KR20070032311A - 신경줄기세포 - Google Patents

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KR20070032311A
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루치아노 콘티
스티븐 마이클 폴라드
오스틴 제라드 스미스
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더 유니버시티 코트, 더 유니버시티 오브 에딘버러
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Abstract

부착 신경줄기세포의 균일한, 대칭적으로 분열하는 집단이 선택적으로 FGF 수용체 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자와 조합된, EGF 수용체 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자를 이용하여, ES 세포들 또는 태아 뇌 분리체 또는 성체 뇌 분리체로부터 수득된다. 신경줄기세포 집단은 매우 순수하며 100회 이상의 계대 후에 뉴런으로 분화되는 능력을 유지한다.
신경줄기세포, EGF 수용체, FGF 수용체, 계대

Description

신경줄기세포{Neural stem cells}
본 발명은 신경줄기세포 및 신경줄기세포의 대칭적 분열(symmetrical division) 및 자가 분열(self-renewal)을 촉진하기 위한 신경줄기세포의 배양 조건 및 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 조성물, 세포 집단(cell population), 세포주(cell line) 및 단일 신경줄기세포도 제공된다.
신경줄기세포는 다양한 출처로부터 체외에서 분리되는 것으로 주장되었으나, 현재까지 대칭적으로-분열하는, 비분화 상태의 대규모 배양에서 세포들을 확장하는 것은 가능하지 않다. 이 상태에서 세포들의 장기적 확장(expansion)은 실험 및 치료적 관점에서 모두 매우 바람직할 것이다. 순수한 신경줄기세포 집단을 갖는 것은 은 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)의 세 종류의 세포들로의 방향성 분화(directed differentiation)를 가능하게 할 것이다.
세포들의 이질적 집단에서 소수 성분(minor component)으로서이기는 하나, 신경줄기세포를 배양하는 공지된 일 방법은 신경구(neurosphere) 시스템이다. 이 시스템은 이질적 세포들의 집합체(aggregate)의 계대 배양(serial passaging)을 포함하며, 이들 중 작은 부분만이 진정한 신경줄기세포이다. 신경구의 대부분의 세포 들은 수임 전구세포(committed progenitor)이다.
신경구의 이질성(heterogeneity) 및 불안정성, 및 뉴런을 생성하는 제한적인 능력에 대한 다수의 보고가 있다(예를 들면, Morshead et al., 2002). Rappa et al. Neuroscience 2003은 신경구 세포들을 1-7일 동안 피브로넥틴 상에 평판 배양(plating)하고 그 후 신경구를 재형성(reform)하는 것에 의한 신경구 세포들의 형질감염(transfect) 방법을 보고하나, 신경구 내에 존재할 수 있는 줄기세포들의 유의성 있는 특성 규명(characterization)은 제공하지 않는다.
Suslov et al 2002는 신경구 시스템은 너무 이질적이어서 그 내부에 존재하는 줄기세포의 의미 있는 특성 규명이 불가능하다는 명확한 데이터를 제공한다. 주요 결론은 신경구 내에 이질성이 있을 뿐 아니라-"클론 내 신경세포-계통 다양성(intra-clonal neural cell-lineage)을 보이고, 즉, 그들은 NSC(신경줄기세포) 외에, 상이한 분화 상태에 있는 뉴론 전구세포(neuroal progenitor) 및 신경아교 전구세포(glial progenitor)를 포함하고" - 또한, 상이한 클론 신경구 라인(clonal neurosphere line) 간에 유전자 발현 프로파일에 큰 차이가 존재한다는 것이다. Suslov의 유전자 발현 프로파일링은 그 논문에서 명확하게 확인된 바와 같이 신경구 내에 있는 줄기세포들의 정의를 구성하지 않는다: - "수득된 분자적 표현형은 본 시스템 내의 클론원성(clonogenic) NSC가 이질적이며, 서브세트들은 별개의 신경 발달적 수임(neural developmental commitment)를 반영한다".
이 분야의 많은 문헌은 신경아교세포(glial cell)의 특성들을 기술한다. Skogh et al. MCN 2001은 GFAP를 발현하고 RC2 및 네스틴(nestin)에 대해 가변적으 로 염색되는 신경아교세포의 배양을 기재한다-마우스 GFAP는 체내에서 방사아교세포(radial glia)에서 발현되지 않는다는 것이 주목된다(Rakic, 2003). 그들은 그들의 세포들이 신경원성(neurogenic) 방사아교세포의 대표적 특징인, Pax6를 발현하지 않고 (Malatesta et al., 2001, 2003), 다른 방사아교세포 마커들을 조사하지 않는다고 보고한다. 그들은 이질적인 배양들을 가졌고 클론 분석은 수행하지 않았다.
체외에서 방사아교세포의 다른 설명들은 그들을 분화 중간체(differentiation intermediates) 또는 최종 생성물로 고려한다. 따라서, Bibel et al(NatNeurosci, 2004)은 ES 세포로부터 일시적인 방사아교-유사 세포(transient radial glia-like cell)를 통한 뉴런의 생성을 보고하고, Gregg 및 Weiss (J Neurosci, 23: 11587-601,2003; US공개특허 2003/0032181)는 신경구 세포들의 방사아교세포로의 "분화"를 기술한다. Hartfuss et al(Dev Biol, 2001)는 방사아교세포가 신경구에 존재한다는 것을 보여준다.
Gregg 및 Weiss는 방사아교세포가 신경구의 분화 산물이라는 것을 발견하고, "이 결과들은 신경줄기세포가 RGC[방사아교세포]를 생성할 수 있고, 성체 CNS에서 RGC-유도 이동(RGC-guided migration)이 재현될 수 있다"고 결론지었다. 일반적인 견해는 방사아교세포는 신경구로부터 유래된 분화된 세포 유형들 중 하나라는 것이다.
Liour 및 Yu (Glia,2003)는 방사아교세포 분화는 ES 세포들로부터 수득될 수 있다는 것을 보여주나, 이 분야의 다른 보고서들과 같이, 신경원성 방사아교세포의 확장은 보고하지 않는다.
Gobbel et al. Brain Res 2003은 다분화능(multipotent) 랫트 세포들의 증식을 "기판(substrate)에 느슨하게 부착하여 성장하는 세포들의 구형 집단(spherical cluster)"으로, 즉, 균일한 단일층으로의 증식이 아닌 것으로 기재한다. 또한, 이 논문의 초록은 "이 세포들은 3회의 분열 중 약 2회에서 유사후분열 세포(postmitotic cell)을 생성하여, 확장을 어렵게 한다"라고 결론짓는다. 그들의 배양에 광범한 신경아교세포원성(gliogenic) 분화가 있으나, 저자들은 "비교적 작은 수의(relatively few)"(<3%)의 뉴런을 발견한다. 그들은 그 세포들의 분자적 표현형을 제공하지 않는다.
WO 01/30981는 뉴런으로 분화될 수 있는 세포들의 배양을 기술한다. 그러나, 이 세포들은 GFAP 및 네스틴에 대해 양성이고 성상아교세포(astroglial cell)로 기술되며 비교적 순수하지 않고, 혼합된 집단이다.
줄기세포들은 특정한 세포적 미세환경(microenvironment) 또는 적소(niche)를 필요로 한다는 것이 줄기세포 생물학의 정설이다. 항상 인정되는 것은 아니나, 신경구에서 줄기세포들은 전구세포들, 모세포들(blast cells) 및 미성숙 분화 자손(progeny) 중 전체 세포들의 소 분획만을 구성한다는 것이 알려져 있다. 이와 같은 혼합된 세포 유형들의 집합은 그 내부에 줄기세포들일 수 있는 작은 비율의 세포들에 대한 적소(niche)를 구성할 수 있다.
문헌에 ES 세포들로부터 신경줄기세포의 동질적인 집단을 유도하는 것에 관한 보고는 없고, 신경아교세포-한정적(glial-restricted)이 되기 전에 일시적으로 확장될 수 있는 신경상피 전구 세포(neuroepithelial precursor cells)를 유도하는 것에 관한 보고만 있다(예를 들면, Brustle et al., Science 1999).
따라서, 본 발명이 속하는 기술 분야에 다수의 문제들이 존재한다.
모든 보고는 그들의 배양체(culture)가 이질적이라는 것을 인정한다. 대칭적으로 분열하고 비분화된 상태인 신경줄기세포의 대규모 배양을 유지하기 위해 신경구 시스템을 이용하는 것은 가능하지 않았다. 다수의 신경줄기세포들을 배양하려는 다른 시도들은 5-20회 계대배양 이상 성공하지 못했고, 또한 세포들의 분화하려는 높은 경향 때문에 방해되었다. 한 가지 예외는 성숙된 랫트의 해마 줄기세포(hippocampal stem cell)에 대한 연구이나, 이들은 핵형상(karyotypically) 비정상이고 저효율로 뉴런을 형성한다.
일시적인 신경 발달 전구체(transient neural developmental precursor)가 알려져 있으나, 영구적인 또는 거의-영구적인(nearpermanent) 자가-분열능 줄기세포들은 분리되어 정제되지 않았다.
ES 세포들로부터 신경줄기세포를 유도하고, 그 후 이 신경줄기세포들을 순수-배양으로 유지하는 것이 바람직하나 현재까지 이는 가능하지 않다. 또한 이식을 위해 ES 세포들로부터 신경줄기세포를 유도하는 것이 바람직하나 공지된 ES-유래 세포 집단에서 ES 및 기타 비-신경 세포의 영속성(persistence)이 이식 수혜 동물(recipient animal)에서 종양을 초래한다. 또한 태아 및 출생-후(post-natal) CNS로부터 순수한 신경줄기세포 집단을 수득하는 것이 더 바람직하다.
신경줄기세포의 거동을 제어하는 분자 및 세포 수준의 사건들에 대한 완전한 이해가 배발생을 이해하는 경로로서뿐 아니라, 신경줄기세포들이 미래의 치료적 응용을 위해 분리, 확장 및 제어될 수 있는 기반(framework)으로서 필수적이다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 신경줄기세포의 배양 방법은 전술된 이유들 때문에, 그와 같은 조사 및 치료적 응용에 적합하지 않다. 따라서, 그 세포들이 대칭적으로 분열하고, 자가-분열능을 갖는 상태로 유지될 수 있게 하는 대량의 신경줄기세포들의 배양 방법 및 조건을 개발하는 것이 바람직하다. 한정 배지(defined media)의 이용이 임상적 환경에서는 매우 바람직하므로 전술된 요건들을 충족시키는, 한정 배양 배지를 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 전술된 하나 또는 그 이상의 문제들을 해결한다.
보다 상세하게는, 본 발명은 신경줄기(NS) 세포의 대칭적 분열을 촉진하는 방법으로서, 상기 세포들을:-
(a) EGF 패밀리의 수용체 하류(downstream)의 신호전달 경로의 활성자(activator); 및
(b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 세포들은 혈청의 부재 하에, 예를 들면, 혈청 및 혈청 추출물을 포함하지 않는 배지에서 배양된다. 또한, 세포들이 부착배양(adherent culture)로 지칭되는, 기판(substrate)에 부착되어 배양되는 것이 바람직하다. 또한, 배양 배지는 인슐린이나 또는 세포들 상의 인슐린 수용체의 또 다른 아고니스트(agonist)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상황에서, "촉진하는(promoting)"이라는 용어는 신경줄기세포의 대칭적 분열 상태에서의 유지를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다수의 계대 배양 동안 비분화된 상태의 신경줄기세포의 자가-분열 및 대칭적 분열을 지원하고 바람직하게는 촉진하는 배양 배지가 제공된다. 그 배지는 실질적으로 신경줄기세포의 비대칭적 분열 및 분화를 방지한다.
본 발명은 또한 신경줄기세포를 수득하는 방법을, 구체적으로는 본 명세서의 프로토콜에 기재된 바와 같은 방법을 제공하고 추가적으로 그와 같은 방법에 의해 수득되는 세포들을 제공한다.
본 발명은 또한 신경세포 집단, 조성물, 세포주, 클론원성 세포주, 및 자가- 분열능을 가지며, 대칭적으로-분열하는 단일 신경줄기세포를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양태들은 ES 세포들의 신경줄기세포로의 분화를 촉진하는 방법, 및 상기 수득된 신경줄기세포들을 자가-분열능을 가지며, 대칭적으로 분열하는, 실질적으로 비분화된 상태로 유지하는 방법을 제공한다.
정의 섹션
"신경줄기세포(Neural stem cells)"
본 명세서에서 사용된 "신경줄기세포"라는 용어는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능(potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다.
신경줄기세포는 대칭적으로, 또는 비대칭적으로 분열할 수 있다. 대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 두 개의 딸 신경줄기세포 또는 두 개의 수임 전구세포를 형성할 수 있고, 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 대칭적 분열은 대칭적 자가-분열(self-renewal)을 의미하고; 비대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 하나의 딸 신경줄기세포 및 하나의 수임 전구세포(예를 들면, 뉴런 전구세포 또는 신경아교 전구세포)를 형성한다.
본 발명의 신경줄기세포는 방사아교세포로 기술될 수 있고, RC2, 3CB2, GLAST, BLBP 및 Pax6의 방사아교세포 마커들 중 하나 이상(바람직하게는, 모두)을 발현하는 것으로 입증되었다. 바람직하게는, 본 발명의 신경줄기세포는 RC2, 3CB2 및 GLAST를 발현한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 신경줄기세포는 RC2, 3CB2, GLAST 및 적어도 하나의 BLBP 또는 Pax-6을 발현한다. 본 발명의 신경줄기세포는 또한 신경 전구세포 마커(neural precursor marker)인 네스틴(nestin) 또는 비멘틴(vimentin), LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌(prominin) 중 하나 이상(바람직하게는 모두)의 발현에 대해 양성이고, Oct-4 또는 Nanog 중 하나 이상(바람직하게는 양자 모두)의 발현에 대해 음성인 것을 특징으로 한다(실시예 1-3 참조).
본 발명의 신경줄기세포는 다분화능(multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다. 하기의 실시예들은 본 발명의 방법에 따라 배양된 신경줄기세포들이 그들의 분화능을 유지하고 모든 예상되는 세포 유형들로 분화될 수 있다는 것을 확인한다.
"신경줄기세포의 출처(Sources of neural stem cells)"
다양한 출처로부터 본 발명의 신경줄기세포를 유도하는 것이 가능하다. 예를 들면, 신경줄기세포는 배아, 성체 조직, 태아 조직, 배아줄기(ES) 세포(야생형 ES 세포 또는 유전적으로 변형된 ES 세포)로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 신경줄기세포는 마우스 ES 세포 또는 인간 ES 세포로부터 유래되거나, 또는 마우스 태아세포 또는 인간 태아세포로부터 유래된다.
본 발명의 신경줄기세포는 특히, 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 신경줄기세포는 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래된다.
"EGF 수용체 패밀리"
본 명세서에서 사용된 "EGF 수용체 패밀리(EGF receptor family)"라는 용어는 EGF 신호전달 인자들(EGF signalling factors)의 패밀리에 의해 활성화될 수 있는 수용체의 패밀리(통상적으로, 동형이합체성(homodimeric) 또는 이형이합체성(heterodimeric) 수용체)를 의미한다. 수용체들은 4개의 고도로 상동적인 막관통 당단백질(homologous transmembrance glycoprotein)의 패밀리로 구성된다: ErbB-1(EGF-R로도 알려짐), ErbB-2, ErbB-3 및 ErbB-4.
"EGF 수용체"에 대한 지칭은 EGF 수용체 패밀리의 단량체성 또는 이합체성 수용체 복합체를 포함한다.
각 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인, 단일 소수성 막-통과(membrance-spanning) 도메인 및 타입-1 수용체 티로신 키나아제 활성을 통한 신호 전달을 담당하는 세포질 티로신 키나아제 도메인(cytoplasmic tyrosine kinase domain)을 갖는다. 상기 수용체들에 대한 리간드 결합은 수용체 이합체화(dimerisation) 및 자가인산화(autophosphorylation)를 초래하고, 일련의 생물학적 효과를 가져오는 다수의 세포성 기질(cellular substrates)의 인산화로 이어진다. 수용체 이합체화는 수용체 리간드 및 UV 조사와 같은 독성 환경적 자극을 포함한 다양한 자극에 의해 유발될 수 있다. 각각의 이합체성 수용체는 상이한 SH2-함유 이펙터(effector) 단백질을 채용하는 것에 의해 개별적인 신호전달 경로를 개시한다. 예를 들면, EGF-R 이합체는 구아닌 뉴클레오티드 방출 인자, SOS에 결합된, 어댑터 단백질 Grb와 복합체를 형성한다. Grb-SOS 복합체는 수용체의 인산티로신(phosphotyrosine) 부위에 직접 결합하거나 또는 Shc를 통해 간접적으로 결합할 수 있다. 이와 같은 단백질의 상호작용은 SOS가 Ras와 근접하게 위치하게 하여, Ras 활성화를 가능하게 한다. 이는 뒤이어 ERK 및 JNK 신호전달 경로를 활성화하고 이는 유전자 발현을 조절하는 c-fos, AP-1 및 Elk-1과 같은 전사 인자들을 활성화한다. EGF 수용체들은 또한 PLCγ 신호전달 경로를 활성화할 수 있다.
"FGF 수용체"
본 명세서에서 사용된 "FGF 수용체"라는 용어는 막관통 FGF 수용체 티로신 키나아제의 패밀리의 구성원을 의미한다. FGF 수용체의 4개의 주요한 이소형(isotype), FGFR1, FRFR2, FGFR3 및 FGFR4가 있고, 그들은 헤파린 및 헤파린 술페이트(HS) 시스템과 긴밀하게 결합되어 작용하는 것으로 알려져 있다. FGF 수용체에 대한 지칭은 FGF 수용체 패밀리의 단량체성 또는 이합체성(동형이합체성 또는 이형이합체성) 복합체를 포함한다.
FGF 수용체와 관련된 세포성 신호전달 경로는 MAP 키나아제 경로 및 PCLγ 경로를 포함한다.
"배양 배지(Culture Media)"
본 발명에서 사용되는 배양 배지는 바람직하게는 기초 배지(basal medium)를 함하고, 선택적으로 추가적인 성분으로 보강된다.
기초 배지는 신경줄기세포를 위한 탄소 및/또는 비타민 및/또는 미네랄의 필수적인 원천(source)을 공급하는 배지이다. 기초 배지는 일반적으로 단백질을 포함하지 않고 그 자체로는 신경줄기세포의 자가-분열/대칭적 분열을 지원할 수 없다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 배양 배지는 정의되지 않은 구성성분(예를 들면, 혈청 및/또는 영양 세포(feeder cell)), 즉, 함량이 알려지지 않거나 또는 특정되지 않은 다양한 인자들을 포함할 수 있는 성분들을 포함하지 않는다. 혈청 및 혈청 추출물을 포함하지 않는 완전히 정의된 배지를 이용하는 장점은 신경줄기세포의 배양 및 추후 조작을 위한 효율적이고 일관된 프로토콜이 유도될 수 있다는 것이다.
