多种所关注细胞因子拮抗剂的表达盒。
可替代地，可以将外源性核酸(例如，对细胞因子拮抗剂进行编码的表达盒)连同TALEN一起引入细胞中。此过程可以用于将DNA片段引入所关注靶基因中和/或将缺陷引入内源性基因中，从而降低靶基因的表达，并且此时引入用于表达一种或多种细胞因子拮抗剂的外源性核酸。
免疫细胞群可以被进一步修饰成表达外源性细胞因子、如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)，如嵌合细胞因子受体、嵌合synNotch受体、嵌合免疫受体、嵌合共刺激受体、嵌合杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，和/或外源性T细胞受体。这可以在敲入修饰和/或敲除修饰之前、之后或同时进行。可以使用常规重组技术将此类受体克隆并整合到任何合适的表达载体中。嵌合抗原受体的设计的考虑因素也是本领域已知的。参见例如，Sadelain等人,《癌症发现(Cancer Discov.)》,3(4):388-98,2013。
III.治疗应用
包括如本文所述的经修饰免疫细胞的任何免疫细胞群可以用于治疗如白血病或淋巴瘤等靶疾病的过继免疫细胞疗法。由于引入免疫细胞中的敲入修饰和敲除修饰，预期此类修饰的治疗用途将降低与常规过继免疫细胞疗法相关的细胞毒性(降低过继免疫细胞疗法中使用的免疫细胞和接受者的内源性免疫细胞两者的炎性细胞因子产量和/或信号传导，其可以由经输注的免疫细胞活化)，同时实现相同或更好的治疗效果。
为了实践本文所述的治疗方法，可以将有效量的免疫细胞群(包括如本文所述的任何经修饰免疫细胞)通过合适的途径(例如，静脉内输注)施用于需要治疗的受试者。免疫细胞群可以在施用之前与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，这也在本公开的范围内。免疫细胞对于受试者而言可以是自体的，即免疫细胞是从需要治疗的受试者获得的，对被修饰以减少例如本文所述的一种或多种靶细胞因子/蛋白质的表达，以表达本文所述的一种或多种细胞因子拮抗剂，以表达CAR构建体和/或外源性TCR或其组合。然后可以将所得经修饰免疫细胞施用于同一受试者。与施用非自体细胞相比，将自体细胞施用于受试者可以导致免疫细胞的排斥减少。可替代地，免疫细胞可以是同种异体细胞，即所述细胞是从第一受试者获得的，如本文所述被修饰并且将其施用于不同于第一受试者但属于同一物种的第二受试者。例如，同种异体免疫细胞可以源自人类供体，并且施用于不同于所述供体的人类接受者。
待治疗的受试者可以是哺乳动物(例如，人、小鼠、猪、牛、大鼠、狗、豚鼠、兔子、仓鼠、猫、山羊、绵羊或猴子)。所述受试者可能患有癌症、患有感染性疾病或免疫病症。示例性癌症包含但不限于血液系统恶性肿瘤(例如，B细胞急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤)。示例性感染性疾病包含但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)感染、人乳头瘤病毒(HPV)感染、登革病毒感染、疟疾、败血症和大肠杆菌(E.coli)感染。示例性免疫病症包含但不限于自身免疫疾病，如类风湿性关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、多发性硬化症、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、银屑病、格雷夫斯病(Graves'disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌无力和血管炎。
如本文所使用的术语“有效量”是指单独地或与一种或多种活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重的个体患者参数、治疗持续时间、施用途径、赋形剂使用、与其它活性剂的共同使用(如果有的话)以及在健康从业者的知识和专业知识内的相似因素而变化。待施用的量取决于待治疗的受试者，包含例如个体免疫系统产生细胞介导的免疫应答的能力。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断。然而，本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量范围。
如本文所使用的术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物应用于或施用于受试者，所述受试者患有靶疾病、靶疾病的症状或对靶疾病的易感性，其目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或对疾病的易感性。
包括如本文所述的经修饰免疫细胞的免疫细胞群可以与用于癌症的其它类型的疗法(如化学疗法、外科手术、放射、基因疗法等)结合使用。此类疗法可以与本文所述的免疫疗法同时地或顺序地(以任何顺序)施用。当与另外的治疗剂共同施用时，由于相加作用或协同作用，可以降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
可用于与本文所述的经修饰免疫细胞组合的其它抗癌治疗剂的非限制性实例包含但不限于免疫检查点抑制剂(例如，PDL1、PD1和CTLA4抑制剂)、抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶的组织抑制剂、催乳素、血管抑素、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体以及胎盘增殖素相关蛋白)；VEGF拮抗剂(例如，抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段)；化学治疗化合物。示例性化学治疗化合物包含嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷(floxuridine)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷(cytarabine))；嘌呤类似物(例如，氟达拉滨(fludarabine))；叶酸拮抗剂(例如，巯基嘌呤(mercaptopurine)和硫鸟嘌呤(thioguanine))；抗增殖剂或抗有丝分裂剂，例如长春花生物碱(vinca alkaloids)；微管干扰剂，如紫杉烷(taxane)(例如，紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel))、长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)、诺考达唑(nocodazole)、埃坡霉素(epothilones)和长春瑞滨(navelbine)，以及表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)；DNA损伤剂(例如，放线菌素(actinomycin)、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素(anthracycline)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡铂(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、癌得星(cytoxan)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、己二胺(hexamethyhnelamine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺(iphosphamide)、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲(nitrosourea)、普卡霉素(plicamycin)、甲基苄肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷(teniposide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(etoposide))。
在一些实施例中，放射或放射和化学疗法与包括本文所述的经修饰免疫细胞的细胞群组合使用。另外的有用的药剂和疗法可以在《医师案头参考(Physician's DeskReference)》,补充第59版,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人,编辑《雷明顿药学科学与实践(Remington's The Science and Practice of Pharmacy)》,补充第20版,(2000),马里兰州巴尔的摩的利平科特·威廉姆斯和威尔金斯公司(LippincottWilliams and Wilkins,Baltimore Md.)；Braunwald等人,编辑《哈里森内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》,补充第15版,(2001),麦格劳·希尔公司(McGraw Hill),纽约州；Berkow等人,编辑《默克诊断与治疗手册(The Merck Manualof Diagnosis and Therapy)》,(1992),默克研究实验室(Merck ResearchLaboratories),新泽西州拉威(Rahway N.J.)中找到。
