KR20230162885A

KR20230162885A - 삼차원 시상하부 오가노이드로부터 유래된 신경줄기세포를 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20230162885A
Application number: KR1020220062408A
Authority: KR
Inventors: 김경숙; 이태용; 김민성; 이상훈; 알란 술리스티오 야누아르; 김민수
Original assignee: 코아스템켐온 주식회사
Priority date: 2022-05-20
Filing date: 2022-05-20
Publication date: 2023-11-29
Also published as: WO2023224431A1

Abstract

본 발명은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 노화 마우스에 이식한 경우, 노화로 인해 감소되었던 기억력, 인지능력, 근력, 근조직 밀도 및 골밀도가 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 에너지 대사를 증가시켜 비만을 개선시키는 것을 확인하였다. 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포에서 분리한 엑소좀을 노화 마우스에 이식한 경우에도 유사하게 노화로 인한 감소한 기억력, 인지능력 및 근력이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 노인성 질환 예방 및 치료제로 매우 유용하리라 기대된다.

Description

삼차원 시상하부 오가노이드로부터 유래된 신경줄기세포를 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 그의 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING AGE-RELATED DISEASES COMPRISING NEURAL STEM CELLS DERIVED FROM 3D HYPOTHALAMIC ORGANOID AND USE THEREOF}

본 발명은 인간 만능 줄기세포로부터 3D 배양하여 제조된 시상하부 유사 오가노이드를 분리 해체하여 수득된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

시상하부는 성장·사춘기·대사·스트레스 대응·생식·수유 보육·면역 등 인간의 몸의 항상성을 유지하기 위한 중추기관이다. 신경줄기/전구세포는 성체의 시상하부에 존재하며, 시상하부의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 노화 등으로 인해 유발되는 시상하부의 기능이상에 대한 대체 치료법으로 신경줄기세포가 주목받고 있다.

하지만, 시상하부는 뇌의 심부에 있으며, 작은 영역이므로, 실제 조직을 추출하여 연구에 사용하는 것은 불가능하다. 따라서, 배아줄기세포과 같은 다능성 줄기세포로부터 시상하부 신경세포를 제작하기 위한 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 예를 들어, Wataya 팀은 gfCDM 배지를 사용하여, 세포를 응집시켜 3차원 부유 배양을 통해 마우스 배아줄기세포로부터 시상하부 아르기닌 바소프레신(AVP)을 생산하는 신경세포를 제작하였다(Wataya T et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(33):11796-11801). 또한, Merkle 팀은 3차원 배양 및 2차원 배양방법을 통해, 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell)로부터 시상하부 신경세포로의 분화에 성공하였다(Merkle FT et al., Development, 2015, 142(4):633-643). 하지만 상기 다각적인 연구에도 불구하고 임상에 적용하기에는 아직 한계가 있다.

Wataya T et al.(2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801. Merkle FT et al.(2015) Development 142(4): 633-643.

이에 본 발명자들은 인간 배아줄기세포에서 3D로 배양된 시상하부 유사 오가노이드에서 수득한 신경줄기세포가 실제 뇌의 시상하부에 존재하는 신경줄기세포와 유사하며, 이를 노화 마우스에 이식한 경우 노화와 관련된 증상이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 측면은 시상하부 유사 오가노이드에서 유래된 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 분비된 엑소좀 및 이를 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 i) 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양액으로부터 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는 엑소좀 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 시상하부 유사 오가노이드에서 유래된 신경줄기세포; 및 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포에서 분비되는 엑소좀;으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 및/또는 엑소좀을 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 시상하부 유사 오가노이드에서 유래된 신경줄기세포를 노화 마우스에 이식한 경우, 노화로 인해 감소되었던 기억력, 인지능력, 근력, 근조직 밀도 및 골밀도가 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 에너지 대사를 증가시켜 비만을 개선시키는 것을 확인하였다. 상기 시상하부 유사 오가노이드에서 유래된 신경줄기세포의 배양액에서 분리한 엑소좀을 노화 마우스에 이식한 경우에도 유사하게 노화로 인한 감소한 기억력, 인지능력 및 근력이 회복되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 시상하부 유사 오가노이드에서 유래된 신경줄기세포 및 이의 배양액에서 분리한 엑소좀은 노인성 질환 예방 및 치료제로 매우 유용하리라 기대된다.

도 1은 인간 배아줄기세포(hESC) 또는 인간 역분화줄기세포(hiPSC)로부터 인간 시상하부 오가노이드를 제조하고, 제조된 시상하부 오가노이드에서 시상하부 신경줄기세포(htNSC)로 분화 유도하는 방법을 모식화한 도면이다.
도 2는 hESC를 배양하여 제작된 오가노이드의 배양액에 다양한 시상하부 패터닝 유도 물질을 처리하고 시상하부(NKX2-1, RAX) 또는 중뇌(EN1) 마커 유전자의 발현을 q-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 오가노이드 유래 인간 htNSC에서 신경줄기세포 마커(SOX2, NESTIN, KI67) 및 시상하부 영역 특이적 마커 유전자(NKX2-1, RAX, ISL1)의 발현을 형광면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, DAPI는 세포핵을 나타낸다.
도 4는 오가노이드 유래 인간 htNSC에서 시상하부 영역 특이적 마커 유전자(RAX, NKX2.1, ISL1, OTP, SF-1)의 발현을 q-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 오가노이드 유래 인간 htNSC의 전사체 및 인간 태아 뇌의 영역별 전사체를 DGE(Differential gene expression) 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 존재 하에서 5번 계대배양하는 동안 세포수의 증식을 측정하여 집단배가수(population doubling level, PDL) 및 축적된 세포수로 나타낸 그래프이다.
도 7은 동결보관된 오가노이드 유래 인간 htNSC를 재배양하여 세포사(ethidium Homodimer I dye, EthD-1), 세포 생존(calcein) 및 신경줄기세포(Rax, Nestin) 관련 단백질의 발현을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다.
도 8은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 신경세포로 분화 유도하였을 시, 분화된 htNSC에서 신경세포 마커(synapsin1(SYN1), TuJ1(TUBB), MAP2, RBFOX3(NeuN)), 시상하부 특이적 신경 펩타이드(α-MSH, Neuropeptide Y(NPY), Secretagogin(SCGN), PMCH) 및 성상교세포 마커(GFAP)의 발현을 면역형광염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 신경세포로 분화시킨 후, leptin 또는 ghrelin 처리에 의한 STAT3 또는 FOXO1의 인산화를 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면(상단) 및 이를 정량화한 그래프(하단)이다.
도 10은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 70일간 분화를 유도시킨 후, 단일세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 군집화(clustering)한 결과를 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)로 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 각 군집 특이적 유전자를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 각 군집 특이적 유전자를 분석한 결과를 UMAP로 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 군집화 결과를 Voxhunt를 이용하여 Allen Developing Brain atlas의 마우스 뇌 전사체(생후 14일령)와 비교분석한 결과를 나타낸 도면이다. 비교해 본 결과, htNSC에서 분화된 모든 세포 군집(cluster)은 생후 14일 마우스 뇌의 시상하부부분에 정확히 위치함으로서, 본 확립된 프로토콜에 의해 분화된 세포가 시상하부 특이 세포임을 확인하였다.
도 14는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 70일간 분화를 유도시킨 후, 단일세포 RNA 시퀀싱 결과를 Monocle3를 이용하여 슈도 타임 분석(pseudotime analysis)하여 슈도타임(pseudotime)에 따라 시각화한 도면이다.
도 15는 슈도타임 분석을 통해 시상하부 신경줄기세포(htNSC)가 중간세포(Int1, Int2)에서 신경줄기세포(NSC)로 분화됨을 보여주며, 세포증식인자 CDK1, pro-neural 유전자인 ASCL1, 신경세포인자인 TUBB3, SNAP25도 각 발달단계에 맞게 발현이 변화되는 것을 보여주는 도면이다.
도 16은 슈도타임 분석을 통해 시상하부 신경줄기세포(htNSC)가 중간세포(Int1, Int2)에서 신경줄기세포(NSC)로 분화할 시, 시상하부 발달에 주요인자로 알려진 ROBO1, SLIT1, SLIT2의 고유 발현 증감 패턴 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 pySCENIC을 사용하여 유전자 조절 네트워크(GRN) 분석을 실시하여 각 세포군(Neu1, Ast1, Tan)의 주요 분화 조절자(master regulator)(regulon)의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 18은 신경세포군(Neu1 및 Neu2)을 재분석하여 군집화한 결과를 t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding)로 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 재분석된 신경세포군별 시상하부 관련 유전자(SCGN, PMCH, FEZF2, PITX2, ONECUT2 및 VGF)의 발현 분포를 나타낸 도면이다.
도 20은 신경세포군(Neu1, Neu2)을 재분석하여 각 군별 단일세포의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 21은 성상교세포 전구세포군(APC)의 군집화 결과를 UMAP으로 시각화한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 성상교세포 전구세포군(APC) 내의 세포군별 GFAP, SPARCL1 및 AQP4 유전자의 발현 분포를 나타낸 도면이다.
도 23은 성상교세포군(Ast1, Ast2, Ast3), 성상교세포 전구세포군(APC) 및 띠뇌실막세포(tanycyte, Tan)군 내의 세포군별 발현되는 단일세포 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 24는 오가노이드 유래 인간 htNSC가 이식된 마우스에서 노화 개선 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 것이다.
도 25는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 12개월령 마우스의 시상하부에 이식하고 1개월 후, 마우스의 시상하부 내 이식된 세포를 인간세포 마커(hNCAM), 시상하부 신경줄기세포 마커(RAX), 신경세포 마커(RBFOX3(NeuN)) 및 인간 성상교세포 마커(hGFAP)의 발현을 면역형광염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 26은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 트레이드밀 수행능력(treadmill performance)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 그립 강도 시험(grip strength test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 로타로드 시험(rotarod test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 개방공간 시험(open field test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 모리스 수중미로 시험(Morris water maze test) 결과 중 잠복 플랫폼(hidden platform) 훈련 시 공간 지각학습에 소요된 시간을 나타낸 그래프이다.
도 31은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 모리스 수중미로 시험 결과 중 프로브 실험(probe trial) 시 타겟 사분면에 머무른 시간을 나타낸 그래프이다.
도 32는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 Y 미로 시험(Y maze test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 33은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 신물체탐색 시험(novel object recognition test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 34는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 그래프(좌측) 및 마우스 외형을 관찰한 결과를 나타낸 도면(우측)이다.
도 35는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 fat mass 및 lean mass를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 36은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 먹이 섭취량을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 37은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 대사 케이지를 이용하여 마우스의 활동량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 38은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 대사 케이지를 이용하여 마우스의 에너지 소비량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 39는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 당부하 시험(glucose tolerance test) 결과를 나타낸 도면이다.
도 40은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 사타구니 백색지방조직(iWAT)을 H&E 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면(좌측) 및 지방세포 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프(우측)이다.
도 41은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 부고환 백색지방조직(eWAT)을 H&E 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면(좌측) 및 지방세포 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프(우측)이다.
도 42는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 견갑골 내 갈색지방조직(iBAT)을 H&E 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면(좌측) 및 지방세포 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프(우측)이다.
도 43은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 간조직을 H&E 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. htNSC 이식된 마우스에서 간조직내 지방축척이 감소되는 것을 확인하였다.
도 44는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 사타구니 백색지방조직(iWAT) 내의 지방분해(lipolysis), 열발생(thermogenesis) 및 갈색화(browning)와 관련 단백질(MTCO1, SDHB, FGF21) 및 β-actin의 발현을 웨스턴블롯으로 확인한 도면(상단) 및 이를 β-actin으로 정량하여 나타낸 그래프(하단)이다.
도 45는 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 부고환 백색지방조직(eWAT) 내의 지방분해, 열발생 및 갈색화와 관련 단백질(MTCO1, SDHB, FGF21) 및 β-actin의 발현을 웨스턴블롯으로 확인한 도면(상단) 및 이를 β-actin으로 정량하여 나타낸 그래프(하단)이다.
도 46은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 간조직 내의 지방분해 및 스트레스 관련 단백질(p-eIF2A, eIF2A, ATF4, FGF21, GDF15) 및 β-actin의 발현을 웨스턴블롯으로 확인한 도면(상단) 및 이를 β-actin으로 정량하여 나타낸 그래프(하단)이다.
도 47은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 신장조직 내의 p16 및 p21의 발현을 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면(상단) 및 이를 정량하여 나타낸 그래프(하단)이다.
도 48은 오가노이드 유래 인간 htNSC를 마우스의 시상하부에 이식한 4개월(16개월령) 후, 마우스의 대퇴골의 X-ray 촬영 결과를 나타낸 도면(상단) 및 골지수 분석 결과를 나타낸 그래프(하단)이다. BMD: 골밀도(bone mineral density), BV: 골부피(bone volume), TV: 조직부피(tissue volume), Tb.Th: 골소주 두께(trabecular thickness), Tb.N: 골소주 개수(trabecular number)
도 49는 오가노이드 유래 인간 htNSC 유래 엑소좀의 노화 예방 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 도식화한 것이다.
도 50은 오가노이드 유래 인간 htNSC 유래 엑소좀 주입 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 로타로드 시험(rotarod test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 51은 오가노이드 유래 인간 htNSC 유래 엑소좀 주입 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 그립 강도 시험(grip strength test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 52는 오가노이드 유래 인간 htNSC 유래 엑소좀 주입 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 수동회피 시험(passive avoidance test) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 53은 오가노이드 유래 인간 htNSC 유래 엑소좀 주입 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령) 후, 마우스의 모리스 수중미로 시험(Morris water maze test) 결과 중 잠복 플랫폼(hidden platform) 훈련 시 공간 지각학습에 소요된 시간 및 프로브 실험(probe trial) 시 타겟 사분면에 머무른 시간을 나타낸 그래프이다.

