JP2002531127A - 成長因子相同体ｚｖｅｇｆ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリペプチドの成長因子、それらを製造する方法、それらをコードするポリヌクレオチド、それらに対する抗体、およびそれらを使用する方法が開示される。ポリヌクレオチドは、配列番号２の残基４６〜１６３または配列番号２の残基２３５〜３４５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸セグメントを含んでなる。ポリペプチドのマルチマーがまた開示される。ポリペプチド、マルチマーのタンパク質、およびポリヌクレオチドは、細胞および組織の発生の研究および調節において、細胞培地の成分として、および診断剤として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 多細胞動物において、細胞の増殖、分化、および移動はポリペプチド成長因子
により制御される。これらの成長因子は、（solid）固形腫瘍の発生を包含する
、正常および病因の両方においてある役割を演ずる。 ポリペプチド成長因子は、細胞表面のレセプターに結合することによって細胞
の事象に影響を及ぼす。このようなレセプターの多数は、チロシンキナーゼであ
る。結合は細胞内の一連のシグナリング事象を開始し、究極的に表現型の変化、
例えば、細胞分裂、プロテアーゼ産生、および細胞移動を変化させる。

【０００２】 成長因子は構造の類似性に基づいてファミリーに分類することができる。この
ようなファミリーの1つ、PDGF（血小板由来成長因子）ファミリー、は、ジサル
ファイド結合により安定化された二量体構造により特徴づけられる。このファミ
リーは、PDGF、胎盤成長因子（PIGF）、および血管内皮成長因子（VEGF）を包含
する。これらのタンパク質の個々のポリペプチド鎖は、システイン残基の対間の
ジサルファイド結合により形成された、システイン結節の回りの蝶ネクタイ様立
体配置を有する、特徴的な高次構造を形成する。ループ間の疎水性相互作用は、
2つのモノマーのニ量体化に寄与する。

【０００３】 下記の文献を参照のこと：Daopin他、Science 257：369、1992；Lapthorn他
、Nature 369：455、1994。このファミリーのメンバーは、ホモダイマーおよび
ヘテロダイマーの両方として活性である。例えば、下記の文献を参照のこと：He
ldin他、EMBO J. 7：1387−1393、1988；Cao他、J. Biol. Chem. 271：315
4−3162、1996。システイン結節のモチーフおよび蝶ネクタイの折りたたみは、
また、成長因子−ベータ（TGF−β）および神経成長因子（NGF）を形質転換する
成長因子、および糖タンパク質ホルモンの特徴を示す。それらのアミノ酸配列は
非常に発散しているが、これらのタンパク質のすべてはシステイン結節の6つの
保存されたシステイン残基を含有する。

【０００４】 4つの血管内皮成長因子が同定された：VEGF、また、血管透過性因子として知
られている（Dvorak他、Am. J. Pathol. 146：1029−１０３９、1995）；VEG
F−B（Olofsson他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：2567−2581、1996；
Ahyward他、WIPO公開No. WO 96／27007）；VEGF−C（Joukov他、EMBO J. 15
：290−２９８、1996）；およびVEGF−D（Oliviero、WO 97／12972；Achen他、
WO 98／07832）。5つのVEGFポリペプチド（121、145、165、189、および206ア
ミノ酸）が、VEGF mRNAのオールタネイトスプライシングから生ずる。

【０００５】 VEGFは血管形成として知られているプロセスを通して血管系の発生を刺激する
が、血管内皮細胞は細胞周期に再び入り、下に横たわる基底膜を分解し、移動し
て新しい毛細血管の芽を形成する。次いでこれらの細胞は分化し、成熟血管が形
成される。この成長および分化のプロセスは、前血管形成因子および抗血管形成
因子の均衡により調節される。血管形成は、胚発生および創傷治癒において起こ
る、組織の正常の形成および修復に対して中心をなす。血管形成は、また、ある
種の疾患、例えば、充実性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、斑紋変性
、およびアテローム性動脈硬化症の発生における因子である。

【０００６】 脊椎動物および無脊椎動物からの多数のタンパク質は、神経の発生に影響を及
ぼすとして同定された。これらの分子のあるものは、ニューロピリンのファミリ
ーおよびセマホリン／コラプシンのファミリーのメンバーである。突起として知
られている、ニューロン細胞のアウトグロースは、細胞体から離れて成長してシ
ナプス接続を形成する。細胞体から離れる方向に情報を運ぶ、長い、細い突起は
軸索と呼ばれ、そして細胞体にまた細胞体から情報を運ぶ短い、太い突起は樹状
突起と呼ばれる。軸索および樹状突起は集合的に神経突起と呼ばれる。

【０００７】 神経突起は成長円錐体、神経突起の成長先端により拡張され、これらの高度に
運動性であり、究極的に身体におけるニューロン網状組織を増加しかつ拡張する
役割をする。 VEGFの3つのレセプターが同定された：KDR／Flk−1（Matthews他
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：9026−9030、1991）、Fit−1（de Vr
ies他、Science 255：989−991、1992）、およびニューロピリン−1（Soker他
、Cell 92：735−745、1998）。ニューロピリン−1はクセノプス・タドポール
（Xenopus tadpole）において最初に同定され、次いでニワトリ、マウス、およ
びヒトにおいて同定された、細胞表面の糖タンパク質である。

【０００８】 ニューロピリン−1の一次構造は、これらの脊椎動物の間において高度に保存
されている。ニューロピリン−1は、セマフォリン III（Kolodkin他、Cell 90
：753−762、1997）、セマ Eおよびセマ IV（Chen他、Neuron 19：547−559
、1997）。種々の活動はニューロピリン−1のそのリガンドへの結合に関連づけ
られた。例えば、ニューロピリン−1に対するセマフォリン IIIの結合は、ニュ
ーロンの成長円錐体およびin vitroにおける神経突起の反発を包含することが
できる（Kitsukawa他、Neuron 19：995−1005）。

【０００９】 マウスにおいて、ニューロピリン−1は特定の発育段階における心臓血管系、
神経系、および手足において発現される。ニューロピリン−1を過剰発現するキ
メラマウスは、胚致死的であることが見出された（Kitsukawa他、Development
121：4309−4318、1995）。キメラ胚は、いくつかの形態学的異常、例えば、過
剰の毛細血管および血管、血管の拡張、奇形心臓、異所性芽形成および神経線維
の脱線維束収縮、および余分の指を示した。ニューロピリン−1遺伝子を欠如す
るマウスは重度の心臓血管の異常、例えば、中枢神経系および末梢神経系におけ
る脈管網状組織の形成の障害を有する（Takasima他、American Heart Associa
tion 1998 Meeting、Abstract No.3178）。

【００１０】 ニューロピリン−1はVEGFの細胞表面のレセプターとして同定され（Soker他、
前掲）、そしてVEGF₁₂₁よりもVEGF₁₆₅に対して選択的結合活性を表示する。それ
はin vitroにおいて血管内皮細胞および腫瘍細胞上で発現されることが示され
た。ニューロピリン−1が細胞中でKDRと共発現されるとき、ニューロピリン−1
はKDRに対するVEGF₁₆₅の結合およびVEGF₁₆₅仲介化学走性を増強する。

【００１１】 逆に、ニューロピリン−1に対するVEGF₁₆₅の結合の阻害は、KDRに対するその
結合および内皮細胞に対するその有糸分裂誘発活性を阻害する（Soker他、前掲
）。また、ニューロピリン−1はPIGF−2のレセプターである（Migdal他、J. Bi
ol. Chem. 273：22272−22278）。第2セマフォリンレセプター、すなわち、ニ
ューロピリン−2はニューロピリン−1との相同性を示すが、結合特異性が異なる
（Chen他、Neuron 19：547−559、1997）。

【００１２】 セマフォリンは、ほぼ500アミノ酸の限定的セマフォリンドメインを共有する
分子の大きいファミリーである。このファミリーは、分泌されたタンパク質およ
び膜結合タンパク質の両方を含有する、多数のサブファミリーに再分割すること
ができる。これらのサブファミリー、すなわち、クラスIII（SemD）およびクラ
スIV（SemD）の選択されたメンバーは、ジサルファイド架橋により結合されたホ
モダイマーを形成する。

【００１３】 SemDの場合において、33kDaのカルボキシル末端の配列を欠如する65kDaイソ型
をつくる、追加のタンパク質分解プロセシングが存在する。ニ量体化は機能的活
性のために重要であると考えられる（Klostermann他、J. Biol. Chem. 273：
7326−7331、1998）。コラスピン−1は、軸索誘導タンパク質のセマフォリンフ
ァミリーの最初に同定された脊椎動物メンバーであり、また、共有結合二量体を
形成することが示され、ニ量体化はつぶれ活性に必要である（Koppel他、J. Bi
ol. Chem. 273：15708−15713、1998）。

【００１４】 セマフォリンIIIはin vitroにおいて神経突起の調節性成長クローンのつぶれ
および化学反発性に関係づけられた。in vivoにおいて、また、それは骨格およ
び心臓の欠陥を包含する、正しい感覚求心性神経支配および発育の他の面のため
に必要であることが示された（Fehar他、Nature 383：525−528、1996）。セマ
フォリンファミリーの他のメンバーは、生物学的の他の形態に関係づけられるこ
とが示された。ヒトセマフォリンE遺伝子はリウマチ様滑液細胞において発現さ
れ、サイトカインの阻害を介して免疫抑制的役割を演ずると考えられる（Mangas
ser−Stephan他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 234：153−156、1997）
。

【００１５】 CD100、すなわち、白血球セマフォリンはB細胞の凝集および分化を促進する（
Hall他、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 93：11780−11785、1996）。また
、CD100は多数のT細胞リンパ腫において発現されることが示され、そして悪性T
細胞新生物のマーカーであることができる（Dorfman他、Am. J. Pathol. 153
：255−262、1998）。セマフォリン相同体がまたDNAウイルス（Lang、Genomics
51：340−350、1998）およびポックスウイルス（Comeau他、Immunity 8：473
−482、1998）において同定された。マウスセマフォリン遺伝子、すなわち、M−
semaHの転写はマウス腫瘍細胞系統と相関する（Christensen他、Cancer Res.
58：1238−1244、1998）。

【００１６】 細胞プロセスの制御における成長因子、他の調節分子、およびそれらのレセプ
ターの役割は、それらを治療的関与のための候補およびターゲットとするようで
ある。例えば、血小板由来成長因子は歯周病（米国特許第5,124,316号）、胃腸
管潰瘍（米国特許第5,234,908号）、および皮膚潰瘍（Robson他、Lancet 339：
23−25、1992；Steed他、J. Vasc. Surg. 21：71−81、1995）の治療のため
に開示された。PDGFレセプターの阻害は障害されたヒヒ動脈における内膜形成不
全を減少させることが示された（Giese他、Restenosis Summit VIII、Poster
Session ＃23、1996；米国特許第5,620,687号）。

【００１７】 血管内皮成長因子（VEGF）は虚血性四肢における血管の成長を促進することが
示され（Isner他、The Lancet 348：370−374、1996）、創傷治癒剤としての
使用、歯周病の治療、脈管移植外科手術における内皮化の促進、および心筋梗塞
後の側副血行の促進のために提案された（WIPO公開No. WO 95／24473；米国特
許第5,219,739号）。また、VEGFは培養において血管内皮細胞の成長を促進する
ために有用である。可溶性VEGFレセプター（可溶性flt−1）は、細胞表面のレセ
プターに対するVEGFの結合をブロックし、in vitroにおいて血管組織の成長を
阻害することが見出された（Bacteriology News 16（17）：5−6、1996）。

【００１８】 ホルモンの立証された臨床的実用性にかんがみて、治療剤、診断剤、および研
究の道具および試薬として使用するための追加の、このような分子がこの分野に
おいて必要とされている。これらおよび他の要求は本発明により処理される。

【００１９】 発明の説明 本発明は、配列番号2タンパク質のエピトープ担持部分を含んでなる少なくと
も15のアミノ酸残基の単離されたポリペプチドを提供する。ある種の態様におい
て、ポリペプチドは配列番号2の残基46〜163または配列番号2の残基235〜345に
対して少なくとも90％同一であるセグメントを含んでなる。追加の態様において
、ポリペプチドは記のペプチドから成る群から選択される：配列番号2の残基15
〜163；配列番号2の残基46〜163；配列番号2の残基15〜170；配列番号2の残基46
〜170；配列番号2の残基15〜234；配列番号2の残基46〜234；配列番号2の残基15
〜229アミド；配列番号2の残基15〜230；配列番号2の残基15〜345；配列番号2の
残基46〜345；配列番号2の残基235〜345；および配列番号2の残基226〜345。

【００２０】 本発明は、また、式R1_x−R2_y−R3_zのアミノ酸配列を含んでなる単離されたポ
リペプチドを提供する：式中、R1は配列番号2の残基46〜163に対して少なくとも
90％同一である100〜120残基長さのポリペプチドを含んでなり、そして配列番号
2の残基104〜124に対応する配列モチーフC［KR］Y［DNE］［WYF］X｛11，15｝G
［KR］［WYF］C（配列番号4）を含んでなり、R2は配列番号2の残基164〜234に対
して少なくとも90％同一であるポリペプチドであり、R3は配列番号2の残基235〜
345に対して少なくとも90％同一であるポリペプチドであり、

【００２１】 そして配列番号2の残基250、280、284、296、335、および337に対応する位置
におけるシステイン残基；配列番号2の残基282に対応する位置におけるグリシン
残基；および配列番号2の残基250〜337に対応する配列モチーフCX｛18，33｝CXG
XCX｛6，33｝CX｛20，40｝CXC（配列番号3）を含んでなり、そしてx、y、および
zの各々は独立して0または1であり、ただしxおよびzの少なくとも1つは1であり
、そしてxおよびzの各々が1である場合、yは1である。こうして、（a）x＝1、（
b）z＝1、および（c）x＝1かつz＝1である、上記式の単離されたポリペプチドが
提供される。

【００２２】 ある種の態様において、x＝1でありかつR1は配列番号2の残基18〜163に対して
少なくとも90％同一である。関係する態様において、x＝1であるかつR1は配列番
号2の残基46〜163を含んでなる。他の態様において、z＝1であるかつR3は配列番
号2の残基235〜345を含んでなる。追加の態様において、x＝1、z＝1であり、か
つポリペプチドは配列番号2の残基46〜229、配列番号2の残基164〜345、または
配列番号2の残基46〜345を含んでなる。単離されたポリペプチドは、配列番号2
の286、287、291、および294に対応する位置にシステインをさらに含んでなる。
他の態様において、単離されたポリペプチドは親和標識をさらに含んでなる。関
係する態様において、単離されたポリペプチドは免疫グロブリンの定常ドメイン
をさらに含んでなる。

【００２３】 本発明は、また、第2ポリペプチドに作用可能に連鎖されている第1ポリペプチ
ドを含んでなり、第1ポリペプチドが上に開示した式R1ｘ−R2ｙ−R3ｚのアミノ
酸配を含んでなる、単離されたタンパク質を提供する。このタンパク質は、細胞
の増殖、分化、代謝、または移動をモジュレートする。1つの態様において、第2
ポリペプチドは、VEGF、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、PIGF、PDGF−A、およびPD
GF−Bから成る群から選択される。他の態様において、タンパク質はホモダイマ
ーである。

【００２４】 また、工程（a）下記の作用可能に連鎖された因子を含んでなる発現ベクター
を含有する宿主細胞をDNAセグメントが発現される条件下に培養し：（i）配列番
号2の残基46〜345、（ii）配列番号2の残基46〜234、（iii）配列番号2の残基16
4〜345、および（iv）配列番号2の残基235〜345；および転写ターミネーター；
そして（b）DNA構築物の発現のタンパク質産物を細胞から回収する；を含む方法
により製造された単離されたタンパク質が提供される。

【００２５】 本発明の他の面において、ほぼ4kbまでの長さの単離されたポリヌクレオチド
が提供され、ここで前記ポリヌクレオチドは上に開示したポリペプチドをコード
する。本発明の1つの態様において、ポリヌクレオチドはDNAである。 本発明のそれ以上の面において、下記の作用可能に連鎖された因子を含んでな
る発現ベクターが提供される：（a）転写プロモーター；（b）上に開示したDNA
ポリヌクレオチド；および（c）転写ターミネーター。ベクターは、DNAポリヌク
レオチドに作用可能に連鎖された分泌シグナル配列をさらに含んでなる。

【００２６】 また、上に開示した発現ベクターが導入されており、DNAセグメントによりコ
ードされるポリペプチドを発現する、培養された細胞が提供される。培養された
細胞はポリペプチドを製造する方法において使用することができ、この方法は細
胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる。 本発明において提供されるタンパク質は、薬学上許容されるビヒクルと組み合
わせ医薬組成物を提供することができる。 本発明は、また、上に開示したポリペプチドのエピトープに特異的に結合する
抗体を提供する。本発明の抗体は、なかでも、モノクローナル抗体および一本鎖
抗体を包含し、そしてリポーター分子に結合することができる。

【００２７】 本発明は、また、下記の工程を含んでなる、患者において遺伝的異常を検出す
る方法を提供する：（a）患者から遺伝的試料を採取し、（b）遺伝的試料を配列
番号1または配列番号1の補体の少なくとも14の隣接ヌクレオチドを含んでなるポ
リヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対し
てハイブリダイゼーションする条件下に、インキュベートして第1反応生成物を
生成し、そして（c）第1反応生成物を対照反応生成物と比較し、ここで第1反応
生成物と第2反応生成物との間の差は患者における遺伝的異常を示す。 追加の面において、本発明は、繊維芽細胞または平滑筋細胞に有効量の上に開
示したタンパク質を適用することを含んでなる、前記細胞の成長を刺激する方法
を提供する。

【００２８】 他の面において、本発明は、細胞の成長または他の細胞のプロセスをモジュレ
ートする方法を提供する。1つの態様において、繊維芽細胞または平滑筋細胞に
有効量の上に開示したタンパク質を適用することを含んでなる、前記細胞の成長
を刺激する方法が提供される。他の態様において、細胞表面のPDGFアルファレセ
プターを含んでなる細胞を上に開示したポリペプチドまたはタンパク質に対して
暴露し、これによりポリペプチドまたはタンパク質をレセプターに結合させかつ
レセプターを活性化することを含んでなる、細胞表面のPDGFアルファレセプター
を活性化する方法が提供される。それ以上の態様において、上に開示したポリペ
プチドまたはタンパク質が細胞表面のPDGFアルファレセプターに結合するのを阻
害する化合物に、細胞表面のPDGFアルファレセプターを含んでなる細胞を暴露す
ることを含んでなる、PDGFアルファレセプター仲介細胞プロセスを阻害する方法
が提供される。

【００２９】 本発明のそれ以上の方法において、有効量のzvegf3アンタゴニストを哺乳動物
に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるzvegf3活性を阻害する方法が提
供される。ある種の態様において、アンタゴニストは、抗体、レセプター、リガ
ンド結合性レセプターフラグメント、またはレセプターＩｇG−Ｆｃ融合タンパ
ク質である。

【００３０】 本発明の他の面において、式R1_x−R2_y−R3_zのアミノ酸配列を含んでなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドの補体である、単離された、アンチセン
スポリヌクレオチドが提供される：式中、R1は配列番号2の残基46〜163に対して
少なくとも90％同一である100〜120残基長さのポリペプチドを含んでなり、そし
て配列番号2の残基104〜124に対応する配列モチーフC［KR］Y［DNE］［WYF］X｛
11，15｝G［KR］［WYF］C（配列番号4）を含んでなり、R2は配列番号2の残基164
〜234に対して少なくとも90％同一であるポリペプチドであり、R3は配列番号2の
残基235〜345に対して少なくとも90％同一であるポリペプチドであり、

【００３１】 そして配列番号2の残基250、280、284、296、335、および337に対応する位置
におけるシステイン残基；配列番号2の残基282に対応する位置におけるグリシン
残基；および配列番号2の残基250〜337に対応する配列モチーフCX｛18，33｝CXG
XCX｛6，33｝CX｛20，40｝CXC（配列番号3）を含んでなり、そしてx、y、および
zの各々は独立して0または1であり、ただしxおよびzの少なくとも1つは1であり
、そしてxおよびzの各々が1である場合、yは1である。1つの態様において、アン
チセンスポリヌクレオチドは作用可能に連鎖されたプロモーターおよびターミネ
ーター配列をさらに含んでなる。

【００３２】 アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞にアンチセンスポリヌクレオチドを投
与することを含んでなる、細胞においてzvegf3の産生を阻害する方法において使
用することができる。 本発明のこれらの面および他の面は本発明の下記の詳細な説明および添付図面
を参照すると、明らかとなるであろう。

【００３３】 用語「親和標識」は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製または検出
を提供するか、あるいは基質への第2ポリペプチドの結合部位を提供するために
、第2ポリペプチドに結合させることができるポリペプチドのセグメントを表す
ために使用される。原理的には、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能な
任意のペプチドまたはタンパク質を親和標識として使用することができる。親和
標識は下記のものを包含する：

【００３４】 ポリヒスチジントラクト、プロテインA（Nilsson et al.、EMBO J. 4：10
75、1985；Nilsson et al.、Methods Enzymol. 198：3、1991）、グルタチ
オンSトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene 67：31、1988）、マル
トース結合性タンパク質（KellermanおよびFerenci、Methods Enzymol. 90：4
59−463、1982；Guan他、Gene 67：21−30、1987）；Glu−Glu親和標識（Gruss
enmeyer et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：7952−4、1985；配
列番号5参照）、サブスタンスP、Flag^TMペプチド（Hopp et al.、Biotechnolo
gy 6：1204−1210、1988）、ストレプトアビジン結合性ペプチド、チオレドキ
シン、ユビクイチン、セルロース結合性タンパク質、T7ポリメラーゼ、または他
の抗原性エピトープまたは結合ドメイン。

【００３５】 一般に、Ford et al.、Protein Expression and Purification 2：95−
107、1991、参照。親和標識をコードするDNAおよび他の試薬は、商業的供給会社
から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージイ州ピスカ
タウェイ；New England Biolabs、マサチュセッツ州ベバーリイ；およびEastm
an Kodak、コネチカット州ニューヘブン）。

【００３６】 用語「対立遺伝子変異型」は、本明細書において、同一染色体遺伝子座を占有
する遺伝子の2またはそれ以上のオールタネイト形態の任意のものを表すために
使用される。対立遺伝子の変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に
表現型の多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント（コー
ドされたポリペプチドの非変化）であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードすることができる。対立遺伝子変異型という用語は
、また、本明細書において遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされるタンパ
ク質を表すために使用される。

【００３７】 用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。

【００３８】 「ベータ鎖様領域」は、ポリペプチドバックボーン二面角ファイ（φ）および
プサイ（ψ）のある種の組合わせにより特徴づけられるタンパク質の領域である
。φが−60°より小さくかつψが90°より大きい領域はベータ鎖様である。当業
者は認識するように、β−鎖の限界は多少不正確であり、それらを定めるために
使用する基準とともに変化することがある。例えば、下記の文献を参照のこと：
RichardsonおよびRichardson in Fasman、編、Prediction of Protein Str
ucture and the Principles of Protein Conformation、Plenum Press、
New York、1989；およびLesk、Protein Architecture；A Practical Approa ch 、Oxford University Press、New York、1991。

