CN108148865A - 一种稳定表达vegf120的间充质干细胞株及其体外应用 - Google Patents

一种稳定表达vegf120的间充质干细胞株及其体外应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能稳定高表达外源VEGF的BM‑MSCs细胞株，采用慢病毒过表达系统PLVTH‑pol‑IRES‑puro共转染293T细胞后收获的慢病毒感染BM‑MSCs获得。该细胞株能修复高脂微环境下胰岛微血管内皮细胞MS‑1的增殖损伤，促进其生存能力，为糖尿病微血管病变的治疗提供了可能的思路及方法。

Description

一种稳定表达VEGF120的间充质干细胞株及其体外应用
技术领域
本发明涉及一种稳定表达VEGF120基因的骨髓源间充质干细胞株及其制备方法，且这种细胞株能够有效改善糖尿病病理环境下胰岛微血管内皮细胞的增殖生存能力。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起，并伴有眼、肾、足、心脏等处的慢性血管并发症。据2016年4月世界卫生组织(WHO)报告显示：全球已有超过4亿人患有糖尿病，占总人口的8.5％；近40年的时间里，成年糖尿病患者增加了3倍，且绝大部分在发展中国家；预计到2030年，糖尿病将成为第7大致死病因。而我国是全球糖尿病患者最多的国家，成年人患糖尿病及前驱糖尿病的比例也分别达到11.6％及50.1％，昂贵的医疗费用及巨大的精神压力已摧毁了无数家庭的幸福。目前尚未找到根治糖尿病的方法，患者以药物控制为主要治疗手段，分为口服药物治疗及注射胰岛素治疗，而前者副作用大，后者价格昂贵，因而寻找根治糖尿病的方法已迫在眉睫。
胰岛是高度血管化的器官，β细胞通过分泌血管生长因子(如VEGF，血管内皮生长因子)募集内皮细胞，而内皮细胞分泌活性因子(如HGF，肝细胞生长因子)维持β细胞正常生理功能，并在β细胞周围形成密集毛细血管网络，传递氧及营养物质，并及时对血糖改变做出应答进而精确调控。糖尿病病理状态下，内皮细胞受到损伤，血管基底膜增厚，窗孔结构减少，有效滤过面积降低；内皮细胞线粒体肿胀，嵴排列紊乱，基质密度降低，造成信息传递一定程度阻断，β细胞对机体血糖变化应答缓慢。
VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，有调控血管通透性，促进血管形成，促进内皮细胞增殖及迁移等多种生物学活性。在胰岛内，VEGF主要由内分泌细胞表达分泌，在维持葡萄糖稳态及糖尿病发生发展中扮演着重要的作用。研究表明，在β细胞特异性敲除VEGF-A的转基因小鼠中，血管密度下降，胰岛超微结构发生改变，葡萄糖稳态遭到破坏；在β细胞特异性过表达VEGF-A的转基因小鼠中，短期过表达后恢复基线会促进β细胞和内皮细胞的增殖生存，而长期过表达会导致内皮细胞大量增殖而抑制β细胞的活性。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种来源于发育早期中胚层的多能干细胞，其多向分化潜能及在损伤部位靶向募集的能力能直接或间接地起到糖尿病治疗作用。国内外研究表明，多次尾静脉注射MSCs能缓解II型糖尿胰岛功能损伤；并且在特定诱导条件下，MSCs能分化为内皮细胞、上皮细胞修复胰岛的血管损伤；而过表达VEGF的MSCs能增强胰岛移植的效果，治疗糖尿病小鼠下肢血管损伤，促进伤口愈合。
因而，本发明旨在MSCs中稳定高表达VEGF，利用MSCs的靶向募集作用及VEGF的血管修复作用，在体外一定程度上缓解胰岛微血管内皮的损伤，为体内实验提供依据并为糖尿病研究和治疗提供一种可靠的新思路。
发明内容
本发明在于构建一种稳定过表达VEGF120基因的骨髓源间充质干细胞株(BM-MSCs)。本发明运用PLVTH-pol-IRES-puro慢病毒过表达系统共转染293T细胞收获慢病毒，后用慢病毒感染BM-MSCs，成功获得稳定过表达VEGF120基因的BM-MSCs细胞株。