IV.用于治疗用途或制备经修饰免疫细胞的试剂盒
本公开还提供了用于涉及本文所述的免疫细胞群的本文所述的任何靶疾病的试剂盒，以及用于制备如本文所述的经修饰免疫细胞的试剂盒。
如本文所述的用于治疗用途的试剂盒可以包含包括免疫细胞群的一个或多个容器，所述免疫细胞群可以被调配成药物组合物。免疫细胞群包括本文所述的任何经修饰免疫细胞或其组合。免疫细胞群(如T淋巴细胞、NK细胞以及本文所述的其它细胞)可以进一步表达如本文所述的CAR构建体和/或外源性TCR。
在一些实施例中，试剂盒可以另外包括在本文所述的任何方法中使用免疫细胞群的说明书。所包含的说明书可以包括将免疫细胞群或包括所述免疫细胞群的药物组合物施用于受试者以在受试者中实现预期活性的描述。试剂盒可以进一步包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适合于治疗的受试者的描述。在一些实施例中，说明书包括将免疫细胞群或包括所述免疫细胞群的药物组合物施用于需要治疗的受试者的描述。
与免疫细胞群或包括如本文所述的免疫细胞群的药物组合物的使用相关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本公开的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页上的书面说明。标签或包装插页指示药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症、延迟受试者的疾病或病症的发作和/或减轻受试者的疾病或病症。
本文中提供的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置或输注装置)组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器还可以具有无菌进口端。药物组合物中的至少一种活性剂是包括任何经修饰免疫细胞或其组合的免疫细胞群(例如，T淋巴细胞或NK细胞)。
试剂盒任选地可以提供如缓冲剂等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本公开提供了包括以上所描述的试剂盒的内容物的制品。
这里还提供了用于制备本文所述的经修饰免疫细胞的试剂盒。这种试剂盒可以包含一个或多个容器，每个容器含有用于将敲入修饰和/或敲除修饰引入免疫细胞中的试剂。例如，试剂盒可以含有用于进行如本文所述的一种或多种敲除修饰的基因编辑系统的一种或多种组分。可替代地或另外，试剂盒可以包括用于表达也如本文所述的细胞因子拮抗剂的一种或多种外源性核酸，以及用于将外源性核酸递送到宿主免疫细胞中的试剂。这种试剂盒可以进一步包含用于对宿主免疫细胞进行所期望的修饰的说明书。
V.通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在如以下等文献中进行了充分解释：《分子克隆：实验室手册》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait,编辑1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis,编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney,编辑1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)普莱南出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(CellTissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods inEnzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell,编辑)：《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人,编辑1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》(Mullis等人,编辑1994)；《当代免疫学指南(Current Protocols inImmunology)》(J.E.Coligan等人,编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.,编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)》(P.Shepherd和C.Dean,编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra,编辑哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实践方法(DNA Cloning:Apractical Approach)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.D.Hames&S.J.Higginseds(1985；《转录和翻译(Transcription andTranslation)》(B.D.Hames&S.J.Higgins,编辑(1984；《动物细胞培养》(R.I.Freshney,编辑(1986；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)》(lRL出版社,1986)；以及B.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide To Molecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人,(编辑)。
本公开的应用不限于在本文的说明书中阐述的或在附图中展示的构造细节和组件布置。本公开能够具有其它实施例并且能够以不同的方式实践或进行。而且，本文所使用的措辞和术语是出于说明的目的并且不应该被认为具有限制性。本文中对“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化的使用意在涵盖其后列出的项及其等效物以及另外的项。还如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数指代物。
无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员能够基于以上描述，最大限度地利用本发明。因此，以下具体实施例应当被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余内容。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
实例1.携带敲入基因表达盒的T细胞的抗IL6R抗体的表达成功地抑制IL6信号传导。
通过Lipofectamine 2000转染产生对源自靶向IL6R的托珠单抗的单链可变片段(scFv)抗体进行编码的第三代自我去活化(SIN)慢病毒载体。然后将所得慢病毒载体应用于Jurkat E6-1细胞(急性T细胞白血病)的旋转转导(在室温下2500rpm持续90分钟)。扩增并培养经转导的细胞以收集含有所分泌的scFv的上清液，用于评估使用HEK-Blue IL-6细胞(英杰公司(Invivogen))阻断人IL6途径信号传导。使用HEK-Blue IL-6报告细胞，因为其能够在人IL6刺激时产生分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。通过分光光度计在650nm波长下测量经过转化的底物Quanti-Blue(英杰公司)的光吸光度来量化SEAP产量。
如图2所示，对来自Jurkat T细胞的不同稀释度的上清液进行测试，所述细胞具有对托珠单抗scFv进行编码的敲入基因盒。来自这些细胞的上清液通过与报告细胞上表达的IL6R结合来抑制IL6活性。例如，甚至在上清液的1/8稀释度下，IL6途径信号传导也有减少(图2)。这些结果表明，由敲入基因盒编码的托珠单抗scFv是功能性的，并且有效阻断IL6-IL6R信号传导。
实例2.敲除内源性细胞因子基因。
