NO336021B1

NO336021B1 - Anvendelse av en antagonist av Angptl3 til fremstilling av et medikament for behandling eller forebygging av vevsskade forbundet med en inflammatorisk leversykdom, og en antagonist av Angptl3 for nevnte anvendelse.

Info

Publication number: NO336021B1
Application number: NO20042410A
Authority: NO
Inventors: Napoleone Ferrara; Hans-Peter Gerber; Joe Kowalski; Maria Teresa Pisabarro; Daniel Eric Sherman
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2015-04-20
Also published as: CN101905024A; WO2003044172B1; WO2003044172A2; IL161542A0; US20090098117A1; JP5105696B2; MXPA04004609A; US20070134250A1; US7267819B2; KR20050044485A; IL203894A; CA2464542C; NZ532852A; EP1451578A4; US8541376B2; KR20100029861A; WO2003044172A3; EP1451578B1; ZA200403070B; EP1451578A2

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår Angptl3-polypeptider så vel som fremgangsmåter og midler til å fremstille og bruke slike proteinmolekyler, og antistoffer som binder Angptl3-polypeptider.

Veksten av nye blodceller er en forutsetning under normale fysiologiske prosesser for embryonisk og postnatal utvikling. Slik proliferasjon av nye blodkar fra pre-eksisterende kapillærer, en prosess som kalles angiogenese, spiller i tillegg en nøkkelrolle i den patologiske utvikling av faste tumorer, diabetiske retinopatier, psoriasis, inflammasjon og reumatoid artritt (Ferrara, Recent Prog. Horm. Res. 55:15-35 (2000), diskusjon 35-6).

Angiogenese avhenger ikke bare av vekstfaktorer så som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF), men blir også influert av celleadhesjonsmolekyler (CAM) inkludert integriner. Inaktivering av forskjellige gener som koder spesifikke adhesjonsreseptorer eller administrering av blokkerende antistoffer i dyremodeller har betydelige virkninger på den angiogene reaksjonen til endotelceller (Elicieri og Cheresh, Mol. Med., 4:741-50 (1998)).

Integrinfamilien av celleadhesjonsproteiner er sammensatt av 15 a og 8 P underenheter som er uttrykt i minst 22 forskjellige ap heterodimere kombinasjoner (Byzova et al., Mol. Cell, 6(4):851-60 (2000)). Bland disse har minst seks (ctvp3, ctvP5, ct5pi, a2pi, ctvpi og ctipi) av kombinasjonene har blitt implisert i angiogenese (Hynes og Bader, Thromb. Haemost., 78(l):83-7 (1997); Hynes et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 32(5):501-10 (1999)). Integriner fasiliterer cellulær adhesjon til og migrasjon på de ekstracellulære matriksproteinene funnet i intracellulære rom og fundamentmembraner.

Integrin av|33 er en reseptor for en bred variasjon av ekstracellulære matriksproteiner inkludert vitronektin, fibronektin, fibrinogen, laminin, kollagen, Van Willebrand faktor, osteopontin og et fragment av MMP2 (PEX) blant andre (for oversikt se Eliceiri og Cheresh, Cancer J. Sei. Am. 6 Suppl 3:245-9 (2000)). På tross av dens promiskuøse ligandbindingsadferd er ikke av|33 bredt uttrykt i voksent vev, men finnes på noe vaskulært, intestinalt og uterus glatte muskelceller (Vren et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 35:3466-74 (1994). Denne reseptoren er også uttrykt på visse aktiverte leukocytter, på makrofager og osteoklaster, hvor den spiller en avgjørende rolle under benresorpsjon (McHugh et al., J. Clin. Invest., 105:433-40 (2000)). I størst grad blir avP3 oppregulert på endotelceller eksponert til hypoksi og cytokiner så som vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGF-A)

(Suzuma et al., Invest Ophthalmol. Vis. Sei. 39:1029-35 (1998); Walton et al., J. Cell. Biochem. 78:674-80 (2000)). In vivo ble øket ekspresjon av avP3 observert på vaskulære celler i tumorgranuleringsvev, under sårheling, makuladegenerasjon og andre neovaskulære sykdommer. I et utvalg av in vitro og in vivo modeller av tumorangiogenese førte blokade av ctvP3 med monoklonale antistoffer eller

ligandantagonister til dempet blodkardannelse (Brooks et al., Cell 79:1157-64

(1994); Eliceiri og Cheresh, Mol. Med. 4:741-50 (1998)).

Mens det er et stort antall rapporter som fokuserer på mekanismen involvert i regulering av angiogenese under patologiske betingelser så som tumorvekst eller kollateral kardannelse etter myokardial ischemi er overraskende lite kjent når det gjelder rollen til den angiogene prosess under leverregenerering. Etter delvis hepatektomi (PH), uttrykte både hepatocytter og ikke-parenchymale celler vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) mRNA (Mochida et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226:176-9 issn: 0006-291x (1996)), noe som antyder at VEGF ved hjelp av å indusere angiogenese, kan spille en rolle i leverregenerasjon. Imidlertid forandret ikke nøytraliserende antisera mot VEGF restitusjonshastigheten etter skade men førte til en reduksjon av prolifererende endotelceller og hepatocytter i denne modellen (Taniguchi et al., J. Histochem. Cytochem. 49:121-30 (2001)). I støtte for dette hemmet ikke tilsetting av angiogeneseinhibitoren TNP-470 sårheling etter delvis hepatektomi, noe som antyder av TNP470-sensitiv angiogenese ikke er nødvendig under leverregenerasjon (Tanaka et al., Br. J. Surg., 83(10): 1444-7

(1996)).

WO0053757 beskriver Angptl3 (SEKVS ID nr. 2) og andre polypeptider og viser til agonister og antagonister derav i farmasøytiske formuleringer for behandling av cardivaskulære, endotel- og hjertelidelser.

W09967382 beskriver humane angiopoietin-liknende vekstfaktorer (ALGF) utledet fra muskler og lever.

Det er et behov for identifikasjon av nye faktorer som er involvert i leverregenerering og særlig angiogeneseprosessen under leverregenerering.

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en antagonist av Angptl3 i fremstillingen av et medikament for behandling eller forhindring av vevsskade forbundet med en inflammatorisk leversykdom kjennetegnet ved overekspresjon av Angptl3, der antagonisten av Angptl3 binder til Angptl3 eller avp3 integrin og inhiberer evnen til Angptl3 til spesifikt å binde til og regulere cellulære responser mediert av avp3 integrin, og der antagonisten er: a) et antistoff, der antistoffet er et anti-Angptl3 antistoff eller et anti- avp3 antistoff; b) et immunoadhesin, der immunoadhesinet omfatter ligandbindingsregionen av avp3 integrin fusjonert til en immunoglobulinsekvens eller reseptorbindingsregionen av Angptl3 fusjonert til en immunoglobulinsekvens; eller, c) en kombinasjon av et peptid omfattende SEKV. ID NO: 14, et peptid omfattende SEKV. ID NO: 15 og et peptid omfattende SEKV. ID NO: 17.

I følge et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en antagonist av Angptl3 for anvendelse i behandling eller forhindring av vevsskade assosiert med en inflammatorisk leversykdom kjennetegnet ved overekspresjon av Angptl3, der antagonisten av AngptB binder til Angptl3 eller avp3-integrin og inhiberer evnen til Angptl3 til spesifikt å binde til og regulere cellulære responser mediert av avp3-integrin, og der antagonisten er: a) et antistoff eller antistoffragment derav der antistoffet er et anti-AngptB-antistoff eller et anti- avp3-integrinantistoff; b) et immunoadhesin, der immunoadhesinet omfatter ligandbindingsregionen av avp3-integrin fusjonert til en immunoglobulinsekvens eller

reseptorbindingsregionen av AngptB fusjonert til en immunoglobulinsekvens; or

c) en kombinasjon av et peptid omfattende SEKV. ID NO: 14, et peptid omfattende SEKV. ID NO: 15 og et peptid omfattende SEKV. ID NO: 17.

I en foretrukket utforming er vevet humant levervev. Antagonisten er fortrinnsvis en antagonist til AngptB med SEKV. ID nr. 2. Vevsskaden er assosiert med inflammasjon. Inflammasjonen er fortrinnsvis assosiert med en kronisk leversykdom valgt fra gruppen som består av levercirrhose, leverfibrose, kronisk hepatitt, virus hepatitt A, B, C, D, E og G, toksisk metabolsk leverskade, fettlever, ischemi-reperfusjonsskade av lever og sepsis. Leverchirrhose er alkoholisk levercirrhose eller primær biliær cirrhose (PBC). Hepatitt er valgt fra gruppen som består av kronisk autoimmun hepatitt, kronisk alkoholisk hepatitt og ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH).

I en annen utforming er antagonisten en anti-AngptB-antistoff, et anti-avP3-antistoff, eller et immunoadhesin. Antistoffet er fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, et antistoffragment eller et enkeltkjedet antistoff som er valgt fra gruppen som består av Fab-, Fab'-, F(ab')2- og Fv-fragmenter. Det monoklonale antistoff er fortrinnsvis kimerisk, humanisert eller humant. Immunoadhesinet omfatter minst den ligandbindende region av avP3 fusjonert til en immunoglobulinsekvens eller som omfatter minst den reseptorbindende region av AngptB brukt til en immunoglobulinsekvens.

Det beskrives videre en fremgangsmåte til behandling av en kronisk leversykdom i et pattedyrindivid, som omfatter å administrere til pattedyrindividet med behov derav en effektiv mengde av en antagonist av AngptB med SEKV. ID nr. 2, eller et pattedyrhomolog derav. I én utforming er pattedyrindividet et menneske. Behandlingen inkluderer forhindring og mer spesifikt forhindring av progresjon av leversykdom. Antagonisten administrert er en antagonist av AngptB med SEKV. ID nr. 2, eller et antistoff, særlig et anti-AngptB-antistoff eller et anti-ctvP3-antistoff. Den kroniske lever er kjennetegnet ved forhøyet uttrykk av AngptB. Leversykdommen er valgt fra gruppen som består av levercirrhose, leverfibrose, kronisk hepatitt, viral hepatitt A, B, C, D, E og G, toksisk metabolsk leverskade, fettlever, ischemireperfusjonsskade av leveren og sepsis.

Det beskrives videre en fremgangsmåte til behandling av akutt leversykdom, som omfatter å administrere til et pattedyrindivid med behov derav av en terapeutisk effektiv mengde av et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 80 % sekvensidentitet til den humane Angptl3-sekvens til SEKV. ID nr. 2, eller en agonist derav. I én utforming er pattedyrindividet et menneske. Behandlingen inkluderer forhindring og mer spesifikt forhindring av progresjon av akutt leversykdom. Polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som har minst 98 % identitet til den humane Angptl3-sekvensen til SEKV. ID nr. 2, eller en agonist derav. I en foretrukket utforming omfatter polypeptidet aminosyreregionene 281-293 (Pl, SEKV. ID nr. 14), 442-460 (P2, SEKV. ID nr. 15) og 415-430 (P3, SEKV. ID nr. 17) av den humane AngptB-sekvens til SEKV. ID nr. 2.1 en ytterligere foretrukket utforming omfatter polypeptidet fibrinogendomenet til humant AngptB-sekvensen til SEKV. ID nr. 2.1 enda en ytterligere utforming omfatter fremgangsmåten administrering av et ytterligere terapeutisk middel. Det ytterligere terapeutiske middel er en vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) eller fibroblastvekstfaktor (FGF). Agonisten er et agonistantistoff som spesifikt binder AngptB eller avpB.

I følge en utførelsesform i følge oppfinnelsen er den inflammatoriske leversykdommen omfatter lever cirrhose, lever fibrose, kronisk hepatitt, fettlever, iskemisk reperfusjonsskade av leveren, sepsis eller toksisk metabolsk leverskade. , Leverchirrosen kan f eksempel være alkoholisk levercirrhose eller primær biliær cirrhose.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen er den den inflammatoriske leversykdommen er toksisk metabolsk leverskade eller fettlever.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen er anti-AngptB antistoffet eller anti- avp3 integrinantistoffet er et monoklonalt antistoff, antigen bindende antistoffragment, eller enkeltkjedet antistoff.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen er det monoklonale antistoffet er et kimær antistoff, humanisert antistoff eller humant antistoff.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen er antistoffragmentet er et Fab, Fab', F(ab') 2, eller Fv fragment.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen omfatter forhindring det å forhindre progresjon av leversykdommen.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen omfatter AngptB en eller flere av aminosyreregioner 281 til 293, 415 til 430, eller 442 til 460 av SEKV. ID NO:2. I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen omfatter AngptB en aminosyresekvens av SEKV. ID NO:2.

I følge en annen utførelsesform i følge oppfinnelsen er AngptB kodet av et polynukleotid omfattende en nukleinsyresekvens av SEKV. ID NO:l.

I følge et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes

I alle terapeutiske anvendelser (inkludert forhindring), kan AngptB-polypeptidet, eller en agonist eller en antagonist derav, administreres i kombinasjon med et ytterligere terapeutisk middel, så som en ytterligere angiogen faktor, f.eks. vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) eller fibroblastvekstfaktor (FGF).

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er nukleotidsekvensen til AngptB (SEKV. ID nr. 1) (DNA 16451).

Fig. 2A og 2B er aminosyresekvensen til AngptB (SEKV. ID nr. 2).

Fig. 3A er en sammenligning av domenestrukturen til AngptB (SEKV. ID nr. 2) og angiopoietin-1 (ANGI) og angiopoietin-2 (ANG2). Fig. 3B viser resultatene av FACS-analyse av HMVEC-celle inkubert med tilpasset medium som inneholder gD-epitopmerket versjon av humant ANG2, ARP1, AngptB eller kontrollmedium. Fig. 4 viser resultatene av sam-immunoutfellingseksperiment ved å bruke 293 celler sam-transfektert med plasmider som koder gD-merket versjon av henholdsvis ANGI-, ANG2-, ARP1-, AngptB- og Tiel-reseptor eller Tie2-reseptor. Supernatanter som ble immunutfelt med antistoffer mot Tiel eller Tie2 og proteiner oppløst med SDS-PAGE og blottet på PVDF-membran ble inkubert med antistoff henholdsvis mot gD-merke eller Tie-reseptorer. Fig. 5A-C viser homologimodellering av fibrinogendomenet til AngptB. (A) Bånddiagram av påleiring av røntgenstrålestrukturen til C-terminus til y-kjeden av humant fibrinogen (3FIB) i hvitt, og den modellerte struktur av det fibrogen-liknende domenet til AngptB i grønt. Alfaspiralene er vist som sylindere og betatrådene som piler. Regioner som er forskjellig i begge strukturer er merket. (B) Bånddiagram av den modellerte struktur av det fibrinogenliknende domenet til AngptB i grønt. Regioner Pl, P2 og P3 involvert i a5|33 er forsterket med gult. (C) Sekvenssammenstilling av C-terminus til y-kjeden til human fibrinogen (3FIB) (SEKV. ID nr. 27) og det fibrinogenliknende domenet til AngptB (SEKV. ID nr. 28) og humant angiopoietin 1 (SEKV. ID nr. 29), 2 (SEKV. ID nr. 30) og 4 (SEKV. ID nr. 31). Hydrofile og ladede residuer er vist i blått og aromtiske/hydrofobiske residuer i orange. Konsensussekvensen er vist nedenfor sammenstillingen; med konserverte hy dro file/ladede og aromatisk/hydrofobe mutasjoner markert som henholdsvis blå og orange firkanter. Residuer som tilsvarer peptidene brukt i foreliggende undersøkelse er plassert i en gul boks. Nummereringen tilsvarer 3FIB røntgenstrålestrukturen.

Fig. 6A-C presenterer bevismaterialet for at AngptB er et sekrert glykoprotein. (A) Koomassfarget SDS-polyakrylamidgel til immunoaffinitetsrenset humant Angptl 3.

(B) Sølvfarget SDS-polyakrylamidgel til immunoaffinitetsrenset murint AngptB fra forbigående transfekterte CHO-celler. (C) Sammenligning av molekylvekter til

rekombinant AngptB-protein med (+) eller uten (-) PNGase-F-behandling. Den predikterte molekylvekten til gD-merket hAngptB er 60 kDa. Western blot ble utført ved å bruke et anti-gD-antistoff.

Fig. 7A-E presenterer funksjonell analyse av domenene engasjert i endotelial cellebinding ved AngptB og identifikasjon av av|33-integrin som mediator for biologiske responser. (A) HMVEC-adhesjon ble testet etter preinkubasjon med kombinasjoner av peptidene pl, p2 og p3 (100 u.m eller 250 u.m totalt), kontroll (NL6-PP2-scr, 250 urn) eller RGD- eller RGE-peptider (250 |am) før stimulering med 200 nM MA i 4 timer. Adhesjon i nærvær av 200 nM PMA og i fravær av peptider ble gitt en verdi på 100 %. (B) Adhesjon av 293 celler som overuttrykker enten integrin ctllbpB, avpB, av^l, eller av|35 ble testet i mikrotiterplater belagt med 200 ug/ml hAngptB eller BSA. Celler ble tillatt å klebes ved 37°C og kvantifisert etter 4 timer. (C) 96-brønners plater ble belagt med økende mengder av hAngptB ved 4°C natten over, uspesifikk binding ble blokkert med 3 % BSA ved 37°C i 1 time og brønner ble vasket med PBS før HMVEC-celler ble platet. Dataene vist er gjennomsnitt og SD av tre separate eksperimenter. (D) HMVEC ble preinkubert med eller uten 25 mg/ml blokkerende antistoffer anti-a5pi (JBS5), anti-avp3 (LM609), eller anti-ctvp5 (P1F6) før stimulering med 200 nM PMA. Som negativ kontroll ble adhesjon utført i nærvær av 10 mM EDTA. (E) Migrering av ikke-stimulert eller hAngptB-stimulerte (50 u.g/ml) HMCECer i nærvær eller fravær av 25 u.g/ml blokkerende antistoffer anti-ctvpB (LM609), eller anti-ctvP5 (P1F6) i 16 timer. Fig. 8A-C viser at AngptB er uttrykt i hepatocytter under utviklingen og er sterkt oppregulert i syk lever. (A) Northern blot analyse av hAngptB ble gjort ved å bruke humant multivevsblott (Clontech) og ga ekspresjon av hAngptB i lever og nyre. Hvert spor inneholder 2 jag av RNA fra voksen hjerne (BR), hjerte (HT), skjelettmuskel (SM), kolon (CO), tymus (TH), milt (SP), nyre (KD), lever (LI), tynntarm (SI), placenta (PL), lunge (LU), og leukocytter fra perifert blod (PBL). (B) Ekspresjon av hAngptB er sterkt oppregulert i hepatocytter i vev fra levercirrhose og etter toksisk skade med acetominofen. Ingen forandringer ble observert i en levertumorprøve. (C) In situ hybridisering av føtal muselever viser ekspresjon av mAngptB på El5 og El8 i hepatocytter men ikke i erytroide forløpere, endotelceller og megakaryocytter. Fig. 9A-E viser virkningen av CCLF1 på induksjon av in vivo angiogenese i rottehornhinne. (A) Representative flatmonterte fotomikrografer av rottehornhinne 6 dager etter implantasjon av hydronpellets behandlet med buffer (kontroll), (B) murin AngptB (500 ng), (C) VEGF (100 ng), (D) murin AngptB (500 ng) og VEGF (100 ng). (E) Oppsummerte data av in vivo angiogenetisk respons til kontroll, VEGF (100 ng), mAngptB (500 ng), mAngptB (500 ng) og kombinasjoner som angitt. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt + SE, n=5 dyr/gruppe. p<0,005 sammenlignet med kontroll (Mann-Whitney-test for ikke-parametriske verdier). Fig. 10A-B viser en beskyttende virkning av murin AngptB i CC 14 indusert levertoksisitet som vurdert ved serumnivåer av aspartat transferase (AST) på dag 7 etter adenoviral infeksjon på dag 0 og CC14-behandling på dag 4. Fig. 10A viser like nivåer av ekspresjon på dag 7 etter adenoviral infeksjon på dag 0 og CC14-behandling på dag 4 på alle konstruktene testet. Fig. 10B viser AST-nivåer i serum fra mus på dag 7 behandlet med de angitte virale vektorer på dag 0 og CC 14 på dag 4 (p<0,0001). Fig. 11 A-B viser en økning i serum AST-nivåer etter forlenget ekspresjon av murin AngptB i levre fra C57/B16 villtypemus. Fig. 1 IA viser AST-nivåer i serum fra mus på forskjellige tidspunkter etter behandling med de angitte virale konstruktene på dag 0 og CC14-behandling på dag 4. Fig. 1 IB viser en økning i ALT- og AST-nivåer i serum fra RAG2 knock-out mus 2 uker etter adenoviral infeksjon. Resultater er vist med gjennomsnitt + SEM. Antall dyr pr. gruppe var 6 (p<0,0001).

