CN101553245A - 用于细胞重编程的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗以感兴趣的细胞的数量或生物活性缺乏为特征的疾病、紊乱或损伤的治疗组合物和方法。所述方法提供了用于生成重编程的细胞或用于增加感兴趣的细胞、组织或器官的再生的组合物。这样的方法可用于治疗具有特定细胞类型缺乏或该细胞类型产生的多肽缺乏的受治疗者。具体地，本发明提供了用于改善或预防与1和2型糖尿病相关的高血糖及有关并发症的预防和治疗方法以及组合物。

Description

用于细胞重编程的组合物及其用途

相关申请的交互引用

本申请要求2006年7月19日提交的美国临时专利申请第60/832,070号的权益，其全部内容通过引用完整并入本申请。

对联邦政府资助的研究下的发明权益的声明

本工作受到美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)的下列资助金的资助：第DK064054号和第DK071831号资助金。(美国)政府享有本发明的某些权益。

背景技术

因为目前用于治疗1型糖尿病(T1D)的方法不可有效预防长期并发症，研究者正寻求可选的治疗方法，包括使用胰岛素生成细胞(IPC)来恢复血糖正常。尽管可以通过植入功能性β细胞来治疗T1D，但是胰岛的植入因牺牲供体胰岛和需要终生的免疫抑制治疗来减少移植排斥危险而受到阻碍。

为了治疗1型糖尿病，研究者正积极寻求用于实现干细胞向生成胰岛素的胰腺β细胞子代(IPC)的定向分化的可靠策略。使用重组DNA技术的基因调控是将干细胞定向分化为所需谱系、特别是关于肝脏至内分泌胰腺转分化的非常有前景的方法。该方法已经用于在体外和体内实验中从肝细胞和肝脏干细胞产生IPC。尽管这些研究提供了使用肝脏作为潜在的自体供体细胞用于1型糖尿病治疗中的细胞治疗的重要前景，但是已经证明人类临床治疗中使用基因操作受到争议。因此，迫切需要不依赖于基因治疗的用于产生胰岛素生成细胞的组合物和方法。

发明内容

如下文所述，本发明的特征是用于治疗或预防以感兴趣的细胞(例如胰腺细胞)的数量或生物活性缺乏为特征的疾病、紊乱或损伤(例如糖尿病)的治疗方法。

一方面，本发明提供了一种用于细胞(例如成体细胞或胚胎干细胞)重编程的方法，所述方法涉及使成体细胞接触融合或包含蛋白转导结构域的转录因子多肽或其片段，并且改变成体细胞中至少一种多肽(例如胰腺转录因子多肽)的表达水平，由此使得该细胞重编程。

另一方面，本发明提供了一种用于产生胰岛素生成细胞的方法，所述方法涉及使细胞(例如成体细胞或胚胎干细胞)接触与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子或其片段，并且增加该细胞中胰岛素的表达，由此产生胰岛素生成细胞。

又一方面，本发明提供了一种用于诱导胰岛素生成细胞再生的方法，所述方法包括使胰腺细胞接触包含Pdx-1多肽、VPA16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段，由此诱导胰腺细胞再生。

又一方面，本发明提供了一种用于产生胰岛素生成细胞的方法，所述方法包括使肝脏衍生细胞接触包含Pdx-1多肽、VP16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段，由此产生胰岛素生成细胞。在一个实施方案中，使肝脏衍生细胞体外或体内接触。在另一个实施方案中，经门静脉或经其分枝提供所述融合蛋白，使得所述融合蛋白定向肝脏的特定叶。在又一个实施方案中，通过肝脏衍生细胞的转分化来产生胰岛素生成细胞。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的成体细胞接触与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子或其片段，并且增加所述成体细胞中胰岛素表达，由此产生胰岛素生成细胞。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的成体胰腺细胞接触包含Pdx-1多肽、VP16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段，并且诱导所述成体胰腺细胞再生，由此改善所述受治疗者的高血糖。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者(例如患有1型或2型糖尿病的人或动物患者)的高血糖的方法，所述方法包括使肝脏衍生细胞接触包含Pdx-1多肽、VP16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段，并产生胰岛素生成细胞，由此改善所述受治疗者的高血糖。在一个实施方案中，所述肝脏衍生细胞是肝细胞或肝脏衍生的干细胞。在又一个实施方案中，在接触所述融合蛋白之前细胞不能表达可检测水平的胰岛素。在又一个实施方案中，所述方法减低所述受治疗者的血糖水平。在又一个实施方案中，所述方法使得所述受治疗者的血糖水平正常。在又一个实施方案中，所述方法还包括进行有效量的包含Ngn3多肽、蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段的给药。

另一方面，本发明提供了一种含有或基本组成为与早期或晚期胰腺转录因子(例如，Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1以及Pax6)具有至少85％、90％、95％或甚至100％的氨基酸同一性的多肽以及蛋白转导结构域(例如，HIV-1TAT PTD结构域、聚精氨酸序列、VP22结构域或触角足(antennapedia)蛋白转导结构域)的融合多肽、其类似物或片段，其中所述融合蛋白在细胞中的表达相对于相应对照细胞改变至少一种多肽的表达。在一个实施方案中，所述融合多肽还包括单纯疱疹病毒VP16(Herpes simplex virus VP16)激活结构域或其片段或类似物，用于纯化的序列标签(例如六组氨酸标签)，或特别结合抗体的抗原结构域(例如V5结构域)。在又一个实施方案中，所述融合多肽包含或基本组成为人类Pdx-1多肽或其片段，单纯疱疹病毒VP16激活结构域，以及蛋白转导结构域，或其生物活性片段。

又一方面，所述融合多肽含有胰腺转录因子启动子和可检测结构域。在多个实施方案中，所述启动子选自Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1以及Pax6中的任一种或多种，在其他实施方案中，所述可检测结构域选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)以及β-半乳糖苷酶中的任一种或多种。在其他实施方案中，所述多肽还包含促进多肽纯化的氨基酸序列标签，例如六组氨酸标签或GST。

在其他方面，本发明提供了包含编码任何前述方面的多肽的核酸序列的表达载体。在一个实施方案中，所述载体含有操作性连接所述核酸序列的启动子。在一个实施方案中，所述启动子被定位用于细菌或哺乳动物细胞中的表达。

又一个方面，本发明提供了一种包含任何前述方面的表达载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述细胞是原核或真核细胞。在其他实施方案中，所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞以及酵母细胞中的任何一种或多种。

又一方面，宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、人类细胞)含有任何前述方面的融合多肽。在又一些其他实施方案中，所述细胞选自下述细胞中的任一种或多种：脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞还包含第二融合多肽，例如含有Ngn3和蛋白转导结构域的融合多肽，或其生物活性片段。

又一方面，本发明提供了一种包含任何前述方面的宿主细胞的组织。

又一方面，本发明提供了一种包含任何前述方面的宿主细胞的器官。

又一方面，本发明提供了一种包含任何前述方面的宿主细胞的基质。

又一方面，本发明提供了一种用于产生任何前述方面的重组多肽的方法，其包括：提供一种使用任何前述方面的被定位在细胞中表达的分离的核酸分子转化的细胞；在用于表达所述核酸分子的条件下培养所述细胞；以及分离所述多肽。

又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含于药学上可接受的赋形剂中的有效量的任何前述方面的多肽或前述方面的宿主细胞。在其他实施方案中，所述组合物还含有有效量的包含Ngn3氨基酸序列和蛋白质转导结构域或其生物活性片段的融合多肽。

又一方面，本发明提供了一种包装的药物，所述药物包含：任何前述方面的多肽或任何前述方面的宿主细胞；和使用所述多肽或细胞改善受治疗者的高血糖(例如，与1型或2型糖尿病有关的高血糖)的说明书。

又一方面，本方面提供了一种用于治疗高血糖(例如，与1型或2型糖尿病有关的高血糖)的药盒，所述药盒包含有效量的任何前述方面的融合多肽或任何前述方面的宿主细胞，及其使用说明书。

又一方面，本方面提供了一种腺病毒相关病毒(AAV)载体，其包含Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA中任何一种或多种的胰腺转录因子，其中所述多肽可操作地连接用于被定位在哺乳动物细胞中表达的启动子。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的一种细胞接触前述方面的AAV载体并且诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的肝脏衍生细胞接触前述方面的AAV载体并且诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的一种细胞接触前述方面的AAV载体并且诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

又一方面，本发明提供了一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治疗者的肝脏衍生细胞接触前述方面的AAV载体并且诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

又一方面，本发明提供了一种宿主细胞(例如，成体细胞、胚胎干细胞、肝细胞或胰腺细胞)，所述宿主细胞包含前述方面的AAV载体或多肽(例如融合多肽)。在一个实施方案中，所述细胞是下述细胞中的一种或多种：脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞或它们的祖细胞或干细胞。

又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含于药学上可接受的赋形剂中的有效量的腺病毒载体。

又一方面，本发明提供了一种治疗受治疗者的糖尿病的方法，所述方法包括使所述受治疗者接触有效量的Pdx1多肽，以诱导Pdx1、INGAP、Reg3d、Reg3g以及胰腺炎相关蛋白Pap中的任何一种或多种基因在所述受治疗者组织中的表达，由此治疗糖尿病。在一个实施方案中，表达增加是下述情况中的一种或多种：Pdx1增加约3-4倍，INGAP表达增加约14-15倍，Reg3d表达增加约7-8倍，Reg3g增加约6-7倍，以及胰腺炎相关蛋白Pap增加30-35倍。在又一个实施方案中，所述方法增加Pdx1、胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶、IAPP、胰岛素II、促生长素抑制素、NeuroD、Isl-1以及胰腺外分泌基因p48和淀粉酶中任何一种或多种的表达。在又一个实施方案中，至少两种、三种、四种或五种基因的表达增加。在又一个实施方案中，所有这些基因的表达都增加。

又一方面，本发明提供了一种诱导有需要的受治疗者中胰岛β细胞再生的方法，所述方法包括将有效量的Pdx1蛋白给药至所述受治疗者并且诱导胰岛β细胞再生。在一个实施方案中，进行至少约1-5mg/kg体重的PDX1的给药。在另一个实施方案中，经静脉系统或腹腔系统进行PDX1的给药。在另一个实施方案中，所述方法增加胰岛素水平至少约1-20倍。在另一个实施方案中，PDX1的给药增加Pdx1、INGAP、Reg3d、Reg3g、胰腺炎相关蛋白Pap、胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶、IAPP、胰岛素II、促生长素抑制素、NeuroD、Isl-1以及胰腺外分泌基因p48和淀粉酶中任何一种或多种的表达。

在又一些其他方面，本发明提供了宿主细胞(例如，成体细胞、胚胎干细胞、肝细胞或胰腺细胞)和药物组合物，所述宿主细胞包含AAV载体，所述药物组合物包含于药学上可接受的赋形剂中的有效量的所述载体或细胞。

在任何前述方面的多个实施方案中，所述细胞是下述任意一种或多种的成体细胞(例如肝细胞或肝脏衍生细胞)：脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞以及它们的祖细胞或干细胞。在又一些其他实施方案中，使所述细胞体外或体内接触。在任何前述方面的又一些其他实施方案中，改变是在相应的对照细胞中不可检测地表达的多肽水平的增加(例如5％、10％、25％、50％、75％、85％、95％或更多)。在又一些其他实施方案中，重编程细胞表达胰岛素。在任何前述方面的多个实施方案中，转录因子是Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA中的任何一种或多种。在又一些其他实施方案中，所述细胞是体外或体内接触的胚胎细胞或成体胰腺细胞。在任何前述方面的又一些其他实施方案中，所述接触增加了胰岛素生成细胞的数量。在其他实施方案中，所述接触通过复制或新生增加了再生。在其他实施方案中，所述方法还包括使所述细胞接触一种融合蛋白，所述融合蛋白包含Ngn3和蛋白转导结构域或其生物活性片段。在又一些其他实施方案中，所述方法还包括获得所述多肽的步骤。在任何前述方面的又一些其他实施方案中，所述给药方法提供了一种或多种胰腺转录因子的顺序给药，包括下述的任何一种或多种给药：进行有效量于细胞中的Pdx1蛋白的给药至少约0-4天(例如，0天、1天、2天、3天或4天)；进行接下来的Ngn3的给药，使得有效量的Ngn3存在至少约2-6天(例如，2天、3天、4天、5天或6天)；进行接下来的Pax4的给药，使得有效量的Pax4存在至少约4-8天(例如，4天、5天、6天、7天、8天)；持续进行Pdx1的给药，使得有效量的Pdx1维持于细胞中，其中在Pax4存在于细胞中的同时进行Pdx1的给药。

在任何前述方面的又一些其他实施方案中，所述融合蛋白含有或基本组成为作为早期因子或晚期因子(例如，Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6、MafA)的胰腺转录因子(例如人类或小鼠)。在又一些其他实施方案中，任何前述方面的所述融合蛋白与参考序列具有至少85％、90％或95％的同一性，其中序列比较是多肽或肽片段的总长度。

具体地，本发明提供了用于1型和2型糖尿病的蛋白治疗。从具体实施方式和权利要求来看，本发明的其他特征和优点将显而易见。

定义

“胰腺和十二指肠同源框-1(Pdx-1)多肽”是指与GenBank登录号NP_032840、AAI11593提供的序列或NM008814编码的序列具有至少85％同源性并且具有DNA结合或转录调控活性的蛋白或其片段。

“胰腺和十二指肠同源框-1(Pdx-1)”核酸序列是指编码PDX-1的核酸序列。典型的pdx-1核酸序列包括BC111592和NM_008814。

“NeuroD1多肽”是指神经原分化蛋白1或其片段，其与GenBank登录号NP_002491或NP_035024提供的序列具有至少85％同源性并且具有DNA结合或转录调控活性。

“NeuroD1核酸分子”是指编码NeuroD1多肽的多核苷酸或其片段。典型的NeuroD1核酸分子包括NM_002500和NM_010894。

“神经元素3(Neurogenin 3)多肽”是指与GenBank登录号AAK15022或AAI04328提供的序列具有至少85％同源性并且具有DNA结合或转录调控活性的蛋白或其片段。

“神经元素3核酸分子”是指编码神经元素3多肽或其片段的多核苷酸或其片段。典型的神经元素3核酸分子包括AF234829和BC 104327。

“Pax4多肽”是指与GenBank登录号AAI07151或NP_035168提供的序列具有至少85％同源性并且具有DNA结合或转录调控活性的蛋白或其片段。

“Pax4核酸分子”是指编码Pax4多肽的多核苷酸或其片段。典型的Pax4多肽包括NM_011038和BC107150。

“成体细胞”是指非衍生自胚胎或生殖细胞的体细胞。

“诱导再生”是指诱导细胞、组织或器官的发生。再生的方法包括但不限于新生、复制、细胞增殖、转分化，或涉及产生类似感兴趣的细胞的其他细胞的任何其他方法。

“蛋白转导结构域”是指促进蛋白进入细胞或细胞器的氨基酸序列。典型的蛋白转导结构域包括但不限于最小的十一氨基酸多肽(unidecapeptide)蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57)、包含足够引导进入细胞的多个精氨酸(例如，3、4、5、6、7、8或9个精氨酸)的聚精氨酸序列、VP22结构域(Zender等，Cancer Gene Ther.2002Jun；9(6)：489-96)，以及触角足蛋白转导结构域(Noguchi等，Diabetes(《糖尿病》)2003；52(7)：1732-1737)。另外，参见Nat Biotechnol.(《自然生物技术》)2001年12月；19(12)：1173-6。

“重编程”是指改变细胞使得在重编程细胞中产生在重编程之前在该细胞中(或在相应的对照细胞中)不产生的至少一种蛋白产物。通常，重编程细胞具有改变的转录或翻译模式，使得重编程细胞表达在重编程之前在该细胞中(或在相应的对照细胞中)不表达的一系列蛋白。

“肝脏衍生细胞”是指衍生自肝脏的任何细胞。这样的细胞包括肝细胞、肝脏干细胞、肝细胞的原代或永生培养物，或获得自肝脏的任何其他细胞。

“胰腺转录因子”是指在胰腺组织中表达的任何转录因子。典型的胰腺转录因子包括但不限于Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2(小鼠NM_010919、NP_035049，人类C075092、AAH75092)、Nkx6.1(小鼠NP_659204、AF357883，人类P78426、NM_006168)、Isl1(小鼠NM_021459、NP_067434，人类NM_002202、NP_002193)、Pax6(小鼠BC036957、AAH36957，人类NP_000271、BC011953)，以及MafA[(v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A)(人类NP_963883、NM_201589，小鼠NP_919331、NM_194350)]。

“转分化”是指细胞中这样一种变化，即使得转分化的细胞表达通常在该细胞中不表达的至少一种感兴趣的蛋白的变化。例如，转分化为胰岛素生成细胞表型的肝细胞表达胰岛素或胰高血糖素。

“VP16激活结构域”是指当其与感兴趣的序列拼接时增加转录的衍生自单纯疱疹病毒的氨基酸序列。典型的VP16激活结构域描述于例如Sadowski，I.，Ma，J.，Triezenberg，S.和Ptashne，M.(1988)。GAL4-VP16 is anunusually potent transcriptional activator.(GAL4-VP16是一种显著有效的转录激活因子。)Nature(《自然》)335，563-564；和Triezenberg，S.J.，Kingsbury，R.C.和McKnight，S.L.(1988).Functional dissection of VP16(VP16的功能性剖析)，the trans-activator of herpes simplex virus immediateearly gene expression.(单纯疱疹病毒即早基因表达的反转激活因子)，Genes Dev.(《基因与发育》)2，718-729。图18G显示了一种典型的VP16激活结构域。

“改变”是指基因或多肽的表达水平变化(增加或减少)，如通过如上所述的那些本领域已知的标准方法所检测的。如本文所使用的，改变包括表达水平变化10％，优选表达水平变化25％，更优选变化40％，以及最优选变化50％或更大。

“类似物”是指具有参考多肽或核酸分子的功能的结构相关的多肽或核酸分子。

“化合物”是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽，或其片段。

在该公开内容中，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等具有美国专利法中赋予它们的含义，且可指“囊括”、“涵盖”等，“基本由......组成”、“基本组成为”等具有美国专利法中赋予它们的含义，该术语为开放式的，允许多于所引用的事项的存在，只要所引用的事项的基本或新颖特征不因多于所引用的事项的存在而改变，但排除现有技术的实施方案。

“可检测的标记物”是指当与感兴趣的分子连接时，使得后者可经分光镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，通常用于ELISA的酶)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原。

“标记的核酸或多肽”是这样的核酸或多肽：即通过连接键或化学键与标记物共价连接，或通过离子键、范德华力、静电吸引、疏水相互作用或氢键与标记物连接，使得核酸或探针的存在可通过检测与所述核酸或探针连接的标记物的存在而检测的核酸或多肽。

“有效量”是指相对于未治疗的患者改善疾病的症状所需要的制剂的量。用于实施本发明来治疗性治疗疾病的活性化合物的有效量根据给药的方式、受治疗者的年龄、体重以及一般健康状况而不同。最终，主治医师或兽医将决定合适的量和给药方案。这样的量被称为“有效”量。

“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。该部分包含参考核酸分子或多肽的整个长度的优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。

“融合蛋白”是指合并至少两个非天然连续的氨基酸序列的蛋白质。

“同一性”是指感兴趣的序列和参考序列之间的氨基酸或核酸序列的同一性。序列同一性通常使用序列分析软件(例如，威斯康辛大学生物技术中心基因计算机组的序列分析软件包(威斯康辛大学麦迪逊分校大学路1710号，53705)，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量。这些软件通过将同源性程度分配至不同的置换、删除和/或其他修饰而将同一或相似的序列进行配对。保守置换通常包括下列组内的置换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天门冬氨酸，谷氨酸，天门冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。在确定同一性程度的一个典型的方法中，使用BLAST程序，e^-3和e^-100之间的概率分值表示密切相关的序列。

“杂交”是指于不同的严谨性条件下在互补多核苷酸序列(例如，表1和2中所列的基因)或其部分之间配对形成双链分子。(见，例如Wahl，GM.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152：399；Kimmel，A.R.(1987)Methods Enzymol.152：507)。

