ES2322881B1 - Uso de compuestos agonistas de la actividad pi3k en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, dichas composiciones farmaceuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents
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Abstract
Uso de compuestos agonistas de la actividad PI3K
en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas
composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas.
La invención describe el uso de un compuesto
activador de la actividad de la vía sinaptogénica PI3K en la
elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la
profilaxis y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o con
pérdida de sinapsis, por ejemplo la enfermedad Alzheimer o
Parkinson, así como una composición farmacéutica que comprende
dicho compuesto, por ejemplo una construcción genética o un vector
de expresión PI3K que permite la expresión de una proteína o
péptido con actividad sinaptogénica PI3K.
Description
Uso de compuestos agonistas de la actividad PI3K
en la elaboración de composiciones farmacéuticas, dichas
composiciones farmacéuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas.
Biomedicina y biotecnología. Desarrollo de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades
humanas que cursan con neurodegeneración y pérdida de sinapsis.
El número de sinapsis (N) en un sistema nervioso
cambia bajo la influencia de una gran variedad de factores no
patológicos que incluyen el estado hormonal (Kretz, O. et
al., Hippocampal synapses depend on hippocampal estrogen
synthesis. J. Neurosci. 24, 5913-5921,
2004), la actividad (Harris, K.M., Fiala, J.C., & Ostroff, L.
Structural changes at dendritic spine synapses during
long-term potentiation. Philos. Trans. R. Soc.
Lond. B Biol. Sci. 358: 745-748, 2003;
Devaud, J.M., & Ferrús, A. Molecular genetics of
activity-dependent synaptic changes. J.
Neurogenet. 17: 271-293, 2004) o la edad
(Coggan, J.S. et al., Age-associated synapse
elimination in mouse parasympathetic ganglia. J. Neurobiol.
60: 214-226, 2004; Gan, W.B., Kwon, E.,
Feng, G., Sanes, J.R., & Lichtman, J.W. Synaptic dynamism
measured over minutes to months: age-dependent
decline in an autonomic ganglion. Nat. Neurosci. 6,
956-960, 2003; Rosenzweig, E.S. & Barnes, C.A.
Impact of aging on hippocampal function: plasticity, network
dynamics, and cognition. Prog. Neurobiol. 69,
143-179, 2003). También, los defectos cognitivos
asociados a la edad o a ciertas patologías resultan en la pérdida
generalizada de sinapsis en las neuronas cerebrales (Coleman, P.D.
& Yao, P.J. Synaptic slaughter in Alzheimer's disease.
Neurobiol Aging 24: 1023-1027, 2003;
Spires, T.L. & Hyman, B.T. Neuronal structure is altered by
amyloid plaques. Rev Neurosci. 15:
267-278, 2004). Sin embargo, N no parece cambiar
con la edad en el estrato radial de CA1 mientras que está
severamente reducido en el giro dentado del hipocampo de rata
(Geinisman, Y. et al., Aging, spatial learning, and total
synapse number in the rat CA1 stratum radiatum.
Neurobiol. Aging. 25, 407-416, 2004).
Además, las sinapsis excitatorias, pero no las inhibitorias,
parecen estar reducidas en la corteza prefrontal de monos viejos
(Luebke, J.I., Chang, Y.M., Moore, T.L., & Rosene, D.L. Normal
aging results in decreased synaptic excitation and increased
synaptic inhibition of layer 2/3 pyramidal cells in the monkey
prefrontal cortex. Neuroscience 125,
277-288, 2004). Estos resultados sugieren que la
pérdida de sinapsis es específica de la región, e incluso, del tipo
neuronal. En este contexto, la modulación local del número de
neuronas podría ser una forma eficiente de aminorar el deterioro
cognitivo asociado a la edad o la patología.
Sin embargo, los mecanismos celulares y
moleculares que controlan N en cada neurona bajo unas condiciones
fisiológicas particulares, permanecen ampliamente desconocidos.
Como una primera aproximación, el número de sinapsis (N) que una
neurona establece está relacionado con su tamaño celular. Así,
queda justificado investigar el papel que el mecanismo molecular
que controla el tamaño celular pudiera tener sobre la
sinaptogénesis. En Drosophila, la mutación gigas
provoca un incremento entre dos y tres veces del número de sinapsis
y del tamaño celular de las neuronas sensoriales (Acebes, A. &
Ferrús, A. Increasing the number of synapses modifies olfactory
perception in Drosophila. J. Neurosci. 21:
6264-6273, 2001; Canal, I., Fariñas, I, Gho, M.
& Ferrús, A. The presynaptic cell determines the number of
synapses in the Drosophila optic ganglia. Eur. J. Neurosci.
6: 1423-1431, 1994). gigas, el
ortólogo en Drosophila del gen humano TSC2, es un componente
clave de la vía de señalización del receptor de insulina (InR) que
regula negativamente TOR (Inoki, K., Zhu, T. & Guan, K.L. TSC2
mediates cellular energy response to control cell growth and
survival. Cell 115: 577-590, 2003;
Brogiolo, W. et al., An evolutionarily conserved function of
the Drosophila insulin receptor and insulin-like
peptides in growth control. Curr Biol. 11:
213-221, 2001; Marygold, S.J. & Leevers, S.J.
Growth signaling: TSC takes its place. Curr Biol. 12:
R785-787, 2002). Por otro lado, la vía del receptor
de insulina (InR) (ver Figura 6) controla el tamaño celular a
través de una red de interacciones, conservada entre muchas
especies, que integra procesos que van desde la actividad ARN
polimerasa I (Drakas, R., Tu, X. & Baserga, R. Control of cell
size through phosphorylation of upstream binding factor 1 by
nuclear phosphatidylinositol 3-kinase. Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 9272-9276,
2004) hasta la progresión del ciclo celular y la ingesta de
nutrientes (Lynch, M., Fitzgerald, C., Johnston, K.A., Wang, S.
& Schmidt, E.V. Activated eIF4E-binding protein
slows G1 progression and blocks transformation by
c-myc without inhibiting cell growth. J. Biol.
Chem. 279, 3327-3339, 2004).
En este contexto, se sabe que la insulina juega
un papel en la conectividad neural durante el desarrollo (Song,
J., Wu, L., Chen, Z., Kohanski, R. A. & Pick, L. Axons guided
by insulin receptor in Drosophila visual system.
Science 300: 502-505, 2003), la
actividad sinóptica (Huang, C.C., You, J.L., Lee, C.C., & Hsu,
K.S. Insulin induces a novel form of postsynaptic mossy fiber
long-term depression in the hippocampus. Mol.
Cell. Neurosci. 24: 831-841, 2003) y el
comportamiento adulto (Zhao, W. et al. Brain Insulin
Receptors and Spatial Memory. Correlated changes in gene
expression, tyrosine phosphorylation, and signaling molecules in
the hippocampus of water maze trained rats. J. Biol. Chem.
274: 34893-34902, 1999).
Además, la actividad de la vía del InR está
pareja con otras vías que también exhiben propiedades
sinaptogénicas. Por ejemplo, las vías de señalización de Wg/Wnt y
TGF\beta coordinan elementos pre- y
post-sinópticos actuando como morfógenos secretados
(Packard, M. et al., The Drosophila Wnt, wingless, provides
an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.
Cell 111: 319-330, 2002). También, la
kinasa de adhesion focal (FAK), PKC o el
proto-oncogen ras son conocidos por jugar un
papel en la sinaptogénesis (Rico, B. et al., Control of
axonal branching and synapse formation by focal adhesion kinase.
Nat. Neurosci. 7: 1059-1069, 2004;
Ruiz-Canada, C. et al. New synaptic bouton
formation is disrupted by misregulation of microtubule stability in
aPKC mutants. Neuron 42, 567-580
(2004; Arendt, Th. et al. Neuronal activation of Ras
regulates synaptic connectivity. Eur J. Neurosci. 19:
2953-2966, 2004). Todas estas moléculas de
señalización forman una intrincada red regulatoria cuyo resultado
final reflejará el balance entre los factores que promueven y los
que inhiben la sinaptogénesis. Red que, además, sustenta la
coordinación necesaria entre el tamaño celular y la actividad
metabólica. La actividad adicional de estos mecanismos
sinaptogénicos puede explicar la observación de la presente
invención de que la regulación a la baja de la vía del PI3K (e.j.:
por la regulación a la alta de PI3K^{DN} o los represores
TSC1/TSC2 y S6K) no tiene efectos sinópticos negativos.