Fug, 12A-D viser en økning i vaskulær lekkasje i hud fra K5-AngptB transgene mus eller i villtype FVB-mus i respons til intradermal administrering av AngptB-uttrykkende adenovirale vektorer. Fig. 12A viser resultater fra virkelig tid RT-PCR-analyse av RNA isolert fra forskjellige organer hos transgene og kulltilpassede villtype kontrollmus. Transgen ekspresjon i huden nådde ca. 10 % av de endogene AngptB-ekspresjonsnivåer som ble oppdaget i leveren. Fig. 12B viser resultater fra virkelig tid RT-PCR-analyse av RNA isolert fra hudbiopsier fra transgene og kulltilpassede villtypekontrollmus på forskjellige tidspunkter etter fødsel. Fig. 12C viser resultater fra Evans Blue assay som ble utført på 11 uker gamle transgene og kulltilpassede villtype kontrollmus for å bestemme nivået av vaskulær permeabilitet. Transgene mus viste en signifikant økning i vaskulær permeabilitet i basaltilstanden (venstre paneler) men ikke når de ble utfordret med sennepsolje (høyre panel). Mengden av ekstravaserte Evans Blue farge ble målt med lysspektrofotometer på 610 nm absorpsjon og uttrykt som innhold farge pr. 1 mg våtvektvev (nedre panel). Resultater er vist som gjennomsnitt + SEM og antall dyr pr. gruppe var 6, P<0,05. Fig. 12D viser resultater fra Evan Blue assayet utført 6 dager etter administrering av FVB-mus injisert intradermalt med lxl0<9>Pfu av det angitte adenovirale konstrukt. Hud av mus behandlet med AngptB (p<0,05) eller VEGF (p<0,005) viste en signifikant økning i vaskulær permeabilitet under basale forhold (venstre paneler) under sammenligning med kontrollbehandlede dyr (LacZ). Mengder av ekstravaserte Evans Blue farge ble målt med et lysspektrofotometer på 610 nm og uttrykt som innhold farge pr. 1 mg våtvekt vev. Resultatene er vist som gjennomsnitt + SEM, og antall dyr pr. gruppe er 6, P<0,05.

Fig. 13 viser bindingsnivået til ferskt isolerte murine hepatocytter til rekombinant murin AngptB (mAngptB). Hepatocyttadhesjon til kulturskåler belagt med de angitte konsentrasjoner av rekombinant mAngptB, fibronektin eller BSA-kontroll. Uspesifikk binding ble blokkert med 3 % BSA ved 37°C i 1 time, og brønnene ble vasket med PBS før cellene ble utplatet. Dataene vist representerer gjennomsnitt + SD av ett representativt eksperiment kjørt i trefold i totalt tre uavhengige eksperimenter.

A. Definisjoner

Betegnelsen "leversykdom" er brukt heri i bredest mulig form og refererer seg til enhver sykdom i leveren assosiert med enhver type av leverskade, uten hensyntagen til den underliggende årsak. Således kan leversykdom resultere f.eks. fra infeksiøse eller autoimmune prosesser, fra mekanisk eller kjemisk skade til leveren, eller fra kreft, hvorav alle er inkludert innenfor definisjonen "leversykdom". Kjemisk skade på leveren kan forårsakes av et utvalg av toksiner, så som alkohol, karbontetraklorid, trikloretylen, jernoverdose, legemiddeloverdose, legemiddelbivirkninger etc.

Betegnelsen "vevsskade assosiert med inflammasjon" og grammatikalske variasjoner derav blir brukt til å betegne enhver vevsskade som i det minste delvis resulterer fra inflammasjon eller er etterfulgt av en inflammatorisk respons. Vevet kan f.eks. være levervev eller hjertevev og vevsskaden kan f.eks. være assosiert med en inflammatorisk leversykdom.

Betegnelsen "inflammatorisk leversykdom" som brukt heri refererer seg til enhver leversykdom, viss patogenese involverer aktivering og rekruttering av inflammatoriske celler til leveren, uten hensyn til om den underliggende årsaken er en infeksiøs eller autoimmun prosess, kjemisk skade til leveren eller annet. Således inkluderer inflammatoriske leversykdommer uten begrensning alkoholisk hepatitt og cirrhose, viral hepatitt, ischemi reperfusjonsskade på lever, sepsis og primær gallecirrhose (PBC). For overtrykk, se Lawson et al., Toxicol Sei 54:509-16 (2000).

Betegnelsen "kronisk leverskade" blir brukt heri for å betegne leversykdommerkarakterisert veden overekspresjon av AngptB og inkluderer, uten begrensning, inflammatoriske sykdommer i leveren og leverturmorer. Inflammatoriske sykdommer i leveren inkluderer f.eks. cirrhose, så som alkoholisk levercirrhose og primær gallecirrhose (PBC), leverfibrose, kronisk hepatitt, dvs. kronisk autoimmun hepatitt, kronisk alkoholisk hepatitt, ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH, også kjent som steatose), viral hepatitt A, B, C, D, E og G, toksisk metabolsk leverskade, fettlever, ischemireperfusjonsskade på leveren, og sepsis. Levertumorer inkluderer f.eks. hepatocellulær karsinom, kolangiokarsinom og metastatisk kreft i leveren.

Betegnelsen "akutt leversykdom" er brukt heri for å betegne en leversykdom med kort varighet, hvor historien typisk ikke overskrider 6 måneder. Inkludert i denne definisjonen er f.eks. akutt hepatitt, akutt autoimmun hepatitt og akutt alkoholisk hepatitt og akutt leversvikt. Spesifikt inkludert i definisjonen er enhver leversykdom av kort varighet som ikke erkarakterisert vedoverekspresjon av AngptB.

"Alkoholisk hepatitt" som brukt heri, inkluderer akutt kronisk hepatitt som resulterer fra utstrakt alkoholkonsumpsjon og kan variere fra en mild hepatitt med unormale laboratorietester som den eneste indikasjon på sykdommen, til alvorlig leverdysfunksjon med komplikasjoner så som gulsott (gul hud forårsaket av bilirubintilbakeholdelse), hepatisk ensefalopati (nevrologisk dysfunksjon forårsaket av leversvikt), ascites (væskeakkumulering i abdomen), blødende esofagusvariser (åreknutevener i esofagus), unormal blorstørkning og koma.

Betegnelsen "viral hepatitt" som brukt heri betegner hepatitt som resulterer fra hepatitt A, B, C, D, E eller G infeksjon.

Hepatitt A virus (HAV) er en virus fra enterovirusgruppen i Picornaviridae-familien, som vanligvis forårsaker en mild sykdomkarakterisert vedhurtig inntredelse av feber, sykdomsfølelse, kvalme, anoreksi og abdominal smerte etterfulgt av flere dager med gulsott.

Hepatitt B virus (HBV) er en for det meste dobbelttrådet DNA-virus i Hepadnaviridae- familien. HBV forårsaker hepatitt hos mennesker og beslektet virus i denne familien forårsaker hepatitt hos ender, jordrotter og skogmurmeldyr. HBV-genomet har fire gener: pol, env, pre-coreog X som henholdsvis koder det virale DNA-polymerase, kappeprotein, forkjerneprotein (som blir utviklet til viral kapsid) og protein X. Funksjonen til protein X er ikke klar men den kan være involvert i aktivering av vertscellegener og utvikling av kreft. HBV forårsaker akutt kronisk hepatitt. Sjansene for å bli kronisk infisert avhenger av alder. Ca. 90 % infiserte nyfødte og 50 % av infiserte unge barn vil bli kronisk infisert. I kontrast utvikler bare ca. 5-10 % av immunokompetente voksne infisert med HBV kronisk hepatitt B.

Hepatitt C virus (HCV) er en positiv, enkelttrådet RNA-virus i Flaviridae- familien. Genomet er ca. 10000 nukleotider og koder et enkelt polyprotein på ca. 3000 aminosyrer. Polyproteinet blir prosessert av vertscelle og virale proteaser inn i tre hovedstrukturene proteiner og flere ikke-strukturelle proteiner som er nødvendig for virusreplikasjon. Flere forskjellige genotyper av HCV med noe forskjellig genomiske sekvenser er blitt identifisert som korrelerer med forskjeller i prognose og respons til behandling. Ca. 85 % av individene som er akutt infisert med HCV blir kronisk infisert. Følgelig er HCV en viktig årsak til kronisk (som varer lenger enn 6 måneder) hepatitt. Når infeksjonen er kronisk blir virus nesten aldri borte uten behandling. I sjeldne tilfeller forårsaker HCV-infeksjon klinisk akutt sykdom og til og med leversvikt, mens imidlertid de fleste tilfellene med akutt infeksjon er klinisk udetekterbare.

Hepatitt D virus (HDV, også kalt deltavirus) er en liten sirkulær RNA-virus. HDV er replikasjonsdeffektiv og kan ikke utvikle seg i fravær av en annen virus. Hos mennesker skjer HDV-infeksjon bare i nærvær av HBV-infeksjon.

Hepatitt E virus (HEV) forårsaker vanligvis hepatitt klinisk ikke kan skilles fra hepatitt A sykdommen. Symptomer inkluderer sykdomsfølelse, anoreksi, abdominal smerte, leddsmerter og feber. Hepatitt E skjer både i epidemiske og sporadisk endemiske former vanligvis assosiert med kontaminert drikkevann.

Hepatitt G virus (HBV) er en relativt nylig oppdaget flavivirus beslektet men adskilt fra HCV, som kan forårsake akutt og kronisk hepatitt.

Ischemireperfusjonsskade skjer når blodgjennomstrømningen til en region av kroppen blir temporært stoppet (ischemi) og deretter reetablert (reperfusjon). Betegnelsene "ischemia reperfusjonsskade" og "ischemisk reperfusjonsskade" som blir brukt om hverandre betegner initiell skade assosiert med oksygendeprivasjon til en celle og den påfølgende skade assosiert med den inflammatoriske reaksjonen når cellen blir gjentilført oksygen. Ischemireperfusjonsskade kan skje under visse kirurgiske prosedyrer, så som reparasjon av visse aortaanaurismer og organtransplantasjon. Skaden kan skje i de deler av kroppen hvor blodtilførselen ble avbrutt, eller den kan skje i deler fullt tilført med blod under ischemiperioden. Ischemireperfusjonsskade i leveren kan resultere f.eks. fra hepatiske og gallekirurgiske reseksjoner, og klinisk er den manifestert ved slike komplikasjoner som leverdysfunksjon inkludert akutt hepatocellulær skade og nekrose.

"Primær gallecirrhose (PBC)" er en sykdomkarakterisert vedinflammatorisk nedbrytning av de små galleganger i leveren. PBC fører eventuelt til levercirrhose. Etiologien til PBC er ikke fullstendig forstått, men på grunn av nærvær av autoantistoffer er det generelt ment å være en autoimmun sykdom mens imidlertid andre etiologier, så som infeksiøse midler, ikke er blitt fullstendig ekskludert. Ca. 90 % av pasienter diagnostisert med PBC er kvinner, vanligvis mellom 40 og 60 års alder.

"Sepsis" er et resultat av bakteriell infeksjon som kan oppstå i enhver del av kroppen, inkludert lever eller gallegang. Sepsis kan være en livstruende situasjon spesielt hos folk med et svekket immunsystem.

Betegnelsen "angiogenese" som brukt heri betegner prosessen hvorved nye blodkar oppstår fra eksisterende vaskulatur og krever både proliferasjon og motilitet til endotelcellene for å foregå.

Betegnelsen "cirrhose" er brukt heri for å betegne en patologisk leverskadekarakterisertanatomisk med utstrakte noduler i leveren kombinert med fibrose. Cirrhose er den avsluttende fellesveien for de fleste typer av kroniske leversykdommer, inkludert de assosiert med kronisk alkoholmisbruk, kronisk virushepatitt, metabolske og gallesykdommer.

Betegnelsen "AngptB-polypeptid", "AngptB-protein" og "AngptB" er brukt om hverandre og omfatter native sekvens AngptB og AngptB-polypeptidvarianter (som er videre definert heri). AngptB-polypeptidet kan isoleres fra et utvalg av kilder, så som fra humane vevstyper eller fra en annen kilde, eller fremstilt ved rekombinant og/eller syntetiske metoder. Det skal bemerkes at AngptB tidligere ble referert til som "FLS139", "NL6", eller "CCFL1". Følgelig enhver benevnelse av AngptB skal også leses som å referere seg til FLS139-, NL6- og CCFLl-polypeptider.

En "nativ sekvens AngptB" eller "nativ AngptB" omfatter et polypeptid som har samme aminosyresekvens som et AngptB-molekyl avledet fra naturen. En slik nativ sekvens AngptB kan isoleres fra naturen eller kan fremstilles ved rekombinante og/eller syntetiske midler. Betegnelsen "nativ sekvens AngptB" eller "nativ AngptB" omfatter spesifikt naturlig forekommende trunkerte eller sekrete former (f.eks. en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende variantformer (f.eks. alternativt spleisede former), og naturlig forekommende alleliske varianter av AngptB. I én utforming av oppfinnelsen er den native sekvensen AngptB en moden eller full-lengde nativ sekvens AngptB som omfatter aminosyre 1 til 460 i henhold til SEKV. ID nr. 2. Mens det humane AngptB-polypeptid med SEKV. ID nr. 2 er vist å begynne med metioninresiduet designert heri som aminosyreposisjon 1, er det mulig at en annen metioninresidu lokalisert enten oppstrøms eller nedstrøms fra aminosyreposisjon 1 i SEKV. ID nr. 2 kan anvendes som startaminosyreresidu for AngptB-polypeptidet. I tillegg inkluderer betegnelsen "nativ sekvens AngptB" og "nativ AngptB" spesifikt polypeptid uten det initierende metionin.

"AngptB-varianten" eller "AngptB-variantpolypeptidet" viss betegnelser er brukt om hverandre, betyr et aktivt AngptB-polypeptid som definert nedenfor som har minst ca. 80 % aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen til (a) residu 1 til 460 i AngptB-polypeptidet med SEKV. ID nr. 2, eller en ikke-human pattedyrhomolog derav, eller (b) et annet spesifikt avledet fragment av aminosyresekvensen med SEKV. ID nr. 2, eller et ikke-humant pattedyrhomolog derav. Slike AngptB-variantpolypeptider inkluderer f.eks. AngptB-polypeptider hvori én eller flere aminosyrerester blir tilsatt, eller tatt vekk, på N- og/eller C-

terminus, så vel som innenfor én eller flere interne domener, fra SEKV. ID nr. 2. Vanligvis vil et AngptB-variantpolypeptid ha minst ca. 80 % aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 81 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 82 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 83 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 84 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 85 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 86 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 87 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 88 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 89 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 90 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 91 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 92 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 93 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 94 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 95 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 96 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 97 %

aminosyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 98 %

aminosyresekvensidentitet og enda mer fortrinnsvis minst ca. 99 % aminosyresekvensidentitet med residuene 1 til 460 i AngptB-polypeptid med SEKV. ID nr. 2, eller en ikke-human pattedyrhomolog derav. AngptB-variantpolypeptidet omfatter ikke en nativ Angptl-polypeptidsekvens. Vanligvis er AngptB-variantpolypeptider minst ca. 10 aminosyrer i lengde, ofte minst ca. 20 aminosyrer i lengde, ofte minst ca. 30 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 40 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 50 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 60 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 70 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 80 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 90 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 100 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 150 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 200 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 250 aminosyrer i lengde, mer ofte minst ca. 300 aminosyrer i lengde eller mer. Særlig foretrukne AngptB-varianter bibeholder minst én aminosyreregion 281 til 293, 415 til 430, og 442-460 av det native humane AngptB-sekvensen med SEKV. ID nr. 2, eller tilsvarende region(er) i et ikke-humant pattedyr AngptB-homolog, eller inneholder bare konservative aminosyresubsitusjoner innen slike regioner.

Betegnelsen "fibrinogent domene" eller "fibrinogenlignende domene" er brukt for å betegne aminosyrer fra ca. posisjon 238 til ca. posisjon 460 i aminosyresekvensen til AngptB (SEKV. ID nr. 2).

"Prosent (%) aminosyresekvensidentitet" med hensyn på Angptl3-polypeptidsekvensene identifisert heri er definert som prosentandel av aminosyreresiduer i en kandidatsekvens som er identisk med aminosyreresiduene i en Angptl3-sekvens, etter sammenstilling av sekvensene og innføring av gap, hvis nødvendig, for å oppnå maksimal prosent sekvensidentitet, og ikke betraktning av noen konservative substitusjoner som del av sekvensidentiteten. Sammenstilling med den hensikt å bestemme prosent aminosyresekvensidentitet kan utføres på forskjellige måter som er innenfor kunnskapen på området, f.eks. ved å bruke offentlig tilgjengelig datamaskinprogramvare så som BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 eller Megalign (DNASTAR) programvare. De med kunnskap på området kan bestemme egnede parametere for å måle sammenstilling, inkludert enhver algoritme som er nødvendig for å oppnå maksimal sammenstilling over hele lengden av sekvensene som blir sammenlignet. Med hensikt heri er imidlertid prosent aminosyresekvensidentitetsverdier oppnådd som beskrevet nedenfor ved å bruke sekvenssammenligningsdatamaskinvare ALIGN-2, hvor den fullstendige kildekode for ALIGN-2-programmet er tilveiebragt i fig. 4A-Q. ALIGN-2-sekvenssammenligningsdatamaskinprogramvare ble fremstilt av Genetech, Inc. og kildekoden vist i fig. 4A-Q er blitt innlevert med brukerdokumentasjon i U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, hvor det er registrert under U.S. Copyright Registration No. TXU510087. ALIGN-2-programmet er offentlig tilgjengelig gjennom Genetech, Inc., South San Francisco, California eller kan kompileres fra kildekoden tilveiebragt i fig. 4A-Q. ALIGN-2-programmet bør kompileres for anvendelse på en UNIX operativt system, fortrinnsvis digital UNIX V4.0D. Alle sekvenssammenligningsparametere er satt ved ALIGN-2-programmet og varierer ikke.

For foreliggende hensikter er % aminosyresekvensidentitet til en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B (som alternativt kan nevnes som en gitt aminosyresekvens A har eller omfatter en viss % aminosyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B) beregnet som følger:

100 ganger fraksjonen X/Y

hvor X er antall aminosyreresiduer skåret som identiske tilpasninger ved sekvenssammenstillingsprogrammet ALIGN-2 idet programmets sammenstilling av A og B, og hvor Y er det totale antall aminosyreresiduer i B. Det skal forstås at når lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden av aminosyresekvens B vil prosent aminosyresekvensidentitet mellom A og B ikke være lik prosent aminosyresekvensidentitet mellom B og A.

Med mindre spesifikt angitt på annen måte er alle prosent

aminosyresekvensidentitetsverdier brukt heri oppnådd som beskrevet ovenfor ved å

bruke ALIGN-2-selvenssammenligningsdatamaskinprogramvaren. Prosent aminosyresekvensidentitet kan imidlertid også bestemmes ved å bruke sekvenssammenligningsprogrammet NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2-sekvenssammenligningsprogrammet kan lastes ned fra http:// www. ncbi. nlm. nih. gov. NCBI-BLAST2 bruker flere søkeparametere hvori alle av søkeparameterne er satt på standardverdier inkludert f.eks., umaskering = ja, tråd = alle, forventet inntreden =10, minimum lav kompleksitetslengde = 15/5, flerpass e-verdi = 0,01, konstant for multipassering = 25, dropoff for avsluttende gapsammenstilling = 25 og skårematrise = BLOSUM62.

I situasjoner hvor NCBI-BLAST2 blir anvendt for

aminosyresekvenssammenligninger blir prosent aminosyresekvensidentitet for en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B (som alternativt kan benevnes som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss prosent aminosyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B) beregnes som følger:

100 ganger fraksjon X/Y

hvor X er antall aminosyreresiduer skåret som identiske tilpasninger ved et sekvenssammenstillingsprogram NCBI-BLAST2 i det programmets sammenstilling A og B, og hvor Y er totalt antall aminosyreresiduer i B. Det skal forstås at der hvor lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden av aminosyresekvens B vil % aminosyresekvensidentitet for A til B ikke være lik % aminosyresekvensidentitet for B til A.

"AngptB-variant nukleinsyresekvens" betyr en nukleinsyremolekyl som koder et aktivt AngptB-polypeptid som definert nedenfor og som har minst ca. 80 % nukleinsyresekvensidentitet med enten (a) en nukleinsyresekvens som koder residuet 1 til 460 av AngptB-aminosyresekvens med SEKV. ID nr. 2, eller en ikke-human pattedyrhomolog derav, eller (b) en nukleinsyresekvens som koder et annet spesifikt avledet fragment av aminosyresekvens med SEKV. ID nr. 2 eller en ikke-human pattedyrhomolog. Vanligvis vil en AngptB-variant polynukleotid ha minst ca. 80 % nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 81 % nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 82 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 83 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 84 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 85 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 86 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 87 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 88 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 89 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 90 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 91 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 92 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 93 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 94 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 95 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 96 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 97 %

nukleinsyresekvensidentitet, mer fortrinnsvis minst ca. 98 %

nukleinsyresekvensidentitet, og enda mer fortrinnsvis minst ca. 99 % nukleinsyresekvensidentitet med enten (a) en nukleinsyresekvens koder residuene 1 til 460 i SEKV. ID nr. 2, eller en ikke-human pattedyrhomolog av et slikt humant polypeptid.