【００３９】 用語ポリヌクレオチド分子の「相補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配
列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5'
ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。 「に対応する」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を参照して使用するとき
、2つの配列が最適に整列しているとき、参照位置と整列する第2配列中の位置を
示す。

【００４０】 用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1またはそれ以上の縮重コドンを含むヌク
レオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して
）を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一
アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの各々はAs
pをコードする）。

【００４１】 用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または
円形のDNA分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、プロ
モーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして、また、1またはそれ以
上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリア
デニル化シグナル、およびその他を包含することができる。発現ベクターは、一
般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因子を
含有することができる。

【００４２】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくな
いコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で
使用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子は、そ
れらの自然の環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクロー
ンを包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされ
る他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、
プロモーターおよびターミネーター、およびその他を包含することができる。ア
ソシエートされた領域の同定は、当業者にとって明らかであろう（例えば、Dyna
nおよびTijan、Nature 316：774−78、1985、参照）。

【００４３】 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血
液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパ
ク質である。1つの形態において、単離されたポリペプチドまたはタンパク質は
他のポリペプチドまたはタンパク質、特に動物由来の他のポリペプチドまたはタ
ンパク質を実質的に含まない。ポリペプチドおよびタンパク質は高度に精製され
た形態、すなわち、95％より大きい純度、より好ましくは99％より大きい純度の
ポリペプチドを提供することができる。この関係において使用するとき、用語「
単離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または
誘導化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。

【００４４】 「モチーフ」は、ある種のアミノ酸残基を必要とするタンパク質配列中の、1
系列のアミノ酸位置である。あるモチーフは各このような位置における可能な残
基の組を規定する。

【００４５】 用語「作用可能に連鎖された」は、2またはそれ以上の実在物が、それらの意
図する目的と調和して機能するように、一緒に結合されていることを意味する。
セグメントについて言及するとき、この句は、例えば、コード配列が正しいリー
ディングフレームで結合されており、そして転写がプロモーターにおいて開始し
、1またはそれ以上のコーディングセグメントを通してターミネーターに進行す
ることを示す。ポリペプチドを言及するとき、「作用可能に連鎖された」は共有
結合した（例えば、ジサルファイド結合により）および非共有結合した（例えば
、水素結合、疎水性相互作用、または塩架橋相互作用により）配列を包含し、こ
こで配列の1またはそれ以上の所望の機能は保持されている。

【００４６】 用語「オーソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。
オーソログの間の配列の差は種形成の結果である。 「PDGFアルファレセプター仲介細胞プロセス」は、PDGFアルファレセプターの
活性化に応答して起こる細胞のプロセスである。このようなプロセスは、細胞分
裂、化学走性、細胞分化、および高分子の産生または放出である。

【００４７】 「ポリヌクレオチド」は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリ
ヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、in vitroで合成
されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することがで
きる。ポリヌクレオチドは、塩基対（略号「bp」）、ヌクレオチド（「nt」）、
またはキロ塩基（「kb」）として表される。

【００４８】 この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌク
レオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、そ
れは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解さ
れるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は
長さがわずかに異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違う
ことがある；こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対
合していなことがある。このような不対末端は、一般に、20ntを超えない長さで
あろう。

【００４９】 「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により
結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリペ
プチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。 用語「プロモーター」は、本明細書において、RNAポリメラーゼを結合しかつ
転写を開始するDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野において認識
されている意味について使用される。プロモーター配列は普通に、しかし常にで
はないが、遺伝子の5'非コード領域の中に見出される。

【００５０】 「タンパク質」は、1または2以上のポリペプチド鎖を含んでなる高分子である
。タンパク質は、また、非特異的成分、例えば、炭水化物基からなることができ
る。炭水化物および他の非特異的置換基を細胞によりタンパク質に付加すること
ができ、細胞においてタンパク質は産生され、そして細胞の型とともに変化する
であろう。タンパク質はアミノ酸バックボーン構造により本明細書において定義
される；置換基、例えば、炭水化物基は一般に特定されないが、それにもかかわ
らず、存在することができる。

【００５１】 用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードす
るDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きい
ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。
通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌
ペプチドを除去する。 「セグメント」は、特定した属性を有する、より大きい分子（例えば、ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド）の部分である。例えば、特定したポリペプチド
をコードするDNAセグメントは、5'→3'向に読んだとき、より長いDNA分子の部分
、例えば、プラスミドまたはプラスミドフラグメントである。

【００５２】 不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10％の正確さであると理解さ
れるであろう。 本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。 本発明は、一部分、成長因子ドメインおよびCUBドメインを含んでなるポリペ
プチドをコードする、新規なDNA分子の発見に基づく。成長因子ドメインは、PDG
Fファミリーの「システイン結節」構造の特徴を示すシステイン残基およびベー
タ鎖の配置により特徴づけられる。

【００５３】 CUBドメインは、ニューロピリン（Takagi他、Neuron 7：295−307、1991；So
ker他、前掲）、ヒト骨形態形成タンパク質−1（Wozney他、Science 242：1528
−1534、1988）、ブタ精液血漿タンパク質およびウシ酸性精液タンパク質（Rome
ro他、Nat. Struct. Biol. 4：783−788、1997）、およびアフリカツメガエ
ル（X. laevis）トロイド（tolloid）様タンパク質（Lin他、Dev. Growth Di
ffer. 39：43−51、1997）におけるCUBドメインに対して相同性の配列を示す。
この新規なDNAに対応するmRNAの組織分布の分析は、発現が成体ヒト組織におい
て広く分布していること、そして発現がマウス胚において15日までに起こること
を示した。このポリペプチドを成長因子ドメイン中のVEGFに対するその相同性に
かんがみて「zvegf3」と表示した。

【００５４】 zvegf3配列および他の成長因子に対するその相同性に基づく構造の予測は、ポ
リペプチドが、細胞の増殖、移動、分化、または代謝をモジュレートすることに
よって器官の発生を制御するように、組織に対して作用するホモマルチマーまた
はヘテロマルチマーを形成するできること示唆する。zvegf3ヘテロマルチマーは
、下記のものを包含する、タンパク質のPDGF／VEGFファミリーの他のメンバーか
らのポリペプチドを含んでなることができる：VEGF、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−
D、zvegf4（配列番号36および37）、PIGF（Maglione他、Proc. Natl'l. Acad.
Sci. USA 88：9267−9271、1991）、PDGF−A（Murray他、米国特許第4,899,
919号；Heldin他、米国特許第5,219,759号）、またはPDGF−B（Chiu他、Cell 3
7：123−129、1984；Johnsson他、EMBO J. 3：921−928、1984）。

【００５５】 ポリペプチドのこのファミリーのメンバーは、器官の発生および再生、発生後
の器官の成長、およびおよびの維持、ならびに組織の維持および修復のプロセス
を調節する。これらの因子は、また、癌、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、
虚血性四肢疾患、末梢血管性疾患、血管内過形成、アテローム性動脈硬化症、お
よび血管腫の形成を包含する、療法上の治療を必要とする病理学的プロセスに関
係する。

【００５６】 これらの病理学的状態を治療するために、タンパク質、またはそれらのそれぞ
れのレセプターのPDGF／VEGFファミリーのメンバーと対抗する化合物を開発する
ことがしばしば必要であろう。これは中和性抗体、小さい分子アンタゴニスト、
レセプターの結合活性を維持するが、レセプター活性化活性を欠如する成長因子
の修飾された形態、可溶性レセプター、またはポリペプチドの産生をブロックす
るアンチセンスまたはリボザイム分子の開発を包含することができる。

【００５７】 配列番号2は本発明の代表的ポリペプチドの配列である。配列番号2に示すアミ
ノ酸配列の分析は、残基1〜14が分泌ポリペプチドを形成することを示す。CUBド
メインは残基46から残基163に延長する。プロペプチド様配列は残基164から残基
234に延長し、そしてそのカルボキシル末端に2つの潜在的切断部位、すなわち、
残基231〜232における二塩基性部位および残基231〜234におけるフリンまたはフ
リン様プロテアーゼのターゲット部位、を含む。成長因子ドメインは残基235〜
残基345に延長する。当業者は認識するように、ドメイン境界は多少の不正確で
ありそして特定した位置から±5残基まで変化することを期待することができる
。

【００５８】 潜在的タンパク質分解的切断部位は残基232および234に存在する。BHK細胞に
おいて産生された組換えzvegf3のプロセシングは、残基225〜226において起こる
ことが見出された。シグナルペプチドの切断は、残基14（±3残基）後に起こる
ことが予測される。この分析は、表1に示すように、zvegf3ポリペプチド鎖が切
断されて複数のモノマー種が産生しうることを示唆する。

【００５９】 Arg−234後の切断は引き続く残基231〜234の除去を生じることが期待され、Gl
y−230がアミドに変換することがある。Lys−232後の切断は引き続く残基231の
除去を生じることが期待され、再びGly−230がアミドに変換することがある。さ
らに、CUBドメインのカルボキシル末端においてドメイン間領域の7残基までを含
むことが有利であろう。ドメイン間領域は、同様な量だけそのアミノ末端におい
てトランケートすることができる。表1参照。

【００６０】

【表１】

【００６１】 表1に開示するポリペプチドに対して少なくとも90％または少なくとも95％同
一であるポリペプチドは、また、本発明の範囲内に包含され、ここでこれらの追
加のポリペプチドは後に開示するようにある種の特徴ある配列モチーフを保持す
る。 zvegf3ポリペプチドは、アミノ酸残基を示す下付き数字を付して本明細書にお
いて表示される。例えば、表1に開示するCUBドメインのポリペプチドは「zvegf3 _15-163 」、「zvegf3_46-163」、「zvegf3_15-170」、および「zvegf3_46-170」と表
示される。

【００６２】 zvegf3ポリペプチドの高次構造は、既知の相同体との配列の整列および入手可
能なソフトウェアを使用するコンピューター解析（例えば、Insight II（商標
）ビューアーおよび相同性モデル化ツール；MSI、カリフォルニア州サンディエ
ゴ）により予測することができる。配列番号2の解析により、成長因子ドメイン
の二次構造はシステイン結節が優性を占め、システイン結節は可変ベータ鎖領域
と一緒に結束し、ループ化して蝶ネクタイ様構造になることが予測される。配列
の整列により、成長因子ドメイン内の位置250、280、284、296、335、および337
におけるCys残基、およびGly282はこのファミリー内で高度に保存されているこ
とが示される。

【００６３】 更なる分析において、Cys残基250と296、280と335、および284と337が対合し
て（ジサルファイド結合の形成）システイン結節を形成することが示唆される。
保存された残基のこの整列はCX｛18，33｝CXGXCX｛6，33｝CX｛20，40｝CXC（配
列番号3）により表され、ここでアミノ酸残基は慣用の一文字コードにより表さ
れ、Xは任意のアミノ酸残基であり、そして｛y，z｝はyからzまでの残基長さの
可変残基領域を示す。

【００６４】 コンセンサス蝶ネクタイ構造は次のように形成される：システイン結節に対す
るアミノ末端 → ベータ鎖様領域1 → 可変ループ1 → ベータ鎖様領域2
→ システイン結節 → ベータ鎖様領域3 → 可変ループ2 → ベータ鎖
様領域4 → システイン結節 → ベータ鎖様領域5 → 可変ループ3 →
ベータ鎖様領域6 → システイン結節。可変ループ1および2は蝶ネクタイの1つ
の側を形成し、可変ループ3は他方の側を形成する。

【００６５】 zvegf3成長因子ドメインの構造は、ループ2およびベータ鎖様領域3および4に
おける他のファミリーメンバーのコンセンサス構造から発散するように思われ、
ここですべては略号化されており、本質的に残基285（Ala）〜295（Gln）を含ん
でなるシステインクラスターで置換されており、このクラスターは配列番号2の
位置286、287、291、および294におけるCys残基を含む。配列番号2中のベータ鎖
様領域の近似境界は次の通りである：領域1、残基251〜259；領域2、残基275〜2
79；領域5、残基297〜301；領域6、残基329〜334。ループは領域1および2、およ
び領域5および6を分離する。

【００６６】 zvegf3のCUBドメインは、9つの独特なベータ鎖様領域とベータバレル構造を形
成すると考えられる。これらの領域は、配列番号2の残基48〜51、55〜59、72〜7
8、85〜90、107〜112、119〜123、139〜146、および156〜163を含んでなる。ア
フリカツメガエル（Xenopus laevis）ニューロピリン前駆体（Takagi他、前掲
）、ヒトBMP−1（Wozney他、前掲）、およびアフリカツメガエル（X. laevis）
トロイド様タンパク質（Lin他、前掲）のCUBドメインの多重整列は、配列番号2
の残基104〜124に対応する保存されたモチーフの存在を示す。このモチーフは式
C［KR］Y［DNE］［WYF］X｛11，15｝G［KR］［WYF］C（配列番号4）により表さ
れ、ここで正方形括弧は所定の位置における可能な残基を示し、そしてX｛y，z
｝は上に定義した通りである。

【００６７】 本発明のタンパク質は、zvegf3のCUBドメインに対して相同性のCUBドメインを
含んでなるタンパク質を包含する。これらの相同性ドメインは100〜120残基長さ
であり、そして配列番号2の残基104〜124に対応する配列のモチーフC［KR］Y［D
NE］［WYF］X｛11，15｝G［KR］［WYF］C（配列番号4）を含んでなる。これらの
相同性CUBドメインは配列番号2の残基46〜163に対して少なくとも90％同一であ
るか、あるいは配列番号2の残基46〜163に対して少なくとも95％同一である。 本発明のCUBドメインを含有するタンパク質は、zvegf3のドメイン間領域また
はその相同体をさらに含むことができる。ドメイン間領域は配列番号2の残基164
〜234に対して少なくとも90％同一である。

【００６８】 本発明の追加のタンパク質は、zvegf3の成長因子ドメインまたはその相同体を
含んでなる。これらのタンパク質は、こうして、配列番号2の残基235〜345に対
して少なくとも90％または95％同一であるポリペプチドセグメントを含んでなり
、ここでポリペプチドセグメントは配列番号2の残基250、280、284、296、335、
および337に対応する位置におけるシステイン残基；配列番号2の残基282に対応
する位置におけるグリシン；および配列番号2の残基250〜337に対応する配列モ
チーフCX｛18，33｝CXGXCX｛6，33｝CX｛20，40｝CXC（配列番号3）を含んでな
る。

【００６９】 CUBドメイン、ドメイン間領域、および成長因子ドメインの組合わせを含んで
なる追加のタンパク質は上記表1に示されている。各場合において、本発明は、
また、上に開示した相同性ドメインを含んでなる相同性タンパク質を包含する。

【００７０】 構造解析および相同性により、zvegf3ポリペプチドは第2ポリペプチドと複合
化してマルチマータンパク質を形成することが予測される。これらのタンパク質
はホモダイマーおよびヘテロダイマーを包含する。後者の場合において、第2ポ
リペプチドはトランケートまたは他の変異型のzvegf3ポリペプチドまたは他のポ
リペプチド、例えば、PIGF、PDGF−A、PDGF−B、VEGF、VEGF−B、VEGF−C、VEGF
−D、またはzvegf4ポリペプチドであることができる。

【００７１】 本発明の範囲内の二量体タンパク質の中には、第2サブユニット、すなわち、
第2zvegf3ポリペプチドまたは他の第2サブユニットとの非共有結合のアソシエー
ション（例えば、疎水性相互作用）により、あるいは成分モノマーのシステイン
残基間の分子間ジサルファイド結合により安定化された共有結合のアソシエーシ
ョンにより形成された二量体が存在する。配列番号2において、位置274、286、2
78、291、294、および339におけるCys残基は分子内または分子間のジサルファイ
ド結合を形成することができる。

【００７２】 残基274および287は鎖間ジサルファイド結合を形成するようである。ホモダイ
マーにおいて、成分ポリペプチド（AおよびBと表示する）は、鎖間ジサルファイ
ド結合A274−B287、A287−B274のパターンで反平行配置で結合することができる
。データによりさらに示唆されるように、追加の鎖間ジサルファイドはCys286と
Cys291、およびCys294とCys339の対合により形成されるが、これらの4つの残基
のあるものまたはすべては鎖間対合に関係することがある。

【００７３】 こうして、本発明は、上に開示したzvegf3ポリペプチドを含んでなる種々のマ
ルチマータンパク質を提供する。これらのzvegf3ポリペプチドは、zvegf3_15-234 、zvegf3_46-234、zvegf3_15-229アミド、zvegf3_15-230、zvegf3_15-345、zvegf3_{46 -345} 、およびzvegf3_235-345、ならびに本明細書において開示するこれらのポリ
ペプチドの変異型および誘導体を包含する。

【００７４】 配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照
のこと：Altschul et al.、Bull. Math. Bio. 48：603−616、1986およびH
enikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915−10919
、1992。簡単に述べると、表2（アミノ酸は標準的1文字コードにより示されてい
る）に示すように10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクス
テンションペナルティー、およびHenikoffおよびHenikoff（ibid.）の「ブロサ
ム（BLOSUM）62」スコアリング行列を使用して、2つのアミノ酸配列を整列させ
て整列スコアを最適化する。次いで同一％を次のように計算する：

【００７５】

【表２】

【００７６】 アミノ酸配列間の同一性レベルは、「FASTA」類似性検索アルゴリズム（Pears
onおよびLipman、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 2444、1988；およびPear
son、Meth. Enzymol. 183：63、1990）を使用して決定することができる。簡
単に述べると、まず、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を無視して、疑
問の列（例えば、配列番号2）および同一性の最高密度（ktup変数が1である場合
）または同一性の対（ktup＝2である場合）を有する試験配列が共有する領域を
同することによって、FASTAは配列の類似性を特性決定する。

【００７７】 次いでアミノ酸置換マトリックスを使用してすべての対合アミノ酸の類似性を
比較することによって、同一性の最高密度を有する10領域を再スコアリングし、
そして最高のスコアに寄与する残基のみを含めるように領域の末端を「トリミン
グ」する。「カットオフ」値（配列の長さおよびktup値に基づいて前もって決定
した式により計算する）より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場
合、領域を結合してギャップを有する近似整列を形成することができるかどうか
を決定するために、トリミングした初期領域を検査する。

【００７８】 最後に、アミノ酸の挿入および欠失を可能とする、Needleman−Wunsch−Selle
rsアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48：444、1970；S
ellers、SIAM J. Appl. Math. 26：787、1974）の変更を使用して、2つのア
ミノ酸配列の最高スコア領域を整列させる。FASTA分析のために好ましいパラメ
ーターは次の通りである：ktup＝1、ギャップオープニングペナルティー＝10、
ギャップエクステンションペナルティー＝1、および置換マトリックス＝BLOSUM6
2。Pearson、1990（前掲）の付録2に説明されているように、スコアリングマト
リックスのファイル（「SMATRIX」）を修飾することによって、これらのパラメ
ーターをFASTAプログラムの中に導入することができる。

【００７９】 また、上に開示した比を使用して核酸分子の配列の同一性を決定するために、
FASTAを使用することができる。ヌクレオチド配列を比較するために、ktup値は1
〜6、好ましくは3〜6、最も好ましくは3の範囲であることができ、他のパラメー
ターをデフォルトとして設定する。

【００８０】 本発明は、配列番号2のアミノ酸配列と比較したとき、1またはそれ以上の保存
的アミノ酸変化を有するポリペプチドを包含する。BLOSUM62（表2）はタンパク
質配列セグメントの約2,000の局所的多重整列に由来するアミノ酸置換マトリッ
クスであり、関係するタンパク質の500より多いグループの高度に保存された領
域を表す（HenikoffおよびHenikoff、前掲）。こうして、本発明のアミノ酸配列
の中に導入することができる保存的アミノ酸置換を定めるために、BLOSUM62置換
頻度を使用することができる。

【００８１】 本明細書において使用するとき、用語「保存的アミノ酸置換」は−1より大き
いBLOSUM62値により表される置換を意味する。例えば、アミノ酸置換が0、1、2
、または3のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、お置換は保存的である。好
ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも1（例えば、1、2または3）のBLOSUM62値
により特徴づけられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも2（例
えば、2または3）のBLOSUM62値により特徴づけられる。

【００８２】 本発明のタンパク質はアミノまたはカルボキシル末端のエクステンション、例
えば、アミノ末端のメチオニン残基、マレイミド活性化キーホールリンペットヘ
モシアニンへの引き続く結合を促進するためにアミノまたはカルボキシル末端の
システイン残基、約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド、または上に開示
した精製を促進するポリペプチドエクステンション（親和標識）をさらに含んで
なることができる。2またはそれ以上の親和標識を組合わせで使用することがで
きる。親和標識を含んでなるポリペプチドは、zvegf3ポリペプチドと親和標識と
の間にポリペプチドリンカーおよび／またはタンパク質分解的切断部位をさらに
含んでなることができる。典型的な切断部位は、トロンビン切断部位および因子
Xa切断部位を包含する。

【００８３】 本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合物および1またはそれ以上の
ポリペプチド融合物を含んでなる関係するマルチマータンパク質を提供する。例
えば、zvegf3ポリペプチドは、米国特許第5,155,027号および米国特許第5,567,5
84号に開示されているように、二量体化タンパク質に対する融合物として製造す
ることができる。これに関して典型的な二量体化タンパク質は、免疫グロブリン
の定常領域ドメインを包含する。

【００８４】 二量体化は、また、zvegf3ポリペプチドをロイシンジッパー配列に融合するこ
とによって安定化することができる（Riley他、Protein Eng. 9：223−230、1
996；Mohamed他、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 51：241−250、1994
）。免疫グロブリン−zvegf3ポリペプチド融合物およびロイシンジッパー融合物
を遺伝子操作された細胞中で発現させて、種々のマルチマーzvegf3アナローグを
産生することができる。補助的ドメインをzvegf3ポリペプチドに融合させて、そ
れらを特定の細胞、組織、または高分子（例えば、コラーゲン）にターゲッティ
ングさせることができる。

【００８５】 例えば、ターゲット細胞表面上のレセプターに特異的に結合するリガンドにzv
egf3ポリペプチドを融合させることによって、zvegf3ポリペプチドまたはタンパ
ク質を前もって決定した細胞型にターゲッティングすることができる。このよう
にして、ポリペプチドおよびタンパク質を療法または診断の目的でターゲッティ
ングすることができる。zvegf3ポリペプチドを1またはそれ以上の部分、例えば
、精製のために親和標識およびターゲッティングドメインに融合させることがで
きる。ポリペプチド融合物は、また、特にドメイン間に、1またはそれ以上の切
断部位を含むことができる。Tuan他、Connective Tissue Research 34：1−9
、1966参照。

