CN106478776A - 抗纤维化肽及其在用于治疗以纤维化为特征的疾病和病症的方法中的用途 - Google Patents

抗纤维化肽及其在用于治疗以纤维化为特征的疾病和病症的方法中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于抑制和/或逆转纤维化的方法和组合物。本发明还提供肽和多肽，其是在细胞或组织中触发BMP信号转导和抑制和/或逆转EMT的BMP激动剂。

Description

抗纤维化肽及其在用于治疗以纤维化为特征的疾病和病症的 方法中的用途
本申请为申请日为2012年7月19日、申请号为201280045650.7(PCT/US2012/047468)、发明名称为“抗纤维化肽及其在用于治疗以纤维化为特征的疾病和病症的方法中的用途”的申请的分案申请。
优先权和通过引用结合
本申请要求2011年7月19日提交的美国临时申请顺序号61/509,340的较早申请日权益，所述文献的内容通过引用结合到本文中。本申请还要求2012年6月20日提交的美国临时申请顺序号61/662,337的较早申请日权益，所述文献的内容通过引用结合到本文中。本文引用或参考的所有文献以及本文所引用文献中引用或参考的所有文献，连同本文中或通过引用结合到本文中的任何文献中提及的任何产品的任何制造商说明书、描述、产品说明书和产品单，都通过引用予以结合，并可用于本发明的实践。
发明背景
1.发明领域
本发明涉及物质的组合物、其制备方法以及用于治疗纤维化和/或纤维化相关病况的方法。本发明还涉及多肽或肽的设计、制备、以及在治疗纤维化和/或导致纤维化的潜在病况中的用途，所述病况包括上皮-间充质转换(EMT)过程的逆转和/或抑制。
2.背景
当机体的天然愈合过程出错时，发生纤维化，通常的特征在于在响应与某种潜在原因相关的慢性炎性病况时组织的极度过度生长、硬化和/或瘢痕化，所述原因例如组织损伤、感染、自身免疫反应、化学损伤、过敏反应、毒素、辐射、机械损伤或其它各种持续刺激(TAWynn, J.Pathol.,2008,214:199-210)。尽管临床和病因上的表现范围可以很广泛，但是纤维化病症在以下方面是相似的：它们一般都共有某种潜在的持续刺激，其连续不断地促进多种生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维发生细胞因子的释放，这导致胞外基质成分的增加和过量积累，其逐渐破坏正常组织和改变其结构直到功能丧失。该过程通常在多个月份和年份内发生并且最终可导致器官功能障碍或死亡。常见纤维化疾病的实例包括例如，糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎(nepthritis)和硬皮病(同上)。
通常，组织损伤后的天然愈合过程开始于位于损伤部位的上皮和/或内皮细胞释放炎性介质，这引发以血小板-诱导的凝血块形成为开始的愈合级联和临时的胞外基质(ECM)的形成。血小板脱粒还导致血管舒张并增加血管通透性，同时活化的成肌纤维细胞和上皮和/或内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)，其进一步破坏基底膜，让更多炎性细胞募集到损伤部位(同上)。所述细胞还产生多种生长因子、细胞因子和趋化因子，其刺激额外免疫系统细胞向该部位的募集和增殖，引起级联反应，尤其导致血管生成反应和由活化的淋巴细胞分泌促纤维化细胞因子(profibrotic cytokine)和生长因子，包括肿瘤生长因子–β(TGF-β)。这些事件进一步活化成纤维细胞，成纤维细胞转化为成肌纤维细胞，其迁移到伤口并促使伤口收缩。在收缩伤口的部位，上皮和/或内皮细胞分裂以再生损伤组织，从而完成自然伤口愈合过程(同上)。
纤维化不同于该过程，这是因为持续性和慢性炎症病况的存在，其触发包括ECM材料过量积累在内的级联，所述ECM材料不能转化并最终导致瘢痕组织的产生或形成和伴随的由瘢痕化导致的器官或组织功能障碍(同上)。
已经知道促纤维化蛋白例如转化生长因子-β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)参与纤维化疾病。因为TGF-β诱导成纤维细胞合成ECM，所以长期以来一直认为该细胞因子是纤维化反应的主要介质(LeRoy等人,Eur.CytokineNetw.,1:215-219)。十多年前发现CTGF是由人内皮细胞分泌的一种蛋白质(Bradman等人,J.Cell Biol.,1991,114:1285-1294)，其由TGF-β诱导并且被认为是TGF-β对成纤维细胞作用的下游介质(Leask等人,J.Invest.Dermatol.,2004,122:1-6；Grotendorst,G.R.,Cytokine Growth Factor Rev.,1997,8:171-179)。同样，TGF-β诱导基质蛋白纤连蛋白的ED-A形式(ED-A FN)的表达，其是通过纤连蛋白转录物的可变剪接而发生的一种纤连蛋白变体(Oyama等人,Biochemistry,1989,28:1428-1434)。ED-A FN的这种诱导是TGF-β1-触发的α-SMA和胶原I型表达增强所需要的(Serini等人,J.Cell Biol.,142:873-881)。因此TGF-β被认为是在许多组织的纤维化诱导中的“主要开关”，所述组织包括例如肺(Sime等人,Clin.Immunol.,2001,99:308-319)和肾(Lan,Int.J.Biol.Sci.,2011,7:1056-1067)。在这一点上，在特发性肺纤维化患者的肺中或在慢性肾病患者的肾中TGF-β被上调，并且活性TGF-β在大鼠的肺或肾中的表达导致明显的纤维化反应，而对TGF-β1不能响应提供了针对博来霉素-诱导的纤维化(Zhao等人,Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.,2002,282:L585-L593)或肾间质纤维化(Zeisberg等人,NatMed,2003,9:964-8)的保护作用。
上皮-间充质转换(EMT)过程也已被广泛认为是受损组织经历纤维化反应的常见机制。EMT是完全分化的上皮细胞经历向间充质表型转换的过程，其随后产生成纤维细胞和成肌纤维细胞，并且其被越来越多地认为在上皮损伤后的纤维化和瘢痕形成中起到重要作用。在肺和其它器官损伤后该过程促进纤维化的程度是活跃的研究对象。近来，已经证明转化生长因子(TGF)-β在体外和体内在肺泡上皮细胞(AEC)中诱导EMT，并且上皮标记和间充质标记共定位于特发性肺纤维化(IPF)患者的肺组织中的增生性II型(AT2)细胞，表明AEC可表现出极度可塑性并在肺纤维化中作为成纤维细胞和/或成肌纤维细胞的来源。首次描述了TGF-β1在正常哺乳动物上皮细胞中作为EMT的诱导物(Miettinen等人,1994,127:2021-2036)并其后证明在体外在许多 不同的上皮细胞中介导EMT，所述上皮细胞包括肾近端小管、晶状体和最近的肺泡上皮细胞(Fan等人,Kidney Int,1999,56:1455-1467；Hales等人,Curr Eye Res,1994,13:885-890；Kasai等人,Respir Res,2005,6:56；Saika等人,AmJPathol,2004,164:651-663；和Willis等人,Am J Pathol,2005,166:1321-1332)。因此，EMT在纤维化中可起到常见的通用作用，无论潜在疾病病因如何。
尽管有关纤维化及其潜在的分子过程的知识有限(或缺乏)，但是纤维化疾病代表了缺乏有效疗法的最大类别的病症之一，并因此表现出严重不足的医学需求。通常，对纤维化患者的唯一补救是器官移植。然而，因为器官供应不足以满足需要，所以患者常常在等待接受合适器官期间死亡。仅肺纤维化可能是在硬皮病肺疾病、特发性肺纤维化、放疗和化疗诱导的肺纤维化和职业性吸入尘粒所致病况中的主要死亡原因。缺乏合适的抗纤维化治疗，主要是因为对纤维化疾病的病因学基本上还是未知的。了解如何控制正常组织修复和该过程在纤维化疾病中如何出错以便鉴定有效的治疗方法将是至关重要的。
能够治疗纤维化病况的新的治疗解决方法将促进本领域。具体地讲，成功靶向潜在原因的治疗对任何类型的纤维化疾病都通用，并且它能够延缓、逆转和/或消除纤维化或引起纤维化的潜在分子过程(包括EMT)。
发明概述
本发明部分地基于本发明人的如下发现：先前公开的多肽/肽的一个亚类是BMP(骨形态发生蛋白)受体(包括I型和II型受体)的激动剂，并且所述多肽/肽能够抑制和/或逆转上皮向间充质转换(EMT)和纤维化，并因此可用于治疗性治疗纤维化和纤维化相关的或涉及到纤维化的病况。因此，本发明涉及某些多肽/肽的设计、制备、以及在治疗、抑制、逆转和/或消除纤维化和/或导致或引起纤维化病况的某些潜在病况(包括EMT)中的用途。利用本发明，具体而言是利用本发明的多肽/肽和方法，提供在机体的任何组织和/或器官中治疗任何纤维化病 况，包括但不限于糖尿病性肾病相关的纤维化、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病。
最近，已经发现转化生长因子β(TGF-β)，作为纤维发生的重要介质，是EMT的诱导物，EMT进而介导纤维化。进一步鉴定BMP-7逆转TGF-β-诱导的EMT，由此表明BMP-7在抵消经由EMT的纤维化发生中的作用。本发明人发现先前公开的肽的特定亚类(如本文中进一步描述)是BMP激动剂，即模拟BMP或其特定亚部分并且经由BMP受体而结合和活化BMP信号转导的肽，有效抑制和/或逆转EMT和与包括以下在内的各种病况相关的纤维化：糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病。
因此，第一方面，本发明涉及某些肽或多肽(即，其可互换地称为本发明的“化合物”、“肽”或“多肽”)，其是BMP受体(包括I型和II型受体)的激动剂，并且其是先前公开的肽的一个亚类。已经发现本发明的BMP-激动剂化合物诱导BMP信号转导，从而模拟BMP对TGF-β-诱导的EMT和纤维化的抵消作用。在其它方面，本发明提供本发明的BMP-激动剂肽的制备方法，包括通过生物和化学或合成方法。在再其它方面，本发明涉及分离的核酸分子，其编码本发明的肽或前肽(其可被切割或经其它修饰以形成所需的本发明的BMP-激动剂肽)，其包括用于在体外或体内制备本发明的肽的核酸分子，例如在为了体基因转移的目的中作为将本发明的肽递送到有需要的受试者的手段。在又其它方面，本发明涉及物质的药物组合物，其包含本发明的一种或多种肽，或本发明的前肽，或编码所述肽或前肽的一种或多种核酸分子，和一种或多种药学上可接受的载体。在又一方面，本发明涉及在纤维化疾病患者中给予治疗有效量的本发明的肽或药物组合物以治疗或预防(即预防性给予)纤维化或导致纤维化的相关潜在病况病症(例如EMT)的方法，包括但不限于治疗糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病。再一方面，本发明涉及药盒或药物包装，其具有一个或多个容器、一种或多种本发明的肽或多肽或包含它们的药物组合物、以及使用所述药盒或药物包装的内容物的说明书。
在具体的实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽可包含具有选自SEQ ID NO:1-77(如表1或下文的他处所示)的氨基酸序列的肽。在某些其它实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽可包含具有与SEQ ID NO:1-77的那些肽相似的序列的肽，并且其特别可包含这样的肽，所述肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少99％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少95％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少90％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少85％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少80％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少75％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少70％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少65％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少60％或更大的序列同一性。
在其它实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽可包含本发明的肽(和/或前肽，视情况而定)的任何合适的变体、类似物、同源物或片段，和与之相关的小分子。在一个实施方案中，所述肽调节上皮向间充质转换(EMT)过程。在另一个实施方案中，所述肽调节纤维化。在具体的实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽(其可包括其任何合适的变体、类似物、同源物或片段)模拟BMP信号转导过程。在其它具体的实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽(其可包括其任何合适的变体、类似物、同源物或片段)将抵消、抑制和/或逆转TGF-β-诱导的EMT。在再其它实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽(其可包括其任何合适的变体、类似物、同源物或片段)将抑制、逆转或以其它方式消除纤维化。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含编码表1的SEQ ID NO:1-77的那些肽或并非表1的那些具体实施方案而在本发明范围内的任何肽或前肽的核苷酸序列。在又一个实施方案中，所述分离的核酸分子可以是DNA表达或克隆载体，并且所述载体可以任选地包括可与所述核酸操作性连接的启动子序列，其中启动子引发编码本发明的肽或前肽的核苷酸序列的表达。在再一个实施方案中，可将所述载体转化到细胞中，所述细胞例如原核或真核细胞，优选哺乳动物细胞，或更优选人体细胞。在再一个实施方案中，所述载体可以是能感染哺乳动物细胞并导致SEQ ID NO:1-77的多肽在感染所述病毒的动物中表达的病毒载体。在仍其它实施方案中，所述核酸分子包含用于实现在宿主细胞中有效表达的任何合适的和/或有利的元件，无论所述宿主细胞是原核还是真核宿主细胞，无论表达是在体外还是在体内进行。在再其它实施方案中，本发明的核酸分子可包含体基因转移载体，以将编码本发明的肽或其任何变体、类似物、同源物或片段(包括其任何有用的前肽)的核酸序列引入，用于通过体基因转移将本发明的肽给予有需要的受试者。
就前肽而言，所述前肽是本发明的肽的无活性形式，其可在某些条件下被激活。制备前体药物或前抗体的方法是已知的。在一个实施方案中，所述前肽可包含与目标肽连接的一个或多个额外的多肽序列。在一种形式中，所述前肽是包括完整多肽序列的前导序列或末端部分的单一的多肽翻译产物，所述前导序列或末端部分最初随产物表达而存在，并且其降低或消除或掩蔽目标肽的活性。前导序列或末端部分，一旦被去除(例如通过蛋白酶切割)，导致肽重获其BMP信号转导活性。
在本发明的药物组合物的实施方案中，所述组合物可包含本发明的肽或多肽，有或无药学上可接受的载体。
在本发明的药物组合物的其它实施方案中，本发明的组合物可包 含一种或多种另外的活性剂。一种或多种另外的活性剂可包括其它抗纤维化疗法。一种或多种另外的活性剂还可包括涉及到导致或参与或涉及纤维化病况的潜在疾病或病况的其它疗法。例如，在纤维化是糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病的组成部分的某些实施方案中，所述另外的一种或多种活性剂可包括有效针对治疗不同于纤维化本身的这些潜在病况的其它症状或方面的药剂。
在涉及到本发明肽的生产和/或制备方面，本发明涉及有关方法的某些实施方案，所述方法包括在提供表达所述肽的条件下培养含有编码SEQ ID NO:1-77的核酸分子的细胞；和回收所表达的肽。在某些其它实施方案中，所述核酸分子可编码SEQ ID NO:1-77或本发明的任何其它BMP-激动剂肽的合适变体、类似物、同源物或片段。
在涉及到药盒的方面，在某些实施方案中，本发明的药盒包括一个或多个容器、本文所述的肽或药物组合物以及使用其中内容物的说明书。在某些实施方案中，所述肽可以是SEQ ID NO:1-77或本发明的任何其它BMP-激动剂肽的合适的变体、类似物、同源物或片段。在其它实施方案中，所述药盒可包含一种或多种其它活性剂，例如可对于治疗导致或包括纤维化要素的病况具有活性的那些，例如用于治疗糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎或硬皮病的第二药剂。在仍其它实施方案中，所述药盒还可包含分离的核酸分子，其编码本发明的BMP-激动剂肽或者SEQ ID NO:1-77或本发明的任何其它BMP-激动剂肽的变体、类似物、同源物或片段。在有需要的受试者中治疗纤维化的方法中，药盒的核酸分子可以适用于体基因转移。
在涉及到本发明的肽或编码本发明的肽的核酸分子在治疗纤维化或者治疗涉及或引起纤维化病况的病况中的用途的方面，在多个实施方案中，本发明提供在治疗下的纤维化涉及糖尿病性肾病、肝硬化、 特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎或硬皮病。在某些实施方案中，本发明提供治疗慢性肾病(CKD)相关的纤维化、即CKD相关的肾纤维化的方法。在某些其它实施方案中，本发明的方法涉及治疗特发性肺纤维化。在仍其它的实施方案中，本发明涉及治疗肝硬化相关的纤维化的方法。在再其它的实施方案中，本发明提供治疗心纤维化的方法。在其它实施方案中，本发明提供治疗动脉粥样硬化相关的纤维化的方法。在再其它的实施方案中，本发明提供治疗硬皮病相关的纤维化的方法。
在某些实施方案中，本发明提供通过经由合适方式给予受试者治疗有效量的本发明的BMP-激动剂肽或其变体、类似物、同源物或片段(包括表1中如SEQ ID NO:1-77所确定的肽中的任一个或多个)以治疗、抑制和/或逆转以下的疾病过程相关的纤维化的方法：例如，与糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎或硬皮病相关的纤维化。本发明的肽的给予可通过合适方式进行，包括口服、胃肠外、输注、注射、吸入或经由皮肤或通过任何可行的方式。在又一个实施方案中，可以核酸分子的形式递送本发明的肽(包括本发明的肽的任何前肽、或任何变体、类似物、同源物或片段)，所述核酸分子经设计以编码并在宿主体内表达本发明的肽。
在本发明的方法中，给予的本发明的BMP-激动剂肽可包含具有与SEQ ID NO:1-77的那些肽相似的序列的肽，并且其特别可包含这样的肽，所述肽具有的氨基酸序列与任何SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少99％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少95％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少90％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少85％或更大的序列同一性，或与SEQID NO:1-77的任一个具有至少80％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少75％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个 具有至少70％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少65％或更大的序列同一性，或与SEQID NO:1-77的任一个具有至少60％或更大的序列同一性。
根据以下详述，这些和其它实施方案被公开或者是显而易见的，并包含在以下详述中。
附图简述
结合附图，可以最大限度地理解以下详述，所述详述是以举例方式给出，不得视为将本发明仅限于所述的具体实施方案中。
图1描绘了对两种浓度(100μM和200μM)的所鉴定的肽SEQ ID NO:1-11的E-钙粘蛋白荧光的定量比色分析。通过荧光水平所示的E-钙粘蛋白表达的损失是上皮表型的损失的指示。可以用上皮表型的损失的其它标记进行类似分析，所述其它标记包括细胞角蛋白和顶端肌动蛋白-结合跨膜蛋白-1(MUC-1)的损失。E-钙粘蛋白表达的损失是EMT的普遍特征，无论起始刺激物如何(Hay E D,Acta Anat.,1995,154:8-20)。可通过增加E-钙粘蛋白产量而观察间充质表型的逆转(Vanderburg CR,Acta Anat,1996,157:87-104)。
图2–16是荧光显微图，显示所测试的化合物(SEQ ID NO:1-11)对E-钙粘蛋白(上皮表型的标记)水平的影响。图2显示了因在仅暴露给培养基的HK-2细胞上表达的E-钙粘蛋白的免疫荧光染色的荧光，而图3(在100mM D-葡萄糖存在时的细胞)显示了D-葡萄糖-诱导的E-钙粘蛋白表达的损失(经细胞的免疫荧光染色而观察)。图4–16显示了分别用100mM D-葡萄糖和100uM化合物SEQ ID NO:1(TFA盐、乙酸盐和氯化物盐)以及100uM化合物SEQ IDNO:2–11处理的HK-2细胞的免疫荧光。因为不清楚在所有情况下如何根据荧光显微图来评价化合物的作用，所以开发了比色分析方法(参见实施例1-4的方法与材料，部分C)，并且分析结果见表3和图1。
图17描绘了支持实施例2所论述的研究的STZ实验方案。在标准动物养殖条件下维持正常饮食的远系繁殖(out-bred)CD1小鼠上进 行实验。小鼠接受单次腹膜内注射在柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中的链脲霉素(STZ)，剂量200mg/kg。通过尾静脉采样，使用葡萄糖氧化酶的酶促试验(Medisense glucometer,Abbott Laboratories,Bedford,MA)测定血糖。在STZ注射后5或6个月结束时(溶媒对照组)或6个月结束时(THR123或BMP-7组)处死的动物组中评价糖尿病性肾病。实验设计详见图17。从STZ注射后第5个月至第6个月，一组经STZ注射小鼠接受每天口服给予剂量为5mg/kg体重的Thrasos化合物达一个月。从第1个月至第6个月，腹膜内给予剂量为300μg/kg体重的BMP-7。
图18–22是在图17所概述的和实施例2和3以及图24-29所讨论的研究中的代表性的小鼠组织显微照片。更具体地讲，这些是来自以下小鼠的肾切片的代表性显微照片：对照小鼠、在糖尿病性肾病诱导后5个月的小鼠、在糖尿病性肾病诱导后6个月的小鼠、在糖尿病性肾病诱导后6个月并在诱导后1至6个月用BMP7治疗的小鼠、以及在糖尿病性肾病诱导后6个月并在诱导后1至6个月用THR-123化合物(SEQ ID NO 1)治疗的小鼠。
图18：对照小鼠(无STZ,n＝5)的肾切片的代表性组织学。
图19：根据图17所概述的和实施例2和3以及图24-29所讨论的研究，STZ-诱导的糖尿病性肾病后5个月的小鼠(n＝6)的肾切片的代表性组织学。
图20：根据图17所概述的和实施例2和3以及图24-29所讨论的研究，糖尿病性肾病诱导后6个月的小鼠(n＝10)肾切片的代表性组织学。
图21：根据图17所概述的和实施例2和3以及图24-29所讨论的研究，在糖尿病性肾病诱导后6个月并在诱导后1至6个月用BMP-7治疗的小鼠(n＝4)的肾切片的代表性组织学。
图22：根据图17所概述的和实施例2和3以及图24-29所讨论的研究，在糖尿病性肾病诱导后6个月并在诱导后5至6个月用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗的小鼠(n＝9)的肾切片的代表性组织学。
图23描绘了图18-22中鉴定的肾切片的H&E(苏木精和曙红)和马松三色(Masson'strichrome)染色的定量测定。马松三色-染色切片用于分析在间质组织中的胶原蓄积。用该染色，胶原被染成蓝色，细胞呈红色。图显示了在糖尿病性肾病诱导后5和6个月在小鼠肾中的间质纤维化的明显增加。然而，在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)后的小鼠中，表明间质纤维化的胶原蓄积明显减少。该分析方法在实施例1-4的方法C中讨论。用THR-123在最后一个月的治疗效果类似于BMP-7治疗最后5个月所观察到的效果，并且效果足够大以表明纤维化逆转。
