CN105002142A - 直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用。本发明提供了一种使肝细胞重编程为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛β细胞；本发明的优势在于，第一，采用非病毒EntransterTM-D转染试剂，不但具有较高的转染效率，同时大大提高了直接重编程过程中转染的安全性。第二，根据文献的报道，筛选出适用于直接重编程为胰岛β细胞新的最佳转染组合Pdx1、Pax4、Neurod1。第三，根据各个转录因子发挥作用的先后顺序，筛选出最佳转染时段24h，从而提高了直接重编程为胰岛细胞的成熟度问题，本研究中重编程效率达23％。

Description

直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用。

背景技术

目前，糖尿病仍是困扰世界各国的严重社会卫生难题，糖尿病患病率呈急剧上升趋势。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,是由于T细胞参与的胰岛β细胞选择性破坏所致，胰岛细胞移植技术存在供体缺乏及免疫抑制，应用受到限制。因此，越来越多研究关注寻求胰岛素分泌细胞的来源问题。

细胞直接重编程技术，是2006年Takahashi和Yamanaka等发现的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)之后的一项新技术。该技术不同于诱导性多能干细胞，它是指将一种终末分化的细胞直接转变为另外一种成体细胞。细胞直接重编程技术，突破了伦理、免疫排斥、来源不足等问题，具有相对安全、重编程时间较短及靶向性好的优点。这一技术的开展，为自体细胞替代治疗提供了的新方向。但直接重编程技术目前主要处于研究阶段，应用到临床疾病治疗仍有一定的距离，其中在重编程效率和成熟度及安全性方面还有待于进一步的完善和提高，但相信通过不断的努力，这一技术将会为临床疾病的治疗带来新的途径。

关于糖尿病的治疗，最早源于埃德蒙顿(Edmonton)方案的提出，胰岛移植技术的开展为糖尿病的替代治疗开创了先河，然而，这一技术的免疫排斥及胰岛供体的不足，使得这一技术应用上受到限制，这就需要寻求新的胰岛素分泌细胞来源。近年来研究发现，干细胞的诱导分化，成为胰岛素分泌细胞来源的一个新的突破点。从胚胎干细胞的诱导分化、间充质干细胞的诱导分化到目前研究热点诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的形成，重编程技术的发展，为这一领域的研究带来新的希望。然而，这些转变的过程中存在着伦理、免疫排斥及肿瘤风险等，需要研究新的靶目标来实现用胰岛素分泌细胞进行糖尿病的替代治疗。细胞直接重编程技术的核心就是关键转录因子的筛选。Ferber等通过Pdx1基因腺病毒载体介导的经尾静脉注入糖尿病模型小鼠，研究发现，Pdx1蛋白在小鼠的肝、肾、心、上皮组织均有表达，表达水平最高的为肝细胞，转染后1周小鼠血糖变化由33.3mmol/L降到11.1mmol/L，其中，肝脏中胰岛素分泌量是对照组的25倍。Yang等利用单纯疱疹病毒VP16蛋白激活域与Pdx1融合，由慢病毒载体介导，体外转染肝细胞后，肝卵园细胞株(WB cell line)选择性转化为有胰岛素分泌能力的β细胞，随后又采用慢病毒载体将Pdx1和Pdx1—PV16分别转染体外培养的肝卵园细胞株，结果显示在高葡萄糖培养基的环境中，Pdx1-PV16的作用下胰岛素分泌能力更为明显。研究发现，Pdx1作用后期胰岛素表达能力丧失的细胞，通过转染Neurod1这些细胞又重新恢复了胰岛素表达能力，表明Neurod1和Pdx1具有协同表达胰岛素分泌细胞的特性。可见，Pdx1可以有效驱动胰芽的形成，但是仅有Pdx1并不能定向驱动细胞进一步发育而成，需要Ngn3、Neurod1、Mafa、Pax4等的相互作用。2008年，zhou等筛选出的最佳转录因子组合Pdx1、Ngn3、Mafa(PNM)成功将小鼠胰腺外分泌细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞，达到20％的重编程效率，不足之处在于缺乏完整的胰岛样结构，胰岛素的分泌量远不及正常的胰岛β细胞。为了深入研究这一过程的基因层面的变化，2012年，Akinci通过转染该组合到大鼠AR42j-B13细胞系后发现，有大量胰岛 β细胞特性基因表达，并从组蛋白和甲基化层面对Pdx1进行分析，染色体被PNM组合所修饰，促进这些特异性基因的表达。同年，他们又将PNM组合构建成串联载体，尾静脉输注的方式将小鼠体内重编程，发现了串联载体在肝脏内具有明显的聚集性，实现了对肝脏细胞的直接重编程，并且发现了导管样结构，证实是来源于SOX9+细胞。鉴于胆囊和胰腺的同源性，Hickey等发现，通过转染转录因子Pdx1、Mafa、Neurog3实现了小鼠胆囊细胞向胰岛素分泌细胞的转变。研究发现，人类胰岛组蛋白的甲基化是由于H3K4me3和H3K27me3的作用所致，使得α、β细胞的转变。为了更加深入的研究与人类相关的直接重编程技术，Pennarossa等选取猪为重编程的对象，此次重编程与之前的不同点在于使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-胞嘧啶(5-aza-CR)诱导所形成，重编程效率达(38.1±9.2)％。Berneman-Zeitouni等通过转录因子Pdx1、Pax4和Mafa的顺序进行不同方式的转染，发现三个转录因子间隔24h转染，重编程肝细胞为胰岛素分泌细胞，转分化效率达到15％，不但效率较高，同时具有较高的成熟度，为细胞重编程技术的发展带来了新的突破。直接重编程技术既避免了胰岛移植供体不足和免疫排斥等限制，也可避免干细胞分化的胰岛素细胞转分化效率低以及安全性问题。

近年来，细胞直接重编程技术应用于寻找胰岛β细胞的来源成为一个新的热点，但这一技术仍然存在重编程效率低、成熟度差的问题，在转染方法上也存在安全性及效率低的问题。如何突破这些障碍成为直接重编程技术的突破口。

发明内容

本发明的目的是提供一种使离体成体细胞重编程为胰岛β细胞的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛β细胞；