신경줄기세포를 포함하는 약학 조성물

본 발명의 일 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 상기 약학 조성물은 노인성 질환 예방 및 치료용 일 수 있다.

이때, 상기 약학 조성물은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경세포; 또는 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포 및 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경세포를 포함하는 세포집단을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "시상하부(hypothalamus)"는 2개의 시상(thalamus) 사이 아래에 위치하며, 뇌하수체(pituitary gland)를 경유하여 신경계(nervous system) 및 내분비계(endocrine system)를 연결하는 기능을 한다. 구체적으로, 시상하부는 대사과정 및 자율신경계(autonomic nervous system)의 활동을 관장하고, 신경호르몬(neurohormone)을 합성하고 분비하여 뇌하수체를 조절함으로써 체온, 배고픔, 갈증, 피로, 수면, 일주기 생체 리듬 등을 조절한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "오가노이드(organoid)"는 줄기세포를 이용하여 최소 기능을 할 수 있도록 제작한 '미니 유사 장기'로, 3차원(3D) 구조로 만들어져 실험실에서도 실제 신체 기관과 비슷한 환경을 만들 수 있는 것이 특징이다. 즉, 오가노이드는 3D 입체 구조를 가지는 세포를 의미하며, 동물 등에서 수집, 취득하지 않은 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 신경, 장 등의 장기와 유사한 모델을 의미한다. 이때, 이를 구성하는 세포의 유래는 제한되지 않는다.

또한, 상기 오가노이드는 세포의 성장 과정에서 주변 환경과 상호 작용하도록 허용되는 환경을 가질 수 있다. 2D 배양과는 달리, 3D 세포 배양은 체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있다. 이에 따라 본 발명에서 3D 오가노이드는 실제로 생체 내에서 상호 작용을 하고 있는 장기를 거의 완벽히 모사하여, 질병의 치료제 개발 및 등을 관찰할 수 있는 훌륭한 모델이 될 수 있다.

일반적으로 오가노이드는 만능줄기세포를 배양하여 제조할 수 있다. 이때, 만능줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)는 몸을 구성하는 어떠한 형태의 세포로 유도 분화가 가능한 줄기세포를 의미하며, 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC, 역분화 줄기세포)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 만능줄기세포는 포유류에서 분리한 것일 수 있으나, 바람직하게는 인간의 것일 수 있다.

본 발명에서 오가노이드는 시상하부를 모사한 시상하부 유사 오가노이드일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 시상하부 유사 오가노이드는 인간 배아줄기세포(hESC)를 증식 배양하여 3D 신경계 오가노이드를 제작하고 시상하부 영역으로 패터닝을 유도하는 물질을 처리함으로써 시상하부 유사 오가노이드를 제작할 수 있다. 상기 패턴화된 시상하부 유사 오가노이드를 해체하여 최종적으로 시상하부 신경줄기세포를 수득할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "패턴화"는 오가노이드 제작 시, 뇌 세부 조직들 중 최종적으로 뽑아내고자 하는 세포의 오리진 조직의 특성을 지니는 운명체의 세포군을 다수의 세포군으로 함유되도록(target cell enriched) 오가노이드를 제작함을 의미한다.

본 발명에서 상기 패턴화는 시상하부 영역으로의 패턴화일 수 있다.

본 발명에서 인간 만능 줄기세포에서 신경계 오가노이드 제작 및 패턴화는 아스코르빈산, ALK 억제제 및 BMP 억제제가 포함된 배지에 배양함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게, ALK 억제제는 SB431542일 수 있으며, BMP 억제제는 noggin일 수 있다.

또한, 패턴화를 유도하는 물질은 헤지호그 신호전달계(hedgehog signal pathway)를 활성화하는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 헤지호그 신호전달계를 활성화하는 물질은 소닉 헤지호그(sonic hedgehog, SHH) 및 SMO(smoothened) 항진제(agonist)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "소닉 헤지호그(SHH)"는 골격계, 중앙신경계, 얼굴 등과 같은 여러 가지 신체 조직의 발달에서 세포 증식과 형태 형성에 매우 중요한 역할을 한다. 특히, 척수, 대뇌, 소뇌 등 중추신경계의 발생, 신경줄기세포의 증식 및 분화에 중요한 역할을 하는 단백질이다. 상기 SHH가 세포막 수용체인 PTCH1(Patched1)에 결합하면 SMO 수용체가 활성화되어 헤지호그의 음성조절인자인 SUFU(suppressor of fused)를 억제함으로써 전사인자인 GLI1를 활성시켜 신경세포의 증식을 촉진한다. 본 발명에서 SMO 항진제는 purmorphamine일 수 있다.

상기 시상하부 패턴화 오가노이드는 인슐린, 아스코르빈산 및 bFGF가 포함된 배지에서 추가 배양될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "배지"는 in vitro에서 오가노이드의 증식, 생존 및 분화를 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 해당 분야에서 사용되는 오가노이드의 배양 및 분화에 적합한 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지의 종류와 배양 조건이 적절히 선택될 수 있다. 본 발명에서 상기 배지는 인간 줄기세포로부터 신경전구세포로 분화를 유도하기에 적합한 배지일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "신경줄기세포(neural stem cell, NSC)"는 미성숙(immature) 세포로서 미분화(undifferentiated)된 상태로 계속 증식하는 자가 복제(self-renewal)이 가능하고, 신경계 세포로의 분화능을 가진 세포를 의미한다. 상기 신경줄기세포는 인간을 포함한 포유동물의 태아 신경계 전반에 걸쳐 다양한 해부학적 부위에서 존재하고, 최근에는 태아 뿐만 아니라 성체 신경계의 특정 부위에서도 신경줄기세포가 존재하며, 일생을 통하여 신경줄기세포는 뇌의 특정 부위에서 계속 증식하면서 새로운 신경세포를 생성할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화될 수 있다. 상기 신경줄기세포는 시험관 내에서 증식되어 생체 내 이식이 가능하며, 숙주 신경계에 이주, 생착, 통합되어 치료적으로 유용한 물질을 분비하고, 세포 구조학 및 기능적으로도 적절한 신경세포로 분화가 가능한 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포(hypothalamic NSC, htNSC)는 SOX2, NESTIN 및 KI67으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신경줄기세포 마커를 발현하며, RAX, NKX2-1, ISL1, OTP 및 SF-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시상하부 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 상기 신경줄기세포 마커 및 상기 시상하부 마커가 전체 DAPI 양성 세포 집단에서 약 84% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 신경줄기세포 마커 및 상기 시상하부 마커가 전체 DAPI 양성 세포 집단에서 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%로 발현할 수 있다.

SOX2(SRY-box transcription factor 2)는 배아줄기세포의 전분화능을 조절하는 전사인자로서, 배아줄기세포의 자가 재생(self-renewal) 또는 다분화능(pluripotency)을 유지하고 특정 세포로의 분화 과정을 조절하는 역할을 한다.

Nestin은 VI형 중간 필라멘트(intermediate filament, IF) 단백질로, 축삭의 방사상 성장과 관련된 신경세포에서 주로 발현된다. 중추신경계, 말초신경계, 근성 및 기타 조직의 발달 초기 단계에서 발현되며, 성체에서는 중추신경계 손상 후 반흔(glial scar) 형성 및 손상된 근육 조직 재생 등과 같은 병리학적 상황에서 발현이 유도된다. Nestin은 유사분열 세포에서 세포 리모델링에 관여하는 중간 필라멘트의 조립 및 분해를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

KI67은 세포 증식과 관련된 핵 단백질로, 세포주기의 S에 발현이 현저히 증가하여 세포 증식 마커로 사용된다.

또한, RAX(Retina and anterior neural fold homeobox)는 paired-homeodomain을 포함하는 전사인자로서, 초기 배아 발생(embryogenesis)동안 전방 신경판(anterior neural plate)에서 발현되고, 발생 후기에는 망막, 시상하부 및 송과선(pineal gland)에서 발현된다.

NKX2-1은 갑상선 전사인자 1(Thyroid transcription factor 1, TTF-1)로도 알려져 있는 전사인자로서 갑상선, 폐 및 간뇌에 특이적인 유전자의 발현을 조절한다.

ISL1(ISL LIM homeobox 1)은 2개의 LIM 도메인(N 말단) 및 1개의 homeodoamin(C 말단)을 포함하는 전사인자이다. ISL1은 배아 발생 시 랑게르한스 섬의 발달을 조절하고, 마우스 배아에서 신경관의 운동신경세포 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

OTP(Orthopedia homeobox)는 homeodomain을 포함하는 전사인자로, 시상하부 신경내분비 세포의 분화 및 발달에 관여하는 것으로 알려져 있다.

SF-1(Steroidogenic factor 1)은 부신(adrenal gland)과 생식기관(reproductive organs) 발생 및 기능에 필수적인 인자로 알려져 있다. 뇌에서는 시상하부 복내측핵(VMH)에만 발현하여 VMH 발생 및 기능을 조절하고 에너지대사 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 냉동 및 해동 과정 후에도 형태를 유지하며, 높은 생존율을 나타낼 수 있다.

또한, 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 계대배양이 가능할 수 있다. 구체적으로, 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 1회 내지 10회, 2회 내지 8회, 3회 내지 7회 또는 4회 내지 6회 계대배양이 가능할 수 있다.

본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 시상하부 특이적 신경세포로 분화할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 synapsin1(SYN1), TuJ1(TUBB), MAP2 및 RBFOX3(NeuN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 신경세포 마커를 발현하며, α-MSH, Neuropeptide Y(NPY), Secretagogin(SCGN) 및 PMCH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시상하부 신경 펩타이드를 발현하는 신경세포로 분화할 수 있다.

Tuj1은 Neuron-specific class III β-tubulin(TUBB3)으로 알려져 있으며, 미세소관의 주요 구성요소이다. 주로 신경세포에서 발현되며, 신경발생과 축삭 유도 및 유지에 관여한다.