"배양 표면(Culture Surfaces)"
본 발명의 모든 양태에서 신경줄기세포의 배양을 위한 통상적인 표면은 본 발명이 속하는 기술분야에서 세포 배양에 유용한 것으로 인식된 배양 표면이고, 이들은 플라스틱, 금속, 복합물을 포함하나, 널리 상업적으로 입수가능한 플라스틱 조직 배양 플레이트와 같은 표면이 통상적으로 이용된다. 그와 같은 플레이트들은 종종 직경이 수 센티미터이다. 규모 확장을 위해서, 이와 같은 유형의 플레이트는 훨씬 큰 직경으로 이용될 수 있고 다수의 반복 플레이트 단위(repeat plate unit)들이 이용될 수 있다.
배양 표면은 또한 일반적으로 그 표면상에 코팅된, 세포 부착 단백질(cell adhesion protein)을 더 포함할 수 있다. 줄기세포 상에 존재하는 수용체 또는 다른 분자들은 세포 부착 단백질 또는 다른 세포 배양 기판에 결합되고 이는 표면으로의 부착을 촉진하고 성장을 촉진한다. 젤라틴 코팅된 플레이트들이 특히 바람직하다.
본 발명은 EGF 수용체의 아고니스트, 또는 EGF 및 EGF-2 수용체 모두의 아고니스트를 포함하는 배지에서 기판에 부착된 신경줄기세포의 배양이 줄기세포의 무제한의, 대칭적 분열을 촉진하고, 실질적으로 그들의 뉴런/신경아교세포로의 분화를 방지한다는 발견에 근거한다.
본 발명의 다양한 양태들이 상세하게 기술된다.
본 발명의 제1 양태는 신경줄기(NS) 세포들의 대칭적 분열을 촉진하는 방법으로서 상기 세포들을:-
(a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및
(b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
신경줄기세포를 수득하는 본 발명의 또 다른 방법은:-
(1) 신경줄기세포를 포함하는 세포들의 혼합된 집단을 수득하는 단계;
(2) 상기 세포들을 (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및 (b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에 다시 평판배양(replating)시키는 단계;
(3) 상기 세포들을 배양하는 단계;
(4) 세포들의 집합체(aggregate)를 채취하는 단계;
(5) 상기 세포들을 (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및 (b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에 평판배양시키는 단계;
(6) 상기 세포들을 배양하는 단계;
(7) 상기 세포들을 (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및 (b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에 단일 세포들로서 재평판배양시키는 단계;를 포함한다.
본 발명의 방법은 신경줄기세포 특이적 마커를 발현하는 세포들을 선택하는 단계, 예를 들면, 그와 같은 마커의 발현을 그의 분화된 자손에서의 발현에 비해 신경줄기세포에서 우세한 활성을 갖는 프로모터에 연결하는 단계에 의해 보강될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 세포들을 65% 또는 그 이하의 합류점(confluence), 보다 바람직하게는 55% 또는 그 이하의 합류점, 특히 50% 미만의 합류점에서 계대(passage)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 다른 바람직한 특징들은 실시예 9의 본 발명의 프로토콜에 기재된 바와 같다.
본 발명의 배양은 바람직하게는 부착 배양(adherent culture)이고, 즉, 세포들이 기판에 부착된다.
기판은 통상적으로 배양 용기 또는 또 다른 물리적 지지체, 예를 들면, 배양 디쉬, 플라스크, 비드 또는 다른 담체의 표면이다. 바람직하게는, 기판은 세포들의 부착을 개선하기 위해 코팅되고 접합한 코팅은 라미닌, 폴리라이신, 폴리-오르니틴 및 젤라틴을 포함한다. 세포들이 현탁액이 아니고 세포들의 볼(ball) 또는 덩어리(cluster)가 아니며 단일층 배양으로 배양되는 것이 바람직하다. 보다 높은 밀도에서, 세포들은 상호 간에 겹쳐져 쌓이기 시작할 수 있으나, 배양체는 본질적으로 기판에 부착된 단일층이거나 또는 단일층으로서 개시된다.
EGF 패밀리의 수용체 하류의 하나 이상의 신호전달 경로들은 바람직하게는 EGF 패밀리의 수용체의 아고니스트를 이용하여 활성화될 수 있다. EGF 패밀리의 수용체의 아고니스트는 적합하게는 신호전달 인자들의 EGF 패밀리의 구성원이고, 바람직하게는 EGF 수용체의 세포외 도메인에 결합된다. "아고니스트(agonist)"라는 용어는 EGF 패밀리의 수용체들을 활성화시킬 수 있는, 신호전달 인자들의 EGF 패밀리에 대한 모방체(mimetics), 융합 단백질, 항체 또는 키메라(chimera) 및 그들의 단편, 변이체 및 유도체를 포괄한다.
신호전달 인자들의 EGF 패밀리를 구성하는 분자들은 그들이 하나 이상의 EGF-유사 도메인을 포함한다는 것에 의해 특징지워질 수 있다. 이 도메인은 디술피드 결합의 형성을 통해 3개의 펩티드 루프를 생성하는 6개의 시스테인 잔기들에 의해 한정될 수 있다.
EGF 수용체 패밀리의 수용체를 통해 작용할 수 있고, 따라서 이 수용체들의 하류 경로들을 활성화시킬 수 있는 특정한 아고니스트들은 EGF, TGF-α, 암피레귤린(amphiregulin), 헤파린 결합-EGF, 에피레귤린(epiregulin), 베타셀룰린(betacellulin), 뉴레귤린(neuregulins) 1-4, 및 크립토(Cripto)-1을 포함한다. 바람직하게는, 아고니스트는 EGF 자체이다.
FGF의 수용체 하류의 하나 이상의 신호전달 경로들은 바람직하게는 FGF의 수용체의 아고니스트를 이용하여 활성화될 수 있다. FGF의 수용체의 아고니스트는 적합하게는 신호전달 인자들의 FGF 패밀리의 구성원이다. "아고니스트"라는 용어는 FGF의 수용체들을 활성화시킬 수 있는, 신호전달 인자들의 FGF 패밀리에 대한 모방체(mimetics), 융합 단백질, 항체 또는 키메라(chimera) 및 그들의 단편, 변이체 및 유도체를 포괄한다.
바람직하게는, FGF 수용체의 아고니스트는 FGF-2, 또는 라미닌-FGF이다.
EGF 수용체 패밀리의 수용체 또는 FGF 수용체의 하류의 신호전달 경로의 활성화는 개별적인 신호 전달 경로의 구성적으로 활성인(constitutively active) 수용체, 또는 하류 이펙터(downstream effector)(예를 들면, MEK 또는 Bcl2)에 의해 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 신호전달 경로들은 각각의 수용체를 우회하고 직접 신호전달 경로들을 활성화시킬 수 있는 세포-투과성 소형 분자들에 의해 활성화된다. 따라서, 본 발명에서, "활성자(activator)"라는 용어는 EGF 수용체 패밀리의 수용체 또는 FGF 수용체의 하류에 있는 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 모든 분자들을 포괄한다.
본 발명의 신경줄기세포 배양의 유지에서 활성자의 효과는 하기의 실시예 1-1 및 1-2에서 설명된다. 여기에서, 신경줄기세포들의 벌크(bulk) 집단 및 클론 집단은 EGF 및 FGF-2를 포함하는 배지에서 유지되고 복수 회 계대될 수 있다. 또한, 테스트된 세포 집단에서 신경줄기세포 마커의 편재하는 존재에 의해 보는 바와 같이, 신경줄기세포의 분화가 미미하거나/없고(실시예 1-3 참조), 그들은 그들의 분화능을 유지하고 모든 예상되는 세포 유형들로 분화될 수 있다(실시예 1-4 참조).
따라서, 본 발명은 자가-분열능을 가지며, 대칭적으로 분열하는, 비분화 상태에 있는 신경줄기세포의 대집단을 유지하는 효율적인 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 신경줄기세포를 포함하는 조성물로서, 상기에서 상기 신경줄기세포들은 부착 배양 상태이고 상기 조성물의 세포들의 50%, 70% 또는 80% 이상은 신경줄기세포인 것인 조성물을 포함한다. 신경줄기세포들의 비율은 바람직하게는 90% 이상이고, 보다 바람직하게는 95% 이상이고, 매우 바람직하게는 97% 이상이다. 또한, 본 발명의 신경줄기세포는 광범위하게 계대될 수 있다. 신경줄기세포는 30회 이상, 보다 바람직하게는 60회 이상, 매우 바람직하게는 90회 이상 계대되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 신경줄기세포의 집단에서, 상기 세포들의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상은 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포이다. 이 조성물의 세포들은 단독으로 또는 조합된 본 발명의 모든 특징들에 의해 보다 특징지워질 수 있다.
또한, 신경줄기세포;
EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및
FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 조성물들을 제공한다.
조성물은 바람직하게는 기초 배지를 포함한다. 또한, 상기 조성물의 신경줄기세포들의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%가 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포인 것이 바람직하다.
전술된 신경 세포 집단 및 조성물들 모두에서, 신경줄기세포는 바람직하게는 종양발생 유전자(oncogene)을 코딩하는 외생 유전 물질을 포함하지 않고, 즉, 그들은 불멸화(immortalizaiton) 전략을 거치지 않았다. 특정 구체예들에서, 집단/조성물의 신경줄기세포들은 그들이:
신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴;
Sox-2;
방사아교세포 특이적 마커들 RC2, 3CB2, GLAST, BLBP 또는 Pax-6;
LewisX 항원;
Musashi-1; 및
프로미닌; 중 하나 이상의 발현에 대해 양성이고; 및
Oct4, 및
Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 세포들은 RC2, 3CB2 및 GLAST의 발현에 대해 양성이다. 다른 구체예들에서, (선택적으로 선행된 마커 프로파일 외에) 세포들은 BLBP, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴, 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌 중 하나 이상의 발현에 대해 양성이다. 특히 바람직한 구체예들에서, (선택적으로, 선행된 마커 프로파일 외에) 세포들은 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성이다.
추가적인 구체예들에서, (선택적으로, 전술된 마커 프로파일 외에) 세포들은 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성이다. 마우스-유래의 NS 세포들을 포함하는 특정 조성물/집단에서, 세포들의 1%를 넘지 않는 비율이 GFAP 또는 βIII 튜블린의 발현에 대해 양성이고, 이에 의해 세포들의 성상세포(astrocyte) 또는 뉴런으로의 분화가 미미하다는 것이 확인된다. 다른 조성물/집단에서, 세포들의 1%를 넘지 않는 비율이 성숙된 성상세포, 뉴런 또는 희소돌기아교세포에 대한 마커의 발현에 대해 양성이다.
본 발명은 또한 랫트 세포들로 수행되었다. 따라서, 본 발명자들은 랫트 CNS로부터 세포들을 채취하고 본 발명의 방법을 이용하여 (i) 고순도, 통상적으로 80% 또는 90%를 초과하는 비율의 랫트 신경줄기세포의 구성, 및 (ii) 다수의 배가(doubling) 후에, 50회 이상, 100회 이상, 심지어 200회 이상의 배가 후에 뉴런 및 신경아교세포를 형성하는 능력을 보유하는 세포들의 높은 비율(50% 이상)이라는 특성을 갖는 랫트 신경줄기세포의 배양을 수득했다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서, 랫트에서 유래한 세포들은 명확하게 고도로 이질적이고 성숙된 해마상 융기(adult hippocampus)로부터만 유래한다. 본 발명자들은 이 출처로부터 세포들을 수득하지 않고, 대신에 랫트의 CNS로부터 수득했다. 이 점에서 본 발명의 방법은 랫트, 마우스, 인간의 세 종 모두에서 작용했다는 것이 주목할 만하다. 일반적으로 본 발명의 방법 후에 단일 세포가 신경줄기세포 콜로니를 형성한다면, 그 콜로니의 세포들로부터 뉴런을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 이는 예를 들면, (i) 핵들(즉, 모든 세포들을 염색함) 및 (ii) 뉴런들(즉, 뉴런만 염색함)을 별도로 염색하는 것에 의해 측정된다. 염색된 세포들의 상대적인 수를 비교하여, 뉴런을 형성하는 세포들의 비율이 계산될 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 신경줄기세포를 제조하는 방법으로서, (i) 전술된 방법에 따라 신경줄기세포를 배양하여 신경줄기세포의 배양체(culture)를 수득하는 단계, 및 (ii) 상기 배양체로부터 신경줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 분리된 신경줄기세포는 대칭적 방식으로 분열하도록 조절된 세포이다.
신경줄기세포들이 유래되는 세포들의 다수의 출처들이 이용될 수 있다. 일 방법에서, 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포의 배양체를 얻기 위해, 세포들을 동물의 신경 조직으로부터 수득하여 본 발명의 방법에 따라 배양한다. 신경 조직은 성체 조직 또는 태아 조직으로부터 유래될 수 있다. 신경조직은 CNS로부터 유래될 수 있고, 신경줄기세포의 대칭적으로 분열하는 집단은 인간 및 마우스로부터의 성체 CNS 및 태아 CNS로부터 채취된 추출물로부터 수득될 수 있다. 신경 조직은 바람직하게는 방사아교세포 표현형(radial glial phenotype)을 갖는 것으로 확인되고, 예를 들면, 이 표현형을 갖는 세포들은 소뇌 및 망막으로부터의 추출물에서 확인되었고, 소뇌 및 망막은 모두 세포들의 적합한 출처를 나타낸다. 신경줄기세포는 질병을 모델링하기에 유용한, 질병 상태의(diseased) 신경 조직으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들면, 이 목적을 위해 뇌종양으로부터 세포들이 수득될 수 있다.
한가지 옵션은 질병 상태의 개인으로부터 신경줄기세포를 얻고, (i) 그 세포들을 분석(assay)을 위해 이용하거나, 또는 (ii) 동일한 개인에게 세포들을 다시 이식하기 전에 유전적 변형을 수행할 수 있다. 따라서, 세포들은 알쯔하이머 병, 파킨슨 병을 포함하는 신경 퇴행성 질환; 또는 뇌종양을 가진 개인으로부터 수득될 수 있다.
신경줄기세포를 수득하는 또 다른 방법은:
(i) 신경줄기세포로 분화될 수 있는 다분화능 또는 전분화능(multipotent or pluripotent) 줄기세포를 얻는 단계,
(ii) 상기 단계 (i)의 세포를 전분화능 세포들에 대해 비-허용적(non-permissive)인 배지에서 (a) EGF 패밀리의 수용체의 하류에 존재하는 신호전달 경로의 아고니스트 및 (b) FGF 패밀리의 수용체의 하류에 존재하는 신호전달 경로의 아고니스트의 존재 하에 배양하는 단계를 포함한다.
이용 시, 잠재적으로 오염시킬 수 있는 ES 세포들을 이 방법에 의해 제거하거나, 실질적으로 그 수를 감소시켜, 보다 순수한 배양체 및 이식 시 또는 테라토마(teratoma)를 생성할 가능성이 보다 낮은 배양체를 제공한다.
줄기세포는 적합하게는 전분화능 줄기세포, 특히, ES 또는 EG 세포이다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 EGF 수용체의 아고니스트 및 FGF 수용체의 아고니스트의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 NS 세포들을 이용하여, 본 발명자들은 EGF 및 FGF를 제거하고 혈청 또는 BMP4를 첨가하여 성상세포들을 수득하고, 본 발명자들은 EGF를 제거하고, 약 1주의 간격 후에 FGF를 제거하고 세포들을 라미닌 상에 평판배양하여 뉴런을 수득하며, EGF와 FGF를 모두 제거하여 희소돌기아교세포를 수득했다. 일반적으로, 신경줄기세포를 생성하기 위해 이용된 본 발명의 모든 방법들은 선택적으로 신경줄기세포를 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포로 분화시키는 추가적인 단계를 포함하고, 그 후, 선택적으로 상기 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포를 예를 들면, 분석, 이식 등에서 이용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일단 신경줄기세포 배양체가 분리되면, 신경줄기세포주를 수립하기 위해 이용될 수 있다. 그와 같은 세포주의 수립은 바람직하게는:-
(a) 단일 신경줄기세포를 수득하는 단계,
(b) 전술된 방법들 중 하나에 따라 상기 신경줄기세포를 배양하고, 이에 의해 신경줄기세포의 클론 집단을 수득하는 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 세포주를 수립하기 위해 이용된 단일 신경줄기세포는 대칭적으로-분열하는 신경줄기세포, 또는 대칭적 방식으로 분열하도록 조절된 신경줄기세포이다. 바람직하게는, 상기 단일 신경줄기세포는 신경줄기세포를 얻기 위한 전술된 방법에 따라 수득된다.
바람직한 구체예에서, 전술된 방법에 의해 수득된 신경줄기세포주는 신경줄기세포의 클론 집단, 즉, 모든 세포들이 단일 신경줄기세포의 자손인 집단이다.
단일 신경줄기세포 및 세포주(선택적으로 전술된 방법들에 의해 수득가능함)는 또한 본 발명의 일부분을 형성한다. 제1 구체예에서, 세포들이 EGF 수용체 패밀리의 수용체의 하류에 있는 신호전달 경로의 활성자, 및 FGF 수용체의 하류에 있는 신호전달 경로의 활성자의 존재 하에 유지될 수 있는 세포주들이 제공된다. 다른 구체예들에서, 단일 신경줄기세포 및 세포주의 세포들은 그들이:-
신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴;
Sox-2;
방사 아교세포 특이적 마커들 RC2, 3CB2, GLAST, BLBP 또는 Pax-6;
LewisX 항원;
Musashi-1; 및
프로미닌; 중 하나 이상의 발현에 대해 양성이고; 및
Oct4, 및
Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 세포는 RC2, 3CB2 및 GLAST의 발현에 대해 양성이다. 다른 구체예들에서, (선택적으로, 선행된 마커 프로파일 외에) 세포들은 BLBP, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴, 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌 중 하나 이상의 발현에 대해 양성이다. 특히 바람직한 구체예들에서, (선택적으로, 선행된 마커 프로파일 외에) 세포들은 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성이다.
다른 특정한 구체예들에서, (선택적으로, 전술된 마커 프로파일 외에) 세포들은 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성이다. 특정한 마우스-유래의 세포주들에서, 세포들의 1%를 넘지 않는 비율이 GFAP 또는 βIII 튜블린의 발현에 대해 양성이다. 다른(예를 들면, 인간) 세포주에서, 세포들의 1%를 넘지 않는 비율이 성숙한 성상세포, 뉴런 또는 희소돌기아교세포의 마커들의 발현에 대해 양성이다.
단일 신경줄기세포, 및 세포주의 세포들은 종양발생 유전자(oncogene)를 코딩하는 외생 유전 물질을 포함하지 않고, 즉, 그들은 불멸화 전략을 거치지 않았다. 또한, 기재된 세포주들은 신경줄기세포주인 것이 바람직하다.