所述Pdx1蛋白的氨基酸序列为序列6；

所述Pax4蛋白的氨基酸序列为序列7；

所述Neurod1蛋白的氨基酸序列为序列7为序列8。

上述方法中， 

所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因的转染间隔时间均为24h。

上述方法中， 

所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因的转染顺序依次为所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因。

上述方法中， 

所述Pdx1蛋白编码基因通过表达Pdx1蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞；

所述表达Pdx1蛋白编码基因的重组载体为将所述Pdx1蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体；

所述Pax4蛋白编码基因通过表达Pax4蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞；

所述表达Pax4蛋白编码基因的重组载体为将所述Pax4蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体；

所述Neurod1蛋白编码基因通过表达Neurod1蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝 脏细胞；

所述表达Neurod1蛋白编码基因的重组载体为将所述Neurod1蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体。

上述方法中， 

所述将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞为先将所述表达Pdx1蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞，得到首次转染细胞，24小时后再将所述表达Pax4蛋白编码基因的重组载体转染所述首次转染细胞，得到二次转染细胞；24h后再将所述表达Neurod1蛋白编码基因的重组载体转入所述二次转染细胞。

上述方法中，所述成体细胞为在体内数量多，直接重编程一部分细胞后且不影响宿主机体功能的成体细胞，如脂肪细胞、肌肉细胞或肝脏细胞等。本方法采用的为离体肝脏细胞；

所述表达载体为pCDNA3.1-EGFP；

所述离体肝脏细胞为离体小鼠肝脏细胞，具体为NCTC-1469。

由上述方法制备的胰岛β细胞也是本发明保护的范围。

由上述胰岛β细胞分泌的胰岛素或C肽也是本发明保护的范围。

上述方法或上述的胰岛β细胞或上述的胰岛素在制备治疗糖尿病产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述方法或上述的胰岛β细胞或上述的胰岛素在制备降低血糖产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还有一个目的是提供一种治疗糖尿病产品或降低血糖产品。

本发明提供的产品，包括上述的胰岛β细胞或上述的胰岛素。

所述产品为试剂盒或药物。

或本发明提供一种使离体成体细胞重编程为胰岛β细胞的产品，为如下1)或2)；

1)包括Pdx1蛋白、Pax4蛋白和Neurod1蛋白；

2)包括含有Pdx1蛋白编码基因的表达盒、重组载体或病毒、含有Pax4编码基因的表达盒、重组载体或病毒和含有Neurod1编码基因的表达盒、重组载体或病毒；

所述离体肝脏细胞为离体小鼠肝脏细胞，具体为NCTC-1469。

所述产品为试剂盒。

本发明的实验证明，本发明的优势在于，第一，采用非病毒EntransterTM-D转染试剂，不但具有较高的转染效率，同时大大提高了直接重编程过程中转染的安全性。第二，根据文献的报道，筛选出适用于直接重编程为胰岛β细胞新的最佳转染组合Pdx1、Pax4、Neurod1。第三，根据各个转录因子发挥作用的先后顺序，筛选出最佳转染时段24h，从而提高了直接重编程为胰岛细胞的成熟度问题，本研究中重编程效率达23％，高糖刺激下胰岛素和C肽的释放量是NIT-1细胞系的1/7，并通过动态观察不同天数下基因的表达情况，重编程后第9天的胰岛β细胞基因表达量较高。通过构建糖尿病模型小鼠，将直接重编程的胰岛β细胞移植到小鼠左侧肾包膜下，观察重编程后细胞的降糖效果。发现，直接重编程细胞移植2组(4×10⁶cells)小鼠的胰岛素释放量高于直接重编程细胞移植1组(2×10⁶cells)，说明通过增加重编程细胞的细胞数量可以提高降血糖的作用。

附图说明

图1为pCDNA3.1-EGFP质粒载体图谱。

图2为流式细胞术和荧光显微镜鉴定EntransterTM-D转染效率。

图3为转染后质粒在细胞系内的基因表达。

图4为转染后质粒在细胞系内的蛋白表达。

图5为串联载体转染细胞系后细胞形态变化。

图6为RT-PCR筛选的最佳组合。

图7为不同转录因子组合重编程后胰岛β细胞的mRNA的表达(*P<0.05)。

图8为流式细胞术检测各组胰岛素的表达量。

图9为不同时间段蛋白表达。

图10为不同时段重编程β细胞胰岛素分泌量(*P<0.05)。

图11为流式细胞术检测各组胰岛素的表达量。

图12为直接重编程β细胞后基因表达情况(*P<0.05)。

图13为第9天重编程细胞的蛋白水平鉴定。

图14为流式细胞术检测第9天各组直接重编程β细胞胰岛素的表达量。

图15为ELISA检测细胞培养上清胰岛素和C肽的含量。

图16为直接重编程β细胞进行小鼠肾包膜移植。

图17为移植后受体小鼠血糖变化。

图18为第7、24天移植后小鼠葡萄糖糖耐量变化。

图19为移植后小鼠胰岛素释放量(*P<0.05)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

部分材料如下：

NCTC-1469小鼠肝细胞系购买于上海通派生物科技有限公司。

EntransterTM-D转染试剂盒由北京英格恩有限公司提供。

SCID-Beige(雄性)实验小鼠购买于自北京维通利华实验动物技术有限公司。

小鼠肝细胞系完全培养基：含90％的L-DMEM低糖培养基，加用10％胎牛血清和100U/mL青霉素和链霉素的L-DMEM低糖培养基，配制好储存在4℃保存，3天内用完。 

小鼠肝细胞系冻存液：含有70％的L-DMEM低糖培养基，加用20％的胎牛血清，加用10％的DMSO，现配现用，每管冻存管用1ml冻存。

透膜及封闭抗原液：称取质量浓度2％的BSA粉，用0.2％tritonX-100溶液(母液用PBS稀释500倍)溶解均匀，可现配现用。

250ml LB液体培养基：胰蛋白胨2.5g氯化钠2.5g酵母粉1.25g双蒸水250ml配制好后，121℃高压灭菌，冷却后加入250ul母液未0.1g/ml的氨苄青霉素，配制成氨苄青霉素工作浓度为100ug/ml。