【００８６】 本発明のポリペプチド融合物は一般に約1,500以下のアミノ酸残基、しばしば
約1,200以下の残基、しばしば約1,000以下の残基を含有し、多くの場合において
かなり小さいであろう。例えば、331残基（配列番号2の残基15〜345）のzvegf3
ポリペプチドを大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼ（1,021残基；Casadab
an他、J. Bacteriol. 143：971−980、1980参照）、10残基のスペーサー、お
よび4残基の因子Xa切断部位に融合させて、1366残基のポリペプチドを生じさせ
ることができる。第2の例において、配列番号2の残基235〜345をマルトース結合
性タンパク質（ほぼ370残基）、4残基の切断部位、および6残基のポリヒスチジ
ンタグに融合させることができる。

【００８７】 zvegf3成長因子ドメイン（例えば、zvegf3_235-345またはzvegf3_164-345）を含
んでなるポリペプチドを非zvegf3CUBドメインに融合させることができる。本発
明の関係する態様において、zvegf3成長因子ドメインおよびCUBドメインを含ん
でなるzvegf3ポリペプチドを非zvegf3CUBドメイン、例えば、ニューロピリンポ
リペプチドを含んでなるCUBドメインに融合させる。

【００８８】 本発明は、さらに、zvegf3CUBドメイン（例えば、zvegf3_45-163）を含んでな
るポリペプチド融合物を提供する。細胞表面のセマフォリンを有する細胞、例え
ば、内皮、ニューロン細胞、リンパ球、および腫瘍細胞に、zvegf3またはそれを
含有する他のタンパク質をターゲッティングするために、ニューロピリン−1に
対する相同性を有するCUBドメインを使用することができる。

【００８９】 zvegf3CUBドメインを他の部分、例えば、ポリペプチド（例えば、他の成長因
子、抗体、および酵素）および非ペプチド部分（例えば、放射性核種、造影剤、
およびその他）に結合させて、細胞表面のセマフォリンを発現する細胞にそれら
をターゲッティングすることができる。zvegf3のCUBドメインと成長因子ドメイ
ンとの間の二塩基性部位およびフリン様部位は、組織内に存在する局所的プロテ
アーゼを通して、または外因的源から添加されたプロテアーゼにより、成長因子
ドメインまたは他の部分のタンパク質分解的放出を可能とすることができる。タ
ーゲッテッド部分の放出はより局在化された生物学的作用を提供することができ
る。

【００９０】 野生型zvegf3CUBドメインおよびその変異型を含んでなるタンパク質を使用し
て、細胞表面のセマフォリンにより仲介される活性をモジュレートすることがで
きる。理論により拘束されたくないが、zvegf3はそのCUBドメインを介してセマ
フォリンに結合することができる。セマフォリンIIIが血管発生に関係するとい
う観測は、タンパク質の血管成長因子ファミリーのメンバーが、また、特にニュ
ーロピリン−1に対するVEGFおよびセマフォリンIIIの共結合活性のために、関係
しうることを示唆する。

【００９１】 こうして、ニューロピリン−セマフォリンの相互作用のアゴニストおよびアン
タゴニストを設計するために、zvegf3を使用することができる。例えば、本明細
書に開示するzvegf3は、ソマフォリン刺激活性、例えば、神経突起の成長、心臓
血管系の発生、軟骨および四肢の発生、およびTおよびB細胞の機能に対抗する分
子を設計する出発点である。追加の応用は、種々の病理学、例えば、慢性関節リ
ウマチ、種々の型の癌、自己免疫疾患、炎症、網膜炎、血管腫、心臓、腎臓およ
び末梢動脈を包含する組織内の虚血性事象、急性神経損傷、および中枢神経系お
よび末梢神経系の疾患における関与を包含する。

【００９２】 生物学的活性に対して必須の高次構造の崩壊を最小するために、zvegf3におい
てアミノ酸配列を変化させることができる。一般に、保存的アミノ酸変化は好ま
しい。タンパク質ファミリーの特徴を示す成長因子ドメインにおけるシステイン
結節および「蝶ネクタイ」配置を崩壊させないように、アミノ酸残基を変化させ
る。保存されたモチーフもまた維持されるであろう。アミノ酸配列変化の効果は
、上に開示したようにコンピューターのモデル化により予測するか、あるいは結
晶構造の解析により決定することができる（例えば、Lapthorn他、前掲、参照）
。

【００９３】 配列番号2の疎水性プロファイルは第1図に示されている。当業者は認識するよ
うに、全体のプロファイルを崩壊しないように、zvegf3ポリペプチドのアミノ酸
配列の変更を設計するとき、この疎水性が考慮されるであろう。アミノ酸置換の
選択における追加の基準は、第6図に示すマウスおよびヒトzvegf3配列の整列に
より提供される。

【００９４】 また、本発明のポリペプチドは天然に存在しないアミノ酸残基を含んでなるこ
とができる。天然に存在しないアミノ酸は下記のものを包含するが、これらに限
定されない：トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−
ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、
アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキ
シエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、
trt−ロイシン、ノバリン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニ
ン、4−アザフェニルアラニン、および4−フルオロフェニルアラニン。

【００９５】 天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に導入する、いくつかの方法
がこの分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプ
レッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in vitro系を用いる
ことができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法はこの分野に
おいて知られている。大腸菌（E. coli）S30抽出物および商業的に入手可能な
酵素および他の試薬を含んでなる無細胞系において、ナンセンス突然変異を含有
するプラスミドの転写および翻訳を実施する。

【００９６】 タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、下記の文献を参照
のこと：Robertson他、J. Am. Chem. Soc. 113：2722，1991；Ellman他、Me
th. Enzymol. 202：301、1991；Chung他、Science 259：806−809、1993；お
よびChung他、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 90：10145−10149、1993）
。

【００９７】 第2の方法において、突然変異体したmRNAおよび化学的にアミノアシル化され
たサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより、クセノプス・オオサイ
ト（Xenopus oocytes）中で翻訳を実施する（Turcatti他、J. Biol. Chem.
271：19991−19998、1996）。第3の方法において、置換すべき自然アミノ酸（例
えば、フェニルアラニン）の非存在および所望の天然に存在しない1またはそれ
以上のアミノ酸（例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン
、4−アザフェニルアラニン、および4−フルオロフェニルアラニン）の存在下に
、大腸菌（E. coli）細胞を培養する。

【００９８】 自然対応物の代わりに天然に存在しないアミノ酸をタンパク質の中に組込む。
Koide他、Biochem. 33：7470−7476、1994参照。天然に存在するアミノ酸残基を
in vitro化学的修飾により天然に存在しない種に変換することができる。化学
的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、置換の範囲をさらに拡張するこ
とができる（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2：395−403、1993）。

【００９９】 この分野において知られている手法、例えば、部位特異的突然変異誘発または
アラニン走査突然変異誘発に従い、本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸を同
定することができる（CunninghamおよびWells、Science 244：1081−1085、198
9；Bass他、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 88：4498−4502、1991）。後
者の技術において、単一アラニンの突然変異を分子中のすべての残基において導
入し、生ずる突然変異分子を他の性質の生物学的活性について試験して、分子の
活性に重大であるアミノ酸残基を同定する。

【０１００】 既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法を使用して、多重アミノ酸配列を行い、試験することができる：
Reidhaar−OlsonおよびSauer、Science 241：53−57、1988またはBowieおよびS
auer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86：2152−2156、1989。簡単に述べ
ると、これらの著者らはポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にラン
ダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異化ポリペプチド
を配列決定して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を
開示している。使用できる他の方法は下記のものを包含する：ファージディスプ
レイ（例えば、Lowman他、Biochem. 30：10832−10837、1991；Ladner他、米国
特許第5,223,409号；Huse，WIPO公開WO 92／06204）および領域特異的突然変異
誘発（Derbyshire他、Gene 46：145、1986；Ner他、DNA 7：127、1988）。

【０１０１】 開示したzvegf3DNAおよびポリペプチド配列の変異型は、下記の文献に開示さ
れているように、DNAシャフリングにより発生させることができる：Stemmer、Na
ture 370：389−391、1994およびStemmer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA
91：10747−10751、1994。簡単に述べると、親遺伝子をランダムフラグメント
化し、次いでPCRを使用してリアセンブリーして、ランダムに導入された点突然
変異を生じすることによって、in vitro相同的組換えにより変異型遺伝子を発
生させる。

【０１０２】 親遺伝子のファミリー、例えば、対立遺伝子変異型または異なる種からの遺伝
子を使用して、追加の可変性をプロセスの中に導入することによって、この技術
を修飾することができる。所望の活性について選択またはスクリーニングし、次
いで突然変異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択する
と同時に有害な変化に対して選択することによって、配列を急速に「進化」させ
る。

【０１０３】 上に開示した突然変異誘発法を高い体積または高い処理量のスクリーニング法
と組合わせて、zvegf3変異型ポリペプチドの生物学的活性、特に細胞増殖または
細胞分化のモジュレートにおける生物学的活性を検出することができる。例えば
、色素の組込みまたは³H−チミジンの組込みを測定する有糸分裂誘発アッセイを
多数の試料について実施することができ、ならびにリポーター遺伝子（例えば、
ルシフェラーゼ遺伝子）の発現を検出する細胞をベースとするアッセイを実施す
ることができる。選択されたファミリーメンバーに対する結合を増強または阻害
することを包含する、セマフォリンファミリーのメンバーに対するその結合をモ
ジュレートするために、CUBドメインの突然変異誘発を使用することができる。

【０１０４】 zvegf3CUBドメインを含んでなるタンパク質を療法上および／または診断上の
実用性を最適化するために、結合活性の修飾されたスペクトルは望ましいことが
ある。セマフォリンファミリーの選択されたメンバーに対するCUBドメイン結合
活性の変化をモニターするために、標識化CUBタンパク質を利用する直接的結合
を使用することができる。これに関して重要性を有するセマフォリンは、単離さ
れたタンパク質、細胞膜の中に存在するタンパク質、および細胞表面上に存在す
るタンパク質を包含する。

【０１０５】 CUBドメインドメインは、アイソトープ、例えば、¹²⁵I、酵素、例えば、アル
カリ性ホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼに対する複合化、
ビオチンとの複合化、およびFITCを包含する種々の蛍光マーカーとの複合化を包
含する、種々の方法により標識化することができる。これらおよび他のアッセイ
を下記においていっそう詳しく説明する。活性zvegf3ポリペプチドをコードする
突然変異誘発化DNA分子を宿主細胞から回収し、現代的装置により急速に配列決
定することができる。これらの方法は、問題のポリペプチド中の個々のアミノ酸
残基の重要性の急速な決定を可能とし、そして未知の構造のポリペプチドに適用
することができる。

【０１０６】 前述の方法を使用して、上記表1に開示された、野生型タンパク質の生物学的
性質を保持するzvegf3ポリペプチドに対して相同性である、種々のポリペプチド
を同定しおよび／または製造することができる。また、このようなポリペプチド
は一般的に前述したように追加のポリペプチドセグメントを含むことができる。

【０１０７】 本発明は、また、上に開示したzvegf3ポリペプチドをコードする、DNAおよびR
NA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチ
ドは、センス鎖；アンチセンス鎖；および水素結合により一緒にセンス鎖および
アンチセンス鎖の両方を有する、二本鎖としてDNAを包含する。zvegf3ポリペプ
チドをコードする代表的DNA配列を配列番号1に記載する。遺伝暗号に基づいて、
zvegf3ポリペプチドをコードするアミノ末端方向DNA配列は容易に発生させるこ
とができる。UをTと置換することによって、対応物のRNA配列を発生させること
ができる。

【０１０８】 当業者は容易に認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーにかんがみて、zv
egf3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子の間でかなりの配列の変動
が可能である。配列番号6は、配列番号2のzvegf3ポリペプチドをコードするすべ
てのDNAを包含する縮重DNA配列である。当業者は認識するように、配列番号6の
縮重配列は、また、UをTと置換することによって配列番号2をコードするすべて
のRNA配列を提供する。

【０１０９】 こうして、配列番号6のヌクレオチド1〜1035、1〜489、43〜489、136〜489、4
3〜702、136〜702、43〜690、43〜1035、136〜1035、および703〜1035を含んで
なるzvegf3ポリペプチドエンコーディングポリヌクレオチドおよびそれらのRNA
同等物は本発明に包含される。縮重ヌクレオチド位置を表すために配列番号6内
で使用した1文字コードを表3に記載する。「分解能」はコード文字により表され
るヌクレオチドである。「補体」は1またはそれ以上の相補的ヌクレオチドのコ
ードである。例えば、コードYはCまたはTを表し、そしてその補体RはAまたはGを
表し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。

【０１１０】

【表３】

【０１１１】 所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号6におい
て使用する縮重コドンを、下記表4に記載する。

【表４】

【０１１２】 当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する、縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セ
リン（WSN）の縮重コドンは、ある環境において、アルギニン（AGR）をコードす
ることができ、そしてアルギニン（MGN）の縮重コドンは、ある環境において、
セリン（AGY）をコードすることができる。

【０１１３】 同様な関係はフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在
する。したがって、縮重配列に包含される、いくつかのポリヌクレオチドは変異
型アミノ酸配列をコードすることができるが、当業者は、配列番号2のアミノ酸
配列を参照することによって、このような変異型配列を容易に同定することがで
きる。変異型配列は、本明細書において記載するように、機能性について容易に
試験することができる。

【０１１４】 本発明のある種の態様の範囲内において、単離されたポリヌクレオチドは、ス
トリンジェント条件下に、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号1、または
それに対して相補的である配列の同一サイズの領域に対してハイブリダイゼーシ
ョンするであろう。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度お
よびpHにおいて、特定の配列の熱的融点（Tm）よりも約5℃低いように選択され
る。Tmは標的配列の50％が完全に合致するプローブに対してハイブリダイゼーシ
ョンする温度（規定されたイオン強度およびpHにおいて）である。典型的なスト
リンジェント条件は、塩濃度がpH7において約0.03Mまででありかつ温度が少なく
とも約60℃である条件である。

【０１１５】 前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを包含
する。DNAおよびRNAを製造する方法はこの分野においてよく知られている。大量
のzvegf3RNAを産生する組織または細胞から単離されたRNAから、相補的DNA（cDN
A）を製造する。このような組織および細胞はノザンブロッティング（Thomas、P
roc. Natl'l. Acad. Sci. USA 77：5201、1980）により同定され、そして
甲状腺、脊髄、および副腎を包含する。

【０１１６】 グアニジンHCl抽出し、次いでCsCl勾配における遠心により単離しすることに
よって、全RNAを製造することができる（Chirgwin他、Biochemistry 18：52−9
4、1979）。AvivおよびLeder（Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 69：1408−
1412、1972）の方法を使用して、ポリ（A）⁺RNAを全RNAから製造する。既知の方
法を使用して、ポリ（A）⁺RNAから相補的DNA（cDNA）を製造する。別の方法にお
いて、ゲノムDNAを単離することができる。いくつかの応用（例えば、トランス
ジェニック動物における発現）のために、ゲノムクローンを使用するか、あるい
は少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようにcDNAクローンを修飾すること
が好ましいことがある。

【０１１７】 cDNAおよびゲノムクローンを同定し、単離する方法はこの分野においてよく知
られており、当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプロービン
グまたはプライミングするために、本明細書に開示する配列、またはその一部分
の使用を包含する。zvegf3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例え
ば、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」、Mullis、
米国特許第4,683,202号）により同定し、単離することができる。発現ライブラ
リーをzvegf3、レセプターフラグメント、または他の特異的結合性相手に対する
抗体でプロービングすることができる。

【０１１８】 当業者は認識するように、配列番号1および2に開示する配列はヒトzvegf3の単
一対立遺伝子を表す。これらの配列の対立遺伝子変異型は、標準的手順に従い異
なる個体からのcDNAまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによって
、クローニングすることができる。zvegf3の選択的にスプライスされた形態がま
た存在することが期待される。

【０１１９】 本明細書に開示するzvegf3ポリヌクレオチドを使用して、他のzvegf3タンパク
質をコードするポリヌクレオチドを単離することができる。このような他のポリ
ヌクレオチドは、他の種（オーソログ）からの対立遺伝子変異型、選択的にスプ
ライスされたcDNAおよび対応物のポリヌクレオチドを包含する。これらのオーソ
ログポリヌクレオチドは、なかでも、それぞれのオーソログタンパク質を製造す
るために使用することができる。問題の他の種は下記のものを包含するが、これ
らに限定されない：哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊
椎動物および無脊椎動物の種。

【０１２０】 非ヒト霊長類、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、およびウマのポリ
ヌクレオチドおよびタンパク質を包含する、他の哺乳動物種からのzvegf3ポリヌ
クレオチドおよびタンパク質は特に重要である。非ヒトztbg1ポリペプチドおよ
びポリヌクレオチド、ならびにそれらのアンタゴニストおよび他の関係する分子
を、なかでも、獣医学において使用することができる。ヒトzvegf3のオーソログ
は、慣用クローニング技術と組み合わせて本発明により提供される情報および組
成物を使用して、クローニングすることができる。例えば、本明細書において開
示するzvegf3を発現する組織および細胞型から得られたmRNAを使用して、cDNAを
クローニングすることができる。

【０１２１】 mRNAの適当な源は、本明細書に開示する配列から設計したプローブでノザンブ
ロットをプロービングすることによって、同定することができる。次いで陽性の
組織または細胞系統のmRNAから、ライブラリーを製造する。次いで、種々の方法
、例えば、完全なまたは部分的ヒトcDNAで、または開示された配列をベースとす
る縮重プローブの1またはそれ以上の組でプロービングすることによって、zvegf
3をコードするcDNAを単離することができる。ハイブリダイゼーションは一般に
低いストリンジェンシイの条件下に実施されるであろう。

【０１２２】 ここで洗浄は1×SSC中で40℃における初期洗浄および5℃のより高い間隔でバ
ックグラウンドが適当に減少されるまで引き続く洗浄で実施される。また、本明
細書に開示する代表的ヒトzvegf3配列から設計されたプライマーを使用して、ポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）（Mullis、米国特許第4,683,202号）により、cDNAを
クローニングすることができる。追加の方法において、cDNAライブラリーを使用
して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、そして問題のcDNAの発現を
zvegf3ポリペプチドに対する抗体で検出することができる。また、同様な技術を
ゲノムクローンの単離に適用することができる。

【０１２３】 変異型および融合タンパク質を包含する、任意のzvegf3ポリペプチドについて
、上記表3および4に記載する情報を使用して、その変異型をコードする、完全に
縮重のポリヌクレオチド配列を容易に発生させることができる。 他のファミリーメンバーの配列との整列により同定された、zvegf3の保存され
た領域を使用して、関係するポリヌクレオチドおよびタンパク質を同定すること
ができる。例えば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）およびこの分野
において知られている他の技術を使用して、種々の組織源から得られたRNAからz
vegf3の中に存在する保存されたモチーフをコードする配列を増幅することがで
きる。

【０１２４】 特に、下記表5に示すような、高度に縮重のプライマー（PDGF AおよびB鎖、V
EGF、VEGF−B、VEGF−C、およびVEGF−Dとのzvegf3の整列から設計された）は、
相同的成長因子ドメインをコードするポリヌクレオチドをクローニングするため
に有用である。アフリカツメガエル（X. laevis）ニューロピリン前駆体、ヒト
BMP−1、およびアフリカツメガエル（X. laevis）トロイド様タンパク質とのzv
egf3の整列から設計された、表6に示すプライマーは、CUBドメインをコードする
ポリヌクレオチドをクローニングするために有用である。こうして、配列番号1
および2のzvegf3配列の相同体をコードする、追加のポリヌクレオチドを得るた
めに、表6および7のプライマーを使用することができる。

【０１２５】

【表５】

【０１２６】

【表６】

【０１２７】 本明細書に開示するzvegf3ポリヌクレオチド配列は、また、プロモーター配列
を包含する、zvegf3遺伝子の5'非コーディング領域をクローニングするためのプ
ローブまたはプライマーとして使用することができる。これらのフランキング配
列を使用して、zvegf3および他の組換えタンパク質の発現を指令することができ
る。さらに、Treco他、米国特許第5,641,670号に開示されているように、内因的
zvegf3遺伝子の発現を活性化または増加するための調節構築物のターゲッティン
グ部位として、5'フランキング配列を使用することができる。

【０１２８】 また、本発明のポリヌクレオチドは自動化合成法により製造することができる
。選択する現在の方法はホスホルアミダイト法である。化学的に合成する場合、
二本鎖DNAを必要とし、各相補的鎖は別々につくられる。短い、二本鎖セグメン
ト（60〜80bp）の製造は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、次いで
それらをアニーリングすることによって達成することができる。より長いセグメ
ント（典型的には＞300bp）は、20〜100ヌクレオチド長さである、一本鎖フラグ
メントからモジュール形態で組立てられる。

【０１２９】 ポリヌクレオチドの自動化合成法は当業者のレベルの範囲内であり、そして適
当な装置および試薬は商業的供給会社から入手可能である。一般に、下記の文献
を参照のこと：GlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology，Principles & Applications of Recombinant DNA 、ASM Press、ワシントンD．C．、1
994；Itakura他、Ann. Rev. Biochem. 53：323−56、1984；およびClimie他
、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 87：633−7、1990。

【０１３０】 全長のポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、および融合ポリペプチ
ドを包含する、本発明のポリペプチドは、慣用技術に従い遺伝子操作された宿主
細胞において製造することができる。適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換
またはトランスフェクトし、培養成長させることができる細胞型であり、そして
細菌、真菌細胞、および培養した高等真核細胞（多細胞生物の培養した細胞を包
含する）を包含する。

【０１３１】 クローニングされたDNA分子を操作し、外因的DNAを種々の宿主細胞の中に導入
する技術は、下記の文献に開示されている：Sambrook他、Molecular Cloning：
A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、C
old Spring Harbor、NY、1989、およびAusubel他、Current Protocols in
Molecular Biology、Green and Wiley and Sons、NY、1993。

【０１３２】 一般に、zvegf3ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内の転写
プロモーターおよびターミネーターを包含する、その発現に必要な他の遺伝的因
子作用可能に連鎖される。ベクターは、また、普通に1またはそれ以上の選択可
能なマーカーおよび1またはそれ以上の複製起点を含有するが、当業者は認識す
るように、ある種の系において、選択可能なマーカーを別のベクター上に存在さ
せることができ、そして宿主細胞ゲノムの中への組込みにより外因的DNAを複製
させることができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベ
クターおよび他の因子は当業者のレベルの範囲内の日常的設計事項である。多数
のこのような因子は文献に記載されており、商業的供給会社を通して入手可能で
ある。

【０１３３】 宿主細胞の分泌経路の中にzvegf3ポリペプチドを向けるために、分泌シグナル
配列（また、リーダー配列、プレプ配列または前配列として知られている）を発
現ベクターの中に存在させる。分泌シグナル配列はzvegf3のそれであることがで
きるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例えば、t−PA；米国特許第5,641
,655号参照）から誘導するか、あるいは新たに合成することができる。