优选地，慢病毒表达系统包括过表达载体质粒PLVTH质粒、包装质粒p8.91、包膜质粒pMD2.G，且转染时三者质量比为4∶3∶2。
优选地，将VEGF120基因整合到PLVTH载体时选取酶切位点为Pme I和Spe I。
本发明在于应用该细胞株修复糖尿病微环境下损伤的胰岛微血管内皮细胞。
有益效果：稳定过表达VEGF120的BM-MSCs细胞株能够修复高脂(棕榈酸酯；PA)环境下胰岛微血管内皮细胞凋亡，促进其增殖生存能力。
优选地，所述的胰岛微血管内皮细胞为MS-1。
附图说明
图1慢病毒表达系统中过表达载体质粒PLVTH具体结构
图2PLVTH载体质粒酶切结果验证
图3转染48h荧光图
图4感染72h荧光图
图5RT-PCR验证VEGF过表达
图6Western Blot验证VEGF过表达
图7PA对MS-1损伤的时间和剂量关系图
图8过表达VEGF的MSC-CM对PA损伤的MS-1细胞活力关系图
具体实施方式
实施例1一种稳定表达外源性VEGF120的骨髓源间充质干细胞株的建立，它包括以下步骤：
(1)PLVTH-VEGF120过表达载体的构建：在NCBI上检索获得VEGF120的CDS序列，在基因的5’端加上Pme I酶切位点及Kozak序列，在基因的3’端加上Spe I酶切位点，送由生物公司进行全基因合成。过表达载体质粒PLVTH-pol-IRES-puro及合成的基因通过Pme I及SpeI双酶切后经2％琼脂糖凝胶电泳验证(图2)并回收，用T4DNA连接酶将两段双酶切片段进行连接，16℃连接过夜后转化至DH5a大肠埃希菌中，涂布于Amp+固态琼脂培养基，次日挑取阳性克隆于液体培养基中培养过夜后提取质粒，送生物公司测序验证后获得插入鼠源VEGF120基因的PLVTH载体——PLVTH-VEGF120。
(2)细胞培养：BM-MSCs用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养，293T细胞用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养，培养箱条件：37℃，5％CO2。
(3)慢病毒包装：转染前24h以3×105细胞/35mm培养皿的细胞总量铺6孔板，使次日转染时细胞融合度在70％-90％。转染前1h更换为新鲜无血清培养基，将PLVTH-VEGF120、包装质粒p8.91和包膜质粒pMD2.G按4∶3∶2的质量比共转染293T细胞，所用的转染试剂为Lipfectamine 6000。转染后6h更换为新鲜完全培养基，转染后48h于荧光显微镜下观察荧光强度，图3，收集细胞上清液，2000rpm离心5min除去细胞沉淀，再用0.45μm水系聚醚砜PES滤膜过滤，得到慢病毒。
(4)慢病毒感染BM-MSCs：感染前24h时，将BM-MSCs以1×105细胞/35mm培养皿的细胞总量铺6孔板，次日感染前细胞融合度在60％左右最佳。BM-MSCs用PBS洗涤3遍，将病毒上清和预热的完全培养基按3∶1混合，加入polybrere使终浓度为8μg/ml，按每孔2ml混合液加入6孔板。感染24h、48h，用新鲜完全培养基换液，感染后72h时于荧光显微镜下观察荧光强度，图4，RT-PCR(图5)及Western Blot(图6)验证后获得能稳定过表达VEGF的BM-MSCs细胞株。
实施例2细胞损伤模型的建立
实验分为调零组、空白组及不同浓度PA组，每组设置5个复孔。
细胞模型建立：
(1)收集对数期MS-1细胞以1×104细胞/35mm培养皿的细胞总量铺96孔板，待细胞密度达到至80％后，吸出原来培养基，PBS洗涤一遍，实验组加入不同浓度无血清培养基稀释的含5％BSA的PA溶液200μL，对照组和空白组加入无血清培养基200μL，使每孔终体积200μL。
(2)放置在5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育6、12、24h，倒置显微镜下观察细胞状态；每孔加入20μL 5mg/ml MTT溶液，在37℃恒温培养箱中继续培养4h。