1×Krebs Ringer buffer配制：在无菌环境下，用量筒量取20mL10×Krebs Ringer buffer浓缩液，用灭菌的ddH₂O180ml进行稀释，充分混合均匀后进行分装保存。

KRBB低糖缓冲液(5.5mM)配制：称取D-glucose 0.05溶解于50ml的1×Krebs Ringer buffer缓冲液，滤器(0.22μm微孔滤膜)过滤分装储存。

KRBB高糖缓冲液(17.5mM)配制：称取D-glucose 0.16溶解于50ml的1×Krebs Ringer buffer缓冲液，滤器(0.22μm微孔滤膜)过滤分装储存。

pCDNA3.1-EGFP质粒(Invitrogen，Catalog nos.V790-20and V795-20,respectively)， 图1所示。

Pcmv：巨细胞病毒启动子序列，作用时高表达目的基因；

BGH：牛生长激素基因，RNA稳定性的保护；

SV40：复制序列：使得抗性基因能够更好的表达；

T7启动子和引物序列：确保目的基因在体内的核转录和表达。

下述实施例的统计学处理：所有数据均采用SPSS19.0软件处理作统计学分析，用Excel软件和GraphPad5.0软件编辑图片作图。采用的数据分析为均数±标准差(means±SD)表示，组间比较采用完全随机设计的方差分析(One-Way ANOVA)，比较两组间采用两样本t检验(Independent-Sampless t Test)。

实施例1、转录因子质粒表达载体构建、鉴定及效率评估

一、转录因子质粒表达载体构建

人工合成如下基因Pdx1(序列2)、Ngn3(序列1)、Mafa(序列3)、Neurod1(序列4)和Pax4(序列5)。

基因Pdx1编码的蛋白Pdx1的氨基酸序列为序列6；

基因Pdx4编码的蛋白Pdx4的氨基酸序列为序列7；

基因Neurod1编码的蛋白Neurod1的氨基酸序列为序列8。

1、串联载体pcDNA3.1(+)-Pdx1+Ngn3+Mafa—GFP和pcDNA3.1(+)-Pdx1、Ngn3、Mafa、Neurod1、Pax4单个载体的构建

1)串联载体pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP的构建

pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP载体为将序列表中序列1所示的Ngn3替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和HindIII酶切位点间的DNA片段，且将序列表中序列2所示的Pdx1基因替换pCDNA3.1-EGFP的HindIII和KpnI酶切位点间的DNA片段，且将序列3所示的Mafa基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和XbaI酶切位点间的DNA片段，得到的重组载体。

2)pcDNA3.1(+)-Neurod1质粒载体构建

pcDNA3.1(+)-Neurod1载体为将序列表中序列4所示的Neurod1基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。

3)pcDNA3.1(+)-Pax4质粒载体构建

pcDNA3.1(+)-Pax4载体为将序列表中序列5所示的Pax4基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。

4)pcDNA3.1(+)-Pdx1质粒载体构建

pcDNA3.1(+)-Pdx1载体为将序列表中序列1所示的Pdx1基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和HindIII酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。

5)pcDNA3.1(+)-Mafa质粒载体构建

pcDNA3.1(+)-Mafa载体为将序列表中序列3所示的Mafa基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和HindIII酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。

6)pcDNA3.1(+)-Ngn3质粒载体构建

pcDNA3.1(+)-Ngn3载体为将序列表中序列2所示的Ngn3基因替换pCDNA3.1-EGFP载体的BamHI和HindIII酶切位点间的DNA片段得到的重组载体。

二、重组载体的转染效率和荧光表达的鉴定

1、空载体转染NCTC-1469小鼠肝细胞系后的转染效率和荧光表达

将空载体pCDNA3.1-EGFP转染NCTC-1469小鼠肝细胞系，具体如下：

(1)种板：将细胞提前一天种植在6孔板中，以30％-50％细胞密度进行转染；

(2)配制DNA稀释液：用50μl无血清稀释液(OPTI-MEM)稀释3μgDNA(待转染质粒pCDNA3.1-EGFP)，混匀充分；

(3)配制EntransterTM-D稀释液：用50μl无血清稀释液(OPTI-MEM)稀释9μl的EntransterTM-D试剂，混匀充分于室温下静置5分钟。

(4)配制转染复合物：将EntransterTM-D稀释液分别加入到DNA稀释液中，用加样器吹吸10次以上混匀充分，静置于室温15-30分钟。

(5)转染：将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。

(6)更换培养基：转染4-6小时后，重新更换新鲜培养基，培养时间持续24-48小时。

取转染后24h的6孔板细胞，酒精擦拭干净后，移至于超净台下，PBS洗涤2遍后，每孔加入300ul的胰蛋白酶溶液，待细胞回缩间隙变宽后于1ml的完全培养基终止消化，移至于15ml离心管中，1200r/min离心4min，用PBS洗涤2遍后，用PBS重悬，上流式细胞仪进行绿色荧光数量的鉴定。结果如图2A所示，上流式细胞仪鉴定，该转染试剂的转染效率达86％左右。

取转染后24h的6孔板细胞，酒精擦拭干净后，移至于超净台下，PBS洗涤2遍后，放置显微镜下进行观察，拍照。结果如图2B所示，显示荧光下空载体的表达量，结合两组实验结果证明EntransterTM-D试剂高效的转染效率。

2、重组载体转染NCTC-1469小鼠肝细胞系后的转染效率和荧光表达

将上述一构建的重组载体pcDNA3.1(+)-Ngn3、pcDNA3.1(+)-Mafa、pcDNA3.1(+)-Pdx1、pcDNA3.1(+)-Pax4、pcDNA3.1(+)-Neurod1和pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP按照上述1的方法转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中，得到转染pcDNA3.1(+)-Ngn3细胞(N-Ngn3)、转染pcDNA3.1(+)-Mafa细胞(N-Mafa)、转染pcDNA3.1(+)-Pdx1细胞(N-Pdx1)、转染pcDNA3.1(+)-Pax4细胞(N-Pax4)、转染pcDNA3.1(+)-Neurod1细胞(N-Neurod1)和转染pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP细胞(N-PNM)。