【０１３４】 分泌シグナル配列はzvegf3DNA配列作用可能に連鎖させる、すなわち、2つの配
列を正しいリーディングフレームで結合し、新しく合成されたポリペプチドを宿
主細胞の分泌経路の中に向けるように位置決定する。分泌シグナル配列は問題の
ポリヌクレオチドをコードするDNA配列に対して5'に普通に位置決定されるが、
分泌シグナル配列は問題のDNA配列中のどこかに位置決定することができる（例
えば、下記の文献を参照のこと：Welch他、米国特許第5,037,743号；Holland他
、米国特許第5,143,830号）。

【０１３５】 宿主細胞の分泌経路を介するzvegf3ポリペプチドの発現はマルチマーのタンパ
ク質を産生させることが期待される。前述したように、このようなマルチマーは
ホモマルチマーおよびホモマルチマーの両方を包含し、後者はzvegf3ポリペプチ
ドのみを含んでなるタンパク質、およびzvegf3および異種ポリペプチドを包含す
るタンパク質を包含する。例えば、zvegf3ポリペプチド、および関係するファミ
リーメンバーからのポリペプチドを含んでなるヘテロマルチマー（例えば、VEGF
、VEGF−B、VEGF−C、VEGF−D、zvegf4、PIGF、PDGF−A、またはPDGF−B）を、
宿主細胞における2つのポリペプチドの共発現により製造することができる。

【０１３６】 これらの他のファミリーメンバーをコードする配列は既知である。例えば、下
記の文献を参照のこと：Dvorak他、前掲；Olofsson他、前掲；Hayward他、前掲
；Joukov他、前掲；Oliviero他、前掲；Achen他、前掲；Maglione他、前掲；Hel
din他、米国特許第5,219,759号；およびJohnsson他、前掲。タンパク質混合物が
発現から生ずる場合、個々の種を慣用法により単離する。モノマー、二量体、お
よび高次マルチマーを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離する
。

【０１３７】 個々の二量体に対して特異的抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、または個々の成分ポリペプチドに対して特異的抗体を使用する
順次イムノアフィニティー工程により、ヘテロマルチマーをホモマルチマーから
分離することができる。一般に、米国特許第5,094,941号参照。また、適当な条
件下に成分ポリペプチドにインキュベートすることによって、in vitroにおい
てマルチマーを組立てることができる。一般に、in vitro組立ては、変性およ
び還元性条件下にタンパク質混合物をインキュベートし、次いでポリペプチドを
再フォルディングおよび再酸化してホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成す
ることを包含するであろう。細菌細胞中で発現されたタンパク質の回収および組
立てを後述する。

【０１３８】 培養された哺乳動物細胞は、本発明において適当な宿主である。外因的DNAを
哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カルシ
ウム仲介トランスフェクション（Wigler 他、Cell 14：725、1978；Corsaroお
よびPearson、Somatic Cell Genetics 7：603、1981；GrahamおよびVan der
Eb、Virology 52：456、1973）、エレクトロポレーション（Neumann 他、EM
BO J. 1：841−845、1982）、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクション
（Ausubel 他、ibid.）、およびリポソーム仲介トランスフェクション（Felgne
r他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：7413−7、1987；Mackey他、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85：8027−31；Hawley−Nelson 他、Focus 15：7
3、1993；Ciccarone 他、Focus 15：80、1993）。

【０１３９】 培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記
の特許文献に記載されている：Levinson 他、米国特許第4,713,339号；Hagen
他、米国特許第4,784,950号；Palmiter 他、米国特許第4,579,821号；およびRi
ngold、米国特許第4,656,134号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを
包含する：COS−1（ATCC No. CRL 1650）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）
、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATC
C No. CRL 1573；Graham 他、J. Gen. Virol. 36：59−72、1977）およ
びチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO−K1；ATCC No. CRL 61）細胞
系統。

【０１４０】 追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そして公衆の寄託機
関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリイランド州
ロックビレ）から入手可能である。一般に、強い転写プロモーターは、SV−40ま
たはサイトメガロウイルスからのプロモーターを包含する。例えば、米国特許第
4,956,288号参照。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からプ
ロモーター（米国特許第4,579,821号および米国特許第4,601,978号）およびアデ
ノウイルスの主要な後期プロモーターを包含する。哺乳動物細胞において使用す
るための発現ベクターは、pZP−1およびpZP−9を包含し、これらはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（マリイランド州ロックビレ）に、それぞれ
、受け入れ番号98669および98668で受託された。

【０１４１】 薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、培養された哺乳動物細胞
について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれ
る。選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させ
ることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。典型的な
選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝
子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G−418またはその他の存在にお
いて実施される。

【０１４２】 また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベルを増加することができる
、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在においてトランスフェクタ
ントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入された遺伝子の産物を高い
レベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は実施される。典型
的な増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与す
る、ジヒドロフォレートリダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒ
グロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を
使用することもできる。

【０１４３】 変更された表現型を導入するオールタネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光
タンパク質、または細胞表面のタンパク質、例えば、CD4、CD8、クラスIのMHC、
胎盤アルカリ性ホスファターゼを使用して、FACSソーティングまたは磁気ビーズ
分離技術により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクトされた細胞を選
別することができる。

【０１４４】 昆虫細胞、植物細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクタ
ーとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使
用することは、Sinkar 他、J. Biosci.（Bangalore）11：47−58、1987、にお
いて概観されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産
生は、Guarino 他、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO94／06463号に記
載されている。

【０１４５】 オートグラファト・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病
ウイルス（AcNPV）から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで、昆虫細
胞を感染させることができる。下記の文献を参照のこと：KingおよびPossee、Th e Baculovirus Expression System：A Laboratory Guide 、London、Chapma
n & Hall、O'Reilly他、Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual 、New York、Oxford University Press、1994；およびRichardson、
編、Baculovirus Expression Protocols、 Methods in Molecular Biolog y 、Totowa、NJ、Humana Press、1995。

【０１４６】 組換えバキュロウイルスは、また、Luckow他が記載するトランスポゾンをベー
スとする系の使用により産生することができる（J. Virol. 67：4566−79、19
93）。この系はキットの形態（Bac−to−Bac^TM；Life Technologies、マリイラ
ンド州ロックビレ）で販売されている。転移ベクター（例えば、pFastBac1^TM；L
ife Technologies）は、「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大きいプラスミド
として大腸菌（E. coli）の中に維持されたバキュロウイルスのゲノムの中にzv
egf3ポリペプチドをコードするDNAを動かすために、Tn7トランスポゾンを含有す
る。

【０１４７】 下記の文献を参照のこと：Hill−PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 7
1：971−976、1990；Bonning他、J. Gen. Virol. 75：1551−1556、1994；お
よび、ChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543−1549、1995
。さらに、転移ベクターは、上に開示したポリペプチドのエクステンションまた
は親和標識をコードするDNAとのインフレーム融合物を含むことができる。

【０１４８】 この分野において知られている技術を使用して、zvegf3エンコーディング配列
を含有する転移ベクターを大腸菌（E.coli）宿主細胞の中に形質転換し、そして
組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドについ
て細胞をスクリーニングする。組換えバキュロウイルスのゲノムを含有するバク
ミドDNAを普通の技術に従い単離し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Spodo
ptera frugiperda）細胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトする。zvegf3タ
ンパク質を発現する組換えベクターを引き続いて生成させる。この分野において
普通に使用されている方法により、組換えウイルスの系統を作る。

【０１４９】 タンパク質を製造するために、組換えウイルスを使用して宿主細胞、典型的に
はヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（例えば
、Sf9またはSf21細胞）またはトリコデルマ・ニ（Trichoderma ni）（例えば、
High Five（商標）細胞；Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）に由
来する細胞系統を感染させる。一般に、下記の文献を参照のこと：GlickおよびP
asternak、Molecular Biotechnology，Principles & Applications of Rec ombinant DNA 、ASM Press、ワシントンD．C．、1994。また、米国特許第5,300
,435号参照。

【０１５０】 無血清培地を使用して細胞を成長させ、維持する。適当な培地処方物はこの分
野において知られており、そして商業的供給会社から得ることができる。細胞を
ほぼ2〜5×10⁵細胞の接種密度から1〜2×10⁶細胞の密度に成長させ、この時間に
おいて組換えウイルスストックを0.1〜10、より典型的には3付近の感染多重度に
添加する。使用する手順は一般に入手可能な実験室のマニュアルに記載されてい
る（例えば、KingおよびPossee、前掲；O'Reilly他、前掲；Richardson、前掲）
。

【０１５１】 酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに
関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces c
erevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタ
ノリカ（Pichia metanolica）を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレ
ビシエ（S. cerevisiae）を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産す
る方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている：Kawasaki、米国特許第4,
599,311号；Kawasaki他、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008
号；Welch他、米国特許第5,037,743号；およびMurry他、米国特許第4,845,075号
。

【０１５２】 選択マーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄養（例
えば、ロイシン）の非存在において増殖する能力により、形質転換された細胞を
選択する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におい
て使用するために好ましいベクター系は、Kawasaki他（米国特許第4,931,373号
）により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコースを含有す
る培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵母において使用
するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例え
ば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Ingsman他、米国特許第4,615,974号；
およびBitter、米国特許第4,977,092号、参照）およびアルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子からのものを包含する。

【０１５３】 また、米国特許第4,990,446号；米国特許第5,063,154号；米国特許第5,139,93
6号および米国特許第4,661,454号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenul
a polymorpha）、シゾサッカラロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマ
イセス・フラギリス（Kluyveromyces frgilis）、ウスチラゴ・マイディス（Us
tilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノ
リカ（Pichia metanolica）、ピキア・グイレルモンディイ（Pichia guillerm
ondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を包含する、他の酵母
のための形質転換系はこの分野において知られている。

【０１５４】 例えば、Gleeson他、J. Gen. Microbiol. 132：3459−3465、1986；Cregg
、米国特許第4,882,279号；およびRaymond他、Yeast 14：11−23、1998、参照
。McKnight他、米国特許第4,935,349号の方法に従い、アスペルギルス（Aspergi
llus）細胞を利用することができる。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremoni
um chrysogenum）は、Sumino他、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニ
ューロスポラ（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,4
86,533号に開示されている。ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）中の組
換えタンパク質の産生は、米国特許第5,716,808号；米国特許第5,736,383号、米
国特許第5,854,039号、および米国特許第5,888,768号に開示されている。

【０１５５】 細菌大腸菌（Escherichia coli）、バシラス（Bacillus）および他の属の株
を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用である。これらの宿主
を発現し、その中にクローニングされた外来DNA配列を発現する技術はこの分野
においてよく知られている（例えば、Sambrook他、ibid.参照）。大腸菌（E. c
oli）のような細菌においてzvegf3ポリペプチドを発現させるとき、ポリペプチ
ドを、典型的には不溶性粒子として、細胞質の中に保持させることができるか、
あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間の中に向けることができる
。前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソ
チオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。

【０１５６】 次いで変性されたポリペプチドをリフォルディングさせ、変性物の希釈により
、例えば、尿素の溶液および還元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチ
オンとの組合わせに対する透析、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析
により、二量体化させることができる。別法において、タンパク質を細胞質から
可溶性形態で回収し、変性しないで単離することができる。タンパク質を細胞か
ら、例えば、リン酸塩緩衝液中の、水性抽出物として回収する。

【０１５７】 問題のタンパク質を捕捉するために、抽出物をクロマトグラフィーの媒質、例
えば、固定化された抗体またはヘパリン−セファローズカラムに直接適用する。
分泌されたポリペプチドをペリプラスミック空間から可溶性および機能的形態で
、細胞を崩壊させることによって（例えば、超音波処理または浸透圧ショックに
より）ペリプラスミック空間の内容物を解放し、タンパク質を回収し、これによ
り変性およびリフォルディングの必要性を排除することができる。

【０１５８】 原核宿主細胞中のzvegf3融合タンパク質の産生は特に重要である。典型的な融
合タンパク質は、マルトース結合性タンパク質に融合したzvegf3ポリペプチドを
含んでなる。このような融合物はポリペプチドの融合を精製するために追加の配
列、例えば、ポリヒスチジンをさらに含むことができる。融合のzvegf3成分およ
び非zvegf3成分の分離を可能とするために、酵素切断部位（例えば、トロンビン
切断部位）をまた含めることができる。

【０１５９】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。
規定された培地および複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野にお
いて知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよ
び無機質を含む。培地は、また、必要に応じて、成長因子または血清のような成
分を含有することができる。一般に、外因的に添加されたDNAを含有する細胞に
ついて成長培地を選択する。

【０１６０】 この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須
栄養素は発現ベクター上に担持されるか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフ
ェクトされた選択可能なマーカーにより補足される。炭素、窒素および微量栄養
素の適切な源を含む培地中で約25℃〜35℃の温度において、ピキア・メタノリカ
（P. metanolica）細胞を培養する。慣用の手段、例えば、小さいフラスコの震
盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分にエアレーションする。

【０１６１】 zvegf3ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、また、この分野において
知られている方法、例えば、専用固相合成、部分的固相法、フラグメントの縮ま
たは古典的溶液合成に従い化学的合成により製造することができる。例えば、下
記の文献を参照のこと：Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149、1963；
Stewart他、Solid Phase Peptide Synthesis（第2版）、Pierce Chemical
Co.、イリノイ州ロックフォード、1984；BayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot
. 3：3、1986；およびAtherton他、Solid Phase Peptide Synthesis：A Pr actical Approach 、IRL Press、Oxford、1989。

【０１６２】 zvegf3ポリペプチドを含んでなる非共有結合の複合体は、zvegf3ポリペプチド
および第2ポリペプチド（例えば、PDGF／VEGFファミリーのzvegf3ポリペプチド
または他のペプチド）を生理学的pH付近においてインキュベートすることによっ
て製造することができる。典型的な反応において、約0.1〜0.5μg／μlの濃度の
ポリペプチドをpH約7.4において弱い緩衝液（例えば、0.01Mのリン酸塩または酢
酸塩緩衝液）中でインキュベートする；塩化ナトリウムを約0.1Mの濃度に添加す
ることができる。37℃において、反応は4〜24時間で本質的に完結する。例えば
、Weintraub他、Endocrinology 101：225−235、1997参照。

【０１６３】 所望の成分ポリペプチドを単離し、それらをin vitroで組合わせることによ
って、共有結合の複合体をつくることができる。この方法において製造すること
ができる共有結合の複合体は、zvegf3ポリペプチド、2つの異なるzvegf3ポリペ
プチドのヘテロダイマー、およびzvegf3ポリペプチドおよびタンパク質のVEGF／
PDGFファミリーの他のファミリーメンバーからのポリペプチドのヘテロダイマー
を包含する。

【０１６４】 2つのポリペプチドを変性および還元性条件下に一緒に混合し、変性剤の除去
によりタンパク質を復元する。除去は、例えば、緩衝液を交換する透析またはサ
イズ排除クロマトグラフィーにより実施することができる。2つの異なるポリペ
プチドを組合わせるとき、生ずる復元されたタンパク質は個々の成分のホモダイ
マーならびに2つのポリペプチド成分のヘテロダイマーを形成することができる
。Cao他、J. Biol. Chem. 271：3154−3162、1996参照。

【０１６５】 意図する使用に依存して、in vivoポリペプチドおよびタンパク質を≧80％の
純度、≧90％の純度、≧95％の純度に精製するか、あるいは汚染する高分子、特
に他のタンパク質および核酸に関して99.9％より高く、かつ感染性因子および発
熱因子を含まない、薬学上純粋な状態に精製することができる。

【０１６６】 発現された組換えzvegf3タンパク質（キメラポリペプチドおよびマルチマーの
製造を包含する）を、慣用タンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技
術の組合わせにより精製する。一般に、下記の文献を参照のこと：Affinity Ch romatography：Principle & Methods 、Pharmacia LKB Biotechnology、スイ
ス国ウップサラ、1988；およびScopes、Protein Purification：Principles a nd Practice 、Springer−Verlag、New York、1994。ポリヒスチジン親和標識
（典型的には約6ヒスチジン残基）を含んでなるタンパク質を、ニッケルキレー
ト樹脂上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。例えば、Houchu
li他、Bio／Technol. 6：1321−1325、1988参照。

【０１６７】 さらに、成長因子ドメインそれ自体はpH7.0〜8.0および25mMのリン酸ナトリウ
ム、0.25MのNaClにおいてニッケル樹脂に結合する。結合したタンパク質は、pH5
.0に低下する、下降するpH勾配またはイミダゾール勾配において溶離することが
できる。glu−gluタグを含んでなるタンパク質を、慣用手順に従いイムノアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、Grussenmey
er他、前掲、参照。マルトース結合性タンパク質の融合物を、この分野において
知られている方法に従いアミロースカラム上で精製する。

【０１６８】 下記においていっそう詳細に説明するように、強いカチオン交換体上のクロマ
トグラフィーおよび引き続く疎水性相互作用クロマトグラフィーの組合わせを使
用して、zvegf3成長因子ドメインのタンパク質を精製することができる。タンパ
ク質をBHK細胞において産生するとき、インスリン様成長因子結合性タンパク質4
（IGFBP4）をこれらの条件下にzvegf3と同時精製する。逆相HPLC、第四級アミン
強カチオン交換体上の低いイオン強度およびpH7.0〜9.0におけるアニオン交換、
またはフェニルエーテル樹脂上の疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して
、それ以上の精製を実施することができる。

【０１６９】 また、zvegf3はpH6〜8においてPBS中で種々の色素マトリックス（例えば、BLU
E1、BLUE2、ORANGE1、ORANGE3およびRED3、Lexton Scientific、カリフォルニ
ア州シグナルヒル、から）に結合し、これから結合したタンパク質を20mMのホウ
酸緩衝液pH8.8中の1〜2MのNaCl中で溶離することができることが発見された。RE
D3から溶離されたタンパク質をRED2（Lexton Scientific）上に通過させて、残
りの汚染物質を除去することができる。

【０１７０】 この分野において知られている方法を使用して、zvegf3タンパク質をモノマー
またはマルチマーとして製造し；グルコシル化しまたは非グルコシル化し；ペギ
ル化または非ペギル化することができ；そして初期のメチオニンアミノ酸残基を
含めるか、あるいは含めないことができる。

【０１７１】 本発明は、さらに、配列番号2に示すようなタンパク質のエピトープ担持部分
を含んでなるポリペプチドを提供する。「エピトープ」は、抗体が結合すること
ができるタンパク質の領域である。例えば、Geysen他、Proc. Natl'l. Acad.
Sci. USA 81：3998−4002、1984参照。エピトープは線状であるか、あるいは
コンフォメーション的であることができ、後者はタンパク質のフォルディングの
ときエピトープを形成するタンパク質の不連続領域から構成されている。線状エ
ピトープは一般に少なくとも6アミノ酸残基長さである。タンパク質配列の一部
分を模擬する、比較的短い合成ペプチドは、部分的模擬されたタンパク質と反応
する抗血清を日常的に誘発することができる。

【０１７２】 Sutcliffe他、Science 219：660−666、1983参照。短い、線状エピトープを
認識する抗体は、変性されたタンパク質を用いる分析および診断の応用、例えば
、ウェスタンブロッティングにおいて有用である（Tobin、Proc. Natl'l. Aca
d. Sci. USA 76：4350−4356、1979）。短いペプチドに対する抗体は、また
、自然コンフォメーションのタンパク質を認識することができ、こうしてタンパ
ク質の発現およびタンパク質の単離をモニターのために、溶液中のzvegf3タンパ
ク質を、例えば、ELISAにより検出するとき、または免疫沈降の研究において有
用であろう。

【０１７３】 本発明の抗原、エピトープ担持部分は、zvegf3タンパク質に特異的に結合する
、モノクローナル抗体を包含する、抗体を発生させるために有用である。抗原、
エピトープ担持部分は、zvegf3タンパク質の少なくとも6、しばしば少なくとも9
、よりしばしば15〜抗体30の隣接アミノ酸残基の配列を含有する（例えば、配列
番号2）。zvegf3タンパク質のより大きい部分、すなわち、30〜50残基から配列
全体までを含んでなるポリペプチドが含まれる。エピトープ担持部分のアミノ酸
配列は水性溶媒中の実質的に溶解性を提供するように選択される、すなわち、配
列は比較的親水性の残基を含み、そして疎水性残基は実質的に回避されることが
好ましい。

【０１７４】 このような領域は、配列番号2の残基43〜48、96〜101、97〜102、260〜265、
および330〜335を含む。前述したように、免疫原として、多少のより長いペプチ
ド、例えば、配列番号2の残基80〜104、299〜314、および299〜326を含んでなる
ペプチドを使用することが一般に好ましい。後者のペプチドは、カップリングを
促進するために追加のN末端のCys残基を使用して製造することができる。 本明
細書において使用するとき、用語「抗体」はポリクローナル抗体、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラ
グメント、例えば、F（ab'）₂およびFab'タンパク質分解フラグメントを包含す
る。

【０１７５】 遺伝子操作された無傷の抗体またはフラグメント、例えば、キメラ抗体、Fvフ
ラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよび
ポリペプチドもまた包含される。非ヒトCDRをヒトフレームワークおよび定常領
域の上にグラフト化するか、あるいは全体の非ヒト可変ドメインを組込む（必要
に応じて暴露した残基を置換することによって、前記ドメインをヒト様表面で「
クローキング（cloaking）」する、ここで「ベニヤ化された」抗体が生ずる）こ
とによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。

【０１７６】 いくつかの例において、ヒト化抗体はヒト可変領域のフレームワーク内に非ヒ
ト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。抗体をヒト化する
ことによって、生物学的半減期を増加することができ、そしてヒトへの投与のと
きの悪い免疫反応の可能性は減少する。ヒト構造を有する抗体を産生するように
遺伝的に変更されたマウスにおいて、モノクローナル抗体を産生させることがで
きる。

【０１７７】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を製造し、単離する方法はこの
分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Cooligan他
、（編者）、Current Protocols in Imunology、National Institutes of
Health、John Wiley & Sons，Inc.、1995；Sambrook他、Molecular Cloni ng：A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor、NY、1989；およびHurrell
、J. G. R.（編者）、Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications 、CRC Press，Inc.、フロリダ州ボカレイトン、1982。当業者に
とって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ、
イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラットにzvegf3ポリペプチドまたはそ
のフラグメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させること
ができる。

【０１７８】 アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全ア
ジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、zvegf3ポリペプチ
ドの免疫原性を増加させることができる。また、免疫化に有用なポリペプチドは
、融合ポリペプチド、例えば、zvegf3またはその一部分と免疫グロブリンポリペ
プチドまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチド
が「ハプテン様」である場合、このようなタンパク質は免疫化のための高分子担
体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン
（BSA）、または破傷風トキソイド）に好都合に結合または連鎖させることがで
きる。

【０１７９】 抗体を発生させるか、あるいは選択する別の技術は、zvegf3タンパク質または
ペプチドに対するリンパ球のin vitro暴露、およびファージまたは同様なベク
ター中の抗体ディスプレイライブラリーの選択（例えば、固定化または標識化さ
れたzvegf3タンパク質またはペプチドの使用による）を包含する。このようなラ
ンダムペプチドディスプレイライブラリーをつくり、スクリーニングする技術は
この分野において知られており（Ladner他、米国特許第5,223,409号；Ladner他
、米国特許第4,946,778号；Ladner他、米国特許第5,403,484号およびLadner他、
米国特許第5,571,698号）