Vanligvis er AngptB-variant nukleinsyresekvensene minst ca. 30 nukleotider i lengde, ofte minst ca. 60 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 90 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 120 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 150 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 180 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 210 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 240 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 270 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 300 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 450 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 600 nukleotider i lengde, mer ofte minst ca. 900 nukleotider i lengde eller mer.

"Prosent (%) nukleinsyresekvensidentitet" med hensyn på AngptB-polypeptidkodende nukleinsyresekvenser identifisert heri er definert som prosentandelen av nukleotider i en kandidatsekvens som er identiske med nukleotidene i et AngptB-polypeptidkodende nukleinsyresekvens, etter sammenstilling av sekvensene og innføring av gap, hvis nødvendig for å oppnå maksimal prosent sekvensidentitet. Sammenstilling med hensikt å bestemme prosent nukleinsyresekvensidentitet kan utføres på forskjellige måter som er innenfor kunnskapen på området, f.eks. ved å bruke offentlig tilgjengelig dataprogramvare så som BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 eller Megalign (DNASTAR) programvare. De med kunnskap på området kan bestemme egnet parameter for å måle sammenstilling, inkludert enhver algoritme nødvendig for å oppnå maksimal sammenstilling over hele lengden av sekvensene som blir sammenlignet. For hensikter heri er imidlertid prosent nukleinsyresekvensidentitetsverdier oppnådd som beskrevet nedenfor ved å bruke sekvenssammenligningsdataprogramvaren ALIGN-2. ALIGN-2-sekvenssammenligningsdataprogramvare er autorisert av Genetech, Inc. og kildekoden har blitt innlevert med brukerdokumentasjon i U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, hvor det er registrert under U.S. Copyright Registration No. TXU510087. ALIGN-2-programmet er offentlig tilgjengelig gjennom Genetech Inc., South San Francisco. ALIGN-2-programmet bør kompileres for anvendelse i et UNIX operativt system, fortrinnsvis digitalt

UNIX V4.0D. Alle sekvenssammenligningsparametere er satt ved ALIGN-2-programmet og varierer ikke.

For hensikter heri er prosent nukleinsyresekvensidentitet til en gitt nukleinsyresekvens C til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D (som alternativt kan kalles en gitt nukleinsyresekvens C som har eller omfatter en viss prosent nukleinsyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D) beregnet som følger:

100 ganger fraksjon W/Z

hvor W er antall nukleotider skåret som identiske tilpasninger ved sekvenssammenstillingsprogrammet ALIGN-2 idet programmets sammenstilling av C og D, hvor Z er totalt antall nukleotider i D. Det skal forstås at hvor lengden av nukleinsyresekvens C ikke er lik lengden av nukleinsyresekvens D vil prosent nukleinsyresekvensidentitet for C til D ikke være lik prosent

nukleinsyresekvensidentitet for D til C.

Med mindre spesifikt angitt på annen måte, er alle prosent

nukleinsyresekvensidentitetsverdier brukt heri oppnådd som beskrevet ovenfor ved å bruke ALIGN-2-sekvenssammenligningsdataprogrammet. Prosent nukleinsyresekvensidentitet kan imidlertid også bestemmes ved å bruke sekvenssammenligningsprogrammet NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2-sekvenssammenligningsprogrammet kan lastes ned fra http:// www. ncbi. nlm. nih. gov. NCBI-BLAST2 bruker flere søkeparametere hvori alle av de søkeparameterne er satt til standardverdier inkludert f.eks. avmaskering = ja, tråd = alle, forventede hendelser = 10, minimum lav kompleksitetslengde = 15/5, multipasserings e-verdi = 0,01, konstant for multipassering = 25, dropoff for avsluttende gapsammenstilling = 25 og skårematrise = BLOSUM62.

I situasjonene hvor NCBI-BLAST2 blir anvendt for sekvenssammenligninger er prosent nukleinsyresekvensidentitet for en gitt nukleinsyresekvens C til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D (som alternativt kan omformes som en gitt nukleinsyresekvens C som har, eller omfatter en viss prosent nukleinsyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D) beregnet som følger:

100 ganger brøken W/Z

hvor W er antall nukleotider skåret som identiske tilpasninger ved sekvenssammenstillingsprogrammet NCBI-BLAST2 i at det programmets sammenstilling av C og D, og hvor Z er totalt antall nukleotider i D. Det skal forstås at der hvor lengden av nukleinsyresekvens C ikke er lik lengden av

nukleinsyresekvens D, vil prosent nukleinsyresekvensidentitet for C til D ikke være lik prosent nukleinsyresekvensidentitet for D til C.

I andre utforminger er AngptB-variant polynukleotider nukleinsyremolekyler som koder et aktivt AngptB-polypeptid og som er i stand til å hybridisere, fortrinnsvis under strenge hybridiserings- og vaskebetingelser, til nukleotidsekvenser som koder full-lengde AngptB-polypeptid med SEKV. ID nr. 2. AngptB-variant polypeptid kan være de som blir kodet av et AngptB-variant polynukleotid.

Betegnelsen "positiv" i sammenheng med

aminosyresekvensidentitetssammenligninger utført som beskrevet ovenfor inkluderer aminosyreresiduer i sekvensene sammenlignet som ikke bare er identiske men også de som har lignende egenskaper. Aminosyreresiduer som skårer en positiv verdi til en aminosyreresidu av interesse er de som enten er identiske til aminosyreresiduen av interesse eller har en foretrukket substitusjon av aminosyreresidu av interesse.

For hensikter heri er prosent verdi av positive av en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B (som alternativt kan omformes som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss prosent positiv til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B) beregnet som følger:

100 ganger brøken X/Y

hvor X er antall aminosyreresiduer som skårer en positiv verdi som definert ovenfor ved sekvenssammenstillingsprogrammet ALIGN-2 ved at programmets sammenstilling av A og B, og hvori Y er totalt antall aminosyreresiduer i B. Det skal forstås at der hvor lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden av aminosyresekvens B vil prosent positive av A til B ikke være lik prosent positive av B til A.

Betegnelsen "antistoff er brukt i bredest mulig betydning og dekker spesifikt f.eks. enkle anti-AngptB monoklonale antistoffer (inkludert agonist, antagonist og nøytraliserende antistoffer), anti-AngptB-antistoffsammensetninger med polyepitopisk spesifisitet, enkeltkjedet anti-AngptB-antistoffer, og fragmenter av anti-AngptB-antistoffer (se nedenfor). Betegnelsen "monoklonalt antistoff som brukt heri betegner et antistoff oppnådd fra en populasjon av hovedsakelig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffer som omfatter populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i små mengder.

Betegnelsen "monoklonalt antistoff som brukt heri betegner et antistoff oppnådd fra en populasjon av hovedsakelig homogene antistoffer, dvs. de individuelle antistoffene som omfatter populasjonen er identiske unntagen for mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan være tilstede i små mengder.

"Antistoff-fragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, fortrinnsvis antigenbindingen eller variable region av det intakte antistoffet. Eksempler på antistoff-fragmenter inkluderer Fab-, Fab'-, F(ab')2- og Fv-fragmenter, dialegemer; lineære antistoffer (Zapata et al., Protein Eng.. 8( 10): 1057-1062 [1995]); enkeltkjedede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoff-fragmenter.

Papainfordøyelse av antistoffer produserer to identiske antigenbindende fragmenter kalt "Fab"-fragmenter, hver med et enkelt antigenbindende sete, og en rest "Fc"-fragment, viss navn reflekterer dets evne til lett å krystalliseres. Pepsinbehandling gir et F(ab')2-fragment som har to antigenkombinerende seter og er fremdeles i stand til å tverrbinde antigen.

"Fv" er minimum antistoff-fragmentet som inneholder et fullstendig antigengjenkjennende og -bindende sete. Denne regionen består av en dimer med ett tungt- og ett lett-kjede variabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfigurasjonen at de tre CDR av de variable domenene interagerer for å definere et antigenbindende sete på overflaten av VH-VL-dimeren. Kollektivt gir de seks CDR antigenbindende spesifisitet til antistoffet. Selv et enkelt variabelt domene (eller halvparten av en Fv som omfatter bare tre CDR spesifikt for et antigen) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigen, skjønt med en lavere affinitet enn hele bindingssetet.

Fab-fragmentet inneholder også det konstante domenet til den lette kjede og det første konstante domenet (CH1) i den tunge kjeden. Fab-fragmenter adskiller seg fra F ab'-fragmentet ved tilsetting av noen residuer på karboksyterminus i den tunge kjede CH1-domenet som inkluderer én eller flere cysteiner fra antistoffhengselregionen. Fab'-SH er designeringen heri for Fab' hvori cysteinresiduet(ene) til de konstante domenene bærer en fri tiolgruppe. F(ab')2-antistoff-fragmenter var opprinnelig produsert som par av Fab'-fragmenter som har hengselcysteiner mellom seg. Andre kjemiske koblinger av antistoff-fragmenter er også kjent.

De "lette kjeder" til antistoffer (immunoglobuliner) fra enhver virveldyreart kan plasseres i én eller to klart adskilte typer, kalt kappa (.) og lambda (.), basert på aminosyresekvensene til deres konstante domener.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet for deres tunge kjeder, kan immunoglobuliner plasseres i forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere oppdeles i underklasser (isotyoper), f.eks. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA og IgA2. De tungkjedekonstante domenene som korresponderer til de forskjellige klassene av immunoglobuliner er kalt a, y og u., henholdsvis. Underenhets strukturene og de tredimensjonale konfigurasjoner til forskjellige klasser av immunoglobuliner er velkjent.

Betegnelsen "dialegemer" betegner små antistoff-fragmenter med to antigenbindende seter, hvor fragmentene omfatter et tungkjede variabelt domene (Vh) koblet til et lettkjede variabelt domene (Vl) i den samme polypeptidkjede (Vh-Vl). Ved å bruke en linker som er altfor kort til å tillate paring mellom de to domenene på samme kjeden blir domenene tvunget til å pares med de komplementære domenene på en annen kjede og danner to antigenbindende seter. Dialegemer er beskrevet mer fullstendig i f.eks. EP 404 097; WO 93/11161; og Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90:644-6448 (1993).

Et "isolert" antistoff er ett som er blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent av dets naturlige omgivelser. Kontaminantkomponenter av dets naturlige omgivelse er materialer som ville interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for antistoffet og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteinøse eller ikke-proteinøse oppløsninger. I foretrukne utforminger vil antistoffet renses (1) til mer enn 95 vekt% av antistoffet som bestemt ved Lowry-metoden og mest fortrinnsvis mer enn 99 vekt%, (2) til en grad tilstrekkelig til å oppnå minst 15 residuer av N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av en sekvensanordning med rotasjonskopp (spinning cup sequenator), eller (3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved å bruke Coomassiblått eller fortrinnsvis sølvfarge. Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ i rekombinante celler siden minst én komponent av antistoffets naturlige omgivelser ikke vil være tilstede. Ordinært vil imidlertid isolert antistoff fremstilles med minst ett rensetrinn.

Betegnelsen "variabel" betegner det faktum at visse deler av de variable domenene adskiller seg i stor grad i sekvens blant antistoffer og blir brukt i bindingen og spesifisiteten til hvert hele antistoff for dets spesielle antigen. Variabiliteten er imidlertid ikke likt distribuert gjennom de variable domenene til antistoffene. Den er konsentrert i tre segmenter kalt komplementarbestemmende regioner (CDR) eller hypervariable regioner, både i lettkjedet og tungkjedet variable domener. De mer sterkt konserverte deler av variable domener er kalt rammeverk (FR) regioner. De variable domenene til native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR-regioner, som i stor grad adopterer en p-arkkonfigurasjon, sammenbundet med tre CDR, som danner løkker som sammenkobler og i noen tilfeller danner del av p-arkstrukturen. CDR'ene i hver kjede blir holdt sammen i tett nærhet ved FR-regionene, og, med CDR fra den andre kjede, og bidrar til dannelsen av de antigenbindende setene i antistoffet (se Kabat et al., NIH Publ. nr. 91- 3242. vol. I, sider 647-669 (1991)). De konstante domenene er ikke involvert direkte i binding av et antistoff til et antigen, men utviser forskjellige effektorfunksjoner, så som deltagelse av antistoffet i antistoff-avhengig cellulær toksisitet.

Betegnelsen "hypervariabel region" betegner når den brukes heri aminosyreresiduene til et antistoff som er ansvarlig for antigenbinding. Den hypervariable region omfatter aminosyreresiduer fra en

"komplementærbestemmende region" eller "CDR" (dvs. residuer 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i det lettkjedede variable domenet og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i det tungkjedevariable domenet; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) og/eller de residuer fra en "hypervariabel løkke"

(dvs. residuene 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i det lettkjedevariable domenet og 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i det tungkjedevariable domenet; Clothia og Lesk, J. Mol. Biol.. 196:901-917 [1987]). "Rammeverk" eller "FR" residuer er de variable domeneresiduene utover residuene fra den hypervariable regionen som heri er definert.

"Humaniserte" former av ikke-human (f.eks. murin) antistoffer er kimeriske immunoglobuliner, immunoglobulinkjeder eller fragmenter derav (så som Fv, Fab, Fab', F(ab')2eller andre antibindende undersekvenser av antistoffet) som inneholder minimal sekvens avledet fra ikke-humant immunoglobulin. For det meste er humaniserte antistoffer humane immunoglobuliner (resipient antistoff) i hvilke residuer fra en CDR til resipienten blir erstattet av residuer fra en CDR av en ikke-human art (donoarantistoff) så som mus, rotte eller kanin som har den ønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller er Fv FR-residuer av det humane immunoglobulin erstattet ved tilsvarende ikke-humane residuer. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte residuer som er funnet verken i resipientantistoffet eller i de importerte CDR eller rammeverkssekvensene. Disse modifikasjoner er gjort for ytterligere å raffinere og maksimalisere antistoffytelsen. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte hovedsakelig alle av minst én, typisk to, variable domener, i hvilke alle eller hovedsakelig alle CDR-regioner tilsvarer de til et ikke-humant immunoglobulin og alle eller hovedsakelig alle av FR-regionene er de til en human immunoglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet vil også optimalt omfatte minst én del av en immunoglobulinkonstant region (Fc), typisk den til et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature. 321:522-525

(1986); Reichmann et al., Nature. 332:323-329 [1988]; og Presta, Curr. Op. Struct. Biol.. 2:593-596 (1992). Det humaniserte antistoff inkluderer et PRIMATIZED™ antistoff hvori den antigenbindende region til antistoffet er avledet fra et antistoff fremstilt ved å immunisere makak-aper med antigen av interesse.

Som brukt heri angir betegnelsen "immunoadhesin" antistoffliknende molekyler som kombinerer bindingsspesifisiteten til et heterologt protein (et "adhesin") med effektorvirkningen til de konstante domener i immunoglobulinet. Strukturelt omfatter immunoadhesiner en fusjon av en aminosyresekvens med den ønskede bindingsspesifisiteten som er noe annet enn et antistoffs sete for antigengjenkjennelse og binding (dvs. er "heterologt"), og den konstante domenesekvensen til immunoglobulinet. Adhesindelen av et immunoadhesinmolekyl er typisk en tilgrensende aminosyresekvens som omfatter minst bindingssetet til en reseptor eller ligand. Den konstante domenesekvensen til immunoglobulinet i immunoadhesinet kan oppnås fra ethvert immunoglobulin, så som IgG-1, IgG-2, IgG-3, eller IgG-4 undertyper, IgA (inkludert IgA-1 og IgA-2), IgE, IgD eller IgM.

"Stringens" til hybridiseringsreaksjoner er lett å bestemme for en med ordinær kunnskap på området og er generelt en empirisk beregning avhengig av probelengde, vasketemperatur og saltkonsentrasjon. Generelt krever lengre prober høyere temperaturer for riktig sammenføyning, mens kortere prober trenger lavere temperaturer. Hybridisering generelt avhenger av evnen til denaturert DNA for å resammenføyes når komplementære tråder er tilstede i omgivelser under smeltetemperaturen. Desto høyere graden av ønsket homologi mellom proben og den hybridiserbare sekvens jo høyere er den relative temperaturen som kan anvendes. Som et resultat følger det at høyere relative temperaturer vil ha en tendens til å gjøre reaksjonsbetingelsene mer stringente, mens lavere temperaturer gjør det ikke. For ytterligere detaljer og forklaring av stringens for hybridiseringsreaksjoner, se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Stringente betingelser" eller "betingelser med høy stringens" som definert heri kan identifiseres av de som: (1) anvender lave ionestyrker og høye temperaturer for vasking, f.eks. 0,015 M natriumklorid/0,0015 M natriumsitrat/0,1 % natriumdodekylsulfat ved 50°C; (2) anvende under hybridiseringen et denatureringsmiddel, så som formamid, f.eks. 50 % (vol/vol) formamid med 0,1 % bovint serumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumsitrat ved 42°C; eller (3) anvende 50 % formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat, 5 x Denhardts oppløsning, sonikert laksespermie DNA (50fig/ml), 0,1 % SDS, og 10 % dekstransulfat ved 42°C, med vaskinger på 42°C i 0,2 x SSC

(natriumklorid/natriumsitrat) og 50 % formamid ved 55°C, etterfulgt av høy-stringensvask som består av 0,1 x SSC som inneholder EDTA ved 55°C.

"Moderat stringente betingelser" kan identifiseres som beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, og inkluderer anvendelse av vaskeoppløsning og hybridiseringsbetingelser (f.eks. temperatur, ionestyrke og prosent SDS) mindre stringent enn de beskrevet ovenfor. Et eksempel på moderat stringente betingelser

er natten over inkubasjon ved 37°C i en oppløsning som omfatter: 20 % formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5 x Denhardts oppløsning, 10 % dekstransulfat og 20 mg/ml denaturert laksespermie DNA utsatt for skjærekrefter, etterfulgt av vasking av filtrene i 1 x SSC ved ca. 37-50°C. Personen med kunnskap på området vil vite hvordan temperaturen, ionestyrke, etc. skal justeres som nødvendig for å tilpasses faktorer så som probelengde og liknende.

Betegnelsen "epitopmerket" refererer seg når det er brukt heri til et kimerisk polypeptid som omfatter et AngptB-polypeptid fusjonert til et "merke-polypeptid". Merke-polypeptidet har nok residuer til å tilveiebringe en epitop mot hvilke et antistoff kan fremstilles, likevel er det kort nok slik at det ikke interfererer med aktiviteten til polypeptidet som det er fusjonert med. Merke-polypeptidet er fortrinnsvis rimelig unikt slik at antistoffet ikke i stor grad kryssreagerer med andre epitoper. Egnede merke-polypeptider har generelt minst seks aminosyreresiduer og vanligvis mellom 8 og 50 aminosyreresiduer (fortrinnsvis mellom 10 og 20 aminosyreresiduer).

Betegnelsen "biologisk aktivitet" og "biologisk aktiv" med hensyn på AngptB-molekyler heri refererer seg til molekylets evne til spesifikt å bindes til og regulere cellulære responser mediert av en nativ ctvpB-integrinreseptor, så som adhesjon og/eller migrering av vaskulære endotelceller. I denne sammenheng inkluderer betegnelsen "regulere" både fasilitering og inhibisjon, derfor inkluderer de (native og variant) AngptB-molekylene i henhold til foreliggende oppfinnelse agonister og antagonister av en nativ ctvpB-integrinreseptor. Foretrukne biologiske aktiviteter til AngptB-ligander heri inkluderer fasilitering eller inhibisjon av vaskularisering (angiogenese) og spesielt deltagelse i den angiogene prosess under leverregenerasjon.

Betegnelsen "agonist" er brukt for å betegne peptid og ikke-peptidanaloger av de native AngptB-molekyler i henhold til foreliggende oppfinnelse og til antistoffer som spesifikt binder slike native AngptB-molekyler, forutsatt at de har evnen til å signalisere gjennom en nativ AngptB-reseptor (ctvpB). Med andre ord er betegnelsen "agonist" definert i sammenheng med den biologiske rollen til AngptB-reseptor (ctvpB). Foretrukne agonister har de foretrukne biologiske aktivitetene til et nativt AngptB, som definert ovenfor, så som fasilitering av vaskularisering (angiogenese), f.eks. under leverregenerasjon.

Betegnelsen "antagonist" blir brukt for å betegne peptid- eller ikke-peptidanaloger til et nativt AngptB-molekyl og til antistoffer, forutsatt at de har evnen til å inhibere den biologiske funksjon til AngptB uten hensyn til om de har evne til å binde AngptB eller dets reseptor avpB. Følgelig inkluderer antagonister som har evnen til å binde AngptB eller dets reseptor anti-AngptB og anti-avpB-antistoffer. Foretrukne antagonister er inhibitorer til adhesjon- og/eller migrasjon av vaskulære endotelceller, og særlig inhibitorer av angiogenese, spesielt angiogenese assosiert med malign tumorvekst, inflammatoriske sykdommer i leveren eller hj erte sykdommer.