Usando un novedoso y altamente sensible
procedimiento para monitorizar el número de sinapsis en el cerebro
de Drosophila, se ha descubierto que la actividad de la vía
InR-PI3K controla la formación y el mantenimiento de
nuevas sinapsis de una forma autónoma celular lo que abre nuevas
posibilidades terapéuticas.
Con anterioridad, se han descrito la existencia
de compuestos inhibidores de PI3K útiles para el tratamiento de
tumores y otras enfermedades humanas (W02005042519, AU2003280188,
W02005023800, US2005014771). Sin embargo, con la excepción de la
identificación de la PI3K/akt como promotora de la hipertrofia
muscular y la perspectiva de la utilidad de activadores de esta vía
para el tratamiento de la atrofia muscular (Methods of inhibiting
atrophy or promoting hypertrophy, Regeneron Pharma. NZ519087) no se
han descrito enfermedades humanas en las que el incremento de la
actividad de PI3K pueda constituir una aplicación terapéutica.
Un objeto de la presente invención lo constituye
el uso de un compuesto o agente regulador, preferentemente un
activador, inductor o agonista de la actividad de la vía
sinaptogénica PI3K en la elaboración de medicamentos o
composiciones farmacéuticas para la profilaxis y tratamiento de
enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos, preferentemente
seres humanos, afectados por un proceso neurodegenerativo o de
pérdida de sinapsis.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la
composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad Alzheimer.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la
composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en
el que el compuesto está constituido por una construcción genética
que permite la expresión de una proteína o péptido con actividad
sinaptogénica que mimetiza la vía sinaptogénica PI3K en el interior
de las neuronas de un mamífero, preferentemente humanas, de forma
similar a las construcciones genéticas elaboradas en la presente
invención (ver Ejemplo 1) y que comprende una o varias secuencias
de nucleótidos PI3K pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína PI3K,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencia de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera de las definidas en a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en
el que el compuesto está constituido por un vector de expresión
génica, en adelante vector de expresión PI3K, que comprende una
secuencia de nucleótidos PI3K o una construcción genética PI3K
descritas en la presente invención y que permite la expresión de
una proteína o péptido con actividad sinaptogénica que mimetiza la
actividad de la vía PI3K humana en el interior de neuronas de
mamíferos, preferentemente humanos.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
neurodegeneración o pérdida de sinapsis pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención,
al grupo constituido por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad
de Parkinson, la demencia fronto-temporal, las
ataxias y el envejecimiento no patológico, que comprende un
compuesto ó agente activador de la vía sinaptogénica PI3K, en
cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es
capaz de estimular la generación y mantenimiento de nuevas
sinapsis.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto activador es una construcción genética o un vector
de expresión PI3K que permite la expresión de una proteína o
péptido con actividad sinaptogénica que mimetiza la actividad
sinaptogénica de la proteína PI3K humana en el interior de neuronas
de mamífero, preferentemente humanas, de forma similar a las
construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver
ejemplo 1) y que comprende una o varias de las secuencias de
nucleótidos PI3K pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- la secuencia de nucleótidos PI3K, codificante de la proteína PI3K,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera de las definidas en a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína humana PI3K (p110).
La invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevas aproximaciones terapéuticas para el tratamiento
de enfermedades neurodegenerativas humanas -tales como
enfermedades neurodegenerativas humanas que cursan con demencia,
alteraciones sensoriales y locomotrices- entre las que se encuentra
la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, demencia
fronto-temporal, ataxia cerebelosa, y también cabe
incluir condiciones de envejecimiento no patológico en donde se
aprecia declive cognitivo.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han observado que la regulación al alta
-en concreto, su sobreexpresión- de un conjunto de proteínas -las
proteínas PI3K (fosfatidil inositol 3 kinasa), Akt y Rheb- genera y
mantiene de manera eficiente nuevas sinapsis en un amplio abanico
de neuronas en animales de diferente edad.
En este contexto, en la presente invención se
describe además por primera vez que varios elementos de la vía del
InR, incluyendo S6KIp70 y el factor de transcripción Foxo, no
producen efectos detectables sobre la sinaptogénesis. Así, parece
que la vía sinaptogénica y la del InR se solapan inicialmente, para
después diverger por encima de TOR (ver Figura 6).
De esta manera en la presente invención se ha
identificado una vía sinaptogénica específica -es decir, que
provoca el incremento en el número de sinapsis activas- en la que
participan, conjuntamente con otras proteínas no conocidas en la
actualidad, las proteínas PI3K, Akt y Rheb (ver Ejemplo 1 y 2). En
adelante, esta vía sinaptogénica específica se denomina vía
sinaptogénica PI3K. Por otro lado, se ha demostrado que este
incremento del número de sinapsis (N) no es una consecuencia
directa del incremento del tamaño celular y que no se afecta la
proliferación celular.
Con todo esto, se concluye que la señalización
de la PI3K y de las otras proteínas induce la formación de
sinapsis ectópicas morfológicamente normales y funcionalmente
activas, en un amplio abanico de neuronas distintas: neuronas
sensoriales olfativas en la antena y fotorreceptoras en el ojo,
interneuronas del cuerpo elipsoidal, y motoneuronas; lo que
conlleva cambios de comportamiento locomotor y sensorial (Ejemplo
1).
Por otro lado, las nuevas sinapsis generadas
requieren la actividad permanente de la PI3K que incluso controla
fuertemente la estabilidad sinóptica en los adultos
envejecidos.
Además, la regulación condicional de la
señalización de PI3K mostrada en la presente invención, indica que
la ramificación puede ser reiniciada (ver Figura 7, Ejemplo 3),
demostrando que el rejuvenecimiento neuronal es factible en
células, tanto si están en fase de reconexión en la metamorfosis,
como si se trata de moscas adultas envejecidas. Finalmente, el
péptido 740Y-P induce la formación de nuevas
sinapsis en neuronas humanas mediante la unión a la subunidad
reguladora p85 que activa a la subunidad catalítica pilo (Ejemplo
4) siendo la primera evidencia de que las formas ortólogas de la
proteína PI3K, las proteínas p110\alpha y p110\beta humanas,
presentan dicha actividad, lo que no ocurre utilizando inhibidores
de la PI3K como el LY294002 y Wortmannin (Figura 9).
En resumen, en la presente invención se describe
como la activación de la fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K) y
otras proteínas de la vía sinaptogénica PI3K aumenta el número de
sinapsis en neuronas. Es de destacar que PI3K induce sinaptogénesis
durante el desarrollo del sistema nervioso así como en el cerebro
adulto, incluso senil, y que esto se ha corroborado también en
neuronas humanas.
Considerando la naturaleza conservadora de las
vías de señalización, es probable que el efecto sinaptogénico de la
PI3K descrito aquí pudiera también ser efectivo en los humanos.
Estos hallazgos pueden originar el desarrollo de gran número de
aplicaciones prácticas para el tratamiento de procesos
neurodegenerativos, incluyendo el retraso del envejecimiento o el
deterioro cognitivo como aquellos que caracterizan el
envejecimiento y los trastornos neurológicos incurables tales como
las enfermedades de Alzheimer o Parkinson. Entre estas aplicaciones
clínicas estaría incluida el uso de la sobreexpresión de cualquiera
de las proteínas PI3K de la vía sinaptogénica aquí descrita en el
interior de las neuronas de un animal, preferentemente un ser
humano, enfermo de un proceso neurodegenerativo que se puede
realizar mediante procedimientos de terapia génica. Igualmente, se
pueden utilizar agonistas de la actividad de cualquiera de las
proteínas descritas de la vía sinaptogénica PI3K para la
elaboración de medicamentos para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson,
entre otras.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto o agente regulador,
preferentemente un activador, inductor o agonista de la actividad
de la vía sinaptogénica PI3K, en adelante uso de un compuesto de la
presente invención, en la elaboración de medicamentos o
composiciones farmacéuticas para la profilaxis y tratamiento de
enfermedades, desórdenes o patologías de mamíferos, preferentemente
seres humanos, afectados por un proceso neurodegenerativo o de
pérdida de sinapsis.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto/agente activador o agonista" se refiere a
una molécula que cuando se une o interactúa con una proteína de la
vía sinaptogénica PI3K, o con fragmentos funcionales de la misma,
incrementa la intensidad o prolonga la duración de la actividad
biológica de dicha proteína. En esta definición se incluye además
aquellos compuestos o moléculas que permiten incrementar la
expresión de un gen codificante de una proteína de la vía
sinaptogénica PI3K, preferentemente PI3K ya sea la forma endógena
existente de forma natural en una célula o una forma exógena que se
introduce artificialmente en dicha célula. Por otro lado, la
definición de PI3K en la presente invención incluye tanto a la
proteína PI3K de mosca así como a sus formas ortólogas en humanos,
las proteínas p110\alpha, p110\beta y p110\delta
(Vanhaesebroeck B, Leevers SJ, Panayotou G, Waterfield MD.