【０１８０】 そしてランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびこのようなライブラ
リーをスクリーニングするキットは、例えば、クロンテク（Clontech）（カリフ
ォルニア州パロアルト）、インビトロゲン・インコーポレーテッド（Invitrogen
Inc.）（カリフォルニア州サンディエゴ）、ニュー・イングランド・バイラブ
ズ・インコーポレーテッド（New England Biolabs Inc.）（マサチュセッツ
州ベバーリイ）およびファーマシア（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）
（ニュージャージイ州ピスカタウェイ）から商業的に入手可能である。

【０１８１】 本明細書に開示するzvegf3配列を使用して、ランダムペプチドディスプレイラ
イブラリーをスクリーニングして、zvegf3に結合するタンパク質を同定すること
ができる。これらの「結合性タンパク質」は、zvegf3ポリペプチドと相互作用し
、細胞の標識化またはアフィニティー精製による相同体ポリペプチドの単離に使
用することができるか、あるいはそれらを直接的または間接的に薬剤、トキシン
、放射性核種およびその他に結合させることができる。

【０１８２】 これらの結合性タンパク質は、また、分析方法において、例えば、発現ライブ
ラリーのスクリーニングおよび活性の中和するために；診断アッセイにおいて、
例えば、組織中のポリペプチドの循環レベルを測定するために；根元的な病理学
または疾患のマーカーとしてポリペプチドを検出または定量するために；そして
in vitroおよびin vivoにおいてzvegf3の結合およびシグナルトランスダクシ
ョンをブロックするzvegf3アンタゴニストとして；使用することができる。

【０１８３】 抗体は対照（非zvegf3）ポリペプチドまたはタンパク質に対する結合アフィニ
ティーよりも少なくとも10倍大きいアフィニティーでzvegf3ポリペプチド、ペプ
チドおよびエピトープに抗体が結合する場合、抗体は特異的に結合すると決定さ
れる。これに関して、「非zvegf3ポリペプチド」は関係する分子VEGF、VEGF−B
、VEGF−C、VEGF−D、PIGF、PDGF−A、およびPDGF−Bを包含するが、非ヒト種か
らのzvegf3ポリペプチドを排除する。zvegf3オーソログ間で期待される高いレベ
ルのアミノ酸配列の同一性のために、ヒトzvegf3に対して特異的な抗体はまた他
の種からのzvegf3に結合することができる。

【０１８４】 抗体の結合アフィニティーは、例えば、スキャッチャード分析容易に決定する
ことができる（Scatchard、G.、Ann. NY Acad. Sci. 51：660−672、1942）
。特定の抗体をスクリーニングし、単離する方法はこの分野において知られてい
る。例えば、下記の文献を参照のこと：Paul（編者）、Fundamental Immunolog y 、Raven Press、1993；Getzoff他、Adv. in Immunol. 43：1−98、1988；G
oding、J. W.（編者）、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice 、Academic Press Ltd.、1996；Benjamin他、Ann. Rev. Immunol. 2：67−
101、1984。

【０１８５】 この分野において知られている種々のアッセイを利用して、zvegf3タンパク質
またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる。典型的なアッ
セイは、Antibodies：A Laboratory Manual、HarlowおよびLane（編）、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、1988、に詳細に記載されている。この
ようなアッセイの代表的な例は下記のものを包含する：並流免疫電気泳動、ラジ
オイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ（ELISA）、ドッ
トブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およ
びサンドイッチアッセイ。さらに、抗体を野生型／突然変異のzvegf3タンパク質
またはポリペプチドに対する結合についてスクリーニングすることができる。

【０１８６】 zvegf3を発現する細胞の標識化；アフィニティー精製によるzvegf3の単離；zv
egf3ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイ；根元的な病理学または
疾患のマーカーとして可溶性zvegf3の検出または定量；FACSを使用する分析方法
；発現ライブラリーのスクリーニング；抗イディオタイプ抗体の発生；のために
、そして中和性抗体またはin vitroおよびin vivoにおいてzvegf3の結合をブ
ロックするアンタゴニストとして、zvegf3に対する抗体を使用することができる
。適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、イ
ンヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含す
る；間接的タグまたは標識は、ビオチン−アビジンまたは他の補体／抗補体の対
を中間体として使用することを特徴とする。

【０１８７】 抗体は、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に対して直接的また
は間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体はin vivo診断または
療法の応用において使用することができる。そのうえ、zvegf3またはそのフラグ
メントに対する抗体は、in vitroにおいて、アッセイ、例えば、ウェスタンブ
ロットまたはこの分野において知られている他のアッセイにおいて、変性したzv
egf3またはそのフラグメントを検出するために使用することができる。また、zv
egf3を発現する細胞またはzvegf3のレセプターに対して、結合した治療成分また
は診断成分をターゲッティングするために抗体を使用することができる。

【０１８８】 いくつかの適用（例えば、ある種の療法上の応用）のために、中和抗体を使用
することが好ましい。本明細書において使用するとき、用語「中和抗体」は、そ
れを100倍モルアクセスにおいて添加したとき、同族体抗原の生物学的活性の少
なくとも50％を阻害する抗体を意味する。当業者は認識するように、より大きい
中和活性は時には望ましく、そして100倍または10倍モルアクセスにおいてにお
いて50％阻害を提供する抗体を好都合に使用することができる。

【０１８９】 zvegf3タンパク質およびそのアンタゴニストの活性は、in vitroにおいて培
養した細胞を使用するか、あるいはin vivoにおいて適当な動物モデルに特許請
求した本発明の分子を投与することによって測定することができる。zvegf3活性
のアッセイにおいて使用するターゲット細胞は、血管細胞（特に内皮細胞および
平滑筋細胞）、造血細胞（骨髄およびリンパ系）細胞、肝臓細胞（肝細胞、有 窓内皮細胞、クップファー細胞、および伊藤細胞を包含する）、神経突起細胞（
星状細胞、膠細胞、樹枝細胞、およびPC−12細胞を包含する）、シュワン細胞、
胎児肺細胞、関節滑膜細胞、周細胞、軟骨細胞、乏突起神経膠細胞、骨芽細胞、
およびPDGFアルファレセプターを発現する他の細胞を包含する。

【０１９０】 zvegf3タンパク質を種々のこの分野においてよく知られている方法によりレセ
プター結合活性について分析することができ、このような方法はレセプター競合
アッセイ（Bowen−PopeおよびRoss、Methods Enzymol. 109：69−100、1985）
、レセプターの使用、およびIgG融合タンパク質として産生されたレセプターの
使用（米国特許第5,750,375号）を包含する。レセプター結合アッセイは、評価
のための既知の細胞表面レセプターを含有する細胞系統について実施することが
できる。レセプターは細胞の中に自然に存在するか、あるいは遺伝子操作された
細胞により発現された組換えレセプターであることができる。

【０１９１】 zvegf3に結合することができる細胞型は、zvegf3−トキシン複合体、例えば、
zvegf3タンパク質とサポニンとの複合体を使用して同定することができる。組織
培養、器官培養、またはin vivo設定における細胞によるzvegf3−トキシン複合
体の結合は、細胞の中への複合体の組込みを可能とする。サポニンはいったん細
胞の中に入ると、細胞に対して毒性作用を示し、これにより細胞を殺す。この活
性を使用して、zvegf3に結合し、その中に入ることができる細胞型を同定するこ
とができる。応答性細胞型の同定を可能とすることに加えて、複合体の注射後に
動物内の病理を観察することによって、zvegf3が生物学的活性を有する器官およ
び組織を同定するin vivo研究において、トキシン複合体を使用することができ
る。

【０１９２】 培養した細胞を使用して、zvegf3タンパク質の活性をin vitroにおいて測定
することができる。既知のアッセイを使用してマイトジェン活性を測定すること
ができる。このようなアッセイは、チミジン組込みアッセイ（例えば、下記の文
献に開示されている：RainsおよびRoss、Methods Enzymol. 109：749−773，1
985およびWahl他、Mol. Cell. Biol. 8：5016−5025、1988）、色素組込みア
ッセイ（例えば、下記の文献に開示されている：Mosman、J. Immunol. Meth.
65：55−63、1983およびRaz他、Acta Trop. 68：139−147，1997）、または
細胞の計数を包含する。

【０１９３】 適当な有糸分裂誘発アッセイにおいて、³H−チミジンを（1）20％のコンフル
エント培養物の中に組込んで増殖する細胞をさらに刺激するzvegf3タンパク質の
能力を観測し、そして（2）48時間コンフルエンスに保持した休止細胞の中に組
込んで接触誘導成長阻害を克服するzvegf3タンパク質の能力を観測する。適当な
色素組込みアッセイは、ターゲット細胞の中への色素アラマー（Alamar）ブルー
（Raz他、前掲）の組込みの測定を包含する。また、下記の文献を参照のこと：G
ospodarowicz他、J. Cell. Biol. 70：395−405、1976；EwtonおよびFlorini
、Endocrinol. 106：577−583、1980；およびGospodarowicz他、Proc. Natl'l
. Acad. Sci. USA 86：7311−7315、1989。

【０１９４】 いっそう成熟した表現型に分化するように誘導可能である適当な前駆体細胞を
使用して、細胞分化をアッセイすることができる。例えば、内皮細胞および造血
細胞は普通の先祖細胞、血管芽細胞から誘導される（Choi他、Development 125
：725−732，1998）。また、骨芽細胞への分化を刺激するzvegf3タンパク質の能
力を測定するために、間葉幹細胞を使用することができる。

【０１９５】 分化はオステオカルシンの発現、無機質化する細胞の能力、およびアルカリ性
ホスファターゼの発現により示され、それらのすべてはこの分野において知られ
ている日常的方法により測定することができる。腫瘍細胞の増殖および転移に対
するzvegf3タンパク質の作用は、例えば、下記の文献に記載されているように、
ルイス肺癌腫モデルを使用して分析することができる：Cao他、J. Exp. Med.
182：2069−2077、1995。ニューロン由来の細胞に対するzvegf3タンパク質の
活性は、神経突起の成長に対する作用を測定するアッセイにより分析することが
できる。

【０１９６】 また、1またはそれ以上の追加の成長因子または他の高分子のzvegf3誘導産生
を測定するように設計されたアッセイにより、zvegf3活性を検出することができ
る。このようなアッセイは、肝臓細胞成長因子（HGF）、表皮成長因子（EGF）、
形質転換成長因子アルファ（TGFα）、インターロイキン−6（IL−6）、VEGF、
酸性線維芽細胞成長因子（aFGF）、およびアンギオゲニンの存在を決定するアッ
セイを包含する。適当なアッセイは、問題の高分子に対して応答性のターゲット
細胞を使用するアッセイ、競合結合アッセイ、免疫学的アッセイ（例えば、ELIS
A）、およびこの分野において知られている他のフォーマットを包含する。

【０１９７】 処理した一次ヒト皮膚繊維芽細胞、滑膜細胞および軟骨細胞から、メタロプロ
テアーゼを測定する。zvegf3タンパク質の存在下の培養に応答して産生されたコ
ラゲナーゼ、ゲラチナーゼおよびストロメラシンの相対レベルを測定する（Loit
aおよびStetler−Stevenson、Cancer Biology 1：96−106、1990）。被験タン
パク質に応答して皮膚繊維芽細胞および軟骨細胞によりプロコラーゲン／コラー
ゲンの合成は、分泌された発生期コラーゲンの中への³H−プロリンの組込みによ
り測定される。SDS−PAGEおよび引き続くオートラジオグラフィー（Unemoriおよ
びAmento、J. Biol. Chem. 265：10685−10685、1990）により、³H標識化コ
ラーゲンを可視化する。

【０１９８】 皮膚繊維芽細胞および軟骨細胞からのグリコサミノグリカン（GAG）は、1,9−
ジメチルメチレンブルー色素結合アッセイにより測定する（Farndale他、Biochi
m. Biophys. Acta 883：173−177、1986）。また、コラーゲンおよびGAGのア
ッセイをIL−1βまたはTGF−βの存在下に実施して、これらのサイトカインに対
する確立された応答を修飾するzvegf3の能力を検査する。

【０１９９】 単球活性化アッセイを実施して（1）単球活性化をさらに刺激するzvegf3タン
パク質の能力を観測し、そして（2）結合誘導またはエンドトキシン誘導単球活
性化をモジュレートするzvegf3タンパク質の能力を観測する（Fuhlbrigge他、J.
Immunol. 138：3799−3802、1987）。活性化に応答して産生されるIL−1βお
よびTNFαレベルをELISAにより測定する（Biosource，Inc. Camarillo、カリフ
ォルニア州）。単球／マクロファージ細胞は、CD14（LPSレセプター）により、
エンドトキシンに対して繊細に感受性であり、そして中程度のレベルのエンドト
キシン様活性を有するタンパク質はこれらの細胞を活性化するであろう。

【０２００】 培養における種々の造血細胞についてzvegf3タンパク質の造血活性をアッセイ
することができる。適当なアッセイは、一次骨髄または末梢血白血球コロニーア
ッセイ、および後の段階の系列制限コロニーアッセイを包含し、これらはこの分
野において知られている（例えば、Holly他、WIPO公開WO 95／21920）。適当な
半固体培地（例えば、15％の胎仔ウシ血清、10％のウシ血清アルブミン、および
0.6％のPSN抗体混合物を含有する50％のメチルセルロース）上にプレートした骨
髄細胞を被験ポリペプチドの存在下にインキュベートし、次いでコロニー形成に
ついて検査する。

【０２０１】 既知の造血因子を対照として使用する。造血細胞系統に対するzvegf3ポリペプ
チドのマイトジェン活性を、³H−チミジン組込みアッセイ、色素組込みアッセイ
または細胞計数により測定することができる（RainsおよびRoss、Methods Enzy
mol. 109：749−773，1985およびFoster他、米国特許第5,641,655号）。例えば
、細胞を多ウェルマイクロタイタープレート中で培養する。試験試料および³H−
チミジンを添加し、細胞を37℃において一夜インキュベートする。

【０２０２】 ウェルの内容物をフィルターに移し、乾燥し、計数して標識化の組込みを決定
する。また、3−（4,5−ジメチルチアゾル−2−イル）−2,5−ジフェニルテトラ
ゾリウムブロミド（MTT）の代謝破壊をベースとする比色アッセイを使用して、
細胞増殖を測定することができる（Mosman、前掲）。簡単に述べると、MTTの溶
液を100μlのアッセイ細胞に添加し、細胞を37℃においてインキュベートする。
4時間後、200μlのイソプロパノール中の0.04N HClを添加し、この溶液を混合
し、試料の吸収を570nmにおいて測定する。

【０２０３】 細胞移動を本質的に下記の文献に記載されているようにしてアッセイする：Ka
ehler他、Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology 17：932−
939、1997。タンパク質が低いタンパク質濃度の領域から高いタンパク質濃度の
領域への細胞の移動を誘導する場合、タンパク質は化学走性であると考えられる
。2つのチャンバーを分離するポリスチレン膜を有する変更されたボイデン（Boy
den）チャンバー（Transwell；Corning Cosar Corp.）を使用して、このアッ
セイを実施する。

【０２０４】 1％のBSAを含有する媒質中で試験試料を希釈し、トランスウェル（Transwell
）を含有する24ウェルのプレートの下のチャンバーに添加する。次いで0.2％の
ゼラチンで前処理したトランスウェルインサート上に、細胞をプレートする。37
℃において4時間インキュベートした後、細胞移動を測定する。移動しない細胞
をトランスウェル膜の上部からぬぐって除去し、膜の下面に結合した細胞を固定
し、0.1％のクリスタルバイオレットで染色する。次いで染色された細胞を10％
の酢酸で抽出し、吸収を600nmにおいて測定する。次いで移動を標準検量線から
計算する。

【０２０５】 平滑筋細胞（SMC）移動をKenagy他の大動脈外植アッセイ（Circulation 96：
3555−3560、1997）により測定する。典型的なプロトコルにおいて、外植片をヒ
ヒ胸大動脈から調製し、内側中膜を分離し、1mm断片に細切する。5μg／mlのト
ランスフェリン、5μg／mlのインスリン、1mg／mlのオバルブミン、および被験
化合物を補充したDMEMを含有する組織培養フラスコの中に、外植片を入れる。移
動する細胞の数を毎日測定する。

【０２０６】 細胞接着活性を本質的に下記の文献に記載されているようにアッセイする：La
Fleur他、J. Biol. Chem. 272：32798−32803、1997）。簡単に述べると、マ
イクロタイタープレートを被験タンパク質で被覆し、非特異的部位をBSAでブロ
ックし、細胞（例えば、平滑筋細胞、白血球、または内皮細胞）をほぼ10⁴〜10⁵ 細胞／ウェルの密度でプレートする。細胞を37℃においてインキュベートし（典
型的には約60分間）、次いで非接着性細胞をおだやかな洗浄により除去する。接
着した細胞を慣用法（例えば、クリスタルバイオレットを使用する染色、細胞の
溶解、およびライゼイトの光学密度の測定）により定量する。

【０２０７】 対照ウェルを既知の接着性タンパク質、例えば、フィブロネクチンまたはビト
ロネクチンで被覆する。血管形成活性についてのアッセイもまたこの分野におい
て知られている。例えば、血管形成における始原内皮細胞に対するzvegf3に対す
る作用は、ヒヨコ尿漿膜血管形成アッセイにおいてアッセイすることができる（
Leung、Science 246：1306−1309、1989；Ferrara、Ann. NY Acad. Sci. 7
52：246−256、1995）。簡単に述べると、8日齢の受精卵の殻の中に小さい窓を
カットし、被験物質を尿漿膜に適用する。72時間後、膜を血管新生について検査
する。

【０２０８】 他の適当なアッセイは下記のアッセイを包含する：初期段階のウズラ（Coturn
ix coturnix japnica）胚のマイクロインジェクション（Drake他、Proc. Nat
l'l. Acad. Sci. USA 92：7657−7661、1995）；角膜血管新生の齧歯類モデ
ル（MuthukkaruppanおよびAuerbach、Science 205：1416−1418、1979）、ここ
で同系交配マウスの角膜中のポケットの中に被験物質を挿入する；およびハムス
ターの頬袋アッセイ（Haecket他、Arch. Surg. 128：423−429、1993）。血管
透過性の誘導は血管形成活性を示し、そしてこの誘導は被検化合物の投与後に試
験動物（例えば、マウスまたはモルモット）の血管系からのタンパク質の漏出を
検出するように設計されたアッセイにおいて測定される（MilesおよびMiles、J.
Physiol. 118：228−257、1952；Feng他、J. Exp. Med. 183：1981−1986
、1996）。

【０２０９】 血管形成活性についてのin vitroアッセイは下記のアッセイを包含する：三
次元コラーゲンゲルマトリックスモデル（Pepper他、Biochem. Biophys. Res.
Comm. 198：821−831、1992およびFerrara他、Ann. NY Acad. Sci. 732
：246−256、1995）、これは微小血管内皮細胞により管様構造の形成を測定する
；およびマトリゲル（matrigel）モデル（Grant他、″Angiogenesis as a co
mponent of epithelial−mesenchmal interactions″、GoldbergおよびRosen
、Epithelial−Mesenchmal interaction in Cancer、Birkhaeuser Verlag、
1995、235−248；Baatout、Anticancer Research 17：451−456、1997）、こ
れはマトリゲル、すなわち、ラミニンに富んだ基底膜抽出物、の中に播種された
内皮細胞による細胞移動および管形成に対する作用を決定するために使用される
。血管形成アッセイは、可能な組合わせ作用を評価するために、VEGFの存在およ
び非存在において実施される。VEGFはin vivoアッセイにおいて対照として使用
することができる。

【０２１０】 zvegf3活性は、また、軸索の誘導および成長を測定するアッセイを使用して測
定することができる。ニューロン成長パターンの変化を示すアッセイ、例えば、
下記の文献に記載されているアッセイは特に重要である：Hastings、WIPO公開WO
97／29189およびWalter他、Development 101：685−96、1987。ニューロンの
成長に対する作用を測定するアッセイはこの分野においてよく知られている。例
えば、Cアッセイ（例えば、RaperおよびKapfhammer、Neuron 4：21−9、1990お
よびLuo他、Cell 75：217−27、1993）を使用して、成長するニューロンに対す
るzvegf3の崩壊活性を測定することができる。Goodman、Annu. Rev. Neurosci
. 19：341−77、1996。

【０２１１】 zvegf3タンパク質、zvegf3アゴニスト、またはzvegf3アンタゴニスト、または
このような細胞の凝集物からコンディショニングした培地を、ゲルマトリックス
の中において、神経成長因子と同時培養した、適当な神経細胞、例えば、背根神
経節（DRG）または交感神経節外植片付近に配置することができる。対照細胞に
比較して、ニューロン成長のzvegf3誘導変化を測定することができる（例えば、
下記の文献に記載されているように、Messersmith他、Neuron 14：949−59、19
95およびPuschel他、Neuron 14：941−8、1995）。同様に、本発明の分子の存
在下に成長させたニューロン細胞懸濁液を使用して、神経突起のアウトグロース
を測定することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：O'Shea他、Neuron
7：231−7、1991およびDeFreitas他、Neuron 15：333−43、1995）。

【０２１２】 zvegf3タンパク質の生物学的活性は、非ヒト動物において、外因的タンパク質
の投与により、zvegf3をコードするポリヌクレオチドの発現により、そしてアン
チセンスまたはノックアウト技術を使用する内因的zvegf3の発現の抑制により、
研究することができる。zvegf3タンパク質は、個々に、他のzvegf3タンパク質と
組み合わせて、または他の成長因子（例えば、VEGF、PIGF、またはPDGF）を包含
する、非veg3タンパク質と組み合わせて、投与するか、あるいは発現させること
ができる。例えば、zvegf3ポリペプチドの組合わせ（例えば、zvegf3_15-163、zv
egf3_15-230、およびzvegf3_235-345の組合わせ）を試験動物に投与するか、ある
いは動物において発現させることができる。試験動物を臨床的徴候、体重、血球
計数、臨床化学、組織病理学、およびその他のようなパラメーターの変化につい
てモニターすることができる。

【０２１３】 既知の動物モデル、例えば、db／dbマウスモデル（Cohen他、Diabetologia 3
9：270−274、1996およびCohen他、J. Clin. Invest. 95：2338−2345、1995
）またはトランスジェニック動物モデル（Imai他、Contrib Nephrol. 107：20
5−215、1994）において、肝臓および腎臓の線維症に対するzvegf3およびzvegf3
アンタゴニストの作用を試験することができる。

【０２１４】 また、ブレオマイシンを使用してマウスにおいて線維症に対する作用をアッセ
イすることができる。化学療法剤ブレオマイシンはヒトにおいて肺性線維症の既
知の原因因子であり、そして繊維芽細胞の数の増加、コラーゲン沈着の増強、お
よびマトリックス改造の調節解除を包含する、間質性肺疾患を誘導することがあ
る。C57B1／6マウスにブレオマイシンを浸透圧ミニポンプにより1週間投与する
。