图24描绘了与正常动物所观察到的相比，在糖尿病性肾病诱导后5和6个月时FSP-1(成纤维细胞分泌蛋白-1，一种间充质标记)表达净增加分别为27和29倍。这样的增加在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)的小鼠中被明显降低。经1个月治疗之后，THR-123使标记浓度降低至小于在5和6个月时水平的1/10。
图25描绘了与正常动物相比，在糖尿病性肾病诱导后5和6个月，小鼠表现出高百分率的损伤小管。然而，小管损伤在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)的小鼠中明显减少。因此，暴露给STZ导致了肾皮层中的完整小管的持续损失。1个月后开始给予BMP终止了该进展，并且在研究的最后一个月期间给予THR-123表现出逆转小管的损失。
图26描绘了肾的相对间质体积在糖尿病性肾病诱导后5和6个月的小鼠中明显增加，而在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)或用BMP-7治疗(从第1个月到第6个月)的小鼠中明显减少。因此，在第一个月后开始用BMP7治疗终止了间质体积增加的进展，并且用THR-123(SEQ ID NO:1)治疗表现出逆转该进展。
图27描绘了肾小球表面在糖尿病性肾病诱导后5和6个月的小鼠中明显增加，而在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)或用BMP-7治疗(从第1个月到第6个月)的小鼠中明显减少。因此，用BMP7治疗表现出减慢肾小球的恶化，但THR-123(SEQ ID NO:1)表现出无效果。
图28描绘了在糖尿病性肾病诱导后5和6个月的小鼠中肾小球膜基质(mesangialmatrix)增加。这种增加在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)或用BMP-7治疗(从第1个月到第6个月)的小鼠中被明显降低。在6个月，用SEQ ID NO:1的治疗使该水平降低至37％。
图29描绘了在糖尿病性肾病诱导后5和6个月的小鼠中BUN水平增加。然而，在糖尿病性肾病诱导后用THR-123(SEQ ID NO 1)治疗1个月(从第5个月到第6个月)或用BMP-7治疗(从第1个月到第6个月)的小鼠中，BUN水平降至对照动物的水平，表明在THR-123治疗后肾功能的明显改善。因此，在研究的最后5个月中给予BMP7，使BUN水平增加至2％，而用THR-123(SEQ ID NO:1)在处死前的最后一个月进行治疗，将BUN的增加从5个月时的85％降低至12％。
图30提供了描述本发明的肽(称为THR-123)的结构的图。该化合物对应于表1的SEQ ID NO:1。该图进一步包括左边的hBMP7结构的三维stick模型并显示了hBMP7中的保守环的位置，其被THR-123至少部分地通过位置1的半胱氨酸和残基11的半胱氨酸之间的二硫键的策略性安置所模仿。
图31提供了一个表格，显示出对于与I型和II型BMP受体结合，THR-123(SEQ IDNO:1)和BMP-7的比较。如同BMP-7，THR-123与ALK2和ALK3(I型)BMP受体和BMPR-II(II型)BMP受体两者结合。然而，BMP-7，而非THR-123与ALK6(I型)受体结合。值得特别注意的是，与BMP7不同，THR-123不与ALK6BMP I型受体ECD结合。
图32显示了THR-123(SEQ ID NO:1)诱导Smad 1/5/8磷酸化和核易位，表明所述化合物是BMP信号转导的激动剂。将人肾近端小管上皮细胞(HK-2)在THR-123存在(右图)和不存在(左图)时孵育。细胞经洗涤后，与针对phospho Smad 1/5/8的第一抗体一起孵育，然后用荧光标记的第二抗体进行免疫染色。在肾纤维化中pSmad 1/5/8的显著性依赖于TGF-β-依赖性促纤维化途径的BMP7抑制，所述途径对肾纤维化损伤至关重要。具体地讲，这样的TGF-β-依赖性促纤维化途径的BMP7抑制，部分地由下游BMP靶蛋白Smad 1、5和8的活化而介导。(Manson SR等人,J.Urol.85:2523-30,2011)。
图33显示了单侧输尿管阻塞(UUO)后间质体积的增加在图中是明显的。UUO动物显示出间质空间扩大3倍。在接受BMP-7或THR-123(SEQ ID NO:1)的动物中，间质空间的扩大被明显减少，表明Thrasos化合物阻止了间质纤维化。
图34显示了通过分析胶原沉积(纤维化的指标)进一步检查了单侧输尿管阻塞(UUO)后肾间质组织的扩大。与假手术的肾相比，在经溶媒治疗的UUO肾中，羟脯氨酸含量(总胶原的度量)增加了3倍。THR-123(SEQ ID NO:1)和BMP-7有效地降低了UUO-诱导的羟脯氨酸含量的增加，表明THR-123改善了UUO-诱导的肾纤维化。
图35提供柱状图，显示在人肾小管上皮细胞(HK-2)中，THR-123(SEQ ID NO:1或“THR-C”)和特定抑制剂SB 203580对p38MAPK的磷酸化水平的作用的比较。p38MAPK的重要性在于该蛋白涉及对TGF-β-依赖性EMT的非Smad-依赖性途径。涉及TGF-β-依赖性EMT的其它非Smad-依赖性途径包括RhoA、Ras、PI3激酶、Notch和Wnt信号转导途径。所述结果显示THR-123在HK-2细胞中有效地抑制了基础p38磷酸化。用作阳性对照的特定抑制剂SB203580和BMP-7，正如所料地抑制了p38磷酸化。在测定中，1uM的较低浓度的THR-123与10uM的所述特定抑制剂效力相同。
图36提供柱状图，显示THR-123(SEQ ID NO:1或“THR-C”)和 特定抑制剂SB203580对TNF-α刺激所致的p38MAPK磷酸化水平的作用的比较。已经证实促炎因子对p38MAPK活性的调节与纤维化有关。结果表明TNFα在HK-2细胞中诱导p38磷酸化，并且TNFα所诱导的磷酸化受到单独的THR-123或THR-123与SB 203580组合的有效抑制。
图37提供柱状图，显示在人肾小管上皮细胞(HK-2)中，THR-123(或“THR-1405”)和特定抑制剂SB 203580对TNF-α-诱导的IL-6(一种炎性标记)产生的水平的作用比较。结果表明TNFα在HK-2细胞中刺激IL-6产生。THR-123或SB 203580单独添加，明显减少了由HK-2细胞产生的TNFα-诱导的IL-6。与单独THR-123相比，添加这两者的组合导致了IL-6产量的更大减少。这些结果表明，通过THR-123阻断p38活化，抑制了作为肾纤维化进展的重要决定因素的细胞炎症。
图38：经由p38促分裂原-激活的蛋白激酶(MAPK)的肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的产生是由肾毒性剂顺铂所致的AKI的发展中的一个关键性机制(Ramesh,G和Reeves,WB.Am JPhysiol Renal Physiol 289:F166-F174,2005)。因此进一步检查THR-123以确定所述化合物是否能够在动物中抑制顺铂-诱导的肾毒性。图中上方的右图和左图显示了对于ICAM-1表达免疫染色的肾切片，下方的右图和左图显示了对于巨噬细胞存在而言的免疫染色。左栏中的肾切片为仅用顺铂治疗，右栏的图为用顺铂和THR-123治疗。上方的图中的箭头指示被THR-123减少的ICAM-1表达。下方的图中的箭头指示经Mac CD-68染色测定的巨噬细胞浸润，THR-123减少这种浸润。结果表明在受损的肾PTEC中能够抑制p38MAPK的THR-123，能够抑制巨噬细胞的小管浸润，并由此在大鼠中抑制顺铂-诱导的肾毒性的炎症。
图39证明了肾近端小管上皮细胞(HK-2)中的上皮-间充质转换(EMT)受到THR-123的阻止。将HK-2细胞暴露给高葡萄糖，导致E-钙粘蛋白表达的显著损失(下图)，这表明EMT被诱导。THR-123在肾PTEC中能有效阻止D-葡萄糖(50mM)诱导的上皮表型的损失(通过E-钙粘蛋白表达来评价)。这些结果表明在血糖过多病况(糖尿病病况)下Thrasos化合物能阻止上皮-间充质-转换(EMT)过程，该过程是涉及小管-间质纤维化的重要机制。
图40证明了口服给予的THR-123对小鼠慢性肾病的晚期糖尿病性肾病模型的作用。当在糖尿病性肾病诱导后小鼠用口服THR123治疗1个月(从第5个月到第6个月)时，所述化合物减少了肾纤维化(右下图)并减少了间质体积(柱状图)。
图41证明了THR-123不能诱导多能干细胞(C3H10T1/2)的成骨细胞性分化。将用单独介质、BMP-7或THR-123处理的鼠多能间充质干细胞(C3H10T1/2)针对碱性磷酸酶活性(一种骨发生标记)染色。当用单独介质(对照,图A)或用THR-123(图B)处理时未见细胞染色。作为阳性对照的BMP-7,2ug/mL(图C)诱导多能干细胞的成骨细胞性分化，如针对碱性磷酸酶活性染色所示。细胞用苏木精复染色。
图42.在肾小管中的内源Alk-3表达对肾纤维化的作用。A.定量实时PCR。在肾毒性血清肾炎诱导之前(第0天)和之后(免疫后1周、3周、6周和9周)，自C57BL/6小鼠肾中分离总RNA。使用针对指定基因的特定引物组进行定量RT PCR。本图显示了在每个时间点针对18sRNA的相对表达。B-D.对照或肾毒性血清处理的肾的马松三色染色的代表性的图。放大倍数x100。E-G.用对磷酸化Smad1(活性BMP信号转导的标志)具有特异性的抗体标记的相应的肾(B-D)的代表性的图。放大倍数x200。H.示意图。将表达处于γGT启动子控制之下的Cre-重组酶的小鼠培育成这样的小鼠：其中通过floxed STOP盒将LacZ报道基因与Rosa26启动子分开，产生γGT-Cre；R26R-STOP-LacZ报道小鼠。I-J.β-半乳糖苷酶染色。对照R26R-STOP-LacZ小鼠(I)和γGT-Cre；R26R-STOP-LacZ报道小鼠(J)的肾经酶促染色，以检测用曙红复染色的β-半乳糖苷酶活性(蓝色沉淀)。图中的箭头指示代表性的LacZ染色。放大倍数x400。K.示意图。通过将γGT-Cre小鼠与携带floxed Alk-3等位基因的小鼠杂交，产生在肾小管上皮细胞(γGT-Cre,Alk-3flox/flox)中条件性地缺乏Alk-3的小鼠。L-M.Alk-3免疫组织化学分析。Alk-3在对照Alk-3flox/flox小鼠中稳健表达(L)。在γGT-Cre；Alk-3flox/flox小鼠(M)中未检出小管Alk-3蛋白表达。N-U.组织病理学。γGT-Cre；Alk-3flox/flox小鼠和同窝对照小鼠(Alk-3flox/flox)用肾毒性血清进行攻击。放大倍数x200的马松三色染色肾的代表性的图。V.在NTN肾中的纤维化的定量测定。通过imageJ软件分析马松三色染色图并定量测定纤维化面积。在每个时间点分析4-6只小鼠。W.在NTN 60天，在γG-Cre；Alk-3flox/flox小鼠(n＝5)和同窝对照小鼠(n＝3)中测定血液尿素氮。X,Y.对照(Alk3flox/flox)和γGTCre；Alk3flox/flox小鼠的肾的E-钙粘蛋白/FSP1免疫标记。Z.通过计数双重标记的小管数量，评价E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性小管的百分率，每玻片500小管，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值±s.e.m.。
图43.在γGT-Cre；Alk3flox/flox小鼠中增加的小管p-smad2蓄积。A,B.Alk3flox/flox和gGTCre；Alk3flox/flox小鼠的肾的phospho-smad2(p-smad2)免疫标记。C.在小管中评价p-smad2阳性小管的百分率，每玻片500小管，每个实验组5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。
图44.在γGT-Cre；Alk3flox/flox小鼠中的巨噬细胞蓄积。使用Mac-1抗体标记冷冻切片的巨噬细胞并通过荧光显微镜术进行免疫荧光分析。在无病的肾中(A和B)发现少量巨噬细胞。在Alk3flox/flox小鼠的NTN肾中，巨噬细胞蓄积(C)，这样的巨噬细胞蓄积在γGT-Cre；Alk3flox/flox小鼠(D)的NTN肾中是明显的。显示了来自5个独立实验的代表性的图。
图45.THR-123的药代动力学。A.BMP7结构图，其残基量来自对其作图的分析。B,C.对单个I型受体、Alk-3(B)和Alk-6(C)具有特异性的放射性-配体受体结合测定。Alk-3或Alk-6的高度纯化的胞外域(ECD)(作为与Fc结构域的融合蛋白表达)作为受体。在每次测定中，将纯化受体固定在各孔并加入肽类似物或未标记的BMP7，然后加入125I-标记的BMP7。在自动γ计数器上对放射性标记的BMP7复合物计数。结果表示为平均值±s.e.m.。在两次测定中作为阳性对照的未标记的BMP7，给出线性的剂量相关的反应曲线。D,E.在经由尾静脉iv注射THR-123(125I-Tyr)之后在Wistar大鼠体循环中的THR-123的浓度，其通过总放射性测量法来测定。α期(D)为大约90％注射剂量并具有非常短的半寿期。β期(E)为注射剂量的剩余的10％并具有长得多的半寿期，为55–58min。F.125I-THR-123的组织分布。大鼠经静脉内给予剂量为6.25mg/kg-体重的125I标记-THR-123后6小时，收获组织并通过自动γ孔计数器分析。大部分放射性位于肾和膀胱内。G.口服给予THR-123和THR-123从体内的清除。口服给予剂量为5mg/kg体重的125I标记-THR-123的放射性在给予后1-6小时之间定位于肾内，峰值在大约3小时。125I标记-THR-123的放射性在给予后24小时从肾中完全清除。
图46.THR-123的体外稳定性。将THR-123以0.1mg/mL的终浓度加入到新鲜收获的大鼠血液(雄性Sprague-Dawley,0.35kg BW)和血浆以及PBS-甘露醇缓冲液中。将血液、血浆和缓冲液的母管在37℃孵育至多6h并在0、7.5、15、30、60、120、240和360min收集双份样品的500μl(血液)和250μl(血浆和血液)用于分析。使用检测限为1μg/ml的LC-MS-MS方法分析样品中的THR-123。THR-123在血浆中缓慢降解，半寿期为358min，而在血液中降解较快，半寿期仅为70min。在PBS-甘露醇缓冲液中，超过400min未观察到降解。
图47.THR-123的抗炎活性。将PTEC-衍生的HK-2(HK-2)细胞培养在24-孔板(30,000细胞/孔)上。将细胞暴露给单独的K-SFM培养基或TNF-α(5ng/ml)。TNF-α孵育后20小时，细胞用预加温的培养基洗涤2次，随后将细胞与不同浓度的THR-123或BMP7孵育60小时。在孵育结束时，收获培养基并进行ELISA分析。A:IL-6,B:IL-8和C:ICAM-1结果已给出。一式三份地进行分析，图中数据显示为平 均值±s.e.m.。
图48.THR-123在NP-1细胞中抑制TGF-β-诱导的细胞凋亡。在指定分子存在时将NP-1细胞与TGF-β(3ng/ml)一起孵育24h。通过膜联蛋白V标记(Roche)分析细胞凋亡。单用TGF-β(A)、用TGF-β+BMP-7(1μg/ml)(B)、TGF-β+THR-123(10μM)(C)和TGF-β+ctrl肽(D)处理的细胞的代表性的合并图(绿色：膜联蛋白V和明视场图像)。TGF-β增加细胞凋亡，而BMP-7和THR-123减少细胞凋亡。
图49.THR-123在NP-1细胞中抑制缺氧-诱导的细胞凋亡。在指定分子存在时将NP-1细胞在缺氧(2.5％O2)时孵育24h。通过膜联蛋白V标记(Roche)分析细胞凋亡。单用缺氧(A)、用缺氧+BMP-7(1μg/ml)(B)、缺氧+THR-123(10μM)(C)和缺氧+ctrl肽(D)处理的细胞的代表性的合并图(绿色：膜联蛋白V和明视场图像)。缺氧增加细胞凋亡；BMP-7和THR-123减少细胞凋亡。
图50.THR-123在人近端小管上皮细胞(HK2)中抑制顺铂-诱导的细胞凋亡。将永生化的人近端小管上皮-衍生的HK-2(人肾-2)细胞在24-孔板上传代(～25,000至30,000细胞/孔)。将细胞暴露给单独的K-SFM培养基或者含有THR-123的K-SFM培养基。BMP7作为实验的阳性对照。孵育后2小时，将细胞暴露给顺铂60小时(A-C)。D.将细胞暴露给顺铂6小时，然后将THR-123加入到培养基中。通过膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(TACS膜联蛋白V-FITC)(R&D Systems)染色，然后通过荧光显微镜术测定细胞凋亡。终浓度：THR-123250μM、BMP-71μg/ml、顺铂10μM。
图51.THR-123在NP-1细胞中抑制上皮-间充质转换。A-E：明视场图像。暴露给TGF-β(各3ng/ml在无血清DMEM培养基中)和EGF达48h的细胞经历EMT，显示出细胞形状与对照细胞相比明显拉长(A、B)。BMP-7(1μg/ml)或THR-123(10μM)的共孵育阻止这些表型变化(C、D)。对照肽显示出对TGF-β-诱导的EMT无效果(E)。F-J.E-钙粘蛋白免疫荧光标记。NP-1细胞在细胞边缘表达E-钙粘蛋白(F)。 暴露给TGF-β达48h的细胞表现出E-钙粘蛋白水平与对照细胞相比明显下降(F、G)。BMP-7(1μg/ml)或THR-123(10μM)的共孵育阻止E-钙粘蛋白的损失(H、I)。对照肽显示出对TGF-β-诱导的EMT无效果(J)。显示了代表性结果。
图52.THR-123在MCT细胞中抑制上皮-间充质转换。THR-123抑制EMT。暴露给TGF-β(各2.5ng/ml在无血清DMEM培养基中)达48h的细胞经历EMT，显示出细胞形状明显拉长(B)。THR-123(10μM)的共孵育阻止了这些表型变化(C)。D、E.间充质标记CTGF(D)和Snail1(E)的qPCR分析。从细胞中提取总RNA。1μg总RNA用于产生互补cDNA，然后进行qPCR。N＝3。图中的数据表示为平均值±s.e.m.。
图53.THR-123在NP-1细胞中逆转EMT。A-E：倒置显微镜图。A.NP1细胞的基底多边形上皮性质。B.与TGF-β和EGF孵育48h诱导EMT并显示出拉长的纺锤形细胞。C、D.将BMP 7(1μg/ml)(C)或THR-123(10μM)(D)加入到经TGF-β和EGF诱导的间充质样细胞中再过48小时。细胞显示出形态学的逆转并再次显示出多边形上皮性质(C、D)。E.Ctrl肽不逆转EMT。F.在逆转实验中计算长宽比。通过使用倒置显微镜，得到孔中不同区域的细胞的5个代表性图。分析了总共100个细胞(每图20个细胞)。上皮细胞形态学特征在于较低比例，而间充质细胞表现为较高比例。图中的数据表示为平均值+s.e.m.。G.NP-1细胞的基础长宽比为1.4+0.2(平均值±SD)。平均值加上一个SD被估计为上皮特征并估计了各实验设置中的上皮特征的百分率。18％BMP7和24％THR-123处理的NP-1细胞重新得到上皮特征。H-L.E-钙粘蛋白的免疫荧光图。与未经处理的细胞相比，TGF-β孵育降低了E-钙粘蛋白水平(H、I)。BMP-7(J)和THR-123(K)在TGF-β-孵育的NP-1细胞中逆转了E-钙粘蛋白表达。Ctrl肽显示对E-钙粘蛋白水平无影响(L)。显示了3次独立实验的代表性结果。
图54.THR-123在MCT细胞中逆转TGF-β-诱导的EMT。A-E. 细胞通过TGF-β和EGF孵育48h而诱导EMT(E)。EMT诱导后，将细胞与BMP-7(1μg/ml)(C)、THR-123(10μM)(D)或对照肽(E)再孵育48h。观察到EMT逆转(C、D)。Ctrl肽表现出无效果(E)。F.在逆转实验中计算长宽比。通过使用倒置显微镜，得到孔well中不同区域的细胞的5个代表性图。分析了总共100个细胞(每图20个细胞)。上皮细胞形态学特征在于较低比例，而间充质细胞表现为较高比例。图中的数据表示为平均值±s.e.m.。G:在MCT细胞中长宽比为3或以下被估计为上皮特征，并估计了各实验设置中的上皮特征的百分率。52％BMP7和41％THR-123处理的MCT细胞重新得到上皮特征。实验重复3次。
图55.THR-123对缺血再灌注损伤所致的急性小管损伤的影响。通过将左肾蒂钳制25分钟诱导缺血再灌注损伤(IRI)。缺血再灌注损伤后，小鼠接受THR-123口服(5mg/kg/天)或PBS直到处死之日。A.缺血再灌注后在磷酸盐缓冲盐水处理的小鼠中的肾组织学显示了严重急性小管坏死。箭头指示坏死的小管。B.缺血再灌注程序后，同时给予THR-123治疗的小鼠中的肾组织学显示了轻度小管坏死。C.在THR-123处理的小鼠中的肾小管坏死百分率显著地小于经磷酸盐缓冲液处理的小鼠。分析了每组的10个视场。D.在第7天IRI通过quantichrome比色尿素测定法估计血液尿素氮。所有组都无差异。分析了PBS组(n＝5)和THR-123-处理组(n＝4)。图中数据显示为平均值±s.e.m.。
图56.THR-123对单侧输尿管阻塞(UUO)小鼠的影响。在UUO之日，开始BMP-7(300μg/Kg/每隔一天,腹膜内给予)或THR-123(5mg/Kg/天，口服或腹膜内给予)。A-D：正常肾、第5天UUO肾的马松三色染色。A.正常肾切片。B.第5天UUO小鼠肾显示正常肾小球、小管萎缩、小管扩张和间质性炎症。C、D.用5mg/kg(C)或15mg/kg(D)的THR-123口服治疗的UUO小鼠肾显示了较少的小管萎缩、小管扩张和间质性炎症。E.相对间质体积的形态测量分析。通过 点计数法计算间质体积。F-I.正常肾、第7天UUO肾的马松三色染色。与用PBS治疗(F)的小鼠相比，用BMP7-腹膜内(G)或THR-123-腹膜内(H)/口服(I)治疗的UUO小鼠显示了较少的肾间质体积。J.相对间质体积的形态测量分析。通过点计数法计算间质体积。对于小管-间质损伤的定量测定，在每只小鼠中分析每个肾的8视场。正常小鼠(n＝4)、第5天UUO无治疗(n＝4)、第5天UUO并用5mg/kg THR-123治疗(n＝4)、第5天UUO并用15mg/kg THR-123治疗(n＝4)、第7天UUO并用PBS治疗(n＝8)、第7天UUO并用BMP治疗(n＝8)和第7天UUO并用THR-123治疗的小鼠(同时对于i.p.和口服，n＝7)。图中数据显示为平均值±s.e.m.。
图57.THR-123对单侧输尿管阻塞(UUO)小鼠的影响(H&E染色)。在UUO进行之日，开始BMP7治疗(300μg/Kg/每隔一天，腹膜内给予)或THR-123治疗(5mg/Kg/天，口服或腹膜内给予)。A.正常肾切片。B.第5天UUO小鼠。C、D.用5mg/kg(C)或15mg/kg(D)的THR-123口服治疗的UUO小鼠肾。E-H.第7天UUO肾组织学。当与在第7天的PBS治疗(E)的UUO肾相比时，用BMP7-腹膜内(F)或THR-123-腹膜内(G)/口服(H)治疗的UUO小鼠在肾中表现出维持的小管。正常小鼠(n＝4)、第5天UUO无治疗(n＝4)、第5天UUO并用5mg/kg THR-123治疗(n＝4)、第5天UUO并用15mg/kg THR-123治疗(n＝4)、第7天UUO并用PBS治疗(n＝8)、第7天UUO并用BMP治疗(n＝8)和第7天UUO并用THR-123治疗的小鼠(i.p.和口服两者，n＝7)。
图58.在UUO小鼠中对纤维化标记进行基因表达分析。在正常肾和第7天UUO肾(有或无指定治疗)中对于纤连蛋白-EIII和胶原I型进行定量RT-PCR分析。
图59.AA-123在肾毒性血清肾炎小鼠中逆转肾纤维化。A-D.来自以下小鼠肾切片的代表性马松三色染色图：未治疗的对照小鼠(A)；6周NTN(B)；NTN后9周(C)；和在6周NTN开始给予THR-123的9周NTN(D)，原始放大倍数x200。E-G.以下小鼠的形态测量分析： 对照小鼠(0周)(n＝5)，在NTN诱导后1周(n＝6)、3周(n＝8)和6周(n＝6)的小鼠，以及在6周NTN开始给予THR-123的9周NTN小鼠(THR-123(6-9W)(n＝6))，评价肾小球硬化症评分百分率(E)、小管萎缩指数(F)和纤维化指数(G)。H.对以下小鼠进行血液尿素氮测量：6周NTN(n＝3)、9周NTN(n＝5)和在6周NTN开始给予THR-123的9周NTN(n＝5)。I-L.来自以下小鼠的肾的E-钙粘蛋白/FSP1免疫标记：对照未治疗小鼠(I)、6周NTN(J)、9周NTN(K)、和在6周NTN开始给予THR-123的9周NTN(L)。显示了代表性结果。M.通过统计双重标记的小管数量，评价E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性小管的百分率，每玻片500小管，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值±s.e.m.。