使用赛默飞世尔科技公司(thermo scientific)GeneArt Crispr/Cas9编辑试剂盒来产生GM-CSF、IL2和TNF敲除。每种sgRNA包括用于靶向待编辑的基因位点的间隔序列和具有SEQ ID NO:31的序列的支架RNA。通过在人GM-CSF、IL2和TNF基因基因座的外显子I中的PAM序列之前靶向19-20nt序列(可替代地17-20nt)来设计间隔序列。sgRNA是通过赛默飞世尔科技公司GeneArt sgRNA合成试剂盒通过体外转录来合成的。将赛默飞世尔科技公司TrueCut Cas9蛋白v2与sgRNA组合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物，并且通过BTX ECM830电穿孔仪引入Jurkat细胞。在电穿孔之后约7天，通过ELISA试剂盒(BD生物科学公司(BDBiosciences)和R&D系统)验证基因表达的成功破坏。对于ELISA，工程化Jurkat细胞通过PMA/肌霉素活化过夜，并且收集上清液用于分析细胞因子产量。图3-5显示，相对于具有正常分泌细胞因子的野生型Jurkat细胞，所测试的每种细胞因子的细胞因子减少百分比。
在Jurkat细胞中测试了八种靶向人GM-CSF的sgRNA。被测试的大多数sgRNA导致GM-CSF水平的一些下降(图3)。例如，sgRNA候选物3-6显示GM-CSF水平降低超过40％(图3)。由sgRNA 1-8靶向的人GM-CSF中的序列分别由双链序列示出：
5'-GCTGCAGAGCCTGCTGCTCT-3'(SEQ ID NO:1)
3'-CGACGTCTCGGACGACGAGA-5'(SEQ ID NO:74)
5'-GGAGCATGTGAATGCCATCC-3'(SEQ ID NO:2)
3'-CCTCGTACACTTACGGTAGG-5'(SEQ ID NO:75)
5'-GCATGTGAATGCCATCCAGG-3'(SEQ ID NO:3)
3'-CGTACACTTACGGTAGGTCC-5'(SEQ ID NO:76)
5'-GAGACGCCGGGCCTCCTGGA-3'(SEQ ID NO:4)
3'-CTCTGCGGCCCGGAGGACCT-5'(SEQ ID NO:77)
5'-GATGGCATTCACATGCTCCC-3'(SEQ ID NO:5)
3'-CTACCGTAAGTGTACGAGGG-5'(SEQ ID NO:78)
5'-GCTCCCAGGGCTGCGTGCTG-3'(SEQ ID NO:6)
3'-CGAGGGTCCCGACGCACGAC-5'(SEQ ID NO:79)
5'-GCGTGCTGGGGCTGGGCGAG-3'(SEQ ID NO:7)
3'-CGCACGACCCCGACCCGCTC-5'(SEQ ID NO:80)
5'-GCTGGGGCTGGGCGAGCGGG-3'(SEQ ID NO:8)
3'-CGACCCCGACCCGCTCGCCC-5'(SEQ ID NO:81)
以下(分别地)提供了用于靶向上述人GM-CSF位点的gRNA(例如，sgRNA)中的示例性原型间隔序列和含有所述序列的示例性sgRNA序列：
sgRNA 1间隔子：
GCUGCAGAGCCUGCUGCUCU(SEQ ID NO:32)
sgRNA 1全序列：
Figure BDA0002723941600000481
sgRNA 2间隔子：
GGAGCAUGUGAAUGCCAUCC(SEQ ID NO:34)
sgRNA 2全序列：
Figure BDA0002723941600000482
sgRNA 3间隔子：
GCAUGUGAAUGCCAUCCAGG(SEQ ID NO:36)
sgRNA 3全序列：
Figure BDA0002723941600000483
sgRNA 4间隔子：
GAGACGCCGGGCCUCCUGGA(SEQ ID NO:38)
sgRNA 4全序列：
Figure BDA0002723941600000484
sgRNA 5间隔子：
GAUGGCAUUCACAUGCUCCC(SEQ ID NO:40)
sgRNA 5全序列：
Figure BDA0002723941600000491
sgRNA 6间隔子：
GCUCCCAGGGCUGCGUGCUG(SEQ ID NO:42)
sgRNA 6全序列：
Figure BDA0002723941600000492
sgRNA 7间隔子：
GCGUGCUGGGGCUGGGCGAG(SEQ ID NO:44)
sgRNA 7全序列：
Figure BDA0002723941600000493
sgRNA 8间隔子：
GCUGGGGCUGGGCGAGCGGG(SEQ ID NO:46)
sgRNA 8全序列：
Figure BDA0002723941600000494
类似地，还在Jurkat细胞中测试了五种靶向人IL2的sgRNA。如图4所示，sgRNA候选物1、3和5显示出IL2水平的超过20％的降低，其中sgRNA候选物1和5显示出超过40％的细胞因子降低。
由sgRNA 1-5靶向的人IL2中的序列分别由双链序列示出：
5'-GACTTAGTGCAATGCAAGAC-3'(SEQ ID NO:9)
3'-CTGAATCACGTTACGTTCTG-5'(SEQ ID NO:82)
5'-GATTTACAGATGATTTTGAA-3'(SEQ ID NO:10)
3'-CTAAATGTCTACTAAAACTT-5'(SEQ ID NO:83)
5'-AAGAAAACACAGCTACAAC-3'(SEQ ID NO:11)
3'-TTCTTTTGTGTCGATGTTG-5'(SEQ ID NO:84)
5'-CAACTGGAGCATTTACTGC-3'(SEQ ID NO:12)
3'-GTTGACCTCGTAAATGACG-5'(SEQ ID NO:85)
5'-TCTTTGTAGAACTTGAAGT-3'(SEQ ID NO:13)
3'-AGAAACATCTTGAACTTCA-5'(SEQ ID NO:86)
以下(分别地)提供了用于靶向上述人IL2位点的gRNA(例如，sgRNA)中的示例性原型间隔序列和含有所述序列的示例性sgRNA序列：
sgRNA 1间隔子：
GACUUAGUGCAAUGCAAGAC(SEQ ID NO:48)
sgRNA 1全序列：
Figure BDA0002723941600000501
sgRNA 2间隔子：
GAUUUACAGAUGAUUUUGAA(SEQ ID NO:50)
sgRNA 2全序列：
Figure BDA0002723941600000502
sgRNA 3间隔子：
AAGAAAACACAGCUACAAC(SEQ ID NO:52)
sgRNA 3全序列
Figure BDA0002723941600000503
sgRNA 4间隔子：
CAACUGGAGCAUUUACUGC(SEQ ID NO:54)
sgRNA 4全序列：
Figure BDA0002723941600000511
sgRNA 5间隔子：
UCUUUGUAGAACUUGAAGU(SEQ ID NO:56)
sgRNA 5全序列：
Figure BDA0002723941600000512
为了减少Jurkat细胞中的TNF产量，表征了八种靶向人TNF的sgRNA。如图5所示，所有八种sgRNA均减少了TNF的产量。例如，sgRNA候选物1-6和8将TNF细胞因子产量减少超过70％。
由sgRNA 1-8靶向的人TNF中的序列分别由双链序列示出：
5'-GAGCACTGAAAGCATGATCC-3'(SEQ ID NO:14)
3'-CTCGTGACTTTCGTACTAGG-5'(SEQ ID NO:87)
5'-GGACGTGGAGCTGGCCGAGG-3'(SEQ ID NO:15)
3'-CCTGCACCTCGACCGGCTCC-5'(SEQ ID NO:88)
5'-GAGGCGCTCCCCAAGAAGAC-3'(SEQ ID NO:16)
3'-CTCCGCGAGGGGTTCTTCTG-5'(SEQ ID NO:89)
5'-GGGGGCCCCAGGGCTCCAGG-3'(SEQ ID NO:17)
3'-CCCCCGGGGTCCCGAGGTCC-5'(SEQ ID NO:90)
5'-GCTGAGGAACAAGCACCGCC-3'(SEQ ID NO:18)
3'-CGACTCCTTGTTCGTGGCGG-5'(SEQ ID NO:91)
5'-GGCGCCTGCCACGATCAGGA-3'(SEQ ID NO:19)
3'-CCGCGGACGGTGCTAGTCCT-5'(SEQ ID NO:92)
5'-GTGCAGCAGGCAGAAGAGCG-3'(SEQ ID NO:20)
3'-CACGTCGTCCGTCTTCTCGC-5'(SEQ ID NO:93)
5'-GGAGTGATCGGCCCCCAGA-3'(SEQ ID NO:21)
3'-CCTCACTAGCCGGGGGTCT-5'(SEQ ID NO:94)
以下(分别地)提供了用于靶向上述人TNF位点的gRNA(例如，sgRNA)中的示例性原型间隔序列和含有所述序列的示例性sgRNA序列包含：
sgRNA 1间隔子：
GAGCACUGAAAGCAUGAUCC(SEQ ID NO:58)