MAP2(Microtubule associated protein 2)는 신경발생의 필수 단계인 미세소관 조립에 관여하는 것으로 알려진 세포골격 단백질이다. 마우스의 신경세포 발달 단계에서 MAP2는 주로 수상돌기에 위치하며 수상돌기의 모양 안정화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

Synapsin은 시냅신 패밀리의 구성원으로, 시냅스 생성 및 신경 전달 물질 분비 조절 기능을 한다.

NeuN는 Hexaribonucleotide binding protein-3 또는 Fox-3로 알려져 있으며, 일반적으로 신경세포의 바이오마커로 사용되는 신경세포 핵에 존재하는 단백질이다.

α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone)는 내인성 펩티드 호르몬 및 멜라노코르틴 계열의 신경 펩타이드로서, 멜라닌 생성을 촉진하는 멜라닌 세포 자극 호르몬 중 하나이다. 또한 섭식 행동, 에너지 항상성, 성행위, 허혈 및 재관류 손상에 대한 보호에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

NPY(Neuropeptide Y)는 중추 및 말초 신경계에서 다양한 생리학적 및 항상성 조절에 관여하는 36개 아미노산으로 이루어진 뉴로펩타이드이다. NPY는 뇌 및 척수로 구성된 포유동물의 중추신경계에 가장 많이 존재하는 펩타이드이다. 자율신경계에서는 주로 교감신경계의 신경세포에서 생성되어 혈관을 수축시키는 역할을 하며, 지방조직의 성장에도 관여한다. 또한 시상하부를 비롯한 뇌의 다양한 위치에서 생성되어 음식 섭취 및 에너지 저장을 증가시키고, 불안, 스트레스 및 통증 감작을 감소시키며, 일주기 리듬 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.

Secretagogin(SCGN)은 세포질에서 발현되는 칼슘결합 단백질로, 염화칼륨에 의해 유도되는 칼슘 유입(influx) 및 세포 증식에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 스트레스 호르몬인 코르티코트로핀 방출호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH)의 방출 및 뇌의 스트레스 활성화에 관여하는 것으로도 알려져 있다.

PMCH(Pro-Melanin Concentrating Hormone)은 MCH(Melanin Concentrating Hormone)의 전구체 단백질로서, 상기 MHC는 배고픔(hunger), 에너지 항상성, 생식 기능 및 수면을 조절하는 신경 펩타이드이다. 상기 PMCH의 기능 이상은 전두골간단이형성증 2(Frontometaphyseal Dysplasia 2) 및 헌팅턴병(Huntington Disease)과 관련 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 본 발명에서 만능 줄기세포가 시상하부를 구성하는 세포로 변하는 과정을 포함하며, 전구세포가 특정 분화 형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포(htNSC)가 신경세포로 분화 시, 성상교세포(GFAP⁺) 및 신경교세포도 함께 분화될 수 있다. 이때, 분화된 신경세포 및 성상교세포는 말초 기관에서 생성된 펩타이드인 leptin 및 ghrelin에 반응하여 생체 영양 상태를 감지할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포(htNSC)는 분화되어 신경줄기/전구세포군(neural stem/progenitor cell, NSC), 중간전구세포군(intermediate progenitor cell, IPC), 신경세포군(neural cell, Neu1 및 Neu2), 성상교세포 전구세포군(astrocyte progenitor cell, APC), 성상교세포군(astrocyte, Ast1, Ast2 및 Ast3), 띠뇌실막세포군(tanycyte, Tan), 연합신경세포 전구세포군(interneuron progenitor cell, Int1 및 Int2), 방사상 신경교세포군(radial glia, RG) 및 프로테오글리칸 분비 신경교세포군(proteoglycan-secreting glia)으로 군집화(clustering)될 수 있다.

전구세포(progenitor cell)는 특정 유형의 세포로 분화하는 세포로서, 줄기세포보다 더 특이적으로 "표적세포"로 분화하는 세포를 의미한다. 줄기세포가 무한 자가분열을 할 수 있는 것에 비하여, 전구세포는 제한된 횟수로 분열할 수 있다. 본 발명에서 전구세포는 신경전구세포(neural progenitor cell), 성상교세포 전구세포(astrocyte progenitor cell) 또는 연합신경세포 전구세포(interneuron progenitor cell) 일 수 있다.

신경세포는 신경계를 구성하는 세포로서, 나트륨 통로, 칼륨 통로 등의 이온 통로를 이용하여 전기적인 방법으로 신호를 전달할 수 있다. 또한 인접한 다른 신경세포와는 시냅스라는 구조를 통해 화학적 신호를 주고받음으로써 다양한 정보를 받아들이고, 저장하는 기능을 한다. 본 명세서에서 신경세포는 "뉴런" 또는 "뉴런세포"와 혼용될 수 있다.

신경전구세포(neural progenitor cell)는 신경세포 분화할 수 있는 세포를 의미한다.

또한, 성상교세포(astrocyte)는 별아교세포라고도 불리우며, 뇌와 척수에 존재한다. 혈뇌장벽(혈액-뇌 장벽)의 안쪽 세포들을 생화학적으로 도와주는 역할을 하며 혈관벽에 돌기가 붙어있어 신경세포에 영양분을 공급하는 역할을 한다. 그 밖에도 신경세포의 이온 농도 조절, 신경세포의 지지, 노페물 제거, 식세포 작용 등의 다양한 역할을 수행한다. 또한 신경조직이 손상되면 신경교종이라는 돌기로 증식하여 그 부분을 채우기도 하며 손상된 조직을 복구하거나 파괴하는 역할을 한다. 성상교세포가 독소를 분해하는 과정에서 생성되는 과산화수소가 신경세포 파괴의 원인이라는 것이 밝혀져 치매 등의 뇌 질환에 대처할 가능성이 제시되고 있다.

성상교세포 전구세포(astrocyte progenitor cell)는 성상교세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다.

띠뇌실막세포(tanycyte)는 시상하부 내의 제3 뇌실 및 제4 뇌실에서 존재하는 뇌실막세포(ependymal cell)로서, 영양(nutrient)상태를 감지하여 식욕을 조절하는 역할을 한다.

연합신경세포(interneuron)는 뇌의 서로 다른 두 영역을 연결하는 신경세포로서, 감각 신경세포 또는 운동 신경세포가 아닌 신경세포의 한 종류이다. 감각 신경세포는 감각 기관이 받아들인 자극을 연합신경세포로 전달하는데, 연합신경세포는 이러한 자극을 통합하고 판단하여 운동 신경세포에 전달한다. 상기 연합신경세포는 중추신경계에 포함되며, 반사, 신경진동 등을 비롯하여 포유류 성체 뇌에서의 신경발생에 핵심적인 역할을 한다.

연합신경세포군(interneuron progenitor cell)는 연합신경세포로 분화하는 세포를 의미한다.

방사상 신경교세포(radial glia)는 신경교세포의 한 종류로서, 신경세포 및 성상교세포의 전구세포를 의미한다. 상기 방사상 신경교세포는 신경세포를 필요한 위치로 안내하는 지지대 역할도 한다.

프로테오글리칸 분비 신경교세포(proteoglycan-secreting glia)는 프로테오글리칸을 분비하는 신경교세포이다. 신경계가 손상되면 성상교세포 및 중간엽세포에서 프로테오글리칸 및 세포외기질단백질(extracellular matrix protein)을 분비하여 손상된 신경계를 회복시킨다. 이는 손상된 부위를 고립시켜 손상이 퍼지는 것을 막는 순기능을 하기도 하지만, 이러한 반흔(glial sacr)을 형성하는 과정에서 성상교세포가 분비하는 물질은 신경돌기가 성장하는 것을 억제하기도 한다.

상기 군집화된 세포군에서 신경세포군(Neu1 및 Neu2)은 시상하부 발생에 관련된 유전자를 발현할 수 있다. 상기 성상교세포 전구세포군(APC)은 SLC1A3, SLCO1C1, CRYM 및 SCG2으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast2); RSAD2, TRAIL, ISG5, IFITs 및 STAT1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast1); 및 SOX9, ID3, Meis2, CLDN5, ALCAM 및 COL1A2로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast3);으로 분화하는 세포를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Ast2군은 신경세포의 영양 공급 및 신경내분비 기능을 담당할 수 있다. 상기 Ast1군은 면역 기능을 담당할 수 있다. 상기 Ast3군은 신경세포의 활성을 조절할 수 있다. 띠뇌실막세포군(Tan)은 RAX, FGF10, COL25A1, CRYM 및 SCN7A로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군일 수 있다.

SLC1A3(Solute carrier family 1 member 3)는 흥분성 아미노산 수송체 1(Excitatory amino acid transporter 1)을 암호화하는 유전자이다.

SLCO1C1(Solute carrier organic anion transporter family member 1C1)은 뇌 및 고환에 발현되는 유기 음이온의 수송을 매개하는 막수송 단백질(organic-anion-transporting polypeptides)을 암호화하는 유전자이다.

CRYM은 NADP-조절 갑상선 호르몬 결합 단백질(NADP-regulated thyroid-hormone-binding protein, THBP)로도 알려진 뮤-크리스탈린(Crystallin Mu) 상동체를 암호화하는 유전자이다.

SCG2는 신경내분비 단백질인 chromogranin/secretogranin 패밀리의 한 구성 단백질인 Secretogranin II를 암호화하는 유전자로서, secretogranin II는 절단되기 전의 전장 단백질은 뉴로펩타이드 및 펩타이드 호르몬을 분비체로 sorting하거나 패킹하는 역할을 하며, 절단되면 후 활성화된 secretoneurin으로서 작용한다.

RSAD2는 Virus inhibitory protein, endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible(Viperin)로 알려져 있는 Radical s-adenosyl methionine domain containing 2를 암호화하는 유전자로, Viperin은 인터페론(IFN)에 의해 활성화되어 DNA 또는 RNA 바이러스의 감염을 억제한다.

TRAIL은 자연세포사멸(apoptosis)을 유도하는 리간드인 TNF-related apoptosis-inducing ligand를 암호화하는 유전자이다.

IFIT는 인터페론에 의해 유도되는 항바이러스 단백질(Interferon induced protein with tetratricopeptide repeats)을 암호화하는 유전자이다.

STAT1은 인터페론, 사이토카인 및 성장 인자에 대한 세포 신호 전달을 매개하는 단백질(Signal transducer and activator of transcription 1)을 암호화하는 유전자이다.

SOX9는 연골 세포 분화 및 골격 발달을 조절하는 전사인자를 암호화하는 유전자이다.

ID3는 DNA 결합 부위가 결여된 단백질로, 이종이량체를 형성하여 DNA 결합 및 전사 활성을 억제하는 전사 조절자를 암호화하는 유전자이다. 상기 전사인자 ID3는 세포 성장, 노화, 분화, 세포자멸사, 혈관신생 및 신생물 형질전환을 포함한 다양한 세포 과정을 조절한다.

Meis2는 homeobox 단백질 Meis2를 암호화하는 유전자로서, Meis2는 HOX 또는 PBX 단백질에 결합하여 이량체를 형성하거나 PBX 및 HOX 단백질의 DNA 결합 이량체에 결합하여 동종단백질-DNA 복합체를 안정화시켜 전사를 조절하는 역할을 한다.

CLDN5는 세포 내의 타이트 정션(tight junction)을 특이적으로 제거하는 Claudin-5를 암호화하는 유전자이다.

ALCAM은 CD166을 암호화하는 유전자로, CD166은 흉선 내 T 세포 발달 시 흉선 상피 세포 및 CD6+ 세포의 접착을 매개하는 역할을 한다.

COL1A2는 1형 콜라겐의 한 종류인 Collagen alpha-2(I) chain을 암호화하는 유전자이다.