图60.肾毒性血清肾炎小鼠的肾的光学显微镜(H&E)分析。来自以下小鼠的肾的代表性的组织学H&E染色：未治疗的对照小鼠(A)；6周NTN(B)、9周NTN(C)；和在NTN诱导后6周开始给予THR-123的9周NTN(D)，放大倍数x200。
图61.在肾毒性血清肾炎小鼠中对纤维化标记进行基因表达分析。经由定量实时PCR测定，对在以下小鼠的肾中的纤连蛋白(FN-EIII)和I型胶原(COL-I)进行Fold基因表达：对照小鼠(0周NTS)(n＝5)，1周(n＝6)、3周(n＝8)和6周(n＝6)NTN后的小鼠以及在NTN诱导后6周给予THR-123的9周NTN的小鼠(THR-123(6-9W)(n＝6))。
图62.在肾毒性血清肾炎小鼠中的巨噬细胞分析。A-C.来自以下小鼠的肾的Mac-1免疫标记：未治疗的对照小鼠(A)、6周NTN(B)；和9周NTN(C)、以及在NTN诱导后6周开始给予THR-123治疗的9周NTN(D)，放大倍数x400。E.通过统计每个玻片的5个随机视场中的阳性标记的细胞，评价每个视场(x400放大倍数)的巨噬细胞数，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图63.在NTN中的phospho-smad1/5标记。A-C.指定动物组的冷冻肾切片用phospho-smad1/5(p-smad1/5)抗体标记，然后用FITC-缀合的第二抗体。通过荧光显微镜术分析p-smad1/5水平。图(C)中的箭头 指示核蓄积的p-smad1/5。D.p-smad1/5水平的定量测定。通过统计每个玻片的5个随机视场中的阳性标记的细胞，评价每一视场的p-smad1/5数量(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。
图64.AA-123在COL4A3缺陷型小鼠中抑制肾纤维化。A-C.来自以下小鼠的肾小球的代表性组织学PAS染色：16周龄野生型(A)；16周龄COL4A3-/-(B)、和用THR-123治疗的16周龄COL4A3-/-小鼠(C)，原始放大倍数x400。D-F.来自以下小鼠的肾的代表性的组织学马松三色染色：16周龄野生型(D)；16周龄COL4A3-/-(E)，和用THR-123治疗的16周龄COL4A3-/-小鼠(F)，原始放大倍数x100。G-I.以下小鼠的形态测量分析：16周龄野生型(n＝5)、COL4A3-/-(n＝5)和用THR-123治疗的COL4A3-/-小鼠(n＝5)，评价正常肾小球百分率(G)、小管损伤指数(H)、相对间质体积(I)。J.以下小鼠的血液尿素氮测量：20周龄野生型(n＝5)、16周龄COL4A3-/-(n＝5)和用THR-123治疗的COL4A3-/-小鼠(n＝5)。K-M.肾的FSP1/E-钙粘蛋白免疫标记。显示了代表性结果。N.E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性小管的百分率，每玻片500小管，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图65.在COL4A3缺陷型小鼠中的巨噬细胞分析。A-C.来自以下小鼠的肾的Mac-1免疫标记：16周龄野生型(A)、COL4A3-/-(B)和用THR-123治疗的COL4A3-/-小鼠(C)。原始放大倍数为x400。D.通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的巨噬细胞数的形态测量分析(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。图中的野生型小鼠被称为COL4A3+/+。
图66.在COL4A3缺陷型小鼠中的phospho-smad1/5染色。A、B.指定动物组的冷冻肾切片用phospho-smad1/5(p-smad1/5)抗体标记，然后用FITC-缀合的第二抗体。通过荧光显微镜术分析p-smad1/5水平。图(B)中的箭头指示核蓄积的p-smad1/5。C.p-smad1/5水平的定 量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的p-smad1/5数量(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。
图67.THR-123逆转了小鼠糖尿病性肾病的进程。链脲霉素-诱导的糖尿病CD-1小鼠用BMP7治疗(300μg/kg每隔一天,IP,糖尿病诱导后1-6月)或THR-123治疗(5mg/kg/天,口服，糖尿病诱导后5-6月)。来自以下小鼠的代表性的肾切片组织学PAS染色(A-E)和马松三色染色(F-J)：未治疗的对照小鼠(A,F)；5个月糖尿病性肾病(DN)(B,G)；6个月DN(C,H)；BMP7处理的6个月DN(D,I)；和THR-123处理的6个月DN(E,J)。放大倍数x400(A-E)和x100(F-J)。K-N：肾小球和小管-间质组织的形态测量分析。分析了肾小球表面积(K)、肾小球膜基质(L)、小管萎缩(M)和相对间质体积(N)。对于肾小球的定量测定，在每只小鼠中分析了20个肾小球。对于小管-间质损伤的定量测定，在每只小鼠中分析了每个肾的8个视场。O：在糖尿病小鼠中，THR-123对血液尿素氮水平的影响。P-T:正常(Q)或用BMP7(S)或THR-123(T)治疗的糖尿病(Q-T)小鼠肾的免疫荧光分析(放大倍数x200)，用于检测FSP1和E-钙粘蛋白。图(Q)和(R)中的箭头指示FSP1和E-钙粘蛋白双重阳性小管。U.提供了FSP1+细胞的百分率的定量分析(U)。对每只小鼠分析了10个视场。在所有分析中，分析了对照(n＝5)、糖尿病5个月(n＝6)、糖尿病6个月(n＝10)、BMP7-治疗的糖尿病(n＝4)和THR-123治疗的糖尿病(n＝9)。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图68.在糖尿病小鼠中的肾的PAS染色。显示了以下的PAS染色(x200)：对照(A)、5个月糖尿病性肾病(DN)(B)、6个月DN(C)、用BMP7(D)或THR-123(E)治疗的DN。分析了对照(n＝5)、糖尿病5个月(n＝6)、糖尿病6个月(n＝10)，用BMP-7治疗的糖尿病(300μg/kg每隔一天,IP,糖尿病诱导后1-6个月,n＝4),用THR-123治疗的糖尿病(5mg/kg/天,口服,糖尿病诱导5-6个月,n＝9)。显示了代表性的图。
图69.THR-123在糖尿病性肾病小鼠中减少了巨噬细胞浸润。正 常(A)和用溶媒、BMP7或THR-123治疗的糖尿病性肾病(DN)(B至D)的Mac-1免疫荧光研究。放大倍数x400。巨噬细胞在正常肾的皮质区中少见(A)。DN5个月或6个月后，巨噬细胞在萎缩的小管周围常见(B,C)。BMP7(D)和THR-123(E)显著地减少了巨噬细胞浸润。显示了代表性的图。F.通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的巨噬细胞数(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值±s.e.m.。在图中，糖尿病性肾病被称为DN。
图70.THR-123在DN中增加了phospho-smad1/5标记。A-D.指定动物组的冷冻肾切片用phospho-smad1/5(p-smad1/5)抗体标记，然后用FITC-缀合的第二抗体。通过荧光显微镜术分析p-smad1/5水平。图(C)和(D)中的箭头指示核蓄积的p-smad1/5。(E)p-smad1/5水平的定量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的p-smad1/5数量(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。在图中，糖尿病性肾病被称为DN。
图71.卡托普利和THR-123的组合抑制了晚期糖尿病性肾病相关的纤维化进程。链脲霉素-诱导的糖尿病CD-1小鼠用卡托普利治疗(p.o.50mg/Kg/天,糖尿病诱导后7-8个月)或用卡托普利和THR-123(p.o.5mg/kg/天,糖尿病诱导后7-8个月)的组合治疗。以下的代表性的肾切片的组织学PAS染色(A-D)和马松三色染色(E-H)：7个月DN(A,E)；8个月DN(B,F)；8个月DN用卡托普利治疗(C,G)；8个月DN用卡托普利和THR-123的组合治疗(D,H)。放大倍数x400(A-D)和x100(E-H)。I-L：肾小球表面积(I)、肾小球膜基质(J)、小管萎缩(K)和相对间质体积(L)的形态测量分析。对于肾小球的定量测定，在每只小鼠中分析了20个肾小球。对于小管-间质损伤的定量测定，在每只小鼠中分析了每个肾的8个视场。M：在糖尿病小鼠中，THR-123对血液尿素氮水平的效果。N-Q：免疫荧光分析(放大倍数x200)，用于检测E-钙粘蛋白/FSP1。图(N)和(O)中的箭头指示E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性 小管。R.提供了E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性小管百分率的定量分析。对每个肾分析了10个视场。对以下糖尿病小鼠进行所有分析：7个月(n＝2)、8个月无治疗(n＝3)、卡托普利治疗的8个月糖尿病(n＝3)以及卡托普利和THR-123在8个月糖尿病中的联合治疗(n＝4)。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图72.THR-123和卡托普利在糖尿病性肾病小鼠中减少了巨噬细胞浸润。显示了7个月糖尿病性肾病(DN)(A)、8个月DN(B)、卡托普利治疗的8个月DN(C)以及卡托普利和THR-123的组合治疗的8个月DN(D)的Mac-1免疫荧光研究。在DN小鼠中，小管蓄积的巨噬细胞从7到8个月DN被明显增加。卡托普利部分地抑制了巨噬细胞浸润，卡托普利与THR-123的组合完全地抑制了巨噬细胞浸润。显示了代表性的图。E.通过统计在每个玻片的5个随机视场中的阳性标记的细胞，评价每个视场(x400放大倍数)的巨噬细胞数，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。在图中，糖尿病性肾病被称为DN。
图73.糖尿病小鼠中的血糖水平和体重。血糖水平(A,B)和体重(C,D)测量。图中的数据显示为平均值±s.e.m.。
图74.在DN中卡托普利/THR-123细胞凋亡。A-C.通过TUNEL染色，在指定动物组的冷冻肾切片中分析小管细胞的细胞凋亡。图(A)中的箭头指示TUNEL阳性小管细胞。(D)TUNEL阳性小管细胞的定量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的TUNEL阳性小管数量(x200放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。在图中，糖尿病性肾病被称为DN。
图75.卡托普利/THR-123在DN中增加了phospho-smad1/5标记。A-C.指定动物组的冷冻肾切片用phospho-smad1/5(p-smad1/5)抗体标记，然后用FITC-缀合的第二抗体。通过荧光显微镜术分析phospho-smad1/5水平。图(C)中的箭头指示核蓄积的phosho-smad1/5。(D)p-smad1/5水平的定量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的p-smad1/5数量(x400放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。在图中，糖尿病性肾病被称为DN。
图76.在肾病模型中，THR-123作为受体作用于小管Alk3。A-D,THR-123对Alk3flox /flox和gGTCre；Alk3flox/flox小鼠中IRI模型肾损伤的影响。缺血再灌注损伤后，小鼠接受THR-123口服(5mg/kg/天)直到处死之日。A-C,显示了指定小鼠组的代表性的H&E染色图。D.IRI中的肾小管坏死的百分率。每组分析了10个视场。图中数据显示为平均值±s.e.m.。E-T,THR-123对Alk3flox/flox和gGTCre；Alk3flox/flox小鼠中NTN模型肾损伤的影响。NTN引入指定小鼠组后6周，小鼠用PBS或THR-123口服治疗。E-H,显示了指定小鼠组的代表性的MTS染色图。I,在指定组中的9周NTN模型的形态测量分析。J-N,在Alk3flox/flox和gGTCre；Alk3flox/flox小鼠中的NTN模型的肾的巨噬细胞蓄积分析。J-M,指定小鼠组的Mac-1免疫荧光研究。N,通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每个视场(x400放大倍数)的巨噬细胞数，每个实验组5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。O-S,EMT分析,O-R,在NTN-诱导的并经过PBS或THR-123治疗的Alk3flox/flox和GTCre；Alk3flox/flox小鼠的肾的E-钙粘蛋白/FSP1免疫标记。S.E-钙粘蛋白/FSP1双重阳性小管的百分率。每玻片500小管，每个实验组分析5个玻片。图中数据显示为平均值±s.e.m.。T,在指定小鼠组(所有n＝4)中的NTN的6周和9周的血液尿素氮测量。
图77.THR-123在Alk-3缺失小鼠的IRI肾中不抑制巨噬细胞蓄积。通过将左肾蒂钳制25分钟诱导缺血再灌注损伤(IRI)。缺血再灌注损伤后，小鼠接受THR-123口服(5mg/kg/天)或PBS，直到处死之日。A-C.在指定组中的Mac-1免疫荧光研究。D.通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每个视场(x400放大倍数)的巨噬细胞数，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图78.THR-123在Alk-3缺失小鼠的IRI肾中不抑制细胞凋亡。通过将左肾蒂钳制25分钟诱导缺血再灌注损伤(IRI)。缺血再灌注损伤后，小鼠接受THR-123口服(5mg/kg/天)或PBS，直到处死之日。A-C.通过TUNEL染色，在指定动物组的冷冻肾切片中分析小管细胞的细胞凋亡。D.TUNEL阳性小管细胞的定量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的TUNEL阳性小管数量(x200放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图79.THR-123在Alk-3缺失小鼠的NTN肾中不抑制细胞凋亡。A-D.通过TUNEL染色，在指定动物组的冷冻肾切片中分析小管细胞的细胞凋亡。显示了代表性的图。E.TUNEL阳性小管细胞的定量测定。通过统计在每个玻片的5个随机视场中阳性标记的细胞，评价每一视场的TUNEL阳性小管数量(x200放大倍数)，每个实验组5个玻片。图中的数据显示为平均值+s.e.m.。
图80描绘了荧光显微图的RGB图的定量分析的几何学基础。
图81显示了使用来自Photoshop的RGB分析直方图分析用于测试化合物的荧光显微图的实例。图81A是用100mM D-葡萄糖处理的细胞视场并对应于0％的E-钙粘蛋白信号；图81B是仅暴露给培养基的细胞视场并对应于100％的信号；和图81C是暴露给100mM D-葡萄糖和100uM试验肽两者的细胞视场。根据分析，60％的评分被指定给该图像，也就是说，试验肽的作用为维持在单用培养基中所观察到的60％的E-钙粘蛋白信号，尽管存在100mM D-葡萄糖。
不希望以任何方式限制本发明或限制以上附图所提供的公开内容，所述附图共同证明了THR-123(SEQ ID NO:1)通过Smad和p38MAPKBMP信号转导两者起作用，并抑制肾炎症、高葡萄糖(高血糖)诱导的上皮-间充质转换(EMT)和肾纤维化。上图提供的数据进一步表明靶向BMP信号转导途径(例如Smad和p38MAPK)而不诱导骨发生的本发明化合物对肾病可提供新的药理学干预。
发明详述
近来，TGF-β超家族蛋白的肽激动剂已描述于US 7,482,329、WO2007/035872和WO2006/009836，其各自通过引用以其整体结合到本文中。本发明根据以下发现：这些化合物的一个亚类能够经由BMP受体(包括I型和II型受体)诱导BMP信号转导，因此引起对TGF-β1-诱导的EMT和由此导致的纤维化的抑制和/或逆转。近来，已经发现转化生长因子β(TGF-β)，作为纤维发生的重要介质，诱导EMT，其进而介导纤维化。还知道BMP-7逆转TGF-β-诱导的EMT，因此表明了BMP-7在抵消经由EMT所致的纤维化发生中的作用。已经发现本发明的肽(正如本文进一步描述的那样)能有效抑制和/或逆转EMT和包括以下在内的各种病况相关的纤维化：糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病。
术语的定义和使用
参考以下本发明实施方案和其中所包括的实施例的详述，可以更容易地理解本发明。在公开和描述现有方法和技术之前，应当知道，本发明不限于具体的分析方法或合成方法，这些当然可以改变。还要知道本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的而并非限制性的。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员公知的含义。
如本文和所附权利要求书所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非上下文明确另有说明。因此，例如，对于“基因”是指一个或多个基因并包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。
如本文所用的“芳族氨基酸”，是指具有侧链的疏水性氨基酸，其侧链含有具有共轭电子体系的至少一个环(芳基)。芳基还可以被取代基进一步取代，所述取代基例如烷基、烯基、炔基、羟基、硫烷基、硝基和氨基以及其它基团。遗传编码的芳族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳族氨基酸包括苯基甘氨 酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
如本文所用的“脂族氨基酸”，是指具有饱和或不饱和直链、支链或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸的实例包括丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。非编码的脂族氨基酸的实例包括正亮氨酸(Nle)。
如本文所用的“酸性氨基酸”，是指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH时因为失去氢离子，典型地具有带负电荷侧链。遗传编码的酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。
如本文所用的“碱性氨基酸”，是指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸在生理pH时因为与水合氢离子缔合，典型地具有带正电荷侧链。遗传编码的碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的实例包括非环状氨基酸鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸和高精氨酸。
如本文所用的“极性氨基酸”，是指具有在生理pH时不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有一个键，其中由两个原子共享的电子对更靠近这两个原子中的一个。遗传编码的极性氨基酸的实例包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸的实例包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
正如本领域技术人员将会理解的那样，以上分类并非绝对--若干氨基酸显示超过一种特征性性能，并且因此可包括在超过一个类别中。例如，酪氨酸具有芳环和极性羟基两者。因此，酪氨酸具有双重性质并且可包括在芳族类别和极性类别中。
如本文所用的“受试者”，优选为哺乳动物，例如人，但也可以是动物，例如家养动物(例如狗、猫等)、家畜(例如牛、羊、猪、马等)和实验动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用的化合物的“有效量”，是足以达到所需治疗和/或预防效果的量，例如，足以达到预防或减少所治疗疾病(例如与以上列举的TGF-β超家族多肽相关的疾病)的相关症状的量。给予受试者的化合物的量取决于疾病的类型和严重程度并取决于个体的特征，例如一般健康、年龄、性别、体重和药物耐受力。它还取决于疾病的程度、严重性和类型。技术人员能够根据这些和其它因素确定合适剂量。典型地，足以达到治疗或预防效果的本发明的化合物的有效量范围为大约0.000001mg/千克体重/天至大约10,000mg/千克体重/天。优选地，剂量范围为大约0.0001mg/千克体重/天至大约100mg/千克体重/天。本发明的化合物还可彼此组合给予，或与一种或多种另外的治疗用化合物组合给予。
“分离的”或“纯化的”多肽或多肽或其生物活性部分基本不含组织分化因子-相关多肽所来源的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染多肽，或基本不含化学前体或其它化学物(当经化学合成时)。
如本文所用的术语“变体”，是指不同于本发明的化合物、但保留其基本性质的化合物。其非限制性实例是对于参考化合物而言具有保守取代的多核苷酸或多肽化合物，统称为简并变体。变体的另一非限制性实例是与本发明化合物的结构不同、但保留其相同活性结构域的化合物。变体包括N-末端或C-末端延伸、加帽的氨基酸、反应性氨基酸侧链官能团的修饰(例如从赖氨酸残基支化)、聚乙二醇化和/或截短的多肽化合物。通常，变体与本发明化合物在总体上非常相似并在许多区域中相同。因此，变体可含有在编码区、非编码区或这两者中的改变。
如本文所用，术语“局部的”或“局部地”，当在一种或多种治疗药的局部给予或共给予时，是指将治疗药递送到临近或接近损伤部位、毗邻或紧邻损伤部位、在损伤部位周围或接触到损伤部位、或在损伤的组织或器官内部或里面的身体部位。局部给药通常不包括系统给药 途径。
如本文所用，术语“药学有效方案”是指给予一种或多种治疗药的系统计划，其包括例如药物浓度、量或水平、时间安排和重复、及其在给药过程中进行的任何变化等方面，在给予所述药物时其有效治疗纤维化。技术人员，通常包括治疗纤维化病况患者的开业医师，将会知道和理解如何确定药学有效方案，无需过度实验。
如本文所用，术语“共给予(co-administering)”或“共给予(co-administration)”等是指同时或大致同时给予两种或更多种作用剂、治疗药、化合物、疗法等的行动。给予本发明的不同作用剂(例如化疗药、抗纤维化疗法或免疫治疗药)的顺序或次序可以不同，不限于任何特定顺序。共给予还可指将两种或更多种作用剂给予机体的不同区域或经由不同的递送计划的情况，例如其中将第一种作用剂系统给予，而第二种作用剂在组织损伤或正在进行纤维化的部位经局部给予，或其中将第一种作用剂经局部给予，而第二种作用剂经系统给予到血液中。
如本文所用，术语“基本上逆转纤维化”是指其中在治疗之下的在靶组织或器官中的纤维化材料或成分减少或完全消除。基本上逆转纤维化优选地是指这样的情况：其中与治疗前相比，至少大约10％、或大约25％、或大约50％、或更优选地至少大约75％、或更优选地大约85％、或还更优选地大约90％、或更优选地大约95％、或更优选地99％或更多的纤维化成分或物质已被除去。