제3양태에서, 본 발명은 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포들의 형질감염(transfect)된 집단을 수득하고 유지하는 방법으로서:
(a) ES 세포들을 선택성(selectable) 마커 A를 코딩하는 구조체로 형질감염시키고, 사용 시 상기 선택성 마커는 신경 전구세포-특이적 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인, 형질감염 단계;
(b) 상기 ES 세포들의 신경 전구세포들로의 분화를 촉진하는 단계;
(c) 상기 선택성 마커 A를 발현하는 신경 전구세포를 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 세포들을 전술된 방법들 중 하나에 의해 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
선택성 마커 A는 항생제 내성, 세포 표면 마커 또는 예를 들면, EP-A-0695351에 기재된 바와 같은 또 다른 선택성 마커를 코딩할 수 있다. 신경 전구세포-특이적 프로모터는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, BLBP 및 네스틴 신경 인핸서(nestin neural enhancer)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 이 선택 전략의 추가적인 세부사항은 실시예 1-1에서 제공된다.
본 발명의 신경줄기세포(즉, 단일 신경줄기세포 및 본 발명의 조성물, 세포주 및 집단에 존재하는 신경줄기세포들)는 유전적으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 신경줄기세포를 형질감염시키는 방법으로서:-
(a) 상기 신경줄기세포를 선택성 마커 B 및 폴리펩티드를 코딩하는 구조체로 형질감염시키는 단계; 및
(b) 상기 선택성 마커 B를 발현하는 신경줄기세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
선택성 마커 B는 항생제 내성 또는 세포 표면 마커를 코딩할 수 있고, 선택성 마커 A와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 적합한 형질감염 방법들은 공지되어 있으며, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 뉴클레오펙션(necleofection) 및 레트로-바이러스 및 렌티-바이러스를 통한 형질감염(retro-and lenti-viral transfection)을 포함한다.
유전적으로 변형된 신경줄기세포들은 또한 본 발명의 일부분을 형성하며, 본 발명은 따라서, 상기 구조체를 더 포함하는, 단일 신경줄기세포, 또는 본 발명의 조성물, 집단 또는 세포주에 존재하는 신경줄기세포들을 제공한다. 그와 같은 신경줄기세포들은 선택성 마커 B 외에, 선택성 마커 A를 이미 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 임의의 출처로부터 유래한 신경줄기세포들과 사용하기에 적합하다. 하나의 특정한 구체예에서, 본 발명은 ES 세포들의 출처로부터 신경줄기세포들을 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, ES 세포들의 신경줄기세포로의 분화는 ES 세포들을 신경 전구세포들로 전환시키는 단계, 예를 들면, 단일층에서의 배양 또는 배아체(embryoid body) 분화 및 뒤이은 NSA 배지에서의 신경 전구세포들의 배양에 의해 촉진된다. 또한, NSA 배지는 보충적인 포도당 및 HEPES와 같은 보충적인 구성성분들을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 대안으로서, 포도당 및 HEPES로 보충된 배지(바람직하게는 기초 배지)는 또한 이 분화를 촉진하기 위해 이용될 수 있다.
NSA 및/또는 포도당 및 HEPES의 존재 하에, 조건들은 신경줄기세포의 증식에 유리하며, 배양 내에 존재하는 비-신경세포(non-neural cell)가 사멸된다는 추가적인 장점을 갖는다. 이는 신경줄기세포의 실질적으로 순수한(예를 들면, 존재하는 모든 세포들의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95%가 신경줄기세포임) 배양체를 가져온다. 실시예 1-5는 본 방법의 추가적인 세부사항을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 실시예 1-5의 방법은 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포의 집단을 제조하기 위해 이용될 수 있고, 상기 신경줄기세포들은 뒤이어 전술된 본 발명의 배양 방법들 중 하나를 이용하여 유지된다.
실시예 1-5의 방법은 또한 ES 세포들의 신경줄기세포로의 분화에 대한 인자들의 효과를 분석하기 위해 이용될 수 있다. 바람직한 분석 구체예에서, ES 세포들은 테스트될 인자의 존재 하에, 실시예 1-5에 기재된 방법을 이용하여 배양된다. 인자의 효과는 예를 들면, 결과적으로 수득된 세포들의 마커 프로파일을 결정하는 것, 즉, 세포들이 본 발명의 세포들과 유사한 마커 프로파일을 갖는지 또는 ES 마커 프로파일이 유지되는지 여부를 입증하는 것에 의해 평가될 수 있다. 테스트되는 인자들은 유도성(inductive) 인자 또는 차단성(blocking) 인자일 수 있다.
신경(neurological) 질환 및 신경퇴화성 질환, 및 뇌 손상의 치료; 특히, 파킨슨 병 및 알쯔하이머 병, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증의 치료에서 신경줄기세포의 이용에 많은 관심이 있다. 본 발명의 방법, 조성물, 세포 집단, 세포주 및 단일 세포들은 모두 그와 같은 치료 및 그와 같은 치료를 위한 제제(preparation)의 제조에서 이용될 수 있다. 본 발명을 이용하여 치료될 수 있는 특정한 신경/신경퇴행성 질환은 파킨슨 병, 운동 뉴런 질병, 뇌졸중, 다발성 경화증 및 헌팅턴 병을 포함한다.
제5양태에서, 따라서, 본 발명은 전술된 세포주, 신경세포 집단, 단일 신경세포 및 조성물의 세포 요법 및 신경퇴행성 질환 및 뇌손상의 치료를 위한 제제의 제조에서의 용도를 제공한다. 그와 같은 제제들은 인산 완충 식염수(PBS)로 제조될 수 있다.
전술된 질병들의 치료 방법은 본 발명의 단일 세포, 세포주, 조성물 또는 세포 집단을 환자에게 이식하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 환자는 포유 동물이고, 보다 바람직하게는 환자는 인간이다. 그와 같은 이식은 배아 CNS 및 성체 CNS 모두에서 성공적인 것으로 입증되었고, 실시예 1-6에서 보다 상세하게 기술된다.
본 발명의 세포들, 및 특히 세포주들은 유도성 인자 또는 차단성 인자의 신경줄기세포의 분화에 대한 효과를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 분석은 본 발명의 신경줄기세포(즉, 조성물, 세포주, 및 집단에 존재하는 신경줄기세포 또는 단일 신경줄기세포)를 테스트될 인자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 인자의 신경줄기세포의 분화에 대한 효과는 결과적으로 얻어진 세포들의 마커 프로파일을 결정하는 것, 즉, 세포들이 본 발명의 세포들에 유사한 마커 프로파일을 갖는지 여부, 또는 이 마커들이 소실되었는지 여부를 입증하는 것에 의해 적합하게 분석될 수 있다. 본 발명의 세포들은 또한 약물의 분석에 적합하다.
뉴런 또는 신경아교세포를 형성할 세포들의 비율을 평가하기 위해, 세포들은 클론으로(clonally) 증식되고; 세포들을 개별적으로 평판배양하며 모든 세포들이 클론성 콜로니를 형성하는 것은 아니나 일반적으로 50%를 초과하는 비율의 세포들이 뉴런(적합한 프로토콜 하에서) 또는 신경아교세포(또한, 적합한 프로토콜 하에서)을 형성할 것이다. 세포들은 본 발명이 속하는 기술로부터 구별되며, 본 발명이 속하는 기술은 신경줄기세포 특성을 갖는 세포들의 동정 및 증식을 주장하나, 집단은 매우 이질적이다. 순수하지 않은 집단이 신경줄기세포의 분화 및 그 비율의 감소를 촉진하는 신호전달을 나머지 신경줄기세포들에게 제공하는 세포들을 포함하기 때문에, 이는 중요한 구별이다. 종래 기술의 방법들은 개별 세포로부터 신경구(neurosphere)를 생성할 수 있으나, 본 발명은 개별 세포로부터 실질적으로 순수한 집단의 생성을 가능하게 한다.
하기의 실시예에서 보다 상세하게 기술되는, 본 발명의 특정한 구체예들에서, 모든 NS 세포 콜로니들은 15% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 30%의 TuJ 양성 뉴런들을 생성한다. 보다 높은 밀도의 배양에서, 본 발명자들은 TuJ 양성 세포들을 계수하였다. 1년의 연속 배양보다 긴, 115회의 계대배양 후에, LC1 NS 세포들의 35%는 뉴런의 형태를 얻었고 베타-III 튜블린을 발현했다. 이 세포들은 이 단계에서 이합체(diploid) 핵형을 유지했다. LC1은 클론화되지않은 집단이다. 따라서, 데이터는 신경아교세포-한정적 전구세포 또는 유전적 전환에 대한 최소한의 선택적 압력이 있었다는 것을 나타낸다.
본 발명의 세포들은 이질적 세포들과의 동시-배양 없이, 정의되지 않은 조건 배지, 세포외 매트릭스 분획 또는 혈청 없이 배양될 수 있으며, 이는 ES 세포가 아닌 다른 줄기세포들에 대해 이전에 보인 적이 없었던 특징이다. 따라서, 본 발명에 따라서, 신경줄기세포들은 바람직하게는 정의된 조건에서 동질적인 배양물로 배양된다. 마이크로웰에서 분리된 하나의 NSC 조차도 확장될 수 있고, 이는 EGF 및 FGF 이외의 세포외 신호들에 대한 최소한의 의존성을 나타내며 NSC에 대한 필수적인 외인성 자가-분열 신호가 체외에서 EGF 및 FCF로 된다는 것을 의미한다.
실시예에서 보다 상세하게 예시된 추가적인 구체예들에서, 실질적으로 단일 세포들의 평판배양으로부터 형성된 모든 콜로니, 즉, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상의 콜로니가 (i) EGF + FGF에서 뉴런 전구세포 마커의 동일한 동질적인 발현 및 분화 마커의 부재를 보이며, 및 (ii) 성장 인자 제거 시 뉴런을 생성한다. 특정한 실시예에서, 모든 콜로니는 이와 같은 특성들을 가졌다. 이는 대칭적인 자가 분열에 대한 증거이다. 또한, 클로닝되지 않은(non-cloned) NS 세포 배양체에 대한 콜로니 분석 데이터는 클론 NS5 라인으로부터의 데이터와 유사하다. NS5로부터 확장가능한 비분화된 콜로니들의 연속적인(serial) 형성은 클론원성(clonogenic) 세포들이 줄기세포들이고 그들의 수가 NS 집단과 비례적으로 확장된다는 것을 보여준다. 형식적으로, 줄기세포 수의 증가는 두 메카니즘을 통해 일어날 수 있다: 신규(de novo) 생성 또는 대칭적인 자가-분열성 분열. 전자는 전-줄기세포(pre-stem cell) 출처, 즉, 전분화능 세포 또는 태아 원기(foetal anlage)를 필요로 하며, 이들 중 어느 것도 본 명세서에 기재된 NS 세포 배양체에 존재하지 않으며, 따라서, 대칭적인 자가-분열은 NS 세포 배양체에서 지속적이어야 한다.
하기의 실시예에서 수득된 특정한 NS 세포들은 Sox2, Pax6, Emx2, Olig1, Olig2, 네스틴, BLBP, GLAST, 비멘틴을 발현하고, RC2, 3CB2, SSEA-1, 및 프로미닌에 대해 면역반응성을 갖는다. 바람직하게는, 그들은 Sox1을 발현하지 않고 GFAP 및 뉴런성 항원에 대해 음성이다. 이와 같은 NS 세포들은 전분화능(pluripotency) 마커 및 다른 배엽(germ layer)의 마커들을 포함하지 않는다. 본 발명자들은 ES 세포들의 경우처럼, 신경줄기세포 특성은 CNS 발달 동안 가려지고, 체외(ex vivo)에서만 진정으로 입증가능한 것으로 주장한다. Sox1 발현은 NS 세포들에서 유지되지 않았다는 발견은 새롭고, 예측되지 않은 것이며, Sox1을 이용한 연속적인 계통 선택은 생산적이지 않을 것이라는 것을 의미한다.
본 발명의 추가적인 구체예들에서, ES 세포-유래의 클론되지 않은(CGR8-NS) NS 라인들 및 클론된(NS5) NS 라인들 및 태아 피질-유래의 클론되지 않은(Cor1) NS 라인들 및 클론된 (Cor1-3) NS 라인들에 의해 예시된, NS 세포들은 배양에서 방사아교세포 마커들 3CB2, BLBP, GLAST, 네스틴, RC2 및 비멘틴의 발현을 보인다. GFAP의 발현은 바람직하게는 이 배양의 세포들의 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만, 특별하게는 2% 미만에서 나타난다. 특정한 실시예에서, GFAP 발현은 세포들의 1% 미만에서 나타난다. 본 발명자들은 또한 115회의 계대 후에 ES 세포 유래의 NS 세포들에서 GFAP 및 βIII-튜블린의 부재 하에 네스틴 및 RC2의 균일한 발현을 보여주었고, 이는 NS 세포 표현형이 안정하다는 것을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 세포들은 ES 세포들로부터 분화되고 30회 계대 후에, 바람직하게는 60회 계대 후에, 보다 바람직하게는 100회 계대 후에 (1) 네스틴 및 RC2를 지속적으로 발현하고 (2) GFAP 및 βIII-튜블린을 지속적으로 발현하지 않는다. GFAP 및 베타 III-튜블린의 비-발현은 5% 미만의 세포들, 바람직하게는 2% 미만의 세포들에서 관찰된다.
본 발명자들은 특정한 NS 세포들에서 전분화능, 중배엽(mesodermal), 또는 내배엽(endodermal) 특이적 전사 인자의 부재를 확인하는 RT-PCR을 통한 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 또한 3개의 상이한 NS 세포 배양(ES 유래, 태아-수질-유래, 및 클론 태아 수질-유래의 NS 세포들)에서 계통 부적합 전사물(lineage inappropriate transcripts)의 부재를 확인하고 뉴런 및 방사아교세포 마커의 일관성있는 발현을 보여주는 Affymetrix(RTM) 발현 프로파일링을 수행하였다.
ES 세포들로부터 분화에 의해 NS 세포들을 수득하는 것은 바람직하게는 세포들을 연속적인 부착 배양에서 유지하는 단계를 포함하고, 보다 바람직하게는 신경구를 형성하는 단계를 생략한다. 그러나, 태아 또는 성체 뇌로부터의 일차 세포 분리집단(primary cell isolate)으로부터의 세포의 분화에 의해 NS 세포들을 수득하는 것은 선택적으로, (i) 먼저 현탁 상태의 집합체(aggregate) 또는 신경구를 형성하는 단계, 및 (ii) 뒤이어 세포들을 부착 배양에서 유지하는 단계를 포함한다. 본 발명자들은 실시예들에서 수일 후에 집합체들은 젤라틴-코팅된 플라스틱에 부착되고 그 후 NS 세포들이 성장한다는 점을 발견했다.
본 발명자들은 본 발명의 세포의 초기 계대 및 후기 계대에서, 구체적으로 LC1 세포들에 대해 8회 및 115회 계대에서 생성된 뉴런 및 성상세포의 비율을 결정하였다. 후자의 배양은 24시간의 이배수기(doubling period)로 12개월의 확장을 의미한다. 후기 계대에서 수득된 뉴런의 수에 약간의 감소가 있으나, 이는 여전히 35%를 초과한다. 46C ES 세포들에서 독립적으로 유래된, NS5 클론 라인은 30회 계대에서 유사한 수준의 뉴런 분화 효율을 보인다. GFAP 면역반응성 성상세포들의 생성은 LC1 NS 세포들 및 또는 NS5 세포들에 대해 양 시점 모두에서 100%에 접근했다. 또한, 복수 회의 계대 동안 배양되고, GFP 렌티바이러스로 형질감염되고 이식 전에 더 확장된 LC1 NS 세포들을 이용하여 뉴런 및 성상세포 모두의 광범한 분화를 보여주는, 체내(in vivo) 데이터를 얻었다. 방사아교세포 마커 발현의 균일성과 조합되어, 클론되지 않은 LC1 NS 세포들의 안정적인 분화능에 대한 데이터는 FGF 및 EGF에서의 부착 배양은 줄기세포의 자가-분열을 촉진하고 신경아교세포 또는 뉴런으로의 수임(commitment to either glial or neuronal fates)을 억제한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 ES 세포들로부터의 분화에 의해 수득되는 NS 세포들이 5주의 기간 동안 종양의 형성 없이 이식될 수 있고, 따라서, 마우스의 뇌에서 4주 내에 육안으로 관찰되는 테라토마(macroscopic teratoma)를 생성하는 ES 세포들과 구별된다.
본 발명은 또한 핵 재프로그래밍 방법(nuclear reprogramming method) 및 그 방법들을 통해 수득된 세포 및 동물에 관한 것이다.
핵 재프로그래밍은 체세포, 선택적으로 줄기 세포 또는 완전 분화 세포(terminally differentiated cell)의 핵을 상대적으로 보다 높은 분화능(potency)을 갖는 세포의 핵으로 행동하도록 재프로그래밍하는 기법이다; 궁극적으로 완전히 재프로그래밍된 핵은 전분화능(pluripotent) 세포의 핵으로서 작용하고 재프로그래밍은 종종 전분화능으로 재프로그래밍하는 것을 의미하는 것으로 받아들여진다. 핵 이식(nuclear transfer)에 의한 재프로그래밍 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 정립되어 있고 종종 "복제양 돌리(Dolly the sheep)"로 불리는 WO 96/07732에 기재된 발명 이후 널리 알려졌다. 따라서, 핵 이식은 인간을 제외한 동물(non-human animal)을 클로닝하게 위해 이용될 수 있다.
핵 이식 방법은 다수의 문제들을 갖는다. 주로, 그들은 효율성이 낮아서, 수득된 세포들이 진정으로 전분화능이 되도록 재프로그래밍되는 경우는 드물다. 또한, 재프로그래밍의 일부로서 핵에 대해 유전자 조작을 수행할 수 있는 것이 바람직하다. 그러나, 현재, 이 조작은 공여자 핵의 클론 집단을 얻는 것이 어렵기 때문에 가능하지 않거나 신뢰할 수 없다. 클론 핵의 경우에도, 재프로그래밍 방법은 다수의 개별적인 단계들을 요구하는 복잡한 절차이다. 마지막으로, 일부 종들로부터의 ES 세포들은 분리하기가 어렵다. 재프로그래밍 기법을 이용하는 것은, 그와 같은 것이 이용가능하고 신뢰성 있다면, 이와 같은 종들에서 전분화능 세포들에 대한 대안적인 경로를 제공할 수 있다.
본 발명의 추가적인 양태들은 전술된 문제들에 대한 대안적인 접근방법을 제공하고 그에 대한 해결안을 제공하는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명은 핵 재프로그래밍 방법으로서, 공여 핵은 본 발명의 신경줄기세포로부터 수득되는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 신경줄기세포는 고효율로 재프로그래밍될 수 있는 것으로 발견되었고, 따라서, 본 발명은 효율적인 재프로그래밍 방법을 제공하고 또한 다수의 종의 유전적으로 조작되고 재프로그래밍된 세포들, 특히, 전분화능 줄기세포들의 생산을 촉진한다. 본 발명을 통해, 개별적인 신경줄기세포들을 클론에 의해(clonally) 증식시킬 수 있는 능력은 유전자 조작 후에 동일한 유전자 조작을 가진 세포들의 클론 집단이 수득되어 재프로그래밍 방법에서 이용될 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 특정한 세포 표면 마커의 존재 및/또는 다른 마커들의 부재에 따라 신경줄기세포를 파악하는 것이 가능하다 - 이는 신경줄기세포가 혼합된 집단, 예를 들면, 뇌 균질 현탁액(brain homogenate)로부터 직접 채집될 수 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 양태들에 따라 배양하는 단계가 생략될 수 있다는 장점을 갖는다.