1)转染后基因鉴定

分别提取转染后24h的转染pcDNA3.1(+)-Ngn3细胞(N-Ngn3)、转染pcDNA3.1(+)-Mafa细胞(N-Mafa)、转染pcDNA3.1(+)-Pdx1细胞(N-Pdx1)、转染pcDNA3.1(+)-Pax4细胞(N-Pax4)、转染pcDNA3.1(+)-Neurod1细胞(N-Neurod1)和转染pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP细胞(N-PNM)的RNA，反转录得到cDNA。

以上述cDNA为模板，用表1所示的引物对Pdx1、Ngn3、Mafa、Neurod1、Pax4进行PCR扩增。

表1 引物序列设计

PCR扩增产物电泳，结果如图3所示，可以看出，6个质粒能正确表达，且表达量很高。

2)转染后蛋白的鉴定

(1)收集转染后24h的转染pcDNA3.1(+)-Ngn3细胞(N-Ngn3)、转染pcDNA3.1(+)-Mafa细胞(N-Mafa)、转染pcDNA3.1(+)-Pdx1细胞(N-Pdx1)、转染pcDNA3.1(+)-Pax4细胞(N-Pax4)、转染pcDNA3.1(+)-Neurod1细胞(N-Neurod1)和转染pcDNA3.1-Pdx1-2A-Ngn3-2A-Mafa-EGFP细胞(N-PNM)，用PBS洗涤2次。

(2)细胞固定：加入适量4％多聚甲醛(4℃预冷)，放置室温下固定20min左右。用PBS洗涤2次，每次洗涤时间为10-15min左右。

(3)透膜及封闭抗原：用0.2％tritonX-100(用PBS降母液稀释500倍)溶解牛血清白蛋白粉(BSA)，配成含2％BSA的透膜封闭液。依次向每孔中加入约1ml的透膜封闭液，在37℃条件下孵育1小时左右。

(4)加一抗：结合预实验摸索抗体的最佳浓度，按一定的比例用2％BSA溶液稀释一抗：Rabbit Anti mouse Pdx1Antibody(1:2000，abcam)，Rabbit Anti mouse Ngn3Antibody(1:100，Santa Cruz Biotechnology)，Rabbit Anti mouse Mafa Antibody(1:100，Santa Cruz Biotechnology)，Rabbit Anti mouse Neurod1Antibody(1:100，Santa Cruz Biotechnology)，Rabbit Anti mouse Pax4Antibody(1:100，Santa Cruz Biotechnology)，放置在4℃冰箱湿敷、避光过夜。

(5)第二天在37℃恒温汽浴箱复温湿敷、避光1小时后，用PBS洗涤3次，每次15min左右。

(6)加二抗：根据预实验摸索抗体的最佳浓度，按一定比例用PBS稀释二抗：

Alexa488Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)Antibody，Goat Anti Rabbit IgG FITC Antibody(1:200)，Goat Anti Rabbit IgG Rhodamine Red Antibody(1:200)，Donkey Anti Goat IgG FITC Antibody Rabbit(1:1000) 

放置于37℃恒温汽浴箱湿敷、避光1小时后，用PBS洗涤3次，每次15min左右。

(7)DAPI染核：用PBS以1:800的比例释DAPI染色剂(使用前先轻轻摇匀)，放置常温下孵育5min，用PBS洗涤3次，每次大概10min。

(8)放置在荧光显微镜进行观察和拍照。

分别单独转染五个质粒鉴定蛋白，转染pcDNA3.1(+)-Ngn3细胞(N-Ngn3)、转染pcDNA3.1(+)-Mafa细胞(N-Mafa)、转染pcDNA3.1(+)-Pdx1细胞(N-Pdx1)、转染pcDNA3.1(+)-Pax4细胞(N-Pax4)、转染pcDNA3.1(+)-Neurod1细胞(N-Neurod1)，结果如图4所示，可以看出，有表达量较高的绿色荧光蛋白。

上述实验证明，采用pCDNA3.1-EGFP质粒载体表达各个目的基因，与其他病毒载体相比具有如下优势，Pcmv巨细胞病毒启动子具有促使目的基因高效表达的作用，具有增强转录后RNA水平的牛生长激素基因(BGH)以及载体中存在的双重选择标记等，使其能在真核细胞中更好的表达。EntransterTM-D转染试剂采用的是纳米技术，不但安全性较高，同时具有较高的转染效率，这为细胞直接重编程技术的开展奠定了基础。

实施例2、细胞直接重编程最佳转录因子组合和转染时段筛选及鉴定

本实验通过研究不同转录因子发挥作用的先后顺序及在不同转染时段筛选重编程效率和成熟度好的最佳组合与时段，对重编程后的β细胞从基因和蛋白方面进行鉴定，为将来的临床应用奠定基础，具体如下：

将实施例1制备的5种重组载体按照如下分组转染NCTC-1469小鼠肝细胞系：

(1)组合1Pdx1+Ngn3+Mafa：将重组载体pcDNA3.1(+)-Ngn3(N-Ngn3)、pcDNA3.1(+)-Mafa(N-Mafa)、pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)按照质量比为1:1:1混匀共同转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中；

(2)组合2Pdx1+Ngn3+Neurod1：将重组载体pcDNA3.1(+)-Ngn3(N-Ngn3)、pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)和pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)按照质量比为1:1:1混匀共同转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中。

(3)组合3Pdx1+Ngn3+Pax4：将重组载体pcDNA3.1(+)-Ngn3(N-Ngn3)、pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)和pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)按照质量比为1:1:1混匀共同转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中。

(4)组合4Pdx1+Pax4+Neurod1：将重组载体pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)、pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)和pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)按照质量比为1:1:1混匀共同转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中。

(5)组合5Pdx1+Pax4+Mafa：将重组载体pcDNA3.1(+)-Mafa(N-Mafa)、pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)和pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)按照质量比为1:1:1混匀共同转染到NCTC-1469小鼠肝细胞系中。