如本文所用，提及“基本上抑制纤维化”是指这样的情况：在所需的目标纤维化位点的纤维化的净含量或水平不随时间增加。
如本文所用的术语“药学上可接受的”，是指材料(例如载体或稀释剂)，其不破坏本文所述化合物的生物活性或性质，并且是相对无毒的(即所述材料给予个体不会引起不想要的生物效应或不会以有害方式与其包含于其中的组合物中所含有的任何成分相互作用)。
如本文所用，术语“选择性地”是指在一个群体中比另一群体中倾 向于以更高频率发生。
如本文所用，术语“偶联”，当涉及“偶联”在一起的两种或更多种作用剂时，是指两种或更多种作用剂之间的共价或其它稳定的缔合。例如，可将本发明的治疗用肽(BMP激动剂肽)经由共价键、共价连接的接头部分或通过离子相互作用与第二抗纤维化作用剂偶联。优选地，偶联在一起的一种或多种作用剂保留其基本相同的独立功能和特征。例如，当治疗药与另一作用剂偶联时可保留与其独立时的相同活性。
如本文所用，术语“靶向部分”是能够增强治疗药或本发明的其它作用剂(例如本发明的BMP激动剂肽)靶向、结合或进入本发明靶细胞(例如具有损伤和正经历纤维化的组织)的能力的部分。在某些实施方案中，靶向部分是多肽、碳水化合物或脂质。任选地，靶向部分是抗体、抗体片段或纳米抗体(nanobodies)。示例性的靶向部分包括肿瘤靶向部分，例如生长抑素(sst2)、铃蟾肽/GRP、促黄体激素-释放激素(LHRH)、神经肽Y(NPY/Y1)、神经降压肽(NT1)、血管活性肠多肽(VIP/VPAC1)和缩胆囊素(CCK/CCK2)。在某些实施方案中，靶向部分与本发明的作用剂非共价缔合。
如本文所用，术语“方案”是指表征药物或试剂如何给予的各种参数，包括剂量水平、时间安排和重复、以及不同的药物或作用剂之间的比例。术语“药学有效方案”是指提供所需的治疗结果或效果(包括基本上抑制或逆转EMT和/或纤维化)的特定方案。术语“重复”是指重复多次给予一种或多种试剂的一般概念。例如，在第一天，以剂量Z，将药物X和药物Y的组合给予(同时或大致同时和以任何顺序共给予)患者。然后，在第二天，以剂量Z或另一剂量，再次给予药物X和Y(同时或大致同时和以任何顺序共给予)。第一和第二天之间的时间安排可以是一天或至多若干天、或一周或若干周，或若干个月。重复给予也可发生在同一天，相隔指定的分钟数(例如10分钟、20分钟、30分钟或更长)或小时数(例如1小时、2小时、4小时、6小时、12小时)。 有效的给药方案可以由本领域普通技术人员例如处方医师使用标准实践来确定。
纤维化疾病
纤维化疾病的特征在于成纤维细胞的活化、胶原和纤连蛋白产量增加、和转分化为收缩性的成肌纤维细胞。该过程通常发生超过多个月份和年份并且最终可导致器官功能障碍或死亡。纤维化疾病的实例包括糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化和硬皮病(系统性硬化病；SSc)。纤维化疾病代表了无有效治疗的最大类别的病症之一，并因此表现出严重不足的医学需求。通常，对纤维化患者的唯一补偿是器官移植；然而，因为器官供应不足以满足需要，所以患者常常在等待接受合适器官期间死亡。在硬皮病肺病、特发性肺纤维化、放疗和化疗诱导的肺纤维化和职业性吸入尘粒所致病症中单单肺纤维化可以是主要的死亡原因。缺乏合适的抗纤维化疗法，主要是因为对纤维化疾病的病因学还是未知的。对于如何控制正常组织修复和该过程在纤维化疾病中如何出错的理解将是至关重要的。
TGF-β及其在纤维化中的作用
已经知道促纤维化蛋白例如转化生长因子-β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)参与纤维化疾病。因为TGF-β诱导成纤维细胞合成和收缩(contract)ECM，所以长期以来一直认为该细胞因子是纤维化反应的主要介质(1)。十多年前作为由人内皮细胞分泌的一种蛋白质而发现的CTGF(2)，由TGF-β诱导并且被认为是TGF-β对成纤维细胞作用的下游介质(3,4)。同样，TGF-β诱导基质蛋白纤连蛋白的ED-A形式(ED-A FN)的表达，这种形式是通过纤连蛋白转录物的可变剪接而产生的一种纤连蛋白变体(5)。ED-A FN的这种诱导是TGF-β1-触发的α-SMA和胶原I型表达增强所需要的(6)。因此TGF-β被认为是在许多组织中的纤维化诱导中的“主要开关”，所述组织包括例如肺(7)和肾(ref)。在这一点上，在IPF患者的肺中或在CKD患者的肾中TGF-β 被上调，并且活性TGF-β在大鼠的肺或肾中的表达导致明显的纤维化反应，而在响应TGF-β1时无反应提供了针对博来霉素-诱导的纤维化(8)或肾间质纤维化(30)的保护作用。
上皮-间充质转换(EMT)及其在纤维化中的作用
EMT(完全分化的上皮细胞经历向间充质表型转换而产生成纤维细胞和成肌纤维细胞的过程)，被越来越多地认为在上皮损伤后的修复和瘢痕形成中起到重要作用。在肺和其它器官中，该过程在损伤后促进纤维化的程度，是活跃的研究对象。近来，已经证明转化生长因子(TGF)-β在体外和体内在肺泡上皮细胞(AEC)中诱导EMT，并且上皮和间充质标记共定位于特发性肺纤维化(IPF)患者的肺组织中的增生性II型(AT2)细胞，表明AEC可表现出极度可塑性并在肺纤维化中作为成纤维细胞和/或成肌纤维细胞的来源。首次描述了TGF-β1在正常哺乳动物上皮细胞中作为EMT的诱导物(9)并证明在体外在许多不同的上皮细胞系中介导EMT，所述上皮细胞包括肾近端小管、晶状体和最近的肺泡上皮细胞(10-14)。
TGF-β1-诱导的EMT和纤维化的逆转
已经证明许多介入导致EMT的逆转。BMP-7(骨形态发生蛋白-7)在成人小管上皮细胞中通过直接抵消TGF-β-诱导的Smad3-依赖性EMT而逆转TGF-β1-诱导的EMT，并且在体内已经显示了经由EMT发生肾纤维化逆转的证据(20)。BMP-7能够延迟晶状体上皮中的EMT并伴有Smad2下调，而抑制性Smad7的过量表达阻止EMT并减少Smads2和-3的核转位(21)。EMT在Smad3敲除小鼠中得到改善(15,16)，而且Smad7(TGF-β信号转导的拮抗剂)或以Smad-依赖性方式起作用的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)，可在肾和晶状体上皮细胞中逆转或延迟纤维化(21,22)。此外，HGF通过上调Smad转录辅阻遏物SnoN而在人肾上皮细胞中阻断EMT，这导致形成转录无活性的SnoN/Smad复合物，因此阻断了TGF-β1的效应(23)。这些研究表明调节Smad活性作为用于抵消TGF-β诱导EMT的作用的策略的可行性。有关介导TGF-β-诱导的EMT的准确分子机制及其与其它信号转导途径相互作用的知识，对于开发抑制/逆转EMT而不破坏TGF-β信号转导的有益效果的策略而言是重要的。
骨形态发生蛋白(BMP)
骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，其控制细胞增殖、分化、迁移和存活。BMP通过两种不同类型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体(称为I型和II型)起作用。II型受体一旦被BMP占据，经历磷酸化，然后使I型受体(也称为ALK)磷酸化。磷酸化的I型受体进而介导特定的胞内信号转导途径和因此决定下游信号转导的特异性。已经鉴定了在结构上类似的3种I型受体：ALK2、ALK3(BMPR-IA)和ALK6(BMPR-IB)。重要的是，I型受体和II型受体两者都形成同聚和异聚复合物。靶细胞的BMP-刺激导致受体复合物在细胞表面重排，其影响了2种下游BMP信号转导途径(典型的Smad-依赖性途径(Smad 1/5/8途径)和非典型的Smad-非依赖性信号转导途径(例如p38促分裂原-激活蛋白激酶途径,MAPK))的活化。Smad1/5/8途径已知在阻塞诱导的肾损伤之后能促进肾修复(Manson SR,Niederhoff RA,Hruska KA,Austin PF.,J Urol.85:2523-30,2011)。相反证据显示p38MAPK途径在促进糖尿病和缺血/再灌注相关的肾损伤中起重要作用(Evans J等人.(2002)EndocrinRev 5:599–622,2002；Furuichi K等人.Nephrol Dial Transplant 17:399–407,2002)。这样，诱导Smad 1/5/8信号转导和抑制p38MAPK磷酸化的化合物是强有力的抗炎和抗纤维化靶标，具有广泛治疗潜力。
BMP还是胞外形态发生的信号转导蛋白，其在胚胎发生和骨形成中起到重要作用。在胚胎发生期间，BMP刺激上皮-间充质转化(EMT)，其对中胚层和神经管形成而言是必不可少的。然而，EMT(其特征在于细胞粘附的损失和增加的细胞运动性)，在癌症形成和转移中也受到刺激，并且也已证明BMP信号转导在某些种类的癌细胞中增加了细胞运动性和侵袭力(Langenfeld,等人,Oncogene 25:685-692, 2006；Kang,等人,Exp.CellRes.316:24-37,2010)。目前有超过20种已知的BMP，已经证明这些蛋白质中的若干与肿瘤生长和从原发肿瘤转移(尤其是转移到骨的乳腺肿瘤和前列腺肿瘤)相关(Alarmo和Kallioniemi,Endocrine-Related Cancer 17:R123-R139,2010；Dai等人,CancerRes.65:8274-8285,2005)。
如上所述，BMP与膜结合的高亲和力I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，通过Smad途径和其它胞内效应子而引发信号转导级联，其刺激了形态发生的细胞功能，例如细胞增殖、细胞生长、分化、骨发生、神经形成和胚胎发生(Walsh等人,Trends in CellBiology 20:244-256,2010)。作为形态发生素，BMP已经证明可用于再生医学，尤其是在刺激骨形成和治疗骨折方面(Rider和Mulloy,Biochem.J.429:1-12,2010)。细胞BMP活性受到许多生物的BMP拮抗剂的高度调节，所述拮抗剂与BMP结合并阻止BMP受体活化，因此阻止了BMP-引发的信号转导(Rider和Mulloy,Biochem.J.429:1-12,2010)。这些BMP-拮抗剂的表达或活性上的改变可促进人类疾病例如纤维化和癌症的发展(Walsh等人,Trends inCellBiology 20:244-256,2010)。
除了这些BMP-结合拮抗剂以外，近来已描述了BMP受体拮抗剂，例如小分子抑制剂dosomorphin和dosomorphin衍生物。已经知道BMP受体拮抗剂可证明用于BMP受体和信号转导途径中的突变所导致的临床病症，例如癌症、骨骼疾病和血管病(Miyazono,等人,J.Biochem.147:35-51,2010)。
本发明的一方面，已经发现先前公开的肽的一个亚类是BMP激动剂，可用于并有效触发或诱导BMP信号转导，其就纤维化而言，导致对EMT的抑制和/或逆转，以及因此对至少部分地由EMT所致的任何纤维化病况的纤维化的抑制和/或逆转。
BMP激动剂肽
一方面，本发明提供用于抑制EMT过程的肽和包含所述肽的药物组合物，用于抑制纤维化和治疗与EMT过程和/或纤维化例如肾纤 维化相关的疾病和病症。
这些肽的变体、类似物、同源物或片段，例如物种同源物，也包括在本发明中，其简并形式亦是如此。可在N-端或C-端或同时在N-端和C-端对本发明的肽加帽。本发明的肽可经聚乙二醇化或经修饰，例如在含有反应性侧链的任何氨基酸残基例如赖氨酸残基上支化。本发明的肽可以是线状的或环化或以其它方式限制。所述肽的尾序列的长度可以不同。
所述肽可含有天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸及其任何组合。在某些实施方案中，本发明的化合物可包含常见的氨基酸，其并非是遗传编码的。这些非遗传编码的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；2,3-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH.sub.2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。
如本文所述，专利公布例如US 7,482,329、WO2007/035872和WO2006/009836中近来已经公开了大量BMP-7激动剂。如本文所述，本申请的发明人已经鉴定了这些肽的一个亚类，其对抑制和/或逆转纤维化而言特别有效，因此，对于治疗纤维化所致的疾病和病症而言特别有效。
在一个实施方案中，用于本发明方法的肽具有SEQ ID NO:55所 示的通用结构：
(H)-CY[YF][DN][ND][SN]S[SNQ]V[LI]CK[RK]YRS-(OH)。在其它实施方案中，本发明提供的代表性的肽概述于表1。
表1
以下惯例用于涉及本文的序列，包括SEQ ID NO:1-77：
标准单字母氨基酸编码20种天然存在的氨基酸。
尖括号(Carrot bracket)包含非天然氨基酸描述符，例如<YD>，代表D-酪氨酸。
方括号包含选择表，其中单字母码分别选择，而多个单字母码通过逗号分开：例如[ACH,DF,RK]代表“Ala、Cys、His、Asp-Phe或Arg-Lys。”
圆括号包含原子，例如(OH)代表羟基。
肽的加帽基团由在序列开始和结束的连字符表示：例如(H)-表示未-加帽的N-末端氨基，而(CH3CO)-表示乙酰化N-端；-(OH)表示未加帽的C-末端羟基，而-(NH2)表示酰胺化的C-端。
在所有情况下，所述肽可以用二硫键环化。位置1的Cys与位置11的Cys以二硫键相连。
在另一个实施方案中，本发明的肽可以是：
DYFDDSSNVLX11KKYRS(SEQ ID NO:2)，其中X11是Dap。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
X1YFDDSSNVLDKKYRS(SEQ ID NO:3)，其中X1是Dap。
在又一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYYDNSSSVLCKRX14RS(SEQ ID NO:4)，其中X14是D-Tyr。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
X1YYDNSSSVLDKRYRS(SEQ ID NO:9)，其中X1是Dap。
在又一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:55)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYYX4X5X6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:56)，其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYFX4X5X6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:57)，其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在又一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3NX5X6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:58)，其中X3是Phe或Tyr；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3DX5X6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:59)，其中X3是Phe或Tyr；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在另一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4NX6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:60)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4DX6SX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:61)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在另一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5SSX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:62)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5NSX8VX10CKX13YRS(SEQ ID NO:63)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在又一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SSVX10CKX13YRS(SEQ ID NO:64)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SNVX10CKX13YRS(SEQ ID NO:65)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SQVX10CKX13YRS(SEQ ID NO:66)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X10是Ile或Leu；其中X13是Lys或Arg。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SX8VLCKX13YRS(SEQ ID NO:67)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X13是Lys或Arg。
在再一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SX8VICKX13YRS(SEQ ID NO:68)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X13是Lys或Arg。
在一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKRYRS(SEQ ID NO:69)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu。
在又一个实施方案中，本发明的肽可以是：
CYX3X4X5X6SX8VX10CKKYRS(SEQ ID NO:70)，其中X3是Phe或Tyr；其中X4是Asp或Asn；其中X5是Asp或Asn；其中X6是Asn或Ser；其中X8是Asn、Gln或Ser；其中X10是Ile或Leu。
在其它实施方案中，本发明的肽可包含SEQ ID NO:1-77所示的那些肽的任何合适的变体、类似物、同源物或片段。本发明的化合物包括与SEQ ID NO:1-77具有同源性的那些，例如，优选地50％或更大的氨基酸同一性、更优选地75％或更大的氨基酸同一性、和甚至更优选地90％或更大的氨基酸同一性。
在某些其它实施方案中，本发明的BMP-激动剂肽可包含具有与SEQ ID NO:1-77的那些肽相似的序列的肽，并且其特别可包含具有以下氨基酸序列的肽：与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少99％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少95％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少90％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少85％或 更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少80％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少75％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少70％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少65％或更大的序列同一性，或与SEQ ID NO:1-77的任一个具有至少60％或更大的序列同一性。
在多肽序列与参考序列具有小于100％的同一性的情况下，不相同的位置优选但并非必须是参考序列的保守取代。保守取代典型地包括以下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。因此，包括在本发明中的是具有突变序列的肽，使得它们与具有相应母序列的多肽例如在序列上、在结构上、在功能上和在抗原特征或其它功能上仍然同源。这样的突变例如可以是涉及保守氨基酸变化的突变，例如在明显相似的分子性质的氨基酸之间的变化。例如，可认为脂族组的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之内的互换是保守的。有时用甘氨酸取代这其中的一个，也可被认为是保守的。其它保守互换包括脂族组的天冬氨酸和甘氨酸之内的那些；酰胺组的天冬酰胺和谷氨酰胺内的那些；羟基组的丝氨酸和苏氨酸内的那些；芳族组的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸内的那些；碱性组的赖氨酸、精氨酸和组氨酸内的那些；和含硫组的甲硫氨酸和半胱氨酸内的那些。有时在甲硫氨酸和亮氨酸组内的取代也可被认为是保守的。优选的保守取代组是天冬氨酸-谷氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸；丙氨酸-缬氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸；和赖氨酸-精氨酸。
本发明还提供具有改变的序列的化合物，所述改变包括插入，使得总氨基酸序列延长，而所述化合物仍然保留合适的TDF激动剂或拮抗剂特性。另外，改变的序列可包含随机的或经设计的截短所述化合物的总氨基酸序列的内部缺失，而所述化合物仍然保留其BMP-激动 剂的功能特性。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1-77中的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基置换，所述其它氨基酸残基具有与它们所置换的残基相似的物理和/或化学性质。优选地，保守氨基酸取代是其中某氨基酸被包含在同一指定类别内的另一氨基酸置换的那些，正如以下将更充分描述的那样。当插入、缺失和取代不破坏所述化合物的功能特性时，它们是合适的。可按照下述体外和体内测定法来测定改变的化合物的功能性，所述测定法经设计用于评价所改变的化合物的BMP-激动剂特性。
SEQ ID NO:1-77的氨基酸残基、SEQ ID NO:1-77的类似物或同源物包括遗传编码的L-氨基酸、天然存在的非遗传编码的L-氨基酸、合成的D-氨基酸或上述所有的D-对映体。
还考虑的是可以前肽或前多肽的形式提供本发明的肽。为了本发明的目的，前肽或前多肽是指本发明的肽的前体形式或变体，其与所述肽的成熟形式相比基本上无活性(即，基本上缺乏BMP信号转导活性)，其进一步包括可切割或可除去的部分。本发明的肽的前体形式优选地没有活性或所述肽的活性减弱或以其它方式降低。这样的前体形式可包含可切割的部分或延伸的氨基酸序列，例如前导序列或末端多肽序列，其可用于各种原因，例如，在细胞产生本发明肽期间用以细胞分泌，或者为了掩蔽本发明肽的活性，直到前肽或前多肽遇到作用的靶损伤部位。例如，前肽或前多肽可含有可切割部分，以除去仅在患病组织中因活性升高(例如蛋白酶或酶)而可被除去的掩蔽部分或前导部分，这是仅在患病状态下的特征，而在健康组织中不存在。这样的掩蔽和前导序列是本领域已知的。这样，本发明的肽可被“靶向”具有对所需的治疗部位增加的特异性。