"Tumor" som brukt heri betegner all neoplastisk cellevekst og proliferasjon, enten malign eller benign, og alle forløperkreft- og kreftceller og vev.

Betegnelsen "cancer" og "cancerøs" betegner eller beskriver den fysiologiske tilstand hos pattedyr som typisk erkarakterisert veduregulert cellevekst. Eksempler på cancer inkluderer men er ikke begrenset til karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi. Mer spesielle eksempler på cancer inkluderer brystkreft, prostatakreft, kolonkreft, skvamøse cellekreft, småcellet lungekreft, ikke-småcellet lungekreft, gastrointestinalkreft, pankreaskreft, glioblastom, servikalkreft, ovariekreft, leverkreft, blærekreft, hepatom, kolorektal kreft, endometriell karsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, bulvalkreft, tyroidkreft, leverkarsinom og forskjellige typer av hode- og halskreft.

"Behandling" betegner både terapeutisk behandling og profylaktisk eller preventive midler, hvori hensikten er å forhindre eller forsinke den målgitte patologiske tilstand eller sykdom. De med behov for behandling inkluderer de som allerede har lidelsen så vel som de som er utsatt for å få lidelsen eller de i hvilke lidelsen skal forhindres. I tumor (f.eks. cancer) behandling kan et terapeutisk middel direkte redusere patologien til tumorceller, eller gjøre tumorcellene mer utsatt for behandling med andre terapeutiske midler, f.eks. stråling og/eller kjemoterapi.

"Patologien" til cancer inkluderer alle fenomener som omfatter pasientens velbefinnende. Dette inkluderer uten begrensning unormal eller ukontrollerbar cellevekst, metastase, interferering med den normale funksjonen til naboceller, frigjøring av cytokiner eller andre sekretoriske produkter på unormale nivåer, undertrykkelse eller forsterking av inflammatorisk eller immunologisk reaksjon, etc.

"Kronisk" administrering betegner administrering av midlet(ene) på en kontinuerlig måte i motsetning til en akutt måte, slik at den initiale terapeutiske virkning (aktivitet) opprettholdes over en utstrakt tidsperiode. "Intermittent" administrering er behandling som ikke blir gjort uten avbrudd, men heller er syklisk av natur.

"Pattedyr" i behandlingsøyemed betegner ethvert dyr klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, husdyr og gårdsdyr, sportsdyr eller kjæledyr og dyr i zoologisk have, så som hunder, katter, kveg, hester, sauer, griser, geiter, kaniner, etc. Fortrinnsvis er pattedyret et menneske.

Administrering "i kombinasjon med" ett eller flere terapeutiske midler inkluderer samtidig og påfølgende administrasjon i enhver orden.

"Bærere" som brukt heri inkluderer farmasøytisk akseptable bærere, eksipienter

eller stabilisatorer som er ikke-toksiske til cellen eller pattedyret som blir eksponert dertil med de anvendte doser og konsentrasjoner. Ofte er den fysiologisk akseptable bærere en vandig pH-bufret oppløsning. Eksempler på fysiologisk akseptable bærere inkluderer buffere så som fosfat, sitrat og andre organiske syrer; antioksidanter som inneholder askorbinsyre; lavmolekylvekt (mindre enn ca. 10 residuer) polypeptid, proteiner, så som serumalbumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer så som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer så som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner; gelaterende midler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol; saltdannende motioner så som natrium; og/eller ikke-ioniske surfaktanter så som TWEEN™, polyetylenglykol

(PEG), og PLURONICS™.

Et "liposom" er en liten bærer sammensatt av forskjellige typer av lipider, fosfolipider og/eller surfaktanter som er nyttig for levering av et legemiddel (så som et PRO 10282 polypeptid eller antistoff dertil) til et pattedyr. Komponentene i liposomet er vanligvis arrangert i et dobbeltlagformasjon på samme måte som lipidarrangementet i biologiske membraner.

Et "lite molekyl" er definert heri som å ha en molekylvekt under ca. 500 Dalton.

En "effektiv mengde" av et AngptB-polypeptid beskrevet heri er en mengde som er i stand til å utløse en ønsket biologisk respons. Særlig er en "effektiv mengde" av et AngptB-polypeptid eller en agonist derav fortrinnsvis en mengde som er i stand til å regulere en cellulær respons mediert av en avpB AngptB-reseptor, så som adhesjon og/eller migrering av endotelceller, f.eks. vaskulære endotelceller. Betegnelsen inkluderer en mengde som er i stand til å gi angiogenese, spesielt angiogenese assosiert med leverregenerasjon.

En "terapeutisk effektiv mengde" i referanse til behandling av tumor, f.eks. når antagonister av et nativt AngptB-polypeptid blir brukt, refererer seg til en mengde som er i stand til å påkalle én eller flere av følgende virkninger: (1) inhibisjon, i noen grad av tumorvekst inkludert forsinkelse og fullstendig stopp av veksten; (2) reduksjon i antall tumorceller; (3) reduksjon i tumorstørrelse; (4) inhibisjon (dvs. reduksjon, forsinkelse eller fullstendig stopp) av tumorcelleinfiltrasjon i perifere organer; (5) inhibisjon (dvs. reduksjon, forsinkelse eller fullstendig stopp) av metastase; (6) forsterking av anti-tumorimmunrespons, som kan, men behøver ikke, resultere i regresjon eller avstøtning av tumoren; og/eller (7) lettelse i noen grad av én eller flere symptomer assosiert med lidelsen. En "terapeutisk effektiv mengde" av et AngptB-polypeptidantagonist med hensikt å behandle en tumor kan bestemmes empirisk og rutinemessig.

"Vaskulær endotelial vekstfaktor" eller "VEGF" er et endotelt cellespesifikt mitogen som er blitt vist å bli stimulert ved hypoksi og nødvendig for tumorangiogenese (Senger et al., Cancer 46:5629-5632 (1986); Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Schweiki et al., Nature 359:843-845 (1992); Plate et al., Nature 359:845-848 (1992)). Betegnelsen som brukt heri inkluderer alle VEGF-isoformer, inkludert uten begrensning de humane VEGF 121 og VEGF 165 isoformer.

B. Ikke- humane pattedvrhomologer av humant AngptB

Isolasjonen av nativt humant AngptB er beskrevet i eksempel 1 og også i PCT-publikasjon WO 99/15654. AngptB-DNA er også blitt deponert ved the American type Culture Collection (ATCC) 18. september 1997 under designeringen FLS139-DNA16451-1078 og gitt ATCC deponeringsnr. 209283.

For å identifisere andre, ikke-humane pattedyrhomologer eller spleisevarianter eller andre naturlig forekommende varianter, kan bibliotek screenes med prober (så som antistoffer til human AngptB-sekvens eller oligonukleotider på minst 20-80 baser) konstruert for å identifisere genet av interesse eller proteinet som er kodet av det. Screening av cDNA eller genomisk bibliotek med den utvalgte probe kan utføres ved å bruke standard fremgangsmåter, så som beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). En alternativ måte å isolere genet som koder andre native AngptB-polypeptider er å bruke PCR-metodologi (Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).

Oligonukleotidsekvensene valgt som prober bør være av tilstrekkelig lengde og tilstrekkelig entydig slik at falske positiver blir minimalisert. Oligonukleotidet blir fortrinnsvis merket slik at det kan detekteres ved hybridisering til DNA i biblioteket som blir screenet. Fremgangsmåter for merking er velkjent på området og inkluderer anvendelse av radiomerker så som<32>P-merket ATP, biotinylering eller enzymmerking. Hybridiseringsbetingelser, som inkluderer moderat stringens og høy stringens, er tilveiebragt i Sambrook et al., supra.

Sekvenser identifisert i slike bibliotekscreeningsmetoder kan sammenlignes og opplinjeres med andre nevnte kjente sekvenser deponert og tilgjengelig i offentlige databaser så som GenBank eller andre private sekvensdatabaser. Sekvensidentitet (på enten aminosyre eller nukleotidnivå) innenfor definerte regioner av molekylet eller over hele lengden av sekvensen kan bestemmes ved å bruke fremgangsmåter kjent på området og som beskrevet heri.

Nukleinsyrer som har proteinkodende sekvens kan oppnås ved å screene utvalgt cDNA eller genomiske bibliotek ved å bruke den deduserte aminosyresekvensen beskrevet heri for første gang, og hvis nødvendig bruke konvensjonelle primerutvidelsesprosedyrer som beskrevet i Sambrook et al., supra, for å detektere forløpere og å utvikle mellomprodukter av mRNA som ikke behøver å ha blitt reverst transkribert inn i cDNA.

C. AngptB- varianter

Nativt humant AngptB er kjent på området og beskrevet f.eks. i PCT-publikasjon nr. WO 99/15654, publisert 1. april 1999. Variasjoner i den native full-lengde sekvens AngptB (SEKV. ID nr. 2) eller i forskjellige domener av AngptB-aminosyresekvens beskrevet heri kan fremstilles f.eks. ved å bruke enhver av de teknikker og retningslinjer for konservative og ikke-konservative mutasjoner, fremsatt f.eks. i US patent nr. 5 364 934. Variasjoner kan være en substitusjon, delesjon eller innskudd av én eller flere kodoner som koder AngptB-polypeptid som resulterer i en forandring i aminosyresekvensen til AngptB sammenlignet med den native sekvensen i SEKV. ID nr. 2. Eventuelt er variasjonen ved substitusjon minst én aminosyre med enhver annen aminosyre i én eller flere av domenene til en nativ eller variant AngptB-sekvens. Veiledning til å bestemme hvilken aminosyreresidu som kan innskytes, substitueres eller tas vekk uten negativt å påvirke den ønskede aktivitet kan finnes ved å sammenligne sekvensen til AngptB med den til homologe kjente proteinmolekyler og minimaliserer antall aminosyresekvensforandringer gjort i regioner med høy homologi. Aminosyresubstitusjoner kan være resultat av å erstatte én aminosyre med en annen aminosyre som har lignende strukturelle og/eller kjemiske egenskaper, så som erstatte et leukin med et serin, dvs. konservative aminosyreerstatninger. Innskudd eller delesjoner kan eventuelt være i området fra ca. 1-5 aminosyrer. Variasjonen tillatt kan bestemmes ved systematisk å foreta innskudd, delesjoner eller substitusjoner av aminosyrer i sekvensen og teste de resulterende varianter for utvist aktivitet med den full-lengde eller modne native sekvens.

Således er AngptB-polypeptidfragmenter tilveiebragt heri. Slike fragmenter kan være trunkert på N-terminus eller C-terminus, eller kan mangle indre residuer, f.eks. under sammenligning med et nativt protein i full-lengde. Disse fragmenter manger aminosyreresiduer som ikke er nødvendig for en ønsket biologisk aktivitet til AngptB -polyppetidet.

Homologimodelleringen av fibrinogendomenet til nativt humant AngptB med SEKV. ID nr. 2, og den funksjonelle analyse av domenene engasjert i endotelcellebinding ved AngptB, som beskrevet i eksempel 5, er nyttig ved konstruksjon av AngptB-varianter heri. Basert på den modulerte struktur til de fibrinogenliknende domenene av AngptB ble det funnet at regioner Pl: aminosyrer 281-293 (SEKV. ID nr. 14); P2: aminosyrer 442-460 (SEKV. ID nr. 15); og P3 aminosyrer 415-430 (SEKV. ID nr. 17) i nativt humant AngptB (SEKV. ID nr. 2) er involvert i ctvpB-binding. For å bibeholde reseptorbinding og evnen til å aktivere og signallere gjennom reseptoren, bør Pl-, P2- og P3-regioner hovedsakelig bli bibeholdt, eller bare konservative substitusjoner bør utføres i disse regioner. På den annen side for å konstruere AngptB-antagonister kan det være nødvendig å foreta mer signifikante aminosyreforandringer innenfor én eller flere av disse regioner. Konstruksjon av AngptB-varianter er ytterligere assistert ved bånddiagrammet vist i fig. 5B, og sekvenssammenstillingen vist i fig. 5C, hvor de hydrofile og ladede residuer blir vist i blått, og de aromatiske og hydrofobe residuer er vist i orange.

Som diskutert ovenfor i spesielle utforminger er konservative substitusjoner av interesse for å fremstille AngptB-varianter i henhold til foreliggende oppfinnelse. Slike konservative substitusjoner er vist i tabell 1 under overskriften foretrukne substitusjoner. Hvis slike substitusjoner resulterer i forandring i biologisk aktivitet blir ytterligere substansielle forandringer, betegnet eksempelsubstitusjoner i tabell 1, eller som ytterligere beskrevet nedenfor under referanse til aminosyreklasser, innført og produktene screenet.

Betydelige modifikasjoner i funksjon eller immunologisk identitet til AngptB-variantpolypeptid blir utført ved å velge substitusjoner som adskiller seg signifikant i sin virkning på å opprettholde (a) strukturen til polypeptidryggraden i området til substitusjonern, f.eks. som en ark- eller spiralkonformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet på målsetet, eller (c) størrelsen på sidekjeden. Naturlig forekommende residuer er oppdelt i grupper basert på vanlige sidekjedeegenskaper: (1) hydrofob; norleukin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytral hydrofil: cys, ser, thr; (3) sur: asp, glu; (4) basisk: asn, gin, his, lys, arg;

(5) residuer som har innflytelse på kjedeorientering: gly, pro; og

(6) aromatisk: trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil medføre utveksling av et medlem av én av disse klassene mot en annen klasse. Slike substituerte residuer kan også innføres i konservative substitusjonssteder eller, mer fortrinnsvis, i gjenværende (ikke-konserverte) steder.

Variasjonene kan foretas ved å bruke fremgangsmåter kjent på området så som oligonukleotidmediert (setestyrt) mutagenese, alaninscanning og PCR-mutagenese. Setestyrt mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res., 1_3_:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.. 10:6487 (1987)), kassettmutagenese [Wells et al., Gene. 34:315

(1985)], restriksjonsseleksjonsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) eller andre kjente teknikker kan utføres på det klonede DNA for å produsere AngptB-variant DNA.

AngptB-fragmentet kan fremstilles ved ethvert av et antall konvensjonelle teknikker. Ønskede peptidfragmenter kan syntetiseres kjemisk. En alternativ tilnærming omfatter å generere AngptB-fragmenter ved enzymatisk fordøyelse, f.eks. ved å behandle proteinet med et enzym kjent for å spalte proteiner på seter definert ved spesielle aminosyreresiduer, eller ved å fordøye DNA med egnede restriksjonsenzymer og isolere det ønskede fragment. Enda en annen egnet teknikk involverer isolering og amplifisering av et DNA-fragment som koder et ønsket polypeptidfragment, ved polymerasekjedereaksjonen (PCR). Oligonukleotider som definerer de ønskede termini av DNA-fragmentet er anvendt på 5'- og 3'-primere i PCR. Fortrinnsvis deler AngptB-polypeptidfragmenter minst én biologisk og/eller immunologisk aktivitet med den native AngptB med SEKV. ID nr. 2.

Scanning aminosyreanalyse kan også anvendes for å identifisere én eller flere aminosyrer langs en sammenhengende sekvens. Blant de foretrukne scanning aminosyrer er relativt små, nøytrale aminosyrer. Slike aminosyrer inkluderer alanin, glysin, serin og cystein. Alanin er typisk en foretrukket scanning aminosyre i denne gruppen fordi den eliminerer sidekjede over beta-karbonet og er mindre sannsynlig til å forandre hovedkjedekonformasjonen til varianten (Cunningham og Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). Alanin er også typisk foretrukket fordi det er den vanligste aminosyre. Videre er den ofte funnet i både begravde og eksponerte stillinger (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Hvis alaninsubstitusjon ikke gir adekvate mengder av varianten kan en isoterisk aminosyre anvendes.

Ytterligere detaljer til å fremstille AngptB-varianter, kovalente modifikasjoner av native og variant AngptB-polypeptider, antistoffer som spesifikt bindes til AngptB (inkludert varianter), og immunoadhesiner er tilveiebragt f.eks. i WO 99/15654.

D. Anvendelse av AngptB- polypeptid

Som beskrevet i eksemplene nedenfor viste ekspresjonsanalyse av AngptB i voksent vev leverspesifikk ekspresjon og sterk oppregulering i hepatocytter ved sykdommer, levercirrhose eller etter toksisk leverskade. Ytterligere resulterte in vivo administrering av AngptB i en økning i vaskulær permeabilitet og en korttids beskyttende virkning fra leverskade men forlenget uttrykk av AngptB var assosiert med leverskade. Enda ytterligere induserte AngptB angiogenese når den ble testet i rottehornhinne in vivo. Den robuste induksjon av karvekst ved AngptB i det siste assayet kombinert med den uttrykte ekspresjon detektert i syke leverprøver angir sterkt at denne faktor spiller en viktig rolle i regulering av den angiogene prosess under leverregenerering.

Følgelig er AngptB og AngptB-agonister trodd å være nyttig ved behandling, forhindring og/eller identifikasjon av individer med risiko for akutt leversykdom og induksjon av leverregenerasjon etter akutt leverskade og/eller angiogenese i et vev. Den akutte leverskade kan være assosiert med inflammatorisk leversykdom, så som kronisk, alkoholisk eller viral hepatitt, kjemisk eller mekanisk skade til lever, hepatektomi som kan skyldes kronisk hepatitt, levercirrhose, primær eller metastatisk leverkreft eller galleblærekreft. Angiogenesen i et vev kan assosieres med hjertevev eller levervev som har blitt skadet som et resultat av en infeksiøs eller autoimmun prosess, mekanisk eller kjemisk skade eller kreft eller metastatisk kreft.

Følgelig er AngptB-antagonister ment å være nyttig til behandling og/eller forhindring av vevsskadekarakterisert vedoverekspresjon av AngptB, en kronisk leversykdom og/eller en hjertesykdomkarakterisert vedforhøyet ekspresjon av AngptB. Vevsskade kjennetegnet ved overekspresjon av AngptB inkluderer levervevsskade assosiert med inflammasjon, uten begrensning inflammasjon assosiert med en kronisk leversykdom, viss patogenese involverer aktivering og rekruttering av inflammatoriske celler til leveren, uten hensyn til om den underliggende årsak er en infeksiøs eller autoimmun sykdom, eller kjemisk skade til leveren eller annet. Således inkluderer levervevsskade kjennetegnet ved overekspresjon av AngptB levercirrhose, så som alkoholisk levercirrhose og primær gallecirrhose (PBC), leverfibrose, kronisk hepatitt, så som kronisk autoimmun hepatitt, kronisk alkoholisk hepatitt, og ikke-alkoholisk steatopepatitt (NASH), virushepatitt A, B, C, D, E og G, toksisk metabolisk leverskade, fettlever, ischemi-reperfusjonsskade av leveren og sepsis, og leverskade assosiert med levertumor, uten begrensning hepatocellulær karsinom, ekstrahepatisk gallegangkarsinom, koloangiokarsinom og metastatisk kreft på leveren. Hjerte vevsskade assosiert med forhøyet ekspresjon av AngptB eller hjertesykdom, viss patogenese inkluderer en inflammatorisk respons eller hvor inflammasjon er en risikofaktor i utviklingen og hjertevevsskade assosiert med forhøyet ekspresjon av AngptB, uten begrensning kransarteriesykdom, kardiomyopati, så som ikke-spesifikk hypertrofi og dilatert kardiomyopati, myokarditt, kongestiv hjertefeil (CHF) og myokardialt infarkt. For gjennomgåelse se Lawson et al., Toxicol Sei 54:509-16 (2000), supra.

Ytterligere er AngptB-antagonister ment å være nyttig til inhibisjon av en uønsket økning i vaskulær permeabilitet i et vev. Vevet kan være lever eller hjertevev. Økningen i vaskulær permeabilitet kan være en øket permeabilitet til små kar etter vevsskade og kan følge nekrose av vaskulært endotel som skyldes eksponering til toksiner eller kan være assosiert med inflammasjon, så som kronisk inflammasjon/behandling og/eller forhindring av vevsskade kjennetegnet ved overekspresjon av AngptB, en kronisk leversykdom og/eller en hjertesykdom kjennetegnet ved forhøyet ekspresjon av AngptB.

Enda ytterligere er AngptB-antagonister ment å være nyttig til forhindring og/eller behandling av kronisk alkoholisk hepatitt, som resulterer fra utstrakt alkoholforbruk. Alkoholisk hepatitt kan variere fra en mild hepatitt med unormale laboratorietester som eneste indikasjon på sykdom til alvorlig leverdysfunksjon med komplikasjoner så som gulsott (gul hud forårsaket av bilirubintilbakeholdelse), hepatisk encefalopati (nevrologisk dysfunksjon forårsaket av leversvikt), asittes (væskeakkumulering i abdomen), blødende esofagusvaricer (åreknutevener i esofagus), unormal blodstørkning og koma.