따라서, 본 명세서에서는 공여 핵이 본 발명의 구체예 또는 양태에 따라 수득된 신경줄기세포로부터 유래되는 것인 핵 재프로그래밍 방법이 제공된다.
특정한 핵 재프로그래밍 방법은:
- 공여 세포(donor cell)를 수득하는 단계;
- 수혜 세포(recipient cell)를 수득하는 단계;
- 상기 공여 세포의 핵을 수혜 세포로 이식하는 단계로서, 상기 공여 세포는 (i) 신경줄기세포, 또는 (ii) 본 발명의 방법에 따라 수득된 세포인 것인 단계; 및
- 상기 공여 세포 핵을 재프로그래밍하기 위해 상기 세포를 배양하고, 이에 의해 재프로그래밍된 세포를 수득하는 단계;를 포함한다.
수혜 세포의 핵은 일반적으로 과정의 한 단계에서 제거되므로 결과물인 세포는 이배체(diploid)이고, 그 제거는 선택적으로 공여 세포 핵의 이식 전에 및 선택적으로 공여 세포 핵의 이식 후에 수행된다.
본 발명의 NS 세포들에 의해 제공되는 흥미로운 가능성들 중 하나는 유전적 손상, 예를 들면, 악성(malignancy)을 유도할 수 있는 손상을 도입하는 것이다. 추가적인 옵션은 따라서, 공여 세포 핵을 유전적으로 조작하는 것이다. 이는 대상이 되는 돌연변이 또는 유전자를 도입하기 위해, 예를 들면, 분석 또는 다른 테스트 목적을 위해 세포 또는 동물을 생성하기 위해 이용될 수 있고, 상기에서 모두 동일한 조작을 갖는 복수의 세포들이 수득된다. 조작의 범위는 광범위하다. 일 예는 질병-유발 유전적 서열 또는 추정적인(putative) 질병-유발 유전적 서열을 공여 세포 핵에 도입하는 것으로, 약물 스크리닝에 유용하다. 또 다른 옵션은 재프로그래밍된 세포로부터 유래된 조직을 포함하는 동물을 수득하고 그 조직을 이용하여 분석을 수행하는 것이다. 세포를 예를 들면, 난모세포로의 핵 이식에 의해 전분화능 상태로 재프로그래밍하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정한 구체예들에서, 원하는 신경줄기세포의 세포 표면 마커들에 대한 본 발명으로부터의 지식을 활용하는 것은 혼합된 집단으로부터 신경줄기세포를 분리하기 위해 필요했을 배양 단계들의 생략을 가능하게 한다. 하나의 그와 같은 재프로그래밍 방법은 세포들의 혼합된 집단을 제공하는 단계, 상기 혼합된 집단으로부터 그의 세포 표면 마커 프로파일에 근거하여 신경줄기세포를 분리하는 단계, 및 상기 분리된 세포의 핵을 수혜 세포로 이식하는 단계를 포함한다.
다른 방법들에서와 같이, 분리된 세포는 그의 핵을 수혜 세포로 이전하기 전에 유전적으로 조작될 수 있다. 또한, 분리된 세포는 집단 내의 하나의 세포의 핵을 수혜 세포로 이식하기 전에 세포들의 클론 집단을 수득하기 위해 배양될 수 있다.
보다 상세하게는, 본 발명의 세포들의 응용은 고효율 약물 검색(high throughput drug screening)이다. 본 발명의 신경줄기세포 및 그들로부터 수득된 뉴런, 신경아교세포 등은 상기 둘 중 하나의 유형의 세포에 대해 활성인 인자들을 파악하기 위한, 스크리닝을 위해 이용될 수 있다. 세포 또는 자손은 뇌종양 모델에서 이용될 수 있다. 세포 및 자손은 신경계, 특히, CNS에서 수득될 수 있고, 그로부터 유래된 신경 세포들 및 그들의 자손이 스크리닝(screen)에서 이용된다: 스크리닝의 속성은 모두에게 명확할 것으로 사료되나, 개략적으로 본 발명의 세포 또는 그의 분화된 자손을 수득하는 단계, 테스트 인자의 존재 하에 상기 세포 또는 자손을 배양하는 단계 및 상기 세포 또는 자손에 대한 상기 인자의 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 특정한 스크리닝 용도에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명에 의해 수득되고, EGF 수용체 또는 추가적인 EGF 수용체를 발현하도록 변형된 세포가 제공된다.
세포들은 스크리닝에서 이용되기 전에 변형될 수 있다. 예를 들면, 유전자에 돌연변이를 도입하거나 또는 질병, 특히, 파킨슨병 및 알쯔하이머병을 포함한 신경세포의 질병에 관여되는 것으로 공지되거나 추정되는 유전자 산물을 코딩하는 핵산을 도입하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 파킨(Parkin) 돌연변이가 도입될 수 있다. 알쯔하이머병에 관여하는 단백질, 예를 들면, APP를 코딩하는 유전자가 발현되거나 또는 돌연변이되거나 또는 그 발현이 변형되게 할 수 있다.
본 발명의 세포들은 세포 요법을 위한 세포들의 출처로서 유용하다. 그들은 잠재적으로 핵 이식을 위한 핵의 출처가 될 수 있는 환자로부터 유래한 줄기세포의 출처를 제공한다. 그들은 신경보호용(neuroprotectvie) 유전자 요법을 포함하는 유전자 요법의 전달을 위해 이용될 수 있다. 하나의 요법 실시예에서, 본 발명의 세포는 신경아교세포 유래의 신경영양성 인자(glial cell derived neurotrophic factor: GDNF)를 발현한다. 이 세포들은 본 발명에 따라서 수득되어 유전적으로 조작될 수 있다. 이 세포들은 손상된 신경 회로(neural circuitry)를 복구하고 및/또는 뇌 기능을 복구하기 위해 이식될 수 있다.
본 발명의 장점은 수득된 세포들의 순도에 있다. 순수한 집단은 이식 또는 배양에서 제어하기가 보다 용이하며, 반면에, 이질적 배양에서는 보다 많은 세포들이 이미 신경아교세포로 진행되도록 정해져 있기 때문에 감소된 비율의 뉴런이 수득된다. 일부 요법들은 뉴런과 성상세포를 모두 필요로 할 것이다.
다른 요법들은 신경아교세포들(예를 들면, MS의 경우, 희소돌기아교세포, 다른 응용들의 경우, 성상세포, 이동 세포)을 필요로 할 것이다.
인간을 제외한 동물의 클로닝 방법이 본 방법에 의해 제공된다. 인간을 제외한 동물을 클로닝하는 방법은 (i) 상기 인간을 제외한 동물로부터 신경줄기세포를 수득하는 단계, (ii) 상기 인간을 제외한 동물과 동일한 종의 난모세포를 수득하는 단계, (iii) 상기 신경줄기세포의 핵을 상기 난모세포에 이식하는 단계, 및 (iv) 상기 단계 (iii)에서 수득된 세포를 상기 동일한 종의 암컷에 이식하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 신경줄기세포의 분리에 근거한 인간을 제외한 동물을 클로닝하는 효율적인 방법을 제공한다. 이 클로닝 방법은 실질적으로 인간을 제외한 모든 동물에 적용될 수 있으나, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 닭 등을 포함하는 가축 및 마우스 및 랫트를 포함하는 실험용 동물에 특히 그러하다.
본 발명은, 최초로, ES 세포들과 동일한 방식으로 이배체이고, 클론원성이며, 형질감염 가능한(transfectable) 조직줄기세포의 순수한 집단의 배양을 가능하게 한다. 이는 광범위한 새로운 실험 기회들을 여는 줄기세포 생물학의 상당한 진일보이다. 예를 들면, "신경줄기세포"의 프로파일링에 관한 이전의 연구들(예를 들면, Suslov 등)은 이질적인 신경구 배양에 대한 의존성 때문에 상당히 손상되었다. 또한, NS 세포들의 방사아교세포 특성은 그들의 체내 대응물(in vivo counterpart)을 정의한다. 방사아교세포의 순수한 집단을 배양하고 유전적으로 조작하는 능력은 또한 줄기세포 및 특화된 스카폴드(scafford) 세포로서 기능할 수 있는 이와 같은 비범한 세포들의 세포 생물학을 분석하는 새로운 기회들을 열어준다. 마지막으로, 이질적인 세포 또는 세포 추출물 없는 단순 배지에서 NS 세포들을 증식시킬 수 있는 능력은 자가-분열이 성장 인자 단독에 의해 주도될 수 있고 현재까지 줄기세포 생물학자들에 의해 필수적인 것으로 간주된 복잡한 미세환경적 적소(niche)를 필요로 하지 않는다는 것을 정립한다. 본 발명은 핵 재프로그래밍 및 세포들을 이용한 선택적인 유전적 조작에 대한 새로운 접근방식들을 가능하게 한다.
본 발명은 NS 세포들로부터 뉴런의 효율적인 생성을 제공한다. 본 명세서에 기재된 프로토콜에 보다 상세하게 설명된 방법에서, 뉴런을 수득하는 방법은 (a) FGF 수용체 아고니스트의 존재 및 EGF 수용체 아고니스트의 부재 하에 신경줄기세포를 배양하는 단계; 및 (b) 그 후, EGF 수용체 아고니스트의 존재 및 FGF 수용체 아고니스트의 부재 하에 상기 신경줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다. 예를 들면, EGF가 존재하지 않는 기간은 세포들이 예를 들면, FGF가 뒤이어 제거된 때 뉴런이 될 수 있게 세포들을 준비시킨다. 신경줄기세포는 바람직하게는 단일층 배양으로 평판배양된다. 일반적으로, NS 세포들은 EGF를 포함하지 않으나 FGF를 포함하는 배지로 이전되어, FGF도 그 배지로부터 제거(세포들을 FGF를 포함하지 않는 배지로 이전시키는 것을 포함함)되기 전의 기간, 즉, 2일 이상 또는 4일 이상 배양된다.특정한 방법에서, 세포들은 FGF-2는 존재하나 EGF는 존재하지 않는 조건에서 1주일간 배양되고 그 후 FGF-2가 제거된다. FGF의 제거는 배양체에서 일부 세포의 사망을 초래하나, 상당한 비율은 생존하여 뉴런을 형성한다. 이 방법은 본 명세서에 기재된 NS 세포들의 유도를 위한 방법에 선택적인 추가로 이용될 수 있다.
본 발명의 모든 양태에 따른 방법/용도는 체내 또는 체외에서 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 방법 및 조성물은 첨부된 도면에서 예시된다:
도 1은 ES 세포들로부터의 신경줄기(NS) 세포의 생성을 도시하고;
도 2는 NS 세포들이 다양한 ES 세포주 및 태아 전뇌(foetal forebrain)로부터 유래될 수 있다는 것을 도시하고;
도 3은 NS 세포들이 성체 뇌 내에 포함되고 분화될 수 있다는 것을 도시하며;
도 4는 인간 ES 세포 또는 태아-유래의 NS 세포를 도시하고;
도 5는 분화성 배지(differentiating medium)에서 배양된 NS 세포들의 전압- 및 전류-클램프 조건 하에서의 전기 활성(electrical activity)을 도시한다.
도면을 보다 상세히 설명하면, 도 1은 ES 세포들로부터의 신경줄기(NS) 세포의 생성을 도시한다: A. EGF 및 FGF-2(a) 에서 증식된 부착 NS 세포 배양체(LC1)는 뉴런성 항원(b) 또는 성상세포 항원(c)의 발현을 보이지 않고, 전구세포 마커 RC2(d) 및 네스틴(도시되지 않음)의 균일한 발현을 보인다. LC1 세포들은 혈청의 첨가 시에 면역양성(immunopositive) 성상세포(e)로 분화되고 성장 인자의 제거 시에 뉴런(f-h)을 생성한다. 수득된 뉴런의 비율은 115회 계대 후 전체 세포의 35%를 초과하는 비율이다(i). B, 클론 NS-5 세포들은 Sox1 신경 계통 선택을 통해 생성되었다. a 및 c는 각각 1회 계대 및 5회 계대에서의 신경 전구세포의 위상 이미지(phase image)이고, b 및 d는 Sox1-GFP 형광에 해당하며, e는 테라사키(Terasaki) 웰에서 평판배양 1 시간 후 단일 세포이고, f는 20회 계대에서의 클론 세포주의 위상차 이미지(phase contrast image)이다. C, ES 세포 및 신경줄기세포/방사아교세포 마커에 대한 RT-PCR (46C, 부모 ES 라인; P5, 신경 분화 후 5회 계대; NS-5 클론 NS 라인; LC1, NS 집단(17회 계대); 뇌, E12.5/E16.5 마우스 뇌). D, 신경줄기세포/방사아교세포마커에 대한 NS-5 면역반응활성. E, 네스틴 면역반응활성(c, f)의 상실과 함께 NS-5의 성상세포(a, b) 및 뉴런(d, e)으로의 분화. F, NS-5 세포의 콜로니들은(a) 성장 인자 제거 시 뉴런을 생성하고(b) EGF/FGF의 존재 하에 GFAP에 대한 면역반응성 없이 RC2 및 BLBP의 균질한 발현을 유지한다(c, d). G, NS-5의 중기 확장(metaphase spread)(31회 계대).
도 2는 NS 세포들이 다양한 ES 세포주 및 태아 전뇌로부터 유래될 수 있다는 것을 보여준다: NS 세포들은 독립적인 ES 세포주(CGR8, E14Tg2a) 또는 일차 피질(Cor-1) 및 선조(Str-1) 조직으로부터 유래되었다. A, 줄기세포/방사아교세포 마커의 RT-PCR. B, 전사 조절자의 RT-PCR. C, ES-유래 세포주(CGR8-NS) 및 태아-유래 세포주(Cor-1)는 LC1으로부터 형태(a, f) 및 신경줄기세포/방사아교세포 마커 면역반응활성(b, c, g, h)에 의해서는 구별가능하지 않고, 각각 뉴런(d, i) 및 성상세 포(e, j)로 분화될 수 있다.
도 3은 NS 세포들이 성체 뇌에 포함되고 분화된다는 것을 보여준다: a-h 해마(a, b) 또는 선조체(c-h)로의 이식 후 4주차의, 렌티바이러스에 의해 eGFP로 형질도입(transduce)된 LC1 NS 세포들의 공초점 이미지. b, d는 각각 패널 a 및 c에서 삽입도(inset)의 보다 높은 배율의 확대임. e, f, 뉴런 마커 TuJ(e, 적색) 또는 MAP-2(f, 적색)의 동시-발현(황색)을 보여주는 eGFP 이식된 NS 세포들(녹색)의 예들임. h, 신경 전구세포 마커 네스틴(적색). i, 성체 마우스 선조체로의 이식 후 4주차의 이식-유래 뉴런(MAP2), 성상아교세포(GFAP), 전구세포(네스틴), 및 증식성 (Ki67) 세포들의 정량적 분석이다. 데이터는 5마리의 개별적인 동물들로부터 유래한 500개 이상의 eGFP+ 세포들의 평균(±표준편차)이다. 스케일 바(Scale bar): a, c, 100 #m; b, d ,e, 40 #m. ; f-h, 20 #m.
도 4는 인간 ES 세포 또는 태아-유래 NS 세포들을 도시한다: A, 인간 ES 세포들로부터의 유도. a, 인간 ES 일차 배양체. b, 인간 ES 세포들의 신경-로제트 구조(neural-rosette structure)로의 분화. c, NS 확장 배지에서 9회 계대. d, 개별적인 세포들은 방사아교세포 형태를 나타낸다. e-h, 신경줄기세포/방사아교세포 마커에 대한 면역염색. B, 인간 태아 전뇌로부터의 유도. i, 피질로부터 생성된 신경구(neurospheres). j, 부착(attachment) 및 성장(outgrowth). k, NS 확장 배지에서의 5회 계대. I, 방사아교세포 형태. m-p, 신경줄기세포/방사아교세포 마커. C, 분화. q, TuJ 양성 미성숙 뉴런. r, GFAP 양성 성상아교세포.
도 5는: A. 분화성 배지에서 6일(a), 20일(b) 및 30일(c) 동안의 배양 후 3 개의 상이한 NS 세포들로부터, 상이한 막 전위(-90 mV의 대기 전위(holding potential)로부터 -70mV 내지 +40mv 사이)에서 수득된, 중첩(superimposed) 내향(inward) 및 외향(outward) 전류 추적(tracings). B. (A)에 도시된 바와 같은 전류 기록을 수득한 직후 전압-클램프에서 전류-클램프로 전환하는 것에 의해 (A)에서와 동일한 세 개의 세포들(a, b 및 c)에서 탈분극화 직사각형 전류 펄스(depolarising rectangular current pulses)의 주사 후에 수득된 중첩된 전압 반응들. 점선(dashed line)은 -60 mV의 전압 수준을 나타낸다. C. 표지에 의해 표시된 바와 같이 증가된 시간 동안 분화성 배지에서 배양된 세포들로부터 -20 mV에서 유도된 평균 Na+ 전류. 막대(bar)는 SE를 나타낸다. D. TTX의 존재 하에 10 mM Ba2 +에서 -40 mV 및 0 mV에서 도출된 중첩된 내향 전류; 대기 전위는 -90 mV였다. E. (D)에서와 동일한 세포로부터의 전류/전압 관계.
본 발명은 하기의 실시예들에 의해 용도가 예시된다.
실시예 1-1.
NS 세포들의 벌크 집단(bulk population)의 분리 및 배양
부착 단일층 배양(adherent monolayer culture)에서 50-70%의 Sox1 양성 신경 전구세포들의 효율적이고 일관성있는 생성을 가능하게 하는 ES 세포 분화 프로토콜이 최근에 정립되었다. 이 배양체 내에서 (마우스로부터 유래된) 신경 전구세포를 분리, 확장, 및 특성을 규명하기 위해, Sox1 유전자 좌(locus)에 표적화된 GFP-IRES-푸로마이신 리포터 카세트을 포함하는, 이전에 생성된 세포주(46C 세포)를 사용하였다(Ying et al., 2003b). 푸로마이신은 7일 후에 분화 배양에 첨가하였고 3일 내에 남은 세포들의 95%를 초과하는 비율이 GFP+ 신경 전구체였다. 이 시점에, 세포들을 EGF/FGF-2로 보강된 N2B27 배지(푸로마이신 불포함)에서 재평판배양(replate)하였다. 이 세포들은 수회의 계대 내에서, 균일한 형태를 가지면서 빠르게 성장하였다.
이 46C 신경 전구체 세포들(46C-NP)은 특징적인 양극 형태(bipolar morphology)를 유지하면서 20회 이상의 계대 동안 지속적으로 유지되었다. 이 배양체들은 매우 미미한 세포 사망을 보였고 약 25 시간의 이배수기(doubling time)로 높은 평판배양 효율을 가졌다.
실시예 1-2.