本发明的肽可经聚乙二醇化或经修饰，例如在含有反应性侧链的任何氨基酸残基例如赖氨酸残基上、或接头上的化学反应性基团上支化。本发明的肽可以是线状的或环化的。所述肽的尾序列的长度可以 不同。
所述肽可含有天然氨基酸、非天然氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸、及其任何组合。在某些实施方案中，本发明的化合物可包含常见的非遗传编码的氨基酸。这些非遗传编码的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2,3-二氨基丁酸(Dab)；2,3-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。化合物的非天然存在的变体可通过诱变技术或通过直接合成而产生。
编码本发明肽的核酸分子
另一方面，本发明还包括编码SEQ ID NO:1-77(包括其简并变体)或本文包括或考虑的任何BMP激动剂肽的一个或多个多核苷酸或核酸分子。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列，其编码表1的SEQ ID NO:1-77的那些肽或并非表1的那些具体实施方案的本发明范围内的任何肽或前肽。在又一个实施方案中，所述分离的核酸分子可以是DNA表达或克隆载体，并且所述载体可以任选地包括可与所述核酸操作性连接的启动子序列，其中启动子引发编码本发明的肽或前肽的核苷酸序列的表达。在再一个实施方案中，可将所述载体转化到细胞中，所述细胞例如原核或真核细胞，优选哺 乳动物细胞，或更优选人细胞。在再一个实施方案中，所述载体可以是病毒载体，其能感染哺乳动物细胞并导致SEQ ID NO:1-77的多肽在感染所述病毒的动物中表达。在又一些实施方案中，所述核酸分子包含用于在宿主细胞中表达的任何合适的和/或有利的元件，无论所述宿主细胞是原核还是真核宿主细胞，无论表达是在体外还是在体内进行。在再一些实施方案中，本发明的核酸分子可包含体基因转移载体，用于将编码本发明的肽或其任何变体、类似物、同源物或片段(包括其任何有用的前肽)的核酸序列引入，用于通过体基因转移将本发明的肽给予有需要的受试者。
对于本发明的一个或多个多肽的重组表达，通过本领域众所周知的和以下详述的重组DNA技术，将含有编码所述多肽的全部或一部分核苷酸序列的核酸插入到合适的克隆载体或表达载体(即，含有用于所插入的多肽编码序列的转录和翻译的必要元件的载体)中。
一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括并非技术上的质粒的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其起到相同功能。这样的病毒载体允许感染受试者并在该受试者中表达化合物。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，其含有编码本文所述的肽的核酸。本发明的重组表达载体可经设计用于在原核或真核细胞中表达所述肽。合适的宿主细胞进一步讨论于Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。
多肽在原核生物中的表达最经常是在大肠杆菌中进行，其用含有指导融合或非融合多肽的表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的多肽上，通常添加到重组多肽的 氨基端。这样的融合载体典型地用作3个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解性；和(iii)通过作为亲和纯化中的配体，有助于重组多肽的纯化。通常在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解的切割位点，使重组多肽从融合部分分离出来成为可能，然后纯化融合多肽。这样的酶及其关联的识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A分别与目标重组多肽融合。
本发明的肽的制备方法
另一方面，本发明涉及本发明的肽的制备方法。一般而言，所述方法可包括本领域任何合适的用于进行这类任务的已知方法，包括合成肽化学，使用合适原核或真核宿主细胞和表达系统的本发明肽的重组表达，或作为体基因转移的特征的所述肽的重组表达(即，作为给药方案的组成部分在治疗部位上的表达)。
在一个实施方案中，可使用标准肽合成技术，例如固相或液相肽合成，经化学法合成肽。也就是所，SEQ ID NO:1-77所公开的化合物可以使用本领域众所周知的组合物和方法，例如在固相支持物或在溶液中经化学合成，参见例如Fields,G.B.(1997)Solid-PhasePeptide Synthesis.Academic Press,San Diego。
在另一个实施方案中，通过重组DNA技术产生肽，例如，所述化合物在细菌、酵母、杆状病毒或真核细胞中过量表达，得到足够量的所述化合物。通过本领域众所周知的方法，实现从异质混合物例如反应混合物或细胞裂解物或其它粗制流份中纯化化合物，所述方法例如离子交换色谱、亲和色谱或其它多肽纯化方法。可通过将SEQ ID NO:1-77所述的化合物表达为与可切割的或否则惰性的表位或序列的 融合物，而便于以上方法。表达系统以及纯化方法的选择是技术人员众所周知的。
对于本发明的一种或多种化合物的重组表达，可将含有编码所述肽的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入到合适的表达载体(即，含有用于所插入的肽编码序列的转录和翻译的必要元件的载体)中。在某些实施方案中，调节元件是异源的(即并非原有基因启动子)。或者，还可由用于所述基因和/或其侧翼区的原有启动子提供必要的转录信号和翻译信号。
各种宿主-载体系统可用于表达所述肽编码序列。它们包括但不限于：(i)用痘苗病毒、腺病毒等感染的哺乳动物细胞系统；(ii)用杆状病毒等感染的昆虫细胞系统；(iii)含酵母载体的酵母或(iv)用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据所用的宿主-载体系统，多种合适的转录和翻译元件中的任何一种都可使用。
表达载体或它们的衍生物包括例如人或动物病毒(例如痘苗病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如杆状病毒)；酵母载体；噬菌体载体(例如λ噬菌体)；质粒载体和粘粒载体。
可选择以所需的特定方式调节所插入的目标序列的表达、或修饰或加工所述序列所表达的肽的宿主细胞株。另外，在所选宿主株中，在某些诱导物存在下可增强某些启动子的表达；因此便于控制经遗传工程改造的化合物的表达。此外，不同的宿主细胞具有对所表达的肽的翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化、磷酸化等)的特征性和特异性机制。因此可选择合适的细胞系或宿主系统，以确保达到对外源肽的所需修饰和加工。例如，细菌系统内的肽表达可用于产生非糖基化的核心肽；而在哺乳动物细胞内的表达确保异源肽的“天然”糖基化。
可使用已开发以测定这类肽的生物活性的任何常规的体内和体外测定法表征本发明的肽的生物活性。用于测试化合物或类似物在应用于修复或再生受损的骨、肝、肾或神经组织、牙周组织包括牙骨质 和/或牙周膜、胃肠和肾组织以及免疫细胞介导的损伤组织中的功效的具体的体内测定法，公开于公众可得的文件，其包括例如EP 0575,555、WO93/04692、WO93/05751、WO/06399、WO94/03200、WO94/06449和WO94/06420。
药物组合物
可将本发明的肽和/或核酸分子及其衍生物、片段、类似物和同源物掺入适合给予的药物组合物中。这类组合物通常包含核酸分子、多肽或抗体，含或不含药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”意图包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌和抗真菌化合物、等张和吸收延迟化合物等。合适的载体描述于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences，其是本领域的标准参考文本，其通过引用结合到本文中。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。脂质体和非水溶媒，例如不挥发性油类也可使用。对于药物活性物质，这类介质和化合物的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或化合物与活性化合物不相容之外，考虑了其在组合物中的用途。补充的活性化合物也可掺入到组合物中。
本发明的药物组合物被配制成与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外、例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(即局部)、透粘膜和直肠给予。供胃肠外、皮内或皮下施用的溶液剂或混悬剂可包含以下成分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌化合物例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的化合物，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。胃肠外制剂可被包入玻璃或塑料制的安瓿、一次性注射器或多剂量小管中。
适合注射用的药物组合物包括无菌水性溶液剂(当水溶性时)或分散剂以及用于临时制备无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHORrTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当至便于注射的流动程度。它在制造和贮存条件下必须是稳定的并且必须针对诸如细菌和真菌等微生物的污染活动而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣剂例如卵磷脂、通过在分散的情况下维持所需粒度和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可通过多种抗细菌和抗真菌化合物而实现对微生物活动的阻止，所述化合物例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，组合物中优选包含等张化合物，例如，糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物而实现注射用组合物的延迟吸收，所述化合物例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射用溶液剂可按下制备：通过将所述肽以所需量掺入具有以上列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中，视需要，然后通过除菌过滤。通常，分散剂可按下制备：通过将活性化合物掺入到含有基础分散介质和以上列举的所需其它成分的无菌溶媒中而制备。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前已除菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们包入明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗性给予的目的，活性化合物可以掺入赋形剂并以片剂、糖锭剂或胶囊剂形式使用。还可使用流动载体制备口服组合物用作漱口剂，其中流动载体中的化合物经口腔施用并漱口和吐出或咽下。可包括药物相容的结合化合物和/或辅料作为组合物的组成部分。片剂、丸剂、胶囊剂、糖锭剂等可含有任何以下成 分或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解化合物，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶态二氧化硅；甜味化合物，例如蔗糖或糖精；或矫味化合物，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味料。
系统给予还可通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮给予，适合穿透屏障的渗透剂用于制剂中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，对于透粘膜给予，包括例如去垢剂、胆盐和fasidic acid衍生物。透粘膜给予可以通过使用喷鼻剂或栓剂而完成。对于透皮给予，将活性化合物配制成本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
也可将化合物制备成栓剂(例如用常规栓剂基料例如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式的药物组合物，用于直肠递送。可将化合物制备成用于离体外植体或植入体的调节或处理。
在一个实施方案中，将活性化合物用保护所述化合物免遭从机体快速清除的载体来制备，例如控释制剂，包括植入体和微胶囊化递送系统。生物可降解的、生物相容的聚合物可以使用，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法是本领域技术人员显而易见的。材料还可购自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.。脂质体悬浮剂(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知方法来制备，所述方法例如描述于美国专利号4,522,811。
特别有利的是配制便于给予和剂量一致的单位剂型的口服或胃肠外组合物。本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量给予待治疗受试者的物理上的分离单位；每一单位含有经计算以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明单位剂型的规格是由活性化合物的独特特征和欲达到的具体治疗效果以及在本领 域中混合这类活性化合物用于个体治疗的固有限制来限定，或者直接取决于活性化合物的独特特征和欲达到的具体治疗效果以及在本领域中混合这类活性化合物用于个体治疗的固有限制。
本发明还考虑了用于体基因转移的药物组合物。可将本发明的核酸分子插入到载体中并用作基因治疗载体。可将基因治疗载体递送到受试者，通过例如静脉内注射、局部给予(参见例如美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(参见例如Chen,等人,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057)。基因治疗载体的药物制备物可包含在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可包含其中已嵌入基因递送载体的缓慢释放基质。或者，在完整的基因递送载体可以从重组细胞中完整产生的情况下(例如逆转录病毒载体)，药物制备物可包含产生基因递送系统的一个或多个细胞。可将药物组合物连同用于给药的说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明也考虑了药物组合物和制剂，用于将本发明的肽与一种或多种另外的活性剂共给予。一种或多种另外的活性剂可包括其它抗纤维化疗法。一种或多种另外活性剂还可包括涉及到导致或参与或涉及纤维化病况的潜在疾病或病况的其它疗法。例如，在其中纤维化是糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病的组成部分的某些实施方案中，另外的一种或多种活性剂可包含能有效针对治疗不同于纤维化本身的这些潜在病况的其它症状或方面的作用剂。可联用的其它的抗纤维化剂可包括例如：主要针对抑制细胞因子、趋化因子、特异性MMP、粘附分子(整联蛋白)和血管生成诱导物例如VEGF的药物；以及抑制成纤维细胞增殖和活化、或活跃诱导成肌纤维细胞的细胞凋亡、或去除或降解ECM的药物，例如胶原酶。然而，应当注意的是，目前，还没有已证明有效的使用中的抗纤维化药物或抗纤维化药物的组合。单单抗炎化合物是无效的，但或可用于联用。可测试甾体抗炎化合物(例如泼尼松)和ACE抑制剂(例如陪哚普利、卡托普利、依那 普利)并与本发明的肽组合用于治疗纤维化。
治疗方法
本发明提供对处于患纤维化相关病症的风险中(或易于患纤维化相关病症)或患有纤维化相关病症的受试者的预防和治疗两者的方法。本发明的方法和肽能有效针对任何纤维化病况，无论病因学如何或无论是什么疾病或障碍导致纤维化。在某些实施方案中，本发明的方法和肽能有效针对至少部分地由EMT所致的纤维化，因此本发明的方法和肽导致对EMT的抑制和/或逆转并由此导致对纤维化的抑制和/或逆转。
可以理解和本文考虑的是，所公开的治疗纤维化的方法可以与本领域已知的治疗纤维化的任何其它方法组合。
可以理解和本文考虑的是，所公开的治疗纤维化的方法可以治疗任何纤维化病况，无论纤维化是否是因为疾病、意外暴露给辐射、意外的组织损伤、治疗性暴露给辐射或外科手术所致。因此，可以理解和本文考虑的是，所公开的方法可用于治疗纤维化，其中所述纤维化的原因包括但不限于硬皮病肺疾病所致的肺纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(Bronchiolitis Olibterans Organizing Pneumonia,BOOP)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、石棉沉积症、意外辐射所致的肺纤维化、治疗性辐射所致的肺纤维化、类风湿性关节炎、结节病、矽肺、肺结核、Hermansky Pudlak综合征、蔗尘肺、系统性红斑狼疮、嗜曙红细胞肉芽肿、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、淋巴血管平滑肌瘤(Lymphangioleiomyomatosis)、囊性纤维化、Nitiofurantoin暴露、胺碘酮暴露、博来霉素暴露、环磷酰胺暴露、或甲氨蝶呤暴露、以及心肌梗塞、损伤相关的组织瘢痕、瘢痕形成手术或治疗性辐射所致的纤维化。因此，例如，喉癌辐射治疗后在喉中的纤维化可以用所公开的方法来治疗。
因此，在多个实施方案中，本发明涉及多肽/肽及其给予以在机体的任何组织和/或器官中治疗包括但不限于以下的任何纤维化病症的方法：与糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化、系统性硬化病、肾炎和硬皮病相关的纤维化。
在某些实施方案中，本文公开的肽可以是用于治疗肾功能障碍、疾病和损伤(例如，输尿管阻塞、急性和慢性肾衰竭、肾纤维化和糖尿病性肾病)的化合物。(Klar,S.,J.Nephrol.2003March-April；16(2):179-85)证明了当在损伤之时开始治疗时,BMP-7治疗在输尿管阻塞(UUO)的大鼠模型中显著减少了肾损伤。后续研究表明，当肾纤维化开始之后给予时BMP-7治疗也减少了肾纤维化。具体地讲，本发明的肽可用于治疗肾病，例如慢性肾病。
在某些其它实施方案中，本发明可用于治疗CKD。慢性肾病(CKD)是估计有13％美国人所患有的疾病。无论疾病起源如何，在CKD中，纤维化是最终的共同途径，其导致疾病发展，最终导致器官衰竭。因为肾衰竭的结果或者是因为CKD患者群体中的高水平的心血管死亡率，慢性肾病是进行性的、不可治愈的和最终致命的。
在某些其它实施方案中，所述肽可用于预防或治疗肾纤维化和CKD。外源给予重组人骨形态发生蛋白(BMP)-7显示在患有实验性肾病的啮齿类中改善肾小球和间质纤维化(Wang和Hirschberg,Am J Physiol Renal Physiol.2003May；284(5):F1006-13)。
在仍其它实施方案中，本发明的肽可用于预防或治疗慢性肝病。肝纤维化是在响应持续而重复的肝损伤所致的慢性肝病(CLD)中引发的瘢痕过程。CLD的某些重要原因包括病毒性乙肝和丙肝、酒精性肝硬化和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。早期CLD的症状因潜在损伤种类不同而异并且可以是临床沉默的，或者可包括急性炎症、虚弱和黄疸。晚期CLD的特征在于肝结构的大量重塑和慢性器官衰竭。
在再其它实施方案中，本发明的肽可用于预防或治疗多种肺相关的纤维化病况和其它纤维化病况，包括特发性肺纤维化(IPF)、系统性硬化病和器官移植纤维化。IPF是使人衰弱并威胁生命的肺病，特征在于阻碍氧摄取的肺的进行性瘢痕。IPF的原因未知。随着瘢痕的发展，IPF患者经历呼吸短促(呼吸困难)和难以进行日常功能，例如日常活动。在美国和加拿大每年诊断出大约40,000例IPF，总患病率估计为150,000。在可从抗纤维化疗法中获益的6种其它间质性肺病和系统性硬化病中也存在着类似的患病率。对于IPF，还没有经FDA批准的治疗，在诊断后5年内大约2/3的患者死亡。患者通常经皮质类固醇和免疫抑制剂治疗；然而，临床上并未证明可改善生存或生活质量。认为肺纤维化的稳定或逆转能稳定肺功能并降低这种破坏性疾病的影响。本发明的肽和方法可用于抑制或逆转IPF相关的肺纤维化。
本发明还可用于治疗系统性硬化病，所述疾病是其中在包括皮肤、血管、心、肺和肾在内的多器官系统中发生过度纤维化的退行性病症。对于这种影响女性超过男性(女性与男性之比为3:1)的威胁生命的疾病，没有有效治疗。系统性硬化病的年发病率估计为每百万人群中有19例。本发明的肽和方法可用于抑制或逆转系统性硬化病。
本发明还可用于治疗器官移植相关的纤维化。在2005年，在美国、日本和5个主要欧洲市场，进行了超过50,000例实体器官移植。到2015年，移植手术的总数有望增加到超过67,000个。具有功能性移植物的存活患者数量仅在美国，在2005年末就接近164,000个。尽管在移植各种器官的能力上已经取得显著进步，但是器官功能的长期维持(大于一年)和患者存活率主要因为慢性排斥而受到损害。慢性排斥的准确表现因所移植的器官不同而异，但都表现出成肌纤维细胞或相关细胞的增殖，最终造成导致功能损失的纤维化。在此时，没有药物可用于治疗进行性的慢性同种异体移植物排斥的纤维增殖性损害(fibroproliferative lesion)。
因此，在多个方面，本发明包括给予本文所公开的肽的方法，为了任何纤维化病况、尤其是EMT所致的或涉及EMT的那些纤维化病况的治疗目的。本发明的调节方法包括使细胞与本发明的肽接触，从而调节所述细胞的一种或多种活性。在一个实施方案中，所述化合物刺激一种或多种活性。
这些调节方法可在体外进行(例如通过将细胞与所述肽一起培养)，或者在体内进行(例如通过将所述肽给予受试者，或通过给予体基因转移载体，其然后在受试者中表达所述肽，作为给予所述肽的方式)。这样，本发明提供对患有以纤维化为特征的疾病或病症的个体的治疗方法。给予本发明组合物的有效剂量和时间表可以凭经验而判定，并且做出这样的判定是本领域技术人员的份内之事。给予组合物的剂量范围是足以产生所需效果(其中所述症状/病症受到影响)的那些。剂量不应大到引起不良副作用，例如不想要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将会随患者的年龄、条件、性别和疾病程度、给药途径、或方案中是否包含其它药物而变化，并且可由本领域技术人员来确定。剂量可由每个医生根据任何禁忌症的情况来调整。剂量可以改变，并且可以以每天一个或多个剂量给予一天或几天。对于给定药物产品种类的合适剂量，可在文献上找到指南。例如，对于抗体，选择合适剂量的指南可以在有关抗体的治疗应用的文献中找到，例如Handbook of MonoclonalAntibodies,Ferrone等人编著,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,(1985)第22章和第303-357页；Smith等人,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人编著,RavenPress,NewYork(1977)第365-389页。单用抗体的典型日剂量的范围从每天大约1ug/kg至100mg/kg体重或更高，取决于上述因素。在合适时，可使用不同的给药方案。