Også omfattet av denne oppfinnelsen er T-cellemedierte sykdommer som påvirker leveren. Autoimmun skade fra T-celler er mediert direkte ved cytotoksiske T-celler og indirekte av T-hjelpeceller. Autoimmunsykdommer viss behandling er vurdert heri inkluderer uten begrensning, autoimmun hepatitt og primær gallecirrhose. Autoimmun hepatitt (også kjent som autoimmun kronisk aktiv hepatitt) er en kronisk lidelse kjennetegnet ved kontinuerlig hepatocellulær nekrose og inflammasjon, som dersom ubehandlet vanligvis utvikler seg til cirrhose og til slutt leversvikt. Primær gallecirrhose er en autoimmunsykdom av det intrahepatiske eller gallesystemet, og er assosiert med forstyrret gallesekresjon. Det er ment at autoimmunantistoffer og T-celler medierer vevsskade til lever assosiert med denne sykdommen. AngptB-antagonister er også nyttig til behandling av ischemi-reperfusjonsskade av leveren. Som diskutert tidligere skjer ischemi-reperfusjonsskade generelt når blodgjennomstrømningen til et område av kroppen blir temporært stoppet (ischemi) og deretter gjenopprettet (reperfusjon). Skaden kan skje i de deler av kroppen hvori blodtilførselen ble avbrutt, eller den kan skje i deler fullt utstyrt med blod under ischemiperioden. Ischemi-reperfusjonsskade av leveren kan resultere fra forskjellige underliggende årsaker så som f.eks. fra hepatisk og gallekirurgiske reseksjoner, og blir manifestert klinisk ved slike komplikasjoner som hepatisk dysfunksjon inkludert akutt hepatocellulær skade og nekrose.

AngptB-antagonister inkluderer uten begrensning antistoffer, små organiske og uorganiske molekyler, peptider, fosfopeptider, antisens og ribosommolekyler, trippel heliksmolekyler, etc. som inhiberer ekspresjon og/eller aktivitet av målgenproduktet.

F.eks. virker antisens RNA og RNA-molekyler direkte ved å blokkere translasjon av mRNA ved hybridisering til målsøkte mRNA og forhindring av proteintranslasjon. Når antisens-DNA blir brukt er oligodeoksyribonukleotider avledet fra translasjonsinitieringssetet, f.eks. mellom -10 og +10 stillinger til målgennukleotidsekvensen, foretrukket.

Ribozymer er enzymatiske RNA-molekyler som er i stand til å katalysere den spesifikke spalting av RNA. Ribozymer virker ved sekvensspesifikk hybridisering til det komplementære mål-RNA, etterfulgt av endonukleolyttisk spalting. Spesifikke ribozymspalteseter i et potensielt RNA-mål kan identifiseres ved kjente teknikker. For ytterligere detaljer se, f.eks. Rossi, Current Biology, 4:469-471

(1994), og PCT-publikasjon nr. WO 97/33551 (publisert 18. september 1997).

Nukleinsyremolekyler i trippel spiralformasjon brukt til å inhibere transkripsjon bør være enkelttrådet og sammensatt av deoksynukleotider. Basesammensetningen til disse oligonukleotidene er konstruert slik at de fasiliterer trippel spiralformasjon via Hoogsteen baseparingsregler, som generelt krever strekk av puriner eller pyrimider på én tråd av en viss størrelse i form av en dupleks. For ytterligere detaljer se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 97/33551, supra.

Når AngptB-polypeptider heri (inkludert deres agonister og antagonister) blir anvendt som terapeutiske midler kan de formuleres i henhold til kjente fremgangsmåter for å fremstille farmasøytisk nyttige sammensetninger, hvorved AngptB-polypeptid blir kombinert i tilblanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Terapeutiske formuleringer blir fremstilt for lagring ved å blande den aktive ingrediens som har den ønskede grad av renhet med eventuelt fysiologisk akseptable bærere, eksipienter eller stabilisatorer ( Remington' s Pharmaceutical Sciences 16. utgave, Osol, A. red. (1980)), i form av lyofiliserte formuleringer eller vandige oppløsninger. Akseptable bærere, eksipienter eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottakeren i de anvendte doser og konsentrasjoner, og inkluderer buffere så som fosfat, sitrat og andre organiske syrer; antioksidanter inkludert askorbinsyre; lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 residuer) polypeptider; proteiner så som serumalbumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer så som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer så som glysin, glysamin, asparagin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner; gelaterende midler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol; saltdannende motioner så som natrium; og/eller ikke-ioniske surfaktanter så som TWEEN™, PLURONICS™ eller PEG.

Formuleringene som skal anvendes for in vivo administrering må være sterile. Dette blir lett utført ved filtrering gjennom sterilfiltrasjonsmembraner før eller etter lyofilisering og re konstitusjon.

Terapeutiske sammensetninger heri blir generelt plassert i en beholder som har en steril tilgangsport, f.eks. en intravenøs oppløsningspose eller ampulle som har en kork som er gjennomtrengbar for en hypoderm injeksjonsnål.

Administrasjonsruten er i henhold til kjente metoder, f.eks. injeksjon eller infusjon ved intravenøs, intraperetonal, intracerebral, intramuskulær, intraokular, intraarteriell eller intralesjonsruter, topisk administrering eller ved forsinkede frigjøringssystemer.

Doser og ønskede legemiddelkonsentrasjoner til farmasøytiske sammensetninger i henhold til foreliggende oppfinnelse kan variere avhengig av den spesielle anvendelse som er forutsatt. Bestemmelse av egnede doser eller administrasjonsrute er godt innenfor kunnskapen til en vanlig lege. Dyreeksperimenter tilveiebringer pålitelig veiledning til bestemmelse av effektive doser for human terapi. Skalering av effektive doser mellom arter kan utføres ved å følge de prinsippene lagt ned av Mordenti, J. og Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" i Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., red., Pergamon Press, New York 1989, sider 42-96.

Når in vivo administrering av et AngptB-polypeptid eller agonist eller antagonist derav blir anvendt kan normale dosemengder variere fra ca. 10 ng/kg til opptil 100 mg/kg av pattedyrkroppsvekt eller mer pr. dag, fortrinnsvis ca. 1 ug/kg/dag til 10 mg/kg/dag avhengig av administrasjonsruten. Veiledning for spesielle doser og leveringsfremgangsmåter er tilveiebragt i litteraturen, se f.eks. US patent nr. 4 657 760; 5 206 344; eller 5 225 212. Det er forventet at forskjellige formuleringer vil være effektive for forskjellige behandlingsforbindelser og forskjellige lidelser, at administrasjon som målretter ett organ eller vev f.eks. kan nødvendiggjøre levering på en måte forskjellig fra et annet organ eller vev.

F.eks. før bestemmelse av effektiv dose for behandling av enhver spesifikk leversykdom blir alvorligheten av sykdommen bestemt ved konvensjonell klinisk og laboratorieevaluering av pasienten. Behandlingens gunstighet blir vurdert ved å følge opp leverfunksjon med kliniske og laboratorievurderinger, utført med regulære regelmessige mellomrom så som hver uke, to uker eller måned.

Når forsinket administrering av et AngptB-polypeptid er ønsket i en formulering med frigjøringsegenskaper egnet for behandling av enhver sykdom eller lidelse som krever administrering av AngptB-polypeptid er mikroinnkapsling av AngptB-polypeptidet vurdert. Mikroinnkapsling av rekombinante proteiner for forsinket frigjøring har blitt vellykket utført med humant veksthormon (rhGH), interferon-y (rhIFN-y), interleukin 2, og MN rgpl20. Johnson et al., Nat. Med.. 2:795-799

(1996); Yasuda, Biomed.Ther..27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/ Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", i Vaccine Design: The Subunit and Adiuvant Approach. Powell and Newman, red. (Plenum Press: New York, 1995), sider 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; og US patent nr. 5 654 010.

Formulering av disse proteiner med forsinket frigjøring ble utviklet ved å bruke poly-melke-koglykolsyre (PLGA) polymer på grunn av dens biokompatibilitet og stort område av biodegraderbare egenskaper. Degraderingsproduktene til PLGA, melkesyre og glykolsyre, kan avklares hurtig i det humane legemet. Videre kan degraderbarheten av dette polymere justeres fra måneder til år avhengig av dens molekylvekt og sammensetning. Lewis "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", i: M. Chasin and R. Langer (red.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), sider 1-41.

Det kan være ønskelig å kombinere AngptB terapeutiske midler med andre terapeutiske regimer. F.eks. kan behandling med AngptB-polypeptider eller deres agonister kombineres med administrasjon av andre angiogene faktorer, så som vaskulær endotelcellevekstfaktor (VEGF) eller fibroblast vekstfaktor (FGF).

E. Fremstillingsprodukter

Det beskrives heri fremstillingsprodukt som inneholder materialer nyttig for diagnose eller behandling av lidelsene beskrevet ovenfor. Fremstillingsproduktet omfatter en beholder og et merke. Egnede beholdere inkluderer f.eks. flasker, ampuller, sprøyter og reagensrør. Beholderne kan fremstilles fra et utvalg av materialer så som glass eller plast. Beholderen inneholder en sammensetning som er effektiv til å diagnostisere eller behandle tilstanden og kan ha en steril tilførselsåpning (f.eks. kan containeren være en pose med intravenøs oppløsning eller en ampulle som har en kork gjennomtrenges av en injeksjonsnål). Det aktive middel i sammensetningen er vanligvis et antitumormiddel som er i stand til å interferere med aktiviteten til et genprodukt identifisert heri, f.eks. et antistoff. Merket på eller assosiert med beholderen angir at sammensetningen er brukt til å diagnostisere eller behandle den valgte tilstand. Fremstillingsproduktet kan ytterligere omfatte en andre beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, så som fosfatbufret saltoppløsning, Ringers oppløsning og dekstroseoppløsning. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelig fra et kommersielt standpunkt og et brukerstandpunkt, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtere, nåler, sprøyter og pakkeinnlegg med bruksanvisning.

F. Diagnostisk anvendelse

Idet AngptB er oppregulert i inflammatoriske leversykdommer kan dets overekspresjon relativt til normale vev tjene som en diagnostisk markør for slike sykdommer.

Genamplifikasjon og/eller ekspresjon kan måles direkte i en prøve, f.eks. ved konvensjonell Southern blotting, Northern blotting for å kvantifisere transkripsjonen av mRNA (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205

(1980)), dot blotting (DNA-analyse), eller in situ hybridisering ved å bruke en egnet merket probe, basert på sekvensene tilveiebragt heri. Alternativt kan antistoffer anvendes som kan gjenkjenne spesifikke duplekser, inkludert DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser. Antistoffene i sin tur kan merkes og assayet kan utføres hvor duplekset er bundet til en overflate, slik at ved dannelsen av dupleks på overflaten kan nærvær av antistoff bindes til dupleksen detekteres.

For eksempel kan antistoffer, inkludert antistoff-fragmenter brukes til kvalitativt eller kvantitativt å detektere ekspresjon av AngptB-proteiner. Som angitt ovenfor er antistoffet fortrinnsvis uttrykt med et detekterbart, f.eks. fluorescerende merke, og binding kan overvåkes ved lysmikroskopi, flow cytometri, fluorimetri eller andre teknikker kjent på området. Disse teknikkene er spesielt egnet hvis det amplifiserte gen koder et celleoverflateprotein, f.eks. en vekstfaktor. Slike bindingsassayer blir utført essensielt som beskrevet i seksjon 5 ovenfor.

In situ deteksjon av antistoffbinding til AngptB-proteinet kan utføres, f.eks. ved immunofiuorescens eller immunoelektronmikroskopi. Ved denne hensikt blir en vevsprøve fjernet fra pasienten og et merket antistoff blir påført den, fortrinnsvis ved å legge antistoffet over på en biologisk prøve. Denne prosedyren tillater også bestemmelse av fordeling av markørgenproduktet i det undersøkte vev. Det vil være klart for de med kunnskap på området at en stor variasjon av histologiske fremgangsmåter er lett tilgjengelig for in situ deteksjon.

En av de mest sensitive og mest fleksible kvantitative fremgangsmåter for å kvantifisere differensiell genekspresjon er RT-PCR, som kan brukes for å sammenligne mRNA-nivåer i forskjellige prøvepopulasjoner, i normale og tumorvev, med eller uten legemiddelbehandling, for å karakterisere mønster for genekspresjon, å diskriminere mellom nært beslektede mRNA og for å analysere RNA-struktur.

Det første trinn er isolasjon av mRNA fra en målprøve. Utgangsmaterialet er typisk totalt RNA isolert fra henholdsvis et sykt vev og et tilsvarende normalt vev. Således kan mRNA ekstraheres f.eks. fra frosset eller arkivert parafin innstøpt og fiksert (formalinfiksert) prøver av sykt vev for sammenligning med normalt vev av samme type. Metoder for mRNA-ekstraksjon er velkjent på området og er beskrevet i standard lærebøker for molekylærbiologi, inkludert Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Metoder for RNA-ekstraksjon fra parafininnstøpt vev er beskrevet f.eks. i Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), og De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). Særlig kan RNA-isolasjonen utføres ved å bruke rensesett, buffersett og protease fra kommersielle fabrikanter, så som Qiagen, i henhold til fabrikantens instruksjoner. F.eks. kan total RNA fra celler i kultur isoleres ved å bruke Qiagen RNeasy minikolonner. Totalt RNA fra vevsprøver kan isoleres ved å bruke RNA Stat-60 (Tel-Test).

Idet RNA ikke kan tjene som et templat for PCR er det første trinn i differensiell genekspresjonsanalyse med RT-PCR revers transkripsjon av RNA-templatet til cDNA, etterfulgt av dens eksponensielle amplifikasjon i en PCR-reaksjon. De vanligste brukte revers transkriptaser er avilomyeloblastose virus revers transkriptase (AMV-RT) og Moloney murin leukemi virus revers transkriptase (MMLV-RT). Revers transkripsjonstrinnet er typisk primet ved å bruke spesifikke primere, tilfeldige heksamerer, eller oligo-dT-primere, avhengig av omstendighetene og målet for ekspresjonsprofilering. F.eks. kan ekstrahert RNA bli revers transkribert ved å bruke et GeneAmp RNA PCR-sett (Perkin Eimer, CA, USA), ved å følge fabrikantens instruksjoner. Det avledede cDNA kan deretter brukes som et templat i den påfølgende PCR-reaksjonen.

Skjønt PCR-trinnet kan bruke et utvalg av termostabile DNA-avhengige DNA-polymeraser anvendes typisk Taq DNA-polymerase som har en 5'-3' nukleaseaktivitet men mangler en 3'-5' endonukleaseaktivitet. Således utnytter TaqMan PCR typisk 5'-nukleaseaktiviteten til Taq eller Tth polymerase for å hydrolysere en hybridiseringsprobe bundet til sitt målamplikon, men ethvert enzym med ekvivalent 5'-nukleaseaktivitet kan anvendes. To oligonukleotidprimere blir brukt for å danne en amplikon typisk for en PCR-reaksjon. Et tredje oligonukleotid, eller probe, er konstruert for å detektere nukleotidsekvens lokalisert mellom de to PCR-primere. Proben er ikke utvidbar med Taq DNA-polymeraseenzym, og er merket med et reporter-fluorescerende fargestoff og et kvele-fluorescerende fargestoff. Enhver laserindusert emisjon fra reporterfargen blir kvalt av kvelefargen når de to fargene er lokalisert tett sammen som de er på proben. Under amplifikasjonsreaksjonen kløyver Taq DNA-polymeraseenzymet proben på en templatavhengig måte. De resulterende probefragmenter disassosieres i oppløsning og signal av den frigjorte reporterfargen er fri fra den kvelende virkningen av den andre fluorofor. Ett molekyl av reporterfarge blir frigitt for hvert nye molekyl syntetisert og deteksjon av ukvalt reporterfarge tilveiebringer basis for interpretativ tolkning av dataene.

TaqMan RT-PCR kan utføres ved å bruke kommersielt tilgjengelig utstyr, så som f.eks. ABI PRIZM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) eller Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland). I en foretrukket utforming blir 5'-nukleaseprosedyren kjørt på en virkelig tid kvantitativ PCR-anordning så som ABI PRIZM 7700™ Sequence Detection System™. Systemet består av en termosykler, laser, ladningskoblet anordning (CCD), kamera og datamaskin. Systemet amplifiserer prøver i et 96-brønnersformat på en termocykler.

Under amplifikasjon blir laserindusert fluorescenssignal oppsamlet i virkelig tid gjennom fiberoptikkabler for alle 96 brønner og detektert på CCD. Systemet inkluderer programvare for å kjøre instrumentet og for å analysere data.

5'-nukleaseassaydata blir initielt uttrykt som Ct, eller terskelsyklus. Som diskutert ovenfor er fluorescensverdier registrert under hver syklus og representerer mengden av produkt amplifisert til det punkt i amplifikasjonsreaksjonen. Det punkt når fluorescenssignalet blir først registrert som statistisk signifikant er terskelsyklus (Ct). ACt-verdier blir brukt som kvantitative mål på det relative antall startkopier av en spesiell målsekvens i en nukleinsyreprøve sammenlignet med ekspresjon av RNA i en celle fra et sykt vev med den fra en normal celle.

For å minimalisere feil og virkningen av prøve-til-prøve variasjon blir RT-PCR vanligvis utført ved å bruke en indre standard. Den ideelle indre standard blir uttrykt på et konstant nivå blant forskjellige vev og er upåvirket av den eksperimentelle behandling. RNA mest som oftest brukes til å normalisere genekspresjonsmønsteret er mRNA for husholdningsgenene glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (GAPDH) og p-aktin.

Differensiell genekspresjon kan også identifiseres, eller konfirmeres ved å bruke mikroarrayteknikk. I denne metoden blir nukleotidsekvensen av interesse platet, eller oppstilt på et mikrochipsubstrat. De oppstilte sekvenser blir deretter hybridisert med spesifikke DNA-prober fra celler eller vev av interesse.

I en spesifikk utforming av mikrooppstillingsteknikken, blir PCR-amplifiserte innskudd av cDNA-kloner påført et substrat i en tett oppstilling. Fortrinnsvis minst 10000 nukleotidsekvenser blir påført substratet. De mikrooppstilte gener, immobilisert på mikrochipen ved 10000 elementer hver, er egnet for hybridisering under stringente betingelser. Fluorescensmerkede cDNA-prober kan dannes gjennom inkorporering av fluorescerende nukleotider ved revers transkripsjon av RNA ekstrahert fra vevene av interesse. Merkede cDNA-prober påført chipen hybridiseres med spesifisitet til hver flekk av DNA på oppstillingen. Etter stringent vasking for å fjerne ikke-spesifikt bundne prober blir chipen skannet ved konfokal lasermikroskopi. Kvantifisering av hybridisering av hvert oppstilte element tillater en vurdering av tilsvarende mRNA-overflod. Med dobbel farge fluorescens, blir separat merkede cDNA-prober dannet fra to kilder av RNA hybridisert parvis til oppstillingen. Den relative overflod av transkriptene fra de to kildene som tilsvarer hvert spesifiserte gen blir således bestemt simultant. Den minatyriserte skala for hybridiseringen tillater en egnet og hurtig evaluering av ekspresjonsmønsteret for store antall av gener. Slike metoder er blitt vist å ha den sensitivitet som er krevet for å detektere sjeldne transkripter, som er uttrykt i noen kopier pr. celle, og reproduserbart detektere minst ca. to ganger forskjellen i ekspresjonsnivåene (Schena et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93(20): 106-49 (1996)). Metodologien for hybridisering av nukleinsyrer og mikrooppstillingsteknologi er velkjent på området.

De følgende eksempler er gitt bare for illustrasjon og er ikke ment å begrense foreliggende oppfinnelses område på noen måte.

EKSEMPLER

Kommersielt tilgjengelige reagenser referert til i eksemplene ble brukt i henhold til fabrikantens instruksjoner med mindre noe annet er angitt. Kilden for de cellene identifisert i de følgende eksempler og gjennom beskrivelsen, ved ATCC aksesjonsnummer er American Type Culture Collection, Manassas, VA.

EKSEMPEL 1

Identifikasjon av AngptB

AngptB ble identifisert i et cDNA-bibliotek fremstilt fra human føtal lever mRNA oppnådd fra Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA USA, katalog nr. 64018-1, ved å følge protokollen beskrevet i "Instruction Manual: Superscript<®>Lambda System for cDNA Synthesis and X cloning" kat. nr. 19643-014, Life Technologies, Gaithersburt, MD, USA. Med mindre noe annet er angitt ble alle reagenser også oppnådd fra Life Technologies. Den totale prosedyren kan oppsummeres i følgende trinn: (1) første trådsyntese; (2) andre trådsyntese; (3) adaptertilsetting; (4) enzymatisk fordøyelse; (5) gelisolasjon av cDNA; (6) ligering i vektor; og (7) transformasjon.