세포주의 배양
클론 세포주를 분리하기 위해, 46C-NP 세포의 5회 계대 벌크 배양체로부터 유래한 단일 세포들을 마이크로웰 플레이트의 별개의 웰들에 평판배양하였다. 수득된 95개의 단일 세포들 중에서, 15개가 콜로니로 성장하였고, 이들 중 4개의 라인들이 10회 계대 이상까지 연속적으로 성장하였다. 하나의 라인(NP5)은 벌크 집단에서 관찰된 것과 동일한 균일한 형태를 갖는 특징적인 양극 세포들(bipolar cell)이었다. 이 NP5 라인은 배양으로 무한정 유지되고 있다(NP5: 41회 계대 ; 5개월 이상).
실시예 1-3.
NS 세포들의 특성 규명
벌크 세포 집단 및 클론 라인들의 특성을 규명하기 위해, 광범위한 마커들에 대한 면역세포화학을 이용하였다. 예상한 대로, 각 세포주는 신경 전구세포 마커, 네스틴 또는 비멘틴에 대해 양성으로 관찰되었다. 중요하게는, 이 세포들은 또한, 방사아교세포 특이적 마커들인 RC2, 3CB2 및 성상세포-특이적 글루타메이트 트랜스포터(GLAST)에 대해 양성이었다. 1% 미만의 세포들이 GFAP 또는 βIII 튜불린에 대해 양성이었고, 이는 이 세포들의 계대 동안 성상세포 또는 뉴런으로의 자발적인 분화는 거의 일어나지 않는다는 것을 의미한다. 영장류/인간 세포와 달리, 설치류의 방사아교세포들은 GFAP에 대해 음성이다. 또한, 이 세포들은 이전에 성체 신경줄기세포를 증식하기 위해(enrich) 사용되었던, LewisX 항원을 인식하는 항체인 SSEA-1에 대해 면역반응활성을 갖는다.
방사아교세포와의 동일성을 확인하기 위해 광범위한 마커들에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 벌크 집단뿐 아니라 4개의 클론 라인들 모두 Oct4 또는 Nanog에 대해 음성이어서, 그들이 ES 세포들이 아니라는 것을 확인하였고, 반면에 그들은 면역세포화학의 결과와 일치되게, 네스틴, 비멘틴 및 GLAST를 발현했다. 또한, 각 세포주는 방사아교세포 마커인 BLBP의 발현을 보였다. 이 세포들은 또한 Musashi-1 및 프로미닌을 발현한다.
흥미롭게도, 46C-NP의 벌크 배양체는 GFP 리포터에 의해 평가된 바와 같이, Sox1의 발현을 점진적으로 상실해서, 5회 계대(~2주)까지 매우 적은 비율의 세포들 만 녹색으로 남았다. 또한, 클론 라인들 중 어느 것도 Sox1-주도의 GFP 발현을 보이지 않았다. RT-PCR은 이 세포들이 Sox1은 발현하지 않으나, 대신에 관련된 SoxB1 클래스 단백질, Sox2를 발현한다는 것을 확인했다. 종합하면, 이 결과들은 일련의 Sox1 발현 신경 전구세포들이 푸로마이신 선택 전략을 이용하여 분리될 수 있고 전뇌 방사아교세포의 특성들을 갖는 Sox1-, Sox2+ 세포들이 분리되어 클론에 의해 확장될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 1-4.
NS 세포주의 뉴런 및 신경아교세포로의 분화
NS 세포주에 의해 발현되는 분자 마커들은 그들이 일종의 신경전구세포라는 것을 확인한다. 이 세포들이 진정한 다분화능(multipotent) 줄기세포(즉, 뉴런 또는 신경아교세포로 분화될 수 있는 줄기세포)라는 것을 확인하기 위해, 세포들의 분화능(potency)을 테스트하기 위해 설계된 일련의 조건들을 테스트하였다.
신경 전구세포의 이전 연구는 유사분열촉진물질(mitogen)의 제거 및/또는 혈청 또는 다른 사이토카인(cytokine)의 첨가를 포함하는 프로토콜을 통해 분화를 유도하였다. 본 실시예의 경우, EGF, FGF, 또는 양자 모두를 플라스틱 상에서 배양되는 증식성 NP5 및 46C-NP 세포들로부터 제거하였다. EGF 및 FGF의 동시 제거는 24시간 내에 신속한 대규모의 세포 사망을 초래했다. 대조적으로, FGF 단독에 의한 배양은 3일에 걸쳐 세포 사망을 가져왔다. EGF 단독에 의한 배양은 세포 사망 또는 분화를 초래하지 않았으나, 세포 증식을 감소시켰다. 따라서, EGF는 분명히 플라스 틱 상에서 배양되는 NS 세포들에 대해 필수적인 세포 생존 신호로 작용한다(FGF 신호전달에 의해 부분적으로 보완됨).
사이토카인의 제거 후 증식하는 세포들에 대한 혈청의 효과도 테스트하였다. 이 방법으로 처리된 세포들은 EGF의 부재 시에도 생존했고, 동기화된 방식으로 빠르게 분화되어, 100%의 세포들이 GFAP에 대해서는 양성으로 염색되고 네스틴에 대해서는 음성으로 염색되는 대형의 편평한 성상세포를 수득했다. 따라서, 증식하는 집단 내의 모든 NS 세포들은 성상세포로 분화될 수 있다. 이 효과는 플라스틱 상에서 EGF/FGF 제거 후 혈청의 부재 하에 BMP4 첨가에 의해 모방(mimic)될 수 있다. CNTF 및 TGF-b는 BMP4에 유사하게 행동했으나, 성상세포 형태는 상이했고 초기에 보다 많은 세포 사망이 있었다. BMP, CNTF 및 LIF는 각각 일차 피질 전구세포(primary cortical progenitor)로부터 성상세포로의 진행(asstrocyte fate)을 유도하는 것으로 입증되었다 (Gross et al., 1996; Lillien and Raff, 1990; Nakashima et al., 1999). 이 연구들과 일치하게, BMP-4 또는 혈청 처리에 의한 Id 유전자의 신속한 유도(>30배)를 관찰했다(데이터는 도시하지 않음).
뉴런 분화를 유도하기 위한 시도로, 라미닌-처리된 디쉬 상에서 EGF의 제거를 테스트하였다. 플라스틱 상의 세포 배양에서 관찰되는 세포 사망을 피하기 위해, 세포들을 FGF는 존재하나, EGF는 존재하지 않는 조건에서 라미닌 기판 상에 평판배양하였다. 플라스틱 또는 젤라틴 상에서 이 조건들 하에서 관찰된 PCD는 일어나지 않았고 세포들은 생존했다. 세포들의 형태에 방사아교세포의 특징적인 단부 족(end feet)을 가지며, 보다 신장된 양극화 과정으로의 변화가 있었다. 이 세포들 은 (BrdU 결합(incorporation)을 통해) 증식에 있어서 급격한 감소를 보였으나 방사아교세포 마커(RC2, 비멘틴, 네스틴)를 유지했고 매우 작은 비율의 뉴런 또는 성상세포들만이 고밀도 영역들에서 관찰된 바와 같이, 분화되지 않았다. 뉴런 분화를 유도하기 위해, 6일 후에 배지를 NSA/N2 + FGF2로부터 FGF2를 포함하지 않는 NSA/B27으로 교체하였다. 이는 MAP2 및 βIII 튜불린 항체 염색에 의해 판단된 바와 같이, 약 40-60%의 세포들의 뉴런 분화를 촉진했다. 이 뉴런들은 GABA 면역반응활성에 의해 평가된 바와 같이, GABA성(GABAergic)이고 성상세포는 거의 없었다(GFAP). 이 결과들은 이전에 기술된 뉴런 분화를 방지하는 FGF의 역할과 일치했다.
각 세포주는 ES 세포들과 유사한 성공율로 동결 및 해동될 수 있다는 것이 발견되었다.
추가적인 테스트에서, 단일 세포로부터 출발하여 분화를 시도하였다. 이 클론 확장 및 분화는 모든 세포들이 뉴런을 형성할 수 있는 능력을 갖는다는 것을 보여주었다.
실시예 1-5.
유전적 선택 전략의 이용 없이 ES 세포주로부터 NS 세포의 분리
NP5를 분리하기 위해 이용된 N2B27 배지는 최초에 ES 세포들의 신경 전구세포로의 전환을 위해 최적화된 것이서 ES 세포들 및 신경 전구세포들의 양호한 생존을 가능하게 했다. 따라서, 푸로마이신 선택의 부재 시에, ES 세포들 및 비-신경 세포들의 전이(carry-over) 때문에, 46C-NP 세포들을 EGF 및 FGF-2로 효율적으로 확장하는 것은 불가능했다(데이터는 도시되지 않음). 이를 극복하고, 다른 비-표적화된 ES 라인들로부터의 방사아교세포들의 생성을 가능하게 하기 위해, 신경 전구세포들의 생존 및 확장을 가능하게 하나 다른 세포 유형들에 대해서는 생존 및 확장을 가능하게 하지 않는 다른 기초 배지 조합들을 테스트하였다.
상업적으로 구매가능한 배지인 NS-A 배지(Euroclone)를 이용하여, 7일 차에 46C ES 세포 단일층 분화의 재-평판배양은 비-신경세포의 세포 사망뿐 아니라 세포들의 덩어리(clump)/구체(sphere) 형성을 초래한다는 것을 관찰하였다. 이 세포 덩어리들의 뒤이은 부착이 일어났고 세포들의 균질한 집단이 성장했다. 이 세포들의 계대가능한(passageable) 집단(> 75회 계대)의 추가적인 특성 규명은 푸로마이신 선택 전략을 이용하여 이전에 관찰했던 발현된 마커들의 동일한 프로파일을 보여주었다. 따라서, 세포들은 신경 전구세포 마커(네스틴, 비멘틴)에 대해 양성이고 또한 방사 아교세포 마커(RC2, GLAST, BLBP 및 Pax6)에 대해서도 양성이었다. 46C-NP 세포들은 일단 수립되면, N2B27 또는 NSA 배지에서 유사하게 행동했고, 형태적으로 작은 차이만 있고, 마커 유전자에는 전혀 차이가 없었다.
이 프로토콜을 이용하여, 6개의 상이한 ES 라인들로부터의 세포주들을 분리하였다: CGR8, E14T. Oct4-GIP, S11, R1 및 V6.5. 이 세포주들 각각은 유사한 형태 및 발현 프로파일을 가지며 광범위하게 계대될 수 있다.
실시예 1-6.
NS 세포들의 이식
NS 세포들의 분화능을 체내에서 테스트하기 위해, 그들을 신장 캡슐 이식(kidney capsule graft), 배아 CNS, 및 성체 CNS로 이식하였다.
NP5에 대해 전기천공을 테스트하였다. 그들은 네모파(square wave) 전기천공기를 이용하여 효율적으로 전기천공된 것으로 관찰되었다. 세포들은 또한 리포펙타민(lipofectamine) + 시약을 이용하여 형질감염될 수 있다. 이는 마우스에서 사용된 모든 유전적 조작이 이제 이용가능하게 되었으므로 주요한 장점이다.
이식된 세포들의 신속한 평가를 위해, 46C-NP를 eGFP 마커 유전자를 유지하는 렌티바이러스 입자들로 형질도입시켰다. 감염은 매우 효율적이었고 세포들의 거의 95%는 성공적으로 표시(mark)되었고, eGFP 신호는 계대되면서 강하고 안정적이었다. 렌티바이러스에 의한 감염(lentiviral infection)의 이용은 형질전환 유전자(transgene)가 안정적으로 통합되고 이식된 세포들의 장기적인 분석을 위해 신호가 안정하게 유지될 수 있게 하였다.
배아 뇌(미성숙 신경 세포들의 분화를 지속시키고 이끌 수 있는 모든 분자들 및 인자들을 포함하는 환경)로의 이식 후 세포들의 거동을 평가하였다. E14.5 마우스 배아를 수혜 세포로 이용하는 Magrassi 및 동료 (Magrassi et al., Development 1999)에 의해 이전에 기재되었던 절차에 따라 2 마이크로리터의 최종 용량에 100,000개의 세포들을 재현탁시켰다. 세포들은 이식 후에도 잘 생존하였고(이식물에서 약 20000개의 세포들의 평가가 이루어짐), eGFP 신호는 용이하게 검출가능했고, 그들은 이식 후 초기 시점에 이미 이동 활성(migrational activity)을 보였다. 이식 후 상이한 시점들(4일, 7일, 2주 및 1개월)에 이식된 세포들이 수득한 운명을 분석했다. 4일 차 및 1주 차에, 대부분의 세포들은 네스틴 면역반응활성에 의해 나타난 바와 같이 여전히 미성숙했고, 23%는 뉴런 마커 TuJ-1을 발현했고 16.3%는 신경아교세포 마커 GFAP를 수득했다. 이 데이터는 이식된 NS가 다분화능 NS 세포로부터 기대되는 바와 같이 체내에서 뉴런 및 신경아교세포를 모두 생성할 수 있다는 것을 나타낸다.
NS 세포들을 또한 성체 선조체로 이식하였다. 이 이식물들에서, 세포들은 잘 생존하였고(생존은 배아 이식물들에서보다는 낮음) 뉴런 및 신경아교세포 운명을 향해 분화되었다. 이식 후 2주차에 수행된 정량적 분석은 세포들의 43.3%가 뉴런-특이적 마커 TuJ-1을 발현했고, 26.6%는 신경아교세포 마커 GFAP에 대한 면역반응활성을 나타냈다. 세포들의 작은 비율(11.1 %)은 네스틴의 발현에 의해 나타난 바와 같이 미성숙 표현형을 유지했다.
신장 캡슐로 이식된 NP5-GF, P 세포들은 테라토마를 생성하지 않았다(n=4, 데이터는 도시되지 않음).
실시예 2
실시예 2-1
방법
마우스 세포 배양 및 분화
ES 세포들 및 신경 분화는 Ying & Smith, 2003에 의해 상세하게 기재된다. LC1이라 불리는 NS 세포들 및 다른 ES-세포 유래의 NS 세포들은 N2 및 10 ng/ml의 EGF 및 10 ng/ml의 FGF-2로 보강된 NS-A 배지(Euroclone)(NS 확장 배지)로 코팅되지 않은 플라스틱 상에 7일차 신경 분화 단일층 배양체를 재-평판배양하는 것에 의해 일상적으로 생성된다. 세포들은 뒤이어 부착되는 집합체들을 형성했고 NS 세포들보다 빠르게 성장했다. 46C-NS 세포라 불리는 세포들은 7일 차에 분화하는 부착 배지에 0.5 μg/ml의 푸로마이신의 추가 후에 생성되었다. 세포들을 푸로마이신의 부재 하에 10ng/ml의 EGF 및 10ng/ml의 FGF-2(Peprotech)를 모두 포함하는 N2B27 배지에서 코팅되지 않은 T75 플라스크로 3일 뒤에 재평판배양하였다. 희석을 제한하여(평판 배양 1시간 후에 단일 세포를 수득함) 96-웰 마이크로웰 플레이트(Nunc)로 단일 세포들을 평판배양하는 것에 의해 클론 라인인 NS-5를 생성했다. 일차 배양체는 E16.5 마우스 배아의 피질/선조체로부터 표준 프로토콜을 이용하여 생성하고 0.1% 젤라틴으로 처리된 플라스크 상에 부착되게 하였다. 그 후, Cor-1 세포 및 Str-1 세포들을 NS 확장 배지를 이용하여 젤라틴 상에서 확장시켰다. 성상세포 분화를 위해, NS 세포들을 1% 우태혈청(fetal calf serum) 또는 10 ng/ml BMP4(R&D System)으로 보충된 NS-A 배지에서 1 x 105개의 세포/웰로 4-웰 배지에서 재평판배양하였다. 뉴런분화를 위해, 5 x 104 개의 NS 세포들을 FGF-2 단독으로 보충된 NS-A에서 폴리-오르니틴/라미닌으로 처리된 웰로 평판배양하였다. 7일 후에, 배지를 성장 인자 없이 B27(Gibco)로 보완된 NS-A로 전환했다. 클론 분화를 위해, NS-5 또는 Cor-1 배양체부터의 1000개의 세포들을 라미닌으로 예비-처리된 10 cm 플레이트에 서 평판배양하고, EGF/FGF-2에서 12일 동안 확장시키고 상기와 같이, 그 상태에서(in situ) 분화시켰다.
NS 세포의 특성 규명
적합한 TRITC 또는 FITC 이차 컨쥬게이트 및 DAPI에 의한 핵 역염색(nuclear counterstaining)를 이용하여 면역세포화학 분석을 수행하였다. 일차 항체는 다음과 같은 희석으로 사용하였다: 네스틴(1:10), 비멘틴(1:50), Pax6(1:5), 3CB2 (1:20), RC2(1:50)(DSHB); TuJ(1:200)(Covance); GFAP(1:300)(폴리클론 및 모노클론, Sigma), MAP2(1:200)(Chemicon and Becton Dickinson); NeuN(1:200), GABA (1:200), Gad65/67(1:200)(Chemicon); 시냅토피신(Synaptophysin)(1:200)(Sigma); Olig2(1:5000)(H. Takebayashi); Emx2(1: 2000)(A. Corte); BLBP(1: 500)(N. Heintz); 프로미닌/mAb13A4(1: 200)(W. Huttner). 음성 대조구는 ES 세포, 분화된 NS 세포 또는 이차 항체(secondary) 단독이었다. RT-PCR의 경우, 전체(total) RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용하여 추출하고, Superscript II (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 생성하였다. PCR은 β-액틴(25회)을 제외한 모든 마커에 대해 30회수행하였다. 중기 확장(Metaphase spread)을 위해, 세포들을 20분간 5ml의 0.56% KCl로 처리하고 얼음 상에서 15분간 메탄올:아세트산(3:1)에서 고정시켜, 유리 슬라이드 상에 확장시키고 TOPRO-3 (Molecular probes)로 염색하였다.
인간 배아 및 태아 배양
고지된 동의로 이루어진 인간 조직에 대한 연구는 로디언 보건국(Lothian Health Board)의 연구 윤리 위원회에 의해 허가받았다. 동결된 과잉의 인간 배아는 연구를 위해 인간 수정 및 배아국(Human Fertilisation and Embryology Authority)에 의해 발행된 라이센스 R0132 하에 기증되었다. 인간 수질(human cortex)은 폴킹혼(Polkinghorne) 가이드라인 하에 연구를 위한 동의와 함께 선택적인 임신 종결(elective termination) 후에 카네기 단계(Carnegie state) 10/20 태아로부터 절개하였다.