Phosphoinositide 3-kinases: a conserved family of
signal transducers. Trends Biochem Sci. 1997, 22(7):
267-72; Anderson KE, Jackson SP. Class I
phosphoinositide 3-kinases. Int J Biochem Cell Biol.
2003, 35(7): 1028-33; Vanhaesebroeck B,
Waterfield MD. Signaling by distinct classes of phosphoinositide
3-kinases. Exp Cell Res. 1999, 253(1):
239-54; Cantrell DA. Phosphoinositide
3-kinase signalling pathways. J Cell Sci. 2001,
114(Pt 8): 1439-45). Un agente activador
puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido
nucleico, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico, o
cualquier otro tipo de molécula que incremente el efecto y/o la
duración de la actividad de una proteína de la vía sinaptogénica
PI3K.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "proteína de la vía sinaptogénica PI3K" se refiere a
una proteína capaz de inducir la generación y mantenimiento de
sinapsis en neuronas y que es estimulada a partir de la activación
de la PI3K o de cualquiera de sus formas homólogas en humanos, como
por ejemplo p110\alpha, p110\beta y p110\delta.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la
composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad Alzheimer.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el uso de un compuesto de la invención en el que la
composición farmacéutica se utiliza para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en
el que el compuesto está constituido por una construcción genética,
en adelante construcción génica PI3K de la presente invención, que
permite la expresión de una proteína o péptido con actividad que
mimetiza la vía sinaptogénica PI3K en el interior de las neuronas
de un mamífero, preferentemente humanas, de forma similar a las
construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver
Ejemplo 1) y que comprende una o varias secuencias de nucleótidos
PI3K pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína PI3K,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera de las definidas en a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las
secuencias mostradas en la presente memoria, por ejemplo, mediante
la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la supresión de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia, y que permita la
codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la
actividad sinaptogénica de la vía PI3K.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de
identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La enzima Fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K)
pertenece a una gran familia de proteína kinasas. Cada una de las
diferentes PI3Ks está sujeta a un mecanismo de regulación
específico. Dentro de ellas, la protagonista de la presente
invención, la PI3K92E que se indica de forma abreviada como PI3K en
la patente, es ortóloga de las proteínas p110\alpha y p110\beta
humanas, denominadas así por su peso molecular en KDa. Las formas
humanas de PI3K son heterodímeros compuestos por una subunidad
catalítica, la p110, y otra subunidad reguladora, la p85. La
secuencia de nucleótidos de las formas ortólogas en humanos,
codificante de las proteínas PI3K, Akt y Rheb que se indican en la
presente invención están identificadas por el número de acceso 5290
(forma p110alpha) y 5291 (forma p110beta); AKT1 207, AKT2 208 y
AKT3 10000; Rheb 6009 y RhebPl (pseudogene) 6008, respectivamente,
en el NCBI; mientras que las formas homólogas de mosca Drosophila
de la PI3K, Akt y Rheb están identificadas por los números,
FBgn0015279 (Flybase ID), FBgn0010379 CG4006 (Flybase ID: 41957
(83B3)), FBgn0041191 CG1081 (Flybase ID: 117332 (83B2)),
respectivamente.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso del compuesto de la presente
invención en el que la secuencia de nucleótidos de a) de la
construcción génica PI3K es la secuencia de nucleótidos PI3K
codificante de la proteína humana PI3K.
La construcción génica PI3K de la invención
también puede comprender, en caso necesario y para permitir un
mejor aislamiento, detección o secreción al citoplasma del péptido
expresado, a una secuencia de nucleótidos que codifica para un
péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento,
detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, otro objeto
particular de la presente invención lo constituye el uso de un
compuesto de la presente en el que el compuesto agonista es una
construcción genética PI3K descrita anteriormente que comprende,
además de la secuencia de nucleótidos PI3K, cualquier otra
secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia
peptídica que permita el aislamiento, la detección o la secreción al
citoplasma celular del péptido expresado, por ejemplo, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una
secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica
reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su
identificación, o cualquier otra que sirva para purificar la
proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad:
péptidos etiqueta tales como c-myc, HA,
E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual. Ed.
Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp.
347-377).
La secuencia de nucleótidos PI3K y la
construcción genética PI3K descritas previamente pueden obtenerse
por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente
conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al.
``Molecular cloning, a Laboratory Manual 2^{nd} ed., Cold Sping
Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3). Dichas
secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de
expresión génica que permite la regulación de la expresión de la
misma en condiciones adecuadas.
Por tanto, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto de la presente
invención en que el compuesto está constituido por un vector de
expresión génica, en adelante vector de expresión PI3K, que
comprende una secuencia de nucleótidos PI3K o una construcción
genética PI3K descritas en la presente invención y que permite la
expresión de una proteína o péptido con actividad sinaptogénica que
mimetiza la actividad de la vía PI3K humana en el interior de
neuronas de mamíferos, preferentemente humanos.
En general, un vector de expresión comprende,
además de la secuencia de nucleótidos PI3K o de la construcción
genética PI3K descritos en la invención, un promotor que dirige su
transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret,
etc), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias
necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción
y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo,
señales de inicio y terminación de transcripción (t1t2,
etc), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias
de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores
transcripcionales, (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión
apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y
necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión,
vectores virales (ADN o ARN), cósmidos, cromosomas artificiales,
etc. que pueden contener, además, marcadores utilizables para
seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o
genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula
huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según
un modo de realización particular de la presente invención dicho
vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho
vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por
los técnicos en la materia al igual que para la transformación de
microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes
métodos ampliamente conocidas -transformación química,
electroporación, microinyección, etc- descritos en diversos
manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular cloning: a laboratory manual, 2^{nd} ed. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.].
Los sistemas de expresión génica pueden permitir
o no la integración del nuevo material genético en el genoma de la
célula huésped. De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos,
construcción génica o el vector de expresión PI3K pueden utilizarse
como un medicamento para proteger células huésped, preferentemente
neuronas afectadas por un proceso neurodegenerativo, en un
procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica de un
ser humano afectado por una enfermedad neurodegenerativa. Las
herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia
génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de
la técnica.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto de la presente invención en
el que el compuesto está constituido por un péptido o proteína que
es una forma proteica constitutivamente activa de PI3K. Una
realización particular es el uso de una forma proteica
constitutivamente activa de PI3K constituida por una proteína de
fusión que incluye, en una misma molécula, los elementos de las
proteínas p85 y p110 humanas esenciales para mantener la actividad,
por ejemplo el dominio SH2 de p85 unida al extremo N terminal de
p110 (A cosntitutively active phosphatidylinositol
3-kinase and uses thereof. WO9625488).
\newpage
Finalmente, el origen de estos compuestos
agonistas de la actividad de las proteínas PI3K puede ser variado,
de tal forma que pueden ser origen natural (por ejemplo, de origen
vegetal, bacteriano, vírico, animales o microorganismos eucariotas)
o sintético.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
neurodegeneración o pérdida de sinapsis, en adelante composición
farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto ó
agente activador de la vía sinaptogénica PI3K, en cantidad
terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es
capaz de estimular la generación y mantenimiento de nuevas
sinapsis.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia
y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto regulador, agonista, de la
actividad sinaptogénica de la proteína PI3K, calculada para
producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre
otras causas, por las características propias de los compuestos,
incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la
alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de
administración.
En otra realización particular, dicha
composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o
suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser
administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo
cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica
adecuada a la vía de administración elegida. En una realización
particular, la administración de la composición terapéutica
proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por
vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión
de las distintas formas farmacéuticas de administración de
medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de
las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de
Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A.
Ediciones, Madrid.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto activador es una construcción genética o un vector
de expresión PI3K que permite la expresión de una proteína o
péptido con actividad sinaptogénica que mimetiza la actividad
sinaptogénica de la proteína PI3K humana en el interior de neuronas
de mamífero, preferentemente humanas, de forma similar a las
construcciones genéticas elaboradas en la presente invención (ver
ejemplo 1) y que comprende una o varias de las secuencias de
nucleótidos PI3K pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína PI3K,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera de las definidas en a), b) y c).