Første trådsyntese

Noti primer-adapter (Life Tech., 2 ul, 0,5 u.g/u.1) ble tilsatt en steril 1,5 ml mikrosentrifugerør til hvilket det ble tilsatt poly A+mRNA (7ul, 5 jag). Reagensglasset ble oppvarmet til 70°C i 5 min. eller tid tilstrekkelig til å denaturere den sekundære strukturen til mRNA. Reaksjonen ble deretter avkjølt på is og 5X første trådbuffer (Life Tech., 4 ul), 0,1 M DTT (2 ul) og 10 mM dNTP blanding (Life Tech., 1 ul) ble tilsatt og deretter oppvarmet til 37°C i 2 min. for å ekvilibrere temperaturen. Superscript II<®>revers transkriptase (Life Tech., 5 ul) ble deretter tilsatt, reagensrøret godt blandet og inkubert ved 37°C i 1 time, og avsluttet ved plassering på is. Den avsluttende konsentrasjon av reaktantene var følgende: 50 mM Tris-HCl (pH 8,3); 75 mM KC1; 3 mM MgCl2; 10 mM DTT; 500 uM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP; 50 ug/ml Not 1 primer-adapter, 5 \ ig (250 ug/ml) mRNA; 50000 U/ml Superscript II<®>revers transkriptase.

Andre trådsyntese

Mens plassert på is ble de følgende reagenser tilsatt reagensrøret fra første

trådsyntesen, reaksjonsbrønnen blandet og tillatt å reagere ved 16°C i 2 timer, hvor man passet på å ikke tillate temperaturen å gå over 16°C: destillert vann (93 ul); 5X annen trådbuffer (30 ul); dNTP-blanding (3 ul); 10 U/ul E. Coli DNA-ligase (1 ul); 10 U/ul E. Coli DNA-polymerase I (4 ul); 2 U/ul E. Coli RNase H (1 ul). 10 U T4 DNA-polymerase (2 ul) ble tilsatt og reaksjonen fortsatt å inkuberes ved 16°C for ytterligere 5 min. Den avsluttende reaksjonskonsentrasjonen var følgende: 25 mM Tris-HCl (pH 7,5); 100 mM KC1; 5 mM MgCl2; 10 mM (NH4)2S04; 0,15 mM p-NAD+; 250 uM av hver dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 1,2 mM DTT; 65 U/ml DNA-ligase; 250 U/ml DNA-polymerase I; 13 U/ml Rnase H. Reaksjonen ble stoppe ved plassering på is og ved tilsetting av 0,5 M EDTA (10 jul) og deretter ekstrahert gjennom fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1, 150 ul). Den vandige fasen ble fjernet, oppsamlet og fortynnet i 5 M NaCl (15 ul) og absolutt etanol (-20°C, 400 ul) og sentrifugert i 2 min. ved 14000 x g. Supernatanten ble omhyggelig fjernet fra den resulterende DNA-pellett, pelletten resusupendert i 60 % etanol (0,5 ml) og sentrifugert igjen i 2 min. ved 14000 x g. Supernatanten ble igjen fjernet og pellett tørket i en speedvac.

Adaptertilsetting

De følgende reagenser ble tilsatt cDNA-pelletten fra andre trådsyntese ovenfor, og reaksjonen ble forsiktig blandet og inkubert ved 16°C i 16 timer: destillert vann (25Hl); 5X T4 DNA-ligasebuffer (10 ul); Sal I adapter (10 ul); T4 DNA-ligase (5 ul). Den avsluttende sammensetning av reaksjonen var følgende: 5 mM Tris-HCl (pH 7,6); 10 mM MgCl2; 1 mM ATP; 5 % (vekt/volum) PEG 8000; 1 mM DTT; 200 u.g/ml Sal 1 adaptere; 100 U/ml T4 DNA-ligase. Reaksjonen ble ekstrahert gjennom fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1, 50 ul), den vandige fase fjernet, oppsamlet og fortynnet i 5 M NaCl (8 ul) og absolutt etanol (-20°C, 250 ul). Dette ble deretter sentrifugert i 20 min. ved 14000 x g, supernatanten fjernet og pellett ble resuspendert i 0,5 ml 70 % etanol og sentrifugert igjen i 2 min. ved 14000 x g. Supernatanten ble deretter fjernet og den resulterende pellett tørket i en speedvac og ført over i neste prosedyre.

Enzymatisk fordøyelse

Til cDNA fremstilt med Sal 1 adapter fra tidligere paragraf ble det tilsatt følgende reagenser og blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 timer: DEPC-behandlet vann (4 ul); Not 1 restriksjonsbuffer (REACT, Life Tech., 5 ul), Not 1 (4 ul). Den avsluttende sammensetning av denne reaksjonen var følgende: 50 mM Tris-HCl (pH (8,0); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1200 U/ml Not 1.

Gel- isolering av cDNA

cDNA blir størrelsesfraksjonert ved akrylamidgelelektroforese på en 5 % akylamidgel, og ethvert fragment som var større enn 1 Kb, som bestemt ved sammenligning med en molekylvektmarkør, ble kuttet ut av gelen. cDNA ble deretter elektroeluert fra gelen inn i 0,1 x TBE-buffer (200 ul) og ekstrahert med fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1, 200 ul). Den vandige fase ble fjernet, oppsamlet og sentrifugert i 20 min. ved 14000 x g. Supernatanten ble fjernet fra DNA-pellets som ble resuspendert i 70 % etanol (0,5 ml) og sentrifugert igjen i 2 min. ved 14000 x g. Supernatanten ble igjen kastet, pellettene tørket i en speedvac og resuspendert i destillert vann (15 ul).

Ligering av cDNA inn i pRK5- vektor

De følgende reagenser ble tilsatt sammen og inkubert ved 16°C i 16 timer: 5X T4 ligasebuffer (3 ul); pRK5, Xhol, Noti fordøyd vektor, 0,5 ug, 1 ul); cDNA

fremstilt fra tidligere paragraf (5 ul) og destillert vann (6 ul) deretter ble ytterligere destillert vann (70 ul) og 10 mg/ml tRNA (0,1 ul) ble tilsatt og hele reaksjonen ble ekstrahert gjennom fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1). Den vandige fase ble fjernet, oppsamlet og fortynnet i 5M NaCl (10 ul) og absolutt etanol (-20°C, 250 ul). Dette ble deretter sentrifugert i 20 min. ved 14000 x g, dekantert og pellett resuspendert i 70 % etanol (0,5 ml) og sentrifugert igjen i 2 min. ved 14000 x g. DNA-pellett ble deretter tørket i en speedvac og eluert i destillert vann (3 ul) for anvendelse i den påfølgende prosedyre.

Transformering av bibliotekligering inn i bakterier

Den ligerte cDNA/pRK5-vektor DNA fremstilt tidligere ble avkjølt på is og tilsatt elektrokompetent DHlOB-bakterier (Life Tech., 20 u.1). Bakterievektorblandingen ble deretter elektroporert etter fabrikantens anbefaling. Deretter ble SOC-media (1 ml) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 min. Transformantene ble deretter platet på 20 standard 150 mm LB-plater som inneholder ampicillin og inkubert i 16 timer (37°C) for å tillate koloniene å vokse. Positive kolonier ble deretter skrapet av og DNA isolert fra bakteriepelletten ved å bruke standard CsCl-gradientprotokoller. Se f.eks. Ausubel et al., 2.3.1.

Identifikasjon av AngptB

AngptB kan identifiseres i det humane føtale leverbibliotek ved enhver standard fremgangsmåte kjent på området, inkludert metodene rapportert av Klein R.D. et al.

(1996), Proe. Nati. Acad. Sei. 93, 7108-7113 og Jacobs (US patent nr. 5 563 637 gitt 16. juli 1996). I henhold til Klein et al. og Jacobs, blir cDNA som koder nye sekrerte og membranbundne pattedyrproteiner identifisert ved å detektere deres sekretoriske ledesekvenser ved å bruke gjærinvertasegen som et reportersystem. Enzymet invertase katalyserer nedbrytning av sukrose til glukose og fruktose så vel som nedbrytning av raffinose til sukrose og melibiose. Den sekrerte form av invertase er nødvendig for utnyttelsen av sukrose hos gjær ( Saccharomyces cerevisiae) slik at gjærcellene som ikke er i stand til å produsere sekretert invertase vokser dårlig på media som inneholder sukrose som den eneste karbon og energikilde. Både Klein R.D., supra, og Jacobs, supra, tar fordel av den kjente evnen til pattedyrsignalsekvenser å funksjonelt erstatte den native signalsekvens til gjærinvertase. Et pattedyr cDNA-bibliotek blir ligert til en DNA som koder et ikke-sekretert gjærinvertase, det ligerte DNA blir isolert og transformert inn i gjærceller som ikke inneholder et invertasegen. Rekombinanter som inneholder det ikke-sekrerte gjærinvertasegenet ligert til en pattedyrsignalsekvens blir identifisert basert på deres evne til å vokse på et medium som inneholder bare sukrose eller bare raffinose som karbonkilde. Pattedyrsignalsekvensene identifisert blir deretter brukt til å screene et andre, full-lengde cDNA-bibliotek for å isolere de full-lengde kloner som koder de korresponderende sekrerte proteiner. Kloning kan f.eks. utføres ved ekspresjonskloning eller ved enhver annen teknikk kjent på området.

Primerne brukt for identifikasjon av AngptB er som følger:

Nukleotidsekvensen til AngptB er vist i fig. 1 (SEKV. ID nr. 1), mens dens aminosyresekvens er vist i fig. 2A og 2B (SEKV. ID nr. 2). AngptB inneholder et fibrinogenliknende domene (fig. 3A, og fig. 5A-C) som utviser en høy grad av sekvenshomologi med de to kjente humane ligandene til TIE-2-reseptor (h-TIE2Ll og h-TIE2L2) og humane angiopoietiner 1, 2 og 4 (ANGI, ANG2, ANG4, Fig. 5C).

En klon av AngptB ble deponert ved the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 18. september 1997 under betingelsene til Budapest-avtalen, og er blitt gitt deponeringsnummeret ATCC 209281.

EKSEMPEL 2

Ekspresjon av AngptB

Human AngptB ble klonet inn i den eukaryote ekspresjonsvektor pRK5tkNEO og baculovirusvektor pHIF, et derivat av pVL1393 innkjøpt fra PharMingen, CA. Plasmid DNA ble kotransfektert med BaculoGold™ DNA (PharMingen, CA) inn i Spodoptera frugiperda ("Sf9") celler (ATCC CRL 1711) ved å bruke Lipfectin (GIBCO-BRL, MD). Etter 4 dager ble cellene høstet, 500 ul av supernatanten ble brukt til å infisere 2 x IO6 Sf9-celler og baculovirus ble oppformert. Etter 72 timers amplifikasjon ble cellene høstet og 10 ml av supernatanten brukt til å infisere 7,5 x IO<5>H5-celler/ml i 40 timer. Etter innhøsting og filtrering gjennom et 0,45 u.m celluloseacetatfilter ble supernatanten renset. Mus AngptB ble overuttrykt i kinesiske hamsterovarie (CHO) celler i stor skala transient transfeksjonseksperimenter. Humant AngptB ble renset fra supernatantene til baculovirus-infiserte innsektsceller dyrket i suspensjon ved å benytte immunoaffinitetskromatografi. Kolonnen ble dannet ved å koble anti-gD Fab til glykofase-CPG (kontrollert poreglass). Det oppklarede (1000 x g 5 min. deretter 0,2 u.m filtrert) medium ble lastet over natten ved 4°C. Kolonnen ble vasket med PBS inntil absorbans ved 280 nm av effluenten returnerte til basislinjen og eluerte med 50 mM Na-sitrat ved pH 3,0. Det eluerte protein ble dialysert (Spectra-pore; MWCO 10000) mot 1 mM HC1 og frosset ved -70°C. Forbigående uttrykte CHO-kulturer som inneholder mus AngptB ble klaret og konsentrert ved å bruke en 10000 MWCO-membran (Amicon). Dette volum ble passert over en anti-gD Fab koblet til glykofase-CPG-kolonne som tidligere beskrevet for human AngptB. Den eluerte oppsamling ble fortynnet med 10 mM Na-acetat (pH 5,0) til en konduktivitet på mindre enn 5 mS og lastet på en S Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, NJ). Kolonnen ble vasket med 10 mM Na-acetat, pH 5,0 inntil absorbansen av effluente ved 280 nm returnerte til basislinje og eluerte med en 20 kolonne volumgradient 0-0,5 M NaCl i 10 mM Na-acetat, pH 5,0. De fraksjonene som eluerte ved 0,45 M - 0,5 M NaCl, som inneholder mus AngptB, ble ytterligere renset ved å bruke revers fase C-4-kromatografi (Vydac, CA). Fraksjonene ble surgjort med 0,1 % trifluoreddiksyregradient. Mus mAngptB eluerte ved 67 % acetonitril og ble lyofilisert og lagret ved -70°C. De identifiserte av de rensede proteiner ble verifisert ved N-terminal sekvensanalyse. LPS-konsentrasjonen ble verifisert ved å bruke kommersielle sett og bestemt til å være < 5 Eu/ml for alle humane eller murine AngptB-preparater.

EKSEMPEL 3

Fremstilling av antistoffer som binder AngptB

Dette eksempel illustrerer fremstilling av monoklonale antistoffer som spesifikt kan bindes til AngptB.

Teknikker for å produsere de monoklonale antistoffene er kjent på området og er beskrevet f.eks. i Goding, supra. Immunogener som kan anvendes inkluderer rensede ligandhomologer i henhold til foreliggende oppfinnelse, fusjonsproteiner som inneholder slike ligandhomologer, og celler som uttrykker rekombinante ligandhomologer på celleoverflaten. Seleksjon av immunogenet kan foretas av en person med kunnskap på området uten unødvendig eksperimentering.

Mus, så som Balb/c blir immunisert med immunogenet emulgert i fullstendige Freunds adjuvans og injisert subkutant eller intraperetonealt i en mengde fra 1-100 u.g. Alternativt blir immunogenet emulgert i MPL-TDM-adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) og injisert inn i dyrenes bakre fotputer. De immuniserte musene blir deretter boosted 10-12 dager senere med ytterligere immunogen emulgert i den utvalgte adjuvans. Deretter i flere uker kan musene også boostes med ytterligere immuniseringsinjeksjoner. Serumprøver kan periodisk oppnås fra musene ved retroorbital blødning for å teste ELISA-assayer for å detektere antistoffene.

Etter at en egnet antistofftiter er blitt detektert, kan dyrene "positive" for antistoffer injiseres med en avsluttende intravenøs injeksjon av den gitte ligand. 3-4 dager senere blir musene ofret og miltcellene blir høstet. Miltcellene blir deretter fusjonert (ved å bruke 35 % polyetylenglykol) til en utvalgt murin myelomcellelinje så som P3X64AgU.l, tilgjengelig fra ATCC, nr. CRL 1597. Fusjonene danner hybridomceller som deretter kan plates i 96-brønners vevskulturplater som inneholder HAT (hypoxantin, aminoterin og tymidin) medium for å inhibere proliferasjon av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.

Hybridomcellene vil screenes i et ELISA for reaktivitet mot antigenet. Bestemmelse av "positive" hybridomceller som sekrerer de ønskede monoklonale antistoffene mot TIE-ligandhomologene heri er godt innenfor kunnskapen på området.

De positive hybridomcellene kan injiseres intraperetonealt inn i syngene Balb/c-mus for å produsere ascites som inneholder de anti-TIE-ligand monoklonale antistoffer. Alternativt kan hybridomcellene dyrkes i vevskulturflasker eller rulleflasker. Rensing av de monoklonale antistoffene fremstilt i ascites kan fullføres ved å bruke ammoniumsulfatutfelling, etterfulgt av geleksklusjonskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A eller protein G anvendes.

EKSEMPEL 4

Endotelcellebinding

Angiopoietiner er sekrerte faktorer som regulerer angiogenese ved å bindes til endotelcellespesifikke tyrosinkinasereseptoren TIE2 via deres N-terminale fibrinogen (FBN)-liknende domene. Det C-terminale viklede spoledomenet tilstede i denne familien av sekrerte ligander ble funnet å være nødvendig for ligand oligomerisering (Procopio et al., J. Biol. Chem. 274:30196-201 (1999)).

Lik angiopoietinene, er AngptB et sekrert lipoprotein som består av et N-terminalt signalpeptid, etterfulgt av et viklet spoledomene og en C-terminal FBN-liknende domene (fig. 3A).

Fordi de strukturelle likhetene mellom AngptB og angiopoietiner, ble AngptB testet for evnen til å bindes, i kultur, til primære endotelceller som uttrykker Tie2-reseptoren. Humane mikrovaskulære endotelceller (HMVEC) kjøpt fra Cell System (Kirkland, WA), opprettholdt i CS-C fullstendig medium som inneholder 10 % føtalt bovint serum og vitogener i henhold til fabrikantens anbefalinger, ble inkubert med betinget media fra forbigående transfekterte 293 celler som uttrykker epitop (gD)-merkede versjoner av Tie2 ligandangiopoietin 1 og 2 (Angl og Ang2), AngptB, og angiopoietinrelatert protein 1 (ARP1). ARP1 er et strukturert beslektet molekyl som består av en viklet spole og et fibrinogenliknende domene men som ikke er i stand til å bindes til Tie2, og ble brukt som en negativ kontroll. Som vist i fig. 3B, ble Ang2 og AngptB sterkt bundet til HMVEC under betingelser hvor ingen binding ble observert for ARP1. Disse funn demonstrerer at binding av AngptB til endotelceller var spesifikk og impliserte nærvær av reseptorer på endotelcellen som medierer binding av AngpB.

For å teste i hvilken grad Tie2, reseptoren for angipoetiner 1, 2 og 3 (Angl, Ang2, og Ang3), eller Tiel, ble en hjemløs reseptor med høy sekvenshomologi til Tie2 bindes til AngptB, ble unoutfellingseksperimenter utført ved å bruke 293 celler forbigående med ekspresjonsvektorer for epitop (gD)-merkede versjoner av Angl og Ang2, AngptB og ARP1 sammen med henholdsvis full-lengde reseptorkonstrukter for Tiel og Tie2. Helcelleekstrakter ble fremstilt ved lyse i RIPA-buffer (lxPBS; 1 % NP40; 0,5 % natriumdeoksycholat; 0,1 % SDS; PMSF, 100 u.g/ml; Aproteinin, 30 ul/ml; natriumortovanadat, 1 u.M) som inneholder friskt tilsatt proteaseinhibitor. Ekstraktet ble inkubert med antistoffer spesifikt for Tiel eller Tie2 (Santa Cruz Biotechnology, San Diego, CA) og det resulterende immunopresipitat ble analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting. Spesifikt ble proteinene oppløst av SDS-PAGE og blottet til PVDF-membran inkubert med antistoffer mot henholdsvis gD-merket eller Tie-reseptorene. Som vist i fig. 4 ble ikke Tiel og Tie2 bundet til AngptB under eksperimentelle betingelser som tillot Tie2-binding til Angl og Ang2. Disse funn viste at AngptB verken er en ligand for Tie2 eller Tiel, og foreslo nærvær av andre reseptorer på endotelcellen som medierer den sterke bindingen observert i cellebindingseksperimentene.

Av interesse er det at eksponering av celler til hypoksi eller VEGF, for å herme "tumorliknende" betingelser, økte signifikant binding av AngptB (data ikke vist). Disse betingelser ble tidligere funnet å indusere integrinekspresjon på endotelceller (Suzuma et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 39:1028-35 (1999)), mens Tiel og Tie2 reseptornivåer ikke ble funnet å være forandret (Mandriota og Pepper, Circ. Res. 83:852-9 (1998) og Oh et al., J. Biol. Chem. 274:15732-9 (1999)).

EKSEMPEL 5

Mulekylærmodellering av FBN- AngptB

Det FBN-liknende domenet til AngptB deler en 39,6 % sekvensidentitet med C-terminus til y-kjeden for humant fibrinogen. For å undersøke den biologiske funksjon og molekylmekanismer med hvilke AngptB bindes til endotelceller, ble det bygget en modell av det FBN-liknende domenet til AngptB ved å bruke strukturell informasjon tilveiebragt ved røntgenstrålekrystallografiske studier på FBN-domener og homologimodellerende teknikker. FBN-domenet har en unik fold som består av tre veldefinerte domener; en N-terminusdomene dannet av et totrådet antiparallelt |3-ark flankert av en kort spiral; et sentralt domene dannet av et femtrådet antiparallelt (3-ark med to korte spiraler og en hårnålsløkke opplinjert mot én av dets overflater, og et tredje domene som er sammensatt hovedsakelig av løkker (fig. 5B).

For å bygge FBN-AngptB-modellen ble en sekvensstruktursammenstilling mellom FBN-AngptB-sekvensen og flere FBN-domenestrukturer utført ved å bruke clustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 22:4673-80 (1994)) og "threading"

(ProCeryon Biosciences Inc.). Fra denne sammenstillingen ble 3FB (PDB-kode) valgt som templatstruktur for modellkonstruksjon. Programmet PROCHECK (Laskowski et al., J. Biomol. NMR 8:477-86 (1996)) brukt til å vurdere den geometriske kvaliteten til modellen som var over gjennomsnitts stereokjemisk kvalitet sammenlignet med referansedatabasen til strukturen deponert i PDB. Den avsluttende FBN-AngptB-modell hadde en r.m.s.d på 1,95 Å for alle Ca-atomer som ble sammenlignet med templatet. Det totale utbyttet av FBN-domenet er konservert i FBN-AngptB, med noen forskjeller i løkkeregioner ved aminosyrestillinger 220-224, 229-306 og 357-363 (Fig. 5A og B).