이식(Transplants)
태아 수술(foetal surgery)은 Magrassi et al, 1998에 기술된 바와 같이 수행하였다. 유리 모세관을 이용하여, HBSS 1 ㎕에 담긴 5x104개의 세포들을 투조(transillumination) 하에 노출된 E14.5 Sprague Dawley 랫트 태아의 피질 비히클(telencephalic vehicle)에 주사하였다. 주사된 태아들을 분만 때까지 발생시키기 위해 복강으로 다시 넣었다. 분만 후에, 동물들을 이식 후 7일 차(산후일(Postnatal day)(P) 1, n=16) 및 5주 차(P30, n=8)에 희생시켰다. 성체 이식의 경우, 129 또는 CD1 마우스를 Kopf 정위 프레임(stereotaxic frame)에 배치하고 HBSS 5 ㎕에 현탁된 2x105개의 NS 세포들을 선조체(n=22) 또는 해마(n=21)로 주사하였다. 이식받은 마우스를 2주(n=16) 및 4주(n=10) 후에 희생시키고 4% 파라포름알데히드를 뇌 부위에(transcardially) 뿌렸다. 동결된 절편들(cryosections)(16 ㎛) 을 하기의 항체들로 염색시켰다: (마우스): NeuN(1: 100) 및 Ki67(1:10)(Chemicon), MAP2(1:200; Becton Dickinson), 네스틴(1:5; Ron McKay); (토끼): βIII 튜블린(1:500; Covance); GFAP(1:200; Dako); 이차 항체, Texas Red (Vector)(Jackson ImmunoResearch) 및 AlexaFluor 488(Molecular Probes). 단편들을 페이딩방지 용액(antifading solution)에 보존하고 Nikon TE2000-S ECLIPSE 및 Biorad Radiance 2100 공초점 현미경으로 분석하였다.
실시예 2-2
본 발명자들은 7일 동안 ES 세포들의 단일층 분화를 유도하고 그 후 EGF 및 FGF-2로 보충된 기초 배지(NS-A + N2)에서 재평판배양하였다. 이와 같은 최소 조건들(ES 세포 생존에 대해 비-허용적임) 하에서 생존한 세포들은 현저하게 부유 클러스터(floating cluster)로 결합하였다. 3-5일 후에, 이 집합체들을 채취하고 신선한 배지에서 재평판배양하였다. 그들은 2-3일 내에 부착되었고 LC1으로 명명된 양극형 세포(bipolar cell)의 형태적으로 균일한 집단으로 성장하였다. 계대 시, LC1 세포들은 지속적으로 부착 배양체로서 성장하였고, 종종 격자(lattice) 네트워크를 형성하였다. 그들은 약 24시간의 이배수기를 가지고 지속적으로 신속하게 증식될 수 있었다. LC1 세포들은 신경 전구세포 마커인 네스틴과 RC2를 보였으나 성상세포 분화 마커인 GFAP 또는 뉴런 항원의 발현은 미미했다(도 1A). 혈청 또는 BMP에 대한 노출 시, LC1 세포들은 48시간 내에 전형적인 성상세포 형태를 취했고 뒤이어 균일하게 GFAP를 발현했다(도 1A,e). 대조적으로, 뉴런 프로세스를 갖는 세포들은 EGF 없이 라미닌 상에서 5-7일간 재평판배양하고 FGF-2를 제거한 후 나타났다. 이 세포들은 뉴런 마커 타입 III β-튜블린, MAP2(도 1A, f, g) 및 neuN (도시되지 않음)을 발현했다. 대부분의 뉴런은 GAD67(도 1A, g) 및 GABA (도시되지 않음)로 염색되고 7일 차까지 서브집단은 성숙 마커 시냅토피신(도 1A, h)의 발현을 보였다. 다수의 뉴런(>35%)이 115회 계대 후까지 생성되었다(도 1A,i). LC1 세포들은 후기 계대(도시되지 않음)에서 이배체 염색체를 유지한다는 발견과 함께, 이는 자가-분열하는 신경줄기(NS) 세포들의 존재를 확인했다.
실시예 2-3
세포 집합체 형성(cell aggregation)이 NS 세포들의 생성에 필수적인지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 유도 과정 전반에 걸쳐 세포 부착을 유지하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 GFPirespac 리포터/선택 카세트가 신경 특화(Aubert et al, 2003)의 특정 마커인 Sox1 유전자에 삽입된 46C ES 세포들을 이용한 계통 선택(Li et al, 1998)을 활용하였다. 분화 유도 후 일시적인 푸로마이신 선택은 잔류 ES 세포들 없이 신경 전구세포들의 정제된 집단을 생성했다(Stavridis et al, 2003)(도 1B a, b). 그 후, FGF-2 및 EGF를 증식 배지(enriched medium)에서 Sox1 발현 신경 전구세포들에 적용했다. 세포들은 이 조건에서 부착된 상태로 남아있었다. 세포 이질성(Cellular heterogeneity)은 양극 세포들이 그 수를 점진적으로 증가시키고 광범위한 격자들을 형성하기 시작하면서 3-4회의 계대에 걸쳐 감소되었다. 흥미롭게도, 이 단계에서 Sox1의 발현이 상실되었으나(도 1B c, d) 세포들은 Sox2 및 네스틴에 대해 양성으로 유지되었다. 신경줄기(NS) 세포들의 존재를 수립하기 위해, 단일 세포들을 테라사키 웰에서 분리하고 부착 배양체로서 확장시켰다(도 1B, e, f). 초기에 벌크 LC1 집단에 유사한 형태 및 성장 특성을 가진 5개의 클론 라인들을 유도했다. 이 세포들은 전분화능 인자들 Oct4 및 Nanog의 검출가능한 발현 및 초기 신경 마커 Sox1의 발현은 없었으나, 범-신경상피(pan-neuroepithelial) 마커인 Sox2 및 네스틴은 유지했다(도 1C). 따라서, NS 세포들이 연속적인 부착 배양을 통해 Sox1 양성 초기 신경외배엽성 전구세포로 생성되었다.
실시예 2-4
클론 NS-5를 보다 상세하게 조사하여 Pax6, Glast,an(' BLBP mRNA를 발현하고 RC2, 비멘틴, 3CB2, SSEA1/Lex1 및 프로미닌에 대해 면역 양성인 것으로 확인하였다(도 1D). 이 마커들의 세트는 신경계의 발생 동안 뉴런 및 성상세포 모두의 전구체인 신경원성 방사아교세포(neurogenic radial glia)의 진단검사용으로 간주된다(Campbell et al, 2002; Hartfuss et al, 2001). 클론되지 않은(uncloned) LC1 세포들의 경우와 같이, NS-5 세포들은 성상세포 및 뉴런 분화가 가능했다(competent)(도 1E). EGF + FGF-2에 클론 밀도로 평판배양된 NS-5 세포들은 양극 세포들의 콜로니를 생성했다. 각 콜로니는 실질적으로 모든 세포들에서 GFAP의 부재 하에 RC2 및 BLBP의 발현을 보였다(도 1F, c, d). 이 서브클론들을 선택하여 연속적으로 확장시켰다. NS 배양체 내에서 뉴런 분화 능력을 가진 세포들의 빈도를 결정하기 위해, 본 발명자들은 다시 NS-5 세포들을 클론 밀도에서 평판배양하고 12 일 동안 EGF/FGF-2에서 확장시키고 그 후, FGF-2 단독에 의해 5일간 확장시키고, 성장인자 없이 추가로 7일간 확장시켰다. 각 콜로니(126/126)는 TuJ 양성 세포들을 생성했다(도 1F, b). 이 데이터는 NS 배양에서 모든 콜로니 형성 세포들이 뉴런 분화능을 가졌다는 것을 나타냈다. 최종적으로, LC1처럼, NS-5 세포들은 이배체 염색체(diploid chromosome complement)를 유지했고(도 1G) 복잡한 세포 미세환경에 대한 요구 없이 자가-분열하는 형질전환되지 않은(non-transformed) 클론 신경줄기(NS) 세포주를 나타냈다.
실시예 2-5
무혈청 단일층 유도 프로토콜이 NS 세포 생성의 전제조건인지 여부를 평가하기 위해, ES 세포들을 배아체 형성 및 혈청-포함 배지에서 레티논산에 대한 노출에 의해 분화하도록 유도하였다(Bain et al, 1995). 집합체들에 대해 48 시간 동안 G418에 의한 Sox2 계통 선택(Li et al, 1998; Billon et al, 2002)을 수행하고 이들을 FGF-2 및 EGF의 존재 및 무혈청 조건에서 재평판배양하였다. 부착 후에, Sox2 양성, 네스틴 양성인 세포들이 증식되어 NS 세포들의 전형적인 양극 형태 및 격자 성장 및 복수의 계대 후 성상세포 및 뉴런 분화능을 보였다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, NS 세포들이 배아체로부터 유도되었다.
실시예 2-6
LC1에 대해 기술된 바와 같은 계통 선택 없이 3개의 독립적인 ES 세포 분리 체들, E14TG2a, CGR8 및 R1으로부터 단일층 유도를 이용하여 NS 세포들을 유도하였다. 조사된 모든 NS 라인들은 네스틴을 발현했고 95% 이상의 세포들에서 RC2가 발현되었다. CGR8 및 E14TG2a로부터 유래된 NS 세포들의 보다 상세한 조사는 방사아교세포 마커들의 완전한 패널을 보였고(도 2A), 신경 전구세포 마커인 Sox2 및 Sox3, 및 bHLH 전사 인자들인 Olig2 및 Mash1의 발현을 보여주었다(도 2B). Sox1의 하향 조절(down-regulation) 및 Sox2의 유지는 이 전사 인자들의 주장된(postulated) 결정적 기능을 고려할 때, 이 NS 세포들의 놀라운 특징이었다(Pevny et al, 1998). 따라서, Sox1이 모든 신경외배엽성 전구세포들을 표시하는 반면에, Sox2가 주요한 역할을 수행할 것 같은 줄기세포들에서는 유지되지 않았다. NS 세포들은 또한 신경 전구세포들의 확장에 관여된 Emx2를 발현했다(Hein et al, 2001; Galli et al, 2002). 테스트된 모든 NS 배양체들은 형태 및 면역염색에 의해 평가된 성상세포 및 뉴런 분화를 수행했다(도 2C).
실시예 2-7
방사아교세포에 대한 그들의 명백한 관계를 고려하여, 본 발명자들은 NS 세포들이 ES 세포들의 체외(ex vivo) 증식에 대한 예비-적응으로부터 초래되었는지 또는 태아 신경 조직으로부터 유도될 수 있는 것인지 여부를 조사하였다. E16.5 태아 뇌로부터의 일차 태아 CNS 세포들은 기초 배지 + 성장인자를 담은 플라스틱에 부진하게 부착되어 자발적으로 집합체를 형성했다. 6-7일 후에, 이 집합체들은 젤라틴-코팅된 플라스틱에 정착했다. 14일 후에, 생성물(outgrowth)에 트립신을 처리 하고 젤라틴 코팅된 플라스틱으로 재평판배양시켰다. 3회의 별개 실험들에서, 형태적으로 NS 세포들로 확인가능한 세포들이 증식되고 뒤이어 연속적인 세포주들로 확장되었다. 이 태아 뇌 유도체들을 ES 세포에서 유래된 NS 세포들과 동일한 방사아교세포 및 신경원성 마커들을 발현했고(도 2A, B) 일치되는 mRNA 프로파일을 보였다. 그들은 마찬가지로 성상세포 및 뉴런 분화에 대한 능력을 보였다(도 2C). 피질 유래의 Cor-1 세포들을 단일 세포들로서 평판배양하고 콜로니들에 대해 NS-5에 대해 기술된 바와 같이 성장인자 제거를 수행했다. 모든 콜로니는 TuJ 양성 뉴런을 생성했다. 이는 Cor1 배양체에서 모든 클론원성(clonogenic) 세포들은 신경원성(neurogenic)이라는 것을 나타냈다. Cor-1 세포들은 또한 용이하게 서브-클로닝되고 연속적으로 개별적인 세포들로부터 확장되었으며, 이는 자가-분열능을 나타낸다. 따라서, NS 세포들이 태아 뇌로부터 유도되었고 ES 세포에서 유래된 NS 세포들의 주요한 특성들을 공유했다.
대부분의 NS 세포들은 방사아교세포에 대해 예상되는, 신장된 양극 형태(elonated bipolar morphology), 층상형 신장(lamellate extensions), 단부-족(end-feet) 및 타원형 핵을 가졌다(Rakic, 2003). 짧은 신장부를 가진 평평하고 조밀한(compact) 세포들도 존재했다. 중기 마커인 인산화된 히스톤 H3에 대한 면역염색은 조밀한 세포들이 유사분열성(mitotic)이라는 것을 나타냈다. 시간 갭 화상현미경(Time lapse videomicroscopy)은 세포 분열 전의 역동적인 형태 변화를 확인했다. 또한, 시간 갭은 NS 세포들이 체내에서 신경상피 및 방사아교세포의 특화된 특징인 인터키네틱(interkinetic) 핵 이동을 수행한다는 것을 보여주었다.
따라서, NS 세포들은 연속적으로 확장가능한 신경원성 방사아교 세포의 체외 유사체였다.
실시예 2-8
동결/해동된 40회 계대의 마우스 신경구들이 NS 확장 배지에서 젤라틴 코팅된 플라스틱 상에 부착되게 하였다. NS 세포들로부터 구별될 수 없는 양극 세포들이 성장했다. 이 세포들은 균일하게 RC2 야성, GFAP 음성인 집단으로 연속적으로 증식되고, 그 후, 성상세포 또는 뉴런으로 분화되도록 유도될 수 있었다.
실시예 2-9
본 발명자들은 마우스 뇌로의 이식 후 NS 세포들의 행동을 조사했다. 렌티바이러스 eGFP 발현 벡터에 의해 형질도입된, ES 세포에서 유래된 LC1 세포들을 E14.5에서 자궁내 주사(intra-uterine injeciton)에 의해 발달 중인 뇌로 도입했다(Magrassi et al, 1998). 출생 후 동물들을 희생시키고 뇌 단편들에서 eGFP 양성 세포들의 존재를 조사했다. NS 세포 자손은 다양한 뇌 영역들로 이동했다. 면역조직학적 분석은 전구체 마커인 네스틴, 뉴런 마커인 TuJ, NeuN 및 MAP2 및 보다 작은 수의 GFAP와 함께 eGFP의 동시-발현을 보여주었다. NS 세포들을 또한 성체 마우스 선조체에 주사했다. 이 경우, GFP 양성세포들은 주사 부위의 인근에 국소화되었다. 이식 4주 후에, GFP 발현 세포들의 44.4±5.7%는 뉴런 형태를 가졌고 MAP2에 대해 면역 양성이었고, 37.4±6.1%는 GFAP를 발현했고, 4.2±1.9%는 네스틴의 발현 을 유지했다(도 3). 증식성 마커 Ki67은 GFP 양성 세포들의 1.0±0.6%에서만 검출되어, NS 세포들은 체내에서 세포 주기로부터 제거된다는 것을 나타내었다. 이와 일치되게, 본 발명자들은 이식 후 1개월 차에 조사된 총 35개의 뇌에서 조절되지 않는 증식 또는 종양 형성의 조직학적 증거를 관찰하지 못했다. 또한, 마우스 신장 캡슐로 이식된 NS 세포들은 증식하거나 또는 테라토마를 생성하지 않았다. 이 데이터는 NS 세포들이 태아 뇌 및 성체 뇌 환경에서 생존 및 분화될 수 있고 ES 세포들과 달리(Brustle et al, 1997), 그들은 테라토마를 생성하지 않았다는 것을 나타냈다. 또한, 뉴런 분화의 비교적 높은 비율은 계대된 신경구의 이식물과 현저하게 대조적이었다(Rossi et al, 2002).
실시예 2-10
마지막으로, 본 발명자들은 유사한 NS 세포들이 인간 출처로부터 분리될 수 있는지 여부를 조사하였다. 기부된 잉여 배아들로부터 인간 ES 세포들을 유도하는 과정에서, 본 발명자들은 배양의 5-6주 후에 신경상피 세포들의 전형적인 로제트 구조로의 광범위한 분화를 관찰했다. 이 세포들을 NS 확장 배지로 옮겼다. 추가적인 3-4주 후에, NS 세포들에 유사한 양극 세포들이 이 배양체들로부터 출현했고(도 4A) 5개월 동안 연속적으로 배양되었다. 본 발명자들은 또한 선택적인 임신 종결로부터 카네기 단계 19-20 인간 태아 피질 조직을 얻었다. 분리된 세포들은 마우스 태아 뇌로부터의 NS 세포들의 유도의 경우에서와 같이 초기에 부유 집합체를 형성했고 이들을 7일 후에 재평판배양하고 젤라틴-코팅된 플라스틱에 부착될 수 있게 하였다. 증식성 배양체를 수립되었다 (도 4B). ES 세포들 및 태아 조직으로부터의 인간 NS 배양체는 양극 세포들과 결합된 평평한 세포들의 존재를 특징으로 가졌다. 그러나, 모든 세포들은 미성숙 전구세포 마커인 네스틴, 비멘틴 및 3CB2를 발현했다(도 4B). 시간 지연 모니터링은 두 세포 형태들이 유연이고(plastic) 상호전환가능하다는 것을 확인했다. 이 인간 세포들은 또한 방사아교세포에서의 인간 GFAP 프로모터의 활성과 일치되는 낮은 수준의 GFAP 발현을 보였다(Rakic, 2003; Malatesta et al, 2000). 그들은 마우스 세포들보다 느리게 증식했고, 수일의 이배수기를 가졌다. EGF 및 FGF-2의 순차적인 제거 후에, 그들은 미성숙 뉴런 세포들을 생성하는 것으로 보였다(도 4C). 강한 GFAP 면역반응활성을 가진, 전형적인 성상세포 형태의 세포들이 혈청에서의 계대 후에 생성되었다(도 4C).
실시예 3
특정 처리들 후에, 세포들이 전기생리학적 관점에서 성숙된 기능성 뉴런으로 효율적으로 전환될 수 있는지 여부를 파악하기 위해, 배양체의 NS 세포들의 전기생리학적 특성들을 패치-클램프(patch-clamp) 기법의 전-세포(whole-cell) 변형을 이용하여 체외 분화 동안 조사하였다.
전기생리학적 기록(electrophysiological recording)을 위한 용액
하기의 성분들로 구성된 수조 용액에서 전극과 세포들 간에 실을 형성하였 다:(단위: mmoles/l):155 NaCl, 1.0 CaCl2, 1 MgCl2, 3.0 KCl, 10 포도당, 10 HEPES/NaOH. 전류-클램프 기록 및 전압-클램프에서 총 전류 기록을 위해 전-세포 구성을 수립한 후, 피펫 충진 용액(pipette filling solution)은 (단위: mmoles/I): 128 KCl, 10 NaCl, 11 EGTA, 4 Mg-ATP, 10 HEPES/KOH (pH 7.4)을 포함했다. 전압 클램프 조건 하에서 전압-개폐(voltage-gated) Na+ 채널의 연구를 위해, 패치 피펫을 (mmoles/I): 130 CsCl, 10 NaCl, 20 TEA-CI, 10 EGTA, 2 MgCl2, 4 Mg- ATP, 10 HEPES/CsOH (pH 7.4)로 채웠고, 세포외 용액은 (단위: mmoles/l): 130 NaCl, 2CaC12, 2MgC12, 10 포도당, 5 테트라암모늄-Cl, CdCl2 0.2, 10 HEPES/NaOH(pH 7.4)를 포함했다. 전압 개폐 Ca2 + 채널의 연구를 위해, 패치 피펫을 (단위: mmoles/l): 120 CsCl, 20 TEA-Cl, 10 EGTA, 2 MgCl2, 4 Mg- ATP, 10 HEPES/CsOH (pH 7.4)로 채웠고, 세포외 용액은 (mmoles/1): 130 NaCl, 10 BaC12, 10 포도당, 5 테트라에틸암모늄-Cl, 10 4-AP 1, TTX 10-3, HEPES/NaOH (pH 7.4)를 포함했다.