(3)将上清液吸净，每孔加入150μL DMSO，摇床避光震荡20min使蓝色结晶物充分溶解。
(4)用酶标仪在570nm、630nm波长处测量各孔的吸光度。
570nm处波长值扣除630nm波长值(调零)为每孔实际吸光度数值，每孔实际吸光度值扣除调零组实际吸光度平均值后计算该组实际吸光度平均值。设空白组的细胞相对活力为1，则实验组细胞相对活力即为实验组实际吸光度平均值比空白组实际平均值为该组细胞相对活力。图1中纵坐标为细胞相对活力，横坐标为6、12、24h时0、100、200、400、800μmol/L浓度下PA损伤的细胞相对活力。根据图7、表1确定PA损伤终浓度为200μmol/L，时间为6h。
表1：PA对MS-1损伤的时间和剂量关系
注：与空白组相比**P＜0.01，***P＜0.001
实施例3过表达VEGF120的BM-MSCs对细胞活性的影响
干细胞上清液(MSC-CM)收集浓缩：
BM-MSCs、过表达VEGF120的BM-MSCs培养在10cm大皿中，待细胞密度达到90％后，更换10ml新鲜无血清DMEM/F12培养基，37℃，5％CO2培养12小时后收集上清液，0.22μm水系聚醚砜PES滤膜过滤，截留分子量5KD的millipore超滤管4000rpm离心20min将干细胞上清液浓缩20倍，-20℃保存备用。
上清液修复损伤实验：
实验分组：调零组、空白组、200μmol/L PA模型组、体积分数为2.5％、5％、10％的浓缩MSC-CM预保护后PA损伤组及体积分数为2.5％、5％、10％的浓缩过表达VEGF120的MSC-CM预保护后PA损伤组。
(1)收集对数期MS-1细胞，以1×104细胞/35mm培养皿的细胞总量铺96孔板，待细胞密度达到至80％后，吸出原来培养基，PBS洗涤一遍，按上述分组进行加样，每组设5个复孔，预保护1h后加入PA进行损伤，使每孔终体积为100μL，PA终浓度为·200μmol/L。
(2)放置在5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育6h后，每孔加入20μL 5mg/ml MTT溶液，在37℃恒温培养箱中继续培养4h。
(3)将上清液吸净，每孔加入150μL DMSO，摇床避光震荡20min使蓝色结晶物充分溶解。
(4)用酶标仪在570nm、630nm波长处测量各孔的吸光度。
用前述相同方法处理读数结果，设对照组的细胞相对活力为1，其他组的细胞相对活力为实验组与对照组的比值，图8为空白组、模型组、不同剂量MSC-CM组、不同剂量过表达VEGF的MSC-CM组处理后细胞相对活力。由图8、表2可以得出以下结论：干细胞上清液及过表达VEGF的干细胞上清液均对PA诱导的MS-1细胞增殖损伤有缓解作用，且过表达VEGF后效果更佳，但两者均不呈现出剂量依赖关系。
表2：MSC-CM对PA损伤后细胞活力的影响
注：与PA组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (4)

1.高效稳定过表达血管内皮生长因子(VEGF120)的骨髓源间充质干细胞株(BM-MSCs)的构建方法，该方法通过PLVTH-pol-IRES-puro慢病毒过表达系统共转染293T细胞收获慢病毒，后用病毒感染BM-MSCs后获得。
2.如权利要求1所述载体构建时将VEGF120基因整合到PLVTH载体时选取酶切位点为PmeI和Spe I，转染时过表达载体质粒PLVTH质粒、包装质粒p8.91、包膜质粒pMD2.G的最优比例为4∶3∶2。
3.棕榈酸酯(PA)在造成胰岛微血管内皮细胞(MS-1)有显著性差异损伤的最佳浓度为200μmol/L。
4.如权利要求1或3所述干细胞上清液及过表达VEGF的干细胞上清液均对PA诱导的MS-1细胞增殖损伤有缓解作用，且过表达VEGF后效果更佳，但两者均不呈现出剂量依赖关系。
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