sgRNA 1全序列：
Figure BDA0002723941600000521
sgRNA 2间隔子：
GGACGUGGAGCUGGCCGAGG(SEQ ID NO:60)
sgRNA 2全序列：
Figure BDA0002723941600000522
sgRNA 3间隔子：
GAGGCGCUCCCCAAGAAGAC(SEQ ID NO:62)
sgRNA 3全序列：
Figure BDA0002723941600000523
sgRNA 4间隔子：
GGGGGCCCCAGGGCUCCAGG(SEQ ID NO:64)
sgRNA 4全序列：
Figure BDA0002723941600000524
Figure BDA0002723941600000531
sgRNA 5间隔子：
GCUGAGGAACAAGCACCGCC(SEQ ID NO:66)
sgRNA 5全序列：
Figure BDA0002723941600000532
sgRNA 6间隔子：
GGCGCCUGCCACGAUCAGGA(SEQ ID NO:68)
sgRNA 6全序列：
Figure BDA0002723941600000533
sgRNA 7间隔子：
GUGCAGCAGGCAGAAGAGCG(SEQ ID NO:70)
sgRNA 7全序列：
Figure BDA0002723941600000534
sgRNA 8间隔子：
GGAGUGAUCGGCCCCCAGA(SEQ ID NO:72)
sgRNA 8全序列：
Figure BDA0002723941600000535
实例3.GM-CSF敲除和IL6阻断剂/IL-1阻断剂-分泌抗CD19CART细胞在体内发挥针对Nalm6白血病细胞的有效细胞毒性
用对(i)抗CD19 CAR和(ii)抗IL6 scFv抗体，以及(iii)IL1RA进行编码的慢病毒载体转导人T细胞。CD8前导序列位于抗IL6 scFv之前。对T2A肽进行编码的核苷酸序列位于(i)与(ii)的编码序列之间，并且对P2A肽进行编码的核苷酸序列位于(ii)与(iii)的编码序列之间。在P2A与(iii)之间存在人生长激素信号序列。
抗CD19 CAR从N端到C端含有CD8前导序列、抗CD19 scFv片段、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域。
以下提供了在此特定实例中使用的抗IL6 scFv、IL-1RA和抗CD19 CAR的结构域的示例性氨基酸序列：
抗IL-6 scFv抗体(SEQ ID NO:22)：
Figure BDA0002723941600000541
人生长激素前导序列(SEQ ID NO:23)：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
IL-1RA(SEQ ID NO:24)：
Figure BDA0002723941600000542
CD8前导序列(SEQ ID NO:25)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
抗CD19 scFv(SEQ ID NO:26)：
Figure BDA0002723941600000543
CD8铰链结构域(SEQ ID NO:27)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8跨膜结构域(SEQ ID NO:28)：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:29)：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3z(SEQ ID NO:30)：
Figure BDA0002723941600000551
向六到八周龄的NGS小鼠(杰克森实验室(Jackson Labs))静脉内注射1×106个GFP+Nalm6白血病细胞(ATCC)。在六天之后，向小鼠注射表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)、SEQ ID NO:22的抗IL-6scFv抗体和SEQ ID NO:24的IL-1RA的2×106个T细胞(抗CD19/IL6/IL1 TCR-CART细胞；图6中的1，n＝5)或表达抗CD19 CAR、IL-6阻断剂和IL-1RA并且使内源性GM-CSF基因被敲除的T细胞(抗CD19/IL6/IL1 TCR-/GM-CSF-CART细胞，图6中的2，n＝6)。未接受CART细胞的小鼠用作对照(图6中的CTRL，n＝4)。
通过Trucount珠粒(BD生物科学公司)监测小鼠的体重、存活率以及血液中GFP+Nalm6白血病细胞和CD45+CD3-T细胞的数量。如图6A所示，植入Nalm6白血病细胞并随后用抗CD19/IL6/IL1RA TCR-CART细胞(第1组)或抗CD19/IL6/IL1RA TCR-/GM-CSF-CART细胞(第2组)处理的小鼠能够在注射后44天维持其体重，而对照小鼠在10天之后体重迅速减轻。三只小鼠死于白血病，并且一只小鼠由于对照组中的明显疾病而被处死。同样，图6B所示的存活率曲线表明第1组和第2组中的小鼠100％存活，而对照组中的小鼠在第20天后没有存活。
为了评估CART细胞对Nalm6白血病细胞的细胞毒性作用，测量了小鼠中剩余的GFP+Nalm6细胞。如图6C所示，在整个实验过程中，Nalm6白血病细胞在对照小鼠血液中增殖。相比而言，在接受CART细胞处理的小鼠中检测到很少或没有Nalm6白血病细胞(第1组和第2组)。这些结果指示抗CD19/IL6/IL1RA TCR-CART细胞和抗CD19/IL6/IL1RA TCR-/GM-CSF-CART细胞两者均能够在体内杀死Nalm6白血病细胞。
此外，为了评估经过注射的人T细胞的性质，随着时间推移测量了经过处理的小鼠血液中的CD45+CD3-T细胞的量。在第1组和第2组两者中，血液中存在的人T细胞的水平随着时间推移而降低，这指示通过基因编辑的GM-CSF KO没有将T细胞转化成白血病样细胞。图6D。
实例4：IL-2敲除对T细胞扩增的影响
用抗CD3/CD28珠粒再刺激在用靶向IL-2的sgRNA 1、3和5进行基因编辑之后显示IL-2产量减少的T细胞。以上实例2中提供了sgRNA 1、3和5的序列。分析随后的T细胞扩增。仅包含具有电穿孔Cas9的T细胞作为对照。在再刺激期间不添加外源性IL-2。
从此研究获得的结果(如图7所示)指示与对照组相比，具有IL-2敲除的T细胞仍能够扩增，但是速率稍低。此结果指示具有IL-2敲除的T细胞仍能够在体外增殖，并且T细胞以较低速率增殖表明IL-2敲除将有效抑制T细胞过度增殖诱导的毒性。
其它实施例
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替换掉。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实例。
通过以上描述，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的实质特点，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求范围内。
序列表
<110> 细胞编辑有限责任公司（Celledit, LLC.）
<120> 用于降低毒性的免疫细胞修饰以及其在过继细胞疗法中的用途
<130> C1553.70000WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 62/642,821
<151> 2018-03-14
<160> 94
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
gctgcagagc ctgctgctct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ggagcatgtg aatgccatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
gcatgtgaat gccatccagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gagacgccgg gcctcctgga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
gatggcattc acatgctccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
gctcccaggg ctgcgtgctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gcgtgctggg gctgggcgag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