一、不同转录因子组合转染后细胞形态学变化

将上述不同组合转染后细胞以5×10⁵的密度提前一天种板于两个六孔板中，转染完成后于第2天、第4天和第6天观察细胞形态学变化。

显微镜下观察细胞在不同生长天数的形态变化，组合4结果如图5，A图是正常状态下的小鼠肝细胞系，细胞呈长梭形，细胞生长状态良好。图B是转染后2天细胞的变化，细胞开始逐渐变小的形态学变化，C图显示的是转染4天后的细胞由梭形向圆形转变，转染后通过提高胎牛血清的密度，细胞的生长状态得到很好的营养供应。D图显示的是细胞转染7天后细胞形态变化，第7天时，细胞开始出现由最初的梭形向圆形明显形态转变， 并呈现聚集状态，证明转染后的细胞为胰岛β细胞。

其他不同载体组合转染的细胞在直接重编程过程中形态变化类似。

二、最佳转染组合的筛选

1、RT-PCR基因鉴定

将上述5种转染组合转染后7天细胞利用Trizo提取RNA，以RNA为模版反转录为cDNA，备用。用表2所示的引物和表3所示的体系进行RT-PCR扩增。以未转染的肝脏细胞NCTC-1469为对照。

表2 引物序列设计

表3 为RT-PCR试剂组分

电泳检测PCR产物，结果如图6所示，可以看出，未转染的肝细胞系是没有Ins1和Ins2(这2个基因为胰岛β细胞标志基因)的表达。无论是肝系还是重编程的细胞(转染后细胞)都表达Pdx1，这可能是由于肝胰同源性所致。经典组合Pdx1+Ngn3+Mafa的鉴定结果示，Ins1、Ins2和Glut2等都有所表达，只是表达量较少。组合2Pdx1+Ngn3+Neurod1、组合4Pdx1+Pax4+Neurod1和组合5Pdx1+Pax4+Mafa所检测的几个基因都有所表达，从条带来看，组合2Pdx1+Ngn3+Neurod1和组合4Pdx1+Pax4+Neurod1的表达较好，组合3Pdx1+Ngn3+Pax4没有Ins1的表达，故排除该组合，本次实验结果分析，初步筛选最佳组合为组合2Pdx1+Ngn3+Neurod1，组合4Pdx1+Pax4+Neurod1。进一步证明，组合4和组合2转染后的细胞为胰岛β细胞。2、Real-time PCR鉴定

以上述5种转染组合转染后7天细胞Trizo提取RNA，以RNA为模版反转录为cDNA，备用。用表2所示的引物、表4所示的体系和表5所示的反应程序进行Real-time PCR扩增。以未转染的肝脏细胞NCTC-1469为对照。

表4 Real Time-PCR反应体系的试剂组份

表5 Real Time-PCR两步法扩增程序

通过Real-time PCR技术测定不同组合中胰腺发育相关基因的表达水平，结果如图7和表6所示，可以看出，五个组合中组合4Pdx1+Pax4+Neurod1和组合5Pdx1+Pax4+Mafa中含有Ins2的表达，但组合4Pdx1+Pax4+Neurod1中Ins1、Glut2高于组合5Pdx1+Pax4+Mafa(P<0.05)，有统计学意义。从表5中可以看出，组合4Pdx1+Pax4+Neurod1中Ins1和Ins2分别高出正常组的0.63和0.61倍，而组合5Pdx1+Pax4+Mafa的Ins1和Ins2分别是正常组的0.21倍和0.61倍。结合RT-PCR结果，本实验筛选出最佳转录因子组合为组合4Pdx1+Pax4+Neurod1，即将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)、pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)和pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)共同转染细胞。进一步证明，组合4转染后的细胞为胰岛β细胞。

表6 五个转录因子组合的胰腺发育相关基因mRNA水平

二、检测最佳组合重编程β细胞的重编程效率

1、流式细胞术检测最佳组合重编程效率

(1)取组合4Pdx1+Pax4+Neurod1转染第9天的细胞进行流式细胞术检测，分别为Pdx1+Pax4+Neurod1组(实验组)和小鼠肝细胞系组(对照组)；

(2)收集细胞，PBS洗涤2次，用0.25％的胰酶消化，待观察到显微镜下的细胞变圆后，终止消化用胰酶3倍体积的完全培养基，轻轻吹打细胞悬液；

(3)离心4min，500g，弃上清，PBS洗涤2次，转入流式细胞管，离心3min，500g，弃上清；

(4)加入500ulCytofix/Cytoperm液，涡旋混匀细胞，室温下进行固定、破膜封闭细胞30min；

(5)离心500g，5分钟，弃掉上清；

(6)1×Perm/Wash buffer加入后混匀细胞，室温避光孵育30分钟，离心500g，5分钟，弃掉上清；

(7)1×Perm/Wash buffer稀释一抗Guinea-pig-anti-mouse insulin Antibody(1:50，abcam)，加入到沉淀的细胞中，轻轻混匀，37℃室温孵育1小时；

(8)离心500g，5分钟，弃掉上清，1×Perm/Wash buffer洗涤细胞，离心500g，5分钟，弃上清，重复1次；

(9)1×Perm/Wash buffer稀释二抗Guinea-pig-anti-mouse insulin Antibody(1:500，Invitrogen)加入到沉淀中，轻轻混匀，37℃室温孵育1小时；

(10)离心500g，5分钟，弃掉上清，1×Perm/Wash buffer洗涤细胞，离心500g，5分钟，弃上清，重复1次；

(11)加入含2％多聚甲醛的PBS重悬细胞，上机检测。

结果如图8所示，图8A为阴性对照组小鼠肝细胞系NCTC-1469，其胰岛素表量基本没有，图8B为小鼠胰岛β细胞系(NIT-1，Yun Wang,Hong-Jie Yan,Shu-Yan Zhou,Yun-Shuang Wang,Hui Qi,Chun-Yan Deng,Fu-Rong Li.The immunoregulation effect of Alpha 1-antitrypsin prolongβ-cell survival after transplantation.PLoS One.2014；9(4):e94548.)，胰岛素表达量达97％，图8C为筛选的最佳组合4Pdx1+Pax4+Neurod1转染得到胰岛β细胞，其胰岛素表达量达到16％，可见，本研究的重编程效果比较明显，但与胰岛β细胞系相比，胰岛素的表达量相对较低，重编程效率还有待于提高。