例如，严谨的盐浓度通常为小于约750mM的NaCl和75mM的枸橼酸钠，优选小于约500mM的NaCl和50mM的枸橼酸钠，以及最优选小于约250mM的NaCl和25mM的枸橼酸钠。低严谨性杂交可在不存在有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下获得，而高严谨性杂交可在至少约35％甲酰胺的存在下，最优选至少约50％甲酰胺的存在下获得。严谨的温度条件通常包括至少约30℃的温度，更优选至少约37℃，以及最优选至少约42℃。不同的其他参数，诸如杂交时间、洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载体DNA的包含或排除为本领域技术人员公知。不同的严谨性程度通过合并所需的这些不同条件而实现。在一个优选的实施方案中，在30℃于750mM NaCl、75mM枸橼酸钠以及1％SDS中进行杂交。在一个更优选的实施方案中，在37℃于500mMNaCl、50mM枸橼酸钠、1％SDS、35％甲酰胺以及100μg/ml变性的鲑精DNA(ssDNA)中进行杂交。在一个最优选的实施方案中，在42℃于250mMNaCl、25mM枸橼酸钠、1％SDS、50％甲酰胺以及200μg/ml ssDNA中进行杂交。关于这些条件的有用的变更为本领域技术人员显而易见。

对于大多数应用来说，杂交之后的洗涤步骤还将在严谨性上不同。洗涤的严谨性条件可由盐浓度和温度来定义。如上所述，洗涤的严谨性可通过降低盐浓度或增加温度而增加。例如，洗涤步骤的严谨盐浓度优选为小于约30mM的NaCl和3mM的枸橼酸钠，最优选小于约15mM的NaCl和1.5mM的枸橼酸钠。洗涤步骤的严谨温度条件通常包括至少约25℃的温度，更优选至少约42℃，最优选至少约68℃。在一个优选的实施方案中，在25℃于30mM NaCl、3mM枸橼酸钠以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。在一个更优选的实施方案中，在42℃于15mM NaCl、1.5mM枸橼酸钠以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。在一个最优选的实施方案中，在68℃于15mMNaCl、1.5mM枸橼酸钠以及0.1％SDS中进行洗涤步骤。关于这些条件的其他变更为本领域技术人员显而易见。杂交技术为本领域技术人员公知，且描述于例如Benton和Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(《美国科学院院刊》)72：3961，1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology(《现代分子生物学实验技术》)，Wiley Interscience，纽约，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques(《分子克隆技术指南》)，1987，学术出版社，纽约)；以及Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆实验室手册》)，冷泉港实验室出版社，纽约。

“增加或减少”是指积极或消极的改变。这样的改变为参考值的5％、10％、25％、50％、75％、85％、90％或甚至100％。

“分离的核酸分子”是指脱离基因的核酸(例如DNA)，其在本发明的核酸分子所来源的生物的天然存在的基因组中侧邻该基因。其术语包括例如掺入载体的重组DNA；掺入自动复制质粒或病毒的重组DNA；或掺入原核或真核生物的基因组DNA的重组DNA；或作为独立于其他序列的分离的分子存在的重组DNA(例如，通过PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组片段或cDNA片段)。另外，该术语包括自DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽”是指与天然伴随的组分分离的本发明的多肽。通常，当所述多肽至少60％重量脱离蛋白质和天然伴随的天然存在的有机分子时被分离。在一个实施方案中，制备物为至少75％、85％、90％、95％或至少99％重量的本发明多肽。本发明的分离的多肽可通过下述方式获得：例如，从天然来源提取，通过编码这样的多肽的重组核酸表达，或通过化学合成蛋白质。可通过任何合适的方法来测量纯度，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。

“标志物”是指具有与疾病或紊乱相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。

“基质”是指提供一种或多种细胞的存活、增殖或生长的介质。在一个实施方案中，基质是包含可生物降解的介质的细胞支架。

“天然存在”是指在生物体细胞中内源性表达。

“获得多肽”中的“获得”是指合成、购买或其它方式获取多肽。

“可操作地连接”是指第一多核苷酸被定位邻近第二多核苷酸，当合适的分子(例如转录激活蛋白)结合所述第二多核苷酸时所述第二多核苷酸指导所述第一多核苷酸的转录。

“多肽”是指任何氨基酸链，不管长度或翻译后修饰。

“被定位用于表达”是指本发明的多核苷酸(例如DNA分子)被定位邻近DNA序列，指导该序列的转录和翻译(即，促进例如本发明的重组多肽或RNA分子的产生)。

“启动子”是指足够指导转录的多核苷酸。典型的启动子包括位于翻译起始位点上游(例如，立即上游)的具有100、250、300、400、500、750、900、1000、1250以及1500个核苷酸长度的核酸序列。

“受治疗者”是指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫。

如本文所使用的，术语“治疗”是指减轻或改善紊乱和/或与其相关的症状。应理解，尽管未排除，但治疗紊乱或异常状况不需要所述紊乱、异常状况或与其相关的症状完全消除。“改善”是指减轻、抑制、减小、减弱、遏制或稳定疾病的发展或进展。

如本文所使用的，术语“预防”、“预防性治疗”等是指减小不患有病症或异常状况但处于患有紊乱或异常状况的危险中或易于发展紊乱或异常状况的受治疗者发展紊乱或异常状况的概率。

“参考”是指标准或对照条件。

附图说明

图1A和1B是示意图。图1A显示了胰岛转录因子在发育中的胰腺内分泌分化中的作用的简化模型。各TF的推荐位置基于其表达时间点和显著的功能性作用的时间点或二者皆有。图1B显示了蛋白转导结构域(PTD)融合蛋白的结构。

图2A、2B和2C显示了通过考马斯蓝染色(图2A)的PTD-Ngn3-V5融合蛋白，使用抗V5抗体(1∶5000)的蛋白质印迹(Western blot)(图2B)，和通过考马斯蓝染色的有或无PTD结构域的PTD-Ngn3-V5融合蛋白。细菌裂解物存在于第1和第2泳道中，Ni-NTA纯化的PTD-Ngn3-V5融合蛋白存在于第3泳道中，通过箭号指示它们的位置。

图3A至3D显示了PTD-Ngn3融合蛋白的分析。图3A是显示分析融合蛋白的细胞转导时程的蛋白质印迹。图3B包括显示已转导融合蛋白的培养物中的细胞的两张显微照片。左侧为使用相差显示的细胞，右侧为使用荧光显示的细胞。荧光图像显示PTD-Ngn3融合蛋白的细胞间局限化。图3C显示了PTD-Ngn3在培养基中的稳定性。图3D是蛋白质印迹，显示了Ngn3融合蛋白保留其生物功能并能够诱导NeuroD和Pax4靶基因表达。

图4A和4B是显示可溶和不可溶的PTD-Ngn3融合蛋白纯化的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。

图5A和5B是分别显示Pdx1和PTD-PDX1融合蛋白纯化的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶和曲线图。图5B显示可溶的PTD-Pdx1融合蛋白的腹腔内注射恢复糖尿病小鼠的血糖量正常。

图6是曲线图，显示血糖攻击试验对于接受PTD-Pdx1融合蛋白腹腔内注射的糖尿病小鼠的影响、对于接受PTD-GFP融合蛋白的对照糖尿病小鼠的影响或对于正常小鼠的影响。PTD-Pdx1融合蛋白腹腔内注射恢复了糖尿病小鼠响应血糖攻击(二乘线)的能力。

图7A和7B显示了PTD-Pdx-1蛋白腹腔内注射对于90％胰切除术小鼠的血糖水平的作用。图7A是曲线图，显示了接受PTD-Pdx1注射的小鼠表现在接受注射的几天内血糖水平降低。当所述融合蛋白的注射停止时，该作用最终消失。图7B包括两张显微照片，显示了经腹腔内注射给药至糖尿病小鼠的PTD-Pdx1VP16促进胰腺β细胞再生。从接受PTD-GFP(图7B-a)或PTD-Pdx1-VP16(图7B-b)的小鼠所取的胰腺切片使用抗pHH3(磷光体-组蛋白H3蛋白，红色)抗体和抗胰岛素(绿色)抗体进行双免疫染色。通过Dapi染色以蓝色突显细胞核。图7B-a和7B-b显示许多阳性染色的有丝分裂细胞存在于接受PTD-Pdx1-VP16或Pdx1注射的小鼠的胰腺胰岛内(箭号)和胰岛外。相比之下，在接受PTD-GFP注射的小鼠的胰岛内(图7B-a，箭号)未观察到有丝分裂(染色)细胞，且在胰岛外稀有细胞。

图8是曲线图，显示了PTD-Pdx1VP16融合蛋白的腹腔内注射改善链唑霉素(Stz)诱导的糖尿病小鼠的高血糖。

图9是曲线图，显示了PTD-Pdx1VP16融合蛋白和PTD-Ngn3融合蛋白的腹腔内注射逆转链唑霉素(Streptozotocin)诱导的糖尿病小鼠的高血糖。

图10A和10B是显微照片，显示了PTD-Pdx1-VP16蛋白的腹腔内注射促进胰腺β细胞的稳健再生。图10A显示了在完整胰腺切片中胰岛素免疫染色突显的胰岛素阳性的胰岛β细胞。图10B显示了在不同尺寸(小到大)的胰岛中胰岛素免疫染色的高倍镜视图。某些仅显示单个的胰岛素⁺细胞。

图11A-11D是显微照片。图11A显示了胰腺的胰岛β细胞中的胰岛素染色。图11B显示了胰岛素阳性细胞存在于接受PTD-Pdx1-VP16融合蛋白腹腔内注射的小鼠肝脏中。图11C是显示第二抗体对照的切片，显示染色为特异性。图11D显示了无胰岛素染色存在于接受PTD-GFP对照融合蛋白腹腔内注射的小鼠的肝脏切片。

图12显示了接受PTD-Pdx1-VP16和PTD-Ngn3腹腔内注射的小鼠在注射后第27天的肝脏切片中胰岛素生成细胞(IPC)的四张显微照片。不同的生成胰岛素的肝细胞存在于肝脏切片中(共1-2％)。

图13A和13B显示了AAV胰腺转录因子对链唑霉素诱导的糖尿病小鼠血糖水平的作用。图13A显示了在接受AAV-GFP注射(1×10⁸病毒颗粒)的小鼠肝脏切片中的GFP蛋白表达。约20％的肝细胞表达GFP蛋白，但分布不均匀。图13B是曲线图，显示了接受AAV-Ngn3门静脉注射的小鼠的血糖水平(三角形线)、接受AAV-Pdx-1-VP16门静脉注射的小鼠的血糖水平(菱形线)或接受AAV-Pdx-1-VP16和Ngn3门静脉注射的小鼠的血糖水平(正方形线)。在接受AAV-Pdx-1-VP16和Ngn3注射的小鼠中观察到协同作用。

图14显示了一只接受AAV-Pdx1-VP16门静脉注射(左小图)的小鼠和一只接受AAV-Ngn3门静脉注射(右小图)的小鼠(各1×10⁸的病毒颗粒)的肝脏切片中的胰岛素阳性细胞。大多数IPC分布于肝包膜下。

图15显示了一只接受AAV-PV/AAV-Ngn3门静脉注射(各1×10⁸的病毒颗粒)的小鼠的肝脏切片中存在胰岛素阳性细胞。左上，胰岛阳性对照。

图16包括四张显微照片，显示了一只接受AAV-PV/AAV-Ngn3门静脉注射的小鼠的肝脏切片中的胰高血糖素免疫染色。

图17A和17B为示意图，显示了胰腺转录因子的顺序表达。

图18A-18I为胰腺转录因子的氨基酸和核酸序列。

图19A和19B显示了腹腔内注射后rPdx1的体内动力学和组织分布。图19A是显示血液Pdx1水平的动力学的蛋白质印迹。以rPdx1蛋白(100μg/只小鼠)腹腔内注射正常的Balb/c小鼠。在指定时间采集血液样品，将20μl血清/泳道装载于SPDS-PAGE凝胶内。使用抗抗体通过蛋白质印迹检测rPdx1蛋白。图19B显示了12幅小图，显示Pdx1的体内组织分布的免疫组织化学分析。在rPdx1(100μg/只小鼠)腹腔内注射之后1小时或24小时收获肝脏、胰腺以及肾脏组织，并且于10％福尔马林中固定。使用抗Pdx1抗体(1∶2000)对石蜡切片进行免疫染色。在治疗后1小时(上两行)和24小时(下三行)通过光学显微镜检查观察Pdx1蛋白在肝脏(1、4以及7)、胰腺(2、5以及8)以及肾脏(3、6以及9)器官中的典型分布模式。底行(10-12)是正常小鼠的肝脏、胰腺以及肾脏组织切片的Pdx1免疫染色。图1B-2的箭号表示具有强细胞核Pdx1免疫染色的胰腺中的小胰岛。

图19C是示意图，显示了用于产生本文所述的结果的实验性时间线。该时间线概括在这里。首先测试评价正常小鼠中血糖基线、葡萄糖攻击胰岛素释放(15分钟)、腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)以及肝脏和胰腺组织胰岛素。然后通过低剂量的链唑霉素5×腹腔内注射诱导小鼠成糖尿病。定期监测空腹血糖水平，并将两次连续读数大于250mg/dL的血糖水平定义为糖尿病(高血糖)。测量某些糖尿病小鼠的葡萄糖攻击的胰岛素释放，以评价这些糖尿病小鼠中的残留胰腺β细胞处理葡萄糖冲击的能力。使用纯化的Pdx1或PTD-GFP融合蛋白(100μg/只小鼠/次注射)每天一次腹腔内注射糖尿病小鼠连续10天，并以指定频率监测血糖水平。在蛋白注射的首剂后第14天左右、在IPGTT检测之后以及在IPGTT的15分钟采集血液样品后，处死两组中的某些小鼠。采集重要器官的组织，并分成三个份：一份速冻用于RT-PCR以检测基因表达，一份在10％福尔马林中固定用于免疫组织学研究，一份没入酸性乙醇中用于提取组织胰岛素。在所述融合蛋白的首次注射后约第30-35天内对于接近血糖量正常的小鼠实施次全胰切除术，并监测血糖水平。在蛋白治疗后40天和50天之间处死所有实验小鼠，并如上所述采集组织。变化样品采集独立地实施相似的动物实验六次。

图20A-20D显示了Pdx1蛋白对血糖水平的体内作用。图20A是曲线图，显示了在5×低剂量(50μg/g bw)链唑霉素腹腔内注射后被诱导成糖尿病(两个读数的空腹血糖水平250-300mg/dL)的Balb/c小鼠的血糖水平。将糖尿病小鼠随机分配至实验性rPdx1或GFP对照组中，并分别接受100μg Pdx1或GFP蛋白每天一次腹腔内注射，连续10天(红色横条)。使用血糖测计仪通过尾静脉抽血定期监测血糖水平。在首次注射后第14-15天和第40天处死某些小鼠。在首次注射后第14天和第40天左右在正常小鼠、GFP治疗的小鼠或rPdx1治疗的小鼠中进行IPGTT。在治疗后第30天左右在所选择的对照小鼠和rPdx1治疗的小鼠中进行次全胰切除术。图20B提供了两幅曲线图，显示了腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。在IPGTT之前至少8小时使小鼠空腹。腹腔内注射推注剂量的葡萄糖(1mg/gbw)，并在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟以及120分钟时检测正常小鼠(底部黑色线)、rPdx1治疗的小鼠(中间的灰色线)或GFP治疗的小鼠(顶部的灰色线)的血糖水平。图20C是显示血糖水平的曲线图，图20D显示了IPGTT之后在治疗后15分钟、第14天和第40天的胰岛素水平。如上所述监测小鼠血糖水平。在15分钟时采集正常小鼠和治疗的通过推注剂量(1mg/g bw)的葡萄糖腹腔内注射攻击的小鼠的血液样品。通过小鼠超敏感胰岛素ELISA试剂盒分析胰岛素水平。每组含有至少5只小鼠。

图21A-21D显示了Pdx1蛋白促进胰腺胰岛细胞再生。图21A提供了显示了胰岛素免疫组织化学的四幅小图。使用抗胰岛素抗体(1∶1000)对于来自以GFP(左)或rPdx1(右)治疗的小鼠的石蜡包埋胰腺组织的切片进行免疫染色。在10×(上面的小图)或40×(下面的小图)放大率获取典型图像。图21B显示了胰腺组织的胰岛素/胰高血糖素双免疫染色。使用兔抗胰高血糖素抗体/PE(红色)和豚鼠抗胰岛素抗体/FITC(绿色)对于GFP治疗的小鼠和rPdx1治疗的小鼠的胰腺组织的石蜡切片进行免疫染色，并在荧光显微镜术下观察。以40×放大率获取所有图像。图21C提供了两幅显示实时定量RT-PCR分析的曲线图。通过实时RT-PCR检测在rPdx1或GFP治疗(100μg/天，持续10天)后第14天和第40天时从糖尿病小鼠的胰腺组织提取的总RNA，和五种靶基因包括胰岛素、Pdx1、INGAPrP、Reg3γ和PAP的表达。使表达水平相对于β-肌动蛋白基因的表达校正正常。结果代表每组中至少3只个体小鼠。将相对的基因表达的倍数差异计算为rPdx1治疗的胰腺中靶基因表达的平均C_T值(与标准的肌动蛋白cDNA相比)和GFP治疗的胰腺样品中这些靶基因的平均C_T值(与标准的肌动蛋白cDNA相比)的比值。缩写：INGAPrP＝胰岛新生相关蛋白有关的蛋白；Reg3γ＝再生的胰岛衍生的3γ；PAP＝胰腺炎相关蛋白。图21D是显示琼脂糖凝胶中的实时PCR条带的琼脂糖凝胶。在琼脂糖凝胶中运行实时产物，以确认治疗后第14天和第40天的样品的尺寸和特异性(凝胶中的单个条带)。

图22A-22C显示了Pdx1蛋白促进肝细胞转分化为胰岛素生成细胞。图22A包括显示胰岛素免疫组织化学染色的九幅小图。使用抗胰岛素抗体(1∶250)在4C下过夜温育肝脏的石蜡切片。使用40×物镜获取图像。在治疗后第14天观察rPdx1治疗的小鼠的肝脏切片中的胰岛素阳性细胞。缩写：B.D.＝胆管，H.T.V.＝肝脏终末静脉，B，黑色箭号表示单个具有双核的表达胰岛素的肝细胞的核染色质凝聚特征。图22B显示了肝脏中胰腺基因的表达。通过琼脂糖凝胶电泳分析从正常小鼠、GFP治疗的小鼠或rPdx1治疗的小鼠提取的RNA的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增。从小鼠胰腺分离的RNA用作阳性对照。对于Ngn3RT-PCR分析，由于成体胰腺不表达该基因，Ngn3cDNA质粒(*)用作阳性对照。缩写：No RT＝未逆转录，D114或D40＝首次蛋白注射后第14天或第40天。图22C和22D为显示其他器官中胰腺基因的表达。通过RT-PCR检测从rPdx1治疗的糖尿病小鼠治疗后第14天的其他器官组织提取的总RNA和四种关键的胰腺基因(Pdx1、胰岛素、胰高血糖素以及淀粉酶)的表达。所有RT-PCR结果代表了在各特定组中至少三只个体小鼠，这些结果独立地重复三次。

图23A和23B为显示胰腺和肝脏组织胰岛素测量的曲线图。图23A显示了胰腺组织的胰岛素测量。使用正常小鼠(n＝4)或GFP(n＝4)或rPdx1(n＝5)经连续10天腹腔内注射治疗的糖尿病小鼠的各组用于该研究。在注射后第14天或第40天处死小鼠，并对完整的肝脏或胰腺进行称重，并采集用于提取组织胰岛素，以防止减小抽样变异。在酸性乙醇中提取组织胰岛素，并使用小鼠超敏感胰岛素ELISA试剂盒通过ELISA检测组织胰岛素。将胰腺中的组织胰岛素含量表示为每mg湿重胰腺组织的胰岛素的量(ng)。**＝(p＜0.05)和***＝(p＜0.001)。图23B显示了肝脏组织胰岛素测量。如上所述使用相同的方法提取肝脏组织胰岛素。将肝脏中的组织胰岛素含量表示为每mg湿重的肝脏组织的胰岛素的量(ng)。在第14天，rPdx1治疗的小鼠(n＝6)在第14天的肝脏胰岛素含量显著高于正常小鼠(n＝4)或GFP治疗的小鼠(n＝5)的肝脏胰岛素含量。**＝(p＜0.05)，***＝(p＜0.001)。