FGF10은 Fibroblast growth factor 10를 암호화하는 유전자로서, FGF10은 배아 발달, 세포 증식, 세포 분화 조절 및 상처 치유에 관여한다.

COL25A1은 Collagen alpha-1(XXV) chain을 암호화하는 유전자로서, Collagen alpha-1(XXV) chain은 뇌 특이적으로 발현하는 막결합 콜라겐 단백질로서 amyloid-β peptide(Aβ)의 섬유화(fibrilization)를 억제하는 역할을 한다.

SCN7A는 Sodium channel protein type 7 subunit alpha를 암호화하는 유전자이다. SCN7A는 흥분성 막(excitabl membrane)의 전압 의존성 나트륨 이온 투과(voltage-dependent sodium ion permeability)를 매개하는 역할을 한다.

신경줄기세포를 포함하는 약학 조성물의 용도

본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 노인성 질환을 예방하거나 치료하는 용도로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경세포, 또는 신경줄기세포 및 신경세포를 포함하는 세포집단을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 신경세포는 상술한 바와 동일하다.

본 발명에서 상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환, 골다공증 및 근육 노화 관련 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.

이때, 상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.

이때, 상기 근육 노화 관련 질환은 근위축증, 폐용성 근위축증 및 노화성 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 노인성 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 노인성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에서 상기 신경줄기세포, 신경세포 또는 이들을 포함하는 세포집단은 항노화 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 1㎖ 당 약 2×10⁵개 내지 약 2×10¹⁰개, 바람직하게는 약 2×10⁶개 내지 약 2×10⁹개, 보다 바람직하게는 약 1×10⁷개 내지 약 2×10⁸개 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 약학 조성물은 1㎖ 당 2×10⁸개 세포를 포함할 수 있다.

여기서 "유효량"이란 항노화 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 동결되지 않은 채 사용되거나, 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제(예를 들어 DMSO, 글리세롤, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민, 덱스트란, 수크로스, 에틸렌 글리콜, i-d 에리스리톨, D-리비톨, D-만니톨, D-솔비톨, i-이노시톨, D-락토스, 콜린클로라이드, 에피라이프(Epilife^®) 세포동결배지(cascade biologics)가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 세포 치료제 형태로 적용될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있다.

이때, "세포치료제"는 대상체로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다. 본 발명에 있어서, 상기 세포치료제는 줄기세포치료제일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에 있어서, 세포 치료제로서 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 질병 부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 여기서, "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물은 경우에 따라서는 신경줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다.

따라서 본 발명의 약학 조성물은 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여할 수 있다. 일 구체예로서 신경줄기세포를 적합한 희석제에 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입 시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 뇌척수액 등이 있을 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

본 명세서에서 사용한 용어, "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 세포 기준으로 1일 약 1.0×10³ 내지 약 1.0×10¹⁰세포/kg, 약 1.0×10⁴ 내지 약 1.0×10⁹세포/kg, 약 1.0×10⁵ 내지 약 1.0×10⁸세포/kg 또는 약 1.0×10⁶ 내지 약 1.0×10⁷세포/kg일 수 있다.

다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 명세서에서 사용한 용어, "개체"는 본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상을 의미하며, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래의 신경줄기세포 이외에, 시상하부 유사 오가노이드 유래의 신경세포 또는 항노화 활성의 상승, 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항노화 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 신경줄기세포, 신경세포 또는 이들을 포함하는 세포집단; 및 항노화 활성을 갖는 화합물 또는 천연 추출물은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 노인성 질환을 예방하거나 및 치료하기 위한 용도를 제공한다. 이때, 상기 약학 조성물은 시상하부 유사 오가노이드 유래의 신경세포를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 신경세포, 노인성 질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료방법을 제공한다. 이때, 상기 약학 조성물은 시상하부 유사 오가노이드 유래의 신경세포를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 노인성 질환, 투여, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

상기 개체는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, 인간일 수 있다.

상기 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 세포 기준으로 1일 약 1.0×10³ 내지 약 1.0×10¹⁰세포/kg, 약 1.0×10⁴ 내지 약 1.0×10⁹세포/kg, 약 1.0×10⁵ 내지 약 1.0×10⁸세포/kg 또는 약 1.0×10⁶ 내지 약 1.0×10⁷세포/kg일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다.

신경줄기세포 유래 엑소좀

본 발명의 또 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 분비된 엑소좀을 제공한다. 이때, 시상하부, 오가노이드 및 신경줄기세포는 상술한 바와 동일하다.

본 발명에서 사용한 용어, "엑소좀(exosome)"은 세포가 분비하는 50 내지 150 nm 크기의 소포체(extracellular vesicles)로서, 미세소포(microvesicle)라고도 알려져 있다. 상기 엑소좀은 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀 내에는 세포 내 단백질, 세포막 단백질, 지질 및 RNA, miRNA, DNA 등 핵산 등 세포의 분화, 성장, 이동 및 신호전달에 관련된 여러 인자들을 복합적으로 포함하고 있어, 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다. 상기 엑소좀의 직경은 약 30 nm 내지 약 500 nm, 약 30 nm 내지 약 400 nm, 약 30 nm 내지 약 300 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 180 nm, 약 75 nm 내지 약 180 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 150 nm일 수 있다. 상기 엑소좀은 원형질막(plasma membrane) 또는 다낭체(multivesicular bodies: MVBs)으로부터 기원하여 세포 밖으로 방출 또는 분비될 수 있다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포, 신경세포 또는 이들을 포함하는 세포집단의 배양물로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포 유래 엑소좀은 노인성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 이때, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 신경세포, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환일 수 있다. 여기서 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환은 상술한 바와 동일하다.

신경줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 약학 조성물

본 발명의 또 다른 측면은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 여기서, 엑소좀, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다. 또한, 상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환일 수 있으며, 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에서 상기 엑소좀은 항노화 활성을 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 1㎖ 당 약 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖로 포함될 수 있다. 여기서 유효량은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 개체에 투여될 수 있다. 여기서 약학적으로 유효한 양, 투여 및 개체는 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 0.005 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 0.02 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 0.1 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.

투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 약학 조성물은 경우에 따라서는 엑소좀을 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 약학 조성물은 국소(협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 발병부위에 직접 투여할 수 있다. 하지만 투여 방법은 이에 한정되는 것은 아니며, 치료에 적합한 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체는 상술한 바와 동일하다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 담체의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산 염, 젤라틴, 인산 칼슘, 규산 칼슘, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 생리 식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항-응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 항노화용 조성물은 유효성분인 상기 엑소좀 이외에, 항노화 활성의 상승, 보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항노화 활성을 갖는 것으로 공지된 세포치료제(예를 들어, 신경줄기세포, 신경세포 또는 이들을 포함하는 세포집단), 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 엑소좀 및 항노화 활성을 갖는 세포치료제, 화합물 또는 천연 추출물은 동시 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포에서 분리한 엑소좀의 노인성 질환을 예방하거나 및 치료하기 위한 용도를 제공한다. 여기서, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 신경세포, 엑소좀, 노인성 질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료방법을 제공한다. 여기서 엑소좀, 개체, 투여, 노인성 질환, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

상기 엑소좀의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 0.005 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 0.02 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 0.1 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.

투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다.

신경줄기세포 유래 엑소좀 제조 방법

본 발명의 또 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는 엑소좀 제조 방법을 제공한다. 여기서, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포 및 엑소좀은 상술한 바와 동일하다.

신경줄기세포 및/또는 신경줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 키트

본 발명의 또 다른 측면은 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포; 및/또는 시상하부 유사 오가노이드 신경줄기세포로부터 분비된 엑소좀을 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 키트를 제공한다. 이때, 시상하부, 오가노이드, 신경줄기세포, 엑소좀, 예방 및 치료는 상술한 바와 동일하다.

상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환, 골다공증 및 근육 노화 관련 질환일 수 있다. 여기서, 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환은 상술한 바와 동일하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 세포배양

인간 배아줄기세포주 H9(H9 hESCs, WiCell)를 mTeSR-1 배지(Stem Cell Technology)에서 피더세포(feeder cell)가 없는 조건으로 매트리겔(matrigel) 코팅된 플레이트에서 배양하였다. 인간 시상하부 유래 신경줄기세포(ntNSC)는 H9 hESC로부터 3D 배양 방법을 사용하여 제작하였다.

구체적으로 hESC를 부착성이 낮은 96웰 둥근 바닥 플레이트에 웰당 10,000개 세포의 밀도로 신경유도배지(neural induction medium)에 현탁하여 접종하고 24시간 배양하였다. 이때, 신경유도배지는 비타민 A(Invitrogen)가 포함되어 있지 않은 B27 및 200 μM 아스코르빈산(Sigma) 및 1.25 mg/ℓ 인슐린이 포함된 N2 배지와 Neurobasal 배지(Gibco)가 1:1로 혼합된 배지에 10 μM SB431542(Tocris), 200 ng/㎖ noggin(Peprotech) 및 20 μM Y27632(ROCK 억제제, Sigma)를 첨가한 배지를 사용하였다.

H9 hESC의 시상하부 패턴화를 위하여 10 μM SB431542(Tocris) 및 200 ng/㎖ noggin(Peprotech)이 포함된 신경 유도 배지에서 5일간 배양한 후, 상기 배지에 추가로 100 ng/㎖ sonic hedgehog(SHH, Peprotech) 및 2 μM purmorphamine(Calbiochem)을 첨가하여 6일간 배양하였다. 분화 시작 후 12일째 되는 날, 형성된 스피어(sphere)를 부착성이 낮은 6웰 플레이트로 옮긴 뒤, neural expansion media에서 8일간(분화 시작 후 20일째 되는 날까지) orbital shaker(80 rpm)를 이용하여 배양하였다. neural expansion media는 1.25 mg/ℓ 인슐린, 200 μM 아스코르빈산, 20 ng/ℓ bFGF(Peprotech) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 N2 media를 사용하였다. 그 뒤, 스피어를 chopping하여 neural expansion media에 현탁하고 poly-L-ornithine/fibronectin이 코팅된 플레이트에 접종하였다. 상기 과정을 통해 수득된 신경줄기세포는 1.25 mg/ℓ 인슐린, 200 μM 아스코르빈산, 10 ng/㎖ BDNF(Peprotech), 10 ng/㎖ GDNF(Peprotech), 125 μM db-cAMP(Sigma) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 N2 media(신경분화배지, neuron differentiation media)에서 배양하여 신경세포로 분화시켰다.

실험예 2. 동물실험

동물 실험을 위한 모든 절차는 한양대학교 의과대학 기관동물관리위원회(institutional animal care and use committee, IACUC)(승인번호, 2018-0217A 및 2020-0142A), 및 한국과학기술연구원(KIST) IACUC 및 기관바이오안전위원회(institutional biosafety committee, IBC)의 승인을 받아 수행하였다(승인번호, KIST-2019-048). 동물실험에는 11개월된 중년(mid-aged) C57BL/6 수컷 마우스는 한국기초과학연구원 또는 Janvier lab에서 구입하여 사용하였다. 마우스는 항온(23±1℃), 항습(50±10%) 및 12시간 명암 주기가 조절되는 사육실에서 먹이 및 물을 자유 섭식시켜 사육하였다.

실험예 3. 세포이식실험

세포이식(Cell transplantation)을 위하여 12개월된 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 먼저, 마우스를 zoletil(37.5 mg/kg) 및 rompun(5.83 mg/kg)을 이용하여 마취시킨 후, N2 media에 현탁시킨 인간 시상하부 유래 NSC(1 ㎕, 2×10⁵　세포/㎕)를 내측기저 시상하부(mediobasal hypothalamus, MBH)에 250 nL/분의 속도로 2분간 주입하였다(AP:-1.5 mm, ML:±0.4 mm, DV:-5.6 mm). 주입이 끝난 뒤, 5분간 주입기(injector)를 제거하지 않고 추가로 방치하였다.