gctggggctg ggcgagcggg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
gacttagtgc aatgcaagac 20
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<212> DNA
<213> 智人
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gatttacaga tgattttgaa 20
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<212> DNA
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aagaaaacac agctacaac 19
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caactggagc atttactgc 19
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tctttgtaga acttgaagt 19
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gagcactgaa agcatgatcc 20
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<212> DNA
<213> 智人
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ggacgtggag ctggccgagg 20
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<213> 智人
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gaggcgctcc ccaagaagac 20
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<212> DNA
<213> 智人
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gggggcccca gggctccagg 20
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
gctgaggaac aagcaccgcc 20
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ggcgcctgcc acgatcagga 20
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gtgcagcagg cagaagagcg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
ggagtgatcg gcccccaga 19
<210> 22
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly
165 170 175
Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser
180 185 190
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr
210 215 220
Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
<210> 23
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20 25
<210> 24
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp
1 5 10 15
Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala
20 25 30
Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val
35 40 45
Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys
50 55 60
Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu
65 70 75 80
Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys
85 90 95
Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu
100 105 110
Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp
115 120 125
Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr
130 135 140
Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu
145 150
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 26
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 27
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 28
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 29
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 31
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
gcugcagagc cugcugcucu 20
<210> 33
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
gcugcagagc cugcugcucu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
ggagcaugug aaugccaucc 20
<210> 35
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
ggagcaugug aaugccaucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
gcaugugaau gccauccagg 20
<210> 37
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
gcaugugaau gccauccagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
gagacgccgg gccuccugga 20
<210> 39
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
gagacgccgg gccuccugga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
gauggcauuc acaugcuccc 20
<210> 41
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
gauggcauuc acaugcuccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 42
gcucccaggg cugcgugcug 20
<210> 43
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
gcucccaggg cugcgugcug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
gcgugcuggg gcugggcgag 20
<210> 45
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 45
gcgugcuggg gcugggcgag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 46
gcuggggcug ggcgagcggg 20
<210> 47
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 47