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos de a) es la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína humana PI3K (p110).
De esta forma, este compuesto agonista de la
proteína PI3K puede favorecer la sinaptogénesis de la PI3K endógena
en el interior de las neuronas eucariotas y, por tanto, prevenir o
revertir los efectos de un proceso neurodegenerativo.
La composición farmacéutica de la presente
invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma
aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
La composición farmacéutica de la invención
puede utilizarse en un procedimiento de tratamiento de una
enfermedad neurodegenerativa que afecta a seres humanos,
perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la presente invención, al siguiente grupo: enfermedad de Alzheimer,
la enfermedad de Parkinson, la demencia
fronto-temporal, las ataxias y el envejecimiento no
patológico.
Figura 1.- La PI3K regula el tamaño celular y
el número de sinapsis en neuronas. a, Visión frontal de un
cerebro entero mostrando 36 neuronas (cuerpo celular: cb)
proyectando al cuerpo elipsodial (EB) desde cada lado, y recibiendo
su entrada a través del escobillón dendrítico (dt)
(Gal4-796/+;
UAS-CD8-GFP/+). b, Secciones del
EB incluidas en plástico y visualizadas con anticuerpo
anti-\betaGal (Gal4-796/+;
UAS-LacZ/+). Observar la organización
glomerular (flechas) del neuropilo del EB. c-e,
Reconstrucciones seriadas de confocal de EBs de moscas controles
(Gal4-796/UAS-syn-GFP),
PI3K activadas
(Gal4-796/UAS-syn-GFP/UAS-PI3K),
y PI3K reprimidas
(Gal4-796/UAS-syn-GFP;
UAS-PI3K^{DN}). f-h, Neuronas
R4m únicas visualizadas con anti-GFP de cerebros
controles (f,
Gal4-796/UAS-CD8-GFP),
PI3K activados (g,
Gal4-796/UAS-CD8-GFP/UAS-PI3K)
y PI3K regulado a la baja (h,
Gal4-796/UAS-CD8-GFP/UAS-PI3K^{DN}).
Los cambios en el tamaño celular pueden ser observados por el
calibre axonal (flechas) y por el diámetro de las proyecciones
profusamente ramificadas. i-k, Uniones
neuromusculares de larva teñidas con HRP (rojo) y el anticuerpo
especifico de sinapsis nc82 (verde) en moscas controles (i,
Gal4-D42/+) y PI3K activada
(j-k,
Gal4-D42/UAS-PI3K). La
ramificación y el número de sinapsis están aumentados en j. Barra
de escala = 40 \mum en a, 30 \mum en b-h, 20
\mum en i,j y 8 \mum en k.
Figura 2.- El efecto sinaptogénico del InR y
PI3K. a-b, Efecto del (a) InR y (b) PI3K sobre
el volumen relativo del EB (syn-GFP) y sobre el
tamaño celular (b, cyto-GFP). Los valores están
normalizados con respecto a las hembras
Gal4-796/+. c-f, Bajos- (c y
d) y altos- (e y f) aumentos de secciones de EM mostrando el EB
(círculo discontinuo en c y d) de los cerebros controles (c y e,
Gal4-796/+) y con la PI3K activada (d y f,
Gal4-796/UAS-PI3K). Los
cerebros que expresan la PI3K tienen un mayor EB (d) que contiene
una mayor densidad de perfiles celulares y vesículas sinópticas
(f). Las especializaciones sinópticas parecen normales (f,
flechas). g-h, imágenes de EM de cerebros
Gal4-796/+;
UAS-PI3K/UAS-HRP corresponden a
escobillones dendríticos, donde estas neuronas reciben su entrada.
Los depósitos de HRP marcan los perfiles celulares más oscuros
(flechas en g). El recuadro en h marca sinapsis reciprocas entre
perfiles celulares marcados (flecha negra) y no marcados (flecha
blanca). i, El perfil de desarrollo del tamaño del EB está basado
en la señal syn-GFP. j-1, Ensayos de
locomoción en la arena de Buridan muestran incrementos en los
tiempos de actividad (j) y en la distancia caminada (k) para las
moscas PI3K, mientras la velocidad de movimiento (1) permanece
normal.
Figura 3.- El efecto sinaptogénico de la vía
de señalización del InR. a, La regulación al alta de Akt, Rheb
y TSC1-2 aumenta el volumen del EB, pero solo Akt y
Rheb afectan el dominio sinóptico. b, La sobreexpresión de GSK3
aumenta ligeramente el tamaño celular, pero reduce
significativamente el número de sinapsis. c, La sobreexpresión de
TOR, TOR^{DN}, S6K, Pten^{RNAi} y Foxo no modifica el número de
sinapsis. d, La regulación al alta y a la baja de Egfr afecta el
tamaño celular pero no el número de sinapsis.
Figura 4.- La actividad sinóptica de la PI3K
requiere su regulación al alta de forma crónica. a, Expresión
normal de la PI3K después de 8 días de sobreexpresión provoca la
perdida de las sinapsis ectópicas en las 48 h siguientes,
sugiriendo una vida media de 24 h. b, Moscas normales que comienzan
la expresión de PI3K en los días 15 (panel izquierdo) o 30 (panel
derecho) inducen la formación de un número significativo de nuevas
sinapsis cuando son analizadas en los días 40 y 45,
respectivamente. Genotipos:
Gal4-796/UAS-syn-GFP;
Ga180^{ts}/+ y
Gal4-796/UAS-syn-GFP/UAS-PI3K/Gal80^{ts}.
Figura 5.- PI3K protege a las neuronas
envejecidas. a, Secciones semifinas del EB teñidas con azul de
toluidina de individuos de 50 días
(Gal4-796/UAS-PI3K/Ga180^{ts}).
La expresión de la PI3K fue iniciada el día 30. Las vacuolas
relacionadas con la edad son abundantes en áreas adyacentes del EB
(puntas de flecha). Una población densa dentro del EB también
contiene vacuolas (flechas negras). b, Grandes aumentos que
corresponden al recuadro en a. Observar la desorganización del
citoesqueleto característica de la edad (estrellas), y la depleción
general de materiales densos a los electrones. c, Grandes aumentos
de los círculos en a. Observar la abundancia de las pequeñas
vesículas sinópticas y las sinapsis múltiples convergiendo sobre
una única dendrita (punta de flecha). Cuerpos anómalos densos a los
electrones (flecha) característicos de neuronas. envejecidas
también pueden ser encontradas.
Figura 6.- Esquema de la vía señalización del
receptor de insulina. Los componentes, actualmente conocidos,
de la vía de señalización del receptor de insulina. Las flechas
indican efecto positivo o activación y las líneas acabadas en barra
indican represión.
Figura 7.- Efecto de PI3K en la formación de
dentritas. Fotografía del penacho dendrítico en una sola
neurona R4d de un mosaico FLP/FRT visualizado mediante un anticuerpo
aCD8-GFP. Nótese la mayor profusión de
ramificaciones en el caso de neuronas que
sobre-expresan PI3K. Este efecto se reproduce en
adultos de 52 días en los cuales el sistema de expresión fue
"encendido" en el día 30. La barra indica una longitud de 15
\mum.
Figura 8. Mosaicos de células sensoriales
mutantes para el gen TSC2 (gigas) perteneciente a la vía
sinaptogénica de PI3K. A) Ojo de adulto en el que el territorio
por debajo de la línea punteada blanca está compuesto por
fotoreceptores mutantes y el territorio por encima de esa línea
está formado sólo por fotoreceptores normales. Nótese la diferencia
de tamaño entre ambos tipos. B) Antenas (órganos olfativos) de un
individuo en el que la antena que se muestra en el lado izquierdo
está compuesta por células mutantes mientras que la de la derecha
lo está por células normales. El número de células en cada caso no
es significativamente diferente.
Figura 9.- Imágenes de microscopia confocal
de neuronas tratadas con reguladores de la actividad PI3K. Se
han tratado neuronas con el péptido activador
740Y-P (panel superior derecho) y con los
inhibidores LY294002 y Wortmannin (panel inferior izquierdo y
derecho, respectivamente) de la proteína PI3K y se ha comparado con
controles no tratados (panel superior izquierdo) la presencia de
SV2, proteína específica de vesículas sinópticas como indicador de
incremento de sinapsis.