실험예 4. 조직학적 분석

마우스를 마취하고 30 ㎖ PBS(pH 7.4)로 심근관류하여 혈액을 제거한 뒤, PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드(PFA, 30 ㎖)로 심근관류하여 조직을 고정하였다. 고정된 뇌조직을 적출하여 4℃에서 밤새도록 4% PFA(PBS에 희석)로 추가 고정하였다. 고정된 뇌조직을 30% 수크로즈에 7일 동안 반응시켜 조직 내 수분을 제거하였다(cryoprotection, 동결보호). 수분이 제거된 뇌조직을 TissueTek O.C.T 컴파운드(Sakura Finetek)로 몰딩하여 얼린 후, cryostat(Leica)를 이용하여 30 ㎛ 두께로 section하여 뇌조직 절편을 준비하였다.

말초 조직의 경우, 해부 후 적출한 백색지방(white adipose tissue, WAT), 갈색지방(brown adipose tissue, BAT), 간 및 대퇴골을 단백질 분석 및 면역 염색을 위해 나누어 보관하였다. 조직 염색을 위하여 각 조직을 4% 포름알데하이드(PFA)에 담궈 4℃에서 밤새 고정시킨 후, 파라핀으로 포매하고 4 ㎛ 두께로 section하여 조직 절편을 준비하였다. 조직 염색은 공지된 H&E 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험예 5. 면역염색

세포 및 cryo-section된 뇌조직 절편을 PBS에 희석된 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 뒤, 1% BSA가 포함된 0.3% Triton X-100을 처리하고 1시간 반응시켰다. 그리고, 1차 항체로 항-Nestin 항체(1:500, BioLegend, 65680), 항-Rax 항체(1:500, Takara, M228), 항-Sox2 항체(1:200, ThermoFisher, MA5-13961), 항-Nkx2-1 항체(1:10, DSHB, 40.2D6), 항-KI67 항체(1:500, Abcam, ab15580), 항-TUJ1 항체(1:200, BioLegend, 801202), 항-MAP2 항체(1:200, Sigma-Aldrich, M1406), 항-RBFOX3 항체(1:200, Millipore, MAB377), 항-SYN1 항체(1:200, Millipore, AB1543), 항-αMSH 항체(1:2000, Phoenix Pharmaceuticals, H-043-01), 항-NPY 항체(1:1000, ImmunoStar, 22940), 항-SCGN 항체(1:500, Sigma-Aldrich, HPA006641), 항-PMCH 항체(1:500, Sigma-Aldrich, M8440), 항-GFAP 항체(1:500, Agilent, Z0334), 항-hNCAM 항체(1:500, Santa Cruz Biotechnology, sc-106), 항-hGFAP 항체(1:400, BioLegend, 837201) 또는 항-huMt 항체(1:500, Abcam, ab92824)를 처리하고 빛을 차단한 상태로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 시각화를 위하여 2차 항체로 Cy3 또는 Alex Flour 488이 부착된 항-마우스 IgG(1:1000, Jackson Immunoresearch Laboratories, 111-165-003 또는 A-11001)를 사용하였다.

염색된 세포 및 뇌조직 절편을 DAPI가 포함된 VECTASHIELD 마운팅 용액(Vector Laboratories)을 사용하여 마운팅하고, 형광현미경(Leica)을 통해 관찰하였다.

실험예 6. 정량적 RT-PCR 분석

RNA를 TRIzol™ 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출한 후, SuperScript™키트(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR(q-PCR)은 iQTM SYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 CFX96™ Real-Time System에서 수행되었으며, 유전자 발현량은 GAPDH 또는 베타 액틴 발현량으로 정량화 하였다. 이때, 사용한 프라이머는 표 1에 나타내었다.

유전자	정방향(forward)	서열번호	역방향(reverse)	서열번호
NKX2-1	CAGGACACCATGAGGAACAGCG	1	GCCATGTTCTTGCTCACGTCCC	2
RAX	GCAAGGTCAACCTACCAGAGGT	3	GCAGCTTCATGGAGGACACTTC	4
OTP	AGCTTCGCCAAGACTCACTACC	5	CACGGAACACGTTGGTCGTCTT	6
ISL1	GCAGAGTGACATAGATCAGCCTG	7	GCCTCAATAGGACTGGCTACCA	8
SF-1	CCAGACCTTCATCTCCATCGTG	9	TGGCGGTAGATGTGGTCGAACA	10
EN1	GCAACCCGGCTATCCTACTTATG	11	ATGTAGCGGTTTGCCTGGAAC	12
ACTB	GTGACAGCAGTCGGTTGGAG	13	AACAACGCATCTCATATTTGGAA	14

실험예 7. 웨스턴 블롯

세포에 단백질 분해효소 억제제 및 인산화 효소 억제제가 첨가된 RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS 및 1 mM EDTA)를 첨가하고 초음파 처리하여 세포를 용해하였다. 상기 세포 용해물을 4℃, 15,000g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수득한 뒤 Pierce BCA 분석(Thermo Fisher)을 통해 정량하였다. SDS-PAGE로 전기영동하여 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮긴 뒤, 5% BSA가 포함된 TBST를 첨가하여 1시간 반응시켜 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 1차 항체를 표 2에 나타낸 바와 같이 처리하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 1차 항체 반응 후, 2차 항체로 염소-항-래빗-HRP 접합체 또는 염소-항-마우스-HRP 접합체(Cell Signaling Technology)를 5% BSA가 포함된 TBST에 1:1,000으로 희석하여 멤브레인에 처리하여 1시간 반응시켰다. 각 항체에 대한 단백질 발현은 West-Pico 화학발광 기질(Thermo Fisher)을 이용하여 확인하였다. leptin 및 ghrelin 활성 분석은 분화 유도된 세포에 leptin(100 ng/㎖) 또는 ghrelin(10 nM)을 각각 처리한 뒤, 1시간 반응시켜 확인하였다.

항체	희석비율	입수처	제품번호
Rabbit polyclonal anti-phospho-STAT3 (Tyr705)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 9131
Rabbit polyclonal anti-STAT3	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 9132
Rabbit polyclonal anti-phospho-FoxO1 (Ser256)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 9461
Rabbit polyclonal anti-FoxO1 (C29H4)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 2880
Mouse monoclonal anti-GAPDH (0411)	1:1000	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-47724
Mouse monoclonal anti-MTCO1 (1D6E1A8)	1:1000	Thermo Fisher Scientific	Cat# 459600
Mouse monoclonal anti-SDHB (G-10)	1:1000	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-271548
Rabbit polyclonal anti-FGF21	1:1000	Abcam	Cat# ab137715
Rabbit polyclonal anti-Beta Actin	1:1000	Proteintech	Cat# 20536-1-AP
Rabbit monoclonal anti-phospho-eIF2alpha (Ser51) (119A11)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 3597
Rabbit monoclonal anti-eIF2alpha (D7D3)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 5324
Rabbit monoclonal anti-ATF-4 (D4B8)	1:1000	Cell Signaling Technology	Cat# 11815
Goat polyclonal anti-GDF15	1:1000	Abcam	Cat# ab39999

실험예 8. 엑소좀 분리 및 마우스 처리

세포 배양 배지 내의 엑소좀(exosome)은 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 정제하였다. 구체적으로, 세포 배양액을 원심분리하여 상등액을 취한 뒤, 초원심분리기에서 300g에서 10분, 2000g에서 10분, 10,000g에서 30, 100,000g에서 1시간 원심분리하여 필터한 뒤, 다시 한번 초원심분리기에서 100,000g에서 1시간 원심분리하여 엑소좀을 수득하였다.

상기 과정으로 분리된 엑소좀은 최종적으로 PBS에 재현탁하여 준비하였다.

모든 마우스에 대하여 초정밀 소동물뇌정위 장치(Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)를 사용하여 실험예 2와 동일한 방법으로 시상하부 제3 뇌실(3V)에 브레그마 후방 2.0 mm 및 브레그마 아래 5.0 mm의 정중선 좌표에 26 게이지 가이드 캐뉼러를 이식하였다. 이 중, vehicle(PBS) 및 엑소좀 처리군은 상기 캐뉼러를 통해 3V에 PBS 또는 엑소좀을 주 3회씩 3개월 동안 주입하였다.

실험예 9. 마우스 행동 실험

모든 행동 실험은 행동 실험실에서 모든 행동 평가는 컴퓨터화된 ANY-maze 비디오-추적 시스템(Stoelting)으로 기록하였다. 또한, 모두 실험은 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행하였다.

실험예 9.1. 근력 평가(grip strength test)

마우스를 정사각형 격자(1 cm 메쉬 크기)에 놓은 뒤, 격자를 뒤집어 마우스가 발로 매달려 있는 시간을 2분 동안 측정하여 기록하였다. 각 마우스에 대해 최소 10분의 휴식을 취하면서 3번 반복 실험하였다.

실험예 9.2. 운동 조화능 평가(rotarod test)

마우스를 5 rpm 속도로 움직이는 로타로드(B.S Technolab INC.)에서 60초 동안 훈련시킨 뒤, 10분 휴식을 취하게 하였다. 그리고, 각 마우스를 5 rpm 속도로 움직이는 로타로드에 놓아두고 5분 동안 분당 5 rpm씩 속도를 증가시키면서 마우스의 행동을 기록하였다. 각 마우스에 대해 30분의 휴식을 취하면서 3번 반복 실험하였다.

실험예 9.3. 지구력 평가(Treadmill test)

지구력 평가는 개별 레인에서 최대 8마리의 마우스를 평가할 수 있는 트레드밀(정도 바이오&플랜트)을 사용하였다. 실험 실행 전에 달리기 부상 및 실패를 방지하기 위하여 마우스를 5 rpm의 속도의 트레이드밀에 5분 동안 놓아두어 적응시켰다. 그 뒤, 10분 동안 분당 2 rpm씩 속도를 증가시키면서 마우스가 달리기를 포기한 시간을 기록하였다.

실험예 9.4. 신물체탐색 시험(novel object recognition)

먼저, 실험을 수행하기 전에 마우스를 개방된 공간 박스(open field, 가로 40 cm × 세로 40 cm × 높이 50 cm)에 10분 동안 자유롭게 놓아두었다. 그리고, 상기 마우스를 동일한 모양의 두 물체(object)를 자유롭게 탐색하도록 하였다(첫번째 세션). 그 뒤, 두 물체 중 하나를 새로운 물체로 교체한 뒤, 상기 마우스를 10분간 노출하였다(두번째 세션). 그리고 마우스가 각 물체를 탐색하는 시간을 기록하였다. 선호도 지수는 두 물체를 탐색하는데 소요된 총 시간에 대한 두 물체(새로운 물체 포함) 중 하나를 탐색하는데 소요된 시간의 비(ratio)로 나타내었다.

실험예 9.5. 모리스 수중미로 시험

모리스 수중미로 시험(Morris water maze test)은 하기의 방법으로 수행되었다.

먼저 물탱크를 24℃의 물로 채우고, 크레욜라 무독성 페인트를 칠하여 물탱크의 배경을 흰색으로 불투명하게 만들었다. 그리고 상기 물탱크를 외부 미로 단서(extra-maze cue, 흰색 배경에 다양한 검은색 모양)가 있는 방의 중앙에 놓아두었다. 이때, 물탱크는 지름이 90 cm로 4개의 사분면(북서, 북동, 남서 및 남동)으로 나누었다. 그리고 직경 10 cm의 원형 플랫폼을 탱크 벽에서 25 cm 떨어진 곳에 배치하고, 매 실험마다 마우스가 동일한 시작 위치에서 플랫폼으로 이동하는데 소요된 시간, 거리 및 속도를 측정하였다.