【０２１５】 炎症期間が後続し、ブレオマイシン投与後ほぼ4〜7日に皮膚の毒性が開始し、
約1週間連続し、次いでマウスは健康を回復する。ブレオマイシンのデリバリー
が終了した後約3〜4週に、マウスを殺し、肺を線維症の徴候について組織学的に
検査する。スコアリングは肺線維症の病変の程度およびそれらの重症度に基づく
。血清を乳酸デヒドロゲナーゼ、すなわち、一般的細胞死または損傷のとき循環
の中に放出される細胞内酵素、についてアッセイする。肺組織をコラーゲン沈着
の測度としてヒドロキシプロリンについてアッセイする。

【０２１６】 末梢四肢虚血および後足虚血のウサギモデルおよび慢性心筋虚血のブタモデル
を包含する、既知の動物モデルにおいて、冠状側副成長の刺激を測定することが
できる（Ferrara他、Endocrine Reviews 18：4−25、1997）。zvegf3タンパク
質をVEGF、アンギオポイエチン、およびFGFの存在および非存在下にアッセイし
て組合わせの作用について試験する。これらのモデルは、下記においていっそう
詳細に説明するように、遺伝子デリバリーのためにアデノウイルスまたは裸DNA
を使用して修飾し、1またはそれ以上の被験タンパク質を局所的に発現させる。

【０２１７】 創傷治癒の促進におけるzvegf3ポリペプチドの効能を動物モデルにおいてアッ
セイすることができる。1つのこのようなモデルは、Mustoe他（Science 237：1
33、1987）の線状皮膚切開モデルである。典型的な手順において、成体ラットの
背側毛皮の中に6cmの切開を作り、次いで創傷鉗子で閉じる。一次的閉鎖前に、
被験物質およびコントロール（溶液、ゲル、または粉末の形態）を適用する。投
与は単一適用にしばしば制限されるが、連続する日に切開下のいくつかの部位に
おいて、追加の適用を注意した注射により実施することができる。創傷後3〜21
日に、創傷の破壊強さを評価する。

【０２１８】 第2モデルにおいて、多数の、小さい、全厚さの切除を行う。耳における軟骨
は創傷を固定し、閉鎖の評価から創傷収縮の変動を除去する。実験的治療および
対照を適用する。創傷部位の形状寸法および解剖学は細胞の内部成長および上皮
移動の信頼性ある定量、ならびに創傷の生化学（例えば、コラーゲン含量）の定
量分析を可能とする。Mustoe他、J. Clin. Invest. 87：694、1991参照。ウ
サギ耳モデルを改変して虚血創傷環境をつくり、これは臨床的状況にいっそう密
接に類似する（Ahn他、Ann. Plast. Surg. 24：17、1990）。

【０２１９】 第3モデルにおいて、ブタまたはモルモットにおける部分的厚さ皮膚の創傷の
治癒を評価する（LeGrand他、Growth Factors、8：307、1993）。実験的治療を
毎日包帯の上または下に適用する。創傷形成後7日に、顆粒化組織の厚さを測定
する。このモデルは創傷治癒の他のin vivoモデルよりもいっそう定量的である
ので、投与量−応答研究のために特に有用である。また、全厚さ切除モデルを使
用することができる。このモデルにおいて、齧歯類における皮筋層またはブタに
おいて皮下脂肪まで表皮および真皮を除去する。実験的治療を局所的に包帯の上
または下に適用し、所望ならば、毎日適用することができる。収縮および細胞の
内部成長および増殖の組合わせにより、創傷は閉じる。

【０２２０】 測定可能な終点は、創傷が閉じるまでの時間、組織学的スコア、および創傷組
織の生化学的パラメーターを包含する。また、障害された創傷治癒モデルはこの
分野において知られている（例えば、Cromack他、Surgery 113：36、1993；Pie
rce他、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86：2229、1989；Greenhalgh、Am.
J. Pathol. 136：1235、1990）。創傷治癒プロセスの遅延または延長は、ス
テロイドを使用する治療、創傷部位の照射、または付随する疾患の状態（例えば
、糖尿病）により薬理学的に誘導することができる。実験的創傷として、線状切
開または全厚さの切除は最も普通である。

【０２２１】 終点は創傷の各型について前述した通りである。創傷治癒の初期段階において
作用する化合物を評価するために、皮下移植片を使用することができる（Broadl
ey他、Lab. Invest. 61：571、1985；Sprugel他、Am. J. Pathol. 129：60
1、1987）。移植片は、多孔質の、比較的非炎症性の容器（例えば、ウシコラー
ゲンが充填されたポリエチレンスポンジまたは発泡ポリテトラフルオロエチレン
の移植片）中で調製され、マウスまたはラットにおいて皮下的に配置される。移
植片の内部は細胞が存在せず、よく定められかつ前もって存在する組織から分離
することができる「創傷空間」を形成する。この配置は細胞の内向き流および細
胞型の評価、ならびに脈管形成／血管形成および細胞外基質産生の測定を可能と
する。

【０２２２】 動物におけるzvegf3タンパク質の発現は、in vivoにおけるタンパク質活性の
過剰生産または阻害の生物学的作用の研究のためのモデルを提供する。ウイルス
ベクターまたは裸DNAを使用してzvegf3をコードするポリヌクレオチドを試験動
物、例えば、マウス、の中に導入することができるか、あるいはトランスジェニ
ック動物を産生することができる。一般に、zvegf3タンパク質は分泌ペプチドを
使用して発現される。適当な分泌ペプチドは、zvegf3分泌ペプチド（例えば、配
列番号2の残基1〜14）および異種分泌ペプチドを包含する。典型的な異種分泌ペ
プチドは、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（t−PA）のそれである。米
国特許第5,641,655号に開示されているように、望ましくないタンパク質分解的
切断を減少するようにt−PA分泌ペプチドを修飾することができる。

【０２２３】 ウイルスデリバリー系を使用して、本発明のタンパク質をin vivoでアッセイ
することができる。典型的なウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、
レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ関連ウイルス（AAV）を包
含する。概観については、下記の文献を参照のこと：Becker他、Mol. Cell. B
iol. 43：161−89、1994；およびDouglasおよびCuriel、Science and Medici
ne 4：44−53、1997。アデノウイルス（下記の文献において概観されている：B
ecker他、Mol. Cell. Biol. 43：161−89、1994；およびDouglasおよびCurie
l、Science and Medicine 4：44−53、1997）はいくつかの利点を提供する。

【０２２４】 アデノウイルスは（i）比較的大きいDNAインサートを収容し、（ii）高い力価
に増殖し、（iii）広い範囲の哺乳動物細胞型を感染し、そして（iv）多数の異
なるプロモーター、例えば、偏在的、組織特異的、および調節可能なプロモータ
ーとともに使用することができる。アデノウイルスは血流中で安定であるので、
静脈内注射により投与することができる。アデノウイルスデリバリー系がE1遺伝
子欠失を有する場合、ウイルスは宿主細胞中で複製することができない。しかし
ながら、宿主組織（例えば、肝臓）異種タンパク質を発現し、プロセスする（そ
して、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）であろう。

【０２２５】 分泌されたタンパク質は高度に血管化した肝臓中の循環の中に入り、感染した
動物に対する作用を測定することができる。ベクターに対する免疫応答を減少し
または排除するために、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルス
ベクターを使用することができる。このようなアクチベーターはE1欠失されてお
り、さらにE2AまたはE4の欠失を含有する（Lusky他、J. Virol. 72：2022−２
０３２、1998；Raper他、Human Gene Therapy 9：671−679、1998）。さらに
、E2bの欠失は免疫応答を減少させることが報告されている（Amalfitano他、J.
Virol. 72：926−933、1998）。

【０２２６】 すべての転写単位が欠失されている、いわゆる「グートレス（gutless）」ア
デノウイルスの発生は、異種DNAの大きいインサートの挿入のために特に有利で
ある。概観については、下記の文献を参照のこと：YenおよびPerricaudet、FASE
B J. 11：615−623、1997。レトロウイルスのベクターは、例えば、下記の文
献に開示されている：Anderson他、米国特許第5,399,346号；Mann他、Cell 33
：153、1983；Temin他、米国特許第4,650,764号；Temin他、米国特許第4,980,28
9号；Markowitz他、J. Virol. 62：1120、1988；Temin他、米国特許第5,124,2
63号；Dougherty他、WIPO公開WO 95／07358；およびKuo他、Blood 82：845、1
993。

【０２２７】 別の方法において、特定の細胞に対してリポソームの分子ターゲッティングを
包含する、ある種の実際的利点を提供する技術である、リポソーム仲介トランス
フェクションにより、ベクターを導入することができる。特定の細胞型にトラン
スフェクションを向けることは、細胞の不均質性を有する組織、例えば、膵臓、
肝臓、腎臓、および脳において特に有利である。ターゲッティングの目的で、脂
質を他の分子に化学的にカップリングすることができる。ターゲッテッドペプチ
ド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、タンパク質、例えば、抗体、また
は非ペプチド分子をリポソームに化学的にカップリングすることができる。

【０２２８】 他の態様において、ターゲット細胞を動物から取出し、DNAを裸DNAプラスミド
として導入する。次いで形質転換された細胞を動物の体の中に再移植する。この
分野において知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポ
レーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAE
デキストラン、リン酸カルシウム沈澱法、遺伝子ガンの使用またはDNAベクター
トランスポーターの使用により、裸DNAベクターを所望の宿主細胞の中に導入す
ることができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Wu他、J. Biol. Chem.
267：963−7、1992；Wu他、J. Biol. Chem. 263：14621−4、1988。

【０２２９】 また、zvegf3遺伝子を発現するように操作されたマウス（「トランスジェニッ
クマウス」と呼ぶ）、およびzvegf3遺伝子機能の完全な非存在を示すマウス（「
ノックアウトマウス」と呼ぶ）を発生させることができる（Snouwaert他、Scien
ce 257：1083、1992；Lowell他、Nature 366：740−42、1993；Capecchi、Sci
ence 244：1288−1292、1989；Palmiter他、Annu. Rev. Genet. 20：465−4
99、1986）。正常マウスまたは遺伝病または他の変更された表現型を有するマウ
スを使用して、トランスジェネシス実験を実行することができる。

【０２３０】 偏在的にまたは組織特異的または組織制限的プロモーター下に、zvegf3を過剰
に発現するトランスジェニックマウスを使用して、過剰発現が表現型の変化を引
き起こすか否かを決定することができる。適当なプロモーターは、メタロチオネ
イン、アルブミン（Pinkert他、Genes Dev. 1（3）：268−76、1987）、およ
びK−14ケラチノサイト（Vassar他、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86（5
）：1563−1567、1989）遺伝子のプロモーターを包含する。メタロチオネイン−
1（MT−1）プロモーターは肝臓および他の組織における発現を提供し、しばしば
高いレベルの循環タンパク質に導く。

【０２３１】 野生型zvegf3ポリペプチド、タンパク質フラグメントまたはその突然変異体の
過剰発現は正常細胞プロセスを変更し、zvegf3の発現が機能的に関係し、zvegf3
、そのアゴニストまたはアンタゴニストの療法上のターゲットを示すことができ
る組織を同定する、表現型を生ずることができる。例えば、全長のzvegf3配列を
過剰に発現するようにトランスジェニックマウスを操作することができ、これは
ヒト疾患との類似性を示す表現型を生ずることがある。

【０２３２】 同様に、ノックアウトzvegf3マウスを使用して、zvegf3がin vivoにおいて絶
対的に必要であるかどうかを決定することができる。ノックアウトマウスの表現
型はzvegf3アンタゴニストのin vivoを予測する。また、例えば、癌、アテロー
ム性動脈硬化症、慢性関節リウマチ、虚血、および心臓血管系疾患を包含する疾
患のモデルにおけるzvegf3タンパク質の作用を研究するために、ノックアウトマ
ウスを使用することができる。

【０２３３】 ヒトzvegf3cDNAを使用して上に開示したネズミzvegf3mRNA、cDNAおよびゲノム
DNAを単離することができ、引き続いてこれらを使用してノックアウトマウスを
発生させる。これらのマウスはzvegf3遺伝子およびそれによりコードされたタン
パク質をin vivo系において研究するために使用することができ、対応するヒト
疾患のin vivoモデルとして使用することができる。そのうえ、本明細書に記載
するzvegf3に対して向けられたzvegf3アンチセンスポリヌクレオチドまたはリボ
ザイムを発現するトランスジェニックマウスは、前述のマウスをノックアウトす
るために同様に使用することができる。

【０２３４】 zvegf3とPDGFリガンドとの間の機能的関係をノックイン実験により研究するこ
とができる。例えば、胚幹（ES）細胞中のPDGFリガンドのゲノム遺伝子座の中に
zvegf3遺伝子またはcDNAをノックインすることによって、動物におけるPDGF A
またはPDGF B遺伝子を置換することができ、次いでノックインマウスを発生さ
せるために使用され、このマウスにおいてzvegf3タンパク質は（置換された）PD
GFゲノム遺伝子座により発現される。

【０２３５】 このようなノックインマウスは多数の問題、例えば、zvegf3が発生間にPDGF機
能を置換することができるかどうか；zvegf3がユニークな機能を有するかどうか
；そして、マウスから確立された細胞系統を使用して、zvegf3シグナルトランス
ダクションのメカニズムを扱うために使用することができる。例えば、下記の文
献を参照のこと：Wang他、Development 124：2507−2513、1997；Zhuang他、Mo
l. Cell. Biol. 18：3340−3349、1998；Geng他、Cell 97：767−777、1999
。

【０２３６】 この技術のそれ以上の応用において、修飾されたzvegf3配列またはzvegf3の特
定のスプライスされたバージョンの中にノックインすることによって、zvegf3の
個々のドメインを特別に欠失または修飾し、これによりそのタンパク質の機能的
ドメインを研究するトランスジェニックモデルを提供することができる。例えば
、下記の文献を参照のこと：Zhuang他（前掲）およびBaudoin他（Genes Dev.
12：1202−1216。1988）。他の応用において、感受性リポーター遺伝子（例えば
、lacZ）をzvegf3遺伝子座の中にノックインすることによって、zvegf3遺伝子を
発現する組織および細胞型を同定することができる。例えば、下記の文献を参照
のこと：Monroe他、Immunity 11：201−212、1999；Zhuang他、前掲；Geng他、
前掲。

【０２３７】 アンチセンス法を使用してzvegf3遺伝子の転写を阻害して、in vivoにおける
このような阻害作用を検査することができる。zvegf3をコードするポリヌクレオ
チドのセグメント（例えば、配列番号1に記載するポリヌクレオチド）に対して
相補的であるポリヌクレオチドは、zvegf3をコードするmRNAに結合しかつこのよ
うなmRNAの転写を阻害するように設計される。また、細胞培養においてzvegf3ポ
リペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するために、このようなアンチセン
スオリゴヌクレオチドを使用することができる。 当業者は認識するように、本明細書に開示するアッセイは、zvegf3タンパク質
、抗zvegf3抗体および他のアンタゴニスト、および種々の源に由来する被験物質
の活性を同定するように、容易に適合させることができる。

【０２３８】 zvegf3タンパク質は、組織の発生または修復、または細胞の分化または増殖を
刺激するために、療法的に使用することができる。zvegf3はPDGFアルファレセプ
ターに結合し、そしてアルファレセプター仲介細胞プロセスを刺激することが見
出された。したがって、このタンパク質はPDGFアルファレセプターアゴニストと
して使用することができる。特定の応用は下記のものを包含するが、これらに限
定されない：

【０２３９】 特に真性糖尿病、結合組織の疾患、喫煙、熱傷、および他の増悪性症状のため
に危うくされた創傷治癒の場合における、静脈血行静止性潰瘍および他の慢性、
非治癒性創傷を包含する、全厚さの皮膚の創傷の治療；骨折の修復；血管新生を
促進しかつ皮膚弁の生存率を増加するための再構成的外科手術；移植された細胞
および組織、例えば、移植されたランゲルハンス島における脈管網状組織の確立
；急性または慢性胎盤機能障害（周産期の罹患率および死亡率を引き起こす重要
な因子）および出血延長を包含する、女性の生殖管の疾患の治療；歯周疾患によ
り損傷された組織の成長の促進；

【０２４０】 損傷された肝臓組織の修復の促進；微小血管の欠乏により特徴づけられる、十
二指腸潰瘍を包含する、胃腸管の急性および慢性病変の治療；血管形成の促進し
かつ慢性脳虚血のためのニューロン変性の予防；虚血性四肢における側副血管の
形成の促進；虚血性損傷を制限するために心筋梗塞後の血管修復および側副血行
の発生を促進するため；および造血の刺激。また、ポリペプチドは、治癒する組
織の脈管再生を促進するために、組織の接着において有用な接着剤である。

【０２４１】 活動性慢性肝炎（C型肝炎を包含する）および多数の他の型の肝硬変を包含す
る、慢性肝疾患による損傷を包含する、肝損傷の治療または修復のために、zveg
f3またはzvegf3アンタゴニストを使用することは、特に重要である。事実上肝臓
全体の破壊を包含する、広く分布した、多量の壊死は、なかでも、下記の原因に
より引き起こされる：激症ウイルス肝炎；痛覚消失アセトアミノフェンの過剰投
与；他の薬剤および化学物質、例えば、ハロタン、モノアミンオキシダーゼイン
ヒビター、結核、リン、四塩化炭素、および他の工業的化学物質に対する暴露。

【０２４２】 明らかな肝細胞壊死を必ずしも産生しない超微細構造的病変に関連する症状は
、子供におけるレイ症候群、テトラサイクリン毒性、および妊娠の急性脂肪肝を
包含する。線維症および正常構築の構造的に異常な小節への変換により特徴づけ
られる拡散プロセスである肝硬変は、下記を包含する種々の理由で発生であるこ
とがある：アルコール乱用、壊死後性肝硬変（通常活動性慢性肝炎のための）、
胆汁性肝硬変、色素沈着性肝硬変、特発性肝硬変、ウイルソン病、およびアルフ
ァ−1−アントトリプシン欠乏症。また、zvegf3は肝慢性受動性鬱血（CPC）およ
び中心出血性壊死（CHN）の治療に有用であることができ、これらは右側心不全
において直面する連続を表す2つの血行変化である。

【０２４３】 zvegf3で治療できる他の血行障害は、肝静脈血栓症、門静脈血栓症、および心
臓硬化症を包含する。肝線維症の場合において、線維症の肝臓における細胞外基
質の産生に関係づけられた、星細胞の活動性を抑制するために、zvegf3アンタゴ
ニストを投与することが有益であることがある（LiおよびFriedman、J. Gastro
enterol. Hepatol. 14：618−633、1999）。

【０２４４】 zvegf3ポリペプチドは単独でまたは、VEGFを包含する、他の脈管形成または血
管形成剤と組合わせて投与することができる。例えば、塩基性および酸性FGFま
たはVEGFは側副血行の発生においてある役割を演ずることが見出され、そしてzv
egf3と1またはそれ以上のこれらの因子との組合わせた使用は有利であることが
ある。また、VEGFは移植された小島細胞の生存に関係づけられた（Gorden他、Tr
ansplantation 63：436−443、1997；Pepper、Arteriosclerosis，Throm. and
Vascular. Biol. 17：605−619、1997）。

【０２４５】 塩基性FGFは血管形成を誘導し、実験動物における潰瘍の治癒を促進すること
が示された（下記の文献において概観されている：Folkman，Nature Medicine
1：27−31、1995）。VEGFは血管の再内皮化を促進し、再狭窄の動物モデルに
おける初期の過形成を減少させる（Asahara他、Circulation 91：2802−2809、
1995；Callow他、Growth Factors 10：223−228，1994）；zvegf3ポリペプチ
ドの効能をこれらおよび他の既知モデルにおいて試験することができる。追加の
薬剤と組合わせてzvegf3を使用するとき、2つの成分を治療する特定の症状に応
じて順次にまたは連続的に投与することができる。

【０２４６】 zvegf3タンパク質を単独でまたは他の造血因子、例えば、IL−3、G−CSF、GM
−CSF、または幹細胞因子と組合わせてを使用して、内皮前駆体幹細胞の拡大お
よび可動化を増強することができる。この方法において拡大することができる細
胞は、骨髄から単離された細胞または血液から単離された細胞を包含する。また
、zvegf3タンパク質を直接個体に投与して、治療した個体内の内皮幹細胞を産生
および分化を増強することができる。患者内で発生させた、または患者に戻した
、幹細胞は次いで体内の虚血領域のモジュレーションにおいてある役割を演じ、
これにより治療効果を提供することができる。

【０２４７】 また、これらの細胞は内皮被覆を欠く領域、例えば、血管移植片、血管ステン
ト、および内皮被覆が損傷または除去された領域（例えば、血管形成領域）の再
内皮化の増強において有効である。zvegf3タンパク質は、また、他の成長因子お
よび分化因子、例えば、アンギオポイエチン−1（Davis他、Cell 87：1161−11
69、1996）と組合わせて使用して、虚血領域（心臓または末梢虚血）、器官移植
片、創傷治癒、および組織移植を包含する、血管新生を必要とする領域における
新しい血管形成の発生および安定化を促進する。

【０２４８】 神経突起の成長および発生をモジュレートし、神経系の構造を区分するために
、zvegf3タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストを使用することができる
。zvegf3タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、それ自体、脊髄およ
び感覚神経突起のアウトグロースを増加することによって末梢性神経疾患の治療
において有効であり、そして卒中、頭部損傷により引き起こされる脳損傷、およ
び脊髄損傷により引き起こされる麻痺後における神経突起のアウトグロースの再
生の療法上の治療の一部分として有効である。また、神経変性疾患、例えば、多
発性硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療において適用するこ
とができる。また、胃組織の発生および神経支配のパターンの伝達において適用
することができる。

【０２４９】 薬学的に使用するために、zvegf3タンパク質は局所または非経口、特に静脈内
または皮下の投与、慣用法に従うデリバリーのために処方される。一般に、医薬
処方物は、zvegf3ポリペプチドを薬学上許容されるビヒクル、例えば、生理食塩
水、緩衝液、水中の5％デキストロース、またはその他と組合わせて含むであろ
う。処方物はさらに1またはそれ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バ
イアル表面上のタンパク質損失を予防するためのアルブミン、およびその他を包
含する。処方方法はこの分野においてよく知られており、そして例えば、下記の
文献に開示されている：Remington：The Science and Practice of Pharma
cy、Gennaro編、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン、第
19版、1995。

【０２５０】 zvegf3は通常約10〜100μg／mlの全体積の濃度で使用されるが、1ng／ml〜100
μg／mlの範囲の濃度を使用することができる。局所適用のために、例えば、創
傷治癒を促進するために、タンパク質は0.1〜10μg／cm²の創傷面積の範囲で適
用され、正確な投与量は許容された標準に従い、治療すべき症状の特質および重
症度、患者の体質、およびその他を考慮して臨床医により決定される。投与量の
決定は当業者のレベルの範囲内である。