Undersøkelser på humant fibrinogen gammakjede førte til identifikasjon av to regioner involvert i binding til integrinet ctMp2, et integrin hovedsakelig uttrykt på leukocytter (Ugarova et al., J. Biol. Chem. 273:22519-27 (1998)). Begge regioner adskilt i form av lineær aminosyresekvens, danner to tilstøtende antiparallelle P-tråder i den tredimensjonale strukturen til FBN-domenet (Pl, residuer 190-202; P2, redsiduer 377-395). En region som er forskjellig i fibrinogen-gammakjeden (P3, 346-358) og tenasin-C er også blitt funnet å være involvert i binding til integring ctvp3 (Yokoyama et al., J. Biol. Chem. 275:16891-8 (2000)). Den foreliggende FBN-AngptB-modell og FBN-domenet til den humane fibrinogengammakjede deler en høy grad av strukturell likhet i de regionene (Pl: 38-50; P2: 199-214; P3: 346-361) (fig. 5A), hvor nummereringen følger nummereringen til 3FIB (PDB-kode). Ifølge aminosyrenummereringen til AngptB (SEKV. ID nr. 2), korresponderer Pl til aminosyrer 281-293 (SEKV. ID nr. 14); P2 korresponderer til aminosyrer 442-460 (SEKV. ID nr. 5); og P3 korresponderer til aminosyrer 415-430 (SEKV. ID nr. 17) i det mature protein aminosyresekvens.

For å teste hypotesen i hvilken grad regioner i det FBN-liknende domenet til AngptB var ansvarlig for binding, ble flere peptider konstruert og syntetisert (tabell 2). P3-sekvensene koder regioner med mest strukturell forskjell mellom de forskjellige domener og kan derfor bestemme reseptorspesifisitet. Flere blandede og inverterte peptider avledet fra de samme regioner ble brukt som kontrollpeptider (tabell 2). Rekombinant humant AngptB-protein merket med en amino-terminal gD-epitop ble dannet ved å bruke et bakulovirus ekspresjonssystem som beskrevet i eksempel 2 (fig. 6A).

Glykosyleringsstatusen til det rekombinante AngptB ble bestemt med PNGase-F-behandling i henhold til fabrikantens instruksjoner (New England Biolabs, MA). Renset protein (50 ng) ble elektroforert gjennom SDS-polyakrylamidgel (10 % Tris-glysin, Invitrogen, CA) og elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen, CA) ved å bruke standard fremgangsmåter. Membranen ble blokkert ved inkubering i 5 % fettfritt melkepulver som kan tilberedes øyeblikkelig i PBS og inkubert natten over ved 4°C med 1 u.g/ml monoklonalt anti-gD (klon 5B6.K6) antistoff i blokkeringsbuffe. Membranene ble vasket med PBS/0,05 Tween 20 og deretter inkubert med pepperrotperoksidasekoblet esel anti-mus antistoffer (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) i én time ved romtemperatur. AngptB-protein ble visualisert ved kjemoluminescent deteksjon i henhold til fabrikantens protokoll (Amersham Pharmacia Biotech, NJ). Immunoutfelling, forbigående transfeksjoner og FACS-analyser ble utført som tidligere beskrevet (Klein et al., Nature 387:717-21 (1997)).

Den reduserte mobilitet til AngptB-båndet ved inkubering med PNGase anga at det rekombinante protein var glykosylert (fig. 6C). Lignende observasjoner ble gjort tidligere for angiopoietinene. Som vist i fig. 7A blokkerte tilsetting av alle tre peptidene til adhesjonsassayet fullstendig binding av endotelceller til AngptB. Integrin avpB er i stand til å gjenkjenne noen av dets ligander i sammenheng med RGD-adhesiv sekvens. Som støtte for vår observasjon at det fibrinogenliknende domenet til AngptB ikke koder slik RGD-sekvens, tilsetting av RGD-peptidet bare delvis utrydder HMVEC-adhesjon, mens RGE-peptider hadde ingen effekt. Dette resultatet foreslår at bare del av AngptB-interaksjonen med avpB blir mediert på en RGD-avhengig måte. I konklusjon foreslår disse dataene at alle tre regioner i det FBN-liknende domenet til AngptB er del av reseptorbindingssetet.

EKSEMPEL 6

Celleadhesionsassaver

A. Identifikasjon av integrin som medierer Angptl3- celleadhesjon

For å identifisere potensielle integriner som bindes til AngptB, ble rekombinant

AngptB-proteiner belagt på 96-brønners flatbundede mikrotiterplater (MaxiSorp, Nunc, Danmark) natten over ved 4°C og blokkert med 100 u.g/ml BSA i PBS i 1 time ved 37°C. Forskjellige 293 cellelinjer stabilt transfektert med forskjellige integrinheterodimerer, inkludert Ilbllla (ctnBpB), ctvpB, avØl og avP5, ble testet for sin evne til å binde AngptB belagte plater. Celler ble høstet og fortynnet i 10<5>celler/ml serumfritt CS-C-medium som inneholder 1 % BSA, 1 mM CaCb og 1 mM MgCb. Celler ble preinkubert med eller uten blokkerende antistoffer eller peptider i 15 min. ved 37°C og deretter stimulert med 200 mM PMA. Cellesuspensjoner (IO4celler/brønn) ble tilsatt de belagte brønner og platene ble inkubert ved 37°C for over utvalgte tidsrom. Ikke-adherente celler ble fjernet ved PBS-vasking og celletilfesting ble målt ved å bruke PNAG-fremgangsmåten til Landegren (Landegren, U., J. Immunol. Methods, 67:379-388 (1984)). Resultater er uttrykt som gjennomsnittelig OD^s-verdier i trippelbrønner.

Blant de stabile cellelinjene testet viste celler som uttrykte avpB en markert økning i tilklebing til AngptB sammenlignet med andre cellelinjer (fig. 7B). Følgelig viser disse funn at rekombinant human AngptB bindes spesifikt til ctvpB-integrinet. Dette er i overenstemmelse med tidligere observasjoner at endotelceller eksponert til hypoksi og VEGF bindes mer effektivt til AngptB.

B. Mediering av Angptl3- celleadhesjon med av/ 33

Integriner er kjent for å indusere biologiske responser så som celleadhesjon og migrering etter aktivering ved deres ligander. Eksperimenter ble designert for å teste i hvilken grad AngptB utøver slike virkninger på primære humane endotelceller, og i hvilken grad avpB var tilstrekkelig til å mediere disse responser. Når det ble testet i endotelcelleadhesjonsassayet induserte AngptB en robust, doseavhengig adhesjon innen 4 timer etter inkubasjonen (fig. 7C). De observerte nivåer var sammenlignbare til nivåene oppnådd når cellene ble platet på vitronektin, prototypliganden for ctvpB (data ikke vist).

For å bestemme i hvilken grad ctvpB-integrinet var tilstrekkelig til å mediere AngptB-celleadhesjon ble blokkerende antistoffer eller inhibitoriske peptider testet for sin evne til å inhibere adhesjonen i celleadhesjonsassayet. Funksjonsblokkerende antistoffer ble tilsatt til endotelcellene før inkubering med de AngptB-belagte brønner. Nærvær av funksjonsblokkerende antistoffer til ct5pi eller ctv|35 forringet ikke adhesjon av HMVEC til kulturskålene belagt med AngptB (20 u.g/ml), mens det av|33-spesifikke antistoffet fullstendig blokkerte adhesjon (fig. 7D). Som en generell kontroll ble EDTA (10 mM) som opphever integrinbinding til deres ligander tilsatt bindingseksperimentet. Som vist i fig. 7D ødela interferensen med integrinet avhengig av divalente kationer fullstendig endotelcelleadhesjon.

EKSEMPEL 7

Cellemigreringsassay

Siden et annet kjennetegn på integrinaktivitet på endotelceller er deres migrerende reaksjoner til ligandstimulering, ble det utviklet et migreringsassay for å tillate undersøkelse av virkningen av AngptB på induksjonen av migrering til endotelceller.

AngptB ble testet i migreringsassayet, beskrevet av T.V. Byzova et al., Exp. Cell Res., 254:299-308 (2000). Migreringsassayet utnytter HTS Multiwell vevskulturinnskudd med 8 u.m porestørrelse (Becton Dickinson, NJ). AngptB-proteinet ble fortynnet i PBS til 50 ng/u.1 til å underbelegge overflaten til membranfilteret. Etter forbelegging med 3 % BSA/PBS ble filtrene plassert i 500 ul serumfri CS-C-medium, 1 % BSA, 1 mM CaC^. HMVEC ble vasket 3 ganger med PBS, høstet og suspendert med 10<5>celler/ml i serumfritt medium supplementert som beskrevet ovenfor. Cellene ble preinkubert med eller uten blokkerende antistoffer (25 u.g/ml) i 15 min. ved 37°C før stimulering med PMA (200 nM). Cellesuspensjonen (250 ul) ble tilsatt det øvre kammer og cellene ble tillatt å migrere natten over ved 37°C i 5 % CO2fuktet inkubator. Etter inkubering ble cellene som forble i toppbrønnene fjernet ved å bruke en pensel, og cellene som hadde migrert til den nedre overflate av membranen ble fiksert med metanol og farget med YO-PRO-l-jodid (Molecular Probes). Migreringsresultater ble kvantifisert som gjennomsnittelig antall av celler/mikroskopisk felt ved å bruke Open/aé programvare (Improvision, MA).

Etter 16-20 timers eksponering av AngptB til endotelceller ble det observert en 2,5 gangers økning i cellemigrering sammenlignet med BSA-kontrollbehandling (fig. 7E). Det viktigste var at slik migrering ble blokkert ved administrering av et antagonistisk antistoff til ctvpB, men ikke med kontrollantistoffer som blokkerer andre integriner. I konklusjon induserer AngptB kraftig migrering av primære humane endotelceller og begge aktiviteter ble blokkert ved antagonistiske antistoffer mot ctvpB.

EKSEMPEL 8

Vevsekspresjon av AngptB

A. In situ hybridisering.

In situ hybridisering ble utført som tidligere beskrevet (Lu, Cell Vision 1:169-176

(1994)). PCR-primere

øvre: 5'T7-promoter: GGATTCTAATACGACTCACT ATAGGGC (SEKV. ID nr.

6) + GGCATTCCTGCTGAATGTACC (hAngptB spesifikk sekvens, SEKV. ID nr. 7) 3' og nedre: 5' T3-promoter: CTATGAAATT AACCCTCACTAAAGGGA (SEKV. ID nr. 8) + ACCACACTCATCATGCCACCA (hAngptB spesifikk sekvens, SEKV. ID nr. 9) 3' ble designert til å amplifisere et 506-bp-fragment av humant AngptB og øvre: 5'T7-promoter: GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGC (SEKV. ID nr. 6) + 5' GATGACCTTCCTGCCGACTG (mAngptB spesifikk sekvens, SEKV. ID nr. 11) 3' og nedre: T3-promoter: CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGA (SEKV. ID nr. 8) + 5' GTCATTCCACCACCAGCCA (mAngptB spesifikk sekvens, SEKV. ID nr. 13). Primere som inkluderte ekstensjoner som koder 27 nukleotid T7 eller T3 RNA-polymeraseinitieringsseter for å tillate in vitro transkripsjon av henholdsvis sens eller antisens riboprober, fra de amplifiserte produkter. Humant vev, 5 u.m tykke snitt ble deparafinisert, deproteinert i 20 u.g/ml proteinase K i 15 min. ved 37°C, renset i 2 x SSC, dehydrert gjennom graderte konsentrasjoner av etanol og inkubert i prehybridiseringsbuffer i 1-4 timer. Musevev ble fordøyd i 4 u.g/ml proteinase K i 30 min. ved 37°C og behandlet som beskrevet ovenfor.<33>P-UTP-merket sens- og antisensprober ble hybridisert til snittene ved 55°C natten over. Ubundet probe ble fjernet ved inkubering i 20 mg/ml RNaseA i 30 min. ved 37°C etterfulgt av en vask med høy stringens ved 55°C i 0,1 x SSC i 2 timer, og dehydrering gjennom graderte konsentrasjoner av etanol. Objektglassene ble dyppet i NBT2 sporemulsjon (Eastman Kodak, NY), eksponert i forseglede plastobjektglassbokser som inneholder et tørkemiddel i 4 uker ved 4°C, fremkalt og motfarget med hematoksylin og eosin.

Vist i fig. 8C er hepatocytt spesifikk ekspresjon som observert i snitt av embryoniske levere fra E15 og El8 museembryoer. Det var ingen AngtpB-ekspresjon på de erytroide forløpere, endotelceller eller megakaryocytter i de embryone snittene analysert.

B. Northern Blots

For å studere AngptB-ekspresjon i voksent humant vev, ble multivev Northern blots probet med en radiomerket probe som dekker 5'-enden av den kodede sekvens, som beskrevet ovenfor. I kontrast til tidligere observasjon med den murine ortolog AngptB (Conklin et al., Genomics 62:477-82 (1999)), som ble funnet å være uttrykt eksklusivt i lever, ble ekspresjon av human AngptB funnet i voksen lever og nyre, signalene observert i nyren var imidlertid signifikant lavere (fig. 8A). Ingen ekspresjon ble funnet i noen av de andre voksne vev analysert, inkludert lunge og hjerne med unntak av noen svake signaler i skjelettmuskelvev. Cellulær lokalisering av AngptB mRNA-ekspresjon ble undersøkt med in situ hybridiseringseksperimentet på forskjellige normale og syke vev avledet fra humane og muse-prøver. Vevene inkluderte alle de viktigste organer, benmarg, så vel som patologisk levervev så som cirrhose, metastatisk lever adenokarsinom og snitt fra acetominofenindusert hepatotoksisitet. Som vist i fig. 8B var noe bakgrunnsekspresjon funnet i normal voksen lever som konfirmerer Northern blot dataene. Mens det ikke var noen forandringer i ekspresjonen i levertumorprøver analysert, ble sterk induksjon observert i snitt avledet fra syk lever assosiert med inflammasjon, så som levercirrhose og etter toksisk skade. Som vist i innskuddene med høy forstørrelse ble hepatocyttspesifikk ekspresjon funnet i både normale og syke levervev (fig. 8C). Ekspresjon ble ikke detektert i stromaceller, i lymfocytter og i endotelceller i eller som omga de syke vevene.

Som oppsummering viser disse dataene et hepatocyttspesifikt ekspresjonsmønster for AngptB under embryonisk utvikling så vel som en sterk hepatocyttspesifikk oppregulering i forskjellige tilfeller av syk lever assosiert med inflammasjon.

C. Genekspresjonsprofilering

Genekspresjonsanalyse ble utført for AngptB ved å bruke GeneLogic database for humane vev som representerer normale og sykdomstilstander, inkludert cancer og ikke-cancer.

Ved å bruke GeneLogic genekspresjonsdatabase ble øket ekspresjon i tilfelle av leversykdom identifisert med in situ hybridisering av humane leversnitt (fig. 8B). Basalnivåer av AngptB var lave i de fleste vev og organer med unntak av lever. En signifikant økning i ekspresjonsnivåer for AngptB mellom normale og patologiske tilstander var tilstede i lever, hjerte og tyroidea. En mer detaljert undertypeanalyse for AngptB-ekspresjon med prøver avledet fra pasienter som lider av forskjellige former for leversykdommer konfirmerte sterkest ekspresjon av AngptB under levercirrhose. Av interesse er det at GeneLogic databaseanalyse klargjorde sterk indeksjon av AngptB-ekspresjon ikke bare i patologiske levere, men også i hjertesykdommer så som kransarteriesykdommer og hypertrofisk kardiomyopati. Sykdomsformene assosiert med øket ekspresjonsnivå av AngptB deler i fellesskap dannelse av fibrotisk vev som består av et utvalg av ekstracellulære matriksproteiner inkludert kollagen, fibronektin, vitronektin og laminin, hvorav alle disse ECM-molekylene er kjent for å bindes til spesifikke integrinformer.

EKSEMPEL 9

Assay for in vivo angiogenisk aktivitet av AngptB

For å teste i hvilken grad AngptB var i stand til å indusere en in vivo angiogen respons i rottehornhinne, ble hyaluronpellets som inneholder murin og human AngptB (500 ng) så vel som humant VEGF (100 ng) implantert separat eller i kombinasjon som beskrevet tidligere (Xin et al., J. Biol. Chem., 274:99116-9121

(1999)). Hydronpellets som inneholder eksipient (kontroll, murin eller humant AngptB (500 ng), VEGF (100 ng), eller kombinasjonen av murint eller humant AngptB (500 ng) og VEGF (100 ng) ble implantert i hornhinnene til 250-300 g hannlige Sprague-Dawley rotter. Alle hydronpellets inneholdt 100 ng sukralfat. På dag 6 ble dyrene autanasert og injisert med fluorescein-isotiocyanatekstrat for å gi visualisering av vaskulaturen. Totale hornhinneetasje ble gjort fra de uttatte øynene og analysert for neovaskulære områder ved å bruke en datamaskinassistert billedanalysator (Image Pro-Plus 2.0, Silver Spring, MD). I kontrast til tidligere rapporter som fokuserer på virkningen av angiopoietin 1 og 2 under testing i hornhinneangiogeneseassayet (Asahara et al., Circ. Res. 83:233-40 (1998)), induserte rekombinant AngptB alene kraftig en sterk angiogen respons 5 dager etter pellettimplantering. Som vist i fig. 9A og B var murin AngptB noe mer potent til å indusere angiogenese sammenlignet med rekombinant humant protein, begge responser var imidlertid sammenlignbare til de nivåene oppnådd for VEGF. I kombinasjonsbehandling med VEGF ble additive men ikke synergistiske virkninger observert (fig. 9B). Disse funn kan reflektere de interavhengige signaltransduksjonsveiene igangsatt av begge ligander (Byzova et al., Mol. Cell. 6:852-60 (2000)).

EKSEMPEL 10

In vivo biologisk aktivitet til AngptB

A. Transient beskyttende virkning og langtidsvirkning av intravenøs og intradermal administrering av AngptB.

Fremgangsmåter

Adenovirusdannelse: Adenoviral CMV-gD-mAngptB, CMV-lacZ og mVEGF164 ble dannet ved å bruke AdEasy adenoviral vektorsystem (Stratagene) hovedsakelig ved å følge fabrikantens instruksjoner. Rekombinante adenovirale vektorer som koder murin AngptB eller VEGF ble konstruert ved å klone en kodende region til AngptB eller VEGF inn i polylinkersetet til Ad-easy-vektorkonstruksjonssettet fra Stratagene. Den kodende region til mAngptB eller VEGF ble klonet mellom Notl-og Hindlll-setene til pShuttleCMV-vektoren. Disse vektorer, ble sammen med det leverte pShuttleCMV-lacZ rekombinert i BJ5183 elektrokompetente bakterier (Stratagene), med AdEasy-vektoren som inneholder Ad5-genomet deletert for El-og E3-regioner. Primære viruslager ble fremstilt ved transient å transfektere de rekombinerte AdEasy-plasmidene inn i hvert HEK293-celler. Adenoviruslagre ble ytterligere amplifisert i HEK293-celler og renset ved å bruke Virakit Adeno purification kit (Virapur). Adenovirustitere ble oppnådd ved agarose-overlagte plakksassayer.

1. Beskyttende virkning av korttidsintravenøs administrering av AngptB.

For korttids analyse av leverbeskyttelse mot toksisk skade, ble adenoviruskonstrukter administrert til 12 voksne BalbC-mus gjennom haleveneinjeksjoner som tillater kontinuerlig og robust ekspresjon av protein i leverne så tidlig som 2 dager og opptil 3 uker etter behandling med en dose av 1 x IO<9>Pfu for mAngptB og LacZ-kodende kontrollvirus, og 1 x IO<7>Pfu av VEGF-kodende virus. 5 dager etter behandling med adenovirale vektorer ble musene underoppdelt i to undergrupper (n=6) som ble ytterligere utsatt for behandling med: bærer (olivenolje) eller CC14 (karbontetraklorid), det kraftige hepatotoksiske middel som induserer leverskade. Både bærer og CC 14 ble gitt med 4 ml/k ved oral gavage. Etter 48 timer ble dyrene drept, blodet ble oppsamlet og vevene ble høstet og fiksert for analyse. Nivåene av konstruktekspresjon i musene ble analysert med western blot analyse på dag 7 etter adenoviral infeksjon (fig. 10A).