실험은 잠복 플랫폼(hidden platform) 훈련 및 프로브 실험(probe trial)의 2단계로 진행하였다. 잠복 플랫폼 훈련은 하기와 같이 진행하였다. 마우스를 먼저 수면 위 0.5 cm에 설치된 가시적인 플랫폼(visible platform)으로 수영하여 10초간 머무르도록 훈련하였다. 이때, 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면 유리 교반 막대를 사용하여 플랫폼으로 유도하였다. 상기 훈련은 입수하는 위치를 다르게 하여(입수 위치는 북쪽, 남쪽, 동쪽 및 서쪽) 하루에 4번씩, 4일 연속으로 실시하였다. 상기 훈련을 수행한 후, 플랫폼이 보이지 않도록 플랫폼을 수면 아래 1 cm 깊이에 설치하였다. 그 후, 마우스를 입수시켜 플랫폼에 도달하기까지의 지연된 시간, 이동한 거리, 경로 효율성, 각 사분면에서 보낸 시간 및 이동한 거리, 총 이동 거리 및 수영 속도를 측정하였다. 프로브 실험(probe trial)은 훈련을 시작한 지 5일째 되는 날, 플랫폼을 제거하고 훈련받은 마우스를 플랫폼이 설치되었던 자리(목표 사분면)의 정반대 위치에서 출발시켜 60초 동안 마우스가 모든 사분면에서 보낸 시간, 목표 사분면 가로지른 거리 및 횟수, 총 이동 거리 및 수영 속도를 기록하였다. 마우스의 학습과 기억은 프로브 시험에서 목표 사분면에서 보낸 총 시간으로 평가하였다.

실험예 9.6. Y 미로 시험

측정 장비는 세 개의 동일한 가지(길이 40 cm - 너비 4 cm - 높이 15 cm)로 구성되고, 각 가지가 접히는 각도는 120°인 Y 미로를 이용하였다. 세 개의 가지를 각각 A, B, C로 정한 뒤에 마우스를 한쪽 가지 끝에 배치한 뒤, 10분 동안 다른 가지로 이동하도록 하였다. 실험동물의 꼬리까지 가지에 들어갈 때의 횟수와, 각 가지에 차례로 들어간 경우를 헤아려 1점(실제변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 세 가지 모두에 겹치지 않게 들어가는 것으로 정의되며(예: ABC, BCA, CAB, 그러나 ABA는 아님), 다음의 수학식 1에 의해 자발적 변경 행동력(spontaneous alteration)을 계산하였다.

<수학식 1>

자발적 변경 행동력(spontaneous alteration)=[(교대 횟수)/(총 가지 항목 -2)]×100

실험예 9.7. 개방공간 시험(open field test)

마우스를 한마리씩 개방공간 박스(길이 40 cm × 너비 40 cm × 높이 50 cm)의 중앙에 배치하고 20분 동안 적응시켰다. 마우스의 움직임을 10분 동안 기록한 다음 Any-Maze 동물 추적 시스템 소프트웨어(Stoeling, Wood Dale)에 연결된 디지털 카메라를 통해 분석하였다. 이때, 총 이동 거리(meter) 및 개방공간 박스의 중앙 및 주변에서 머무른 시간(second)를 측정하였다.

실험예 9.8. 수동회피실험(passive avoidance test)

측정장치(길이 48 cm × 너비 23 cm 너비 × 높이 28 cm)의 중앙에 게이트가 있고, 측정장치 내 구역을 조명이 있는 구획(밝은 구획) 및 어두운 구획으로 동일하게 나누었다. 첫날에 마우스는 10분 동안 두 구획을 자유롭게 탐색하도록 방치하였다. 다음 날(훈련)에는 조명이 있는 구획에 마우스를 60초 동안 방치한 뒤, 다음 게이트를 열어 마우스가 어두운 구획으로 자유롭게 들어갈 수 있도록 하였다. 마우스가 어두운 구획에 들어가면 문을 닫고 마우스 발에 전기 충격(0.3 mA, 3초)을 가하였다. 이때, 단계별 대기 시간 또는 마우스가 어두운 구획에 들어가는 데 걸리는 시간을 기록하였다. 3일째(프로브 시험)에는 조명이 있는 구획에 마우스를 넣고 60초 후에 게이트를 열어둔 뒤 마우스가 게이트 안의 어두운 구역으로 이동하기 전까지의 시간을 측정하였다. 단계별 대기 시간은 540초 동안 측정되었다.

실험예 10. 체성분 분석

실험예 3과 같이 세포이식된 마우스의 지방(fat) 및 lean 퍼센트를 한국 마우스 표현형센터(KMPC)에 의뢰하여 minispec LF50(Bruker)을 이용하여 측정하였다.

실험예 11. 당부하 시험

실험예 3과 같이 세포이식된 마우스를 12시간 금식시킨 뒤, 포도당을 2 g/kg 농도로 복강 내 투여하였다. 포도당 투여 후, 0, 30, 60 및 120분이 경과되었을 때 꼬리에서 혈액을 채취하여 glucometer를 이용하여 혈당을 측정하였다.

실험예 12. 대사 케이지 및 행동 분석

대사율을 측정하기 위해 마우스의 대사 매개변수를 상온(22℃)에서 CLAMS(comprehensive laboratory animal monitoring system) 시스템(Columbus Instruments, Columbus, OH, USA)을 이용하여 간접 열량계 1-2로 분석하였다. 실험 2일 내지 3일 전, 마우스를 단독 측정 케이지(길이 20.5 cm × 너비 10.5 cm × 높이 12.5 cm)에 수용하고 동일한 식이(정상식 또는 고지방식)를 공급하여 적응시켰다. 실험동물의 O₂ 소비(O₂ consumption), CO₂ 생산(CO₂ production), 에너지 소비(energy expenditure), 열(heat) 및 활동량(locomoto activity)을 24시간 동안 측정하였다. 상기 측정 데이터는 CLAX 소프트웨어(버전 2.2.15, Columbus Instruments)를 이용하여 호흡 지수(the respiratory quotient) 또는 CO₂/O₂ 교환 비율(CO₂/O₂ exchange ratio) 및 Δ열(heat) 값을 계산하여 나타내었다.

실험예 13. Bulk RNA-서열 전사체 분석

Total RNA(RIN>8)는 TRIzol을 이용하여(약 2×10⁶ 세포) 분리하고, TruSeq Stranded mRNA LT(Illumina 사)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 준비하였다. 시퀀싱은 NovaSeq 6000(Macrogen)로 수행하였다. 페어드 엔드 라이브러리(paired-end library)는 HISAT2 파이프라인을 사용하여 human reference UCSC hg19와 비교(align)하여 분석하였다. 대조군 및 샘플군 사이의 발현량 차이를 나타내는 유전자(differentially expressed gene, DEG)를 분석하기 위하여 DESeq2 방법을 사용하였다. 이때, 유전자형-조직 발현(genotype-tissue expression, GTEx) 데이터는 dbGaP(The database of Genotypes and Phenotypes) 중에서 사후 기증자의 시상하부, 해마, 피질 및 흑색질에서 각각 4개의 샘플을 무작위로 선별하여 사용하였다(study accession phs000424.v7. p2;　https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/study.cgi?study_id=phs000424.v7.p2).

실험예 14. 단일세포 RNA 염기서열 분석

htNSC를 신경분화배지(neuron differentiation media)에서 뉴로스피어(neurosphere) 상태로 70일 동안 배양하였다.

배양된 시상하부 유사 오가노이드에 파파인 용액(PAP2, Worthington) 및 DNAse 용액(D2, Worthington)을 20:1 비율로 처리하고 37℃에서 20분 동안 반응시킨 뒤 500g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 분리하였다. 상기 방법으로 수득된 세포 펠렛을 0.004% BSA가 포함된 신경분화배지에 재현탁하고 세포 생존율을 측정하였다. 상기 분리된 세포에 대하여 Chromium Next GEM Single Cell 3' RNA library v3.1 Reagent Kit(10Х Genomics, USA)를 사용하여 단일세포 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기 단일세포 cDNA 라이브러리를 NextSeq 500 시스템(Illunimia 사)으로 시퀀싱하여 91 bp 및 28 bp 쌍을 이루는 말단 판독값을 얻었다. 상기 결과를 Cell Ranger 버전 5.0.0(10X Genomics, USA)을 이용하여 UMI(Unique Moleucular Identifier)를 바탕으로 역다중화(de-multiplex) 및 정량화(quantify)하였다.

카운트 매트릭스(count matrix)는 각 샘플에 대하여 기본 매개 변수(default parameter)로 생성하였고, 유전자는 human reference genome GRCh38을 기반으로 매핑하였다.

실험에 15. 세포증식 분석 시험

세포증식은 수학식 2의 공식에 의해 계산된 집단배가수(population doublinfg level, PDL)를 통해 확인하였다.

<수학식 2>

집단배가수(PDL)=log(N/N₀)/log2

이때, N은 각 계대배양이 종료된 시기의 세포수를 의미하며, N₀는 배양 시작 시에 접종된 세포의 수를 의미한다.

실험에 16. 세포 생존률 분석

세포 생존률은 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(ThermoFisher #L3224)를 사용하여 측정였다.

실험에 17. 골 마티크로 CT 분석 시험

각 마우스의 오른쪽 대퇴골을 적출하여 4% 포름알데하이드에서 밤새 고정시켰다. 고정된 대퇴골을 직경 12.3 mm의 스캐닝 튜브에 넣고 데스크탑 마이크로(μCT) 스캐너(SkyScan 1076, Bruker)를 사용하여 이미지를 촬영하였고, 스캔된 이미지는 3D 이미지로 통합하였다. 성장판으로부터 약 0.5 mm 떨어진 부위부터 1.6 mm 부위까지 촬영된 100개의 슬라이드를 관심 영역(region of interest, ROI)으로 하여 총 조직 부피, 골밀도(bone mineral density, BMD), 골부피(bone volume, BV)/조직부피(tissue volume, TV), 골소주 갯수(trabecular number, Tb. N) 및 골소주 두께(trabecular thickness, Tb. Th)를 분석하였다.

실험예 18. 통계 분석

통계 분석은 Prism 소프트웨어 버전 6(GraphPad Software) 또는 IBM SPSS Statistics 26(IBM)을 이용하여 양측 비대응 표본 t검정, 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 Mann-Whitney U 검정으로 분석하였다. 모든 결과는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 오차막대는 평균(mean)±표준 오차(SEM) 또는 중앙값(median)으로 나타내며, p 값은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001로 나타내었다.

실험결과 1. hPSC 유래 시상하부 유사 오가노이드로부터 htNSC 생성

세포 치료제에 사용하고, 인간 시상하부 신경세포 및 비신경세포의 안정적인 세포 공급원을 제공하기 위하여, hPSC를 시상하부 NSC(hypothalamic NSC, htNSC)로 분화시키기 위한 프로토콜을 개발하였다. hESC(H9)를 3D 배양하고, 신경-상피 및 시상하부 영역으로 패터닝을 유도하는 물질 존재 하에서 오비탈 쉐이킹(orbital shaking)을 통해, hESC를 NSC로 분화를 유도하였다(도 1). 시상하부에서 높게 발현된다고 알려진 RAX, NKX2-1, ILS1, 및 낮게 발현된다고 알려진 Engrailed-1(EN1)의 발현을 기초로 하여 시상하부 패터닝 유도 물질의 농도 및 처리 시간을 최적화하였다(도 2). 구체적으로, Sonic hedgehog(SHH) 및 purmophamine을 동시에 처리 시, 시상하부 신경줄기세포 마커인 NKX2.1 및 RAX의 발현이 증가하는 반면, 중뇌 마커인 Engrailed-1(EN1)은 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그 외에 시상하부 패터닝과 관련되어 있다고 알려진 다른 저분자 물질의 처리(CHR, CNTF, IWP-2, XAV, FGF8, NOG)는시상하부 마커 발현을 감소시키고 동시에 중뇌 마커 EN1의 발현을 증가시켰다. 따라서, 본 발명에서는 시상하부 패턴닝에는 SHH 및 purmophamine만을 사용하여 수행하였다.