Inicialmente se propuso disecar la vía del InR
para valorar qué componentes afectan la sinaptogénesis. En este
trabajo, se modula la actividad de la vía de señalización del InR
en un grupo definido de 36\pm4 neuronas que proyectan al cuerpo
elipsoidal (EB) desde cada lado del cerebro adulto de Drosophila.
Este grupo de neuronas incluye todos los tipos conocidos de
neuronas con entrada al EB desde zonas externas al complejo central
(R1, R2, R3, R4d y R4m) (Strauss R. The central complex and the
genetic dissection of locomotor behaviour. Curr Opin
Neurobiol. 12: 633-638, 2002) (Figura 1a
y 1b). La línea Gal4-796 induce la expresión
de Gal4 bajo el control del gen walker/ccb en neuronas
colinérgicas especificas (R1, 2, 3, 4m y 4d) que constituyen la
entrada principal hacia el EB en el complejo central (Renn, S.C.
et al., Genetic analysis of the Drosophila ellipsoid body
neuropil: organization and development of the central complex. J
Neurobiol 41: 189-207, 1999) (Figura 1c
y 1f). El Gal4-796 comienza a expresarse
justo antes de la metamorfosis, cuando el sistema nervioso sufre su
mayor remodelación. Así, el Gal4-796 inicia
la expresión de las construcciones UAS (Brand, A.H. & Perrimon,
N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and
generating dominant phenotypes. Development 118:
401-415, 1993) cuando estas neuronas reinician la
axonogénesis. Basándose en secciones semifinas seriadas de
individuos controles, se calculó que el EB ocupa un volumen total de
alrededor de 83x10^{3} \mum^{3} (Tabla 1). De forma rutinaria
se estimó el volumen del EB cuantificando la señal unida a un
reportero citoplásmico (para medir el tamaño celular) o de
vesículas sinópticas (para calcular el dominio sinóptico)
(cyto-GFP y syn-GFP,
respectivamente) en reconstrucciones de microscopía confocal. Los
cambios reales en el número de sinapsis (\DeltaN) son medidos
sobre secciones de microscopia electrónica (EM).
Primero se analizaron los efectos sobre el
dominio sinóptico (syn-GFP) provocados por la
modulación de la actividad del InR. Los datos indican que existe
una correlación entre la actividad del InR y el número de sinapsis
al observarse un incremento del dominio sinóptico (Figura 2a).
Puesto que, como es sabido, InR también controla la proliferación
celular (Oldham, S. & Hafen, E. Insulin/IGF and target of
rapamycin signaling: a TOR de force in growth control. Trends
Cell Biol. 13: 79-85, 2003), se
investigó la posibilidad de que el aparente incremento del número
de sinapsis debido a la sobreexpresión de InR pudiera ser una
consecuencia de un aumento del número de neuronas
Gal4-796. Usando los reporteros nucleares
(nls-GFP) y unidos a membrana
(CD8-GFP), se encontraron más neuronas
Gal4-796 en los individuos que sobreexpresaban InR
(46\pm1) que en los controles (36\pm4) (Figura 1d y 1e). Es
evidente, pues, que en este tipo de células, la actividad de InR
también estimula la proliferación celular. Sin embargo, el
incremento en el número de sinapsis es proporcionalmente mayor que
el incremento en el número de células, sugiriendo que la
sobreexpresión de la actividad del InR tiene además una actividad
sinaptogénica.
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Se procedió a comprobar la actividad sinóptica
de otros componentes de la vía de señalización del InR. Así, se
encontró que la sobreexpresión de la PI3K aumentaba tanto el tamaño
celular (cyto-GFP, 56%) como el dominio sinóptico
(syn-GFP) (Figura 2b), si bien el efecto
sinaptogénico era mucho más dramático (Figuras 1d y 2b, y Tabla 1:
243% en las sinapsis/\mum^{2}). Sin embargo, no se detectaron
cambios significativos en el dominio sinóptico cuando la PI3K se
regula a la baja por la expresión de una forma dominante negativa
-Gal4-796/UAS-syn-GFP/UAS-PI3K^{DN}-
(Figuras 1e y 2b).
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Seguidamente, se visualizó el efecto de la PI3K
en neuronas R4m Gal4-796 únicas. La regulación al
alta y a la baja de PI3K afecta el tamaño celular (Figuras
1f-h). Puesto que la PI3K está involucrada en el
control de la proliferación celular, se comprobaron los cambios
potenciales en el número de neuronas Gal4-796. No
aparecen diferencias significativas en el control (36\pm4) con
respecto a PI3K (32\pm6). En conclusión, se encontró que la
actividad de la PI3K promueve la formación de nuevas sinapsis sin
afectar a la proliferación celular, definiendo potencialmente una
nueva vía sinaptogénica específica.
Con el fin de obtener un valor más preciso del
número de sinapsis, se contaron el número real de sinapsis en
secciones ultrafinas del EB. Los animales con una regulación al
alta de PI3K mostraron un 18% más de procesos con respecto a sus
controles (Figuras 2c y 2f). La mayoría de estos procesos muestran
una densidad de pequeñas vesículas claras mayor de lo normal
(Figuras 2e y 2f), reflejando un aumento del 24% en la densidad de
sinapsis (Tabla 1). Considerando el aumento de volumen, medido en
conjuntos completos de secciones semifinas seriadas, la estimación
del número de sinapsis totales en el cuerpo elipsoidal de animales
PI3K es de 6.4x10^{6} frente a 3.9x10^{6} en los controles
-hembras normales de 8-9 días posteclosión-, o un
incremento del número de sinapsis del 64% (Tabla 1). Sin embargo,
puesto que el EB está compuesto por una mezcla de neuronas que
expresan Gal4-796 y otras que no, el
incremento del número de sinapsis real en las neuronas que expresan
PI3K debe estar infravalorado. Para medir, a nivel celular, el
incremento del número de sinapsis inducido por PI3K se coexpresó la
PI3K y HRP, esto último para identificar las neuronas
Gal4-796 en EB (Figuras 2g y 2h). Aquí, el
valor resultante del incremento del número de sinapsis en neuronas
expresando PI3K es de 143% (Tabla 1). Este valor es aproximadamente
el mismo que se describió previamente para gigas/TSC2 en
fotorreceptores (Canal, I., Fariñas, I, Gho, M. & Ferrús, A.
The presynaptic cell determines the number of synapses in the
Drosophila optic ganglia. Eur. J. Neurosci. 6:
1423-1431, 1994) y neuronas sensoriales olfatorias
(Acebes, A. & Ferrús, A. Increasing the number of synapses
modifies olfactory perception in Drosophila. J. Neurosci.
21: 6264-6273, 2001).
Finalmente, se examinó la actividad
sinaptogénica de PI3K en un tipo neuronal diferente, motoneuronas
larvarias, mediante la cuantificación del número de sinapsis en la
unión neuromuscular (Figura 1i). Se descubrió que las moscas que
sobreexpresan la PI3K tienen al menos el doble de sinapsis por
fibra muscular que los individuos controles (Figura 1j, 1k y Tabla
1), un valor comparable con las medidas en el EB.
A continuación se monitorizó el patrón temporal
de acumulación de sinapsis en moscas adultas. En los animales
control, el volumen del EB, visualizado por syn-GFP,
crece durante los primeros 8-9 días posteclosión.
Seguido de un periodo estabilizado -la mayor parte de la vida
adulta- y una ligera fase de declive hacia el fin de la vida
(esperanza de vida normal) (Figura 2i). Este perfil temporal se
encuentra también en el lóbulo antenal (Devaud, J.M., Acebes, A.,
Ramaswami, M. & Ferrus, A. Structural and functional changes in
the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a
critical age. J. Neurobiol. 56: 13-23,
2003), la unión neuromuscular de adulto (Rivlin, P.K., St Clair,
R.M., Vilinsky, I., & Deitcher, D.L. Morphology and molecular
organization of the adult neuromuscular junction of Drosophila.
J. Comp. Neurol. 468: 596-613, 2004)
y el ganglio óptico (Barth, M., Hirsch, H.V., Meinertzhagen, I.A.
& Heisenberg, M. Experience-dependent
developmental plasticity in the optic lobe of Drosophila
melanogaster. J Neurosci. 17:
1493-504, 1997), lo que sugiere que todos los
núcleos cerebrales están sujetos a un proceso de maduración
similar. Los animales en los cuales la PI3K está regulada al alta
muestran un perfil de maduración normal, aunque con valores
bastante mayores que sus controles (Figura 2i). Es importante
destacar que el efecto sinaptogénico de la PI3K se mantiene a lo
largo de la vida de la mosca sin signos de inestabilidad o
reducciones compensatorias posteriores.