gcuggggcug ggcgagcggg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 48
gacuuagugc aaugcaagac 20
<210> 49
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 49
gacuuagugc aaugcaagac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 50
gauuuacaga ugauuuugaa 20
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 51
gauuuacaga ugauuuugaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 52
aagaaaacac agcuacaac 19
<210> 53
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 53
aagaaaacac agcuacaacg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 54
caacuggagc auuuacugc 19
<210> 55
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 55
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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ucuuuguaga acuugaagu 19
<210> 57
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 57
ucuuuguaga acuugaagug uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 58
gagcacugaa agcaugaucc 20
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 59
gagcacugaa agcaugaucc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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ggacguggag cuggccgagg 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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ggacguggag cuggccgagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 62
gaggcgcucc ccaagaagac 20
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 63
gaggcgcucc ccaagaagac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 64
gggggcccca gggcuccagg 20
<210> 65
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 65
gggggcccca gggcuccagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 66
gcugaggaac aagcaccgcc 20
<210> 67
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 67
gcugaggaac aagcaccgcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 68
ggcgccugcc acgaucagga 20
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 69
ggcgccugcc acgaucagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 70
gugcagcagg cagaagagcg 20
<210> 71
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 71
gugcagcagg cagaagagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 72
ggagugaucg gcccccaga 19
<210> 73
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 73
ggagugaucg gcccccagag uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
agagcagcag gctctgcagc 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
ggatggcatt cacatgctcc 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
cctggatggc attcacatgc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
tccaggaggc ccggcgtctc 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
gggagcatgt gaatgccatc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
cagcacgcag ccctgggagc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
ctcgcccagc cccagcacgc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
cccgctcgcc cagccccagc 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
gtcttgcatt gcactaagtc 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
ttcaaaatca tctgtaaatc 20
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
gttgtagctg tgttttctt 19
<210> 85
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
gcagtaaatg ctccagttg 19
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
acttcaagtt ctacaaaga 19
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 87
ggatcatgct ttcagtgctc 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 88
cctcggccag ctccacgtcc 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 89
gtcttcttgg ggagcgcctc 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 90
cctggagccc tggggccccc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 91
ggcggtgctt gttcctcagc 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成多核苷酸
<400> 92
tcctgatcgt ggcaggcgcc 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 93
cgctcttctg cctgctgcac 20
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 94
tctgggggcc gatcactcc 19