为了治疗、抑制或预防纤维化而给予所公开的组合物例如本发明的肽之后，可按照技术人员众所周知的多种方式评价治疗用肽的功效。例如，本领域技术人员将理解，通过观察该组合物引起上皮蛋白 标记的增加或表达增加和间充质蛋白标记的减少，或减少纤维化，本文公开的组合物例如肽在受试者中能有效治疗或抑制纤维化。
可将抑制本文所公开的纤维化相互作用的组合物预防性地给予处于纤维化的风险之中的患者或受试者，例如，准备进行癌症例如喉癌的放疗的患者，其中辐射损伤所致的纤维化是可能的。
所公开的组合物和方法还可用作例如分离和测试用于包括但不限于例如以下的各种纤维化相关疾病的新的药物候选者的工具：硬皮病肺疾病、特发性肺纤维化(IPF)、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(BOOP)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、石棉沉积症、意外辐射所致的肺纤维化、治疗性辐射所致的肺纤维化、类风湿性关节炎、结节病、矽肺、肺结核、HermanskyPudlak综合征、蔗尘肺、系统性红斑狼疮、嗜曙红细胞肉芽肿、韦格纳肉芽肿病、淋巴血管平滑肌瘤、囊性纤维化、Nitiofurantoin暴露、胺碘酮暴露、博来霉素暴露、环磷酰胺暴露、甲氨蝶呤暴露、心肌梗塞、损伤相关的组织瘢痕、瘢痕形成手术和治疗性辐射所致的纤维化。
药盒和/或药物包装
本发明还考虑了药盒和药物包装，其中加入了可用于实施本文所公开的方法的作用剂或成分。所述药盒(试剂盒)可包含本文讨论的或者被认为在所公开方法的实施中是需要的或有益的任何材料或材料组合。例如，所述药盒可包含本发明的肽、或一种或多种另外的活性剂。另外，药盒可包含为了治疗和/或诊断目的而使用所述药盒的成分的一组说明书。
整个申请中参考了各种出版物。这些出版物的全部公开内容通过引用以其整体结合到本申请中，以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。对于包含于参考文献中的材料(其在参考文献所依据的语句中论述)而言，所公开的参考文献还分别地和明确地通过引用结合到本文中。
本领域技术人员显而易见的是，在本发明中可以进行各种修改和变动，只要不偏离本发明的范围或精神。考虑到本文公开的发明的说明书和实践，本发明的其它实施方案是本领域技术人员显而易见的。意图是本说明书和实施例被认为仅仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求书所限定。
以下实施例进一步说明了本发明的若干实施方案。尽管所述实施例说明了本发明，但它们无意限制本发明。
实施例
本文所述的结构、材料、组合物和方法意指为本发明的代表性实施例，可以理解，本发明的范围不由实施例的范围来限定。本领域技术人员知道，可以用所公开的结构、材料、组合物和方法上的变动来实施本发明，这样的变动被认为在本发明的范围内。
实施例1:本发明的BMP激动剂肽对葡萄糖-诱导的EMT的影响
已经认为上皮-至-间充质转换(EMT)或腹膜间皮细胞的间皮-至-间充质转换是纤维化的早期机制。EMT是上皮细胞层失去极性和细胞-细胞接触并经历细胞骨架的明显重塑的过程。同时伴有上皮细胞粘附和细胞骨架成分的损失，经历EMT的细胞获得间充质成分的表达并表现出迁移表型。已经证实高浓度葡萄糖诱导HPMC的上皮-至-间充质转换(EMT)，这通过E-钙粘蛋白表达降低以及α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和I型胶原的表达增加和细胞迁移增加来提示。TGF-β信号转导的活化在培养的上皮细胞中足以诱导EMT。(Miettinen PJ等人.J Cell Biol 127:2021–2036,1994)。EMT在肾病的小管萎缩和成肌纤维细胞形态中的作用在数年前被首次提出(Strutz F等人.Exp Nephrol 4:267–270,1996)。然而，TGF-β作为肾小管EMT的介质的证据仅在最近才有报道(Oldfield MD等人.J Clin Invest 108:1853–1863,2001；FanJM等人.KidneyInt56:1455–1467,1999)。例如，发现晚期糖化终末产物(AGE)在体外和在糖尿病大鼠中通过TGF-β信号转导的活化而诱导EMT，表明这种TGF-β-诱导的反应在糖尿病性肾病发展中的重 要作用(OldfieldMD等人.JClin Invest 108:1853–1863,2001)。在多种类型的上皮细胞中由TGF-β活化的信号转导途径以诱导EMT的近期研究的基础上，产生了这种反应-特异性的TGF-β和BMP信号转导途径的模型。
慢性高血糖症在2型糖尿病中是已知的肾纤维化的原因。本实施例中的测定法通过将人近端小管上皮细胞(HK2)暴露给高水平的D-葡萄糖(100mM和200mM)，在该细胞中诱导从上皮向间充质表型(EMT)的转分化。图2显示在仅暴露给培养基的细胞中存在E-钙粘蛋白(荧光标记的抗E-钙粘蛋白抗体)。暴露给100mM D-葡萄糖，导致E-钙粘蛋白表达的损失，如荧光信号的损失所证明。使用这种测定法，根据测试化合物在高水平的D-葡萄糖存在时抑制EMT过程的能力来评价它们。图4–16是分别暴露给100mM D-葡萄糖和100uM SEQ ISNO1-11的HK2细胞的荧光显微图。注意，除了SEQ ID NO 10和11之外所有的都能保持上皮表型(即抑制EMT)。
结果在图1和下表3中提供。在下表3中，使用本文在“方法与材料，部分C”的方法中所述的图像分析，对化合物反应进行评分。0％反应对应于100mM(或200mM)D-葡萄糖(未处理的)的信号，而100％反应对应于在D-葡萄糖不存在时的介质的信号。SEQ ID NO:10和SEQID NO:11所给出的肽具有非常微弱的抗纤维化效果。
表3:对于100uM和200uM本发明的肽，D-葡萄糖-诱导的EMT的抑制百分比。
将SEQ ID NO:5与其内酰胺连接形式(SEQ ID NO:9)和SEQ ID NO:1与其内酰胺连接形式(SEQ ID NO:2&3)进行比较，表明用内酰胺交联置换二硫键交联，影响了活性并且事实上可以增加活性。此外，将SEQ ID NO:5与其N-末端加帽的形式(SEQ ID NO:6&7)进行比较，表明在N-端加帽甚至可以增加活性。能够抑制EMT过程的所有所测化合物在抗炎测定中也都呈阳性；在抗炎测定中呈阳性的SEQ ID NO:11不能抑制EMT过程的事实表明，抗炎活性对于抗EMT活性并不足够。
实施例2:SEQ ID NO:1对EMT和纤维化的逆转功效的体内试验
来自图17所概述的小鼠STZ研究的图18-22中的H&E和马松三色染色的纤维化分析。使用上述用于定量测定体外EMT实验中的E-钙粘蛋白荧光的相同图像颜色分析方法，对图像进行定量测定，结果见图23。
尽管用THR-123治疗的动物在处死前仅治疗了最后一个月，但降低了纤维化染色组织的水平，所述水平原本是在6个月，但事实上低于其在5个月的水平，表明逆转了纤维化。
实施例3:在6个月，所有研究小鼠的肾切片的组织形态测量分析
蛋白FSP1是间充质组织的标记。作为纤维化的度量，用荧光组织免疫学测定FSP1的存在。如图24所示，在5个月期间，间充质组织的净增加是所观察到的正常动物的27倍，而且在6个月期间，净增加是所观察到的正常动物的29倍。这些间充质组织的净增加为STZ-诱导的糖尿病导致上皮细胞向间充质细胞的转化提供了有力证据。用BMP7治疗5个月，在6个月降低了净增加至3倍，而用SEQ ID NO:1仅治疗最后一个月，降低增加至仅2倍，恰好低于在SEQ ID NO:1治疗开始时存在的水平。这又为EMT过程的逆转提供了证据。这种逆转在小管间质组织的其它形态测量参数中也有反映，所述参数 例如损伤小管的百分率(图25)和间质体积的增加(图26)。
然而，对于肾小球组织而言有少量的相应效果，其中用BMP7或SEQ ID NO:1治疗对于研究超过6个月所观察到的肾小球表面积的24％增加而言几乎无效(图27)。尽管肾小球膜基质在5个月有64％增加和6个月有104％增加未受到BMP7治疗的影响，但是用SEQ IDNO:1治疗降低了在6个月的水平至37％(图28)。
当用血清血液尿素氮(BUN)水平测定时，SEQ ID NO:1逆转糖尿病性肾病影响的功效还反映在肾功能上。相对于正常动物而言，在5个月末时水平增加85％，到6个月其增加94％，这表明大大减少肾清除率。最后5个月给予BMP7，使BUN水平增加到2％，而用SEQ IDNO 1仅在处死前的最后一个月治疗，降低了增加到17％，低于治疗开始时的水平(图29)。
实施例4:在人近端小管上皮细胞(HK2)中葡萄糖-诱导的EMT
已经证实，近端小管上皮细胞的转分化是肾纤维化发展中的关键步骤，并且与上皮表型标记E-钙粘蛋白表达的损失相关。这为开发基于细胞的筛选测定法提供了基础，在所述测定法中高浓度的D-葡萄糖(50–100mM)用于在人肾近端小管上皮(HK-2)细胞中诱导E-钙粘蛋白表达的损失，并且测试化合物逆转E-钙粘蛋白表达的损失的能力。
实施例1-4的方法与材料:
A.测定方案
材料：
人近端小管上皮细胞，HK-2(ATCC#CRL-2190)；
无血清角质细胞培养基(GIBCO#17005-042,K-SFM)；
表皮生长因子(EGF:5ng/mL)；
牛脑垂体提取物(BPE:40ug/mL)；
第一抗体，小鼠IgG抗E-钙粘蛋白(R&D Systems#MAB1838)；
BSA[Sigma#A7030]；
第二抗体，FITC-缀合的山羊抗小鼠IgG(Fab2)片段(Sigma-Aldrich#F-2653)；
低聚甲醛(10％)；
TritonX-100(Sigma#T-9284)；
PBS(Fisher Scientific#BP399-1)；
D-PBS(Invitrogen#14190-144)；
聚丙烯吸头(Axygen,Inc.0.5-10uL,目录号T-300-L-R；1-200uL,目录号T-200-L-R；1-1000uL,目录号T-1000-C-L-R)；
50mL聚丙烯培养管(Fisher Scientific,目录号06-443-18)；
24-孔Coster细胞培养板(Fisher Scientific#07-200-84)。
试剂&试验样品：
阳性对照：BMP-7，以0.1和1ug/mL的浓度测定；
测试化合物(肽)：各自以100uM和200uM的终浓度测试。
细胞培养测定法的测定程序：
在24-孔培养板上进行测定；
以25,000和30,000细胞/孔的密度，将HK-2细胞接种在含添加物的1mL K-SFM培养基(生长培养基)中；
将HK-2细胞在37℃孵育24小时，让细胞贴在板上；
次日下午，用无添加物的K-SFM培养基(无血清培养基)更换除了开头2个对照孔之外的所有孔中的培养基；
在37℃继续孵育HK-2细胞过夜；
次日，从所有孔中吸出培养基。将细胞在生长培养基中孵育(开头2个对照孔)或在37℃将其暴露给测试化合物2小时。每种测试化合物的终浓度为100和200uM。BMP-7用作测定中的阳性对照；
孵育后，将D-葡萄糖加入到除了开头2个对照孔之外的所有孔中。D-葡萄糖终浓度为50和100mM；
在37℃将HK-2细胞孵育60小时；
从所有孔中吸出培养基。向各孔加入预升温的生长培养基或无血清培养基，其仅含D-葡萄糖或含有D-葡萄糖和测试化合物或含有D- 葡萄糖和BMP-7。D-葡萄糖和测试化合物的终浓度与以上相同；
在37℃继续孵育HK-2细胞24小时。
B.用于E-钙粘蛋白表达的HK-2细胞的免疫荧光染色和显微镜术
从所有孔吸出培养基，用PBS洗涤细胞2次；
在室温下将细胞在PBS中的3.7％低聚甲醛中固定15分钟；
将细胞与在PBS中的0.2％Triton X-100孵育5分钟；
细胞用PBS洗涤一次；
在室温下，细胞用在PBS中的2％BSA封闭1小时；
用在PBS中的1％BSA稀释第一抗体(小鼠抗E-钙粘蛋白抗体)1:20；
在室温下将细胞与稀释的第一抗体孵育1小时；
细胞用PBS洗涤2次；
用在PBS中的1％BSA稀释第二抗体(FITC标记的山羊抗小鼠IgG)1:20；
在室温下将细胞与稀释的第二抗体孵育1小时；
细胞用PBS洗涤2次；
将细胞在PBS中(1mL/孔)制片；
用荧光显微镜观察细胞并立即拍照。
C.免疫荧光图像的比色定量测定
如果不是有经验的研究者，很难通过观看E-钙粘蛋白细胞荧光图像来判断测试化合物的活性如何(相对于单用培养基)。信号强度是经试验治疗所逆转的上皮表型(即E-钙粘蛋白表达)损失的程度。尽管荧光强度是明显信号，但麻烦的是，非本质的特征使得在没有某种内部参考时难以准确测定。另一方面，本质特征例如颜色又不依赖于强度。已经发现，对于像素区，存在着颜色变化(本质特征)，反映在RGB强度直方图中。CRT颜色是由3种发光颜色构成：红色、绿色和蓝色(RGB)。强度水平通常是1字节宽(0-255)，所以像素颜色被编码为3个量，{R,G,B}。对于从白{255,255,255}到黑{0,0,0}的不同灰色阴 影，R＝G＝B。另一方面，紫色是{200,100,200}。这就是E-钙粘蛋白荧光照片的图像分析基础，其被认为可为测定体外抗纤维化活性提供定量标准。
D.E-钙粘蛋白纤维化测定定量测定方法
在数码照片上选择荧光区，计算像素的RGB统计数据。与每一像素相关的这3数值R、G&B，可被认为是三维颜色-强度矢量。该矢量的长度是颜色矢量，{ρ,γ,β}，是单位矢量(长度＝1.0)，即{ρ,γ,β}≡{R/L,G/L,B/L}＝{R/L,G/L,B/L)，其不依赖于强度，因此是本质特征。颜色矢量可被认为是单位球面表面上的一个点(仅当所有成分为阳性时的第一个八分圆(first octant))。计算像场的颜色矢量的最佳方法是取平均矢量，但是通常从图像分析程序例如Photoshop(Adobe Systems)获得作为直方图的每个R、G和B成分的统计值(c.f.,使用PhotoShop中的图像/直方图图像分析功能)。这些直方图在形状上倾向于高斯分布(Gaussian)，但具有尾巴，所以对于代表图像的所选区域的总体颜色强度矢量而言，最好使用中位值而不是每一直方图的平均值作为成分值。
当荧光抗体结合到膜上的E-钙粘蛋白时，如果有颜色变化，就会有2个不同的颜色矢量，一个代表用培养基处理的细胞，另一个代表用D-葡萄糖处理的细胞。这2个点限定了大圆的弧线(将球分为两半)。来自试验物处理的所有数据点都应当落入介于这些终点之间的弧线(我们称之为信号弧(signal arc))上(参见图42)。通过将代表D-葡萄糖处理的细胞的信号弧的一端作为0，代表正常培养基处理的细胞的另一端作为1.0，根据颜色矢量沿弧线的远近，可对代表试验物处理的细胞的颜色矢量赋值。
矢量和分别是D-葡萄糖处理的(纤维化)和未处理的(单用培养基)细胞的颜色矢量。它们位于大圆上，所述大圆由垂直于与 的矢积，矢量的所有点组成。颜色矢量是数据点(试验物处理的细胞图像区域的颜色矢量)，其预期位于和之间的信号 弧附近，但不一定准确位于其上。为了找到矢量(位于信号弧上的的成分)，我们先计算矢积其矢量限定了含有和两者的大圆。矢量是这2个大圆的2个交叉点之一，并由矢积所限定。与颜色矢量相关的信号就是从到的角度除以从到的角度的比率。
作为实例，下图(图43)显示了用100mMD-葡萄糖、单用培养基和100mMD-葡萄糖加上100uM测试化合物处理的细胞的荧光图像。100mM D-葡萄糖图像的RGB中位值为(47,94,74)，其给出颜色矢量{ρ,γ,β}0％＝(0.674,0.531,0.514)。培养基图像的RGB中位值为(1,93,31)，其给出颜色矢量{ρ,γ,β}100％＝(0.010,0.949,0.316)。这些矢量之间的角度为28.4°，限定大圆的正常矢量(矢量位于大圆上)是 实验化合物图像的RGB中位值为(1,105,75)，其给出颜色矢量{ρ,γ,β}？％＝(0.008,0.814,0.581)。计算成分矢量 从到的角度是+17.0°，所以信号是17.0°/28.4°＝59.8％。
E.误差检测
应当质疑距离信号弧太远的颜色矢量。与信号弧的距离是由颜色矢量和之间的角度给出的。作为一个点与信号弧相距多远的度量，我们采用了和之间的角度到和之间的角度的比率。比率值大于0.1是所考虑的合理标准。
实施例5:本发明的肽在治疗纤维化病症中的用途
纤维化疾病的特征在于成纤维细胞的活化、胶原和纤连蛋白产量增加、和转分化为收缩性的成肌纤维细胞。该过程通常发生超过多个月份和年份并且可导致器官功能障碍或死亡。纤维化疾病的实例包括糖尿病性肾病、肝硬化、特发性肺纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心纤维化和硬皮病(系统性硬化病；SSc)。纤维化疾病代表了无有效治疗的最大类别的病症之一并因此表现出严重不足的医学需 求。通常，对纤维化患者的唯一补偿是器官移植；然而，因为器官供应不足以满足需要，所以患者常常在等待接受合适器官期间死亡。单单是肺纤维化，在硬皮病肺疾病、特发性肺纤维化、放疗和化疗诱导的肺纤维化和职业性吸入尘粒所致病况中可以是主要死亡原因。缺乏合适的抗纤维化疗法，主要是因为对纤维化疾病的病因学还是未知的。对于如何控制正常组织修复和该过程在纤维化疾病中如何出错的理解将是至关重要的。
TGF-β及其在纤维化中的作用
已经知道促纤维化蛋白例如转化生长因子-β(TGF-β)和结缔组织生长因子(CTGF)参与纤维化疾病。因为TGF-β诱导成纤维细胞合成和收缩(contract)ECM，所以长期以来一直认为该细胞因子是纤维化反应的主要介质(1)。十多年前发现的作为由人内皮细胞分泌的一种蛋白质的CTGF(2)，由TGF-β诱导并且被认为是TGF-β对成纤维细胞作用的下游介质(3、4)。同样，TGF-β诱导基质蛋白纤连蛋白的ED-A形式(ED-A FN)的表达，这种形式是通过纤连蛋白转录物的可变剪接而产生的一种纤连蛋白变体(5)。ED-A FN的这种诱导是TGF-β1-触发的α-SMA和胶原I型表达增强所需要的(6)。因此TGF-β被认为是在许多组织中纤维化诱导的“主要开关”，所述组织包括肺(7)和肾(ref)。在这一点上，在IPF患者的肺中或在CKD患者的肾中TGF-β被上调，并且活性TGF-β在大鼠的肺或肾中的表达导致明显的纤维化反应，而在响应TGF-β1时无反应提供了针对博来霉素-诱导的纤维化(8)或肾间质纤维化(30)的保护作用。
上皮-间充质转换(EMT)及其在纤维化中的作用
EMT(完全分化的上皮细胞经历向间充质表型转换而产生成纤维细胞和成肌纤维细胞的过程)，被越来越多地认为在上皮损伤后的修复和瘢痕形成中起到重要作用。在肺和其它器官中，该过程在损伤后促进纤维化的程度，是活跃的研究对象。近来，已经证明转化生长因子(TGF)-β在体外和体内在肺泡上皮细胞(AEC)中诱导EMT，并且上皮 和间充质标记共定位于特发性肺纤维化(IPF)患者的肺组织中的增生性II型(AT2)细胞，表明AEC可表现出极度可塑性并在肺纤维化中作为成纤维细胞和/或成肌纤维细胞的来源。首次描述了TGF-β1在正常哺乳动物上皮细胞中作为EMT的诱导物(9)并已证明在体外在许多不同的上皮细胞系中介导EMT，所述上皮细胞包括肾近端小管、晶状体和最近的肺泡上皮细胞(10-14)。
Smad-依赖性&-非依赖性信号转导在EMT和纤维化中的作用
在动物模型中TGF-β-依赖性Smad途径的调节为TGF-β在体内纤维化EMT中的作用提供强有力的证据。在Smad3null小鼠中，在损伤后在体内晶状体上皮细胞的EMT被完全阻止，而用TGF-β处理的Smad3-/-晶状体上皮细胞原代培养物也被保护以免遭EMT(15)。同样，在肾中，Smad3null小鼠被保护以免遭实验性诱导的小管间质纤维化并显示出减少的EMT和胶原蓄积，而来自Smad3-/-动物的肾小管上皮细胞培养物显示了EMT的阻断和TGF-β1自身诱导的减少(16)。在人近端小管上皮细胞中，增加的CTGF和减少的E-钙粘蛋白是Smad3-依赖性的，增加的MMP-2是Smad2-依赖性的，并且α-SMA的增加依赖于这两者(17)。在正常小鼠和人的上皮细胞中，TGF-β-诱导的EMT的最近的转录组学分析使用显性负方法(dominantnegative approach)证明，Smad信号转导对于所有测试的靶基因的调节而言是至关重要的(18)。涉及TGF-β-依赖性EMT的非Smad-依赖性途径包括RhoA、Ras、p38MAPK、PI3激酶、Notch和Wnt信号转导途径。在大多数情况下，这些协作途径的刺激在特定组织内提供了EMT的诱导和特化(specification)的环境，其中Smads代表显性途径，其在某些情况下可能是必要的，但不足以诱导完全的EMT(19)。
TGF-β1-诱导的EMT&纤维化的逆转
已经证明许多介入都导致EMT的逆转。BMP-7在成人小管上皮细胞中通过直接抵消TGF-β-诱导的Smad3-依赖性EMT而逆转TGF-β1-诱导的EMT，并且在体内已经显示了经由EMT发生的肾纤 维化逆转的证据(20)。BMP-7能够延迟晶状体上皮中的EMT并伴有Smad2下调，而抑制性Smad7的过量表达阻止EMT并减少Smads2和-3的核转位(21)。在Smad3敲出小鼠中改善了EMT(15,16)，而且Smad7(TGF-β信号转导的拮抗剂)或以Smad-依赖性方式起作用的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)，可在肾和晶状体上皮细胞中逆转或延迟纤维化(21,22)。此外，HGF通过上调Smad转录辅阻遏物SnoN而在人肾上皮细胞中阻断EMT，这导致形成转录无活性的SnoN/Smad复合物，因此阻断了TGF-β1的效应(23)。这些研究表明调节Smad活性作为用于抵消TGF-β诱导EMT的作用的策略的可行性。有关介导TGF-β-诱导的EMT的准确分子机制及其与其它信号转导途径相互作用的知识，对于开发抑制/逆转EMT而不破坏TGF-β信号转导的有益效果的策略而言是重要的。
EMT的研究和本发明BMP激动剂肽对EMT的调节
EMT的研究需要使用描述EMT特性的标记组。上皮表型的损失可被特定上皮蛋白表达损失而明确地限定，所述蛋白包括连接相关蛋白(例如E-钙粘蛋白)、细胞角蛋白和顶端肌动蛋白-结合跨膜蛋白-1(MUC-1)。具体地讲，E-钙粘蛋白的损失是EMT的普遍特征，无论起始刺激物如何(24)，并且在某些情况下，如果产生E-钙粘蛋白的话，可以观察到侵袭性间充质表型的逆转(25)。已经证实高血糖症在人肾上皮细胞中可以诱导EMT，所述细胞变得更长，对基质粘附更少，并失去它们的顶端到基部的极性。在该过程期间，细胞显示出增加的TGF-β的重新表达，E-钙粘蛋白表达的损失(26)和胞外基质分子例如纤连蛋白和胶原的合成，这些是与更多成纤维细胞-样表型一致的特征。成肌纤维细胞的活化在细胞粘附、肌动蛋白重组和增加的慢性肾纤维化的细胞进程的过程中起到关键性作用。特发性肺纤维化(IPF)是对肺泡上皮损伤的慢性异常调节反应，伴有上皮细胞和成纤维细胞通过EMT过程向基质-分泌性成肌纤维细胞分化并导致肺的瘢痕形成。在该过程期间，细胞显示出增加的TGF-β的重新表达并损失E-钙粘蛋 白表达，导致成肌纤维细胞活化和胶原产生，从而导致肺纤维化(27,28,29)。
已经证明BMP-7干扰TGF-β信号转导途径，从而导致对EMT过程、成肌纤维细胞扩大和上皮细胞的细胞凋亡的逆转。该效果在动物模型中在治疗肾纤维化中具有很大的益处(30)。本文所述的肽特异性地与II型BMP受体和选择性地与I型BMP受体两者相互作用并诱导BMP信号转导，从而诱导模拟BMP7效应的细胞反应，除了骨生成的诱导之外。这些化合物中的许多但并非所有，在已经历高血糖症的肾小管上皮细胞中抑制EMT过程。EMT在小管-间质纤维化发展中是必要机制。当将人近端小管上皮细胞暴露给高葡萄糖时，检测到E-钙粘蛋白表达的明显损失。像BMP-7的这些化合物在这些细胞中能有效阻止E-钙粘蛋白表达的损失。因此，这些结果解释了BMP信号转导特性的重要性和这些肽激动剂对肾的保护效应。
通过BMP信号转导的活化来控制EMT，对于肺再生事件而言是重要的，但在肺纤维化中它是明显的麻烦(31)。因此，BMP途径的这些肽激动剂在拯救BMP信号转导活性中的用途，代表了用于治疗人肺纤维化的具有巨大治疗潜力的策略。可将这些结论延伸到经由EMT形成纤维化的其它纤维化病症。
肽激动剂在治疗纤维化疾病中的潜在用途
丝氨酸-苏氨酸信号转导途径是由受体和胞内信使分子的至少2个竞争组组成。在TGF-β方面，TGF-βII型受体、I型受体ALK2和3和SMAD 1和5起促进EMT过程和纤维发生的作用，而在BMP方面，BMP II型受体、I型受体ALK2、3和6、和SMAD 1、5和8其促进分化的上皮状态的作用。此外，这2种状态倾向于通过下调相反状态的信号转导实体而使它们稳定。用TGF-β方面刺激细胞，具有下调BMP、BMP受体和SMAD 1、5&8的表达的效应，反之亦然。因此，这2种途径起到双稳态生化开关的作用。治疗和/或逆转纤维化的策略可指向抑制TGF-β方面(TGF-β拮抗剂和抑制剂，例如抗TGF-β 抗体、诱饵受体和TGF-β结合蛋白)，或者可指向刺激BMP方面，其使用BMP-7或BMP途径的其它激动剂，例如这些肽。