2、最佳转染时段的筛选

用空载体pCDNA3.1-EGFP质粒转染NCTC-1469小鼠肝细胞系，转染后分别在12h，24h和36h用免疫荧光技术观察荧光的表达量。

结果如图9所示，在转染后12h，24h和36h三个时间点观察中发现，转染24h后绿色蛋白的表达量最高，而在转染后12h时可能是转染的时间不足，而转染36h后观察数量减少，可能是转染后出现淬灭作用，因此，本研究通过空载体观察，转染后24h绿色荧光蛋白表达量最高。

3、ELISA检测重编程β细胞胰岛素表达筛选最佳转染时段

12h组样本：将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；12h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；12h后再将pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞；

24h组样本：将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞；

36h组样本：将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；36h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；36h后再将pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞；

上述三个样本分别用KRBB缓冲液洗涤2次后，每个样本设置三个组：分别加入1ml的KRBB缓冲液、1mlKRBB低糖缓冲液(5.5mM)、1ml KRBB高糖缓冲液(17.5mM)，刺激2h后分别收集上清液，作为Elisa检测的样本。

按照Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA试剂盒的要求进行操作，方法如下：

(1)从4℃冰箱中取出试剂盒，静置在常温下数分钟。

(2)按照试剂盒的指示，配制各种试剂，依次有洗涤液、酶结合液和标准品等。

(3)选取25ul的体系为准，标准品的浓度依次为0.025ng/mL，0.09ng/mL,0.188ng/mL,0.5ng/mL,1.25ng/mL。

(4)取三个样本每个组的上清液作为检测样本，用微量加样器分别按照每孔25ul加入孔板中，每个检测样本设置2个复孔，以标准品为对照；

(5)依次向标准品和检测样本中加入75ul的酶结合液，注意避光操作。

(6)将样板放置在摇床上(转速为700-800rpm)，在常温下摇动2小时。

(7)摇动2小时结束后，用洗涤液洗涤6次，每孔加入400ul。

(8)6次洗涤结束后，各个样本中依次加入100ul的TMB(显色底物)，每孔依次加入100ul。

(9)将各个样本放置在摇床上，转速为700-900rpm，在室温孵育30分钟。

(10)孵育结束后，向各个样本中依次加入终止液，每孔加入100ul，将各个样本轻轻混匀后，立刻放置在OD450nm的酶标仪上测量(30分钟内)

(11)标准曲线的绘制：根据各个标准品的OD值，以及试剂盒给的浓度，绘制标准曲线。

(12)各个样本浓度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，以及酶标仪测得的各个样本的OD值，求得相应样本的浓度即为胰岛素的释放量。

以NIT-1细胞系(胰岛β瘤细胞系)对照。

结果如图10和表7，可以看出，在间隔24h转染时，高糖和低糖刺激下，重编程的胰岛β细胞的胰岛素释放量是最高，释放量达到0.39ng/ug和0.03ng/ug，是NIT-1细胞系释放量的1/7左右(*P<0.05)具有统计学意义，但仍未达到正常胰岛β细胞胰岛素释放量，说明直接重编程技术还有待于进一步提高。

表7 酶联免疫学方法检测细胞培养上清胰岛素含量(n＝3，x±s)

4、检测最佳组合和最佳转染时段重编程β细胞的效率

最佳组合4按照如下方式转染：将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞；

以小鼠肝细胞系NCTC-1469和小鼠胰岛β瘤细胞系NIT-1为对照。收集转染7天后的细胞(即为重编程细胞)，按照上述1的方法检测重编程效率，结果如图11，图A小鼠肝细胞系NCTC-1469、图B小鼠胰岛β瘤细胞系NIT-1、图C重编程胰岛β细胞；流式细胞术检测重编程效率公式为：重编程后的胰岛β细胞数量/转染的肝细胞系数量×100％＝重编程效率％，重编程效率达21％，与前面筛选的最佳组合重编程效率相比，效率有所提高，说明不同时间段转染有助于提高重编程效率，但与小鼠胰岛β细胞系相比仍有一定的距离。

因此，重编程胰岛β细胞的最佳组合为组合4，最佳转染间隔为24h。

三、检测最佳组合和最佳转染时段获得重编程β细胞

1、直接重编程胰岛β细胞mRNA表达水平的检测

最佳组合4按照如下方式转染：将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞；

在转染后第3、6、9、12天收集转染后细胞采用荧光定量PCR检测转染后细胞个基因的表达量，所用引物见表2。

结果如图12和表8所示，可以看出，在重编程后的第3、6、9天中，胰腺发育相关基因的表达与对照组相比，表达量呈上调趋势，第3天和第6天，基因的表达逐渐上升，第9天基因表达量最高，第12天基因表达有所下降，每个基因的表达量同第3天对比，具有统计学意义(*P<0.05)，Pdx1和Mafa这两个基因的表达在四个时间点的表达都是比较高的，而Ins1和Ins2两个基因是在第9天表达最高，因此，通过本实验，将选取重编程后第9天的细胞作为为最佳动态时间点，且同时也证明了重编程细胞为胰岛β细胞。

表8 直接重编程后基因表达情况

2、直接重编程胰岛β细胞蛋白水平的检测

收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞(重编程胰岛β细胞)，按照实施例1的转染后蛋白的鉴定的方法进行蛋白水平检测。

结果如图13，显示最佳转录因子组合和最佳转染时段筛选后，重编程胰岛β细胞的第9天有蛋白Insulin、Pdx1、C-peptide、Glucagon等表达，但表达量不明显。可能是由于细胞重编程效率不高有关，也有可能在染色过程中存在部分荧光丢失等因素。

3、直接重编程β细胞重编程效率的检测

收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞(重编程胰岛β细胞)，按照上述二的1的方法检测重编程效率。