图24A-24C显示了小鼠Pdx1和PTD-GFP融合蛋白的克隆、表达、纯化以及表征。图24A显示了融合蛋白的产生。顶部小图表示小鼠Pdx1和PTD-GFP的融合蛋白的结构示意图。灰色框表示Pdx1蛋白中的触角足样蛋白转导结构域。将编码小鼠Pdx1或PTD-GFP的cDNA片段克隆至表达质粒中。表达蛋白并通过Ni柱纯化。底部小图显示了在10％SDS-PAGE凝胶中的纯化蛋白，并使用考马斯亮蓝R溶液染色(左小图)。泳道1表示分子量标志物；泳道2为Pdx1；泳道3为PTD-GFP。右小图是使用抗Pdx1抗体(泳道1)和抗his(组氨酸)标签抗体(泳道2)通过蛋白质印迹对融合蛋白的确认。分别通过箭头或箭号表示确认rPdx1和PTD-GFP融合蛋白。图24B显示了Pdx1蛋白的细胞进入的时程。使用Pdx1(1μM)温育WB细胞持续指定的时间，并使用PBS洗涤三次。分离细胞裂解物，并使用兔抗Pdx1抗体(1∶1000)或抗肌动蛋白抗体(1∶5000)通过蛋白质印迹进行探测。(B)通过光密度法对细胞的Pdx1蛋白的相对量进行定量。扫描条带获得它们的密度值，使用它们相应的管家蛋白肌动蛋白对这些数值进行标准化。将峰值读数定义为100％，通过最高读数除其余的数值，得到细胞Pdx1蛋白的相对量的比较。图24C显示了rPdx1蛋白的功能性分析。通过LV-pNeuroD-GFP报告基因转导WB细胞。在使用Pdx1蛋白或LV-Pdx1处理后72小时通过荧光显微术和流式细胞术来观察并定量表达pNeuroD-GFP报告基因的WB细胞。左小图显示表达pNeuroD-GFP的细胞在细胞离心涂片器载玻片上的荧光图像。右上部小图显示了流式点图，Ls；下部小图为显示表达GFP的细胞的百分率的直方图。结果代表了三个独立的实验。

图25A-25D显示了Pdx1的组织分布。使用rPdx1蛋白(1mg)腹腔内注射正常Balb/c小鼠，并在注射后1小时或24小时处死。使用抗Pdx1抗体(1∶1000，我们实验室制备的针对rPdx1蛋白的抗体)对正常小鼠或rPdx1注射的小鼠的组织切片进行免疫染色。图25A显示了对照小鼠的六份组织切片。在脑组织中具有背景细胞核染色，胰腺胰岛显示了Pdx1蛋白的阳性细胞核染色。图25B显示了rPdx1治疗的小鼠注射后24小时的六份组织切片。在注射后24小时，检测肝脏、胰腺以及肾脏切片中的rPdx1蛋白的最低量。脑、心脏以及脾脏的切片显示与无rPdx1注射的正常组织相似的背景染色。图25C包括了九幅小图，显示了rPdx1治疗(1mg)的小鼠注射后1小时的组织切片。检测到肾脏切片(1-2)的cap细胞和近端肾小管细胞中的强Pdx1免疫反应性，胰腺切片(3-4、7-9)的外分泌胰腺腺泡细胞的细胞核和细胞质中的强Pdx1免疫反应性，以及肝脏切片(5-6)的肝细胞的细胞核中的强Pdx1免疫反应性。图25D包括了三幅小图，显示了Pdx1治疗的糖尿病小鼠在注射后第14天的外分泌胰腺腺泡细胞中的胰岛素阳性细胞。

图26是琼脂糖凝胶，显示了正常小鼠肝脏中胰岛素I、胰高血糖素、Pdx1、淀粉酶以及辣根过氧化物酶的表达。

具体实施方式

本发明提供了用于治疗以感兴趣的细胞的数量或生物活性缺乏为特征的疾病、紊乱或损伤的治疗组合物和方法。在一个实施方案中，所述方法提供了用于重编程细胞(例如，成体细胞或胚胎干细胞)或用于增加感兴趣的细胞、组织或器官的再生的蛋白组合物(例如，含有蛋白转导结构域的融合多肽)。如果需要，所述组合物与提供本发明的治疗性多肽的持续表达的治疗性核酸分子进行联合给药。这些方法可用于治疗具有特定细胞类型缺乏或由该细胞类型产生的多肽缺乏的受治疗者。本发明至少部分基于下述观察结果：即通过使肝细胞接触与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子而使成体肝细胞重编程为胰岛素生成细胞而产生胰岛素生成细胞。另外，本发明提供了诱导胰腺细胞再生的组合物和方法。因此，本发明还提供了用于改善或预防1型和2型糖尿病相关的高血糖和有关并发症的预防性和治疗性方法和组合物。

胰腺转录因子

在胚胎发育过程中内分泌胰岛细胞的分化和成熟是由独特的基因调控模式控制的复杂过程(见图1A)。已知众多胰腺转录因子(PTF)在确定可见于胰腺的不同细胞类型中起着重要作用。在这些转录因子中，胰腺和十二指肠同源基因-1(Pdx-1)对于编码区分肝脏和胰腺的关键蛋白具有最大的可能性。在胚胎发生过程中，在向外分泌和内分泌胰腺分化的所有祖细胞中表达的Pdx-1(Soria，Differentiation(《分化》)，2001；68(4-5)：205-219；Hui等，Eur J Endocrinol，(《欧洲内分泌学杂志》)，2002；146(2)：129-141)在正常胰腺发育中起着重要作用。确实，在Pdx-1敲除小鼠中不存在胰腺组织。人类中缺乏功能性Pdx-1蛋白导致胰腺发育不全。在成体中，Pdx-1表达限于β细胞和约20％的δ细胞，它在胰岛素基因表达中起关键作用(Soria，《分化》，2001；68(4-5)：205-219；Hui等，《欧洲内分泌学杂志》，2002；146(2)：129-141)。

其他PTF在发育中的胰腺中的内分泌细胞中选择性表达，在发育中的胰腺中，所述其他PTF在内分泌细胞命运决定中起作用。这些胰腺转录因子含有同源异型结构域，并能够分化为在内分泌祖细胞中共表达的包括神经元素3(Ngn3)、Nkx2.2和Nkx6.1的早期因子和可见于较成熟的细胞中的晚期因子(Pax4、Pax6和Isl-1)(Soria，《分化》，2001；68(4-5)：205-219；Wilson等，Mech Dev(《发育机理学》)，2003；120(1)：65-80)。在胰腺发育过程中，基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Ngn3在内分泌祖细胞中瞬时表达，并直接调控β2/NeuroD。Ngn3控制多能胰腺内胚层祖细胞的内分泌细胞命运决定(Gradwohl等，《美国科学院院刊》，2000；97(4)：1607-1611；Gu等，Development(《发育学》)2002；129(10)：2447-2457；Schwitzgebel等，《发育学》，2000；127(16)：3533-3542)。β2/NeuroD是Ngn3直接下游靶基因的bHLH蛋白β2/NeuroD。β2/NeuroD在胰腺内分泌细胞中表达并激活胰岛素基因转录。Pax4和Pax6是在发育中的肠和成体胰腺中均表达的两种同源异型结构域蛋白，其中它们在确定不同细胞类型中起作用。Pax4是生成胰岛素的β细胞和生成促生长素抑制素的δ细胞的晚期分化中的关键因子(Sosa-Pineda等，《自然》，1997；386(6623)：399-402)。Pax4在发育中的β细胞中瞬时表达，并且通过自动调控关闭(Sosa-Pineda等，《自然》，1997；386(6623)：399-402)。使用Pax4转染小鼠胚胎干细胞与使用Pdx-1转染的细胞相比，导致IPC显著增加(Blyszczuk等，《美国科学院院刊》，2003；100(3)：998-1003)。相比之下，Pax6为生成胰高血糖素的α细胞发生中所需要(St Onge等，《自然》，1997；387(6631)：406-409)。Nkx2.2和Nkx6.1在胰腺细胞的发育中起作用，它们具有相似的基因表达模式(Sander等，《基因与发育》，1997；11(13)：1662-1673)。因为无内分泌细胞存在于Isl-1敲除小鼠中，Isl-1为胰岛细胞的分化所需要(Ahlgren等，《自然》，1997；385(6613)：257-260)。

因为胰腺转录因子诸如Pdx1和Ngn3对于干细胞或祖细胞分化为胰腺内分泌细胞的定型施加上游控制(Ahlgren等，《自然》，1997；385(6613)：257-260)，以及Pax4对于内分泌前体细胞定型成胰岛β细胞施加第二波，这些胰腺转录因子可用于细胞重编程(例如，成体细胞或胚胎干细胞)。在一个实施方案中，将不能表达胰岛素的成体细胞转化成胰岛素生成细胞。例如，如本文所报道，胰腺转录因子用于从肝脏衍生细胞或肝脏干细胞产生胰岛素生成细胞。转录因子通常被认为是不具有从一个细胞转移至另一个细胞能力的细胞溶质蛋白。最近，有证据表明某些转录因子作为旁分泌信号传导分子起作用。这样的转录因子通常包括蛋白转导结构域。最近报道，PDX-1蛋白含有可转导胰管和胰岛细胞的触角足样蛋白转导结构域(Noguchi等，《糖尿病》，2003；52(7)：1732-1737)。蛋白质工程可用于提供包括一个或多个蛋白转导结构域的其他转录因子。

蛋白转导结构域

蛋白转导结构域是使蛋白质能够穿过细胞和核膜转移而导致通过非典型分泌和内化途径进入胞质溶胶的短肽序列(Joliot等，Nat Cell Biol(《自然细胞生物学》)，2004；6(3)：189-196)。在1988年，Green和Loewenstein发现1型人类免疫缺乏病毒(HIV-1)TAT蛋白(一种86个氨基酸的蛋白)能够快速进入细胞，且甚至能够进入细胞核(Green和Loewenstein PM.Cell(《细胞》)1988；55(6)：1179-1188)。Dowdy和共同工作者们基于该观察结果开发了最小的十一氨基酸多肽蛋白转导结构域(对应于HIV-1TAT的残基47-57)(Schwarze等，Science(《科学》)，1999；285(5433)：1569-1572)。该十一氨基酸多肽序列成功用于经腹腔内注射至小鼠将NH2末端TAT-β半乳糖苷酶融合蛋白(120kDa)递送至小鼠组织(Schwarze等，《科学》，1999；285(5433)：1569-1572)。TAT-β半乳糖苷酶融合蛋白保留了生物活性。该常用方法现在已经成功用于转导多种蛋白。如通过使用荧光的直接标记或通过使用抗体的间接免疫荧光所评估的，含有PTD的肽或蛋白在5分钟内以低至100nM的浓度被细胞摄取。该摄取不依赖于细胞内吞机制、跨膜蛋白通道以及蛋白受体结合。另外，体外研究已经确认蛋白转导结构域介导的转移在低温下发生，并且不表现强烈的细胞特异性。

重组多肽表达

本发明提供了可用于治疗糖尿病和其他与感兴趣的细胞的数量或生物活性缺乏有关的疾病、紊乱或损伤的基于蛋白的治疗方法。通常，基于蛋白的治疗剂包括可操作地连接蛋白转导结构域的转录因子，其中，所述蛋白转导结构域能够作为允许生物活性转录因子进入细胞的“分子通行证”。转录因子可重编程细胞。重编程的细胞具有改变的转录和/或翻译模式，即，表达一系列改变的mRNA和/或多肽(相对于未治疗的对照细胞表达的)。

如下文更详细描述的，实际上任何感兴趣的转录因子可与蛋白转导结构域融合且可用于蛋白治疗。有利地，这样的融合蛋白可在体外或体内被递送至细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白用于体外接触细胞，使得该细胞摄取所述融合蛋白。接下来，将该细胞给药至受治疗者用于治疗目的。可选地，将本发明的融合蛋白原位给药至细胞、组织或器官，使得该细胞、组织或器官摄取所述融合蛋白以实现治疗目的。在一个操作实施方案中，本发明的融合蛋白是可操作地连接蛋白转导结构域的胰腺转录因子。当该融合蛋白接触肝细胞、肝干细胞或其他体细胞(例如，胰腺祖细胞、胰腺干细胞、胰岛细胞、内分泌细胞或外分泌细胞)时，重编程该细胞以产生胰岛素和/或胰高血糖素。在另一个实施方案中，与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子增加胰腺细胞(例如胰腺祖细胞、胰腺干细胞、胰岛细胞、内分泌细胞或外分泌细胞)的再生能力。这种再生能力的增加通常导致胰岛素产生增加，使得高血糖受治疗者中的恢复血糖量正常。理想地，胰岛素产生相对于参考量(例如，在治疗前产生的量或在未治疗的对照中产生的量)增加至少约1、2、3、4、5倍，或至少约10、12、15或20倍。

使用本领域技术人员已知的几乎任何方法制备本发明的重组融合多肽。通常，通过使用于合适的表达载体中的全部或部分编码多肽的核酸分子或其片段转化合适的宿主细胞来产生重组多肽。分子生物学领域的那些技术人员应理解许多种表达系统中的任何种类可用于提供重组蛋白。所使用的确切宿主细胞对于本发明来说并不重要。本发明的多肽可在原核宿主(例如大肠杆菌(E.coli))或在真核宿主(例如酿酒酵母，昆虫细胞，例如Sf21细胞，或哺乳动物细胞，例如NIH 3T3，HeLa，或优选COS细胞)中产生。这些细胞可自广泛来源获得(例如马里兰州罗克兰市美国典型培养物保藏中心；还可参见，例如，Ausube等，《现代分子生物学实验技术》，纽约：John Wiley和Sons，1997)。转化或转染的方法和表达载体的选择取决于所选择的宿主系统。转化和转染方法描述于例如Ausubel等，(见上文)；表达载体可选自例如《克隆载体：实验手册》(P.H.Pouwels等，1985，Supp.1987)中提供的那些。

具有多种用于产生本发明多肽的表达系统。可用于产生所述多肽的表达载体包括但不限于染色体载体、附加型载体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(诸如杆状病毒，乳多空病毒，诸如SV40、痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，伪狂犬病毒和逆转录病毒)的载体，以及衍生自它们的组合的载体。

用于多肽产生的一种特定的细菌表达系统是大肠杆菌pET表达系统(例如pET-28)(Novagen，Inc.，Madison，Wis)。根据该表达系统，将编码多肽的DNA以设计成允许表达的方向插入pET载体中。由于编码这样的多肽的基因在T7调控信号的控制下，所述多肽的表达通过诱导T7RNA聚合酶在宿主细胞中的表达而实现。这通常通过使用响应IPTG诱导而表达T7RNA聚合酶的宿主菌株而实现。重组多肽一旦产生，便根据本领域已知的标准方法例如本文描述的那些分离。

用于多肽产生的另一种细菌表达系统是pGEX表达系统(Pharmacia)。该系统应用被设计用于高水平表达基因或基因片段为融合蛋白的GST基因融合系统，快速纯化和恢复功能性基因产物。感兴趣的蛋白与来自日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S-转移酶蛋白的羧基末端融合，使用谷胱甘肽Sepharose 4B通过亲和层析容易自细菌裂解物纯化。通过使用谷胱甘肽洗脱可在温和条件下回收融合蛋白。谷胱甘肽S-转移酶结构域上游的位点特异性蛋白酶的识别位点的存在促进该结构域自所述融合蛋白的裂解。例如，在pGEX-2T质粒中表达的蛋白可使用凝血酶裂解，在pGEX-3X中表达的那些可使用因子Xa裂解。

可选地，本发明的重组多肽在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，一种甲基营养型酵母)中表达。毕赤酵母能够代谢作为唯一碳源的甲醇。甲醇代谢的第一步是甲醇被酒精氧化酶氧化成甲醛。AOX1基因编码的该酶的表达受甲醇诱导。AOX1启动子可用于可诱导的多肽表达，或者GAP启动子可用于感兴趣的基因的组成型表达。

一旦本发明的重组多肽被表达，便使用例如亲和层析进行分离。在一个实施例中，针对本发明的多肽产生的抗体(例如，如本文所述制备的)可附着于柱子并用于分离重组多肽。携带多肽的细胞在亲和层析之前的裂解和分级可通过标准方法实施(参见，例如，Ausubel等，见上文)。可选地，使用结合镍柱的序列标签诸如六组氨酸标签分离多肽。

如果需要，一旦重组蛋白被分离，便通过例如高效液相层析进一步纯化(参见，例如，Fisher，《生物化学和分子生物学实验技术》(LaboratoryTechniques In Biochemistry and Molecular Biology)，Work、Burdon和Elsevier编辑，1980)。本发明的多肽特别短肽片段还可通过化学合成而产生(例如，通过Solid Phase Peptide Synthesis(《固相肽合成》)，第二版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford，I11.中描述的方法)。这些常用的多肽表达和纯化技术还可用于产生和分离有用的肽片段或类似物(本文所述的)。

转录因子/蛋白转导结构域融合多肽和类似物

本发明还包括以增强其重编程细胞能力或其诱导再生能力的方式而修饰的转录因子/蛋白转导结构域融合多肽或其片段。在其他实施方案中，序列的变化增加蛋白的溶解性或产率。例如，本发明提供了一种具有增强的重编程肝脏衍生细胞为胰岛素生成细胞的能力的修饰的胰腺转录因子融合蛋白。在其他实施例中，所述修饰的胰腺转录因子融合蛋白增加胰腺细胞的再生能力。可选地，所述改变位于蛋白转导结构域中，所改变的结构域增加可操作地连接的蛋白向细胞或细胞腔隙诸如细胞核中的转运。在其他实施方案中，蛋白转导结构域中的改变减少对可操作地连接的多肽的生物活性的干扰。

本发明提供了通过产生序列中的改变而优化转录因子或蛋白转导结构域氨基酸序列或核酸序列的方法。这样的改变可以包括某些突变、删除、插入或翻译后修饰。本发明还包括本发明的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可通过氨基酸序列差异、翻译后修饰或通过这两种方式而不同于本发明的天然存在的多肽。本发明的类似物通常表现与所有或部分本发明的天然存在的氨基酸序列具有至少85％、更优选90％、最优选95％或甚至99％的同一性。序列比对的长度为至少5、10、15或20个氨基酸残基，优选至少25、50或75个氨基酸残基，更优选超过100个氨基酸残基。另外，在确定同一性程度的典型方法中，可使用BLAST程序，e^-3和e^-100之间的概率分值表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如，乙酰化、羧基化、磷酸化或糖基化，这些修饰可在多肽合成或加工过程中或在使用分离的修饰酶处理之后发生。类似物还可通过基本序列的改变而不同于本发明的天然存在的多肽。这些包括天然和诱导的基因变异，(例如，通过辐照或暴露于甲基磺酸乙酯(ethanemethylsulfate)的随机诱变或通过位点特异性诱变产生，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，《分子克隆：实验手册》(第二版)，冷泉港出版社，1989，或Ausubel等，(见上文)所描述)。还包括含有不同于L氨基酸的残基(例如D氨基酸)，或天然存在的或合成的氨基酸(例如β或γ氨基酸)的环化的肽、分子和类似物。

除了全长的多肽，本发明还提供了本发明多肽或肽结构域的任何一者的片段。如本文所使用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在其他的实施方案中，片段为至少20个连续的氨基酸，至少30个连续的氨基酸，或至少50个连续的氨基酸，在其他实施方案中，至少60-80、100、200、300个或更多连续的氨基酸。本发明的片段可通过本领域技术人员已知的方法产生，或可从正常的蛋白加工而产生(例如从新生多肽去除不为生物活性所需的氨基酸，或通过可选的mRNA剪接或可选的蛋白加工事件去除氨基酸)。