El efecto funcional del aumento del número de
sinapsis inducido por PI3K fue experimentado en la arena de
Buridán. Este es un ensayo de locomoción basado en la respuesta
optomotora frente a dos barras negras opuestas sobre un fondo
homogéneamente iluminado (Strauss R. The central complex and the
genetic dissection of locomotor behaviour. Curr Opin
Neurobiol. 12: 633-638, 2002). Los
animales con la PI3K regulada al alta en las neuronas
Gal4-796 del EB son activos por periodos de tiempos
mayores, y consecuentemente, caminan distancias mayores que sus
controles (Figuras 2j y 2k). Este resultado sugiere que las nuevas
sinapsis son funcionales. Otro parámetro locomotor como la
velocidad de movimiento, sin embargo, permanece inalterado (Figura
21), indicando que la PI3K en esas neuronas no distorsiona el
comportamiento general de la mosca. De forma similar, los mutantes
gigas/TSC2 muestran un aumento de la percepción sensorial
proporcional al incremento del número de sinapsis (alrededor de dos
veces) (Acebes, A. & Ferrús, A. Increasing the number of
synapses modifies olfactory perception in Drosophila. J.
Neurosci. 21: 6264-6273, 2001; Canal,
I., Fariñas, I, Gho, M. & Ferrús, A. The presynaptic cell
determines the number of synapses in the Drosophila optic ganglia.
Eur. J. Neurosci. 6: 1423-1431,
1994). Con todo esto, se concluye que la señalización de la PI3K
induce la formación de sinapsis ectópicas morfológicamente normales
y funcionalmente activas, al menos en lo que respecta a los cambios
de comportamiento locomotor.
Otros ensayos en los que se ha inducido la
sobreexpresión de PI3K se observa que induce igualmente un
incremento de sinapsis y tamaño celular, tanto en neuronas
sensoriales olfativas en la antena y fotorreceptoras en el ojo
(Figura 8A y 8B), así como motoneuronas larvarias (ver Figura
1i-k). Los resultados descritos en la Figura 8
corresponden a los efectos de una reducción de la actividad de TSC2
en donde se aprecia el efecto en el aumento del tamaño celular de
neuronas sensoriales (fotoreceptores y olfativas) tal como se había
descrito con anterioridad y que permite incluirla como otro
elemento de la vía sinaptogénica de PI3K identificada en la
presente invención.
Después, se analizaron otros componentes de la
cascada de señalización del InR para investigar la vía a través de
la cual PI3K produce su efecto sinaptogénico. Tanto la
sobreexpresión de Akt como la de Rheb inducen un aumento
significativo del domino sinóptico (Figura 3a), aunque menor que
PI3K. Previamente, se había descrito que la regulación a la baja de
gigas/TSC2 producía un efecto sinaptogénico (Acebes, A. &
Ferrús, A. Increasing the number of synapses modifies olfactory
perception in Drosophila. J. Neurosci. 21:
6264-6273, 2001; Canal, I., Fariñas, I, Gho, M.
& Ferrús, A. The presynaptic cell determines the number of
synapses in the Drosophila optic ganglia. Eur. J. Neurosci.
6: 1423-1431, 1994). Sin embargo, la
regulación al alta de TSC1/TSC2 no parece afectar a la
sinaptogénesis (Figura 3a), un resultado acorde con la ausencia de
efecto de la PI3K^{DN} (Figura 2c).
La glicógeno sintasa kinasa 3 (GSK3) es un
represor clave de las vías del InR y Wint/Wingless (Papadopoulou,
D., Bianchi, M.W., & Bourouis, M. Functional studies of
Shaggy/Glycogen synthase kinase 3 phosphorylation sites in
Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 24:
4909-4919, 2004). Más allá de su papel en el
metabolismo, la GSK3 está involucrada en la dinámica de las
neuritas (Sánchez, S. et al., The inhibition of
phosphatidylinositol-3-kinase
induces neurite retraction and activates GSK3. J. Neurochem.
78: 468-481, 2001). Por lo tanto, se decidió
comprobar el efecto potencial de la GSK3 sobre el control de la
sinaptogénesis y del tamaño celular. Mientras la regulación al alta
modifica ligeramente el tamaño celular, el dominio sináptico
aparece significativamente reducido (Figura 3b). Esta observación
complementa un trabajo previo (Franco, B. et al. Shaggy, the
homolog of glycogen synthase kinase 3, controls neuromuscular
junction growth in Drosophila. J. Neurosci. 24:
6573-6577, 2004) que mostraba que la regulación a
la baja de esta enzima provocaba un incremento del número de
sinapsis. Así, se concluyó que la actividad de la GSK3 inhibe la
sinaptogénesis. Es interesante resaltar que la GSK3 se encuentra
sobre-expresada en los cerebros de pacientes de la
enfermedad de Alzheimer (Bertoni-Freddari, C.,
et al., Neuronal death versus synaptic pathology in
Alzheimer's disease. Ann N Y Acad Sci. 1010:
635-638, 2003), o bajo ciertas condiciones de
comportamiento (ej.: inhibición por prepulso), que también
modifican los niveles de GSK3 (Amar, S. et al. Genetic
correlational analysis of glycogen syntahse
kinase-3\beta and prepulse inhibition in inbred
mice. Genes, Brain & Behay. 3:
178-180, 2004). A la luz de los efectos sinópticos
observados en la presente invención, se especuló que la regulación
patológica al alta de GSK3, por su
reducción del número de sinapsis, debe causar los defectos cognitivos asociados a este y otros trastornos neurológicos.
reducción del número de sinapsis, debe causar los defectos cognitivos asociados a este y otros trastornos neurológicos.
Se investigó, también, la habilidad de otros
elementos de la vía del InR, por debajo de PI3K, para modular la
sinaptogénesis. Se observó que la regulación al alta de TOR, S6K y
Foxo (Arden, K.C. FoxO: linking new signaling pathways. Mol
Cell. 14: 416-418, 2004; Fingar, D.C.
et al., mTOR controls cell cycle progression through its
cell growth effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic
translation initiation factor 4E. Mol. Cell. Biol.
24: 200-216, 2004; Radimerski, T. et
al., dS6K-regulated cell growth is
dPKB/dPI(3)K-independent, but requires
dPDK1. Nat Cell Biol. 4: 251-255,
2002) no presentaba un efecto significativo sobre la sinaptogénesis
en el EB (Figura 3c). Así como, la regulación a la baja del
regulador negativo del InR, Pten, por la sobreexpresión de
Pten^{RNAi} no afectó el número de sinapsis (Figura 3c).
Globalmente, los datos actuales indican que el efecto sinaptogénico
de PI3K es efectivamente mediado por Akt, TSC1/TSC2, Rheb y GSK3,
pero no por TOR, S6K o Foxo. Por tanto, los mecanismos que
controlan el tamaño celular y la formación sinóptica comparten
componentes de la vía del InR sólo por encima de TOR y GSK3.
Desde que se sabe que la vía de señalización del
InR regula el tamaño celular, y que el tamaño neuronal muestra una
buena correlación con el número de sinapsis, ambas características
celulares podrían ser determinadas por el mismo mecanismo
molecular. Sin embargo, los efectos de los componentes de la vía de
señalización del InR sobre el tamaño celular y el número de
sinapsis pueden ser disociados. Por ejemplo, la regulación a la
baja de PI3K claramente reduce el tamaño celular, pero no tiene
efecto sobre el número de sinapsis. De forma similar, la
regulación al alta de GSK3 produce un ligero incremento en el
tamaño celular, pero reduce el número de sinapsis.
Adicionalmente, se utilizó un elemento,
desligado de la vía del InR, que sin embargo controla también el
tamaño celular. Según se ha descrito, el receptor de EGF (Egfr)
controla el tamaño celular en varios tejidos de Drosophila
(Diaz-Benjumea, F.J. & Hafen, E. The sevenless
signalling cassette mediates Drosophila EGF receptor function
during epidermal development. Development 120:
569-578, 1994). Aquí, se confirmó que la regulación
al alta o a la baja de Egfr muestran un ligero efecto sobre el
tamaño celular de las neuronas del Gal4-796 (Figura
3d). Estas moscas, sin embargo, no mostraron efectos significativos
sobre el número de sinapsis (Figura 3d), indicando que los
mecanismos moleculares que controlan el tamaño celular y la
sinaptogénesis son independientes.