用TGF-β1治疗肾小管上皮细胞，导致EMT。E-钙粘蛋白表达下降，而间充质标记例如α-SMA、纤连蛋白、胶原I和CTGF的表达增加。BMP-7以剂量依赖性方式抑制所有这些效应。事实上，BMP-7可以逆转TGF-β1-诱导的EMT，导致内源E-钙粘蛋白的重表达(32)。在慢性肾损伤的若干动物模型中，BMP-7减缓了肾功能的持续损失和肾纤维化(33-36)。
在纤维化适应症的情况下进行了类似的观察。在特发性肺纤维化动物模型中，已经证明BMP-7通过调节TGF-β-诱导的EMT和抑制肺成纤维细胞产生胶原(37)，在肺中减缓了实验-诱导的纤维化(31)。在有证据表明BMP-7作为抗炎和抗纤维发生剂而起到重要作用的肝纤维发生的情况下也如此(38)。心纤维化涉及到源自内皮细胞的成纤维细胞的产生，表明内皮-间充质转换(EndMT)类似于在胚心中的房室垫形成期间发生的事件。观察到用TGF-β1处理的心内皮细胞经历了EndMT过程，而BMP-7维持内皮表型。在压力超载和慢性同种异体移植物排斥的小鼠模型中，系统给予重组人BMP-7显著地抑制了EndMT和心纤维化进程(39)。
在慢性肾纤维化相关的血管钙化的情况下，若干研究结果表明BMP-7也是有效治疗。在血管壁中表现出成骨细胞-样表型的细胞在血管钙化的病因学中可能是重要的。骨钙蛋白的表达用作成骨细胞功能的标记。已经证实骨钙蛋白在未治疗的尿毒症动物中增加，但当用BMP-7治疗时，则骨钙蛋白被下调至类似于非尿毒症的对照动物的水平(40)。在所有以上纤维化疾病中，已经知道EMT作为组织纤维发生的组成方面，而且BMP信号转导的刺激已被证明在抑制或甚至逆转EMT过程中是有效的。
假使本申请的肽经证明是BMP信号转导途径的有效激动剂，其抑制对具有高D-葡萄糖(高血糖症)诱导的EMT的人肾近端小管上皮 细胞的效应，并伴有E-钙粘蛋白表达的损失。此外，已经证明这些肽逆转由TGF-β1诱导的EMT，导致内源E-钙粘蛋白的重表达和上皮形态学的维持(参见图---来自Nature Medicine article,41)。在慢性肾损伤的若干动物模型中，经口服给予的这些肽之一减缓了肾功能的持续损失和肾间质纤维化。在特发性肺纤维化的动物模型中，肽激动剂有效抑制了博来霉素-诱导的肺上皮细胞EMT和肺纤维化(参见实施例7和相关图)。THR-123治疗的小鼠(口服日剂量5mg/kg)在第16天处死时具有80％存活率，而溶媒治疗的小鼠在第8天具有100％死亡率。肺组织的组织形态测量分析表明在THR-123治疗的动物中的肺纤维化明显较少。同样，BMP信号转导途径的这些肽激动剂为治疗其它纤维化疾病例如肝硬化、动脉粥样硬化、心纤维化和硬皮病-肾风险(系统性硬化病)提供了治疗潜力。
同样，BMP信号转导的肽激动剂(其是TGF-β作用和组织纤维化的拮抗剂)可为治疗其它纤维化疾病例如肝硬化、动脉粥样硬化、心纤维化和硬皮病-肾风险(系统性硬化病)提供潜在治疗用途。正在考虑用于筛选的若干细胞测定法和动物模型，以测试化合物在这些纤维化疾病中的功效。参见下表的模板。
用于筛选本发明的BMP-激动剂和拮抗剂肽的模板：
模板A：用于测试本发明的肽的纤维化疾病的细胞模型(体外测定)：
模板B：用于测试本发明肽的抗纤维化活性的纤维化疾病动物模型(体内测定)。
实施例6:在肺纤维化模型中测试本发明的肽的抗纤维化活性的体外和体内测定 法
A.体外测定(预计)
目的：
使用人支气管上皮细胞(HBEC)，在体外筛选化合物的抗纤维化活性(抑制或逆转EMT过程)。该测定法检测了测试化合物抑制TGF-β-介导的E-钙粘蛋白表达的下调(上皮标记)和若干间充质标记(即波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA))的上调的能力。此外，同样的细胞用于检查测试化合物对EMT的抑制/逆转是否是Smad-依赖性的，这是BMP信号转导机制中的重要过程。
所述测定也用于优化活性化合物。在响应化合物时，上皮标记E-钙粘蛋白和间充质标记N-钙粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、MMP-2、MMP-9和胶原I型α1(COL1A1)的表达(上或下)，通过蛋白质印迹分析，然后通过定量ELISA测定法测定。
实验设计和方法：
细胞培养:
在37℃，在5％CO2存在下，在加湿培养箱中，将人支气管上皮细胞(HBEC；Lonza,MD,USA)维持在BEGM培养基(Lonza)中。所有使用HBEC的其它实验都只在BEGM培养基中进行，除非另有说明。
EMT测定：
将密度为106细胞/孔的HBEC接种在1:100BEGM:BEBM中(6- 孔板)。让细胞贴壁1天，然后更换为含有5ng/ml TGF-β1(R&D Systems,MN,USA)的培养基。再让HBEC分化3-5天。人BMP 7重组蛋白可用作测定的阳性对照。对于在测试化合物存在时的EMT测定，将HBEC与增加浓度(1-200μM)的测试化合物一起孵育1小时，然后EMT诱导，其通过加入TGF-β1(5ng/ml)起始并孵育48h或3-5天。Smad途径抑制剂SB431542(10μM,Sigma-Aldrich)和ERK途径抑制剂PD98059(10μM,Calbiochem)也可用作参考抑制剂。
相差显微镜术:
可通过相差显微镜术评价在TGF-β1存在时孵育的HBEC。治疗用TGF-β的治疗通常导致松动的细胞-细胞接触，而且细胞变得更稀疏和变为拉长的成纤维细胞的形态学。抗纤维化化合物有望阻止这些形态学变化。
免疫荧光染色和显微镜术:
如上所述，将HBEC细胞铺在孔中并暴露给测试化合物1小时，然后加入TGF-β1(5ng/ml)(EMT诱导)48小时或3-5天。细胞经洗涤后，在1:1丙酮：甲醇混合物中在室温(RT)下固定2分钟，然后在室温下在含有1％山羊血清和1％BSA的PBS中封闭7分钟。为了鉴定磷酸化的SMAD1/5/8和或磷酸化的SMAD2/3的存在以及它们转位到细胞核中，接着将细胞免疫染色，首先用对磷酸化的SMAD1/5/8或磷酸化的SMAD 2/3具有特异性的第一兔抗体，再用针对兔IgG的FITC-标记的第二抗体。用倒置荧光显微镜(Axiovert；Carl Zeiss)，在200x放大倍数(20x物镜和10x目镜)，观察免疫染色的细胞并拍照。
蛋白质印迹：
为了判定上皮标记和间充质标记的上调或下调，将以下抗体用于蛋白质印迹形式：E-钙粘蛋白(Abcam,MA,USA)、N-钙粘蛋白(Zymed,CA,USA)、波形蛋白(Abcam)、α-SMA(Sigma)、MMP-2(R&D Systems)、pSmad2(Cell Signaling,MA,USA)和pSmad1/5/8(CellSignaling)。将孵育的细胞在含有1％NP-40、150mMNaCl、50mM Tris pH 8.0、1mM原钒酸钠、5mMNaF和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,NY,USA)的TRIS缓冲液中裂解。然后将细胞裂解物在4-10％梯度丙烯酰胺凝胶上进行SDS PAGE。然后将电泳后的蛋白条带转移到PVDF膜上并在Tris-缓冲盐水(TBS)、0.1％Tween-20、5％脱脂干奶中在室温下(RT)封闭1小时。然后将印迹在TBS 0.1％Tween(TBS-T)中洗涤3次并在室温下与辣根过氧化物酶-标记的第二抗体(Invitrogen)孵育1小时。在TBS-T中重复洗涤后，通过化学发光(ECL；Pierce,L,USA)，按照制造商的说明书，检测免疫反应性蛋白。针对GAPDH的抗体用作上样对照。
ELISA测定:
可通过ELISA测定法，使用针对上皮标记E-钙粘蛋白的抗体(#7886,CellSignaling Technology,Inc.,MA,USA)，检测HBEC细胞对测试化合物的剂量-相关的抗纤维化反应，并检测间充质标记，针对MMP-2(DMP200,R&D Systems,MN,USA)、MMP-9(DY911,R&DSystems,MN,USA)、αSMA(ACTA2,antibodies-online Inc,Atlanta,GA 30346,USA)、N-钙粘蛋白(ABIN867238,antibodies-online Inc,Atlanta,GA,USA)、人波形蛋白(ABIN869687,antibodies-online Inc,Atlanta,GA,USA)或人胶原I型α1(COL1A1)(ABIN512856,antibodies-online Inc,Atlanta,GA,USA)的抗体。
测定的验证：
数据表明，原代人支气管上皮细胞(HBEC)在响应转化生长因子-β1(TGF-β1)时能够经历EMT，正如通过典型的形态学改变以及经蛋白质印迹和定量ELISA方法在蛋白质水平上EMT标记进程所揭示。在蛋白质水平上检测了若干间充质标记(包括N-钙粘蛋白、波形蛋白、MMP-2)的表达增加和成肌纤维细胞标记a-SMA的表达增加。相比之下，在TGF-β1存在时观察到了上皮标记E-钙粘蛋白的下调以及金属蛋白酶MMP-2的表达增加。还显示了该效应主要是经由Smad2/3依赖性机制介导，并且该效应可进一步被BMP途径活化调节。
化合物活性的证明:
为了判定是否本发明的化合物在HBEC中在经由调节EMT的气道纤维化病理中也可起作用，将HBEC与单独的测试化合物一起孵育或在诱导EMT之前与TGF-β1一起孵育。发现测试化合物抑制由TGF-β1诱导的胶原I表达。此外，由TGF-β1诱导的金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的过量表达被测试化合物所抑制。通过使用相差显微镜术来评价细胞形态学，进一步证实了测试化合物对TGF-β1-介导的MMP2蛋白的上调的拮抗效应。测试化合物能有效抑制TGFβ诱导的若干间充质标记(包括N-钙粘蛋白、波形蛋白、MMP-2)的表达增加和成肌纤维细胞标记a-SMA的表达增加。这与上皮表型E-钙粘蛋白的明显重获有关。为了确保BMP信号转导在测试化合物存在时是有活性的，使用了与Smad 1、5和8磷酸化的形式(BMP信号转导的下游效应子)交叉反应的抗体。在测试化合物存在时发现了Smad1/5/8的磷酸化增加，如果同时加入TGF-β1的话，这种效应可以被终止。这些结果表明了测试化合物在HBEC的EMT期间对TGF-β及其途径的抵消。
因此，结果提供了进一步研究在肺纤维化期间支气管上皮细胞向间充质细胞分化的机制的基础，并用于开发肺纤维化的新治疗方法。
B.体内测定(简化以用于实践)
目的：
将上述体外肺纤维化测定法中发现具有活性的测试化合物，在动物模型中进行测试，在所述模型中通过单次气管内给予博来霉素诱导小鼠肺纤维化。该模型的终点是存活率和肺组织中的纤维化程度的组织形态测量评价。按照Animal Welfare ActRegulation,9CFR 1-4的指导进行研究。
材料与方法：
测试化合物的配制：
将冻干形式的测试化合物溶于50mM乙酸缓冲液(pH 4.5)中，起 始浓度为20mg/mL。然后将母液分为若干份1mL等分试样，快速冷冻并贮存于-70℃备用。在使用当日，将各等分试样融化并在PBS(pH7.5)中进一步稀释至所需的工作浓度。根据预期剂量(mg/kg体重)和口服给予体积来确定工作浓度。
材料：
1.BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Cambridge)，体重21-26g；
2.博来霉素(Blenoxane,Sigma,St.Louis,MO)；
3.环磷酰胺(为单水合物，来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
实验设计:
动物模型:
在BALB/c小鼠(Charles River)中进行了研究，以评价测试化合物(Seq ID No.1-11)能够改善博来霉素-诱导的肺纤维化的程度，所述小鼠在标准动物养殖条件下维持正常饮食。为了引发肺纤维化，给小鼠通过腹膜内注射250μl 12.5mg/ml氯胺酮麻醉，然后通过气管内滴注在50μl无菌PBS中的2U/kg体重的博来霉素(Blenoxane,Sigma,St.Louis,MO)。另外，所述小鼠接受单次腹膜内注射环磷酰胺(150mg/kg体重)。将用博来霉素加上环磷酰胺攻击的动物分为2组，每组具有最少6只动物。溶媒治疗组(组1)接受每日口服给予PBS,pH7.5。化合物治疗组(组2)接受测试化合物，在初步研究中每日口服给予5mg/kg体重，在随后的研究中剂量水平典型地为0.03、0.1、0.3和1.0mg/kg，以建立剂量反应并测定最小有效剂量。继续这些治疗直至博来霉素给予后16天。第三对照组的小鼠接受气管内PBS，而不是博来霉素和环磷酰胺。
肺的准备和肺纤维化的组织学评价：
完成活体研究(in-life study)之后，对动物实施安乐死(甲氧氟烷麻醉)，然后肺中灌注冰冷的Hank氏平衡盐溶液，以除去血源性细胞，然后在30cmH2O的恒定压力和10％正常缓冲的福尔马林(NBF)中膨 胀。将肺在气管上连接，整个取出，并浸泡在NBF中24小时。然后，将组织样品更换到70％乙醇中，然后石蜡包埋，接着通过切片和用苏木精、曙红和马松三色染色。切片经显微镜检分析，通过测定胶原蓄积程度(马松三色)以评价肺纤维化。
Smad信号转导：
为了测定phospho-Smad 1、5、8(BMP信号转导)或phospho Smad2/3(TGF-β信号转导)的水平，将来自各组小鼠的玻片分别染色。切片经过脱去石蜡，再水合，并经历抗原恢复(retrieval)。然后，内源过氧化物酶用3％H2O2猝灭并用50％山羊血清封闭20min。将第一phospho-Smad 1,5,8或phospho-Smad 2,3抗体(兔多克隆，Cell Signaling Technology,Danvers,MA)加入到相应的切片组中，并在4℃在25％山羊血清中孵育过夜。然后将切片与生物素化山羊抗兔第二抗体(Vector Labs Burlingame,CA)孵育60min，然后再用链霉抗生物素-HRP(Dako,Mississauga,ON)处理10min。通过使用棕色色原体3,3-二氨基联苯胺(Dako,Mississauga,ON)使目标抗原显现，并用Harris苏木精溶液(Sigma,Oakville,ON)复染色。
EMT的肺免疫组织化学：
为了评价上皮标记和/或间充质标记的存在，对肺组织切片脱蜡，再水合，用10％山羊血清在室温下封闭60min，然后对于α-SMA或波形蛋白(间充质标记)或E-钙粘蛋白(上皮标记)进行免疫荧光染色。将切片与抗α-SMA抗体或抗波形蛋白抗体在4℃下孵育过夜，或者与抗E-钙粘蛋白抗体在4℃下共孵育过夜，然后与山羊抗小鼠IgG-TRITC抗体或山羊抗兔IgG-FITC抗体孵育1小时(如果合适的话)。为了识别核，DAPI用于将核染色(500ng/ml在95％乙醇中)20秒，然后将盖玻片用80％甘油封片。用装备有数码相机的荧光显微镜检测玻片。
TUNEL测定：
通过使用TUNEL检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, RocheApplied Science)测定凋亡细胞。组织切片经过脱去石蜡，再水合，并用蒸馏过的去离子水洗涤。用蛋白酶K处理后，使用末端转移酶，用荧光素-dUTP标记片段化的DNA。玻片用含有Vectashield的DAPI封片。用装备有荧光检测系统的荧光显微镜分析切片。通过在4,000或更多个细胞的组中手工统计TUNEL+细胞而获得凋亡百分率。
组织匀浆的制备：
胶原测定：
将来自所有组的小鼠的肺在完全蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,Indiana,USA)中匀浆。将匀浆在900x g离心10分钟并冷冻，直到分析之时。
将天狼星红试剂加入到每份肺匀浆(50ml)中并在室温下混合30分钟。通过在16,000g离心5分钟沉淀胶原-染料复合物，再将沉淀物重悬于1ml 0.5MNaOH中。按照各制造商的说明书以540nm处的吸光度和来自已知标准曲线的插值测定各样品中的胶原浓度。
用来自R&D Systems,CA,USA的ELISA试剂盒测定趋化因子、MMP-2和MMP-9的水平。
结果：
动物死亡率：
对于溶媒治疗的小鼠(组1)，在给予博来霉素和环磷酰胺后8天，死亡率为100％。对于化合物治疗的小鼠(其用博来霉素+环磷酰胺攻击)(组2)，在引发纤维化后16天(活体研究结束时)，存活率高达80％，而溶媒治疗的小鼠在第8天死亡率100％。
肺纤维化：
通过测定用马松三色染色的肺切片中胶原蓄积的视场的百分比，在组织形态测量上评价肺纤维化。用博来霉素和环磷酰胺治疗后10天，溶媒治疗的动物显示出增加的肺纤维化，分值为31％。这与所有这些动物的死亡相关。然而，口服给予THR-123在第16天将博来霉素+环磷酰胺诱导的肺纤维化降低至16％，所有小鼠均存活。
其它预期的结果：
博来霉素-治疗的小鼠的肺显示了EMT过程，正如在肺组织切片中的EMT标记进程所揭示。观察到了若干间充质标记(包括N-钙粘蛋白、波形蛋白)的表达增加和成肌纤维细胞标记a-SMA的表达增加。相比之下，在这些切片中观察到了上皮标记E-钙粘蛋白的下调，以及金属蛋白酶MMP-2的表达增加。我们还观察到，该效应主要是经由Smad2/3依赖性机制介导，并且还可进一步被BMP途径活化而调节。
用化合物的治疗导致存活率的明显增加并且抑制了博来霉素-诱导的若干间充质标记(包括N-钙粘蛋白、波形蛋白、MMP-2)和成肌纤维细胞标记a-SMA的表达增加。这与上皮表型E-钙粘蛋白表达的明显重获有关，表明对EMT的阻止。另外，博来霉素处理的动物(其用化合物治疗)在肺组织中显示出磷酸化增加和它们的Smad1/5/8核转位，表明主要的BMP信号转导途径的参与。此外，在用博来霉素处理的小鼠中观察到的胶原和金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达增加，在用所述化合物治疗的动物中全都被抑制。
这些结果(包括预期的)，在这个广泛使用的肺纤维化动物模型中，是测试化合物可通过明显减少纤维化而缓解肺病理学并因此明显提高动物存活率的证据。
实施例7:本发明的BMP激动剂肽在肾小管上皮细胞中经由BMP7信号转导途径和 Alk-3受体而逆转纤维化和EMT
TGFβ超家族的相关分子例如BMP和TGFβ是炎症、细胞凋亡和细胞转换的关键调节剂。在此，证明了BMP7受体，活化素-样激酶3(Alk-3)，在响应肾损伤时显著升高，而且它在肾小管上皮中的特异性缺失导致加速的TGFβ/Smad3信号转导、小管上皮损伤和肾纤维化，表明Alk-3介导的信号转导的肾保护作用。为了治疗性地开发该活性，通过使用合成有机化学构建口服可用的、对Alk-3受体具有特异性结合的小的环状BMP肽模拟物，进行了ALK-3/BMP配体-受体复合物的结构-功能分析。筛选鉴定出肽THR-123(表1的SEQ ID NO:1)， 其在若干不同的体外和体内实验中抑制炎症、细胞凋亡和上皮向间充质转换程序。THR-123在5种不同的小鼠模型中抑制和逆转肾损伤和纤维化，而且THR-123与血管紧张素-转化酶抑制剂卡托普利的组合在控制肾纤维化中表现出额外的治疗益处。我们的结果证明了THR-123是新的抗纤维化剂，在临床上具有逆转纤维化的潜在用途。
介绍：
骨形态发生蛋白-7(BMP7)是转化生长因子(TGF)-β超家族成员，起到TGF-β-介导的纤维发生活性的拮抗剂的作用1-3。BMP7与活化素-样激酶(Alk)-2、-3、-6结合并在不同细胞种类中表现出完全不同的活性4，显示抗炎和抗凋亡功能以及促进骨形成5,6。从功能的观点看，BMP7的抗纤维化活性是用于在临床上测试的有吸引力的候选者，但它的经由不同受体的多种活性(尤其是骨形成)带来一定的临床开发上的挑战。在这一点上，多项研究已经证明BMP7的骨形成作用是专门经由Alk-6介导并且抗纤维化作用可能是经由Alk-3和可能经由Alk-2而介导7-12。BMP信号转导经由Smads 1/5，而TGFβ信号转导经由Smad2/34。
因许多不同病因学所致的终期肾病(ESRD)表现出与小管-间质纤维化程度呈正相关13-17。在此证明了Alk-3通过控制炎症、细胞凋亡和EMT程序而起到抑制纤维化的作用。模拟BMP7活性的小的环状肽(THR-123)与Alk-3结合并逆转肾纤维化。THR-123是针对进行性纤维化肾病(特异的和有效的治疗对此是不可行的)的新的治疗药。
结果：
(A)在小管上皮细胞上的Alk-3受体作为纤维化的阴性调节剂
BMP7在多种肾病模型中已经证明了肾保护特性和抗纤维化效应 2,18-20。某些研究表明在急性和慢性肾损伤中BMP7表达被抑制21-24。我们在慢性肾损伤小鼠中在不同时间点筛选了受BMP7调节的若干分子的表达水平。在所评价的13种不同的BMP7调节的分子中，仅Alk-3表达在肾损伤后1周达到峰值(图42A)。在3-6周之间，与对照肾相 比，Alk-3表达保持高水平(图42A)。在9周时，与对照肾相比，Alk-3表达下降(图42A)。在肾损伤后，在所有所测分子中，BMP7表达水平下降最大，在损伤后3周时达到最低水平并保持低水平直到第9周(图42A)。
BMP7与Alk-3结合并使受体调节的Smads1/5磷酸化4。在NTN诱导的慢性肾纤维化小鼠中(图42B-D)，检测到磷酸化的Smad1(pSmad1)在损伤后1周在小管核中蓄积。有趣的是，pSmad1在肾损伤后大约6周再次下降(图42E-G)，因此显示了用Alk-3表达所观察到的类似趋势(图42A)。这些结果进一步表明BMP7/Alk-3轴与肾上皮损伤和间质纤维化呈负相关。为了在功能上解释该观察结果，使用γGT-Cre小鼠25和具有Alk-3floxed等位基因的小鼠26，我们在小管上皮细胞中删除了Alk-3受体。
在对照小鼠中NTN诱导后6周，与γGT-Cre；Alk-3fl/fl小鼠(Alk-3缺失小鼠)中的纤维化相比，这些小鼠中的纤维化变少(图42T-V)。在Alk-3缺失小鼠中的这种加速纤维化与TGF-β途径的活化增强有关，正如在小管上皮细胞核中通过增加的pSmad2所证明(图43)。通过血清BUN测量所判断的肾功能，在患有纤维化的Alk3缺失的小鼠中比对照小鼠显著更高(图42W)。总之，这些结果表明Alk-3在保护肾间质组织免于纤维化中可能起到关键作用。
与巨噬细胞流入相关的炎症和肾上皮细胞凋亡被认为是肾纤维化的重要促进剂28。重要的是，先前的研究已经证明在肾中BMP7/Alk-3/Smad1/5信号转导途径在控制炎症、细胞凋亡和EMT程序中的重要性。我们证明了对于Alk3缺失的小鼠而言在肾小管上皮中的纤维化导致MAC-1阳性巨噬细胞的流入增加(图44)，而且小管上皮细胞数量增加显示上皮标记E-钙粘蛋白和间充质标记FSP1/S100A4的共定位，表明在这些细胞内的EMT程序(图42X-Z)。
(B)BMP信号转导途径激动剂THR-123的设计
通过与具有最高可变性的TGF-β超家族比对序列区域的比较侧 链溶剂可达性来鉴定最可能参与受体相互作用的TGF-β229,30和BMP731的3D结构区，设计了BMP信号转导途径的环状肽激动剂31。为了进一步精化目标区，使用了结构-方差分析(SVA)程序32，其根据它们与活性的关系衡量各位置上的理化残基特性。目标是鉴定受体-结合区，然后对于特异性BMP活性优化序列。然后将最高评分的残基位置作图到BMP-7的3-D结构上31。在所鉴定的3个结构区中31，经设计在指2环周围的肽证明是最有希望的。这些是分子量～20kDa、长度为16个残基的肽，其经由第一和第十一个残基位置之间的二硫键而环化，以使环稳定，类似于BMP7的指2环中的构象(图45A)。
(C)先导物优化和THR-123的表征
优化的初步筛选是根据在体外的基于细胞的测定中的抗炎功效，其使用人肾小管上皮细胞系(HK-2)。所述测定测试了化合物逆转用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激细胞所致的细胞因子IL-6产量增加的能力。使用SVA程序进行序列-活性分析。6轮优化循环之后，THR-123(图2A)显示作为先导化合物，在其它相关的抗纤维化测定(见下文)中对其进行进一步评价。
首先，分析了BMP的若干I型受体的胞外结构域(ECD)对THR-123的特异性亲和力。通过与125I-标记的BMP7竞争测定冷BMP7与固定化的受体ECD的结合，并通过Scatchard分析法分析以测定BMP7对于每种受体ECD的有效离解常数。为了获得THR-123对特定受体ECD的有效离解常数的估计值，将冷BMP7的离解常数乘以THR-123的ED50与冷BMP7的ED50的比率。数据表明，THR-123与BMP7竞争Alk-3(图45B)和在小程度上竞争Alk-2(数据未显示)，但在Alk-6上却完全未见竞争(图45C)，表明这3种已知BMP I型受体中Alk-3是对THR-123的主要靶标。