非蛋白转录因子/蛋白转导结构域融合类似物具有被设计成模拟融合蛋白功能活性的化学结构。根据本发明的方法进行这些类似物的给药。融合蛋白类似物可超过原始的融合多肽的生理活性。类似物设计的方法为本领域公知，类似物的合成可根据这些方法通过修饰化学结构而实施，使得产生的类似物增加参考转录因子/蛋白转导结构域融合多肽的重编程或再生活性。这些化学修饰包括但不限于取代可选的R基团和使参考融合多肽的特定碳原子的饱和度变化。优选地，融合蛋白类似物相对地对体内降解具有抵抗力，给药后导致持续时间较长的治疗作用。用于测量功能活性的分析方法包括但不限于下文实施例中描述的那些。

试验化合物和提取物

通常，根据本领域已知的方法从天然产物或合成(或半合成)的提取物的大文库或化学文库或来自多肽或核酸文库来鉴定具有重编程活性或诱导再生活性的融合多肽。可将这些候选多肽或编码它们的核酸分子修饰成包括蛋白转导结构域。然后筛选所述修饰的多肽的所需活性。药物发现和开放领域的技术人员应理解，试验提取物或化合物的确切来源对于本发明的筛选程序来说并非关键。在筛选中使用的试剂可包括已知的化合物(例如，已知的用于其他疾病或紊乱的多肽治疗剂)。可选地，实际上任何数量的已知化学提取物或化合物可使用本文所述的方法进行筛选。这些提取物或化合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵液和合成的化合物，以及现有多肽的修饰。

细菌、真菌、植物以及动物提取物形式的天然多肽的文库可从多种来源商购获得，包括Biotics(Sussex，UK)，Xenova(Slough，UK)，HarborBranch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，Fla.)，以及PharmaMar，U.S.A.(Cambridge，Mass.)。这些多肽可使用本领域已知的和本文所述的方法修饰成包括蛋白转导结构域。另外，如果需要，根据本领域已知的方法，例如通过标准的提取和分级方法制备天然和合成地产生的文库。用于合成分子文库的方法的实例可见于现有技术，例如，DeWitt等，《美国科学院院刊》90：6909，1993；Erb等，《美国科学院院刊》91：11422，1994；Zuckermann等，J.Med.Chem.《医学化学》37：2678，1994；Cho等，《科学》261：1303，1993；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(《德国应用化学》)33：2059，1994；Carell等，《德国应用化学》33：2061，1994；以及Gallop等，《医学化学杂志》37：1233，1994。另外，如果需要，任何文库或化合物使用标准的化学、物理或生物化学方法容易地修饰。

多种方法也可用于产生任何数量的多肽、化合物包括但不限于基于糖、脂质、肽和核酸的化合物的随机或定向合成(例如半合成或全合成)。合成的化合物文库可从Brandon Associates(Merrimack，N.H.)和AldrichChemical(Milwaukee，Wis.)商购获得。可选地，用作候选化合物的化合物可使用本领域技术人员已知的标准合成技术和方法自容易获得的原料合成。可用于合成通过本文所述的方法鉴定的化合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)为本领域已知，包括例如下述参考文献中描述的那些：R.Larock，Comprehensive Organic Transformations(《有机官能团转换》)，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(《有机合成的保护性基团》)，第二版，John Wiley和Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′sReagents for Organic Synthesis(《费兆和费兆的有机合成试剂》)，JohnWiley和Sons(1994)；以及L.Paquette编辑，Encyclopedia of Reagents forOrganic Synthesis(《有机合成试剂百科全书》)，John Wiley和Sons(1995)，以及它们的后续版本。

化合物的文库可呈现于溶液(例如，Houghten，Biotechniques(《生物技术》)13：412-421，1992)，或珠(Lam，《自然》，354：82-84，1991)、芯片(Fodor，《自然》，364：555-556，1993)、细菌(Ladner，美国专利第5,223,409号)、芽胞(Ladner，美国专利第5,223,409号)、质粒(Cull等，《美国科学院院刊》89：1865-1869，1992)或噬菌体(Scott和Smith，《科学》249：386-390，1990；Devlin，《科学》249：404-406，1990；Cwirla等，《美国科学院院刊》87：6378-6382，1990；Felici，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)222：301-310，1991；Ladner，见上文)。

另外，药物发现和开发领域的技术人员容易理解其活性已知的材料的去复制(例如，分类学去复制，生物学去复制，和化学去复制，或它们的任何组合)或复制物或重复子消除的方法应在任何可能的时候应用。

当粗提取物被发现具有重编程或再生诱导活性时，阳性导向提取物的进一步分级为分离负责所观察的作用的分子组分所需要的。因此，提取、分级和纯化工艺的目的是仔细表征和鉴定粗提取物内重编程细胞(例如，成体细胞或胚胎干细胞)或增强再生的化学个体。这些异质提取物的分级和纯化方法为本领域已知。如果需要，根据本领域已知的方法对显示可用作治疗剂的化合物进行化学修饰。

治疗方法

本发明提供了具有细胞数量缺乏(例如胰腺细胞数量减少)或细胞生物活性水平不足(例如，胰岛素产生缺乏)相关的疾病和紊乱的治疗方法。例如，本发明提供了用于治疗由于生成胰岛素的胰腺细胞的数量或活性减少而缺乏足够水平的胰岛素的糖尿病患者的组合物。多种与细胞数量缺乏相关的疾病具有细胞死亡增加的特征。这些疾病包括但不限于神经退行性紊乱、中风、心肌梗塞或缺血性损伤。与创伤相关的损伤还可导致支持伤口的区域中细胞数量的缺乏。本发明的方法通过产生可弥补该缺乏的细胞(例如，心肌细胞、神经细胞、表达胰岛素的细胞)而改善这些疾病、紊乱或损伤。通过一种细胞重编程为感兴趣的细胞类型(例如，肝细胞重编程为胰岛素生成细胞)或通过促进细胞、组织或器官再生而产生这些细胞。一般地，本发明提供了一种用于细胞重编程的方法，所述方法涉及：使细胞(例如，脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞以及它们的祖细胞或干细胞)接触包含融合或含有蛋白转导结构域的转录因子多肽或其片段的融合蛋白；并改变所述细胞中至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种多肽的表达水平，由此使所述细胞重编程。

在一个实施方案中，将含有蛋白转导结构域的融合多肽或多肽原位给药至细胞、组织或器官以改善细胞数量缺乏。可选地，将所述多肽体外给药至细胞，然后将含有所述多肽(或编码它们的核酸分子)的细胞给药至患者以改善疾病、紊乱或损伤。将所述多肽以可被细胞摄取的形式递送至这些细胞，使得转导足够水平的蛋白，以改善疾病或紊乱。在一个实施方案中，将治疗性多肽或融合多肽局部递送至其中需要增加再生或其中需要细胞重编程的位点。给药可为足以导致足够水平的细胞转导的任何方式。尽管特定水平的转导根据要实现的治疗目的而不同，但理想地组织的至少2％、5％、10％或15％的细胞被转导。在其他实施方案中，至少25％、35％或50％的细胞被转导。在又一些其他实施方案中，至少75％、85％、95％或更多的细胞被转导。优选地，多肽的水平被改变至少约5％、10％、25％、50％、75％或更多。

在多个实施方案中，通过局部注射至疾病或损伤部位、通过持续输注或通过在外科手术条件下显微注射进行融合多肽的给药(Wolff等，《科学》247：1465，1990)。在其他实施方案中，将所述融合多肽全身地给药至具有可通过细胞再生或重编程改善的细胞数量缺乏的患者的组织或器官。

在另一个方法中，通过将本发明的融合多肽离体转移至离体可培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其子代)中而实现至患者的受累组织中的细胞转导，之后将细胞(或其子代)注射至疾病或损伤部位的靶组织中。在某些实施方案中，细胞位于提供其存活、增殖或生物活性的细胞基质中。本发明包括的另一种治疗方法涉及进行重组治疗融合多肽、其生物活性片段或变异体的给药。

本发明提供了治疗疾病和/或紊乱或其症状的方法，所述方法包括将治疗有效量的含有本发明化合物的药物组合物给药至受治疗者(例如，哺乳动物，诸如人类)。因此，一个实施方案是一种治疗患有或易患以细胞数量缺乏为特征的疾病或紊乱或其症状的受治疗者的方法。该方法包括在使得疾病或病症受治疗的条件下将足以治疗疾病或病症或其症状的治疗量的本发明组合物给药至哺乳动物的步骤。

在其他实施方案中，使用病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒)载体在细胞中转导而产生本发明的治疗性多肽，所述病毒载体尤其因为它们的高效感染和稳定的整合和表达而用于体细胞基因治疗(见，例如，Cayouette等，Human Gene Therapy(《人类基因治疗》)

8：423-430，1997；Kido等，Current Eye Research(《现代眼科研究》)15：833-844，1996；Bloomer等，Journal of Virology(《病毒学杂志》)71：6641-6649，1997；Naldini等，《科学》272：263-267，1996；以及Miyoshi等，《美国科学院院刊》94：10319，1997)。例如，可将编码本发明治疗性蛋白的核酸分子或其部分克隆至逆转录病毒载体中，且可由其内源性启动子、由逆转录病毒长末端重复或由感兴趣的靶细胞类型(例如，中枢神经系统的细胞)的特异性启动子而驱动表达。其他可使用的病毒载体包括例如痘苗病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，诸如EB病毒(Epstein-Barr Virus)(还可参见例如以下参考文献的载体：Miller，《人类基因治疗》15-14，1990；Friedman，《科学》244：1275-1281，1989；Eglitis等，BioTechniques(《生物技术》)6：608-614，1988；Tolstoshev等，CurrentOpinion in Biotechnology(《生物技术新见》)1：55-61，1990；Sharp，TheLancet(《柳叶刀》)337：1277-1278，1991；Cornetta等，Nucleic Acid Researchand Molecular Biology(《核酸研究和分子生物学》)36：311-322，1987；Anderson，《科学》226：401-409，1984；Moen，Blood Cells(《血液细胞》)17：407-416，1991；Miller等，《生物技术》7：980-990，1989；Le Gal La Salle等，《科学》259：988-990，1993；以及Johnson，Chest(《胸科》)107：77S-83S，1995)。逆转录病毒载体特别地得以很好地开发，且已经用于临床环境中(Rosenberg等，N.Engl.J.Med(《新英格兰医学杂志》)323：370，1990；Anderson等，美国专利第5,399,346号)。最优选地，病毒载体用于感兴趣的基因全身给药或将感兴趣的基因给药至需要细胞重编程或增加再生的部位的细胞。

本发明的方法包括将有效量的本文所述的融合多肽或本文所述的组合物给药至受治疗者(包括鉴定为需要这样的治疗的受治疗者)，以产生所述作用。鉴定需要这样的治疗的受治疗者可以在受治疗者或卫生保健专业人员的判断下，并且可以是主观(例如，主张)或客观的(例如可通过检验或诊断方法而测量的)。

本发明的治疗方法(包括预防性治疗)一般包括将治疗有效量的本发明化合物诸如本发明化合物给药至有需要的受治疗者(例如动物、人类)，包括哺乳动物，特别是人类。这样的治疗合适地给药至患有、易感疾病、紊乱或其症状或处于疾病、紊乱或其症状的危险中的受治疗者，特别是人类。那些受治疗者“处于......的危险中”的确定可以通过受治疗者或卫生保健提供者的诊断性检验或意见而进行的任何客观或主观确定(例如，基因检验、酶或蛋白标志物，标志物(如本文所定义的)、家族史等)。本发明的组合物还可用于其中涉及细胞数量缺乏的任何其他紊乱的治疗。

在一个实施方案中，本发明提供了一种监测治疗进展的方法。该方法包括确定患有或易感具有细胞数量缺乏相关的疾病或其紊乱的受治疗者的诊断性标志物(标志物)(例如，本文所述的由本发明化合物调控的任何靶，蛋白或其指示物，等)或诊断性测量(例如，筛选、分析)的水平的步骤，其中所述受治疗者已经进行了足以治疗该疾病或其症状的治疗量的本发明的化合物的给药。在该方法中确定的标志物的水平可以与健康正常对照或其他患病的患者的标志物的已知水平进行比较，以确定受治疗者的疾病状况。在优选的实施方案中，在迟于确定受治疗者的标志物的第一水平的时间点确定所述标志物的第二水平，并且将该两种水平进行比较以监测病程或治疗效果。在某些优选的实施方案中，在根据本发明开始治疗之前确定受治疗者的标志物的治疗前水平，然后在开始治疗之后将该标志物的治疗前水平与受治疗者的标志物的水平进行比较，以确定治疗效果。

胰腺转录因子多核苷酸治疗

本发明还提供了用于在通常不表达胰腺转录因子的细胞、组织或器官中持续表达所述蛋白的方法。如果需要，病毒载体(例如腺病毒相关病毒载体)用于持续表达Pdx-1和/或NeuroD多肽或融合多肽(例如，PTD-Pdx-1、PTD-NeuroD)。如果需要，这些病毒载体可以联合本发明的融合多肽而给药。有利地，含有胰腺转录因子和蛋白转导结构域的融合多肽仅瞬时出现在细胞中，而腺病毒相关病毒载体中表达的多肽或融合多肽持续表达。具有编码Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6或MafA蛋白、其变异体或片段的多核苷酸(例如，AAV表达载体，诸如AAV-2载体)特征的多核苷酸治疗是一种用于治疗高血糖的治疗方法。这些核酸分子可给药至患有高血糖(例如，与1型或2型糖尿病有关的高血糖)的受治疗者的细胞。所述核酸分子必须以它们可被摄取的形式给药至受治疗者的细胞，使得可产生治疗有效水平的胰腺转录因子，诸如Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1或Pax6或其片段。优选地，胰岛-1、Pdx1、neuroD、Nkx6.1或MafA多肽(例如PTD融合多肽)的持续表达维持在有效水平超过1周、2周、3周或超过1个月、3个月、6个月或12个月。如果需要，胰腺转录因子的持续表达与Ngn3和/或Pax4多肽(例如PTD融合多肽)的瞬时存在结合。

转导病毒(例如，逆转录病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒)载体尤其因为它们的高效感染和稳定的整合和表达而可用于体细胞基因治疗(参见，例如，Cayouette等，《人类基因治疗》8：423-430，1997；Kido等，《现代眼科研究》15：833-844，1996；Bloomer等，《病毒学杂志》71：6641-6649，1997；Naldini等，《科学》272：263-267，1996；以及Miyoshi等，《美国科学院院刊》94：10319，1997)。例如，可将编码胰腺转录因子蛋白、其变异体或其片段的多核苷酸克隆至逆转录病毒载体中，且可由其内源性启动子、由逆转录病毒长末端重复或由感兴趣的靶细胞类型的特异性启动子而驱动表达。其他可使用的病毒载体包括例如痘苗病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，诸如EB病毒(还可参见例如以下参考文献的载体：Miller，《人类基因治疗》15-14，1990；Friedman，《科学》244：1275-1281，1989；Eglitis等，《生物技术》6：608-614，1988；Tolstoshev等，《生物技术新见》1：55-61，1990；Sharp，《柳叶刀》337：1277-1278，1991；Cornetta等，《核酸研究和分子生物学》36：311-322，1987；Anderson，《科学》226：401-409，1984；Moen，Blood Cells 17：407-416，1991；Miller等，《生物技术》7：980-990，1989；Le Gal La Salle等，《科学》259：988-990，1993；以及Johnson，《胸科》107：77S-83S，1995)。逆转录病毒特别地得以很好地开发，且已经用于临床环境中(Rosenberg等，《新英格兰医学杂志》323：370，1990；Anderson等，美国专利第5,399,346号)。在一个实施方案中，腺病毒相关病毒载体(例如，血清型2)用于将多核苷酸给药至肝脏或肝叶。

非病毒方法也可用于将治疗剂导入需要调控高血糖的患者的细胞。例如，可通过在脂质转染的存在下进行核酸给药(Feigner等，《美国科学院院刊》84：7413，1987；Ono等，Neuroscience Letters(《神经科学通讯》)17：259，1990；Brigham等，Am.J.Med.Sci.(《美国医学科学杂志.》298：278，1989；Staubinger等，Methods in Enzymology(《酶学方法》)101：512，1983)，通过在非唾液血清类粘蛋白-聚赖氨酸共轭的存在下进行核酸给药(Wu等，Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)263：14621，1988；Wu等，《生物化学杂志》264：16985，1989)或在外科手术条件下通过显微注射(Wolff等，《科学》247：1465，1990)进行核酸给药而将核酸分子导入细胞。在一个实施方案中，核酸联合脂质体和鱼精蛋白进行给药。

基因转移还可通过使用涉及体外转染的非病毒方式而实现。这样的方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔以及原生质体融合。脂质体还可潜在地有益于将DNA递送至细胞中。将正常基因植入至患者的受影响的组织中还可通过将正常核酸转移至可离体培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其子代)之后将细胞(或其子代)注射至靶组织或通过导管递送。

用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并由任何合适的哺乳动物调控元件调控。例如，如果需要，已知优先指导特定细胞类型(例如，肝细胞、肝干细胞或其他肝脏衍生细胞)基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。所使用的增强子可包括但不限于被表征为组织特异性或细胞特异性的增强子的那些。可选地，如果基因组克隆用作治疗构建体，调控可通过同源调控序列介导，或者，如果需要，通过来自异源来源的调控序列介导，包括上述的任何启动子或调控元件。

本发明包括的另一种治疗方法涉及将重组治疗剂诸如重组胰腺转录因子蛋白或其融合蛋白、变异体或片段直接给药至潜在的或实际的患病组织的部位，或给药至其中所述多肽将具有治疗作用的器官，或者全身给药(例如，通过任何传统的重组蛋白给药技术)。所给药的蛋白的剂量取决于多种因素，包括个体患者的尺寸和健康状况。对于任何特定的受治疗者，具体的给药方案应根据个体需要和进行组合物给药或监督组合物给药的人员的专业判断而随时间调整。

多肽和多核苷酸治疗剂

本发明提供了一种用于鉴定能够作为用于治疗以为细胞数量或生物活性缺乏为特征的疾病或紊乱的治疗剂的组合物(包括胰腺转录因子、蛋白转导结构域/融合多肽、其片段，编码这些蛋白、肽、小分子抑制剂以及模拟物的核酸分子)的简单方法。因此，使用本文所述的方法进行鉴定通过将细胞重编程为另一种细胞类型或促进再生的多肽，诸如转录因子或被发现具有医学价值的其他制剂。这样的多肽可用作治疗剂或用作用于现有多肽的结构修饰的信息，例如通过推理性药物设计。这些方法可用于筛选对以感兴趣的细胞类型缺乏为特征的多种异常状况有效的制剂。

对于治疗用途，使用本文公开的方法鉴定的融合多肽可例如配制于药学上可接受的缓冲液诸如生理盐水中进行全身给药。优选的给药途径包括，例如，提供药物在患者中的连续、维持水平的皮下、静脉内、腹腔内、肌肉内或皮内注射。使用于生理学上可接受的载体中的治疗有效量的多肽或核酸分子治疗剂而实施人类患者或其他动物的治疗。合适的载体和它们的配制描述于，例如，E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Sciences(《雷明顿氏药物科学》)。要给药的治疗剂的量根据给药方式、患者的年龄、体重以及细胞缺乏的临床症状而不同。通常，(给药)量在用于治疗其他疾病的其他治疗性多肽或蛋白治疗剂的范围内。在一个实施方案中，以下述剂量进行本发明的融合多肽的给药：即控制通过本领域技术人员已知的诊断方法或使用测量胰腺转录因子多肽的表达或生物活性(诸如靶基因的表达)的任何分析方法确定的高血糖的临床或生理性症状的剂量。在一个实施方案中，以至少约1-5mg/Kg体重或至少约5μg/g体重、0.1mg/20g体重或1mg/20g的有效量进行本发明的组合物的给药。在其他实施方案中，进行至少约0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg或20mg/kg的本发明的多肽治疗剂的给药。