Claims (65)

1.一种免疫细胞群，其包括第一多个经修饰免疫细胞，所述第一多个经修饰免疫细胞在相同条件下相对于同一类型的野生型免疫细胞产生更少的白细胞介素2(IL-2)。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞当被活化时，相对于在相同条件下活化的所述野生型免疫细胞产生更少的IL-2。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞群的总IL-2产量在相同条件下比野生型对应物少约30-95％。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞群的所述总IL-2产量是所述野生型对应物的总IL-2产量的约50％。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的免疫细胞群，其中在所述第一多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，至少一个内源性IL-2等位基因被敲除。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的免疫细胞群，其进一步包括第二多个经修饰免疫细胞，所述第二多个经修饰免疫细胞相对于同一类型的野生型免疫细胞产生的炎性蛋白中的一种或多种的水平降低，其中所述炎性蛋白包括一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体、一种或多种炎性生长因子、一种或多种细胞毒性分子或其组合。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体选自由以下组成的组：IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF。
8.根据权利要求6所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性生长因子选自由以下组成的组：TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF。
9.根据权利要求6所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种细胞毒性分子选自由穿孔素、颗粒酶和铁蛋白组成的组。
10.根据权利要求6到9中任一项所述的免疫细胞群，其中由所述免疫细胞群产生的所述一种或多种炎性蛋白的总水平在相同条件下比野生型对应物的总水平低至少10％。
11.根据权利要求6到10中任一项所述的免疫细胞群，其中在所述第二多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，所述一种或多种炎性蛋白的至少一个内源性等位基因被敲除。
12.根据权利要求6到11中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞和所述第二多个经修饰免疫细胞属于同一类型。
13.根据权利要求12所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞和所述第二多个经修饰免疫细胞重叠。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的免疫细胞群，其进一步包括第三多个经修饰免疫细胞，所述第三多个经修饰免疫细胞表达所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种外源性拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子。
15.根据权利要求14所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种免疫抑制性细胞因子选自由以下组成的组：TGFβ、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35和IL-37。
16.根据权利要求14所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性蛋白的所述一种或多种外源性拮抗剂包括炎性蛋白的可溶性受体和/或对炎性蛋白具有特异性的抗体。
17.根据权利要求14所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性蛋白包括IL6，并且IL6的拮抗剂是托珠单抗(tocilizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、奥洛珠单抗(olokizumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)或其抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的免疫细胞群，其中所述拮抗剂是单链抗体片段(scFv)。
19.根据权利要求18所述的免疫细胞群，其中所述scFv包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
20.根据权利要求14到19中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第三多个经修饰免疫细胞包括对所述一种或多种炎性蛋白的所述一种或多种外源性拮抗剂和/或所述一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种外源性核酸。
21.根据权利要求20所述的免疫细胞群，其中所述外源性核酸中的至少一种外源性核酸被并入所述第三多个经修饰免疫细胞的基因组中。
22.根据权利要求14到21中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第三多个经修饰免疫细胞与所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者属于同一类型。
23.根据权利要求22所述的免疫细胞群，其中所述第三多个经修饰免疫细胞与所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者重叠。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞、其前体或其组合。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的免疫细胞群，其中所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或外源性T细胞受体，其中所述CAR包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个胞内信号传导结构域，并且其中任选地，所述免疫细胞的内源性TCR被敲除。
26.根据权利要求25所述的免疫细胞群，其中所述胞外配体结合结构域包括对细胞表面蛋白具有特异性的单链抗体片段、细胞因子受体的胞外结构域或共刺激受体的胞外结构域。
27.根据权利要求26所述的免疫细胞群，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括(i)CD3ζ的信号传导结构域和/或(ii)来自一种或多种共刺激蛋白或细胞因子受体的一个或多个信号传导结构域。
28.根据权利要求27所述的免疫细胞群，其中所述共刺激蛋白或细胞因子受体选自由以下组成的组：CD28、4-1BB、2B4、KIR、CD27、OX40、ICOS、MYD88、IL2受体和SynNotch。
29.一种免疫细胞群，其包括：
(i)第一多个经修饰免疫细胞，所述第一多个经修饰免疫细胞在相同条件下与同一类型的野生型免疫细胞相比产生的一种或多种炎性蛋白的水平降低；以及
(ii)第二多个经修饰免疫细胞，所述第二多个经修饰免疫细胞表达所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或表达一种或多种免疫抑制性细胞因子。
30.根据权利要求29所述的免疫细胞群，其中所述炎性蛋白包括一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体、一种或多种炎性生长因子、一种或多种细胞毒性分子或其组合。
31.根据权利要求30所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体选自由以下组成的组：IL2、IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF。
32.根据权利要求30到31中任一项所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性生长因子选自由以下组成的组：TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF。