상기 조건으로 패터닝된 오가노이드는 배양 20일째의 시상하부 분화 패턴과 유사한 유전자 발현을 나타내었다.

특히, 섬유아세포 성장 인자(bFGF)는 초기 시상하부 유사 오가노이드 내의 htNSC를 증가시켰다. 배양 20일째(D20)에 상기 오가노이드에서 세포를 분리하여 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에서 bFGF가 포함된 N2 배지를 이용하여 계대배양하였다. 그 결과, 상기 배양된 세포의 84-97%에서 NSC 마커(SOX2, NESTIN, KI67) 및 시상하부 영역 특이적 마커(RAX, NKX2-1, ISL1, OTP, SF-1)의 발현이 관찰되었다(도 3 및 도 4). 상기 분화된 htNSC의 전사체 및 영역별 인간 태아 뇌의 전사체(GTEX)와 비교 분석한 결과, 분화된 htNSC 전사체는 인간 태아 시상하부와 군집화(clustering)되어 시상하부 영역과 유사한 특징을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

또한, 상기 htNSC는 여러번 계대배양을 하여도(약 5계대) 세포 성장을 유지하였다(도 6). 상기 htNSC를 동결보관 후 재배양하여 세포사(ethidium heterodimer-1, EthD-1), 세포 생존(calcein) 및 신경줄기세포(Rax, nestin) 마거 단백질의 발현을 확인한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 해동된 세포의 대부분이 생존하였으며, 시상하부 신경줄기세포 마커 단밸질의 발현량도 동결 전의 세포와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 상기 htNSC는 동결보존 가능하며, 해동 후에도 htNSC의 특징을 유지할 수 있음을 확인하였다.

실험결과 2. 오가노이드 유래 인간 htNSC의 분화 표현형 확인 분석

htNSC에서 신경세포로 분화를 유도하였다. 유도된 신경세포는 뉴런 마커(synapsin1(SYN1), TuJ1(TUBB), MAP2, RBFOX3(NeuN))를 발현하였으며, 시상하부 특이적 뉴로펩타이드(α-MSH, Neuropeptide Y(NPY), Secretagogin(SCGN), PMCH)를 발현하는 하위 세포군도 관찰되었다(도 8).

특히, GFAP⁺ 성상교세포도 분화된 htNSC 배양에서 관찰되었으며, 분화 말기에는 신경교세포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, htNSC에서 분화된 세포에서 leptin 수용체 및 ghrelin 수용체의 발현이 관찰되었고(도 8), 상기 세포에 leptin 또는 ghrelin을 처리하였을 경우, 각 수용체의 하위 신호전달 인자인 STAT3 또는 FOXO1의 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

보다 구체적으로 htNSC로부터 분화된 세포의 표현형을 분석하기 위하여, 분화 70일째에 RNA 시퀀싱(sc-RNA-Seq) 분석을 실시하였다. 총 11,813개의 세포에 대해 Smart-seq2 방법을 이용하여 시퀀싱을 진행하였고, 리딩값을 필터링을 통해 doublet 및 신뢰할 수 없는 값을 제거하여 총 6,394개의 전사체를 이용하여 분석하였다. 먼저, Seurat 알고리즘을 이용하여 군집화(clustering)한 결과 13개의 군집(cluster)으로 나뉘었고, 이를 UMAP(uniform manifold approximation) 맵으로 시각화 하였다. 상기 군집 내에서 잘 알려진 마커 유전자의 발현 수준(Artegiani et al., 2017; Hochgerner et al., 2018; Zeisel et al., 2018)을 바탕으로 상기 군집을 신경줄기/전구세포(neural stem/progenitor cell, NSC), 중간전구세포(intermediate progenitor cell, Int1 및 Int2), 성상교세포 전구세포(Astrocyte progenitor cell, APC), 성상교세포(astrocyte, Ast1, Ast2 및 Ast3), 띠뇌실막세포(tanycyte, Tan), 연합신경세포 전구세포(interneuron progenitor cell, Int1 및 Int2), 방사상 신경교세포(radial glia, RG) 및 프로테오글리칸 분비 신경교세포(proteoglycan-secreting glia)로 구분하였다(도 10). 이때, 각 군집별로 특이적 유전자들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 11 및 도 12).

상기 분석 결과를 재확인하기 위하여 Voxhunt를 이용하여 allen developing brain atlas의 마우스 뇌 전사체(생후 14일령)와 비교분석 하였다. 부피소 공간 해상도(voxel-based spatial resolution)를 바탕으로 분석한 결과, htNSC에서 분화된 모든 세포군이 생후 14일 마우스 뇌의 시상하부 부분에 정확히 위치함을 확인할 수 있었다. 또한, 전구/중간세포군(Int1, Int2, IPC, APC 및 NSC)은 성인의 신경분화가 이루어지는 뇌실 영역과 인접한 시상하부 영역에 편중된 것을 확인할 수 있었다(도 13). 상기 결과를 통해, 본 발명의 방법에 의한 신경줄기세포는 시상하부 특이적임을 확인할 수 있었다.

또한, 신경세포 및 성상교세포가 동일한 전구세포로부터 분화되는 것과 유사하게, UMAP 군집화 결과는 중간전구세포군(Int1 및 Int2)은 신경세포군(Neu1 및 Neu2) 및 성상교세포 전구세포군(APC)으로 양분화되는 것을 확인할 수 있었다(도 14). Monocle3를 사용하여 전구/중간 세포군(Int1, Int2, IPC, APC 및 NSC)을 pseudo-temporal ordering 방법으로 분석한 결과를 살펴보면, 신경줄기세포는 중간 세포군(Int1, Int2), 신경세포(Neu1, Neu2)의 순서로 분화되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 분화가 진행됨에 따라 전구세포 초기에는 세포 증식 마커인 CDK1 발현이 급격히 감소하며, 전구세포 후기에는 전구신경세포 유전자인 ASCL1의 발현이 증가하였고, 신경세포 말기에는 신경세포 특이적 유전자인 TUBB3 및 SNAP25의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 15).

SLIT-ROBO 신호는 최근 시상하부 특이적 뇌 발달에 대한 중요한 조절자로 보고되었다(Romanov et al. 2020). 본 발명의 상기 htNSC에서 분화 유도된 세포에서도 생체 내 시상하부 뇌 발달 상태와 유사한 SLIT-ROBO 신호 유전자 발현 패턴을 확인할 수 있었다(도 16). 상기 결과를 통해, 상기 오가노이드 유래 인간 htNSC의 분화 패턴이 생체 내 시상하부 발달과 유사함을 확인할 수 있었다.

다음으로 군집 유전자의 상위 조절자(regulon)를 찾기 위하여 pySCENIC을 사용하여 유전자 조절 네트워크(GRN) 분석을 실시하였다. 그 결과, SOX4/SMARCA4, STAT1/2 및 THRB/RAX가 신경세포군(Neu1), 성상교세포군(Ast1) 및 띠뇌실막세포 유사 세포군(Tan)에서 상위 조절 유전자(master regulator)임을 확인할 수 있었다(도 17).

상기 신경세포군(Neu1 및 Neu2)을 좀 더 세분화하기 위하여 추가적으로 군집화를 실시하였다. 먼저 상기 신경세포군(Neu1 및 Neu2)을 재 군집화하여 각 세포군별로 가장 많이 발현되는 유전자를 기반으로 해당 세포군을 구분하였다(도 18). 그 결과, 총 13개의 세포군으로 군집화되었으며, 각 세포군별 발현된 대부분의 유전자들이 시상하부 발달과 관련되어 있음을 확인할 수 있었다. 예를 들어, PITX2는 시상하부의 발달 과정에서 특이적으로 발현되는 유전자로서 시상하부 발달에 필수적인 유전자이다(PMID: 18206388). SCGN 신경세포는 CRH-매개 스트레스 반응의 gate keeper 역할을 하는 시상하부 특이적 신경세포이다(도 19). 또한 각 신경세포군에서 발현되는 전사체(transcript), 전사 조절인자(regulon) 및 신경전달물질(neurotransmitter, NT)을 확인할 수 있었다(도 20).

성상교세포 전구세포군(APC)은 3개의 성상교세포군으로 추가 군집화하였다(도 21 내지 도 23). 도 23에 나타낸 바와 같이, Ast2군은 SLC1A3(GLAST)가 발현된 항상성에 관여하는 성상교세포 군집으로서 주로 신경세포에 영양을 공급하는 기능을 할 수 있음을 확인하였다. 또한 Ast2군은 SLCO1C1(갑상선 호르몬 수송체), CRYM(갑상선 호르몬 결합 단백질인 크리스탈린 뮤) 및 SCG2(신경내분비 분비 단백질인 세크레토그라닌 II)와 같은 유전자가 발현된 것을 바탕으로 신경내분비 기능과 관련될 수 있음을 알 수 있었다. Ast1군에서는 RSAD2 및 TRIL과 같은 면역 기능과 관련된 유전자 및 인터페론에 의해 유도되는 유전자(ISG5, IFIT 및 STAT1)가 특이적으로 발현되어 있는 것을 확인하였다. Ast3군은 성상교세포 전구세포(APC)에서 분화되어, SOX9 및 ID3와 같은 성상교세포 관련 전사인자를 발현하지만 GFAP은 발현되지 않았다. Ast3군에서는 뇌실막하층(subependymal zone)에서 NCS의 휴지 또는 활성화와 관련된 Meis2가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(PMID: 31304985). 또한, Ast3군에서는 CLDN5, ALCAM 및 COL1A2와 같은 타이트 정션(tight junction) 형성에 필요한 유전자를 발현하였다(도 24). 최근 보고된 연구에서 COL1A2는 SVZ(PMID: 34413515, PMID: 30625322)에 있는 성상교세포의 하위 집합에 의해 발현되는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 결과를 통해 Ast3군은 뇌실질세포 및/또는 뇌주위세포와 상호작용하는 "B형" 성상교세포일 것으로 가정하였다. 또한, 최근 qNSC가 시상하부 제3 뇌실의 뇌실하층에 존재한다는 보고가 있었기에, 상기 Ast3군이 qNSC일 것으로 추정하였다.

지금까지 띠뇌실막세포(tanycyte)의 발달 기원은 확인되지 않았다. 하지만 최근 띠뇌실막세포가 성상교세포 집단에서 유래했다는 보고(Romanov et al., 2020)와 유사하게, 본 발명에서 상기 단일세포 RNA 시퀀싱 분석 결과를 통해 띠뇌실막세포-유사 세포(Tan)군이 Ast2군에서 유래되었음을 확인할 수 있었다(도 14 및 도 23).

띠뇌실막세포(Tan)군의 경우 RAX, FGF10, COL25A1, CRYM 및 SCN7A와 같은 띠뇌실막세포 특이적 마커 유전자의 발현이 확인되었다. 또한, LEPR(leptin receptor)의 발현이 확인됨으로써, leptin 신호전달을 통한 대사 항상성에 띠뇌실막세포가 관여할 수 있음을 예상할 수 있었다.

상기 단일세포 RNA 시퀀싱 분석을 통해 오가노이드 유래 인간 htNSC의 신경세포 분화 방법은 생체 내 주요 시상하부 세포집단과 유사함을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 분화방법을 통해 띠뇌실막세포 및 시상하부 qNSC를 생산할 수 있음을 확인하였다.

실험결과 3. 오가노이드 유래 인간 htNSC가 이식된 마우스에서 노화 개선 효과 확인

이전 연구를 통해 마우스 유래의 htNSC를 노화 마우스에 이식하였을 시, 노화와 관련된 생리학적 변화 속도가 감소하는 것이 보고되었다(Zhang et al., 2017). 따라서, 본 발명의 hESC로부터 제작된 시상하부 유사 오가노이드 유래 인간 htNSC의 노화 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 htNSC를 12개월 된 노화 마우스에 이식하였다(도 24).