药物组合物的配制

用于治疗以细胞数量缺乏为特征的疾病、紊乱或损伤的本发明组合物的给药可通过下述方式进行：即导致与其他组分组合有效改善、减轻或稳定所述疾病的所述治疗剂的浓度的任何合适的方式。例如，减少或正常化受治疗者血糖水平的量。治疗性多肽、多核苷酸或包含这些制剂的细胞可以以任何合适的量包含在任何合适的载体物质中，并可以以占组合物总重量的1-95％(按重量)的量提供。可以以适于胃肠外(例如，皮下、静脉内、肌肉内或腹腔内)给药途径的剂型提供所述组合物。可以根据传统药学习惯配制所述药物组合物(参见，例如，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》)(第20版)，A.R.Gennaro，Lippincott Williams以及Wilkins编辑，2000；和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(《制药工艺学百科全书》，J.Swarbrick和J.C.Boylan编辑，1988-1999，Marcel Dekker，New York)。理想地，所述多肽可被修饰或配制成增强多肽半衰期、增加吸收或提供持续释放。

可以将根据本发明的药物组合物配制成当给药时基本立即或在给药后的任何预定时间或时间段释放活性化合物。已知后面的组合物类型通常作为控释制剂，其包括：(i)经延长的时间段产生体内的基本恒定药物浓度的制剂；(ii)在预定的延迟时间之后，经延长的时间段产生体内的基本恒定药物浓度的制剂；(iii)在预定的时间段通过维持体内的相对、持续、有效水平而持续起作用的制剂，其具有与活性物质(锯齿形动力学模式)的血浆水平波动有关的伴随的最低程度不想要的副作用；(iv)通过例如邻近腹腔或于腹腔腔内或在其中需要所述组合物分布的其他部位空间放置控释组合物来使作用局部化的制剂；(v)允许方便给药使得例如每1-2天一次或每1-2周一次给药剂量；以及(vi)通过使用载体或化学衍生物将治疗剂给药至患有疾病、紊乱或损伤的受治疗者的功能受干扰的特定细胞类型(例如，肝细胞或胰腺细胞)而靶向疾病、紊乱或损伤的制剂。对于某些应用来说，控释制剂消除了为维持血浆水平在治疗水平而在当天频繁给药的需要。

可寻求多种策略中的任何策略以获得其中释放速率超过讨论的化合物的代谢速率的控释。在一个实施例中，通过合适地选择多种配制参数和成分包括例如多种类型的控释组合物和包衣而获得控释。因此，将治疗剂与合适的赋形剂一起配制成当给药时以控制方式释放治疗剂的药物组合物。其实例包括单个单元或多个单元的片剂或胶囊组合物、油剂溶液、悬浮液、乳剂、微囊、微球、分子络合物、纳米颗粒、贴剂以及脂质体。

如果需要，将本发明的治疗组合物与增强感兴趣的细胞再生或增强感兴趣的细胞重编程的其他制剂一起提供。在一个实施方案中，所述制剂是生长因子，诸如可溶的生长因子。例如，将治疗性多肽、多核苷酸或含有这些制剂的细胞与可溶的生长因子诸如PDGF、EGF、VEGF、bFGF、HGF、NGF、KGF一起提供，或与β细胞促进因子诸如尼克酰胺、exentin4、GLP-1、β细胞调节素(betacellulin)、胰岛新生相关蛋白(INGAP)或Ghrelin一起提供。

给药方法

所述药物组合物可通过以含有传统的非毒性药学上可接受的载体和佐剂的剂型、制剂或经合适的给药装置或植入剂通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌肉内、腹腔内等)。在一个实施方案中，经渗透泵提供本发明的治疗性组合物。这样的组合物的配制和制备为药物配制领域的技术人员公知。其配制可见于《雷明顿：药物科学与实践》，见上文。

胃肠外应用的组合物可以以单位剂型(例如，单剂量安瓿)或以含有几个剂量和其中可添加合适防腐剂的小瓶(见下文)中提供。所述组合物可以是溶液、悬浮液、乳剂、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或其可作为在使用前使用水或其他合适的载体重新溶解的干粉提供。除了活性多肽治疗剂外，所述组合物还可包括合适的胃肠外可接受的载体和/或赋形剂。所述活性多肽治疗剂可掺入至用于控释的渗透泵、微球、微囊、纳米颗粒、脂质体等中。另外，所述组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张度调节剂和/或分散剂。

如上所述，根据本发明的药物组合物可以是适于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将合适的活性融合多肽治疗剂溶解或悬浮于胃肠外可接受的液体载体中。可以应用的可接受的载体和溶剂有水、可通过添加合适量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至合适pH的水、1，3-丁二醇、林格氏溶液以及等渗氯化钠和葡萄糖溶液。含水制剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在化合物中的一种仅少量或轻微溶解于水的情况中，可添加促溶剂或增溶剂，或者溶剂可包括10-60％w/w的丙二醇等。

在一个实施方案中，局部经导管提供本发明的治疗性组合物(例如，多肽、多核苷酸或含有这些制剂的细胞)。例如，为了使肝脏衍生细胞重编程为胰岛素生成细胞，经门静脉将本发明的组合物提供至肝脏。更优选地，通过将所述组合物提供(例如，经导管)至门静脉的三个分枝的仅一个分枝，而将组合物尤其靶向肝脏的单个叶，使得肝脏的仅一个叶包含胰岛素生成细胞。在其他实施方案中，经渗透泵提供本发明的组合物。理想地，渗透泵经1-3天、3-5天、5-7天或2、3、4或5周提供所述组合物的控释。

联合治疗

如果需要，本发明的组合物可联合本发明的任何其他多肽或多核苷酸(包括辅助监测蛋白治疗功效的可检测地标记的融合蛋白)或本领域已知的任何传统治疗剂给药。在一个实施方案中，本发明的融合多肽，诸如与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子，用于减轻糖尿病受治疗者的高血糖。该治疗作用甚至在该治疗方法不完全消除患者对胰岛素的依赖的情况下也是合乎需要的。因此，本发明的融合多肽可以与胰岛素一起给药以改善高血糖或其症状或并发症。理想地，本发明的治疗性融合多肽减轻患者对胰岛素的依赖至少约5％、10％或15％，更理想地至少约20％、25％，或甚至30％，或甚至更理想地50％、75％、85％，或更多。在其他实施方案中，所述多肽治疗剂与本发明的多核苷酸(例如，编码胰腺转录因子或融合多肽的多核苷酸)联合。在其他实施方案中，本发明的组合物联合饮食、体重减轻或口服胰岛素治疗剂、可注射的胰岛素治疗剂、鼻腔胰岛素治疗剂或其他的胰岛素治疗剂，以减少和/或正常化血糖水平。本发明的联合可以配制在一起且同时给药或可以相互间在24小时内、2天、3天或5天内或1周、2周、3周或5周内给药。

药盒或药物系统

本发明的组合物可以组装成用于改善高血糖的药盒或药物系统。根据本发明该方面的药盒或药物系统包含携带工具，例如箱、硬纸盒、试管等，其中具有一种或多种封闭限制形式的容器，诸如小瓶、试管、安瓿、瓶子等。本发明的药盒或药物系统还可以包含用于使用本发明制剂的相关说明书。

除非特别指明，本发明的实践应用了在本领域技术人员范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术。这些技术在下列参考文献中得以完整解释：诸如“分子克隆：实验手册”，第二版(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)”(Gait，1984)；“Animal Cell Culture(动物细胞培养)”(Freshney，1987)；“《酶学方法》”“Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)”(Weir，1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)”(Miller和Calos，1987)；《现代分子生物学实验技术》(Ausubel，1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链式反应)”(Mullis，1994)；“Current Protocols inImmunology(现代免疫学实验技术)”(Coligan，1991)。这些技术适用于制备本发明的多核苷酸和多肽，这样，可以被考虑用于实施和实践本发明。用于具体实施方案的特别有用的技术在下文的部分中讨论。

实施例

本文所述的研究提供了蛋白转导结构域融合蛋白(包括蛋白转导结构域(PTD)胰腺转录因子(PTF)融合蛋白)的治疗性和/或预防性用途。在一个实施方案中，PTD-PTF融合蛋白用于指导肝细胞的重编程或转分化为胰腺内分泌前体细胞或其他胰岛素生成细胞。本发明的PTD-PTF用于逆转糖尿病受治疗者的高血糖。简而言之，本发明提供了具有或无11个氨基酸的TAT蛋白转导结构域(PTD)的编码PTF融合基因(Pdx1、Pdx1-VP16、Ngn3和Pax4)的构建体。这些构建体已用于产生和纯化在体内具有生物活性的PTD-Ngn3、Ngn3以及Pax4融合蛋白。本发明提供了用于监测转分化过程的组合物和方法，包括用于分析以细胞水平和分子水平存在的转分化事件的颜色编码的PTF报告基因。将肝细胞重编程为肝脏衍生的胰腺前体细胞(接下来在细胞移植之后成熟为功能性胰腺细胞β细胞样胰岛素生成细胞)并且恢复糖尿病小鼠的血糖量正常的可行性受到糖尿病小鼠中胰腺转录因子转基因表达的病毒介导的表达的支持。有利地，本发明的Ngn3和Pax4融合蛋白仅在本文所述的细胞中瞬时存在。该瞬时存在足以生成肝脏衍生的调节葡萄糖的完全功能性胰岛素生成细胞。

本文所述的研究提示本发明提供了相对于提供Ngn3和Pax4持续表达的方法的某些优点。具体地，慢病毒介导的Ngn3持续表达导致肝细胞脱离细胞循环并经历细胞凋亡，而在表达Pdx1-VP16的IPC中的LV介导的Pax4持续表达导致被植入的小鼠的严重高血糖和死亡。

实施例1：含有蛋白转导结构域的Ngn3融合蛋白(PTD-Ngn3)

图1B中提供了显示典型的含有蛋白转导结构域(PTD)的融合蛋白的结构的示意图。尽管以一种特定结构显示不同结构域的取向，但这仅作为一个例子而提供。其他组合和结构在本发明的范围内。具体地，PTD结构域可定位在多肽的羧基末端或氨基末端或任何其他位置。

使用pCR T7/CT-TOPO表达质粒(Invitrogen)产生PTD-Ngn3-V5-His标签或Ngn3-V5-His标签融合蛋白。因为抗His标签抗体也识别许多富有组氨酸的蛋白，pCRT7/CT-TOPO质粒也编码V5表位，提供了使用高质量、可商购获得的抗V5抗体选择性检测重组蛋白的优点。简而言之，使用含有PTD(YGRKKRRQRRR)序列的引物，将编码小鼠Ngn3的整个阅读框的cDNA用于产生PCR产物。(所有PCR产物通过在佛罗里达大学DNA中心实验室(University of Florida DNA Core Facility)测序而得以确认)。将PTD-Ngn3和Ngn3PCR产物克隆至表达质粒pCRT7/CT-TOPO质粒(Invitrogen)中，使得产生V5和his标记的融合蛋白。将所产生的载体命名为pCR-PTD-Ngn3-V5-His或pCR-Ngn3-V5-His(PTD阴性对照)。最终的cDNA以下列顺序编码肽序列：PTD(11aa)-Ngn3(214aa)-V5表位(14aa)-His标签(6aa)。所产生的融合多肽保留Ngn3的生物功能。

尽管描述了含有特定蛋白转导结构域(PTD)的融合蛋白，本领域技术人员理解本发明不限于此。各结构域的位置因增强例如蛋白在宿主细胞中的生物活性、转导、可溶性或表达而不同。例如，PTD结构域可存在于多肽的羧基端或氨基端，或可位于分子内的任何位置。

实施例2：PTD-Ngn3-V5-His融合蛋白的制备和纯化

为了制备所需的融合蛋白，在含有氨苄西林(100μg/m1)的LB培养基中于37℃培养使用pCR-PTD-Ngn3-V5-His或pCR-Ngn3-V5-His质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞至OD₆₀₀0.5(对数中期)。通过持续4小时添加0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。收获诱导的细胞并通过于裂解缓冲液(Invitrogen)中声处理裂解。根据制造商的说明，使用Ni-NTA凝胶柱(Invitrogen)纯化可溶的PTD-Ngn3或Ngn3融合蛋白，然后使用PD10柱(Amersham)脱盐。通过考马斯蓝染色观察纯化的蛋白(图2A和2C)，并使用抗V5抗体(图2B)通过蛋白质印迹分析确认。将蛋白等分在含有10％甘油的PBS中，储存于-80℃直至使用。纯化的PTD-Ngn3和Ngn3融合蛋白(图2C)显示了分子量的轻微差异(图2C)

实施例3：含有PTD结构域的Ngn3融合蛋白的功能性特征

为了评价PTD融合蛋白穿透细胞的能力，实施了PTD-Ngn3转导的时程。使用含有纯化的PTD-Ngn3融合蛋白(0.2μM)的培养基温育WB细胞(一种大鼠肝脏上皮干细胞样克隆细胞系(Tsao等，Exp.Cell Res.，154，38-52，1984)不同的时间段，使用PBS洗涤三次，并收获于2×SDS样品缓冲液中。使用抗V5抗体通过蛋白质印迹检测PTD-Ngn3-V5融合蛋白(图3A)。该分析的结果表明由PTD结构域介导的蛋白转导在2小时时达到顶峰。为了观察该过程，根据制造商的说明(Pierce)使用FITC标记纯化的PTD-Ngn3融合蛋白。以0.2μM的终浓度将PTD-Ngn3-V5-*FITC添加至WB细胞，持续2小时。缺乏PTD的Ngn3融合蛋白未能进入细胞。图3B显示＞70％的细胞在细胞质和细胞核中均含有FITC标记的融合蛋白。为了确定PTD-Ngn3融合蛋白在细胞培养基中的稳定性，将所述融合蛋白(0.2μM)添加至WB细胞，并在指定时间去除等分的培养基。使用抗V5抗体通过蛋白质印迹检测融合蛋白(图3C)。尽管蛋白水平减少，但在24小时时，PTD-Ngn3蛋白仍旧存在于培养基中。图4A和4B显示了纯化的可溶的和不可溶的PTD-Ngn3融合蛋白的质量。

为了确定PTD-Ngn3是否可激活为下游靶基因的NeuroD和Pax4，使用LV-Ngn3(MOI＝20)或PTD-Ngn3(0.2μM，每6个小时添加新鲜的PTD-Ngn3)处理人类Huh7细胞持续4天。提取RNA，并进行RT-PCR。图3D显示了LV-Ngn3和PTD-Ngn3蛋白处理之间NeuroD和Pax4(下游靶基因)的Ngn3激活的等同的效力。这些结果表明具有生物活性的PTD-Ngn3融合蛋白产生且该蛋白可通过抗V5抗体检测到。

实施例4：PTD-Pdx1-VP16(PTD-PV)或PTD-Pdx1-VP16/PTD-Ngn3腹腔 内注射恢复糖尿病小鼠的血糖水平

Pdx1作为胰腺的“主要”调控基因而起作用。每天一次使用his标签纯化的可溶的PTD-Pdx1融合蛋白或PTD-GFP融合蛋白(100μg/只小鼠)注射链唑霉素诱导的糖尿病小鼠，持续10天，每隔一天通过尾静脉抽血监测血糖水平。图5A和5B显示了这些实验的结果。图5A显示了用于注射的纯化的蛋白，图5B显示了可溶的Pdx1蛋白的多次腹腔内注射将高血糖逆转至接近正常血糖。在接受PTD-GFP注射的对照小鼠中未观察到对血糖水平的作用。

对正常小鼠、PTD-GFP融合蛋白注射的小鼠和PTD-Pdx1融合蛋白注射的小鼠进行腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)(图6)。使用PTD-Pdx1融合蛋白注射的小鼠显示相对于正常小鼠(菱形)的几乎正常的IPGTT曲线(正方形)。相比之下，接受PTD-GFP的小鼠不能降低额外剂量的葡萄糖。这些结果表明可溶的Pdx1融合蛋白的腹腔内注射降低了糖尿病小鼠的血糖水平，且这些结果具有统计显著性。不希望受理论限制，PTDPdx1融合蛋白进入胰腺细胞并促进胰腺β细胞再生是可能的，可选地，在PTD Pdx1融合蛋白被转移至肠系膜脉管系统(毛血细管、小静脉以及淋巴道)中之后经门静脉运输系统进入肝细胞之后可促进肝细胞转分化为胰岛素生成细胞。

为了确定胰腺β细胞再生是否在恢复血糖量正常中起作用，在接受可溶的PTD Pdx1融合蛋白注射的小鼠中进行了胰切除术。该手术去除了＞90％的胰腺。在手术后监测血糖水平。给小鼠提供胰岛素每天一次注射(PID)且以100μg剂量每天一次提供可溶的Pdx1融合蛋白，持续5天。监测血糖水平。图7A显示了在该小鼠中观察到的高血糖的快速反跳。通过重复的腹腔内PTD Pdx1融合蛋白注射实现血糖量正常。鉴于通过胰切除术去除90％的胰腺导致持续的高血糖，这些结果是令人惊讶的。图7B表明Pdx1或PTD-Pdx1-VP16腹腔内注射促进胰腺胰岛细胞再生。组蛋白H3(一种与染色质结构有关的蛋白)，在有丝分裂中的染色质凝聚过程中尤其被磷酸化(在丝氨酸10)。磷酸基-组蛋白H3(pHH3)的抗体用作检测细胞中有丝分裂活性的可靠方法。

在另一个实验中，使用纯化的可溶的PTD-PV或PTD-PV/PTD-Ngn3融合蛋白每天腹腔内注射患有链唑霉素诱导的糖尿病的两只小鼠(50μg/只小鼠)，持续5天。Pdx1-VP16是Pdx1的激活形式(Pdx1-VP16)。每两天监测小鼠血糖水平一次。在注射后第27天处死小鼠。

图8和9显示了小鼠血糖水平的变化。如图8所示，在糖尿病小鼠的注射后小于3周，可溶的PTD-Pdx1-VP16腹腔内注射将血糖水平从约400mg/dl降低至约200mg/dl。另外，PTD-PV/PTD-Ngn3联合显示了在2周内将血糖水平从约385mg/dl降低至200mg/dl的协同作用(图9)。两只小鼠的体重稳定。

实施例5：胰腺β细胞再生

为了检查所观察的血糖水平降低的机制，处死小鼠，将胰腺、肝脏、脾脏、肾脏、心脏以及肺脏固定于10％甲醛中，用于组织学检查。图10A和10B显示了对PTD-Pdx1-VP16注射的小鼠胰腺的胰岛素免疫染色的结果。这些结果表明在这些注射的小鼠胰腺中具有强有力的胰腺β细胞的再生。相似的结果见于PTD-PV/PTD-Ngn3注射的小鼠胰腺。图10A显示了包括完整胰腺胰岛β细胞的胰腺的典型切片。图10B显示了新再生的胰岛在尺寸上不同，具有许多小胰岛。大多数新再生的胰岛接近或邻近胰管，表明β细胞新生的存在。某些单个分散的胰岛素阳性β细胞邻近外分泌腺，提示外分泌细胞转分化为内分泌β细胞。胰腺β细胞再生的一个机制是残留的β细胞复制。

实施例6：促进肝细胞转分化为胰腺内分泌细胞包括胰岛素生成细胞

对肝脏进行切片，并使用抗胰岛素抗体进行免疫染色。图11A-11D显示了在接受PTD-Pdx1-VP16可溶蛋白注射的小鼠的肝脏切片(图11B)中可观察到的分散的胰岛素阳性细胞。在接受PTD-GFP融合蛋白的小鼠的肝脏切片(D)中未检测到胰岛素阳性细胞。还在接受注射的PTD-Pdx1-VP16/PTD-Ngn3融合蛋白的小鼠的肝脏切片(图12)中通过抗胰岛素抗体检测到分散的胰岛素阳性细胞。这些结果表明小鼠血糖水平的降低归因于由PTD-PTF(Pdx1-VP16或Pdx1-VP16/Ngn3)介导的胰腺β细胞再生和肝细胞至内分泌胰腺转分化。