结果如图14所示，图A小鼠肝细胞系NCTC-1469、图B小鼠胰岛β瘤细胞系NIT-1、图C最佳组合Ad-Pdx1+Pax4+Neurod1；表明，重编程第9天后，多次重复实验，重编程效率在21％-25％之间，均值为23％的胰岛素阳性细胞表达，与之前文献报道相似。

4、直接重编程β细胞成熟度的检测

收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞(重编程胰岛β细胞)，按照上述二的3的方法检测重编程β细胞成熟度。

C肽检测方法：(80-CPTMS-E01，ALPCO)

收集最佳组合Pdx1+Pax4+Neurod1和最佳转染时段24h转染第9天的重编程细胞，用KRBB缓冲液洗涤最佳组合和NIT组2次后，2个样本设置三个组，分别加入1mL的KRBB缓冲液，1mLKRBB低糖缓冲液(5.5mM)，1mLKRBB高糖缓冲液(17.5mM)，分别刺激2h后收集上清液，作为Elisa检测的样本。按照Mouse Ultrasensitive Insulin C-peptide试剂盒的要求进行操作，方法如下：

(1)从4℃冰箱中取出试剂盒，静置在常温下数分钟。

(2)按照试剂盒的指示，配制各种试剂，依次有洗涤液、酶结合液和标准品等。

(3)选取25ul的体系为准，标准品的浓度依次为0.00ng/mL，0.187ng/mL,0.781ng/mL,2.342ng/mL,4.683ng/mL,9.367ng/mL。

(4)取2个样本，分别设置2个复孔，用微量加样器分别向孔板中依次加入标准品、样本(分别在0mM、5.5mM和17.5mM浓度刺激下的上清液)，每孔加入10uL。

(5)依次向标准品和样本中加入100uL的酶结合液，注意避光操作。

(6)将样板放置在摇床上(转速为700-900rpm)，在常温下摇动2小时。

(7)摇动2小时结束后，用洗涤液洗涤3次，每孔加入100uL。

(8)3次洗涤结束后，各个样本中依次加入100uL的TMB(显色底物)，每孔依次加入100uL。

(9)将各个样本放置在摇床上，转速为700-900rpm，在室温孵育10分钟。

(10)孵育结束后，向各个样本中依次加入终止液，每孔加入100uL，将各个样本轻轻 混匀后，立刻放置在OD450nm的酶标仪上测量(30分钟内)

(11)标准曲线的绘制：根据各个标准品的OD值，以及试剂盒给的浓度，绘制标准曲线。

(12)各个样本浓度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，以及酶标仪测得的各个样本的OD值，求得相应样本的浓度即为C肽的释放量。

结果如图15、表9和表10所示，图15A和B显示在低糖(5.5mM)、高糖(17.5mM)的刺激下，最佳组合4Pdx1+Pax4+Neurod1与胰岛β细胞系(NIT)胰岛素和C肽的释放量，分别为0.04ng/ug，0.52ng/ug；0.05ng/ug，0.53ng/ug，均有统计学意义(P<0.05)，在高糖刺激下，组合4Pdx1+Pax4+Neurod1组胰岛素和C肽的释放量是NIT细胞系的1/7左右，小鼠肝细胞直接重编程的胰岛β细胞具有胰岛素释放功能，但功能仍低于NIT细胞系，说明成熟度上存在不足。

表9 酶联免疫学方法检测重编程β细胞胰岛素含量(n＝3，)

表10 酶联免疫学方法检测重编程β细胞C肽含量(n＝3，)

实施例3、直接重编程的小鼠肝细胞为β细胞治疗糖尿病的研究

本研究通过构建小鼠糖尿病模型，将前一阶段筛选出的最佳组合和最佳时间段重编程的胰岛β细胞移植到糖尿病小鼠左侧肾包膜下，监测小鼠的血糖变化，分别进行胰岛素、C肽释放量监测，评估对糖尿病模型小鼠的降糖作用，为临床上治疗糖尿病提供一定依据。

1、糖尿病模型的构建

(1)喂养1周SCID-Beige小鼠后，体重为20-25g左右。

(2)将小鼠禁食不禁水14h，配制的STZ溶液的浓度为20mg/ml；即5-6ul/g小鼠体重。 

(3)小鼠注射STZ之后进行正常喂养，通过尾静脉在每天早晨进行采血监测空腹血糖，连续3天测得的血糖浓度为≥300mg/dL，即为造模成功，获得糖尿病小鼠。

2、细胞移植 

下述待移植细胞按照如下方法制备：

将pcDNA3.1(+)-Pdx1(N-Pdx1)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞；24h后再将pcDNA3.1(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后再将 pcDNA3.1(+)-Neurod1(N-Neurod1)转染到二次转染细胞，9天后收集细胞，为重编程胰岛β细胞，即为待移植细胞。

实验分组： 

①正常小SCID-Beige鼠(6只，阴性对照)：不移植细胞；

②糖尿病小鼠(6只，阳性对照)：注射0.1mlPBS到左肾包膜下；

③移植肝细胞系组(6只，左肾包膜下移植2×10⁶细胞)

④移植组糖尿病小鼠(9只,实验组1)：将2×10⁶细胞移植到糖尿病小鼠左肾包膜下；

⑤移植组糖尿病小鼠2(9只，实验组2,)：将4×10⁶细胞移植到糖尿病小鼠左肾包膜下；

具体方法如下(图16)：

(1)观察造模成功后，准备进行细胞移植，移植前一天，对小鼠进行抗生素喂养。

(2)收集第9天的细胞进行消化，洗涤，用PBS重悬。

(3)以水合氯醛0.004mL/g的浓度对小鼠进行麻醉，剔除小鼠左侧腰部的毛发，进行消毒处理。

(4)小鼠左肾附近的表皮、腹膜用无菌眼科手术剪依次剪开，开口方向与脊柱呈60°角，切口1cm左右。

(5)用手轻轻按压切口两侧肌肤以挤出左肾，使无菌注射器针头在肾包膜上划开2-3mm小口，分别用移液枪吸取细胞悬液，注入肾包膜内。

(6)电热灼合伤口，将左肾移至腹腔缝合，对移植细胞会的小鼠放置在37℃保暖4-5h，确保小鼠生长状态正常后放回小鼠房，连续1周投放恩诺沙星喂养。

3、移植后受体小鼠体重血糖的监测

对移植细胞后的4组小鼠正常小鼠组、糖尿病小鼠组、移植组糖尿病小鼠1(2×10⁶cells)、移植组糖尿病小鼠2(4×10⁶cells)进行血糖和体重水平监测：三天检测一次，至30天。