패치 클램프 기록(Patch Clamp Recording)
실온(20-24℃) 패치-클램프 전-세포 구성(19)을 이용하여 전압-클램프 조건 하에서 Axopatch 200B 패치-클램프 앰플리파이어(Axon Instruments Inc., Burlingame, CA)로 이온 전류를 기록하고 IBM-호환성 PC로 인터페이스된 Digidata 1322A A/D 컨버터(Axon Instruments Inc., Burlingame, CA)를 이용하여 26-100 psec의 시료채취 간격으로 디지털화하였다. 하기의 소프트웨어 패키지를 이용하여 자극, 획득, 및 데이터 분석을 수행하였다:pClamp 9 (Axon Instruments Inc., Burlingame, CA) 및 ORIGIN 6 (Microcal Software Inc., Northampton, MA). 전압-클램프 실험을 위해, 누설(leak) 전류 및 용량성 전류(capacitative current) 의 선형 성분들을 먼저 아날로그 회로에 의해 감소시키고 P/N 방법으로 거의 완전히 상쇄시켰다. 패치 피펫은 보로실리케이트 유리 튜빙(borosilicate glass tubing)으로 제조하고 화염 연마(fire polish)시켰다. 내부 용액으로 충전되면 피펫은 3-4㏁의 최종 저항을 가졌다. 전류는 5 KHz에서 여과시켰다.
도 5A는 내향(Na+) 및 외향(K+) 전압 개폐 이온 전류의 분류에 적합한 수조 용액 및 피펫 충진 용액을 이용하여, 체외 분화의 상이한 단계들에 있는 3개의 NS 세포들(분화성 배지에서 각각 6일, 20일 및 30일 배양됨)에서 탈분극성 테스트 전위로의 전-세포 전압-클램프 단계들 동안 수득된 전류 기록들을 도시한다. 전류 추적의 단순한 조사로부터, 상당한 외향성 전압-개폐 전류가 이미 체외 분화의 초기 단계들(6일 차, 추적(trace) a)에 이미 존재한다는 것이 분명하다. 5 mM 테트라에틸암모늄-Cl을 포함하는 세포외 식염수의 적용에 의해 차단된, 이 전류는 지연된 정류기(delayed-rectifier) K+ 전류의 특징을 갖는다. 그 진폭(amplitude)은 분화의 후기 단계들(20-30일 차, 각각 추적 b 및 c)에서 약간만 증가했다. 이와 대조적으로, 6일 후에 미약했던 내향 전류의 진폭은 분화성 배지에 대한 노출 시간을 증가 시키는 것에 의해 크게 증가되었다. 도 5B는 도 5A에 도시된 동일한 세포에서 전압-클램프에서 전류-클램프 모드로 전환한 후, 약 -80 mV의 대기 전위로부터 70 내지 300 pA 사이의 직사각형 탈분극 전류(rectangular depolarizing current)의 주입 후에 도출된 전압 반응들을 보여준다. 실제로, 전압-개폐 내향 전류의 진폭 증가는 활성 전위를 도출하는 분화성 세포들의 능력(capacity)를 반영한다. 실제로, 단 6일간 분화 활성제에 노출되고 미약한 내향 전류를 보이는 세포는 재생성 전압 반응(regenerative voltage response)(도 5B에서 (a)로 표지된 추적)을 도출할 수 없었다. 이와 대조적으로, 비교적 빠른 탈분극 속도를 갖는 오버슈팅(overshooting) 활성 전위가 30일 동안 분화성 배지에서 배양되고(도 5B에서 (c)로 표지된 추적) 큰 내향 전류를 보이는(도 A에서 추적 c) 세포들에서 도출될 수 있었다. 부전 활동전위(abortive action potential)를 갖는, 중간 상황(intermediate situation)이 분화 활성제로 20일간 처리되고(도 5B에서 (b)로 표지된 추적) 양호한 수준의(moderate) 내향 전류를 보이는(도 A에서 추적 b) 세포들에서 발견되었다. 이 예비 분석으로부터, 이 세포들의 흥분도(excitability) 특성들은 내향 전압-개폐 전도도(conductance)의 양과 엄격하게 상관관계를 갖는다는 것이 파악되었다. 이 전도도의 분화성 배지에 대한 노출 시간의 함수로서의 정량적 분석을 위해, 분화의 상이한 단계들에 있는 세포들을 이용하고 전압-개폐 Na+채널의 활성의 연구에 특이적인 세포내 및 세포외 식염수를 적용하여 내향 전류들을 도출하였다(방법 참조). 세포 분화의 임의의 시점에서, 빠르게 불활성화하는 내향 전류는 선택적인 Na 채널 차단제인 테트로도톡신(1.0 □M)에 의해 완전히 차단되고 -20 내지 -10 mV의 테스트 전위에서 피크를 기록하여, 뉴런에서 전압-개폐 Na+ 전류의 전형적인 특징들을 보였다(데이터는 도시되지 않음). 도 5C에서, 분화 배지에 대한 노출시간의 함수로서 -20 mV에서 Na+ 전류 진폭의 발생을 표시했다. 흥미롭게도, Na+ 전도도의 증가는 분화성 배지에 대한 세포 노출 증가와 양호한 상관관계를 가졌다. 실제로, 평균적으로, 30일의 처리 내에 약 10배의(about a factor 10) Na+ 전도도의 증가가 이루어졌다( 첫 5일간 -55 ± 14 pA (n=17)가 있었고 25일 이상 동안 -434 ± 135 pA (n=13)로 증가됨). 동일한 방식으로, 전류 클램프 조건들에서 Na+ 전류에 의해 도출된 재생성 전위(역치와 피크 사이에서 측정된 mV)는 체외 분화의 첫 15일 동안(n=6) 0과 +20 mV 사이의 범위에 속했으며, 25일을 초과하는 기간동안의 처리 후에, +30과 +70 mV 사이의 값에 도달했다(n=6). 전반적으로, 분화 배지에서 25일보다 긴 기간 동안 처리된 NS 세포들에서 발견된 흥분도 특성 및 근본적인 전압-개폐 Na+ 전도도의 흥분도 특성들은 성체 표현형으로 발전되는 뉴런의 전형적인 특성들이었다. 이전의 결론을 보강하는 또 다른 특징은 분화 배지에 대한 7일 이상의 노출 후에 테스트된 대부분의 세포들에서 전압-개폐 Ca2 + 채널의 존재이다. 도 5D는 10 mM Ba2 +에 담긴(bathed) 동일한 세포로부터 표시된 테스트 전위까지의 막 탈분극에 의해 수득된 샘플 추적들을 보여준다. -40 mV에서 도출된 빠른 활성화 및 비교 적 빠른 불활성화 (□h = 21 ms) 전류 성분은 뉴런성 LVA Ca2 + 전류를 암시한다(Carbone and Lux, 1987). 이와 대조적으로, 느리고(□h = 73 ms) 불완전한 불활성화를 보이는, 0mV에서 도출된 Ba2+ 전류는 뉴런성 HVA Ca2 + 채널 전류의 전형적인 특징들을 가진다. 이 세포들에서 두 개의 구별되는 LVA 및 HVA, Ca2+ 채널 전도도의 존재는 도 5E의 전류-전압 관계에 의해 확인된다. 평균적으로, LVA 전류는 -40 mV에서 피크에 도달하나, HVA 전류에 대한 I/V 관계는 0 mV에서 피크에 도달한다. HVA Ba2 + 전류는 27개의 세포들 중 19개에서 검출가능하나, LVA 전류 성분은 HVA Ca2+ 전류를 이미 발현하는 세포들의 60%에서 측정되었다(n=13).
이 데이터는 본 발명의 신경줄기세포로부터 생성된 뉴런이 기능할 수 있다는 것을 보여준다:그들은 활성 뉴런의 증명특징(hallmark)인 활성 전위를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라, 본 발명자들은 ES 세포들 및 태아 뇌 추출물의 분화된 자손으로 정의된 NS 세포들을 유도하고 균일하게 증식시켰다. NS 세포들은 단순한 부착성 단일배양(monoculture)에서 클론에 의해 증식되고 이배체로 유지되었다. 연장된 확장 후에, 그들은 체외에서 및 성체 뇌로의 이식시 뉴런 및 성상세포로 효율적으로 분화되었다. NS 세포들은 또한 체외에서 희소돌기아교세포를 형성했다. NS 세포들은 균일하게 뉴런 및 성상세포의 태아 전구세포인 방사아교세포들의 형태 및 분자적 특징들을 발현했다. 본 발명자들은 또한 마우스 및 인간 태아 뇌로 부터 부착성 NS 세포주를 수립할 수 있었다.
실시예 6
하기의 프로토콜을 이용하여 마우스 ES 세포들 및 태아 피질로부터 NS 세포들을 얻었다. 유래된 NS 세포들은 균일하게 방사아교세포 마커들을 발현했다. 특히 CGR8 ES 세포들 또는 E16 태아 피질로부터 유래된 NS 세포들(내부 기준: Cor-1 및 클론성 유도체 Cor-1.3)에 대해 면역화학에 의해 표시된 마커들의 발현을 분석했다. 고배율(high power)에서의 조사는 방사아교세포 마커들이 각각 거의 모든 세포들에서 발현되고, GFAP에 대해서는 균일하게 음성이라는 것을 보여주었다.
실시예 7
하기의 프로토콜을 이용하여 확장된 마우스 태아 전뇌 신경구로부터 NS 세포들을 유도하였다. 장기적인 태아 신경구 배양(40회 계대)에서 유래된 NS 라인은 ES-유래된 NS 라인들과 동일한 형태를 보였고, 신경 전구세포/방사아교세포 마커 면역반응활성을 보였고, 뉴런 및 성상세포로 분화될 수 있었다. 이는 신선한 태아 신경구로부터 수득한 NS 세포들은 동결되고 그 후 장기간 동안 신경구로서 배양된 신경구로부터 수특된 NS 세포들과 동일했다.
실시예 8
LC1 마우스 NS 세포들을 태아 랫트 뇌로 이식시켰다. eGFP가 렌티바이러스에 의해 형질도입된 NS 세포들의 공초점 이미지를 E14.5 랫트의 심실로의 이식 1주일 후에 얻었다. 공여 세포들은 심실로부터 연조직(parenchyma)으로 집단으로서 및 단일 세포로서 이동했다. 이식된 세포들은 eGFP 및 뉴런 마커 MAP2, 성상교세포(astroglia) GFAP 또는 전구세포 마커 네스틴의 공동-분포(co-localization)를 보여주었다. 따라서, NS 세포들은 태아 랫트 뇌에서 이식 후에 이동하고 분화되었다.
실시예 9
NS 세포주의 유도 및 조작 프로토콜
본 발명자들은 NS 세포주의 유도 및 조작을 위한 하기의 프로토콜을 개발했다.
ES 세포로부터 마우스 NS 세포주의 유도
ES 세포들은 부착성 단일층 배양에서 Sox1을 발현하는 신경 전구세포로 효율적으로 전환될 수 있다[P1]. 이 ES 세포 분화에 대한 세부적인 프로토콜 및 문제해결은 본 명세서가 아닌 다른 문헌에 기재되어 있다[P2]. 요약하면, ES 세포들은 젤라틴-코팅된 조직 배양 플라스틱 상에서 10% 우태아혈청 및 100 U/ml의 재조합 백혈병 억제 인자(LIF)로 보충된 배지에서 영양세포-불포함 조건 하에 일상적으로 배양된다[P3]. 분화되지 않은 ES 세포들을 T75 플라스크(Iwaki)에서 ~80% 합류점(confluence)까지 확장시키고 트립신 처리하며 N2B27 배지에 재현탁시켰다[P2]. 세포들을 10분 이상 0.1% 젤라틴 용액(Sigma)으로 코팅된 9cm 플레이트(Iwaki)에 평판배양하고 건조시켰다. 초기 평판배양 밀도(initial plating density)가 효율적인 신경 유도를 위한 중요한 파라미터이고, ES 세포주들 간에 변할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 플레이트 당 수개의 상이한 세포 빈도(0.8 x 106, 1 x 106 및 1.2 x 106)로 접종하였다. 배양 배지는 떨어지거나 죽은 세포들을 제거하는 과정에서 매일 교체하였다. 이 조건들 하에서, 세포들의 50-80%는 4-5일 내에 신경 계통 특화(neural lineage specification)를 진행했고, 5일 차 이후로 명확한 뉴런 분화가 검출가능했다.
이질적인 전구세포 배양의 동질적인 NS 세포주로의 전환이 다음과 같이 수행될 수 있다. 7일 차의 분화된 배양체를 트립신 처리하고 2-3 x106개의 세포들을 최종 2 mM의 L-글루타민(Gibco), 변형된 N2 보충제(새로 준비됨)[P2] 및 10ng/ml의 마우스 EGF (Peprotech) 및 인간 FGF-2 (Peprotech)로 보충된 NS-A 배지(Euroclone)를 포함하는 NS 확장 배지에서 코팅되지 않은 T75 플라스크로 재 평판배양시켰다. 확장 배지는 4℃에서 최대 4주까지 보관될 수 있다. 2-3일 내에, 플라스크는 현탁 배양에 수천 개의 부유 집합체들을 포함할 것이다(절대 수는 초기 ES 세포 분화의 효율에 따라 변함). 세포 집합체들을 약한(mild) 원심분리로 채취하거나 또는 30 ml 유니버설 튜브에서 10분간 중력 하에 침전되게 하였다. 이 단계는 잔해(debris) 및 죽은 세포들을 제거하여, NS 세포 형성세포(founder)를 증식시킬 수 있게 하고, 완전한 배지 교환을 보장한다. 세포들을 10 ml의 신선한 NS 확장 배지에서 젤라틴-코팅된 T75 플라스크(Iwaki)로 재평판배양하였다. 추가적인 3-7일 후에, 세포 집합체들은 플라스크에 부착되고 곧 이어 세포들은 특징적인 양극 NS 세포 형태를 가지고 성장했다. 세포들의 광범위한 성장 후(추가적인 3-4일), 전체 집단을 트립신 처리하고 확장 배지에서 젤라틴-코팅된 T75 플라스크에 단일 세포들로서 재평판배양하였다. 세포들은 매우 신속하게 성장했고(이배수기-25시간) 부착된 상태로 유지되었다. 수회의 계대 내에, 잔류하고 있는 분화된 세포들 및 모 세포들(blast cells)이 제거되고(GFAP 및 TuJ1 면역염색에 의해 모니터링함) 배양체들은 NS 세포 마커들에 대해 균일하게 양성이었다.
46C ES 세포들(Soxl-GFP-IRES-pac knock-in)[P4]의 경우, 푸로마이신(0.5□g/ml)에 의한 일시적인 선택이 연속적인 부착 배양을 통해 비-신경 세포들을 제거하고 NS 세포들을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 신경 수임(neural commitment)을 유도하기 위해 젤라틴 코팅된 9cm 디쉬로 N2B27 배지에서 평판배양하였다. 6일 후에 푸로마이신을 48시간 동안 첨가하였다. 증식된(enriched) Sox1 발현 세포 집단(~ 3-5 x 106)을 그 후 젤라틴-코팅된 9cm 플레이트 상에서 EGF(10ng/ml) 및 FGF-2 (10ng/ml)를 포함하는 N2B27 배지에서 재평판배양하였다. 초기에 형태적으로 이질적인 Sox1 발현 집단은 점진적으로 Sox1 음성 특성 및 3-4회 계대 후에 균일한 NS 세포 형태 및 마커 발현을 수득했다.
태아 CNS 및 신경구로부터 마우스 NS 세포주의 유도
NS 세포 확장 배지에서 태아 E16.5 피질 및 일차 배양체의 분리 시 세포 클러스터는 현탁액을 형성한다. 이 일차 집합체들은 확장 배지에서 젤라틴-코팅된 기판으로의 평판배양에 의해 부착 NS 세포주로 용이하게 전환될 수 있다. 부착을 촉진하기 위해, 잔해/죽은 세포들을 먼저 침전(sedimentation)에 의해 효과적으로 제거하고 배지를 완전히 교환하는 것이 중요하다. 세포 집합체들은 2-5일에 걸쳐 부착하고 성장할 것이다. 성장하는 세포들을 뒤이어 트립신 처리하여 단일 세포들로 만들고 NS 세포 확장 배지에서 재-평판배양하여 증식시켰다. 계대된 태아 신경구로부터[P5], NS 세포들은 분리 및 NS 확장 배지에서 젤라틴-코팅된 플라스틱 상으로의직접 평판배양에 의해 편리하게 수립될 수 있다. 초기의 수회 계대 동안, 유도된 NS 라인들은 집합하고 플라스크로부터 분리되며 특히, 세포 빈도가 높다면 신경구를 재-형성하는 경향을 갖는다. 배양체들은 따라서 50% 합류점 이하에서 계대되어야 한다. 자발적으로 집결하는 경향은 가변적이나, 일반적으로 추가적인 계대에 따라, 또는 클론 세포주의 수립을 통해 감소된다.
NS 세포의 계대 및 확장
일단 수립되면, NS 세포들은 NS 확장 배지에서 증식된다. NS 세포들은 젤라틴 코팅된 플레이트/플라스크 상에서 배양되고 일상적으로 1이 2로 내지 1이 5로 분리된다. NS 세포들은 약 25시간의 이배수기를 갖는다. 트립신/EDTA를 이용하여, 또는 칼슘 마그네슘-불포함 PBS(Sigma)와의 배양을 통해 계대된다. 클론 라인의 수립을 위해, 단일 세포들을 확장 배지에서 젤라틴-코팅된 마이크로웰에 배 치(deposit)할 수 있다. 덜 엄격하게, 세포들을 매우 낮은 밀도, 9cm 디쉬 당 1000개의 세포들로 평판배양될 수 있다. 2주 내에 콜로니들이 나타나 선택되고 확장될 수 있다.
NS 세포의 동결보존 및 복구
동결/해동 후에 NS 세포들이 용이하게 회수된다. 통상적으로, 본 발명자들은 60-90% 합류점의 T75 플라스크를 트립신 처리하고, 펠릿을 1.5 ml의 NS 확장 배지 + 10% DMSO에 재현탁시켰다. 그 후, 이를 3 x 1 ml 동결튜브(cryotube) (Nunc)로 나누고 -80℃에 저장하였다. 이 조건들에서 NS 세포들은 6개월 이상의 저장 후에 회수가능했다. 장기적인 보관을 위해, 동결된 바이알들을 액체 질소로 옮겼다. NS 세포들을 바이알들을 빠르게 37℃까지 되게 한 후 10ml의 예비-가열된 NS 확장 배지로의 이전에 의해 해동시켰다. 세포들을 펠릿으로 형성하고 DMSO를 제거하기 위해 새로운 확장 배지에 재현탁시켰다. 동결보관 후 세포 회수율은 NS 세포들의 경우 >95%이다.