Después de mostrar que la actividad de la PI3K
controla la sinaptogénesis durante el desarrollo neural, se
cuestionó si era necesaria la actividad continuada de la PI3K en
los adultos envejecidos para mantener las nuevas sinapsis. Para
este experimento, se controló la expresión temporal de la PI3K
durante la vida adulta mediante una forma sensible a la temperatura
del represor de Gal4, Gal80 (Gal80^{ts}) (McGuire, S.E., Roman, G.
& Davis, R.L. Gene expression systems in Drosophila: a
synthesis of time and space. Trends Genet. 20:
384-391, 2004). Se diseñó un protocolo de
"apagado" en el cual se mantenían las moscas expresando la
PI3K a 30ºC hasta el día 8 posteclosión, permitiendo la maduración
sinaptogénica total (ver Figura 2i). En este momento la expresión
de PI3K era apagada (17ºC) y se seguía la medición durante dos días
más hasta los días 9 y 10. La reducción de expresión de PI3K
produce una eliminación rápida de las sinapsis ectópicas (Figura
4a). Las cuantificaciones realizadas indican que la vida media de
una sinapsis está alrededor de 24 horas. Por tanto, se concluyó
también que la actividad de la PI3K controla fuertemente la
estabilidad sinóptica.
A continuación, se cuestionó si la PI3K tiene la
capacidad para formar nuevas sinapsis cuando es activada en moscas
adultas envejecidas. Para esto, se diseñó un protocolo de
"encendido" en el cual la PI3K no se expresa en los jóvenes
adultos, pero más tarde se enciende en el momento elegido de la
madurez (Figura 4b). Se encontró que al menos eran necesarios 15
días para alcanzar una señal del reportero que permitiera una
detección inequívoca. En los experimentos de encendido, el sistema
de expresión fue activado en los días 15, 30 o 50 de la vida
adulta, seguido de una visualización del reportero en los días 40,
45 o 65, respectivamente. Así, se encontró que las nuevas sinapsis
podían ser formadas cuando se inducía la expresión de PI3K en
adultos envejecidos (Figura 4b). La magnitud en la que se producía
el aumento de la señal de syn-GFP, sin embargo, es
menor que en los animales que expresan constitutivamente la PI3K.
La ultraestructura general de los cerebros con 50 días de edad
total, aunque activada la expresión de PI3K en el día 30, muestran
las apariencia vacuolar característica de cerebros envejecidos
(Figura 5a y 5b). Sin embargo, en el neuropilo del EB, donde se
localizan las neuronas que expresan PI3K, los perfiles celulares,
incluyendo las sinapsis, aparecen indistinguibles de los de los
jóvenes adultos (Figura 5c). Es más, los perfiles de las células
adyacentes en el EB muestran cuerpos electrodensos, relacionados
con la edad pero de naturaleza desconocida, que deben corresponder
a neuronas no-Gal4-796 (Figura 5c). Además,
se obtuvieron imágenes de confocal de alta resolución de los
escobillones dendríticos de neuronas R4d procedentes de mosaicos
inducidos por FRT/FLP para detectar si existen efectos en las
dendritas parecidos a los producidos sobre las sinapsis. La
sobreexpresión constitutiva de PI3K aumenta la ramificación de los
escobillones dendríticos en comparación con los controles (Figura
7). Además, hay también un aumento en la ramificación dendrítica
cuando la expresión de la PI3K comienza en el día 30 de cerebros
envejecidos y observados en el día 52 (Figura 7). Estas
observaciones demuestran que la sinaptogénesis es posible en
neuronas envejecidas mediante un mecanismo autónomo celular,
dependiente
de PI3K.
de PI3K.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha comentado anteriormente, la enzima
Fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K) pertenece a una gran familia de
proteína kinasas, cada una de las cuales está sujeta a un mecanismo
de regulación específico. Dentro de ellas, la protagonista de la
presente invención, la PI3K92E que se indica de forma abreviada
como PI3K en la patente, es ortóloga de las proteínas p110\alpha y
p110\beta humanas, denominadas así por su peso molecular en KDa.
Las formas humanas de PI3K son heterodímeros compuestos por una
subunidad catalítica, la p110, y otra subunidad reguladora, la p85.
La subunidad reguladora p85 reconoce los residuos a fosforilar de
receptores de la familia RTK de factores de crecimiento, tales como
IGF-I, NGF, etc., a través de dominios SH2,
reclutando subunidades catalíticas que adoptan una conformación
activa. Al adoptar esta conformación, la PI3K comienza a fosforilar
de forma específica a sus sustratos iniciando así la vía de
señalización. El objeto del presente ejemplo es demostrar que la
PI3K humana induce, entre otras actividades, la formación de nuevas
sinapsis en neuronas.
Recientemente, se ha descrito que el péptido
740Y-P (BioGen) induce la activación de las formas
humanas de PI3K (p110\alpha y p110\beta), constatada por la
fosforilación de sus sustratos, al unirse a los dominios SH2 de la
subunidad reguladora p85. El siguiente experimento de tratamiento
con 740Y-P sobre una línea de células de
neuroblastoma humano (SHSY5Y) nos permitirá ver si el mecanismo de
sinaptogénesis está conservado en humanos y si éste es específico
de las subunidades \alpha y \beta de la PI3K.
En este experimento, las células del
neuroblastoma humano son inducidas a diferenciación con NGF y
antimicóticos y, seguidamente, tratadas con el péptido
740Y-P durante 48 horas. Las células se siembran y
se crecen en placas de densidad 100.000 cels/ml. y al día
siguiente comienza el tratamiento: 50 microgramos/ml de
740Y-P, en medio D-MEM + 10%FCS
(Suero fetal bovino). De forma similar estas mismas células han
sido tratadas con LY294002 y Wortmannin, inhibidores de la enzima
PI3K (Vanhaesebroeck B et al., (1997) Trends Biochem. Sci.
22; 267-272). La tinción se realiza con un
anticuerpo anti SV2 (Developmental Studies Hybridome Bank (DSHB),
University of Iowa. USA). La SV2 es una proteína específica de
vesículas sinópticas (Feany MF; Lee S; Edwards RH; and Buckley KM
(1992) The synaptic vesicle protein SV2 is a novel type of
transmembrane transporter. Cell 70, 861-867). Los
datos muestran que la señal antiSV2 es mucho más intensa en
células tratadas con 749Y-P con respecto al control
(sin tratamiento) (Figura 9, paneles superiores). Del mismo modo,
la señal es mucho más débil en las células tratadas con los
inhibidores de PI3K, también con respecto al mismo control (Figura
9, paneles inferiores). Es decir, el marcador sinóptico SV2 aumenta
o disminuye su expresión dependiendo de que PI3K esté activada o
inhibida.
Materiales usados y cruzamientos. Las
construcciones de la vía del receptor de insulina
UAS-InR.Exel^{2},
UAS-InR.K1409A^{3}, y
UAS-Pten-dsRNA.Exel^{3} (Exelixis,
Inc.), UAS-S6K.M^{2} (Radimerski, T. et
al., dS6K-regulated cell growth is
dPKB/dPI(3)K-independent, but requires
dPDK1. Nat Cell Biol. 4: 251-255,
2002), UAS-TOR.WT^{III} (Zhang, H., Stallock,
J.P., Ng, J.C., Reinhard, C. & Neufeld, T.P. Regulation of
cellular growth by the Drosophila target of rapamycin dTOR.
Genes & Dev 14: 2712-2724, 2000),
UAS-TOR.TED^{II} (Hennig, KM & Neufeld, T.P.
Inhibition of cellular growth and proliferation by dTOR
overexpression in Drosophila. Genesis 34:
107-110, 2002), fueron obtenidos del centro de
stocks de Drosophila en Bloomington (Fly Base
http://flybase.bio.indiana.edu) mientras que las siguientes
líneas fueron obsequios: Gal4-796 (G. Morata, CBM,
Madrid), UAS-PI3K92E y
UAS-PI3K92E^{D954A} (S. Leevers, Cancer Research
Center, UK), UAS-GSK3 (M. Calleja, CBM, Madrid),
UAS-Akt y UAS-dRheb (E. Hafen, Uni.