在体外测试了THR-123在全血和血浆中的稳定性。在PBS-甘露醇缓冲液中，THR-123在超过400分钟都是稳定的(图46)。在大鼠血浆中，THR-123被缓慢降解，其半寿期为358分钟(图46)，而在全血 中，THR-123快速降解(半寿期为70分钟)(图46)。
使用经iv给予的125I-标记的化合物然后按照放射性衰变来评价THR-123在体循环中的持久性。在血浆和全血两者中，THR-123水平在5分钟内都会立即下降(几乎为90％)，表明在α-相中的THR-123的非常短的半寿期(图45D)。125I-THR-123的β-相评价显示出半寿期为55-58min(图45E)。静脉内给予125I-THR-123后6小时，大部分放射性仍然位于肾和膀胱中(图45F)，表明THR-123在肾中蓄积并且经由膀胱排泄到尿中。口服给予的125I-标记的THR-123在摄取后1小时主要位于肾皮层并在大约3小时达到峰值(图45G)。摄取后24小时，大部分125I-THR-123放射性从肾中被完全清除掉(图45G)。
(D)THR-123抑制小管上皮细胞的炎性细胞因子的产生、细胞凋亡和EMT程序
炎症是肾纤维化中的关键特征。BMP7表现出抗炎活性5,33，因此推动了关于THR-123对若干促炎细胞因子在人肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)中表达的效应的研究。BMP7和THR-123以剂量依赖性方式抑制TNF-α诱导的IL-6的产生(图47A)。THR-123还在HK-2细胞中抑制TNF-α-诱导的IL-8(图47B)和ICAM-1产生(图47C)，表明类似于BMP7的功能，THR-123表现出抗炎特性。
还报道BMP-7保护小管上皮细胞(TEC)免遭细胞凋亡22。通过膜联蛋白V标记分析了TEC中的TGF-β-诱导的细胞凋亡。(图48A)。BMP7和THR-123表现出类似的抗凋亡活性(图48B,C)，但当使用对照杂乱(scrambled)环状肽时却未检出这样的抗凋亡活性(图48C,D)。缺氧诱导的TEC的细胞凋亡也被BMP7和THR-123抑制(图49A-D)。另外，顺铂诱导的细胞凋亡被THR-123抑制(图50A-D)。
已经证明BMP7抑制TGF-β诱导的上皮-间充质转换(EMT)程序2。类似于BMP7，THR-123抑制TGF-β诱导的EMT程序(图51A-D,图52A-C)。TGF-β抑制E-钙粘蛋白表达(图51F和G)，而BMP7和THR-123两者将TGF-β-抑制的E-钙粘蛋白恢复到正常水平(图51H和I)。对照环状杂乱肽对EMT程序表现出不明显的效应(图51J)。TGF-β诱导的与EMT程序相关的基因例如snail和CTGF的表达被THR-123抑制(图52D,E)。与TGF-β和表皮生长因子(EGF)孵育48小时后，肾上皮细胞表现出EMT程序(图53A,B,F,G和图54A,B,F,G)。在这些细胞中，TGF-β-诱导的EMT被用BMP7或THR-123的治疗逆转(图53C,D,F,G和图54C,D,F,G)。对照肽显示了对EMT不明显的效应(图53E和图54E)。THR-123-诱导的EMT的逆转与E-钙粘蛋白表达的恢复(图53H-L)和Smad1/5磷酸化相关(图54H)。
(E)THR-123保护肾免于急性和慢性肾损伤和纤维化
使用小鼠的缺血再灌注损伤(IRI)模型分析了THR-123对急性肾损伤的效应。IRI后7天，对照小鼠表现出的肾形态学与急性肾小管坏死一致，特征在于小管扩张和变平的上皮细胞，其具有嗜酸性粒细胞的同质胞质(图55A,C)。与对照小鼠相比，THR-123-治疗的小鼠在IRI肾中表现出明显更少的小管破坏(图55A-C)。在这两组中血液尿素氮水平类似(图55D)。
单侧输尿管阻塞(UUO)是良好建立的严重肾间质损伤和纤维化模型(图56,图57)。UUO后5天，与正常肾比较，肾表现出显著增加的间质体积(图56A,B,E和图57A,B)。与未治疗小鼠相比，口服给予THR-123(5mg/Kg或15mg/Kg)在UUO肾中抑制间质体积扩张(图56B-E和图57C,D)。UUO后7天，肾表现出严重纤维化并具有增加的间质体积(图56F,J和图57E)。与对照小鼠相比，腹膜内给予BMP-7改善了间质体积扩张(图56F,G,J和图57E,F)。腹膜内和口服给予THR-123都抑制纤维化(图56H-J和图57G,H)。用THR-123治疗降低了小管损伤，与基质成分例如纤连蛋白和I型胶原的表达减少相关(图58)。
然后，分析了THR-123对由绵羊抗肾小球抗体(NTN)所致的肾毒性肾炎模型的效应。具有NTN的肾表现出严重的新月体型肾小球性肾炎伴有间质损害和纤维化2,34。这样的损伤在CD-1小鼠中以渐进方 式发展(图59A-C和E-G和图60A-C)。NTN诱导后6周，小鼠表现出严重的新月体型肾小球性肾炎伴有严重的间质损害和纤维化(图59B和图60B)。THR-123治疗(在NTN诱导后6周开始)改善了肾小球损伤(硬化)和小管萎缩和纤维化(图59D-G和图60D)，与基质成分例如纤连蛋白和I型胶原的表达减少相关(图61)。THR-123治疗后，血液尿素氮降低(图59H)。我们鉴定了具有EMT程序的小管细胞，如对成纤维细胞特异性蛋白(FSP)-1和E-钙粘蛋白两者都呈阳性。类似于先前的报道2，与正常肾相比，EMT程序在NTN肾中是明显的(图59I-K,M)。THR-123治疗显著地减少了表现出EMT程序的细胞数(图59L,M)。与对照正常肾相比，NTN肾表现出增加的Mac-1阳性巨噬细胞蓄积；并且THR-123治疗抑制了巨噬细胞蓄积(图62)。THR-123治疗存在有增加的phospho-Smad1/5蓄积的肾，揭示了Alk3-介导途径的可能刺激(图63)。
奥尔波特综合征(Alport syndrome)是由编码IV型胶原蛋白的基因中的基因突变所致的遗传性肾病35。在IV型胶原链的α3链的小鼠缺陷型(COL4A3KO小鼠)模拟与奥尔波特综合征相关的肾病。在16周龄时，与野生型肾相比，COL4A3KO小鼠表现出增加的肾小球异常、小管萎缩和纤维化(图64A-F)。尽管THR-123治疗不改变肾小球异常(图64C,G)，但它显著地抑制了小管萎缩和间质纤维化(图64F,H,I)。与野生型小鼠相比，在COL4A3KO小鼠中血液尿素氮水平增加(图64J)。THR-123在COL4A3KO小鼠中显著地改善了血液尿素氮水平(图64J)。与野生型肾相比，在COL4A3KO肾中，表现出EMT程序的细胞数显著较高(图64K,L,N)。THR-123治疗抑制了这样的EMT程序的获得(图64M,N)。与对照肾相比，在COL4A3KO肾中的巨噬细胞浸润增加，并且THR-123治疗抑制了巨噬细胞浸润(图65)，THR-123治疗的COL4A3KO肾与phospho-smad1/5的蓄积增加有关(图66)。
然后，评价了THR-123在小鼠中控制糖尿病性肾病(DN)的功效。与对照小鼠相比，注射链脲霉素(STZ)的CD-1小鼠在6个月表现出增 加的肾小球膜基质以及与间质损伤相关的增加的肾小球表面积，表明晚期DN(图67A-C,F-H,图68A-C)。尽管BMP-7或THR-123在糖尿病小鼠中都不抑制肾小球表面积的增加(图67D,E,K)，但BMP-7和THR-123两者在STZ-诱导的6个月DN中都抑制肾小球膜扩大(图67B-E,L)。此外，与5个月DN小鼠相比(在THR-123给予开始之前)，THR-123治疗(5-6个月)逆转了肾小球膜基质扩大(图67B,E,L)。与对照小鼠相比，DN小鼠表现出增加的小管萎缩和间质体积(图67F-H,M,N,图68A-C)。用BMP-7(1-6个月治疗)或THR-123(5-6个月治疗)的治疗抑制了小管萎缩和间质体积增加(图67I,J,M,N,图68D,E)。THR-123逆转了小管萎缩和间质体积扩大(图67M,N)。在STZ给予后5和6个月时测定，在DN中血液尿素氮水平增加(图67O)。BMP-7和THR-123两者在DN中都逆转肾功能障碍(图67O)。BMP-7和THR-123两者治疗都抑制EMT程序(图67P-R,S-U)和巨噬细胞浸润(图69)。THR-123治疗的肾还与phospho-smad1/5的蓄积增加有关(图70)。
血管紧张素-转化酶抑制剂(ACE-I)是充分确定的药物，用于控制若干慢性进行性肾病(包括糖尿病性肾病)的进程36,37。因此，我们在患有晚期糖尿病肾病相关纤维化的小鼠中测试了THR-123和ACE-I[卡托普利(CPR)]组合。糖尿病诱导后7个月，DN肾表现出肾小球表面积和肾小球膜基质沉积上的明显增加(图71A)。在DN诱导后7个月在患有严重DN的小鼠中开始CPR和CPR/THR-123组合治疗(图71A-H)。在所分析的所有组中肾小球表面积都保持一致(图71A-D,I)。在这些实验中，CPR治疗不抑制肾小球膜基质扩大的进程(图71A-C,J)，但与未治疗的对照小鼠相比，CPR与THR-123组合显著地降低了肾小球膜的扩大并使其逆转(图71D,J)。糖尿病诱导后的7-8个月之间(晚期)，DN肾表现出小管萎缩和间质体积扩大(图71E,F,K,L)。CPR单用，部分地抑制了DN肾中的小管-间质变化，而CPR与THR-123组合则完全地抑制了小管萎缩和间质体积扩大(图71G,H, K,L)。血液尿素氮水平分析揭示了DN小鼠在糖尿病诱导后的7-8个月之间表现出明显的肾功能衰退(图71M)。CPR不(p＝0.08)显著地抑制肾功能的进行性损失，但组合治疗可以(图71M)。EMT程序被单独的CPR抑制(图71N-P,R)并且也被CPR/THR-123组合治疗抑制(图71N,O,Q,R)。CPR和CPR-THR-123组合疗法这两者都抑制巨噬细胞浸润(图27)。与相同年龄的未治疗的糖尿病小鼠相比，在所分析的所有组中血糖水平和体重不变(图73)。CPR在糖尿病肾中的显著地抑制细胞凋亡(图74)，而CPR-THR-123组合疗法表现出额外的抗凋亡效应(图74)。CPR-THR-123治疗的肾与phospho-smad1/5的蓄积增加有关(图75)。
(F)THR-123在小管上皮细胞的Alk-3受体的特异性缺陷小鼠中不抑制肾损伤和纤维化
THR-123结合到Alk-3受体上并诱导模拟BMP7的行为(见上文)。所有上述实验都表明THR-123通过抑制炎症、细胞凋亡和EMT程序而起到抑制肾损伤和纤维化的功能。为了在功能上确证THR-123在小鼠中发挥这样的肾保护活性的标靶，测试了THR-123在经历肾损伤的Alk-3缺失小鼠中的功效(图42K)。Alk-3缺失小鼠和它们同窝(对照)小鼠都经历IRI。与对照小鼠相比，Alk-3缺陷型小鼠表现出加速急性肾损伤(图76A-D)。THR-123在对照小鼠中抑制了肾损伤，但在Alk-3缺失小鼠中却未显示治疗效果(图76A-D)。THR-123在对照小鼠中的Alk-3依赖性行为与巨噬细胞蓄积的减少(图77)和小管细胞凋亡的降低相关(图78)。
与对照小鼠相比，在具有NTN的Alk-3缺失小鼠中观察到了加速的肾衰竭和纤维化(图76E,G,I)。已经证明，尽管THR-123在对照小鼠中成功地控制了肾损伤和纤维化(图76E,F,I)，但它在Alk-3缺失小鼠中却无效(图76E-I)。THR-123对具有NTN的对照小鼠的这样的治疗效果与肾中巨噬细胞蓄积的抑制(图76J,K,N)和小管中的EMT程序相关(图76O,P,S)，同时THR-123在具有NTN的Alk3缺 失的小鼠中不抑制巨噬细胞蓄积(图76L,M,N)和EMT程序(图76Q,R,S)。THR-123在具有NTN的野生型肾中抑制细胞凋亡，但对Alk3缺失的小鼠中的细胞凋亡却无效(图79)。最终，THR-123在具有NTN的对照小鼠中恢复了肾功能，但THR-123的这样的肾保护效果在Alk3-缺失的小鼠中却没有实现(图76T)。
讨论：
TGF超家族蛋白对肾纤维化的发病机制具有相当大的影响38。在大部分情况下(Formost part)，该家族中的许多分子，最重要的是TGFβ1和TGFβ2，因其募集成肌纤维细胞、促进EMT程序、影响炎症和诱导上皮细胞的细胞凋亡的能力，而被鉴定为纤维化的正调节物 2 ,5,22,33。尽管多数注意力已放在TGFβ1在纤维化中的作用上，但过去十年中的许多研究也已证明BMP-7(TGF超家族中的另一种分子)起到抑制和逆转纤维化的作用2。BMP-7的行为是经由其抗炎、抗细胞凋亡和EMT抑制作用来实现2,5,22,33。BMP-7抵消了TGFβ1经由Smad-依赖性途径的作用2。
在这一点上，BMP-7还可结合到成骨细胞上的Alk-6受体上并诱导骨形成7,9,11,12。在肾中，小管上皮细胞优势地表达Alk-3受体39。因此，理想的治疗用分子将是结合到Alk-3受体、而非Alk-6受体上的分子。另外，尽管在肾损伤的情况下BMP-7水平下降，但Alk-3在肾病进程中的作用尚未知晓21-24。因此，在本研究中研究了Alk-3在肾纤维化中的作用，开发出构建可以结合到Alk-3、而非Alk-6上的新分子的策略并测试这些分子的作用机制和治疗功效。已经证明系统给予重组人BMP-7经由结合到肾小管上皮细胞上的Alk-3受体上而逆转肾纤维化。这些结果也表明BMP-7和Alk-3的表达与纤维化进程负相关。总之，这些结果表明BMP-7起到与TGFβ1作用相反的可能的肾保护作用2。
同样，在本研究中已经知道Alk-3还是损伤期间肾健康的正调节物。它以保护性方式响应肾损伤并且它的损失扩大了肾纤维化的进 程。这些结果，连同BMP-7的抗纤维化活性，提供了设计具有结合到Alk-3受体上的BMP-7作用的小肽模拟物的理论依据。
THR-123，是一种新的口服可用的Alk-3受体的肽激动剂和BMP-7模拟物。THR-123抑制了肾病进程并逆转了已建立的肾纤维化。
重要的是，已经证明，THR-123和卡托普利的组合显示出在控制糖尿病肾病相关的肾纤维化中的引人注目的额外治疗效果。总之，这些结果表明THR-123抑制了炎症、细胞凋亡、EMT程序并逆转了肾纤维化。该作用是由Alk-3受体介导的39。可能的是，Alk-2受体也可促进THR-123的作用，但是遗传的小鼠模型实验表明，这样的Alk-2介导的活性(如果有的话)是不明显的。
总之，本研究表明，当肾受损时，Alk-3受体是纤维化的负调节物。这样的肾保护特性反映了其配体BMP-7在肾中的作用。设计AA-123利用了这种协同作用并在口服给予患有纤维化的小鼠时表现出重要的治疗功效。这些临床前研究为这种试剂在未来作为抗纤维化药物提供了设计可能的临床测试的知识。
实施例7中使用的方法与材料：
试剂
E-钙粘蛋白的单克隆抗体购自BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ)。FSP1的多克隆抗体由Dr.Eric Neilson,Vanderbilt University Medical Center提供。Mac-1抗体购自AbD Serotec(Oxford,United Kingdom)。Phspho-smad1/5抗体购自Cell SignalingTechnology(BeverlyMA)。通过QuantiChromTMUrea测定试剂盒(BioAssay System,Hayward,CA)或比色试剂盒DIUR-500QuantiChromTM Urea测定试剂盒(Gentaur,KampenhoutBelgium)进行BUN的测量。IL-6、IL-8和ICAM-1的Elisa试剂盒购自R&D system(Minneapolis,MN)。
NTN肾中的微阵列分析
在C57BL6小鼠中通过皮下注射在完全弗氏佐剂中的正常绵羊IgG(200μg)预免疫(第1天)，然后通过静脉内注射肾毒性血清注射剂(50μl,从第5天到第7天)，诱导NTN。在NTN诱导后1、3、6、9周处死小鼠。通过用于RNA提取的Trizol/Invitrogen PureLink RNA MiniKit，从肾中分离总RNA。10毫微克的总RNA用于产生互补cDNA，其使用TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)。进行定量PCR，分析BMP7、BMP受体Alk2、Alk-3、Alk6和BMPRII的基因表达特征，并且使用ABIprism 7000(AppliedBiosystems)对BMP-结合蛋白chordin、crim1、fibrillin1、follistatin、KCP、USAG1、gremlin和noggin进行分析(表:引物序列(下文))。
表1.引物序列
Alk-3在肾小管中的条件性缺失
Alk-3flox小鼠由Yuji Mishina博士(National Institutes of Health)提供并有材料转移协定。γGT-Cre小鼠由Eric Neilson博士(Vanderbilt UniversityMedicalCenter)提供。NTN是通过上述方法诱导。
缺血再灌注损伤
8周龄C5
7B16小鼠用于本研究。小鼠用氯胺酮和赛拉嗪的混合物麻醉并将左肾蒂钳制25分钟。手术后的同一天，开始THR-123(p.o.5mg/Kg/天)或溶媒治疗。术后7天，处死小鼠。
单侧输尿管阻塞
小鼠用氯胺酮和赛拉嗪的混合物麻醉。从周围组织准备输尿管并在左肾的输尿管的上2/3处放2条结扎线，相隔大约5mm，以获得可靠的阻塞。术后的同一天，小鼠用BMP7(300μg i.p./Kg/每隔一天)、THR-123(p.o.5mg或15mg/Kg/天,i.p.5mg/Kg/天)或用PBS(i.p.)作为对照开始治疗。在术后5或7天处死小鼠。
肾毒性血清诱导的肾炎(NTN)
在CD1小鼠中通过上述方法诱导NTN。NTN诱导后6周，开始THR-123(p.o.5mg/Kg/天)，直到9周。在第1周、第3周、第6周和第9周处死小鼠。
对于肾小球硬化症的分析，每只小鼠随机挑选20个肾小球，并按照以下量表评价每个肾小球：无硬化0，0到1/4的肾小球表面积硬化1，1/4至1/2硬化2，1/2至3/4硬化3，和超过3/4硬化或新月体4。肾小球硬化症评分计算为每只小鼠的这些数值的算数平均值。来自所有小鼠的肾小球硬化症评分被主观地分为4类：即，无病、轻度、中度和严重。计算这4类小鼠的百分率。
对于小管萎缩评分，每个玻片随机选择10个200x视野并按照以下量表评价小管萎缩：无萎缩0，0至1/4视野被萎缩小管占据1，1/4至1/2 2，1/2至3/4 3，和超过3/4 4。然后小管萎缩评分计算为每只小鼠的这些数值的算数平均值。来自所有小鼠的小管萎缩评分被主观地分为4类：即，无病、轻度、中度和严重。计算这4类小鼠的百分率并示于图上。
对于间质纤维化的分析，每个马松三色染色的肾切片也随机选择10个200x视野并且按照以下量表评价间质纤维化：无纤维化0，0至1/4视野受到间质纤维化影响1，1/4至1/22，1/2至3/4 3，和超过3/4 4。纤维化指数计算为每只小鼠的这些数值的算数平均值。来自所有小鼠的纤维化指数被主观地分为4类：即，无病、轻度、中度和严重。计算这4类小鼠的百分率。
IV型胶原a3链敲除小鼠(COL4A3-/-)
8周龄COL4A3-/-小鼠用THR-123(p.o.5mg/Kg/天)或者溶媒治疗。在16周龄处死COL4A3-/-小鼠。
对于正常肾小球百分比的形态测量分析，每玻片从随机视野中统计100个肾小球，每实验组统计5个玻片。正常肾小球数量表示为统计的肾小球总数的百分率。
糖尿病性肾病
8周龄雄性CD-1小鼠用于所有糖尿病实验。给小鼠单次腹膜内(i.p.)注射链脲霉素(STZ:200mg/Kg)。糖尿病的诱导定义为STZ注射后2周，血糖水平>16mM。糖尿病诱导后1个月，将小鼠分为3组(BMP7、溶媒和非治疗)，开始BMP7(i.p.300μg/Kg/每隔一天)或溶媒注射。糖尿病诱导后5个月，在糖尿病小鼠中开始THR-123(p.o.5mg/Kg/天)给予。在糖尿病诱导后5(治疗前)或6个月处死小鼠。
对于卡托普利(CPR)和THR-123组合疗法试验，在糖尿病诱导后7个月，将糖尿病小鼠分为3组(溶媒、CPR和CPR-THR-123组合)。开始CPR(p.o.50mg/Kg/天)或者CPR和THR-123(p.o.5mg/Kg/天)组合治疗。在糖尿病诱导后7(治疗前)或8个月处死小鼠。
对于肾小球损伤，我们评价了肾小球膜基质扩大和肾小球的增大。点计数方法用于量化肾小球膜基质沉积。在含有667(29x23)点的数码显微镜屏幕格栅上分析来自每只小鼠的20PAS-染色的肾小球。将命中粉红或红色肾小球膜基质沉积的格栅点的数目除以肾小球中的总点数，得到给定肾小球中的肾小球膜基质沉积的百分率。
形态测量分析
肾切片用苏木精和曙红、马松三色和过碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff)染色。通过小管间质损伤和肾小球损伤的形态测量评价来估计肾损伤程度。通过形态测量分析，使用配备到显微镜上的10-mm2小方格，评价相对间质体积。对每只动物评价5-10个随机选择的皮质区。对小管的加宽的腔和增厚的基底膜评价300-500个小管，以估计萎缩的小管的百分率。该方法用于UUO、COL4A3KO和糖尿病研究。
LacZ的检测
将来自6周龄R26Rstop LacZ flox小鼠27(有或无-Cre)的肾样品(1mm2)在4℃在4％低聚甲醛中固定4小时。样品用PBS pH 7.3洗涤3次，然后在37℃用LacZ染色缓冲液(在PBS中的1mg/ml X-gal、35mM亚铁氰化钾、35mM铁氰化钾、2mM MgCl2、0.02％NP-40、0.01％脱氧胆酸钠)染色过夜。用PBS pH 7.3洗涤后，将样品包埋在石蜡中。然后对切片(10μm)脱石蜡并用曙红复染色。
体外EMT
通过与3ng/ml重组人TGF-μ1孵育48小时，在NP1细胞或MCT细胞中诱导EMT。当EMT发生时，除去培养基并用在DMEM中的THR-123(10μM)或重组人BMP7(100ng/ml)来替换。48小时后，细胞通过免疫细胞化学而表征，使用针对E-钙粘蛋白的第一单克隆抗体(2.5g/ml)和罗丹明-缀合的第二抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)，如先前所述。通过荧光显微镜术观察染色和记录代表性的图，使用Spot advanced软件(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)。另外，在实验结束时收获蛋白和总RNA。对于EMT的形态测量分析，在亮视野图中的细胞的长度/宽度通过image J软件来测量。计算长度/宽度之比。
炎性细胞因子的产生
将人近端小管上皮细胞-衍生的HK-2细胞培养在24-孔板(30,000细胞/孔)上。将细胞暴露给单独的K-SFM培养基或TNF-β(5ng/ml)。TNF-α孵育后20小时，细胞用预加温的培养基洗涤2次，随后将细 胞与不同浓度的THR-123或BMP7孵育60小时。在孵育结束时，收获培养基并对IL-6、IL-8和ICAM-1进行进行ELISA分析。
细胞凋亡
将HK-2细胞在24-孔板上传代(25,000～30,000细胞/孔)。一旦细胞贴壁，将细胞暴露给单独的K-SFM培养基或含有THR-123的K-SFM培养基。BMP7用作实验的阳性对照。2小时孵育后，细胞暴露给顺铂60小时。通过膜联蛋白V-FITC染色，然后通过荧光显微镜术，测定细胞凋亡。终浓度：THR-123250μM、BMP71μg/ml、顺铂10μM。
统计学分析
数据表示为平均值±s.e.m.。使用方差分析(ANOVA)，然后通过用于小鼠样品多重比较的Bonferroni/Dunn检验来测定显著性。统计学显著性定义为P<0.05。Graph-padPrism软件用于统计学分析。
实施例7中引用的参考文献
以下参考文献在实施例7中引用，各个文献的内容通过引用结合到本文中。
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参考文献的结合
本申请全文引用的所有参考文献、专利、待审的专利申请和公布的专利的内容都明确地通过引用结合到本文中。
等同方案
仅使用常规实验，本领域技术人员将会理解或能确定本发明所述的具体的实施方案的许多等同方案。这样的等同方案意图包括在所附 权利要求中。

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1.包含选自SEQ ID NO: 1-314的氨基酸序列及其变体、类似物、同系物或片段的化合物。
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