NS 세포의 성상세포 및 뉴런으로의 분화
NS 세포들의 GFAP 양성 성상세포로의 빠른 분화가 젤라틴-코팅된 플라스크/플레이트 상의 NS-A(N2 포함, EGF/FGF 불포함)에서 NS 세포들의 BMP4(10ng/ml) 또는 1% FCS에 대한 노출의 2일 이내에 일어났다. 세포 밀도는 성상세포 분화에 대한 중요한 파라미터는 아니다.
뉴런 분화를 위해, NS 세포들을 세포들을 분리시키기 위해 칼슘/마그네슘-불포함 PBS에 담긴 Accutase(Sigma)를 이용하여 채취하고 0.5-1.0 x 104 개의 세포들을 FGF-2(5ng/ml), 변형된 N2 및 B27(Gibco)로 보충된 NS-A 배지에서 폴리-오르니틴/라미닌 코팅된 4-웰 멀티디쉬 플레이트(Nunc)의 각 웰에 재평판배양하였다. 본 발명자들은 NS-A 기초 배지가 다른 기초 배지보다 뉴런 분화에 대해 보다 허용적이라는 것을 발견했다. 배지의 절반 분량은 배지의 조건을 유지하기 위해 2-3일마다 교체하였다. 이 조건들에서 7일 후에, 본 발명자들은 배지를 0.25x N2 + B27로 보충되고 EGF 또는 FGF를 포함하지 않는, 1:1의 비율로 Neurobasal 배지 (Gibco)와 혼합된 NSA로 교환했다. 이 조성(formulation)은 뉴런 분화 및 성숙을 더 촉진한다. 뉴런의 보다 장기적인 배양(14일 이상)을 위해, 본 발명자들은 BDNF(10ng/ml)의 존재하에 N2를 포함하지 않고 B27로 보충된 Neurobasal로 배지를 교환했다.
인간 NS 세포의 배양 및 뉴런성 분화
인간 NS 세포들을 마우스 NS 세포들의 경우처럼 추가적으로 100U/ml 재조합 백혈병 억제 인자(LIF)로 보충된 확장 배지로 0.1% 젤라틴(Sigma)-코팅된 플라스크/플레이트 상에서 확장시켰다. 세포들은 약 1주의 이배수기를 가졌다. 세포들이 30% 합류점에 도달하면 트립신으로 처리하여 1을 2로 분리시켰다. 과다성장은 단일층 배양을 유지하고 집합 및 분리(detachment)를 방지하기 위해 피해야한다.
뉴런 분화를 위해, 인간 NS 세포들을 Accutase(Sigma)를 이용하여 채취하고 약 1x104개의 세포들을 확장 배지에서 폴리-오르니틴/라미닌(Sigma) 코팅된 12-웰 플레이트(Iwaki)의 각 웰에 재-평판배양하였다. 세포들을 약 80% 합류점에 도달할 때까지 확장시켰다. 뉴런 분화는 확장 배지로부터 EGF 및 LIF를 제거하는 것에 의해 유도하였다. EGF 및 LIF의 부재 하에 7일 후, 배지를 0.5X N2, B27, FGF2 (5ng/ml), 및 BDNF (10ng/ml)로 보충된, 1:1(Gibco)의 비율로 Neurobasal 배지와 혼합된 NS-A와 교환하였다. 이 조건들에서 추가적인 7일 후에, 배지를 N2 또는 FGF-2 없이 B27 및 BDNF(10ng/ml)로 보충된 Neurobasal 배지로 교환했다. 이 프로토콜 전체를 통해 마우스 NS 세포들에서와 같이, 배지의 절반을 2 또는 3일마다 교환하였다. 추가적인 10일 후에, TuJ1 및 MAP2와 면역반응활성을 갖는 뉴런 형태의 세포들이 전체 세포수의 40 %까지 차지했다. GFAP 양성 세포들이 거의 나타나지 않는 뉴런 분화를 위한 마우스 NS 세포 프로토콜과 대조적으로, 상당한 수의 성상세포들이 또한 생성되었다.
본 발명은 따라서 대칭적으로 분열하고 비-분화된 상태인 여러 종의 신경줄기세포들을 수득하고 유지하는 방법 및 그를 위한 배지를 제공한다. 본 발명은 태아 및 성체 출처로부터의 ES 세포들로터 수득되거나 추출된 세포들을 이용하여 수행되었다. 모든 경우들에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 수득된 결과물인 세포들은 실질적으로 동일하게 보이고 동일하게 행동한다; 그들은 모두 다수, 예를 들면 수백회의 이배수기에 걸쳐 고순도의 배양체로 유지되면서, 그 세포들의 높은 비율은 뉴런 및 신경아교세포를 형성할 능력을 유지한다. 특히, NS 세포들이 인 간(ES, 태아 CNS), 마우스(ES, 태아 CNS, 성체 CNS) 및 랫트 (태아 CNS)로부터 성공적으로 수득되었다. 마우스 신경줄기세포들은 순수한 집단인 배양체로 배양되고, 이식된 후, 체내에서 종양을 형성하지 않으면서 배양되나, 분화되었다.
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Claims (87)

  1. 신경줄기(NS) 세포들의 대칭적 분열을 촉진하는 방법으로서, 상기 세포들을:-
    (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및
    (b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;를 포함하는 배지에서 기판에 부착되게 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자는 EGF 수용체의 아고니스트인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아고니스트는 EGF, TGF-α, 암피레귤린, 헤파린-결합-EGF, 에피레귤린, 베타셀룰린, 뉴레귤린 1, 2, 3, 또는 4, 및 크립토-1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자는 FGF 수용체의 아고니스트인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아고니스트는 FGF-2인 것인 방법.
  6. 신경줄기 세포;
    EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및
    FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 신경줄기세포의 80% 이상은 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포인 것인 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 그들이 RC2, 3CB2, BLBP 및 Sox-2의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 그들이 하기 중 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 조성물:-
    GLAST, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 조성물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성인 것인 조성물.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경줄기세포들은 종양발생 유전자를 코딩하는 외래 핵산을 포함하지 않거나, 또는 상기 신경줄기세포는 불멸화된 줄기세포가 아닌 것인 조성물.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 세포들의 1% 이하는 성숙된 성상세포, 뉴런 또는 희소돌기아교세포에 대한 마커의 발현에 대해 양성인 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 신경세포들의 집단으로서, 상기 세포들의 80% 이상은 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포인 것인 집단.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 신경세포들의 집단으로서, 상기 집단의 상기 신경줄기세포들은 그들이 마커들 RC2, 3CB2 및 BLBP의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 집단.
  16. 제15항에 있어서, 상기 집단의 상기 신경줄기세포들은 그들이 하기의 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 집단:-
    GLAST, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 집단의 상기 신경줄기세포는 그들이 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 집단.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단의 상기 신경줄기세포는 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성인 것인 집단.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집단의 상기 신경줄기세포는 종양발생 유전자를 코딩하는 외래 핵산을 포함하지 않거나, 또는 상기 신경줄기세포는 불멸화된 줄기세포가 아닌 것인 집단.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들의 1% 이하는 성숙된 성상세포, 뉴런 및 희소돌기아교세포에 대한 마커의 발현에 대해 양성인 것인 집단.
  21. 신경줄기세포를 제조하는 방법으로서:-
    제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따른 신경줄기세포를 배양하고, 그에 의해 신경줄기세포의 배양체를 수득하는 단계, 및
    상기 배양체로부터 신경줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항의 방법에 의해 수득 가능한 신경줄기세포.
  23. 제21항의 방법에 의해 수득 가능한 신경줄기세포로서, 상기 세포는 마커들 RC2, 3CB2 및 BLBP의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 신경줄기세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세포는 하기의 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 신경줄기세포:-
    GLAST, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 세포는 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 신경줄기세포.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성인 것인 신경줄기세포.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 종양발생 유전자를 코딩하는 외래 핵산을 포함하지 않거나, 또는 상기 세포는 불멸화된 줄기세포가 아닌 것인 신경줄기세포.
  28. 신경줄기세포주를 수립하는 방법으로서:-
    (a) 단일 신경줄기세포를 수득하는 단계,
    (b) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 신경줄기세포를 배양하고, 이에 의해 신경줄기세포의 집단을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 신경줄기세포 집단은 클론 집단이고, 상기 세포들 모두는 단일 신경줄기세포의 자손인 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 단일 신경줄기세포는 제21항의 방법에 따른 수득되는 것인 방법.
  31. 세포주로서, 상기 세포들은 EGF 수용체 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및 FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자의 존재 하에 유지되는 것인 세포주.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포주는 클론원성인 것인 세포주.
  33. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 세포주로서, 상기 세포들은 그들이 마커들 RC2, 3CB2, Sox-2 및 BLBP의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 세포주.
  34. 제33항에 있어서, 상기 세포들은 그들이 하기의 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 세포주:-
    GLAST, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 세포들은 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상의 발현에 대해 음성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 세포주.
  36. 세포주로서, 상기 세포들은 마커들 RC2, 3CB2, Sox-2 및 BLBP의 발현에 대해 양성인 것을 특징으로 하는 세포주.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포들은 그들이 하기의 하나 이상의 발현에 대해 양성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 세포주:-
    GLAST, Pax-6, 신경 전구세포 마커인 네스틴 또는 비멘틴, LewisX 항원, Musashi-1 또는 프로미닌.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 세포들은 Oct4 또는 Nanog 중 하나 이상 의 발현에 대해 음성인 것을 추가적으로 특징으로 하는 세포주.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들은 Sox-2의 발현에 대해 양성이고, Sox-1의 발현에 대해 음성인 것인 세포주.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들의 1% 이하는 성숙된 성상세포, 뉴런 또는 희소돌기아교세포에 대한 마커의 발현에 대해 양성인 것인 세포주.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 종양발생 유전자를 코딩하는 외래 핵산을 포함하지 않거나, 또는 상기 세포는 불멸화된 줄기세포가 아닌 것인 세포주.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주는 신경줄기세포주인 것인 세포주.
  43. 배양에서 신경줄기세포의 대칭적 분열을 촉진하기 위한, EGF 패밀리의 수용체 하류의 신경전달 경로의 활성자의 용도.
  44. 부착성의 무혈청 배양에서 신경줄기세포의 대칭적 분열을 촉진하기 위한,
    (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자; 및
    (b) FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성자;의 조합의 용도.
  45. 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포의 형질감염된 집단을 수득하고 유지하는 방법으로서:-
    (a) ES 세포들을 선택성(selectable) 마커 A를 코딩하는 구조체로 형질감염시키고, 상기 선택성 마커 A는 신경 전구세포-특이적 프로모터의 제어 하에 발현되는 것인 형질감염 단계;
    (b) 상기 ES 세포들의 신경 전구세포들로의 분화를 촉진하는 단계;
    (c) 상기 선택성 마커 A를 발현하는 신경전구세포를 선택하는 단계; 및
    (d) 상기 선택된 세포들을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 선택성 마커 A는 항생제 내성 또는 세포 표면 마커를 코딩하는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 신경 전구세포-특이적 프로모터는 Sox-1, Sox-2, Sox-3 및 BLBP로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계들은 (a), (b), (c), (d)의 순서로 수행되는 것인 방법.
  49. ES 세포들의 신경 전구세포들로의 분화를 촉진하는 방법으로서:-
    ES 세포들을 (1) 단일층 배양 또는 (2) 배아체 분화에 의해 신경 전구세포들로 전환하는 단계, 및
    상기 신경 전구세포들을 NSA 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 NSA 배지는 포도당 및 HEPES를 포함하는 것인 방법.
  51. 대칭적으로 분열하는 신경줄기세포의 집단을 제조하고 유지하는 방법으로서:-
    제49항 또는 제50항에 따라 신경 전구 세포들의 집단을 수득하는 단계; 및
    상기 집단을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. ES 세포의 신경줄기세포로의 분화에 대한 인자의 효과를 분석하는 체외 방법으로서:-
    상기 인자의 존재 하에 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 따라 ES 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  53. E신경줄기세포의 분화에 대한 인자의 효과를 분석하는 체외 방법으로서:-
    제6항 내지 제13항의 조성물, 제14항 내지 제20항의 집단, 제31항 내지 제42항의 세포주에 존재하는 신경줄기세포, 또는 제22항 내지 제27항의 단일 신경줄기세포를 상기 인자와 접촉하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 인자는 유도성 인자 또는 차단성 인자일 수 있는 것인 방법.
  55. 신경퇴행성 질환 및 뇌 손상의 치료용 제제의 제조를 위한 제6항 내지 제13항의 조성물, 제14항 내지 제20항의 집단, 제31항 내지 제42항의 세포주에 존재하는 신경줄기세포, 또는 제22항 내지 제27항의 단일 신경줄기세포의 용도.
  56. 제6항 내지 제13항의 조성물, 제14항 내지 제20항의 집단, 제31항 내지 제42항의 세포주에 존재하는 신경줄기세포, 또는 제22항 내지 제27항의 단일 신경줄기세포를 환자에게 이식하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환 및 뇌손상을 치료하는 방법.
  57. 제6항 내지 제13항의 조성물, 제14항 내지 제20항의 집단, 제31항 내지 제42항의 세포주에 존재하는 신경줄기세포, 또는 제22항 내지 제27항의 단일 신경줄기세포를 형질감염시키는 방법으로서:-
    (a) 상기 신경줄기세포를 선택성 마커 B를 코딩하는 구조체로 형질감염시키며, 상기 선택성 마커 B는 조직-특이적 프로모터의 제어 하에 발현가능한 것인 형질감염시키는 단계; 및
    (b) 상기 선택성 마커 B를 발현하는 신경줄기세포를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 선택성 마커 B는 항생제 내성 또는 세포 표면 마커를 코딩하는 것인 방법.
  59. 제6항 내지 제13항의 조성물, 제14항 내지 제20항의 집단, 제31항 내지 제42항의 세포주에 존재하는 신경줄기세포, 또는 제22항 내지 제27항의 단일 신경줄기세포로서, 선택성 마커 B를 더 포함하는 것인 신경줄기세포.
  60. 신경줄기세포를 포함하는 조성물로서, 상기 신경줄기세포는 부착 배양체로 존재하고 상기 조성물에서 상기 세포의 80% 이상은 신경줄기세포인 것인 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 세포들의 90% 이상은 신경줄기세포인 것인 조성물.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 30회 이상 계대된 것인 조성물.
  63. 제62항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 60회 이상 계대된 것인 조성물.
  64. 신경줄기세포를 수득하는 방법으로서:
    (i) 신경줄기세포로 분화될 수 있는 다분화능 또는 전분화능 줄기세포를 수득하는 단계,
    (ii) 상기 (i)의 세포를 (a) EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 아고니스트; 및 (b) FGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 아고니스트;의 존재 하에 전분화능 세포들에 대해 비-허용적인 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 줄기세포는 전분화능 줄기세포인 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 ES 세포 또는 EG 세포인 것인 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, EGF 수용체의 아고니스트 및 FGF 수용체의 아고니스트의 존재 하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경줄기세포로부터 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포를 수득하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  69. 핵 재프로그래밍하는 방법으로서, 상기 공여 핵은 제1항 내지 제5항, 제21항, 제28항 내지 제30항, 제45항 내지 제51항 및 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 또는 제22항 내지 제27항, 제31항 내지 제42항, 제59항 및 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 신경줄기세포로부터 유래된 것인 방법.
  70. 핵 재프로그래밍하는 방법으로서:
    -공여 세포를 수득하는 단계;
    -수혜 세포를 수득하는 단계;
    -상기 공여 세포의 핵을 상기 수혜 세포로 이식하고, 상기 공여 세포는 제22항 내지 제27항, 제31항 내지 제42항, 제59항 및 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 신경줄기세포, 또는 (ii) 제1항 내지 제5항, 제21항, 제28항 내지 제30항, 제45항 내지 제51항 및 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포인 것인 이식하는 단계; 및
    - 상기 공여 세포 핵을 재프로그래밍하기 위해 상기 세포를 배양하고, 이에 의해 재프로그래밍된 세포를 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 수혜 세포의 핵을 선택적으로 상기 공여 세포 핵의 이식 전에 및 선택적으로 상기 공여 세포 핵의 이식 후에 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 공여 세포 핵을 유전적으로 조작하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 질병-유발 유전적 서열 또는 추정적인 질병-유발 유전적 서열을 상기 공여 세포 핵으로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    - 상기 재프로그래밍된 세포로부터 유래된 복수의 세포들을 얻기 위해 상기 재프로그래밍된 세포들을 배양하는 단계; 및
    -상기 복수의 세포들을 분석에서 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서:
    - 상기 재프로그래밍된 세포로부터 유래된 조직을 포함하는 동물을 수득하는 단계; 및
    상기 조직을 이용하여 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수혜 세포는 난모세포인 것인 방법.
  77. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서:
    - 세포들의 혼합된 집단을 제공하는 단계;
    - 상기 혼합된 집단으로부터 제22항 내지 제27항, 제31항 내지 제42항, 제59항 및 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 세포를 분리하는 단계; 및
    - 상기 분리된 세포의 핵을 수혜 세포에 이식하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 분리된 세포를 그의 핵을 상기 수혜 세포로 이식하기 전에 유전적으로 조작하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서:
    - 세포들의 클론 집단을 수득하기 위해 상기 분리된 세포를 배양하는 단계; 및
    - 상기 집단의 하나의 세포의 핵을 상기 수혜 세포로 이식하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  80. 인간을 제외한 동물을 클로닝하는 방법으로서:-
    (i) 상기 인간을 제외한 동물로부터 신경줄기세포를 수득하는 단계;
    (ii) 상기 인간을 제외한 동물과 동일한 종의 난모세포를 수득하는 단계;
    (iii) 상기 신경줄기세포의 핵을 상기 난모세포로 이식하는 단계; 및
    (iv) 상기 단계 (iii)에서 수득된 세포를 상기 동일한 종의 암컷으로 이식하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 신경줄기세포는 (i) 제22항 내지 제27항, 제31항 내지 제42항, 제59항 및 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 신경줄기세포, 또는 (ii) 제1항 내지 제5항, 제21항, 제28항 내지 제30항, 제45항 내지 제51 항 및 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 세포인 것인 방법.
  82. 전술된 실시예들 중 하나를 참조하여 기술된 것과 실질적으로 동일한 신경줄기(NS) 세포의 대칭적 분열을 촉진하는 방법.
  83. 전술된 실시예들 중 하나를 참조하여 기술된 것과 실질적으로 동일한 세포주.
  84. 뉴런을 수득하는 방법으로서,
    (a) FGF 수용체의 아고니스트의 존재 및 EGF 수용체의 아고니스트의 부재 하 에 신경줄기세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 그 후, 상기 세포들을 FGF 수용체의 아고니스트의 부재 및 EGF 수용체의 아고니스트의 부재 하에 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 세포들을 단일층 배양으로 평판배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, EGF를 포함하지 않으나 FGF-2는 포함하는 배지로 NS 세포들을 옮기는 단계 및 상기 NS 세포들을 2일 이상의 기간 동안 배양하고 상기 배지로부터 FGF-2를 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경줄기세포들은 제1항 내지 제5항, 제21항, 제28항 내지 제30항, 제45항 내지 제51항 및 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 것인 방법.
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