Zürich, CH), UAS-Foxo (S. Casas, CIB, Madrid),
UAS-Egfr^{1.7}, UAS-Egfr^{DN}
(M. Freeman, MRC Lab., Cambridge, UK), y
UAS-TSCI-UAS-TSC2
(N. Ito, Mass. General Hospital, USA). Como reporteros, se usó GFP
citosólico y nuclear o \beta-galactosidasa, y una
forma de GFP unida a la membrana por CD8 o a las vesículas
sinópticas por sinaptobrevina, UNG (M. Ramaswami, Uni. Arizona,
USA). La visualización se basó en la emisión de luz de GFP o la de
los anticuerpos anti-GFP (1:500 Molecular Probes,
USA) o anti-\betagalactosidasa (1:500 Cappel, USA)
respectivamente. Para los estudios de EM, se usó el
UAS-HRP (L. Luo, Stanford Uni., USA) como
reportero. Todos los cruces fueron alimentados con la comida
habitual de laboratorio mantenidos a 25ºC a menos que otra cosa sea
indicada. Un control estricto de temperatura (25ºC \pm 0,3) fue
importante para asegurar la expresión adecuada de las
construcciones y su consistencia por cruces y genotipos. La
construcción Gal80^{ts} (R. Davis) está activa a 17ºC para
inhibir Gal4, y se hace inactiva a 30ºC permitiendo la expresión
del Gal4. Los mosaicos de neuronas únicas fueron obtenidas por la
activación por choque térmico de la FLP sobre animales que llevaban
la construcción
UAS-FRT-CD2-FRT-CD8-GFP
(Lee, T. & Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell
marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.
Neuron 22: 451-461, 1999). Se
probaron diferentes momentos durante metamorfosis para activación
de la FLP hasta obtener una alta frecuencia de clones de neuronas
únicas. Estos casos fueron visualizados con el anticuerpo
\alphaGFP.
Histología. Para microscopía confocal,
hembras de su correspondiente genotipo y edad fueron recogidas y
anestesiadas en hielo. Los cerebros fueron disecados en tampón
fosfato 0.1 M frío, y montados sin fijar en 50% glicerol en tampón
fosfato 0.1 M. La microscopía electrónica de transmisión fue
llevada a cabo en moscas anestesiadas en hielo, fijadas en tampón
cacodilato 0.1 M/paraformaldehido 2.5%/glutaraldehido
2.5%/CaCl_{2} 0.04% pH 7.5 por 3 horas a temperatura ambiente,
lavadas en tampón cacodilato 0.1 M y postfijadas con OsO_{4} 2%
en tampón fosfato 0.1 M/CaCl_{2} 0.02%/sacarosa 2.25%. Las
cabezas fueron deshidratadas en una serie de etanoles e incluidas
en Araldita. Los bloques se cortaron con un ultramicrotomo Reichert
Ultracut E a 2 \mum y las secciones semifinas teñidas con azul de
toluidina para identificar el cuerpo elipsoidal. Las secciones
semifinas seleccionadas fueron remontadas sobre bloques de Araldita
y seccionadas en ultrafinos. Secciones ultrafinas plata
(60-70 nm) fueron recogidas sobre rejillas de ojal
cubiertas de Formvar, y teñidas con acetato de uranilo (1 h) y
citrato de plomo (15 minutos). Para los estudios de EM sobre los
genotipos que expresan HRP, las moscas fueron anestesiadas en hielo
y fijadas en tampón cacodilato 0.1 M/CaCl_{2}
0.04%/glutaraldehido 2% pH 7.5 por 17 h a 4ºC. Las cabezas fueron
incluidas en agarosa de bajo punto de fusión al 5% y cortadas a 100
\mum en vibratomo. Las secciones de vibratomo fueron incubadas 30
minutos en SA-HRP (1/50), 40 min TSA (1/20), 30
minutos SA-HRP (1/50) y la reacción de DAB revelada
por el método ABC (Vector Lab). Las secciones con señal de DAB en
el cuerpo elipsoidal fueron postfijadas con OsO_{4} 2% en tampón
fosfato 0.1 M/CaCl_{2} 0.02%/sacarosa 2.25%. Las secciones
seleccionadas fueron deshidratadas en alcoholes seriados e
incluidos en Araldita. Los bloques fueron cortados a 2 \mum hasta
la detección de EB teñido con DAB y luego en ultrafinos a
60-70 nm y teñidos con acetato de uranilo y citrato
de plomo. El número de sinapsis fue calculado sobre grupos de
imágenes de secciones seriadas aplicando la técnica del disector
(Acebes, A. & Ferrús, A. Increasing the number of synapses
modifies olfactory perception in Drosophila. J. Neurosci.
21: 6264-6273, 2001) o multiplicando el
volumen del EB x densidad media superficial.
Captura y análisis de imágenes. Los
cerebros para microscopía confocal fueron observados enteros en un
microscopio invertido Leica (Heidelberg, Germany)
TCS-SP2-AOBS-UV
(Leitz DMIRE2). La señal constitutiva de GFP fue detectada por
filtro de fluoresceína, con una fuente de luz láser
krypton-argón de excitación a 488 nm. Secciones
ópticas seriadas (512x512 pixels) fueron cogidas a intervalos de 1
\mum usando objetivos de 65x o 100x. La tinción de las putativas
sinapsis con el anticuerpo monoclonal nc82 (E. Buchner y A.
Hofbauer) fue visualizada con los fluorocromos Alexa 568 y Alexa
488 (1:500 Molecular Probes, USA) usando filtros específicos.
El análisis cuantitativo y la reconstrucción 3D
se llevó a cabo con grupos de imagines de confocal cargadas en
AMIRA 3.1, el área de interés fue marcada en cada archivo por el
Image Segmentation Editor. La correspondiente segmentación de las
imágenes en 3D fue medida para obtener el volumen de cada muestra.
Para las medidas del volumen del cuerpo elipsoidal, imágenes de las
secciones seriadas de semifinos teñidos con azul de toluidina
fueron alineadas con AMIRA 3.1 y cada corte marcado con Image
Segmentation Editor y procesado como los ficheros de confocal para
obtener los volúmenes. Las motoneuronas larvarias fueron analizadas
en secciones confocales únicas espaciadas a 1 \mum (1024x1024
pixels). Todas las mediciones fueron tomadas de al menos dos
observaciones independientes usando material codificado. Todos los
datos numéricos están presentados como la media \pm SEM de al
menos tres experimentos. La significación estadística fue calculada
usando la "T" de Student (comparando las medias de dos
muestras). Las diferencias significativas entre dos grupos
comparados se marco por un asterisco (*) si p<0.05 o menor. Para
ello se utilizó el software SPSS.
Claims (4)
1. Compuesto caracterizado porque está
constituido por una construcción genética que permite la expresión
de una proteína o péptido con actividad sinaptogénica que mimetiza
la vía sinaptogénica PI3K en el interior de las neuronas de un
mamífero, preferentemente humanas y que comprende una o varias
secuencias de nucleótidos PI3K pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína PI3K,
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera de las definidas en a), b) y c),
para su uso como medicamento
destinado a la profilaxis y tratamiento de enfermedades, desórdenes
o patologías de mamíferos, preferentemente seres humanos, afectados
por un proceso neurodegenerativo o de pérdida de sinapsis, tales
como, pero no limitados a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad
de Parkinson, la demencia fronto-temporal, las
ataxias y el envejecimiento no
patológico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1
caracterizado porque la construcción genética PI3K
comprende, además de la secuencia de nucleótidos PI3K definidas en
1a), 1b), 1c) y id), cualquier otra secuencia de nucleótidos
codificante de un péptido o secuencia peptídica que permita el
aislamiento, la detección o la secreción al citoplasma celular del
péptido expresado.
3. Composición farmacéutica o medicamento para
el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan
con neurodegeneración o pérdida de sinapsis caracterizada
porque contiene un compuesto ó agente activador de la vía
sinaptogénica PI3K seleccionado de los grupos definidos en
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en cantidad
terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es
capaz de estimular la generación y mantenimiento de nuevas
sinapsis.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3 caracterizada porque el compuesto activador
esta constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína humana PI3K.
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|---|---|---|---|
| ES200503199A ES2322881B1 (es) | 2005-12-26 | 2005-12-26 | Uso de compuestos agonistas de la actividad pi3k en la elaboracion de composiciones farmaceuticas, dichas composiciones farmaceuticas y sus aplicaciones en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. |
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|---|---|---|---|
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2006
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| BOTHMER, J. et al. "{}Evidence for a selective decrease in type 1 phosphatidylinositol kinase activity in brains of patients with Alzheimer's disease"{}. DEMENTIA. 1994. Vol. 5, páginas 6-11; todo el documento. * |
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