这些结果表明：修饰的胰腺“主要”调控基因、可溶的PTD-Pdx1-VP16蛋白或可溶的PTD-Pdx1-VP16和PTD-Ngn3蛋白的组合多次腹腔内注射至链唑霉素诱导的糖尿病小鼠具有降低血糖水平和改善小鼠的糖尿病的协同作用。该小鼠血糖水平的降低是由于外源性胰腺β细胞再生和肝细胞转分化产生的胰岛素生成细胞的数量增加而导致。这些结果表明经蛋白转导结构域(PTD)进行的胰腺转录因子的递送可在体内成功用于诱导胰腺β细胞并使肝细胞重编程为胰岛素生成细胞。

该方法成功用于治疗小鼠糖尿病，表明使用PTD技术递送的胰腺转录因子(Pdx1-VP16和Ngn3)的组合可用于改善人类1型和2型糖尿病。该治疗可通过将重组的人类PTD-Pdx1-VP16和PTD-Ngn3蛋白注射至腹腔或门静脉以促进治疗糖尿病和预防与持续高血糖相关的代谢并发症的内源性胰腺细胞再生和/或肝细胞转分化而应用。

实施例7：AAV-PTF(Pdx1-VP16、Ngn3，或二者均有)的门静脉注射降 低糖尿病小鼠中的血糖水平

本发明证明了通过诱导关键的胰腺转录因子(即Pdx1、Pdx1-VP16、Ngn3以及Pax4)的基因在体外将肝干细胞重编程为功能性生成胰岛素的β细胞子代的可行性。另外，本发明的结果提示用于重编程的有效的转录因子组合(Pdx1-VP16与Pax4组合和/或Pdx1-VP16与Ngn3组合)。在具体的实施方案中，本发明提供了可用于持续表达感兴趣的胰腺转录因子的表达胰腺转录因子的病毒载体。这样的病毒载体可联合仅瞬时存在于细胞中的含有胰腺转录因子的融合多肽使用。

使用1×10⁸病毒颗粒的AAV-Pdx1-VP16、AAV-Ngn3或AAV-Pdx1-VP16/AAV-Ngn3经门静脉注射三组糖尿病小鼠，一组接受AAV-GFP的小鼠作为AAV病毒的对照。每两天监测血糖水平一次，对于接近正常血糖水平的小鼠进行葡萄糖耐量试验。处死各组的1只小鼠，并检查肝脏和胰腺中β细胞再生和肝脏中胰腺内分泌细胞的存在。图13A显示AAV血清型2的肝细胞转导效率总体约20％。图13B显示了AAV-Pdx1-VP16和AAV-Ngn3组合有效降低糖尿病小鼠的血糖水平并恢复小鼠响应高葡萄糖攻击的能力。单独AAV-Ngn3显示无显著的血糖降低作用。AAV-Pdx1-VP16显示降低血糖水平的中等作用。

实施例8：肝脏衍生的胰岛素阳性细胞

使用抗胰岛素抗体和抗胰高血糖素抗体通过免疫染色对接受AAV-PV、AAV-Ngn3或AAV-PV/AAV-Ngn3病毒的小鼠的肝脏石蜡切片进行检测。图14(左小图)显示了AAV-PV门静脉注射将某些肝细胞转化为强胰岛素阳性细胞。该结果与在这些动物中鉴定的血糖水平降低相一致(图13B)。

经门静脉注射接受AAV-PV/AAV-Ngn3的动物的肝脏切片显示许多胰岛素阳性细胞。大多数这些细胞分布在中央静脉周围(图15)。大多数胰岛素阳性细胞位于肝包膜下的边缘。与该表现相一致，经门静脉注射接受AAV-PV/AAV-Ngn3的小鼠的血糖水平被正常化。尽管胰岛素阳性细胞的分布在区域间不同，据估计胰岛素阳性细胞的总百分数达到肝细胞总数量的2-3％。在单独接受AAV-Ngn3注射的小鼠中未观察到血糖水平的显著降低。在来自这些小鼠的肝脏切片中仅鉴定到分散的胰岛素阳性肝细胞(图14，右小图)。

实施例9：肝脏衍生的胰高血糖素阳性细胞

为了确定肝细胞是否可被胰腺转录因子(PTF)转化为胰腺内分泌细胞，使用抗胰高血糖素抗体对接受AAV-PV、AAV-Ngn3或AAV-PV/AAV-Ngn3病毒的小鼠的肝脏石蜡切片进行免疫染色。这些研究鉴定了肝脏中的胰高血糖素阳性的肝细胞。大多数胰高血糖素阳性的肝细胞紧靠中央静脉。图16显示了接受AAV-PV/AAV-Ngn3门静脉注射的小鼠肝脏切片的胰高血糖素免疫染色的结果。

经门静脉将编码Pdx1-VP16和Ngn3的重组腺病毒相关病毒(AAV)的组合给药至患有链唑霉素诱导的糖尿病的小鼠。接受该组合的小鼠显示血糖水平的协同性降低，表明Pdx1-VP16和Ngn3的表达改善了这些小鼠的糖尿病。该作用大部分由肝细胞转分化为胰岛素生成细胞介导，较小程度由内源性胰腺β细胞再生介导。单独AAV-Pdx1-VP16门静脉注射显示降低血糖水平。该作用与显示肝脏切片中胰岛素阳性细胞和胰高血糖素阳性细胞的存在的组织学结果相一致。为了确定这些作用是否部分由胰腺再生导致，分析了这些小鼠的胰腺的胰岛素免疫染色。在经门静脉注射接受AAV-PTF的小鼠中鉴定到比经腹腔内注射接受载体的小鼠中观察到较低水平的胰腺β细胞再生。单独AAV-Ngn3门静脉注射显示对血糖水平无显著作用。在这些小鼠的肝脏切片中仅鉴定到分散的胰岛素阳性细胞和胰高血糖素阳性细胞。

鉴于关键的胰腺基因诸如Pdx1-VP16和Ngn3可经门静脉被递送而成功将肝脏中的肝细胞转分化为胰岛素生成细胞，可能与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子可经门静脉被递送至肝脏，并且这些融合蛋白可用于体内转分化肝细胞和促进β细胞再生。这些方法可用于治疗患有1型和2型糖尿病的患者和预防与持续高血糖相关的并发症。

实施例10：胰腺转录因子融合蛋白治疗的顺序给药

使用图17中所示的在β细胞分化过程中顺序表达的三种胰腺转录因子体内再生和重编程而提供蛋白治疗，图17提供了特定PTF表达的顺序和持续时间的概况(Soria，《分化》2001；68(4-5)：205-219；Hui等，《内分泌学杂志》2002；146(2)：129-141)。图18A-18I提供了典型胰腺转录因子的序列。Pdx1以双相性方式在发育中的胰腺中表达。它首先在胚龄E9.5至E10之间达到顶峰(在所有胰腺前体细胞中表达)，且表达持续约2-3天。然后，接下来在5-6天的时间间隔Pdx1低水平表达。在该间隔期间，Ngn3表达在E11开始，在E15达到顶峰，并持续2-4天。Ngn3表达决定细胞向胰腺内分泌细胞转化的命运。Pax4因Ngn3消失而出现，并持续约1-3天。Pax4仅在发育中的β细胞中表达。在Pax4激活之后，Pdx1再次出现，在分化的β细胞中持久性表达，并维持β细胞功能。图17B描述了模拟图17A中所述的PTF表达序列的天然过程的PTD-PTF融合蛋白给药。用于胰腺转录因子融合多肽的递送方法反映了发育过程中这些因子的体内表达。

具体地，监测小鼠中PTD-GFP融合蛋白的组织动力学和组织分布。通过三种途径(门静脉、静脉内以及腹腔内)将100μg(约5μg/g体重)PTD-GFP融合蛋白对小鼠给药，在治疗后1小时、2小时、5小时、10小时以及24小时收获组织。通过蛋白质印迹估计PTD-GFP或PTD-PTF的平均半衰期，并通过光密度法进行定量(Cai等，Eur J Pharm Sci(《欧洲药学科学杂志》)2005；Kaneto等，Nat Med(《自然：医学》)2004；10(10)：1128-1132)。基于PTD-GFP数据监测PTD-PTF蛋白在不同组织中的分布。如Xiong等，Stem Cells Dev(《干细胞进展》)2005；14(4)：367-377所述通过免疫组织化学染色并通过先前研究中所述使用抗V5抗体通过蛋白质印迹分析来分析不同组织中的PTD-PTF蛋白。基于这些研究的结果，将对链唑霉素诱导的糖尿病小鼠的融合蛋白腹腔内递送或门静脉注射递送方法优化成反映发育过程中这些因子的内源性表达模式。接下来，如上所述，监测对肝脏重编程或胰腺再生的作用。

实施例11：报告基因构建体的产生

在慢病毒载体中产生含有与编码荧光颜色的蛋白偶联的启动子基因(包括大鼠胰岛素-1启动子eGFP、NeuroD-eGFP、Nkx2.2-RFP以及Pax4-RFP)的质粒。这些编码荧光颜色的报告基因用于监测转分化的阶段。含有全长的人类Pax4或小鼠Nkx2.2启动子DNA序列的质粒用于构建融合报告基因。使用合适的引物通过PCR将小鼠Pax4启动子(-2153-+1)和Nkx2.2(-1840bp至+21)克隆至pCR 2.1-TOPO克隆载体中的限制酶Xhol/SalI(Pax4)和BamHI/XhoI(Nkx2.2)之间。使用相同的限制酶切割所产生的质粒和pDsRed-Express-N1质粒。纯化Pax4(或Nkx2.2)启动子的插入序列，并连接至pDsRed-Express-N1质粒的MCS位点。在筛选含有Pax4或Nkx2.2插入序列的阳性克隆之后，通过限制性消化和序列分析确认这些克隆的整合，扩增报告基因质粒pDsRed-Pax4-RFP和pDsRed-Nkx2.2-RFP并将它们用于体外转染以检测它们的功能。

使用来自人类肝脏的基因组DNA作为模板，使用合适的引物、PfuDNA聚合酶(Washiobio，中国)通过PCR产生包含950bp(-940至+10)的人类NeuroD/β2启动子的报告基因构建体(Miyachi等，Brain Res MolBrain Res(《脑研究：分子脑研究》)1999；69(2)：223-231)。将扩增的PCR产物经受电泳、凝胶纯化，并使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆至pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。使用EcoR1和BamH1通过限制性消化从质粒切除启动子片段，并将其插入eGFP表达载体(pEGFP-1，Clontech)。通过限制性消化和序列分析确认该克隆的整合。

实施例12：小鼠rPdx1的产生和表征

最近发现Pdx1转录因子的触角足样结构域具有内建的PTD，允许该蛋白结合和穿透细胞膜(Noguchi等，《糖尿病》52，1732-1737(2003))并发挥转录功能。首先，构建含有小鼠PDX1或PTD-GFP cDNA的表达质粒，各质粒还含有编码C末端六组氨酸标签的另外的核苷酸序列(用于使用氮川三乙酸镍柱快速纯化)。为了获得用于体外和体内动物研究的足够量的近乎均匀的蛋白质，首先将细菌表达条件优化为每升生长培养基产生10mg rPdx1或PTD-GFP，并将纯化方案改进成确保高产率和纯度。图19A描述了rPdx1和PTD-GFP的结构组成(顶部小图)，显示了表明rPdx1和PTD-GFP融合蛋白的纯度的考马斯蓝染色的SDS凝胶(左小图)。基于凝胶光密度法，这些重组蛋白始终具有至少90-95％的纯度。还使用抗Pdx1抗体或抗GFP抗体通过蛋白质印迹(右小图)确认rPdx1和GFP蛋白。

为了确认rPdx1蛋白具有穿透细胞的能力，使用rPdx1蛋白(0.2μM的终浓度)温育WB细胞持续不同的时间，之后使用PBS洗涤细胞三次。然后将细胞裂解物收集于裂解缓冲液中，通过SDS-PAGE分离它们的蛋白，并使用抗Pdx1抗体和抗肌动蛋白抗体(对照)进行印迹。对细胞印迹中的rPdx1的相对量进行定量并使用肌动蛋白通过光密度法进行标准化。如图19B所示，rPdx1蛋白进入在5分钟之内停止。在Pdx1掺入进行时，细胞rPdx1蛋白水平在1-2小时时达到其峰值，并在6小时时开始降落。

为了确定内化的rPdx1蛋白是否具有生物活性，分析了rPdx1蛋白的转录功能。首先，使用含有pNeuroD-GFP报告基因(Pdx1转录因子的直接下游靶基因)的慢病毒转导WB细胞。然后，在存在或不存在rPdx1蛋白(1μM)的情况下温育细胞72小时。收获这些细胞用于流式细胞术，通过检测表达pNeuroD-GFP的WB细胞的百分数评价rPdx1介导的NeuroD基因活性。为了比较外部给药的rPdx1和细胞制造的Pdx1的效率，使用慢病毒Pdx1载体转导含有NeuroD-GFP启动子构建体的WB细胞72小时，并记录Pdx1水平。表达pNeuroD-GFP的WB细胞用作天然的细胞Pdx1蛋白的阳性对照。重要地，使用WB细胞的LV转导效率接近几乎100％，如所报道的通过LV-CMV-GFP载体表达所判断的(Tang等，Lab Invest(《实验室包埋》)86，829-841(2006))。图19C(左小图)显示了于细胞离心涂片器载玻片上采集的表达NeuroD-GFP的细胞的典型荧光显微照片。流式细胞术揭示了LV-Pdx1处理的细胞(21％)和rPdx1蛋白处理的细胞(19％)在处理72小时后的可比的转录效率。当这两种处理与仅含有pNeuroD-GFP载体的对照细胞相比时，显示统计学上的显著差异(图19C，右小图)。这些结果明显证明了rPdx1蛋白能够快速进入细胞并有效激活其下游的NeuroD基因靶。这些发现证实rPdx1蛋白通过LV-Pdx1转基因表达方式具有与细胞内产生的天然Pdx1蛋白相同或可比的转录活性。

实施例13：体内动力学和组织分布

尽管触角足样PTD允许rPdx1蛋白进入细胞，但关于rPdx1的体内组织分布知道得较少。因此，为了探索rPdx1蛋白用于糖尿病的安全和临床可行性治疗，监测了rPdx1蛋白的组织分布和药代动力学。以每只小鼠0.1mg或1mg rPdx1融合蛋白腹腔内注射Balb/c小鼠。在15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时以及24小时时收集血液样品，并使用抗Pdx1抗体通过免疫印迹检测血清中的rPdx1蛋白。如图20A所示，rPdx1蛋白在血液中的出现在早至注射后1小时时开始明显，在2小时时达到峰值，然后在6小时时显著降落。在24小时的血液样品中未检测到rPdx1蛋白。

对于体内组织分布研究，在腹腔内注射后1小时或24小时收获肝脏、胰腺以及肾脏，并在10％福尔马林中固定。使用抗Pdx1抗体对石蜡切片进行免疫染色。图19B显示了选自在注射后1小时(顶部两行)或24小时(底行)接受0.1mg rPdx1蛋白的动物的典型肝脏、胰腺以及肾脏组织图像。发现Pdx1蛋白在肝细胞的细胞核中浓集，Pdx1阳性细胞在最接近中央静脉处为最大浓度。该分布模式与预测的用于含有PTD的蛋白的快速内化的途径(在Pdx1情况下，Pdx1经末端静脉或毛细血管进入门静脉系统)相一致。确实，预期在最接近中央静脉的那些细胞具有最高的Pdx1掺入。在胰腺的周围外分泌细胞中(可能因直接摄取)和沿胰腺末端毛细血管也检测到Pdx1蛋白。在肾脏样品中，Pdx1蛋白以与蛋白过滤和消除的解剖途径相一致的方式出现：蛋白一开始见于肾小球细胞、cap细胞、近端小管细胞和远端小管细胞，最终在集合管细胞中积累。在注射后24小时，在肝脏、胰腺以及肾脏切片中仅观察到弱的Pdx1蛋白免疫染色(底行)。另外，在注射后1小时于脾脏、心脏、肺脏以及脑的组织中可能因为血液中的高水平Pdx1而检测到无特征性模式的低水平Pdx1蛋白，并且在注射后24小时变为不可检测的水平。基于这些发现结果和文献中的数据(Matsui等，Curr.Protein Pept.Sci.(《蛋白质和肽科学现状》)4，151-157(2003)；Schwarze等，《科学》285，1569-1572(1999))，选择0.1mg Pdx1作为起始剂量，以24小时间隔作为我们的治疗时间安排，以确定rPdx 1对糖尿病小鼠的体内作用

实施例14：rPdx1蛋白对糖尿病小鼠的血糖水平的体内作用

流程1(图19C)描述了用于评价给药的rPdx1蛋白在Stz诱导的糖尿病(空腹血糖在约300mg/dL)小鼠中的体内治疗作用的实验策略(Cao等，《糖尿病》53，3168-3178(2004)；Tang等，《实验室包埋》86，83-93(2006))。使用纯化的rPdx1或PTD-GFP蛋白腹腔内注射(0.1mg或约5μg/g体重)这些动物，连续10天。含有PTD的绿色荧光蛋白(自身是具有工程PTD的非治疗性蛋白)用作阴性对照。在不同的时间点监测空腹血糖水平。如图21A所示(底部黑色线)，接受rPdx1注射的小鼠在首次注射后2周内达到接近血糖量正常，然而，在接受PTD-GFP蛋白的小鼠中未观察到高血糖的改善(图21B中的灰色线)。在蛋白注射首日之后的第14天处死小鼠，收集不同器官组织用于组织胰岛素测量、基因表达分析和/或免疫组织化学研究。

在注射后第14天和第40天，腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)(图20B)显示接受注射的小鼠在两个时刻表现与可见于正常小鼠(黑色线)的接近正常的IPGTT曲线(灰色中部线)。相比之下，接受PTD-GFP的那些小鼠未给出降低推注剂量的葡萄糖的任何能力的提示(顶部灰色线)。为了评价rPdx1治疗的糖尿病小鼠中在它们的血糖水平于rPdx1注射后第14天左右接近正常化之后葡萄糖刺激的胰岛素释放的能力，使用腹腔内注射推注剂量的葡萄糖(1mg/g)注射攻击正常小鼠和治疗的小鼠，在注射后15分钟采集血清用于胰岛素测量。图20C和20D显示在正常小鼠、实验小鼠和对照小鼠中血糖水平(图20C)和血清胰岛素水平(图20D)的结果。寡核苷酸引物序列示于表1(下文)中。

表1：实时PCR引物名称、序列、大小、GenBank号以及PCR条件

基因	正向引物	反向引物	PCR大小	GenBank登录号	Tm(℃)	循环数
							肌动蛋白	ACCACACCTTCTACAATGAGC	GGTACGACCAGAGGCATACA	185	NM_007393	56	38
胰岛素	GCCCTTAGTGACCAGCTAT	GGACCACAAAGATGCTGTTT	167	NM_008386.2	56	38
							Pdx1	ATGAAATCCACCAAAGCTCAC	AGTTCAACATCACTGCCAGCT	190	NM_008814.2	56	38
INGAP	GCTCTTATCTCAGGTTCAAGG	AGATACGAGGTGTCCTCCAGG	178	NM_013893.1	56	38
							Reg3g	CATGACCCGACACTGGGCTATG	GCAGACATAGGGTAACTCTAAG	190	NM_011260.1	56	38
PAP	AATACACTTGGATTGGGCTCC	CCTCACATGTCATATCTCTCC	195	NM_011036.1	56	38

如图21C和21D所示，在注射后第14天和第40天获得的样品的血糖水平证实了使用rPdx1或PTD-GFP蛋白治疗的小鼠的血清胰岛素水平。Pdx1治疗的小鼠在IPGTT中15分钟时的葡萄糖刺激的胰岛素释放在第14天和第40天分别大于GFP对照组6.9倍和11.3倍，提示rPdx1治疗的小鼠处理推注剂量的葡萄糖攻击的能力显著改善。尽管Pdx1治疗的小鼠的血糖水平在第40天接近血糖量正常，在葡萄糖刺激15分钟后释放的胰岛素(2.6μg/L)仍旧比正常的非糖尿病小鼠(5.7μg/L)低得多，(表明新形成的胰岛素生成细胞的成熟度)或小于胰腺组织或非胰腺组织中用于葡萄糖内稳定的β细胞群的最佳水平。