【０２５１】 治療用処方物は一般に血管新生に必要な期間、典型的には1〜数カ月にわたっ
て、慢性的症状の治療において、1年またはそれ以上の期間にわたって投与され
るであろう。投与は治療期間にわたって毎日または間欠的に実施される。静脈内
投与は1〜数時間の典型的な期間にわたってボーラス注射または注入によりなさ
れる。また、持続放出性処方物を使用することができる。一般に、zvegf3の治療
的に有効な量は、治療された症状の臨床的に有意な変化、例えば、創傷閉鎖に必
要な時間の臨床的に有意な減少、血管化の有意な改善、病的状態の有意な減少、
または組織学的スコアの有意な増加を産生するために十分な量である。

【０２５２】 本発明のタンパク質は、一次細胞および培養した細胞系統の両方を包含する、
それぞれの細胞型の増殖、分化、移動、または代謝のモジュレーションにおいて
有効である。これに関して肝細胞、造血細胞（幹細胞および成熟骨髄細胞および
リンパ球系細胞を包含する）、内皮細胞、ニューロン細胞、および間葉細胞（線
維芽細胞および平滑筋細胞を包含する）は特に重要である。zvegf3ポリペプチド
は、これらの細胞型の組織培地に約10pg／ml〜約100ng／mlの濃度で添加される
。当業者は認識するように、zvegf3タンパク質は好都合には培地中で他の成長因
子と組合わせることができる。

【０２５３】 実験室の研究分野において、zvegf3タンパク質は、また、分子量標準として；
タンパク質の循環レベルを測定するアッセイにおける試薬として、例えば、zveg
f3タンパク質の過剰または過小産生により特徴づけられる障害の診断において：
または細胞表現型の分析における標準として使用することができる。

【０２５４】 また、zvegf3タンパク質は、それらの活性のインヒビターを同定するために使
用することができる。被験化合物を上に開示したアッセイに添加して、zvegf3タ
ンパク質の活性を阻害する化合物を同定する。上に開示したアッセイに加えて、
レセプターの結合またはzvegf3依存的細胞の応答の刺激／阻害を測定するように
設計された種々のアッセイにおいて、試料をzvegf3活性の阻害について試験する
ことができる。例えば、zvegf3刺激細胞経路に対して応答性であるリポーター遺
伝子構築物で、zvegf3応答性細胞系統をトランスフェクトすることができる。

【０２５５】 この型のリポーター遺伝子構築物はこの分野において知られており、そして一
般にアッセイ可能なタンパク質、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に
作用可能に連鎖された、zvegf3活性化血清応答因子（SRE）を含んでなるであろ
う。リポーター遺伝子の発現のzvegf3刺激の減少により証明されるように、ター
ゲット細胞に対するzvegf3活性を阻害する能力について、候補の化合物、溶液、
混合物または抽出物を試験する。

【０２５６】 この型のアッセイは、細胞表面レセプターに対するzvegf3の結合を直接的にブ
ロックする化合物、ならびにリポーター−リガンドの結合に引き続く細胞経路に
おけるプロセスをブロックする化合物を検出する。別法において、検出可能な標
識（例えば、¹²⁵I、ビオチン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、FITC、および
その他）で標識化したzvegf3を使用して、レセプターに対するzvegf3の結合を直
接的にブロックする能力について、化合物または他の試料を試験することができ
る。

【０２５７】 この型のアッセイにおいて、レセプターに対する標識化zvegf3の結合を阻害す
る被験試料の能力は阻害活性を示し、これは二次アッセイにより確証することが
できる。結合アッセイにおいて使用するレセプターは細胞のレセプターまたは単
離され、固定化されたレセプターであることができる。 zvegf3タンパク質の活
性は、ケイ素をベースとするバイオセンサーのミクロフィジオメーターで測定す
ることができる。このミクロフィジオメーターは、レセプターの結合に関連する
細胞外酸性化速度またはプロトン分泌および引き続く生理学的細胞応答を測定す
る。典型的なこのような装置は、Cytosensor（商標） Microphysiometer（Mole
cular Devices、カリフォルニア州サニーベイル）である。

【０２５８】 種々の細胞の応答、例えば、増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症応答、
調節およびレセプターの活性化、およびその他をこの方法により測定することが
できる。例えば、下記の文献を参照のこと：McConnel他、Science 257：1906−
1912、1992；Pitchford他、Meth. Enzymol. 228：84−108、1997；Arimilli他
、J. Immunol. Meth. 212：49−59、1998；およびVan Liefde他、Eur. J.
Pharmacol. 346：87−95、1998。ミクロフィジオメーターは、付着性または
非付着性真核細胞または原核細胞をアッセイするために使用することができる。
細胞培地における細胞外酸性化の経時的変化を測定することによって、ミクロフ
ィジオメーターは、zvegf3タンパク質、それらのアゴニスト、およびアンタゴニ
ストを包含する、種々の刺激に対する細胞の応答を直接測定する。

【０２５９】 ミクロフィジオメーターを使用してzvegf3応答性真核細胞の応答を測定し、zv
egf3ポリペプチドに対して応答しない対照真核細胞と比較する。zvegf3応答性真
核細胞は、zvegf3のレセプターをその中にトランスフェクトしてｘに対して応答
性の細胞をつくった細胞、ならびにzvegf3に対して自然に応答性の細胞、例えば
、血管または神経組織に由来する細胞を含んでなる。zvegf3に対して暴露されな
い対照に関して、zvegf3ポリペプチドに対して暴露された細胞の応答の変化、例
えば、細胞外酸性化の増加または減少、により測定した差は、zvegf3モジュレー
テッド細胞応答の直接的測定である。

【０２６０】 そのうえ、このようなzvegf3モジュレーテッド応答を種々の刺激下にアッセイ
することができる。こうして、本発明は、zvegf3タンパク質のアゴニストおよび
アンタゴニストを同定する方法を提供する。この方法は、zvegf3ポリペプチドに
対して応答性の細胞を準備し、被検化合物の非存在下に細胞の第1部分を培養し
、被検化合物の存在下に細胞の第2部分を培養し、そして細胞の第1部分に比較し
て、細胞の第2部分の細胞応答の変化、例えば、増加または減少を検出すること
を含んでなる。

【０２６１】 細胞応答の変化は、細胞外酸性化速度の測定可能な変化として示された。zveg
f3タンパク質の存在下にかつ被検化合物の非存在下に細胞の第3部分を培養する
と、zvegf3応答性細胞の陽性対照、および被検化合物のアゴニスト活性をzvegf3
ポリペプチドのそれと比較する対照が得られる。被検化合物の存在および非存在
下にzvegf3タンパク質に対して細胞を暴露することによって、zvegf3のアンタゴ
ニストを同定することができ、ここでzvegf3刺激活性における減少は被検化合物
のアゴニスト活性を示す。

【０２６２】 また、zvegf3刺激経路に対して応答する細胞、組織、または細胞系統を同定す
るために、zvegf3タンパク質を使用することができる。リガンド応答性細胞、例
えば、zvegf3タンパク質に対して応答性の細胞を急速同定するために、前述のミ
クロフィジオメーターを使用することができる。細胞をzvegf3ポリペプチドの存
在または非存在下に培養する。zvegf3の存在下に細胞外酸性化の測定可能な変化
を誘発する細胞は、zvegf3に対して応答性である。次いで応答性細胞を使用して
、前述したzvegf3ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するこ
とができる。

【０２６３】 zvegf3活性（zvegf3アンタゴニスト）のインヒビターは、抗zvegf3抗体、可溶
性zvegf3レセプター（可溶性PDGFアルファレセプターを包含する；例えば、Herr
en他、J. Biol. Chem. 268：15088−15095、1993）、抗レセプター抗体、お
よび他のペプチドおよび非ペプチドの因子、例えば、リボザイム、小さい分子の
インヒビター、およびzvegf3ポリペプチドの血管形成的または有糸分裂誘発的に
不活性であるレセプター結合性フラグメントを包含する。このようなアンタゴニ
ストを使用して、zvegf3の有糸分裂誘発、走化、または血管形成作用をブロック
することができる。

【０２６４】 したがって、発生する腫瘍の血管新生を阻害し、腫瘍細胞の増殖を直接的にブ
ロックし、またはPDGFアルファレセプター仲介プロセスの阻害を通してアポトー
シスを促進することによって、充実性腫瘍の増殖を減少させるとき、これらのア
ンタゴニストは有効であることがある。例えば、実験の証拠はzvegf3がグリア芽
細胞腫により産生されることを示し、zvegf3活性の阻害がこれらの腫瘍の治療に
おいて有効であること示唆する。

【０２６５】 zvegf3アンタゴニストの他の使用は、糖尿病性網膜症、乾癬、関節炎、および
強皮症の治療；および線維症、例えば、瘢痕形成、ケロイド、肝臓線維症、肺線
維症（例えば、珪肺症、アスベスト肺）、腎臓線維症（糖尿病性ネフロパシー）
、および糸球体硬化症の減少を包含する。zvegf3のインヒビターは、また、zveg
f3活性が病原性である、増殖性血管障害の治療において有効であることがある。
このような障害は、血管形成術、動脈血管内膜切除、血管移植、器官移植、また
は血管ステントの設置後のアテローム性動脈硬化症および内膜過形成再狭窄を包
含する。これらの症状は、ある種の因子が臨床的結果に対して有益でありかつ他
の因子が病原性であることがある、複雑な成長因子仲介応答を包含する。

【０２６６】 また、zvegf3のインヒビターは、糖尿病性網膜症および年齢に関係する黄斑変
性を包含する、眼の血管新生の治療において有効であることを証明できる。実験
の証拠は、これらの症状が網膜における低酸素症により誘導される血管形成因子
の発現から生ずることを示唆する。 また、zvegf3アンタゴニストは炎症性障害、例えば、慢性関節リウマチおよび
乾癬の治療において重要である。慢性関節リウマチにおいて、VEGFはパンヌス、
すなわち、軟骨を浸潤しかつ破壊する、広範に血管化した組織、の形成において
重要な役割を演ずることが研究により示唆される。乾癬病変は血管過多であり、
血管形成性ポリペプチドIL−8を過剰発現する。

【０２６７】 zvegf3アンタゴニストは、また、増殖期間におけるVEGFおよびbVEGFの過剰発
現を示す、小児血管腫の治療において有効であることを証明できる。 インヒビターの正確な化学的および物理的特質および治療すべき症状を考慮し
て、インヒビターは一般的に前述したように薬学的使用のために処方される。関
係する決定は当業者のレベルの範囲内である。VEGFおよびbVEGFを包含する、他
の血管形成および脈管形成因子は、病理学的血管新生に関係づけられた。このよ
うな場合において、zvegf3インヒビターを1またはそれ以上のこれらの他の因子
と組合わせることが好都合であることがある。

【０２６８】 本発明のポリペプチド、核酸、および抗体は、癌、障害されたまたは過剰の脈
管形成または血管形成、および神経系の疾患を包含する、細胞喪失または異常な
細胞増殖の診断または治療において使用することができる。腫瘍または異常な細
胞増殖の他の部位を造影するために、標識化zvegf3ポリペプチドを使用すること
ができる。PDGFアルファレセプターに対するzvegf3の結合にかんがみて、zvegf3
アンタゴニストはこのレセプターを発現する腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫、悪
性黒色腫）の治療において有効である。成体動物における血管形成は一般に創傷
治癒および雌の生殖周期に限定されるので、それは病理学的プロセスの非常に特
異的なインジケーターである。血管形成は、例えば、充実性腫瘍、網膜症、およ
び関節炎の発生を示す。

【０２６９】 zvegf3ポリペプチドおよび抗zvegf3抗体は、薬剤、放射性核種およびその他に
直接または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体はin vivoの
診断的または治療的応用に使用することができる。例えば、対応する相補的分子
（例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現する組織または器官を同定
または治療するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができ
る。さらに詳しくは、zvegf3ポリペプチドまたは抗zvegf3抗体、または生物学的
に活性なそのフラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカッ
プリングさせ、抗相補的分子を発現する細胞、組織、または器官を有する哺乳動
物に送出すことができる。例えば、上に開示したセマフォリンにペプチドまたは
非ペプチドの成分をターゲッティングするために、zvegf3のCUBドメインを使用
することができる。

【０２７０】 適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合さ
せることができ、そしてこれらは放射性核種、酵素、基質、コファクター、イン
ヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、およびその他を包含す
る。適当な細胞障害性分子をポリペプチドまたは抗体に直接または間接的に結合
させることができ、そしてこれらは細菌または植物のトキシン（例えば、ジフテ
リアトキシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin）、
リシン、アブリン、サポニン、およびその他）、ならびに治療用ヨウ素−131、
ルテニウム−188またはイットリウム−90を包含する。

【０２７１】 これらをポリペプチドまたは抗体に直接的に結合させるか、あるいは既知の方
法に従い、例えば、キレート化成分を通して、間接的に結合させることができる
。また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシン
に複合化させることができる。検出可能な分子または細胞障害性分子の間接的結
合のために、検出可能な分子または細胞障害性分子を補体／抗補体の対の1メン
バーと複合化することができ、ここで他方のメンバーはポリペプチドまたは抗体
の部分に結合される。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは
典型的な補体／抗補体の対である。

【０２７２】 他の態様において、ポリペプチド−トキシン融合タンパク質または抗体／フラ
グメント−トキシン融合タンパク質は、ターゲッテッド細胞または組織の阻害ま
たは壊滅のために、例えば、癌治療において使用することができる。望ましくな
い細胞の複製および修飾を行う腫瘍または他の組織にサイトトキシンをターゲッ
トするために使用できる、zvegf3ポリペプチドおよびサイトトキシンは、これに
関して特に重要である。

【０２７３】 他の態様において、in vitro細胞障害性（例えば、腫瘍ターゲットに対する
モノクローナル抗体により仲介される）を増強するために、そしてターゲット組
織（例えば、血液および骨髄の癌）のin vivo殺しを増強するために、zvegf3−
サイトカイン融合タンパク質または抗体／フラグメント−サイトトキシン融合タ
ンパク質を使用することができる。一般に、下記の文献を参照のこと：Hornick
他、Blood 89：4437−447、1997）。

【０２７４】 一般に、サイトカインは全身的に投与する場合、毒性である。記載する融合タ
ンパク質はサイトカインを所望の作用部位、例えば、zvegf3に対する結合部位に
ターゲッティングし、これにより増加した局所的濃度のサイトカインを提供する
ことができる。この目的のために適当なサイトカインは、例えば、インターロイ
キン−2および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）を包含する
。このような融合タンパク質は、腫瘍および望ましくない細胞複製を示す他の組
織のサイトカイン誘導殺しを引き起こすために使用することができる。

【０２７５】 なお他の態様において、zvegf3ポリペプチドまたは抗zvegf3抗体を放射性核種
、特にベータ線放射性またはガンマ線放射性放射性核種と複合化し、再狭窄を減
少させるために使用することができる。例えば、必要な放射能線量を送出し、プ
ラシーボリボンを受け取った対照グループよりも血管中の組織成長が減少し、管
腔直径が大きくなるまで、イリジウム−192含浸リボンを患者のステント付き血
管の中に配置した。さらに、血管再生およびステント血栓症は治療グループにお
いて有意に低かった。本明細書において開示するような、放射性核種を含有する
生物学的に活性な複合体のターゲッティングにより、同様な結果が予測される。

【０２７６】 本明細書に開示する生物学的に活性なポリペプチドまたは抗体を静脈内、動脈
内または導管内に送出すことができるか、あるいは意図する作用部位に局所的に
導入することができる。 zvegf3ポリペプチド腸溶性コーティングポリヌクレオチドは、zvegf3活性を増
加または阻害しようとする、遺伝子療法の応用において有効である。例えば、Is
ner他、The Lancet（前掲）は、VEGF遺伝子療法が虚血性四肢における血管の成
長を促進したことを報告した。zvegf3遺伝子療法の追加の応用は、創傷治癒の刺
激、血管移植の再増殖、神経突起の成長の刺激、および癌の増殖および転移の抑
制を包含する。

【０２７７】 本発明は、また、診断に使用するためのポリヌクレオチド試薬を提供する。例
えば、zvegf3遺伝子、zvegf3のDNAまたはRNAを含んでなるプローブ、またはその
サブ配列を使用して、zvegf3遺伝子がヒト患者の染色体4上に存在するかどうか
、あるいは突然変異が起こったかどうかを決定することができる。zvegf3遺伝子
の遺伝子座における検出可能な染色体異常は下記のものを包含するが、これらに
限定されない：異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化お
よび再配列。このような異常は、本発明のポリヌクレオチドを使用して、分子遺
伝学的技術、例えば、制限フラグメント長さの多形性（RFLP）分析、PCR技術を
使用する短い縦列反復（STR）分析、およびこの分野において知られている他の
遺伝学的結合分析技術を用いることによって検出することができる（Sambrook他
、前掲；Ausubel他、前掲；A. J. Marian、Chest 108：255−265，1995）。

【０２７８】 放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物染色体の高い分解能の、隣接マッ
プを構築するために開発された、体細胞遺伝学的技術である（Cox他、Science
250：245−250、1990）。遺伝子配列の部分的または完全な知識は、染色体放射
線ハイブリッドマッピングパネルとともに使用するために適当なPCRプライマー
の設計を可能とする。全体のヒトゲノムをカバーする、商業的に入手可能な放射
線ハイブリッドマッピングパネル、例えば、Stanford G3 RH PanelおよびGen
eBridge 4 RH Panel（Research Genetics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ
）が入手可能である。

【０２７９】 これらのパネルは、遺伝子、配列標識化部位（STS）、および問題の領域内の
他の非多形性および多形性マーカーの急速な、PCRをベースとする染色体の局在
化および排列を可能とする。この技術を使用して、問題の新しく発見された遺伝
子と以前にマッピングされたマーカーとの間の直接比例する物理的距離を確立す
ることができる。

【０２８０】 遺伝子の位置についての正確な知識は、下記の目的を包含する、多数の目的の
ために有効である：1）短い配列間の関係を決定し、種々の形態、例えば、YAC、
BACまたはcDNAクローンの追加の取り囲む遺伝的配列を得ること；2）同一染色体
領域に対する連鎖を示す、遺伝可能な疾患について存在しうる候補の遺伝子を提
供すること；および3）特定の遺伝子がどのような機能を有するかの決定を促進
することができるモデルの生物、例えば、マウスを相互参照すること。

【０２８１】 下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。実施例1 ． zvegf3をコードする配列の部分を含んでなるクローンを、発現された配列タグ
（EST）の公衆用データベースおよび登録データベースにおいて同定した。登録
データベース中のESTに対応する第1クローンを獲得し、配列決定した。それは約
800bpのオープンリーディングフレームを有する2350bpのインサートを含有した
。ORFの5'末端は欠如されていた。第2クローンは、公衆用データベース中のEST
に対応し、次いで配列決定したが、第1クローンから得られた配列を延長しなか
った。第3クローンは、登録データベースから得られ、次いで配列決定した。こ
のクローンは第1クローンよりもほぼ156bp多くを含有したが、また、5'末端を欠
如していた。

【０２８２】 1系列のノザンブロット（Multiple Tissue Northern Blots、Clontech La
boratories，Inc.、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、ノザンを実施し
た。第1登録ESTに対応するクローンをEcoRIおよびBgIIIで消化することによって
、同定されたESTに直接基づく、ほぼ400bpのDNAプローブを発生させた。シリカ
ゲル膜を含有するスピンカラム（QIAquick（商標） Gel Extraction Kit；Qi
agen，Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を使用して、DNAプローブをゲル精
製した。商業的に入手可能なランダムプライム標識化キット（Rediprime（商標
） II、Amersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者の推奨
に従い使用して、プローブを³²Pで放射能標識化した。

【０２８３】 プッシュカラム（NucTrap（商標）カラム；Stratagene、カリフォルニア州ラ
ジョラ；米国特許第5,336,412号参照）を使用して、プローブを精製した。商業
的に入手可能なハイブリダイゼーション溶液（ExpressHyb（商標） Hybridizat
ion Solution；Clontech Laboratories，Inc.、カリフォルニア州パロアルト
）をプレハイブリダイゼーションのために、ノザンブロットのハイブリダイゼー
ション溶液として使用した。ハイブリダイゼーションを65℃において一夜実施し
、次いでブロットを4回2×SSCおよび0.1％のSDS中で室温において洗浄し、次い
で2回0.1×SSCおよび0.1％のSDS中で50℃において洗浄し、1回0.1×SSCおよび0.
1％のSDS中で56℃において洗浄した。

【０２８４】 次いでノザンブロットをフィルムに対して−80℃において一夜露出し、−80℃
において3日間露出した。すべての組織においてほぼ4.0kbに1つの転写物のサイ
ズが見られた。シグナル強度は甲状腺、脊髄および副腎において最も高かった。
シグナル強度は心臓、腎臓、膵臓、前立腺、卵巣、胃、および気管において平均
であった。シグナル強度はすべての他の組織において低かった。

【０２８５】 マウス多重組織ブロット（Clontech LaboratoriesおよびInvitrogen、カリフ
ォルニア州カールスバッド）を使用して、ノザンブロット分析を実施した。第1
登録ESTに対応するクローンをEcoRIおよびBgIIIで消化することによって、同定
されたESTに直接基づく、ほぼ400bpのDNAプローブを発生させた。上に開示した
スピンカラムを使用して、DNAプローブをゲル精製した。上に開示した³²Pでプロ
ーブを放射能標識化した。

【０２８６】 NucTrap（商標）プッシュカラムを使用して、プローブを精製した。ハイブリ
ダイゼーション条件は上に開示した通りであった。ブロットを4回2×SSC、0.1％
のSDS中で洗浄し、次いで2回0.1×SSC中で50℃において洗浄し、フィルムに対し
て−80℃において一夜露出し、−80℃において3日間露出した。ほぼ3.0kbの転写
物のサイズが7日の胚において見られた。3日の露出は11、15および17日の胚にお
いて低い強度のバンドを示した。強度は胚の日齢とともに減少した。ドットブロ
ットは17日の胚において、そして3日の露出で下顎腺においてスポットを示した
。精巣において3日後、ほぼ2.0kbの潜在的バンドが見られた。

【０２８７】 9つの異なる真核生物種からのEcoRI消化DNAを含有する、前もって作られたサ
ザンブロット（ZOO−BLOT、Clontech Laboratories）を使用して、サザンブロ
ット分析を実施した。対応するクローンをEcoRIおよびBgIIIで消化することによ
って、第1登録データベースESTに直接基づく、ほぼ400bpのDNAプローブを発生さ
せた。スピンカラムを使用して、DNAプローブをゲル精製した。ランダムプライ
ミングにより³²Pでプローブを放射能標識化し、プッシュカラムを使用して精製
した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、マウス多重組織ブロットに
ついて上に開示した通りであった。次いでノザンブロットをフィルムに対して−
80℃において一夜露出し、−80℃において3日間露出した。強いバンドがウサギ
、マウス、ラット、およびサルにおいて見られた。