인간 htNSC는 내측기저 시상하부(mediobasal hypothalamus, MBH) 부위에 2회에 걸쳐 이식되었고, 1개월 내지 4개월 동안 추적 관찰되었다. 이때, vehicle이 주입된 마우스를 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 이식 1개월 후 마우스의 시상하부 내에서 인간 특이적 마커인 hNCAM이 발현되는 세포(hNCAM+)가 관찰되었다. 상기 hNCAM+ 세포 일부에서 htNSC 특이적 마커 단백질인 RAX의 발현이 관찰되었고, RBFOX3 또는 인간 GFAP(hGFAP) 단백질의 발현도 관찰되었다(도 25).

마우스 행동 실험 결과를 살펴보면, 이식 4개월 후, 대조군과 비교하여 인간 htNSC 이식군의 지구력(treadmill performance)(도 26)이 대조군과 비교하여 개선되었다. 또한, 이식 1.5개월 및 4개월 후에는, 대조군과 비교하여 인간 htNSC 이식군의 근지구력(grip)(도 27), 운동 조화능(rotoarod)(도 28), 활동성(locomotoactivity, 개방공간 시험)(도 29)이 개선되었다. 뿐만 아니라, 인간 htNSC 이식군의 장기 및 공간 기억력 및 인지 능력(모리스 수중미로 시험, 도 30 및 도 31)(Y 미로 시험, 도 32)(신물체탐색 시험, 도 33)도 대조군과 비교하여 개선되었다.

시상하부는 오렉신(orexin), TRH 등의 내분비 물질뿐만 아니라 교감 자율신경계를 통해 신경전달을 조절함으로써 전신 대사를 조절한다. 이러한 시상하부의 조절기능은 노화가 진행됨에 따라 손상된다고 보고되어 있다(Waterson et al., 2015, Saper et al., 2014, Gonzalez-Garcia et al., 2020). 본 발명의 인간 htNSC 이식군은 대조군과 비교하여 노화에 의한 전신 신체 대사 및 조직의 노화가 억제되었다. 도 34에 나타낸 바와 같이 인간 htNSC를 이식한 후 1.5개월(13.5개월령) 및 4개월(16개월령)에 각각 마우스의 체중을 관찰한 결과, 대조군의 체중에 비해 인간 htNSC 이식군에서는 유의적인 체중 감소가 관찰되었다(도 34).

또한, 대조군에 비하여 fat%는 감소한 반면, lean%는 유의적으로 증가하였다(도 35). 이에 반해, 음식섭취량에는 대조군 및 인간 htNSC 이식군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 대사 케이지 실험 결과에서는 도 36에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 인간 htNSC 이식군의 활동량(이식 1.5개월(13.5개월령) 후 밤 시간 동안)이 유의적으로 증가를 보였다(도 37). 또한, 이식 1.5개월(13.5개월령) 또는 4개월(16개월령) 후, 에너지 소비량(energy expenditure, EE)은 밤 및 낮 시간에서 모두 대조군과 비교하여 인간 htNSC의 이식군에서 유의하게 증가하였다(도 38). 뿐만 아니라, 인간 htNSC의 이식 4개월 후, 인간 htNSC 이식군의 내당능(glucose tolerance)도 대조군과 비교하여 유의적인 개선 효과를 나타내었다(도 39).

노화의 진행에 따라 체지방 증가뿐만 아니라 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 양 및 활성이 감소되는 것으로 알려져 있다. 상기 노화 현상에 대한 본 발명의 htNSC의 영향을 확인하기 위하여, 인간 htNSC를 이식하고 4개월 후(16개월령)에 사타구니 백색지방조직(inguinal white adipose tissue, iWAT), 부고환 백색지방조직(epididymal white adipose tissue, eWAT) 및 견갑골 내 갈색지방조직(interscapular brown adipose tissue, iBAT)을 H&E로 염색하여 각 조직을 관찰하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 인간 htNSC 이식군의 백색지방조직 및 갈색지방조직의 지방세포의 크기가 유의적으로 감소하였다(도 40 내지 도 42). 또한 간조직에도 노화와 함께 지질 축적이 증가하는데, htNSC 이식군의 간조직에서는 대조군에 비하여 지질 축적이 감소되었다(도 43).

백색지방조직(iWAT 및 eWAT) 내에서 갈색화(browning)와 관련된 미토콘드리아 항상성 유전자인 MTCO1 및 SDHB의 발현, 및 갈색지방세포 분화 및 에너지 대사 조절의 주요 조절자인 FGF21의 발현이 유의적으로 증가하였다(도 44 및 도 45). 또한, 이식군의 간조직 내에서 FGF21 및 GDF15의 발현, 및 스트레스에 의해 유도되는 전사인자 eIF2A의 인산화 및 ATF4의 발현이 증가되었다(도 46). 뿐만 아니라, 대조군에 비하여 htNSC 이식군의 신장에서는 세포 노화에 관련된 p16 및 p21 단백의 발현이 감소하였다(도 47).

시상하부는 전신 대사뿐만 아니라 골대사(리모델링 및 항상성)도 조절하는 것으로 알려져 있다(Sharan et al., 2014). 본 발명에서 12개월령의 마우스에 htNSC를 이식하고 4개월(16개월령) 후, 대퇴골을 X-선 검사를 통해 확인한 결과, 대조군의 경우 골다공증이 관찰되었으며, htNSC 이식군의 경우 대조군과 비교하여 골밀도(BMD), 골부피(BV)/조직부피(TV) 비율, 골소주 두께(Tb.Th), 골소주 개수(Tb.N) 지수에 있어서 유의적으로 증가하였다(도 48).

실험결과 4. htNSC 유래 엑소좀의 뇌실내 이식을 통한 항노화 효과 확인

최근 연구에 의해 이식된 NSC에서 분비된 엑소좀이 치료효과를 나타내는 것이 보고되었다(Zhang et al., 2017). 따라서 인간 htNSC 유래 엑소좀의 노화 예방 효과를 확인하기 위하여 인간 시상하부 오가노이드 유래 인간 htNSC의 배양액에서 엑소좀을 분리하여 12개월령 마우스의 제3 뇌실에 삼투압 펌프를 이용하여 엑소좀을 주입하였다(도 49). 그 결과 상기 인간 htNSC 이식 실험 결과와 유사하게, htNSC 유래 엑소좀을 주입한 경우, 대조군에 비하여 주입 1.5개월 및 4개월 후에 각각 운동 조화능(rotarod) 및 근력(grip)이 증가하였다(도 50 및 도 51). 또한, htNSC 유래 엑소좀이 주입된 마우스의 기억력[(수동회피시험, 도 52) 및 (모리스 수중미로 시험, 그림 53)]이 대조군에 비해 향상된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 인간 htNSC 유래 엑소좀이 잠재적으로 노화를 예방하고 치료하는 방법으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> CORESTEM, Inc <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING AGE-RELATED DISEASES COMPRISING NEURAL STEM CELLS DERIVED FROM 3D HYPOTHALAMIC ORGANOID AND USE THEREOF <130> SPD21-110-CST <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2-1 forward primer <400> 1 caggacacca tgaggaacag cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2-1 reverse primer <400> 2 gccatgttct tgctcacgtc cc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAX forward primer <400> 3 gcaaggtcaa cctaccagag gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAX reverse primer <400> 4 gcagcttcat ggaggacact tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTP forward primer <400> 5 agcttcgcca agactcacta cc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTP reverse primer <400> 6 cacggaacac gttggtcgtc tt 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISL1 forward primer <400> 7 gcagagtgac atagatcagc ctg 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISL1 reverse primer <400> 8 gcctcaatag gactggctac ca 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-1 forward primer <400> 9 ccagaccttc atctccatcg tg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-1 reverse primer <400> 10 tggcggtaga tgtggtcgaa ca 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1 forward primer <400> 11 gcaacccggc tatcctactt atg 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EN1 reverse primer <400> 12 atgtagcggt ttgcctggaa c 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB forward primer <400> 13 gtgacagcag tcggttggag 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTB reversed primer <400> 14 aacaacgcat ctcatatttg gaa 23

Claims

시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 SOX2, NESTIN 및 KI67으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신경줄기세포 마커를 발현하며, RAX, NKX2-1, ISL1, OTP 및 SF-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시상하부 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 상기 신경줄기세포 마커 및 상기 시상하부 마커가 전체 DAPI 양성 세포 집단에서 84% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 1 내지 10계대 증식 가능한 것인, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물,
제1항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 synapsin1(SYN1), TuJ1(TUBB), MAP2 및 RBFOX3(NeuN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 신경세포 마커를 발현하며, α-MSH, Neuropeptide Y(NPY), Secretagogin(SCGN) 및 PMCH로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시상하부 신경 펩타이드를 발현하는 신경세포로 분화되는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 신경세포는 leptin 및 ghrelin에 대한 반응성이 있는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 및 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 분화되어 신경줄기/전구세포군(Neural stem/progenitor cell, NSC), 중간전구세포군(Intermeidate progenitor cell, IPC), 신경세포군(Neural cell, Neu1 및 Neu2), 성상교세포 전구세포군(Astrocyte progenitor cell, APC), 성상교세포군(Astrocyte, Ast1, Ast2 및 Ast3), 띠뇌실막세포군(Tanycyte, Tan), 연합신경세포 전구세포군(Interneuron progenitor cell, Int1 및 Int2), 방사상 신경교세포군(Radial glia, RG) 및 프로테오글리칸 분비 신경교세포군(Proteoglycan-secreting glia)으로 군집화되는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 신경세포군(Neu1 및 Neu2)은 시상하부 발생에 관련된 유전자 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 및 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 성상교세포 전구세포군은
SLC1A3, SLCO1C1, CRYM 및 SCG2으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast2);
RSAD2, TRAIL, ISG5, IFITs 및 STAT1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast1); 및
SOX9, ID3, Meis2, CLDN5, ALCAM 및 COL1A2로 구성된군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 세포군(Ast3);
으로 분화하는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 띠뇌실막세포군(Tan)은 RAX, FGF10, COL25A1, CRYM, SCN7A 및 LEPR로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 발현하는 것을 특징으로 하는, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환, 골다공증 및 근육 노화 관련 질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제11항에 있어서,
상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제11항에 있어서,
상기 근육 노화 관련 질환은 근위축증, 폐용성 근위축증 및 노화성 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포로부터 분비된 엑소좀.
제14항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포 SOX2, NESTIN 및 KI67으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신경줄기세포 마커를 발현하며, RAX, NKX2-1, ISL1, OTP 및 SF-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시상하부 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
제14항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 상기 신경줄기세포 마커 및 상기 시상하부 마커가 전체 DAPI 양성 세포 집단에서 84% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
제14항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
제17항에 있어서,
상기 노인성 질환은 신경 퇴행성 질환 및 근육 노화 관련 질환인 것인, 약학 조성물.
제18항에 있어서,
상기 신경 퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
제18항에 있어서,
상기 근육 노화 관련 질환은 근위축증, 폐용성 근위축증 및 노화성 근감소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
i) 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포를 배양하는 단계; 및
ii) 상기 배양액으로부터 엑소좀을 수거하는 단계를 포함하는, 엑소좀 제조 방법.
시상하부 오가노이드 유래 신경줄기세포; 및/또는 제14항의 엑소좀을 포함하는 노인성 질환 예방 및 치료용 키트.
제22항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포 SOX2, NESTIN 및 KI67으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신경줄기세포 마커를 발현하며, RAX, NKX2-1, ISL1, OTP 및 SF-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 시상하부 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는, 키트.
제22항에 있어서,
상기 시상하부 유사 오가노이드 유래 신경줄기세포는 상기 신경줄기세포 마커 및 상기 시상하부 마커가 전체 DAPI 양성 세포 집단에서 84% 이상 발현하는 것을 특징으로 하는, 키트.