33.根据权利要求30到32中任一项所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种细胞毒性分子选自由穿孔素、颗粒酶和铁蛋白组成的组。
34.根据权利要求29到33中任一项所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种免疫抑制性细胞因子选自由以下组成的组：TGFβ、IL-4、IL-10、IL-13、IL-33、IL-35和IL-37。
35.根据权利要求29到34中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞与所述第二多个免疫细胞属于同一类型。
36.根据权利要求35所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞与所述第二多个免疫细胞重叠。
37.根据权利要求29到36中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者表达嵌合抗原受体(CAR)和/或外源性T细胞受体，其中所述CAR包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个胞内信号传导结构域，并且其中任选地，所述免疫细胞的内源性TCR被敲除。
38.根据权利要求37所述的免疫细胞群，其中所述胞外配体结合结构域包括对细胞表面蛋白具有特异性的单链抗体片段、细胞因子受体的胞外结构域或共刺激受体的胞外结构域。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的免疫细胞群，其中所述一个或多个胞内信号传导结构域包括(i)CD3ζ的信号传导结构域和/或(ii)来自一种或多种共刺激蛋白或细胞因子受体的一个或多个信号传导结构域。
40.根据权利要求37到39中任一项所述的免疫细胞群，其中所述共刺激蛋白或细胞因子受体选自由以下组成的组：CD28、4-1BB、2B4、KIR、CD27、OX40、ICOS、MYD88、IL2受体和SynNotch。
41.根据权利要求29到40中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第一多个经修饰免疫细胞、所述第二多个经修饰免疫细胞或两者是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞或其前体。
42.根据权利要求29到41中任一项所述的免疫细胞群，其中在所述第一多个经修饰免疫细胞中的每个细胞中，所述一种或多种炎性蛋白的至少一个内源性等位基因被敲除。
43.根据权利要求29到42中任一项所述的免疫细胞群，其中所述一种或多种炎性蛋白的所述一种或多种拮抗剂包括所述炎性蛋白的可溶性受体和/或对所述炎性蛋白具有特异性的抗体。
44.根据权利要求29到43中任一项所述的免疫细胞群，其中所述第二多个经修饰免疫细胞包括对一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种外源性核酸。
45.根据权利要求44所述的免疫细胞群，其中所述外源性核酸中的至少一种外源性核酸被并入所述第二多个经修饰免疫细胞的基因组中。
46.一种产生具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供免疫细胞群；以及
(ii)修饰所述免疫细胞以由此减少IL-2产量。
47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括(iii)修饰所述免疫细胞以减少一种或多种炎性蛋白的产量，以及任选地(iv)将对一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种核酸引入所述免疫细胞中，其中所述一种或多种核酸与用于在所述免疫细胞中表达所述一种或多种拮抗剂和/或所述一种或多种免疫抑制性细胞因子的一个或多个启动子可操作地连接。
48.一种产生具有降低的炎性性质的经修饰免疫细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供免疫细胞群；
(ii)修饰所述免疫细胞以减少一种或多种炎性蛋白的产量；以及
(iii)将对一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂和/或一种或多种免疫抑制性细胞因子进行编码的一种或多种核酸并入所述免疫细胞中，其中所述一种或多种核酸与用于在所述免疫细胞中表达所述一种或多种拮抗剂和/或所述一种或多种免疫抑制性细胞因子的一个或多个启动子可操作地连接。
49.根据权利要求46到48中任一项所述的方法，其中修饰步骤包括在所述免疫细胞的IL-2的内源性等位基因或所述一种或多种炎性蛋白的内源性等位基因处进行基因编辑。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述基因编辑包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)、任选地是ARC归巢核酸内切酶的核酸内切酶、大范围核酸酶、mega-TALS或其组合。
51.根据权利要求46到50中任一项所述的方法，其中所述IL-2产量减少约30-95％。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述IL-2产量减少约50％。
53.根据权利要求48到50中任一项所述的方法，其中所述一种或多种炎性蛋白包括一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体、一种或多种炎性生长因子、一种或多种细胞毒性分子或其组合。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述一种或多种炎性细胞因子或其可溶性受体选自由以下组成的组：IL1α、IL1β、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、sIL-1RI、sIL-2Rα、sIL6R、IFNα、IFNβ、IFNγ、MIPα、MIPβ、CSF1、LIF、G-CSF、GM-CSF、CXCL10、CCL5、嗜酸性粒细胞趋化因子、TNF、MCP1、MIG、RAGE、CRP、血管生成素-2和VWF。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述一种或多种炎性生长因子选自由以下组成的组：TGFα、VEGF、EGF、HGF和FGF。
56.根据权利要求53到55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞毒性分子选自由穿孔素、颗粒酶和铁蛋白组成的组。
57.根据权利要求53到56中任一项所述的方法，其中所述一种或多种炎性蛋白的一种或多种拮抗剂包括所述炎性蛋白的可溶性受体和/或对所述炎性蛋白具有特异性的抗体。
58.根据权利要求46到57中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、髓源性抑制细胞、间充质干细胞、其前体或其组合。
59.根据权利要求46到58中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(CAR)和/或外源性T细胞受体，其中所述CAR包括胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及一个或多个胞内信号传导结构域，并且其中任选地，所述免疫细胞的内源性TCR被敲除。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述胞外配体结合结构域包括对细胞表面蛋白具有特异性的单链抗体片段、细胞因子受体的胞外结构域或共刺激受体的胞外结构域。
61.根据权利要求59到60中任一项所述的方法，其中所述一个或多个一个或多个胞内信号传导结构域包括(i)CD3ζ的信号传导结构域和/或(ii)来自一种或多种共刺激蛋白或细胞因子受体的一个或多个信号传导结构域。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述共刺激蛋白或细胞因子受体选自由以下组成的组：CD28、4-1BB、2B4、KIR、CD27、OX40、ICOS、MYD88、IL2受体和SynNotch。
63.一种免疫细胞群，其通过根据权利要求46到62中任一项所述的方法制备。
64.一种细胞疗法的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1到45和63中任一项所述的免疫细胞群。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述受试者是患有癌症、感染性疾病或免疫病症的人类患者。
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