实施例15：Pdx1治疗促进内源性β细胞再生

为了确定胰腺中再生的胰岛β细胞是否在rPdx1介导的血糖量正常的小鼠中起作用，使一组Pdx1介导的血糖量正常的小鼠(n＝4)在注射后30天左右经受次全(＞90％)胰切除术，处理去除的胰腺组织用于形态学分析，和/或组织胰岛素测量。如图20A所示，血糖水平在次全胰切除术之后急剧升高，表明胰腺中胰岛素生成细胞在rPdx1注射后第30天保持和维持血糖量正常中起主要作用。这些结果暗示rPdx1蛋白体内的递送促进了内源性β细胞再生。注意到GFP治疗小鼠中的血糖升的较高，表明最低的自发性β细胞再生的存在。

对石蜡包埋的胰腺组织切片的组织学和胰岛素表达的检测证实强有力的胰岛β细胞再生明显，较大和丰富的胰岛可见于Pdx1治疗的小鼠胰腺，而在GFP治疗的小鼠中观察到稀少的小胰岛(图21A和21B)。所使用的寡核苷酸引物序列示于表2中(下文)。

表2：引物名称、序列、大小、GenBank号以及PCR条件

基因	正向引物	反向引物	PCR大小(bp)	GenBank登录号	Tm(℃)	循环数
							HPRT	CTCGAAGTGTTGGATACAGG	TGGCCTATAGGCTCATAGTG	350	NM_013556	56	40
胰岛素I	TAGTGACCAGCTATAATCAGAG	CAGTAGTTCTCCAGCTGGTA	372	NM_008386	56	40
							胰岛素I(巢式)	ATCAGAGACCATCAGCAAGCA	CTTCCTCCCAGCTCCAGTTGT	248	NM_008386	56	40
胰岛素II	GCTCTTCCTCTGGGAGTCCCAC	CAGTAGTTCTCCAGCTGGTA	288	NM_008387	56	40
							胰高血糖素	TGAAGACCATTTACTTTGTGGCT	TGGTGGCAAGATTGTCCAGAAT	492	NM_008100	57	40

促生长素抑素	CTCTGCATCGTCCTGGCTTTG	GGCTCCAGGGCATCATTCTCT	173	NM_009215	56	40
							IAPP	TGAACCACTTGAGAGCTACAC	TCACCAGAGCATTTACACATA	282	NM_010491	55	40
Glut-2	CGGTGGGACTTGTGCTGCTGG	GAAGACGCCAGGAATTCCAT	412	NM_031197	56	40
							P48	CCCAGAAGGTTATCATCTGCC	CGTACAATATGCACAAAGACG	245	NM_018809	57	40
弹性蛋白酶	AATGACGGCACCGAGCAGTATGT	CCATCTCCACCAGCGCACAC	344	NM_033612	57	40
							淀粉酶	TGGGTGGTGAGGCAATTAAAG	TGGTCCAATCCAGTCATTCTG	371	NM_009669	56	40
葡萄糖激酶	ATCCTGGCAGAGTTCCAGCT	CTTGTGTTTCATCTGATGCT	373	NM_010292	56	40
							Pdx 1	ACCGCGTCCAGCTCCCTTTC	CCGAGGTCACCGCACAATCT	357	NM_008814	57	40
NeuroD1	CATCAATGGCAACTTCTCTTT	TGAAACTGACGTGCCTCTAAT	257	NM_010894	56	40
							Isl 1	AGACCACGATGTGGTGGAGAG	GAAACCACACTCGGATGACTC	296	NM_021459	56	40
NKx 2.2	GACAGCAGCGACAACCCCTACA	CGTGAGACGGATGAGGCTGG	306	NM_010919	56	40
							NKx6.1	AGAGTTCGGGTCCAGAGGT	AGTGATGCAGAGTCCGCCGT	382	NM_144955	56	40
Pax4	CCAGCCACAGGAATCGGACTA	TCCCTGGAGAATTTTTTGGTACT	252	NM_011038	57	40
							Pax6	GTGAATCAGCTTGGTGGTGTC	GAAGGGCACTCCCGTTTATAC	308	NM_013627	56	40

Ngn3

TGGCACTCAGCAAACAGCGA

AGATGCTTGAGAGCCTCCAC

516

NM_009719

56

40

另外，在这些胰腺中还观察到具有胰腺外分泌细胞表现的单个分散的胰岛素阳性细胞。这些发现表明当rPdx1蛋白以多重剂量给药时，经尚未定义的分子和细胞机制促进内源性生成胰岛素的β细胞的再生。

为了进一步观察再生的胰岛的模式，使用抗胰岛素抗体和抗胰高血糖素抗体进行双免疫荧光研究。基于β细胞/β细胞比例和分布模式将小鼠中的胰腺胰岛任意分成三期(图21B)具有重要意义：1期，胰腺β细胞/β细胞比例为约0.2，具有丰富的杂乱的胰高血糖素阳性β细胞和较少的β细胞分散其中；2期，β细胞/β细胞比例约为1，具有大致相等数量的胰高血糖素阳性细胞β细胞和胰岛素阳性细胞β细胞；3期，胰腺β细胞/β细胞比例为5，显示相反的比例，生成胰岛素的β细胞占优势。1期至3期的胰岛的结构变得较有序，同时生成胰岛素的β细胞的数量增加。由于在GFP治疗的小鼠中也观察到上述三种容易辨别的模式，这些模式显现为代表胰岛细胞再生进展的常见表现。

为了确定rPdx1介导的胰岛β细胞再生的分子事件，分析了已知与胰腺和β细胞再生以及正常的β细胞生理功能相关的几种基因的状态。实时PCR用于确定胰腺中它们的表达水平。在使用rPdx1治疗第14天和第40天之后，处死小鼠，从胰腺提取总RNA，以评价再生过程中的基因表达(Gagliardino，《内分泌学杂志》177，249-259(2003)，Pittenger，《胰腺》34，103-111(2007)，Jonsson等，《自然》，371，606-609(1994)，Wu等，Mol.Cell Biol.(《分子细胞生物学》17，6002-6013(1997)，Stoffers等，Nat.Genet.(《自然：遗传学》)15，106-110(1997)，Holland等，《糖尿病》54，2586-2595(2005))。如图21C所示，rPdx1治疗糖尿病小鼠在第14天导致胰岛素(21.3倍)、内源性Pdx 1(3.8倍)、INGAP(14.5倍)、Reg3d(8.1倍)、Reg3g(6.8倍)以及胰腺炎相关蛋白Pap的水平(34.3倍)相对于它们相应的对照(GFP治疗的胰腺)值显著上调。在治疗后第40天观察到相似模式的上述基因上调持续。有趣地，尽管当Pap的表达与GFP治疗的小鼠比较时持续上调，但当治疗后第40天与第14天时的比较时，显著减少。不论负责这些作用的机制(即，β细胞分化和复制，导管细胞新生或外分泌细胞转分化)如何，rPdx 1蛋白具有经上调胰腺再生基因诱导新的细胞形成并由此改善高血糖异常状况的能力。

实施例16：Pdx1治疗促进肝细胞转分化为胰岛素生成细胞

几个体内研究显示病毒介导的肝细胞内Pdx1的转基因表达导致肝细胞转分化为IPC并逆转糖尿病小鼠中的高血糖(Ferber，S.等，《自然：医学》6，568-572(2000)，Ber，I.等，《生物化学杂志》278，31950-31957(2003))。然而，使用rPdx1蛋白直接体内治疗糖尿病小鼠是否可对肝细胞转分化具有相似作用并不清楚。为了确定rPdx1给药在注射后第14天对肝脏的作用，从使用Pdx1或GFP治疗的小鼠获得肝脏组织，并使用抗胰岛素抗体免疫组织化学检测这些样品IPC的存在。可溶的Pdx1蛋白的多次腹腔内注射将高血糖逆转为接近正常血糖量。图22A显示了来自使用PTD-GFP(左列)或Pdx1(右两列)治疗的小鼠的典型肝脏显微照片。大多数分散的胰岛素染色的阳性肝细胞沿中央静脉边缘分布(显微照片中标注的C.V.)，这是一种与肝脏中rPdx1组织分布相一致的模式(见图22B)。存在具有小双细胞核和凝聚染色质的分散的单个胰岛素阳性肝细胞(黑色箭号)，暗示较成熟的细胞模式。这些细胞学特征与具有较大细胞核和较开放的染色质模式(箭号)的那些邻近的胰岛素阴性的活性肝细胞明显不同。在对照的GFP治疗的小鼠肝脏中未观察到胰岛素生成细胞。

接着，通过比较蛋白注射后第14天和第40天的结果研究Pdx1或GFP治疗的肝脏中胰腺基因的表达模式(图22B)。Pdx1治疗的肝脏在第14天专有地表达多种胰腺基因，包括内源性Pdx1、胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶和IAPP，并且与GFP治疗的肝脏的基因表达相比上调其他胰腺内分泌基因(胰岛素II、促生长素抑制素、NeuroD以及Isl1)和胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)的表达。未检测到Ngn3基因的表达。有趣地，在第40天，未观察到胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶以及IAPP基因的表达，而其他上述胰腺基因表达持续存在(尽管以降低的水平)。这些数据表明rPdx1介导的肝细胞产生的胰岛素在早期可具有降低高血糖并促进胰腺β细胞再生的重要作用。

实施例17：rPdx1蛋白对其他重要器官的作用

上述发现结果证明了，当rPdx1体内递送时，通过促进内源性胰岛细胞再生和肝细胞转分化为IPC而具有对糖尿病小鼠的真实治疗作用。鉴于rPdx1蛋白无差别地穿透细胞的固有能力，还检测了rPdx1对不同器官的胰腺基因(包括Pdx1、胰岛素I、胰高血糖素以及淀粉酶)表达的作用的特异性。在收获接受rPdx1治疗后第14天的小鼠的心脏、脑、肾脏、肺脏、肠以及脾脏的组织之后，提取总RNA用于通过RT-PCR进行基因表达研究。该方法背后的理论是：如果腹腔内rPdx1治疗导致胰腺关键基因的无差别激活，这些发现结果会造成对上述肝脏中胰腺基因观察结果显著性的怀疑(图22B)。如图22C所示，在心脏、脑、肾脏、肺脏、肠以及脾脏中发现很小的或没有rPdx1治疗对胰腺基因激活的征象。这些结果表明Pdx1治疗方案在通过促进肝细胞转分化和β细胞再生而恢复血糖量正常方面有效，无不想要的全身毒性的任何可检测证据。

实施例18：胰腺和肝脏之间在组织胰岛素水平的互补关系

为了确定rPdx1治疗后胰腺和肝脏组织衍生的胰岛素改善血糖水平的相对作用，将Pdx1注射后第14天或第40天左右处死的Stz处理的小鼠的胰腺和肝脏提取在酸性乙醇中，并使用用于检测小鼠胰岛素的超敏感ELISA试剂盒检测所产生的胰岛素含量。图23A显示Pdx1治疗的糖尿病小鼠在注射后第14天和第40天的胰腺胰岛素含量分别为正常胰腺水平的约44％和68％，与GFP治疗的对照小鼠(12.0ng/mg和9.5ng/mg)相比，在治疗后第14天是GFP治疗的对照小鼠的6.7倍水平，治疗后第40天是GFP治疗的对照小鼠的15.8倍水平。这些发现结果提示体内rPdx1治疗促进胰腺中胰岛β细胞再生。当将该胰腺胰岛素生成增加与治疗后第14天和第40天的GFP治疗的小鼠相比时，具有统计学显著性。这些结果还与我们对于次全胰切除术之后的反跳性高血糖的发现相一致(图21A)。

对于与胰腺胰岛素含量测量相似治疗的糖尿病小鼠，检测了注射后第14天和第40天肝脏组织的胰岛素含量。如图23B所示，确实，Pdx1治疗的小鼠中在治疗后第14天的肝脏组织胰岛素含量相对于GFP治疗的小鼠显著增加(约16倍)，且比正常肝脏增加接近9倍。有趣地，在Pdx1治疗后第40天肝脏胰岛素含量显著降低，但它仍旧是GFP治疗的小鼠的7.3倍，且为正常肝脏的约2倍。当将该肝脏胰岛素产生的增加与正常小鼠或GFP治疗的小鼠的胰岛素水平相比时具有统计学显著性。

rPdx1蛋白的产生、纯化以及表征示于图24A-24C中。Pdx1组织分布示于图25A和25B。

实施例19：Pdx1治疗不诱导健康小鼠中胰腺基因的表达

使用大剂量rPdx1蛋白以两种方式注射正常小鼠。第一种，使用单次大剂量(10mg)纯化的rPdx1蛋白注射小鼠，第二种，使用1mg/天注射小鼠连续10天。观察小鼠的体重、健康状况，以及其他指标，包括血糖水平，肝脏酶和心肌酶，以监测潜在毒性。当将上述参数与未使用Pdx1蛋白注射的正常小鼠比较时，不具有显著变化。在注射后第14天处死所有小鼠，并检测肝脏中关键的胰腺基因表达。因为在第14天，使用rPdx1注射的小鼠的肝脏强烈表达胰腺基因，包括胰岛素、胰高血糖素、淀粉酶以及内源性Pdx1。为了确定这些关键的胰腺基因是否在接受大剂量rPdx1注射的血糖量正常的小鼠中表达，收获来自两组小鼠的肝脏的总RNA，并如图26所示通过RT-PCR检测基因表达。在接受PTD-GFP注射的对照小鼠中未观察到对血糖水平的作用。肝脏中无所观察的胰腺基因的可检测表达。这提示rPdx1蛋白体内给药对正常小鼠无相关的毒性。该结果提示rPdx1蛋白治疗仅在糖尿病动物中起作用且对正常小鼠无作用。

使用下述材料和方法进行上述实验。

PTD融合蛋白的腹腔内(i.p.)和门静脉(p.v.)递送

通过以50μg/g体重每天一次腹腔内注射链唑霉素(Stz)持续5天将小鼠诱导成高血糖(＞350mg/ML)。然后对正常小鼠或糖尿病小鼠进行麻醉并使用于500μl PBS中的指定量(50-200μg/只小鼠)的PTD-GFP或PTD-PTF融合蛋白腹腔内注射。参见(Kay等，《人类基因治疗》1992；3(6)：641-647)。经尾静脉抽血监测血糖水平。接着采集不同组织包括胰腺和肝脏用于免疫组织化学分析生成胰岛素的细胞和生成胰高血糖素的细胞的存在。

对于PTD-PTF融合蛋白的门静脉递送，使用异氟烷麻醉5-6周龄的小鼠，并根据国立实验动物管理与使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)方案进行手术操作。将动物剃毛，在上腹部区域中制造1-2cm的切口，以暴露门静脉。将特殊的导管放置入门静脉的一个主要分枝中，将出口与植入在小鼠腹部皮肤下的Alzet渗透泵连接(Theeuwes等，Ann Biomed Eng(《生物医学年评》)1976；4(4)：343-353)。将PTD融合蛋白经导管以恒定速率持续不同时间递送至门静脉。对于糖尿病小鼠，监测血糖水平，如先前Cao等，《糖尿病》，2004；53(12)：3168-3178和Tang等，《实验室包埋》2006；86：83-93中所述在标准化血糖之后进行IPGTT。在某些时间点，处死小鼠，收集肝脏、脾脏、肾脏、十二指肠和胰腺的组织，以及植入的重编程的肝细胞。这些组织用于形态学分析、免疫染色(石蜡切片)，和基因表达，以及用于通过ESISA测定组织胰腺激素含量(冷冻组织)，诸如胰岛素、胰高血糖素和淀粉酶。

小型渗透泵植入和PTD-PTF递送

PTD-PTF融合蛋白的长期给药通过在异氟烷麻醉下皮下植入Alzet小型渗透泵而实现(Alza，2001型号-1周，或2002型号-2周)(Theeuwes等，《生物医学年评》1976；4(4)：343-353；Heinrichs等，《美国科学院院刊》1996；93(26)：15475-15480)，输注泵的出口与导管连接允许PTD-PTF融合蛋白连续输入门静脉或腹腔。Alzet渗透泵提供了以可预测水平不间断暴露于试验试剂，允许下述事项：短半衰期蛋白的持续给药(实验动物长期给药的方便方法)；使不想要的实验变量最小化，并确保可再现的恒定的结果；消除对于夜间或周末给药的需要；减少对实验动物的处理和应激；小至足够用于小鼠或非常年幼的大鼠；以及使得制剂靶向递送至几乎任何组织。皮下植入泵，以1ul/小时速率持续1周或以0.5ul/小时的速率持续2周输注PTD-PTF融合蛋白(溶解于PBS中或单独以PBS作为对照载体)。为了实现10ug/g体重/天的PTD-PTF的剂量，将5-10mg/ml的母液用于具有20g体重的小鼠，并相应调整。在植入之前通过在37℃水浴中过夜温育来激活渗透泵，以经时间标准化PTD-PTF融合的起始和速率。

蛋白质印迹

在1600小时时植入PTD-PTF泵，并且在移除泵之后24小时检测血糖水平。采集小鼠组织，并使用PBS匀浆化缓冲液(1％Triton-X、1mM苯甲磺酰氟以及蛋白酶抑制剂鸡尾酒)提取蛋白。于4℃在20,000rpm离心组织裂解物30分钟。在使用Bio-Rad蛋白试剂实施的标准蛋白分析中测定上清液的蛋白浓度。将上清液与等量的2×SDS样品缓冲液混合，并加热至95℃持续5分钟。然后在15,000rpm离心加热的混合物5分钟，以去除不溶解的物质。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上清液。将蛋白转移至硝酸纤维素膜，并使用抗V5抗体(1∶5000)或使用抗GFP抗体进行印迹，然后使用电化学发光(Amersham ECL发光系统(AmershamPharmacia Biotech，Buckinghamshire，英国))观察。使用光密度扫描仪器通过光密度法对融合蛋白水平进行定量。

RT-PCR、组织学、免疫组织化学以及荧光显微术

这些方法在我们的实验室中得到良好建立，其详细情况可见于下列出版物(它们的内容通过引用并入本申请)：Cao等，《糖尿病》2004；53(12)：3168-3178；Tang等，《实验室包埋》2006；86：83-93。对于观察组织切片中的GFP蛋白，将小鼠组织固定于福尔马林中过夜，并转移至50％蔗糖中12小时。将组织切为冷冻切片，并使用含有DAPI的封固剂覆盖载玻片。在荧光显微镜下对含有GFP的细胞进行观察并照相。

质粒和质粒构建

如下，通过将VP16的激活结构域(80个氨基酸)与小鼠的Pdx1的COOH末端融合而构建Pdx1-VP16。使用T7引物和包括ClaI位点(5′-TCGCAG TGG ATC GAT GCT GGA G-3′)的3′引物从IPF1-pcDNA3分离全长的Pdx1。使用HindIII和ClaI切割产物并将其亚克隆至pCS2⁺的VP16-N中(《糖尿病》，2004；53：3033-3345)。然后，将Pdx1-VP16亚克隆至pcDNA3的HindIII和XbaI位点中。PTD序列被添加于该序列。