Resultater

Den beskyttende virkning av AngptB på CC14-indusert hepatocyttnekrose ble vist ved den signifikante, 2,1 ganger reduksjon i blodnivåer av aspartattransferase (AST), som er en indikasjon på leversvikt, i serum fra mus behandlet med adenoviruskodende AngptB, men ikke ved noen av kontrollkonstruktene (p<0,0001)

(fig. 10B). Følgelig kan transient administrering av rekombinant AngptB være gunstig for behandling av leverskade.

2. Indusert leverskade med forlenget intravenøs ekspresjon av AngptB

For å vurdere langtidsvirkninger av øket AngptB-nivåer ble mus som ble behandlet med adenovirale vektorer som koder for AngptB som beskrevet ovenforkarakterisertover en periode på 2 uker etter viral transduksjon.

a. Blodkjemianalyse

Blodkjeminivåer som er indikerende for leverfunksjon ble målt i serumprøver tatt fra villtype, C57B16-mus, under en periode på 2 uker etter adenoviral transduksjon. Hematology Cell-Cyn 13700, og blodkjeminivåer ble bestemt på en Cobas Integra 400.

Som vist i fig. 1 IA induserte adenovirale vektorer som koder AngptB, men ikke kontrollvirus som koder LacZ eller Angiopoietin 1 (Angl), en sterk økning i serum ALT- og AST-nivåer. Økningen i serum ALT- og AST-nivåer var sammenlignbare med nivåer av ALT og AST som er observert med karbontetrakloridbehandling. Følgelig kan interferens med AngptB-aktivitet være potensielle behandlinger under inflammatoriske sykdommer i leveren eller sykdommer i hjertet.

For videre å vurdere et potensielt bidrag av immunsystemet, ble det målt blodkjeminivåer som indikerer leverfunksjon i immunokompromitterte RAG2-knock out mus, som mangler B- og T-celler og SCID-mus, som mangler B, T og naturlige dreperceller (NK). Som vist i fig. 11B, induserte adenovirale vektorer som koder AngptB AST- og ALT-nivåer i RAG2-mus, noe som antyder at de forandringene i leverfunksjon indusert ved AngptB skjer uten hensyn til nærvær av et intakt immunsystem.

b. Hepatocyttproliferasjon

For ytterligere å karakterisere virkningen av behandling med adenovirale vektorer som uttrykker AngptB på RAG2-knock out og SCID-mus, ble celleproliferasjon i forskjellige formalinfikserte, BrdU-inkorporerte organer, inkludert nyre, hjerte, lever, lunge og tynntarm av behandlede mus kvantifisert i RAG2-knock out og SCID-mus som enten var behandlet med adenovirale vektorer som uttrykker AngptB eller kontroll adenovirale vektorer. Celleproliferasjon ble målt ved å utføre BrDU-farging som detekterer celler under S-fasen av cellesyklus på parafininnstøpte snitt som ble tatt fra kontroll- eller AngptB-behandlede mus 14 dager etter adenoviral administrering (IV). BrdU ble administrert intraperetonealt til dyr med en dose på 100 mg/kg, 1 time før avliving. Etter en 20 min. behandling med 0,05 % trypsin ved 37°C og en 45 min. behandling med 95 % formamid i 0,15 M trinatriumsitrat ved 70°C for denaturering, ble vevene farget med museantistoffer til IdU/BrdU (Caltag) med en fortynning på 1:1000 natten over ved 4°C. Et biotinylert hesteantistoff til mus IgG (vektor) ble brukt som det sekundære reagens og detektert ved å bruke Vectastin ABC Standard Elite kit (Vector Laboratories). Museisotyp (Zymed) ble brukt som en negativ kontroll. Snitt ble deretter motfarget med hematoksilin. Det totale antall av merkede kjerner i 10 uavhengige, tilfeldig valgte felt ved å bruke et 40X objektiv ble tellet. Hvert felt dekket et område på 0,063 mm<2>.

Som vist i tabell 2 ble det observert større enn 10 ganger induksjon av hepatocyttproliferasjon i RAG2-knock out og SCID-mus som var behandlet med adenovirale vektorer som uttrykker AngptB.

c. Histologisk analyse

Histologisk analyse ble utført på leversnitt som ble høstet fra C57/B16 14 dager etter infeksjon med adenovirale vektorer. En økning i mitotisk tall som er indikativt på celleproliferasjon i hepatocytter og inflammatoriske infiltrater ble observert i leversnittene som ble isolert fra mus behandlet med adenovirale vektorer som koder AngptB under sammenligning med levere som ble isolert fra kontrollmus som ble behandlet med adenovirale vektorer som koder LacZ. Leverne fra AngptB-behandlede dyr var også signifikant større enn levere fra kontrollbehandlede dyr.

d. FACS-analyser

Skjønt LFA1 og Mac-1 uttrykt på immunceller ikke bindes til rekombinant AngptB (Camenisch et al., 2002) når de er testet ved ELISA-assayer in vitro, kan andre medlemmer av integrinfamilien som er uttrykt på immunceller være involvert med AngptB.

For å undersøke muligheten at inflammatoriske celler bidrar til vevsskaden observert i levere hos mus behandlet med adenoviral vektor som uttrykker CCLF1, ble mengden av perifere blodceller bestemt med FACS for nærvær av forskjellige linjer ved å farge med celletypespesifikke markører. Ingen signifikante forskjeller i mengder av forløpere (Seal), T-celler (CD4 og CD8), B-celler (B220), makrofag (Grl/Macl) og erytroide celler (Teri 19) ble detektert i mus behandlet med adenoviral vektor som uttrykker AngptB når sammenlignet med mengder detektert i mus behandlet med kontroll adenovirale vektorer som uttrykker LacZ eller Angl. På samme måte var det ingen forskjell i mengde av serumglyserider og kolesterol observert mellom behandlingsgruppene.

e. Celleadhesjonsanalyser

For ytterligere å undersøke den cellulære mekanismen involvert i å mediere leverskade, ble celleadhesjonseksperimenter med hepatocytter og endotelceller på AngptB-belagt vevskulturskåler utført på samme måte som celleadhesjonsassayene beskrevet i eksempel 6.

96-brønners flatbunnede plater (MaxiSorp, Nunc, Danmark) ble belagt natten over ved 4°C med de angitte konsentrasjoner av proteiner og blokkert med 3 % BSA i PBS i 1 time ved 37°C. Primære humane hudendotelceller (HMVEC) og ferskt isolerte murine hepatocytter som var fremstilt fra levere fra voksne C57/B16-mus ved å bruke fremgangsmåten beskrevet i LeCOuter et al. (LeCouter et al., 2001) ble høstet og fortynnet til IO<5>celler/ml i serumfritt CS-C-medium som inneholdt 1 % BSA, 1 mM CaCl2og 1 mM MgCl2i nærvær av 200 nM PMA. Kvalitativt like resultater med hensyn på cellebinding ble observert i fravær av PMA. Cellesuspensjoner (IO<4>celler/brønn) ble satt til de belagte brønner og platene ble inkubert ved 37°C i utvalgte tidsrom. Ikke-adherente celler ble fjernet med PBS-vasking og celletilfesting ble målt ved å bruke PNAG-metoden til Landegren (Landegren, 1984). Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittelig OD^s-verdier i triplikate brønner.

Som vist i fig. 13, var HMVEC-adhesjon til AngptB-belagte skåler mellom 20 % og 50 % relativt til nivået av adhesjon observert for fibronektinbelagte plater. Beleggkonsentrasjonsavhengig hepatocyttadhesjon ble også observert. Følgelig kan hepatocytter og endotelceller være involvert i å mediere de biologiske virkninger observert i lever hos AngptB-behandlede mus.

3. Øket vaskulær permeabilitet med intradermal administrasjon av AngptB.

For å undersøke de vaskulære forandringer indusert ved transient AngptB-ekspresjon hos voksne mus, ble adenovirale ekspresjonsvektorer (lxlO"<9>PFU) administrert i et totalt volum på 10 ul i det epidermale hudlag til ørene på voksne FVB-mus under anestesi hvor ytterligere analysert for forandringer i vaskulær permeabilitet ved å bruke Evans Blue assayet. Kortfattet, ble musene anestisert fra begynnelsen og gjennom hele Evans Blue assayet. Etter igangsettelse av anestesi, ble 100 ul Evans Blue (1 % oppløsning i PBS) administrert intravenøst til mus via haleveneinjeksjon. Etter en periode på 60 min. etter administrasjon av Evan Blue, ble musene perfundret fra venstre ventrikkel med 1 % formaldehyd i sitratbuffer med en pH på 3,5 og et trykk på 120 mmHg. Ørene ble fjernet og veid. Evans blue fargestoff ble ekstrahert fra ørene med 1 ml formamid. Mengden av ekstravasert Evans Blue ble målt med et lysspektrofotometer på 610 nm og uttrykt som innholdet farge pr. 1 mg våtvekt vev.

Resultater:

En økning i vaskulær permeabilitet som ble målt med Evans Blue assay relativt til nivåene på vaskulær permeabilitet i mus som ble administrert kontrolladenovirale vektorer som uttrykker LacZ, ble observert i ørene til mus som ble intradermalt administrert med adenovirale vektorer som uttrykker AngptB eller VEGF (fig. 12D), 6 dager etter administrasjon.

B. Øket vaskulær permeabilitet i transgene mus som uttrykker K5-mAngptB

I en alternativ metode ble utviklingsvirkningene av økte nivåer av AngptB-ekspresjon i huden studert ved å danne transgene mus som uttrykte murin AngptB under kontroll av en keratinocyttspesifikk promoter, som blir konstitutivt uttrykt under utvikling og hos voksne.

1. Grunnlegger transgene mus

Grunnlegger transgene mus ble fremstilt ved å bruke K5-gD-mAng5, et konstrukt som tillater ekspresjon av AngptB under kontroll av den murine K5-promoter, som ved standardprosedyrer (Filvaroff et al., 2002). For dannelse av K5-gD-mAng5-konstruktet ble AngptB-genet skåret ut Notl- Notl ble innsatt i pNASSK5P Notl- Notl- SAP og resulterer i K5-gD-mAng5.

Totalt 17 transgene grunnlagsstammer ble dannet. Musungene ble genotypet da de var 9 dager gamle ved PCR i musehale-DNA (QIAGEN, Santa Clarita, CA) ved å bruke følgende primersett:

Ved 8 ukers alder ble biopsier fra flere vev inkludert muskel, nyre, lever, milt, hud, hjerne, tymus og tarm tatt og utsatt for sanntid RT-PCR for bestemmelse av nivåene av endogen og transgen ekspresjon av AngptB. For RT-PCR-analyse ble følgende prober og primere, som var konstruert slik at transendogene og transgene transkripter var målbare, brukt:

Statistisk analyse av forskjellen mellom transgene mus som uttrykker AngptB under den murine K5-promoter ble bestemt ved Studenfs t-test med en verdi på P < 0,05 ble betraktet å være statistisk signifikant og en verdi for P < 0,01 som meget signifikant.

2. Etterkommer transgene mus

Basert på genekspresjonsanalyse fra hudbiopsier fra alle de transgene grunnlagsmusene, ble fem av de høyest AngptB-uttrykkende grunnleggere identifisert og utvalgt for ytterligere avling til C57/B16-mus. Genotypfrekvensanalyse ga normalt Mendelisk frekvensfordeling av de transgene og ingen signifikant postnatal letalitet ble observert å være assosiert med transgen ekspresjon.

a. Transgen ekspresjon

RNA fra forskjellige vev angitt ble isolert og de relative nivåene av transgen ekspresjon relativ til endogen ekspresjon, spesifikt i leveren, ble vurdert ved sanntids RT-PCR.

Som forventet ble økede nivåer av murin AngptB-ekspresjon observert i hud fra transgene versus kulltilpassede villtypekontroller. Transgen ekspresjon av AngptB i huden nådde ca. 10 % av de endogene AngptB-ekspresjonsnivåene i leveren (fig. 12A).

Ytterligere ble moderat ekspresjon i lunge og hjerne hos 12 uker gamle transgene mus observert sammenlignet med villtypemus. Følgelig kan ekspresjon i lunge og hjerne resultere fra en øket transkripsjonen aktivitet til K5-promoter i disse vev.

En understøttelse av den moderate AngptB-ekspresjon funnet ved Northern blot analyse i voksne humane nyrer (fig. 8A) ga Taqman-analyse av musenyre-RNA moderate endogene ekspresjonsnivåer av AngptB.

For å overvåke postnatal transgen ekspresjon over tid ble sanntids RT-PCR-analyse utført med RNA isolert fra hudbiopsier på 3, 6 og 11 uker gamle transgene mus. Som vist i fig. 12B, ble konsistente nivåer av transgen ekspresjon observert i huden til transgene mus på alle utviklingsstadiene testet.

b. Vaskulær permeabilitet

Basert på de transgene ekspresjonsdata ble 12 uker gamle transgene og villtype kulltilpassede villtypekontroller utvalgt og utsatt for et assay for vaskulær permeabilitet ved å bruke Evans Blue assay lik det som beskrevet ovenfor, og tidligere for Angl og Ang2, to strukturelt beslektede medlemmer av angiopoietinfamilien for angiogene molekyler (Maisonpierre et al., 1997; Thurston et al., 2000; Thurston et al., 1999). Vaskulær permeabilitet blir målt ved Evans Blue assay som beskrevet ovenfor. Begge de 11 uker gamle transgene stammer som ble utsatt for Evans Blue analyse hadde en signifikant økning, mellom 2 og 3 ganger økning, i vaskulær permeabilitet på basale nivper (fig. 12C) når de ble sammenlignet til kulltilpassede villtypestammer. Forskjellene i vaskulær permeabilitet mellom de transgene mus og de kulltilpassede villtypemus var imidlertid mindre signifikant når musene ble utfordret med seneppsolje før de ble utsatt for Evans Blue assayanalyse. Følgelig kan økningen i vaskulær permeabilitet hos transgene mus relativt til deres villtype kullkontroller foreslå en rolle for AngptB i regulering av vaskulær permeabilitet.

Deponering av materiale

Som angitt tidligere er følgende materiale blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Disse deponeringer ble foretatt under bestemmelsene i Budapestavtalen vedrørende internasjonal gjenkjenning av deponering av mikroorganismer med hensyn på patentfremgangsmåte og forskrifter derunder (Budapest Treaty). Dette sikrer opprettholdelse av en levende kultur av deponeringen i 30 år fra deponeringsdato. Deponeringen vil gjøres tilgjengelig av ATCC under Budapestavtalens betingelser, og er underkastet en avtale mellom Genetech, Inc. og ATCC, som sikrer permanent og ubegrenset tilgjengelighet av etterkommerne av kulturen som ble deponert til det offentlige ved utstedelse av den tilsvarende US patent eller ved å offentliggjøre enhver amerikansk eller utenlandsk patentsøknad, av hvilke den som kommer først, og sikrer tilgjengelighet av etterkommerne til én bestemt av U.S. Commissioner of Patnets and Trademarks som har krav på dette i henhold til 35 USC §122 og reglene til kommisjonæren som er knyttet dertil (inkludert 37 CF.R. §1.14 med spesiell referanse til 886 OG 683).

Søkeren i foreliggende oppfinnelse har erklært seg enig i at hvis en kultur av materiale som er deponert skulle dø eller mistes eller ødelegges under dyrking under egnede betingelser vil materialet øyeblikkelig bli erstattet ved tilskriving med en annen av samme kultur. Tilgjengelighet av det deponerte materialet skal ikke tolkes som en lisens til å praktisere oppfinnelsen under krenking av de rettigheter garantert under autoriteten til enhver regjering i henhold til dets patentlover.

Foreliggende spesifikasjon er vurdert å være tilstrekkelig til å gjøre det mulig for en med kunnskap på området å praktisere oppfinnelsen. Den foreliggende oppfinnelse skal ikke begrenses i området ved deponerte konstrukt, siden den deponerte utforming er ment som en enkel illustrasjon av visse sider av oppfinnelsen og enhver konstrukter som er funksjonelt ekvivalent er innenfor oppfinnelsens område. Deponering av materiale heri utgjør ikke en innrømmelse at den skrevne beskrivelse ikke er tilstrekkelig for å tillate utøvelse av enhver side av oppfinnelsen, inkludert den beste utførelsen derav, ei heller skal det vurderes som å begrense kravenes omfang til de spesifikke illustrasjonene som de representerer. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de vist og beskrevet heri vil virkelig bli klart for de med kunnskap på området fra den foregående beskrivelse.

Claims

1. Anvendelse av n antagonist av AngptB i fremstillingen av et medikament for behandling eller forhindring av vevsskade forbundet med en inflammatorisk leversykdom kjennetegnet ved overekspresjon av AngptB, der antagonisten av AngptB binder til AngptB eller avp3 integrin og inhiberer evnen til AngptB til spesifikt å binde til og regulere cellulære responser mediert av avp3 integrin, og der antagonisten er: a) et antistoff, der antistoffet er et anti-AngptB antistoff eller et anti- avp3 antistoff; b) et immunoadhesin, der immunoadhesinet omfatter ligandbindingsregionen av avp3 integrin fusjonert til en immunoglobulinsekvens eller reseptorbindingsregionen av AngptB fusjonert til en immunoglobulinsekvens; eller, c) en kombinasjon av et peptid omfattende SEKV. ID NO: 14, et peptid omfattende SEKV. ID NO: 15 og et peptid omfattende SEKV. ID NO: 17.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der den inflammatoriske leversykdommen omfatter lever cirrhose, lever fibrose, kronisk hepatitt, fettlever, iskemisk reperfusjonsskade av leveren, sepsis eller toksisk metabolsk leverskade.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2, der den inflammatoriske leversykdommen er toksisk metabolsk leverskade eller fettlever.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2, der lever cirrhosen er alkoholisk levercirrhose eller primær biliær cirrhose.

5. Anvendelse ifølge hvilket som helst av krav 1 til 4, der anti-AngptB antistoffet eller anti- avp3 integrinantistoffet er et monoklonalt antistoff, antigen bindende antistoffragment, eller enkeltkjedet antistoff.

6. Anvendelse ifølge krav 5, der det monoklonale antistoffet er et kimær antistoff, humanisert antistoff eller humant antistoff.

7. Anvendelse ifølge krav 5, der antistoffragmentet er et Fab, Fab', F(ab') 2, eller Fv fragment.

8. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der forhindring omfatter å forhindre progresjon av leversykdommen.

9. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der AngptB omfatter en eller flere av aminosyreregioner 281 til 293, 415 til 430, eller 442 til 460 av SEKV. ID NO:2.

10. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der AngptB omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NO:2.

11. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, der AngptB er kodet av et polynukleotid omfattende en nukleinsyresekvens av SEKV. ID NO:l.

12. Antagonist av AngptB for anvendelse i behandling eller forhindring av vevsskade assosiert med en inflammatorisk leversykdom kjennetegnet ved overekspresjon av AngptB, der antagonisten av AngptB binder til AngptB eller avp3-integrin og inhiberer evnen til AngptB til spesifikt å binde til og regulere cellulære responser mediert av avp3-integrin, og der antagonisten er: a) et antistoff eller antistoffragment derav der antistoffet er et anti-AngptB-antistoff eller et anti- avp3-integrinantistoff; b) et immunoadhesin, der immunoadhesinet omfatter ligandbindingsregionen av avp3-integrin fusjonert til en immunoglobulinsekvens eller reseptorbindingsregionen av AngptB fusjonert til en immunoglobulinsekvens; or c) en kombinasjon av et peptid omfattende SEKV. ID NO: 14, et peptid omfattende SEKV. ID NO: 15 og et peptid omfattende SEKV. ID NO: 17.

13. Antagonist for anvendelse ifølge krav 12 der inflammatorisk leversykdom omfatter levercirrhose, leverfibrose, kronisk hepatitt, fettlever, iskemisk reperfusjonsskade av leveren, sepsis eller toksisk metabolsk leverskade.

14. Antagonist for anvendelse ifølge krav 12 eller krav 13 der den inflammatoriske leversykdommen er toksisk metabolsk leverskade eller fettlever.

15. Antagonist for anvendelse ifølge krav 12 eller krav 13, der levercirrhosen er alkoholisk levercirrhose eller primær biliær cirrhose.

16. Antagonist for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 15, der anti-Angptl3-antistoffet eller anti- avp3-integrinantistoffeter et monoklonalt antistoff, antigenbindende antistoffragment, eller enkeltkjedet antistoff..

17. Antagonist for anvendelse ifølge krav 16, der det monoklonale antistoffet er et kimær antistoff, humanisert antistoff eller humant antistoff.

18. Antagonist for anvendelse ifølge krav 16, der antistoffragmentet er et Fab, Fab', F(ab') 2, eller Fv fragment.

19. Antagonist for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 18, der forhindring omfatter å forhindre progresjon av leversykdommen.

20. Antagonist for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 19, der AngptB omfatter en eller flere av aminosyreregioner 281 til 293, 415 til 430, eller 442 til 460 av SEKV. ID NO:2.

21. Antagonist for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 20, der AngptB omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NO:2.

22. Antagonist for anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 21, der AngptB er kodet av et polynukleotid omfattende en nukleinsyresekvens av SEKV. ID NO:l.