结果如表11和图17，移植后第3天，小鼠的血糖有所降低，但不是很明显，第6天小鼠血糖降的比较明显，对照组移植小鼠肝细胞系，没有降糖作用，相对而言，移植重编程胰岛β细胞数量较多的移植组2要比移植组1降糖效果明显，但仍未达到正常水平。第27天摘除小鼠左肾，发现小鼠血糖上升到糖尿病小鼠血糖水平，重编程的细胞具有降糖效果，但在体外的效果较好，体内的降糖作用较弱，一方面表明这一技术还有待于完善，另一方面表明，可以通过提高移植重编程细胞数量来抵抗相对重编程不足而导致的降糖效果差的结果，本研究证实了体内实验的降糖效果，但仍未达到正常小鼠的血糖水平，说明今后的研究中，还要克服内环境对直接重编程技术带来的影响。

表11 不同移植组受体小鼠血糖变化

4、移植后受体小鼠糖耐量监测

(1)对移植胰岛β细胞的受体小鼠选取第7天和24天时间点进行糖耐量监测。

(2)对4组小鼠禁食6h，用灭菌注射用水配制的0.5g/ml的葡萄糖溶液，用于小鼠腹腔注射(2g/kg)，断尾采血监测注射0、15、30、60、90min后小鼠的血糖。

选取第7天和第24天时间点对小鼠进行糖耐量监测，从图18、表12和表13结果表明，与糖尿病组对比，移植重编程的胰岛β细胞，15分钟时会有血糖的降低，一直处于一定的血糖调控作用，高于糖尿病组血糖调控，但低于正常小鼠的血糖调控,其中，Transplantation Group2(4×10⁶细胞)小鼠的调控作用高于Transplantation Group1(2×10⁶细胞)，可见，增加重编程的胰岛β细胞能提高对糖尿病小鼠血糖的调控，但二者没有明显的统计学差异(P>0.05)，说明直接重编程技术还有待于进一步的完善，提高重编程的胰岛β细胞调控作用。

表12 移植后第7天各组小鼠葡萄糖耐量实验

表13 移植后第24天各组小鼠葡萄糖耐量实验

5、移植后受体小鼠胰岛素的释放量监测

(1)选取移植胰岛β细胞后受体小鼠第6、12、18、24等天的时间点进行elisa监测。

(2)从4组小鼠中随机抽取3只小鼠，取每只小鼠的眼周静脉的血，离心收集血清，按照elisa试剂盒的要求操作。

(3)的绘制：根据各个标准品的OD值，以及试剂盒给的浓度，绘制标准曲线。

(4)样本浓度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，以及酶标仪测得的各个样本的OD值，求得相应样本的浓度即为胰岛素的释放量。

以NIT-1细胞为对照。

各组小鼠选取第6、12、18、24四个时间点进行检测，随机抽取三只小鼠，眼眶采血后，收集血清，离心后，elisa检测结果如图19和表14显示四个时间段胰岛素都是有分泌，其中，糖尿病小鼠和移植组的小鼠胰岛素释放量少于正常小鼠，与正常小鼠释放量具有统计学差异(*P<0.05)。两组移植组小鼠的胰岛素释放量虽然不如正常小鼠胰岛素释放量水平，但要高于糖尿病小鼠胰岛素释放量，胰岛素和C肽的释放量是NIT细胞系的1/7，其中，Transplantation Group2(4×10⁶细胞)小鼠的胰岛素释放量高于Transplantation Group1(2×10⁶细胞)，但二者无明显统计学差异，后者高于前者胰岛素释放量水平，说明通过增加重编程胰岛β细胞的数量可以提高降糖的效果。

表14 移植后不同时间点小鼠的胰岛素释放水平

Claims (10)

1.一种使离体成体细胞重编程为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛β细胞；

所述Pdx1蛋白的氨基酸序列为序列6；

所述Pax4蛋白的氨基酸序列为序列7；

所述Neurod1蛋白的氨基酸序列为序列7为序列8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因的转染间隔时间均为24h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因的转染顺序依次为所述Pdx1蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurod1蛋白编码基因。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述Pdx1蛋白编码基因通过表达Pdx1蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞；

所述表达Pdx1蛋白编码基因的重组载体为将所述Pdx1蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体；

所述Pax4蛋白编码基因通过表达Pax4蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞；

所述表达Pax4蛋白编码基因的重组载体为将所述Pax4蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体；

所述Neurod1蛋白编码基因通过表达Neurod1蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞；

所述表达Neurod1蛋白编码基因的重组载体为将所述Neurod1蛋白编码基因插入表达载体，得到的重组载体。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述离体成体细胞为离体肝脏细胞；

所述表达载体为pCDNA3.1-EGFP；

所述离体肝脏细胞具体为NCTC-1469。

6.由权利要求1-5中任一所述方法制备的胰岛β细胞。

7.由权利要求6所述胰岛β细胞分泌的胰岛素或C肽。

8.权利要求1-5中任一所述方法或权利要求6所述的胰岛β细胞或权利要求7所述的胰岛素在制备治疗糖尿病产品中的应用。

9.权利要求1-5中任一所述方法或权利要求6所述的胰岛β细胞或权利要求7所述的胰岛素在制备降低血糖产品中的应用。

10.一种治疗糖尿病产品或降低血糖产品，包括权利要求6所述的胰岛β细胞或权利要求7所述的胰岛素；

或一种使离体成体细胞重编程为胰岛β细胞的产品，为如下1)或2)；

1)包括Pdx1蛋白、Pax4蛋白和Neurod1蛋白；

2)包括含有Pdx1蛋白编码基因的表达盒、重组载体或病毒、含有Pax4编码基因的表达盒、重组载体或病毒和含有Neurod1编码基因的表达盒、重组载体或病毒；

所述离体成体细胞为离体肝脏细胞。