腺病毒相关病毒血清型2(AAV2)载体

我们实验室构建了含有小鼠Pdx1、Pdx1-VP16、Ngn3编码序列的所有AAV2-PTF质粒。已经证实了这些病毒的质量和滴度。简而言之，使用合适的正向和反向引物通过pfu从GFP和PTF(小鼠Pdx1、mPdx1-VP16以及mNgn3)的编码序列相应的pCRT-cDNA质粒扩增它们(开始于XbaI位点并结束于Hpa I位点)。在加A反应之后，使用pCR2.1-TOPO载体连接这些PCR产物。通过Xba I和Hpa I消化含有正确插入序列和AAV骨架质粒(pUF11)的阳性克隆。通过凝胶纯化回收6.2kb的pUF11载体和DNA插入序列(mPdx1、mPdx1-VP16以及mNGN3)，然后根据标准操作程序连接。通过限制性酶消化和序列分析仪确认来自所选的阳性克隆的编码序列和正确方向。AAV-PTF载体质粒具有鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子。通过293细胞的三重质粒转染产生AAV2载体。使用CsCl梯度超速离心纯化AAV2-PTF病毒，并通过实时PCR以每ml基因组拷贝数测定病毒颗粒(VP)的滴度。通过银染的SDS-PAGE评价载体的纯度。将浓缩的载体分成等份，储存在-80℃用于体内研究。

rPdx1蛋白的构建和制备

通过PCR扩增全长的小鼠Pdx1cDNA，并亚克隆至pET28b(Novagen)的Nde I和Xho I位点中。于37℃培养含有表达质粒的BL21(DE3)细胞至O.D₆₀₀为0.8的光密度。将异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至0.5mmol/L的终浓度，然后于18℃温育18小时。于含有5mM咪唑和蛋白酶抑制剂的缓冲液A(Roche Diagnostics)中通过脉冲声处理裂解细菌。将离心后获得的细菌裂解物的上清液应用于氮川三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖柱(Invitrogen)，并使用几种体积量的洗涤缓冲液(含有25mM咪唑的缓冲液A)洗涤。通过含有250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白。在PBS透析之后通过SDS-PAGE/考马斯蓝染色表征所洗脱的蛋白部分的纯度。

PTD-GFP蛋白的构建和制备

通过PCR方法构建在GFP的N末端具有HIV-1TAT的11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)的质粒。将PCR片段直接克隆至pT7/CT-TOPO表达质粒(Invitrogen)中。很大程度上如所述用于rPdx1蛋白的方法进行蛋白制备和纯化。

pNeuroD-GFP和小鼠Pdx1慢病毒载体的制备

如先前所述构建含有小鼠Pdx1的cDNA编码序列的慢病毒载体(LV)(Tang等，《实验室包埋》86，83-93(2006))。通过PCR克隆人类NeuroD/β2启动子(Miyachi等，《脑研究：分子脑研究》69，223-231(1999))的950bp报告基因构建体(-940至+10)，并与GFP连接。通过将pNeuroD-GFP基因插入pTYF载体盒而构建LV。制备慢病毒，并如先前所述测定滴度(Tang等，《实验室包埋》86，83-93(2006))。

细胞进入和免疫印迹

使用纯化的rPdx1(0.2μm)处理70％汇合的WB细胞(大鼠肝脏上皮干细胞)15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时、12小时以及24小时。使用PBS洗涤细胞三次，并将其收获于含有蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液(150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.5，500μMEDTA，1.0％Triton X-100以及1％去氧胆酸钠)(Roche Diagnostics)中。如先前所述^1，3使用兔抗Pdx1血清(1∶1000，使用纯化的小鼠rPdx1产生)或抗His抗体(1∶2000，Invitrogen)通过蛋白质印迹检测细胞裂解物中的rPdx1(50μg/泳道)，用于细胞进入研究。

细胞转导和流式细胞术分析

首先，在如先前所述¹的操作程序之后以20的感染复数通过LV-pNeuroD-GFP转导70％汇合的WB细胞。然后，在存在或不存在0.5μm rPdx1蛋白的情况下，温育转导的WB细胞。使用LV-Pdx1(用作细胞产生的Pdx1蛋白的阳性对照)转导含有pNeuroD-GFP的WB细胞。在处理后72小时收获细胞，于1％甲醛中固定10分钟，然后使用PBS加1％BSA洗涤3次，并重悬浮用于流式细胞分析。使用处理的细胞制备细胞离心涂片器载玻片，并使用含有DAPI的封固剂覆盖。

动物研究

如先前所述^1，3，使用链唑霉素(Stz)(Sigma)以50mg/kg体重(bw)剂量注射Balb/c小鼠，连续5天，诱导糖尿病。具有连续两个读数为约300mg/dL的空腹血糖水平的动物接受蛋白治疗。使用纯化的rPdx1或GFP蛋白(0.1mg/天/只小鼠)腹腔内注射糖尿病小鼠连续10天。在小鼠被剥夺食物8小时之后使用血糖测计仪定期测量空腹血糖水平。动物研究的顺序实验事件总结于流程1(图25C)中。

腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)

在进行IPGTT之前使小鼠空腹8小时。使用葡萄糖(1mg/g bw)腹腔内注射正常小鼠、rPdx1治疗的小鼠或GFP治疗的小鼠，并于注射后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟以及120分钟测量血糖水平。在全身麻醉条件下进行次全胰切除术(约90％)。在不同时间点处死小鼠，采集器官组织和血液用于后面的组织学、基因表达、胰腺/肝脏组织含量以及血清胰岛素水平的研究。

Pdx1蛋白体内动力学和组织分布

使用0.1mg或1mg的rPdx1腹腔内注射小鼠。在15分钟、30分钟、1小时、2小时、6小时以及24小时时抽取血液样品。收获来自正常小鼠和rPdx1治疗的小鼠的器官组织切片，固定于10％福尔马林，并包埋于石蜡中，用于使用抗Pdx1抗体(1∶1000)的Pdx1免疫染色。从血液样品分离血清，将30μl/泳道装载于SDS-PAGE凝胶以分离血清蛋白，然后如上所述使用抗Pdx1抗体进行蛋白质印迹。

RT-PCR

使用Trizol试剂从小鼠胰腺和肝脏组织制备总RNA，并使用superscript III逆转录酶(Invitrogen，CA)使用随机六聚体引物合成cDNA。如先前所述(Cao等，《糖尿病》53，3168-3178(2004))通过RT-PCR测定肝脏基因表达。将正向和反向PCR引物设计成位于不同外显子中，它们的序列列于补充的数据(表1)中。在所有RT-PCR分析中不包括RT、阳性以及空白对照。结果代表至少三个独立的实验。

实时定量RT-PCR分析

使用SYBR绿作为用于各循环过程中的PCR产物量的分析物，在热循环仪检测系统(MJ research Inc.DNA engine opticon 2)中，使来自GFP治疗的对照小鼠和rPdx1治疗的小鼠的胰腺组织的cDNA以两份或三份经受三个独立的PCR反应。根据实时PCR条件设计引物，其序列列于表1中。对于实时PCR，需要95C的起始变性温度15分钟，以激活酶，56C的退火温度用于所有引物对。PCR扩增进行38个循环。

免疫组织化学和免疫荧光

将来自不同器官的组织固定于10％福尔马林中24小时，并在制备石蜡块之前转移至PBS。使用抗猪胰岛素第一抗体(1∶1000，Dako)、抗Pdx1第一抗体(1∶5000，CV.Wright馈赠)、抗胰高血糖素第一抗体(1∶200，Dako)温育切片，然后使用抗小鼠或兔IgG的辣根过氧化物酶HRP(Dako)共轭的第二抗体(1∶5000)温育。如先前所述³使用DAB底物试剂盒(Dako)观察具体的免疫染色。对于双免疫荧光，使用豚鼠抗猪胰岛素第一抗体(1∶200，Dako)和山羊抗胰高血糖素第一抗体(1∶50，Santa Cruz)于4℃过夜温育石蜡包埋切片(5μm)，然后使用FITC共轭的驴抗豚鼠IgG(1∶1000，RDI)和alexa fluor 594荧光染料共轭的驴抗山羊第二抗体温育(1∶500，Invitrogen，Molecular probes)。

通过ELISA进行的组织和血清胰岛素测量

收获胰腺和肝脏的完整器官，称重，并根据较小改变的公开的操作程序⁴使用相应量(1ml buffer/0.1g肝脏或0.05g胰腺)立即将其放置于冰上的酸性乙醇溶液中(于70％乙醇中的180mM HCl)。根据制造商的说明使用超敏感的小鼠胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO)测量组织胰岛素水平。立即通过BIO-RAD 3550-UV酶标仪测量光学吸光度。将最终结果转化为胰岛素/mg胰腺组织或ng胰岛素/g肝脏组织。

对于血清胰岛素测量，首先将正常小鼠和治疗的小鼠禁食6小时，并在葡萄糖(1mg/g bw)刺激之后15分钟采集血液样品。如在组织胰岛素ELISA中所述测定血清胰岛素水平。

统计学分析

通过使用独立的样品t检验分析我们的实验结果的统计学显著性，需要小于0.05的P值用于将数据考虑为具有统计学显著性。

其他实施方案

对于前面的描述，显而易见的是可以对本文所述的发明进行改变和变更以使其适应不同的用途和条件。这些实施方案也在下文的权利要求的范围之内。

本文中变量的任何定义中一系列元素的引用包括作为任何单个元素或所列元素的组合(或亚组合)的变量的定义。本发明实施方案的引用包括作为任何单个实施方案的实施方案或与任何其他实施方案或其部分组合的实施方案。

在该说明书中提到的所有专利和出版物以如同各独立的专利和出版物特别和独立地通过引用并入本申请的相同的程度并入本申请。具体地，Cao等，《糖尿病》2004；53(12)：3168-3178；Tang等，《实验室包埋》2006；86：83-93；以及国际专利公布号WO 2005/083059的全部内容通过引用整体并入本申请。

Claims (92)

1.一种用于细胞重编程的方法，所述方法包括：

(a)使所述细胞接触与包含蛋白转导结构域融合的转录因子多肽或其片段的融合蛋白；并且

(b)改变所述细胞中至少一种多肽的表达水平，由此使所述细胞重编程。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中使所述细胞体外或体内接触。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述改变是在相应对照细胞中不可检测地表达的多肽的水平增加。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述重编程的细胞表达胰岛素。

6.一种用于产生胰岛素生成细胞的方法，所述方法包括：

(a)使细胞接触包含蛋白转导结构域的胰腺转录因子或其片段，并且

(b)增加所述细胞中胰岛素的表达，由此产生胰岛素生成细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞选自脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是肝细胞或肝脏衍生细胞。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述步骤(a)的细胞在接触所述融合蛋白之前不能表达可检测水平的胰岛素。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述转录因子选自Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA。

11.一种用于产生胰岛素生成细胞的方法，所述方法包括使胰腺细胞接触包含Pdx-1多肽、VPA16激活结构域以及蛋白转导结构域的蛋白或其生物活性片段，由此诱导胰腺细胞再生。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胰腺细胞体外或体内接触。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述接触增加胰岛素生成细胞的数量。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述再生通过复制或新生而发生。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞接触包含Ngn3和蛋白转导结构域的蛋白或其生物活性片段。

16.一种用于产生胰岛素生成细胞的方法，所述方法包括使肝脏衍生细胞接触包含Pdx-1多肽、VPA16激活结构域以及蛋白转导结构域的蛋白或其生物活性片段，由此诱导胰腺细胞再生。

17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中使所述肝脏衍生细胞体外或体内接触重组融合蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述体内接触通过经门静脉将所述融合蛋白递送至受治疗者而发生。

19.根据权利要求16所述的方法，其中通过所述肝脏衍生细胞的转分化而产生所述胰岛素生成细胞。

20.一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法包括：

(a)使所述受治疗者的细胞接触与蛋白转导结构域融合的胰腺转录因子或其片段；并且

(b)增加所述细胞中胰岛素的表达，由此产生胰岛素生成细胞。

21.根据权利要求20或22所述的方法，其中所述体细胞选自脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。

22.根据权利要求6所述的方法，其中所述转录因子选自Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA。

23.一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法包括：

(a)使所述受治疗者的成体胰腺细胞接触包含Pdx-1多肽、VP16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段；并且

(b)诱导所述成体胰腺细胞再生，由此改善所述受治疗者的高血糖。

24.一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法包括：

(a)使肝脏衍生细胞接触包含Pdx-1多肽、VP16激活结构域以及蛋白转导结构域的融合蛋白或其生物活性片段；并且

(b)产生胰岛素生成细胞，由此改善所述受治疗者的高血糖。

25.根据权利要求23所述的方法，其中所述成体细胞是肝细胞或肝脏衍生细胞。

26.根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中所述受治疗者患有1型或2型糖尿病。

27.根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中所述步骤(a)的细胞在接触所述融合蛋白之前不能表达可检测水平的胰岛素。

28.根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中所述方法降低所述受治疗者的血糖水平。

29.根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中所述方法正常化所述受治疗者的血糖水平。

30.根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中所述方法还包括进行有效量的包含Ngn3多肽、蛋白转导结构域或其生物活性片段的融合蛋白的给药。

31.根据权利要求1-30任一项所述的方法，其中所述方法还包括获得所述多肽的步骤。

32.根据权利要求1-30任一项所述的方法，其中所述方法还包括以使得给药反映发育过程中内源型转录因子的时间点的方式而进行Pdx-1、Pdx-1/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA中的任何一种或多种的给药。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述给药方法提供细胞内的有效量Pdx1蛋白持续至少约0-4天。

34.根据权利要求33所述的方法，所述方法还包括进行接下来Ngn3的给药，使得有效量Ngn3存在至少约2-6天。

35.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括进行接下来Pax4的给药，使得有效量Pax4存在至少约4-8天。

36.根据权利要求35所述的方法，所述方法还包括进行Pdx1的给药，使得有效量Pdx1持续于所述细胞中，其中在Pax4存在于细胞中的同时发生Pdx1的给药。

37.根据权利要求1-35任一项所述的方法，其中所述受治疗者是动物或人类患者。

38.一种融合多肽，所融合多肽包含：

(a)与胰腺转录因子具有至少85％氨基酸同一性的多肽；和

(b)蛋白转导结构域，其类似物或其片段，其中所述融合多肽在细胞中的表达相对于相应对照细胞改变至少一种多肽的表达。

39.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述胰腺转录因子是早期因子或晚期因子。

40.根据权利要求39所述的融合多肽，其中所述胰腺转录因子选自Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA。

41.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含人类胰腺转录因子。

42.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含疱疹病毒VP16激活结构域或其片段或其类似物。

43.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含用于纯化的序列标签。

44.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述序列标签是六组氨酸标签。

45.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含特异性结合抗体的抗原结构域。

46.根据权利要求45所述的融合多肽，其中所述抗原结构域是V5结构域。

47.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含或基本组成为：

(a)人类Pdx-1多肽或其片段；

(b)单纯疱疹病毒VP16激活结构域；以及

(c)蛋白转导结构域，或其生物活性片段。

48.一种融合多肽，所述融合多肽包含胰腺转录因子启动子和可检测的结构域。

49.根据权利要求38所述的融合多肽，其中所述启动子选自Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA。

50.根据权利要求49所述的融合多肽，其中所述可检测的结构域选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)以及β-半乳糖苷酶。

51.根据权利要求38-50任一项所述的融合多肽，其中所述多肽还包含促进所述多肽纯化的氨基酸序列标签。

52.根据权利要求48所述的融合多肽，其中所述序列标签是六组氨酸标签或GST。

53.根据权利要求38-52任一项所述的融合多肽，其中序列比较是所述多肽或肽片段的总长度。

54.根据权利要求38-52任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含延长所述多肽半衰期、增加所述多肽吸收或提供所述多肽的持续释放的改变。

54.一种表达载体，所述表达载体包含编码权利要求37-51任一项所述的多肽的核酸序列。

55.根据权利要求54所述的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接所述核酸序列的启动子。

56.根据权利要求54所述的表达载体，其中所述启动子被定位用于在细菌或哺乳动物细胞中表达。

57.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求40至41任一项所述的表达载体。

58.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。

59.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞以及酵母细胞。

60.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求38-52任一项所述的融合多肽。

61.根据权利要求60所述的宿主细胞，其中所述细胞是来自人类或动物受治疗者的哺乳动物细胞。

62.根据权利要求61所述的宿主细胞，其中所述细胞选自脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。

63.根据权利要求60所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含含有Ngn3和蛋白转导结构域的融合多肽或其生物活性片段。

64.一种组织，所述组织包含权利要求60-63任一项所述的宿主细胞。

65.一种器官，所述器官包含权利要求60-63任一项所述的宿主细胞。

66.一种基质，所述基质包含权利要求60-63任一项所述的宿主细胞。

67.一种用于产生权利要求32-40任一项所述的重组多肽的方法，所述方法包括：

(a)提供一种使用38-52任一项所述的被定位在细胞中表达的分离的核酸分子转化的细胞；

(b)在用于表达所述核酸分子的条件下培养所述细胞；

(c)以及分离所述多肽。

68.一种药物组合物，所述药物组合物包含于药学上可接受的赋形剂中的有效量的38-52任一项所述的多肽或权利要求60-63任一项所述的宿主细胞。

69.根据权利要求68所述的药物组合物，所述药物组合物还包含有效量的含有Ngn3氨基酸序列和蛋白转导结构域的融合多肽或其生物活性片段。

70.一种包装的药剂，所述药剂包含：

(a)权利要求38-52任一项所述的多肽或权利要求60-63任一项所述的宿主细胞；

(b)使用所述多肽或细胞以改善受治疗者的高血糖的说明书。

71.根据权利要求70所述的药剂，其中所述多肽被配制成增强所述多肽的半衰期、增加所述多肽的吸收或提供所述多肽的持续释放。

71.一种用于治疗高血糖的药盒，所述药盒包含有效量的权利要求38-52任一项所述的融合多肽或权利要求60-63任一项所述的宿主细胞及其使用说明书。

72.根据权利要求71所述的药盒，其中所述高血糖与1型或2型糖尿病有关。

73.一种病毒载体，所述载体包含38-52任一项所述的多肽。

74.一种腺病毒相关病毒(AAV)载体，所述载体包含选自Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isl1、Pax6以及MafA的胰腺转录因子，其中所述多肽可操作地连接被定位用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。

75.一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法包括：

(a)使所述受治疗者的细胞接触权利要求74所述的AAV载体；并且

(b)诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

76.一种改善有需要的受治疗者的高血糖的方法，所述方法包括：

(a)使所述受治疗者的肝脏衍生细胞接触权利要求74所述的AAV载体；并且

(b)并且诱导所述细胞表达胰岛素，由此改善所述受治疗者的高血糖。

77.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求73所述的AAV载体。

78.根据权利要求77所述的宿主细胞，其中所述细胞是成体细胞、胚胎干细胞、肝细胞或胰腺细胞。

79.根据权利要求77所述的宿主细胞，其中所述细胞选自脂肪细胞、骨髓衍生细胞、表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞、神经元、胰腺细胞和它们的祖细胞或干细胞。

80.一种药物组合物，所述药物组合物包含于药学上可接受的赋形剂中的有效量的权利要求74所述的腺病毒载体。

81.一种治疗受治疗者糖尿病的方法，所述方法包括使所述受治疗者接触有效量的Pdx1多肽，以诱导选自Pdx1、INGAP、Reg3d、Reg3g以及胰腺炎相关蛋白Pap的基因在所述受治疗者组织中的表达，由此治疗糖尿病。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述表达增加选自下述情况：Pdx1增加约3-4倍，INGAP表达增加约14-15倍，Reg3d表达增加约7-8倍，Reg3g增加约6-7倍，以及胰腺炎相关蛋白Pap增加30-35倍。

83.根据权利要求81所述的方法，所述方法增加选自下述的基因的表达：Pdx1、胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶、IAPP、胰岛素II、促生长素抑制素、NeuroD、Isl-1以及胰腺外分泌基因p48和淀粉酶。

84.根据权利要求81所述的方法，其中至少两种、三种、四种或五种基因的表达增加。

85.根据权利要求81所述的方法，其中所有所述基因的表达增加。

86.一种诱导有需要的受治疗者中胰岛β细胞再生的方法，所述方法包括将有效量的Pdx1蛋白给药至所述受治疗者并且诱导胰岛β细胞再生。

87.根据权利要求86所述的方法，其中PDX1的给药量为至少约1-5mg/kg体重。

88.根据权利要求86所述的方法，其中经静脉注射或腹腔注射进行PDX1的给药。

89.根据权利要求86所述的方法，其中所述方法增加胰岛素水平至少约1-20倍。

90.根据权利要求86所述的方法，其中PDX1的给药增加选自下述的基因的表达：Pdx1、INGAP、Reg3d、Reg3g、胰腺炎相关蛋白Pap、胰岛素I、胰高血糖素、弹性蛋白酶、IAPP、胰岛素II、促生长素抑制素、NeuroD、Isl-1以及胰腺外分泌基因p48和淀粉酶。

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