【０２８８】実施例2 ． ヒト唾液腺ライブラリーをPCRによりzvegf3の全長のクローンについてスクリ
ーニングした。このライブラリーは、ベクターpZP5x中で作られた9.6×10⁵クロ
ーンを表す配置されたライブラリーであった。ベクターpZP5xはベクターpZP−9
（American Type Culture Collection、10801 University Blvd.、バージ
ニア州マナッサス、に受け入れ番号98668で受託された）と同一であるが、Asp71
8部位とBamHI部位との間にメタロチオネインプロモーターの代わりにサイトメガ
ロウイルスプロモーターを含有する。

【０２８９】 こうしてプラスミドはSV40初期プロモーターの制御下にジヒドロフォレートリ
ダクターゼ遺伝子およびSV40ポリアデニル化部位、およびCMVプロモーターの制
御下に問題の遺伝子を挿入するためのクローニング部位およびヒト成長ホルモン
（hGH）遺伝子ポリアデニル化部位を含んでなる。36サイクルの60℃のアニーリ
ング温度でオリゴヌクレオチドプライマーZC19,045（配列番号25）およびZC19,0
47（配列番号26）を使用するPCRにより、各々12,000コロニーの80プールを含有
する作業プレートをスクリーニングした。2つの強い陽性のプール58（T−8 F1
−F12）および77（T−7 H1−H12）が存在した。次いで多少の条件を使用するPC
Rにより、転移プレート中の対応するプールをスクリーニングした。

【０２９０】 2つの陽性プールが転移レベルで得られた。陽性プールはT−7 H11およびT−8
H10であった。5'RACE反応を転移プレートのプール上で実施し、フラグメント
を配列決定してzvegf3配列をチェックし、全長のクローンが存在するかどうかを
決定した。PCRのために、オリゴヌクレオチドプライマーZC12,700（配列番号27
）およびZC19,045（配列番号25）を61℃のアニーリング温度において5サイクル
間、次いで55℃において30サイクル間使用した。配列決定において、プールT−7
H11はフレームシフトを有することを示した。転移プレート8のプールF10配列
は正しいように思われたので、このDNAプールをフィルターのリフトにおいて使
用した。

【０２９１】 転移プレート8からのプールF10をプレートし、ナイロン膜（Hybond−N^TM；Ame
rsham Corporation）を使用してフィルターリフトした。5フィルターの各々に
ついてほぼ1200コロニー／プレートを合計ほぼ6000コロニーについてリフトした
。フィルターを配向のために熱い針でマークし、次いで0.5M NaOHおよび1.5M
Tris−HCl、pH7.2中で6分間変性した。次いでフィルターを1.5M NaClおよび0.5
M Tris−HCl、pH7.2中で6分間中和した。紫外線架橋装置（Stratalinker^R、Str
atagene、カリフォルニア州ラジョラ）を1200ジュールにおいて使用して、DNAを
フィルターに固定した。0.25×SSC、0.25％SDS、および1mM EDTAから成る前洗
浄緩衝液中で、フィルターを65℃において前洗浄した。

【０２９２】 溶液を合計3回45分かけて交換して、細胞破片を除去した。フィルターをほぼ3
時間65℃において25mlのExpressHyb（商標）中でプレハイブリダイゼーションし
た。第1登録データベースクローンをEcoRIおよびBgIIIで消化して産生されたほ
ぼ400bpのフラグメントを使用してプローブを発生させ、上に開示したスピンカ
ラムを使用してゲル精製した。上に開示したランダムプライミングにより³²Pで
プローブを放射能標識化し、プッシュカラムで精製した。ExpressHyb（商標）溶
液をフィルターのハイブリダイゼーション溶液のために使用した。ハイブリダイ
ゼーションを65℃において一夜実施した。

【０２９３】 ブロットを65℃の溶液1（2×SSC、0.1％SDS）中で2回リンスし、次いで65℃に
おいて溶液1中で4回洗浄した。フィルターをフィルムに対して−80℃において一
夜露出した。フィルター上に14の陽性が存在した。85クローンを陽性領域から取
り上げ、オリゴヌクレオチドプライマーZC19,045（配列番号25）およびZC19,047
（配列番号26）を使用するPCRにより50℃のアニーリング温度においてスクリー
ニングした。13の陽性が得られ、個々のクローンについてストリーキングした。
24コロニーを取り上げ、前述したようにPCRによりチェックした。6つの陽性が得
られ、それらのうちの2つを配列決定した。両方の配列は同一であり、全長であ
った。この配列を配列番号1に示す。

【０２９４】実施例3 ． 商業的に入手可能なGeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel（Research G
enetics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ）を使用して、ヒトzvegf3遺伝子を染
色体4に対してマッピングした。GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panelは、
93放射線ハイブリッドクローンの各々からのPCRエイブルDNA＋2つの対照DNA（HF
LドナーおよびA23レシピエント）を含有する。公衆に入手可能なWWWサーバー（h
ttp://www−genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）は、ヒトゲノム
のWhitehead Institute／MIT Center for Genome Researchの放射線ハイブ
リッドマップ（「WICGR」放射線ハイブリッドマップ）に関するマッピングを可
能とし、この放射線ハイブリッドマップはGeneBridge 4 Radiation Hybrid
Panelで構成されていた。

【０２９５】 GeneBridge 4 RH Panelでzvegf3をマッピングするために、20μlの反応物
をPCRエイブル96ウェルのマイクロタイタープレート（Stratagene、カリフォル
ニア州ラジョラ）中で構成し、サーマルサイクラー（RoboCycler^R Gradient 9
6；Stratagene）中で使用した。95のPCR反応物の各々は2μlの10×PCR反応緩衝
液（Clontech Laboratories，Inc.、カリフォルニア州パロアルト）、1.6μlの
dNTP混合物（2.5mMの各々、Perkin−Elmer、フォスターシティー、カリフォルニ
ア州）、1μlのセンスプライマーZC20,368（配列番号28）、1μlのアンチセンス
プライマーZC20,369（配列番号29）、2μlの密度増加因子およびトラッキング色
素（RediLoad、Research Genetics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ）、0.4μl
の商業的に入手可能なDNAポリメラーゼ／抗体混合物（50×Advantage（商標）
KlenTaq Polymerase Mix、Clontech Laboratories，Inc.から得られた）、25
ngの個々のハイブリッドクローンまたは対照からのDNA、および20μlの総体積の
ためのxμlのddH₂Oを含有した。

【０２９６】 反応混合物に等モル量の鉱油をオーバーレイし、シールした。PCRサイクラー
条件は次の通りであった：94℃における初期4分の変性；94℃における35サイク
ルの45秒の変性、56℃における45秒のアニーリング、および72℃における75秒の
エクステンション；次いで72℃における7分の最後のエクステンション。2％のア
ガロースゲル（Life Technologies、マリイランド州ガイサースバーグ）上の電
気泳動により、反応生成物を分離した。

【０２９７】 zvegf3は染色体4 WICGR放射線ハイブリッドマップ上でフレームワークマーカ
ーCHLC.GATA72A08から3.56 cR＿3000にマップされることを結果は示した。近接
および遠位のフレームワークマーカーは、それぞれ、CHLC.GATA72A08およびWI−
3936であった。取り囲むマーカーを使用すると、zvegf3遺伝子は統合されたLDB
染色体4地図上の4q28.3領域の中に位置決定される（The Genetic Location D
atabase、University of Southhampton、WWWサーバー：http://cedar:genetic
s.soton.ac.uk/public#html/）。 同一方法を使用して、マウスzvegf3遺伝子は染色体3にマッピングされ、39.7c
Mに位置するフレームワークマーカーD3MiT212に連鎖されている。

【０２９８】実施例4 ． PCRパネルをマウスzvegf3 DNAについてスクリーニングした。このパネルは脳
、骨髄、15日の胚、精巣、唾液腺、胎盤、15日の胚（Clontech Laboratories）
、および17日の胚（Clontech Laboratories）ライブラリーからの8つのcDNA試
料を含有した。

【０２９９】 PCR混合物はオリゴヌクレオチドzc21,222（配列番号38）およびzc21,224（配
列番号39）を含有した。66℃のアニーリング温度において合計35サイクルについ
て2分のエクステンション時間でEx Taq^TMDNAポリメラーゼ（PanVera、ウイスコ
ンシン州マディソン）＋抗体を使用して反応を実施した。DNA試料はPCRによりzv
egf3について陽性であることが見出され、配列決定により確証され、マウス15日
の胚ライブラリー全プールcDNA、マウス15日の胚（Clontech Laboratories）お
よび17日の胚（Clontech Laboratoriesから得られた）、マウス唾液腺ライブラ
リー全プールcDNA、およびマウス精巣ライブラリー全プールcDNA、およびマウス
精巣を含んだ。

【０３００】 マウス15日の胚ライブラリー全プールcDNA、マウス15日の胚mcDNA、および17
日の胚mcDNA PCR生成物からの約600bpのフラグメントを配列決定した。17日の
胚mcDNAおよびマウス15日の胚ライブラリー全プールcDNA PCR生成物からの配列
はフラグメントがマウスzvegf3 DNAであることが確証された。

【０３０１】 マウス15日の胚ライブラリーを全長のzvegf3 DNAについてスクリーニングし
た。このライブラリーはpCMV・SPORT 2ベクター（Life Technologies、マリイ
ランド州ガイサースバーグ）中の9.6×10⁵クローンを表す配列されたライブラリ
ーであった。35サイクルについて66℃のアニーリング温度においてオリゴヌクレ
オチドプライマーzc21,223（配列番号40）およびzc21,224（配列番号39）を使用
して、各12,000コロニーの8プールを含有する作業プレートをスクリーニングし
た。18の陽性が得られた。4プール（A2、A10、B2、およびC4）からのフラグメン
トを配列決定した；すべてはzvegf3をコードすることが確証された。同一反応条
件および作業および源プレートからのプールを使用するスクリーニングの追加の
ラウンドにおいて、1つの陽性プール（5D）が同定された。

【０３０２】 陽性コロニーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。オリジナ
ル源プレート＃5からのプール5Dを約250コロニー／プレートでプレートし、ナイ
ロン膜（Hybond−N（商標）、Amersham Corporation、イリノイ州アーリントン
ハイツ）に移した。合計約1250コロニーについて、5つのフィルターをリフトし
た。フィルターを配向のために熱い針でマークし、次いで0.5M NaOHおよび1.5M
Tris−HCl、pH7.2中で6分間変性した。次いでフィルターを1.5M NaClおよび0
.5M Tris−HCl、pH7.2中で6分間中和した。紫外線架橋装置（Stratalinker^R、S
tratagene、カリフォルニア州ラジョラ）を1200ジュールにおいて使用して、DNA
をフィルターに固定した。

【０３０３】 35サイクルについて66℃のアニーリング温度においてオリゴヌクレオチドプラ
イマーzc21,223（配列番号40）およびzc21,224（配列番号39）およびマウス15日
の胚鋳型を使用して、プローブを発生させた。シリカゲル膜を含有するスピンカ
ラム（QIAquick（商標） Gel Extraction Kit；Qiagen，Inc.、カリフォルニ
ア州バレンシア）を使用して、DNAプローブをゲル精製した。商業的に入手可能
なキット（Rediprime（商標） IIランダムプライム標識化系；Amersham Corp.
、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者の推奨に従い使用して、DNAを³²P
で放射能標識化した。

【０３０４】 商業的に入手可能なプッシュカラム（NucTrap^Rカラム；Stratagene、カリフォ
ルニア州ラジョラ；米国特許第5,336,412号参照）を使用して、プローブを精製
した。0.25×SSC、0.25％SDSおよび１mM EDTAから成る前洗浄緩衝液中で、フィ
ルターを65℃において前洗浄した。溶液を合計3回45分かけて交換して、細胞破
片を除去した。フィルターを一夜65℃において25mlのハイブリダイゼーション溶
液（ExpressHyb（商標） Hybridization Solution；Clontech Laboratories
，Inc.、カリフォルニア州パロアルト）中でプレハイブリダイゼーションし、次
いで同一中で65℃において一夜ハイブリダイゼーションした。

【０３０５】 フィルターを2回65℃において前洗浄緩衝液（0.25×SSC、0.25％SDSおよび１m
M EDTA）中でリンスし、次いで2回前洗浄緩衝液中で65℃において洗浄した。フ
ィルターをフィルムに対して−80℃において2日間露出した。フィルター上に10
の陽性が存在した。3つのクローンを陽性領域から取り上げ、ストリーキングし
、プライマーzc21,223（配列番号40）およびzc21,224（配列番号41）を使用する
PCRにより66℃のアニーリング温度において、これらの3つの陽性からの15の個々
のコロニーをスクリーニングした。2つの陽性を回収し、配列決定した。両方の
配列は同一であり、全長のマウスzvegf3（配列番号42）をコードすることが見出
された。

【０３０６】 アミノ酸配列はマウスおよびヒトzvegf3の間で高度に保存され、全体のアミノ
酸配列の同一性は87％であった。分泌ペプチド、CUBドメイン、間のドメイン、
および成長因子ドメインは、それぞれ、82％、92％、79％および94％のアミノ酸
の同一性を有する。

【０３０７】実施例5 ． マウス多重組織ブロット（Origene、マリイランド州ロックビレおよびClontec
h、カリフォルニア州パロアルト、から入手した）を使用して、ノザンブロッテ
ィングを実施した。5'末端についてプライマーzc21,223（配列番号40）および3'
末端についてプライマーzc21,224（配列番号39）を使用してPCRにより、ほぼ800
bpのDNAプローブを発生させた。35サイクルについて66℃のアニーリング温度に
おいてEx Taq（商標） DNAポリメラーゼ（PanVera）を使用して、反応を実施
した。

【０３０８】 シリカゲル膜を含有するスピンカラムを使用して反応生成物をゲル精製し、商
業的に入手可能な標識化キット（Multiprime（商標） DNA標識化系、Amersham
Corp.）を製造業者の使用説明書に従いを使用して³²Pで標識化した。プッシュ
カラムを使用して、標識化プローブを精製した。商業的に入手可能なハイブリダ
イゼーション溶液（ExpressHyb（商標） Hybridization Solution；Clontech
Laboratories，Inc.）をプレハイブリダイゼーションのために、ノザンブロッ
トのハイブリダイゼーション溶液として使用した。ハイブリダイゼーションを65
℃において一夜実施し、次いでブロットを4回2×SSCおよび0.05％のSDS中で室温
において洗浄し、次いで2回0.1×SSCおよび0.1％のSDS中で50℃において洗浄し
た。

【０３０９】 次いでブロットをフィルムに対して−80℃において2日間および一夜露出した
。複数の転写物サイズが観測された。約3.5および約4.0kbの転写物が7、11、15
および17日の胚において見られ、最強は7日であり、17日に減少した。約3.0kbの
転写物が腎臓、脳、および多分精巣において見られた。約1.0kbの転写物が精巣
、筋肉、および脾臓において見られた。ドットブロットはノザンブロットに対応
した。

【０３１０】実施例6 ． zvegf3遺伝子を発現するトランスジェニック動物をつくるために、成体の生殖
能力のある（スタッド（studs））（B6C3f1、2〜8月齢（Taconic Farms、ニュ
ーヨーク州ジャーマンタウン））、精管切除した雄（ダッド（duds））（B6D2f1
、2〜8月齢（Taconic Farms））、青春期直前の生殖能力のある雌（ドナー）（
B6C3f1、4〜5週齢（Taconic Farms））および成体の生殖能力のある雌（レシピ
エント）（B6D2f1、2〜4月齢（Taconic Farms））を必要とする。

【０３１１】 ドナーを1週間順化させ、次いでほぼ8 IU／マウスの妊馬血清コナドトロピン
（Sigma、ミゾリー州セントルイス）を腹腔内注射し、46〜47時間後、8 IU／マ
ウスのヒト絨毛膜性性腺刺激ホルモン（hCG）（Sigma））を腹腔内注射して過剰
排卵を誘導する。ホルモン注射後、ドナーをスタッドと交配させる。一般にhCG
注射の13時間後、排卵が起こる。交配後の朝、膣栓の存在により交尾が確証され
る。

【０３１２】 外科用スコープ（Leica MZ12 Stero Microscope、Leica、ドイツ国ウェッ
ツラー）下に、受精卵を収集する。輸卵管を収集し、ヒアウロニダーゼ（Sigma
Chemical Co.）を含有する尿分析スライドの中に卵を解放させる。卵をヒアウ
ロニダーゼ中で1回洗浄し、5％CO₂、5％O₂、および90％N₂と37℃においてインキ
ュベートしたウィッテン（Whitten's）W640培地中で2回洗浄した。マイクロイン
ジェクションまで卵を37℃／5％CO₂インキュベーターの中に貯蔵する。

【０３１３】

【表７】

【０３１４】 zvegf3 cDNAを発現ベクターpHB12−8の中に挿入する（第2図参照）。ラット
インスリンIIイントロン（約200bp）およびポリリンカー（Fse I／Pme I／Asc
I）をNru I部位の中に挿入することによって、ベクターpHB12−8をp2999B4か
ら誘導した。ベクターは、10kbのMT−1 5'フランキング配列および7kbのMT−1
3'フランキング配列によりフランクされた、マウスメタロチオネイン（MT−1）
プロモーター（約750bp）およびヒト成長ホルモン（hGH）非翻訳領域およびポリ
アデニル化シグナル（抗体650bp）を含んでなる。cDNAはインスリンIIおよびhGH
の間に挿入されている。

【０３１５】 10〜20μgのプラスミドDNAを線状化し、ゲル精製し、マイクロインジェクショ
ンのために10mM Tris pH7.4、0.25mM EDTA pH8.0の中に5〜10ng／μlの濃度
で再懸濁させる。 温かい、CO₂平衡化鉱油をオーバーレイした1滴のW640を含有する培地の中に含
有された収集した卵の中に、プラスミドDNAをマイクロインジェクトする。DNAを
注射針（内径0.5mm、外径1mmのホウケイ酸塩ガラスの毛管から引き出した）の中
に抜出し、個々の卵の中に注入する。各卵の一倍体前核の一方または両方の中に
注射針を貫通させる。

【０３１６】 数ピコリットルのDNAを前核の中に注入し、核小体と接触させないで注射針を
抜出す。すべての卵が注入されるまで、この手順を反復する。前もってガス処理
したW640培地を含む器官組織培養皿に、首尾よくマイクロインジェクトされた卵
を移して、37℃／5％CO₂インキュベーター中で一夜貯蔵する。

【０３１７】 次の日に、2細胞の胚を擬妊娠レシピエントの中に移す。精管切除したダッド
と交尾させた後、交尾栓の存在によりレシピエントを同定する。レシピエントを
麻酔し、背左側の毛を剃り、外科用顕微鏡に移す。胸郭、鞍部、および後脚によ
り輪郭され、膝と脾臓との間の中途における、腹領域の中央において、皮膚の中
にかつ筋肉壁を通して、小さい切開を作る。生殖器官を小さい外科用布上に出す
。脂肪パッドを外科用布の上に引っ張り出し、乳児止血小鉗子（Roboz、マリイ
ランド州ロックビレ）を脂肪パッドに取り付け、マウスの背の上に吊下げたまま
にし、器官がすべって戻るのを防止する。

【０３１８】 鉱油を含有する微細なトランスファーピペット、次いで交互W640および気泡を
使用して、前日の注射からの12〜17の健康な2細胞胚をレシピエントの中に移す
。膨潤したアンプルを捜し出し、アンプルと嚢との間に輸卵管を保持し、輸卵管
の中にニックを嚢に密接させて28gの針で作り、アンプルまたは嚢を引裂さかな
いように注意する。

【０３１９】 ピペットを輸卵管中のニックの中に移し、胚を吹き込み、第1気泡をピペット
から逃がす。脂肪パッドを腹腔の中におだやかに押し入れ、生殖器官を滑り込ま
せる。腹腔壁を1本の縫合糸で閉じ、皮膚を創傷クリップで閉じる。マウスを37
℃のスライド加温器上で最小4時間回復させる。 レシピエントをケージに対で戻し、19〜21日の妊娠を可能とさせる。出生後、
分娩後19〜21日を経過させた後、離乳させる。離乳子畜を雌雄鑑別し、別々の性
別のケージの中に入れ、0.5cmバイオプシー（遺伝子型決定のたに使用する）を
きれいなハサミで尾から切り取る。

【０３２０】 商業的に入手可能なキット（DNeasy（商標） 96 Tissue Kit；Qiagen、カ
リフォルニア州バレンシア）を製造業者の取扱説明書に従いを使用して、尾の切
り取り物からゲノムDNAを調製する。トランスジェニックベクターのヒト成長ホ
ルモン（hGH）3'UTR部分に対して設計されたプライマーを使用して、PCRにより
、ゲノムDNAを分析する。ヒト配列に対してユニークな領域（ヒトおよびマウス
成長ホルモン3'UTR DNA配列の整列から同定された）を使用して、PCR反応がマ
ウス配列を増幅しなようにする。プライマーzc17,251（配列番号30）およびzc17
,252（配列番号31）はhGHの368塩基対のフラグメントを増幅する。

【０３２１】 さらに、ベクター配列に対するハイブリダイゼーションしかつcDNAインサート
を増幅する、プライマーzc17,156（配列番号32）およびzc17,157（配列番号33）
をhGHプライマーと一緒に使用することができる。これらの実験において、トラ
ンスジーンについて陽性の動物からのDNAは2つのバンドを発生する：hGH3'UTRフ
ラグメントに対応する368塩基対のバンドおよびcDNAインサートに対応する可変
サイズのバンド。 いったん動物がトランスジェニック（TG）であると確証されると、TG雌を野生
型雄と一緒に配置するか、あるいはTG雄を1または2匹の野生型雌と一緒に配置す
ることによって、動物を同系交配系統に戻し交雑する。子供が生まれ、離乳する
ので、雌雄を分離し、遺伝子型決定のためにそれらの尾を切り取る。

【０３２２】 生きている動物におけるトランスジーンの発現をチェックするために、部分的
肝切除を実施する。剣状突起の真下の上腹に、外科的準備をする。無菌の技術を
使用して、小さい1.5〜2cmの切開を胸骨の下に形成し、肝臓の左横小葉を体外に
出す。4−0絹糸を使用して、下の小葉の回りを結束を作って、小葉を体腔の外部
に固定する。

【０３２３】 非外傷性鉗子を使用して結束を保持すると同時に、吸収性Dexon（American C
yanamid、ニュージャージイ州ワイン）の第2ループを第1結束に近接させて配置
する。遠位切断をDexon結束について行い、ほぼ100mgの切除肝組織を無菌のペト
リ皿の中に入れる。切除肝切片を14mlのポリプロピレンの丸底管に移し、液体窒
素中で短時間凍結し、ドライアイス上で貯蔵する。外科部位を縫合糸および創傷
クリップで閉じ、動物のケージを37℃の加熱パッド上に術後24時間配置する。動
物を術後毎日チェックし、創傷クリップを外科後7〜10日後に除去する。

【０３２４】 ABI Prism 7700（PE Applied Biosystems，Inc.、フォスターシティー、
カリフォルニア州）上のRNA溶液のハイブリダイゼーションアッセイまたは実時
間PCRを製造業者の取扱説明書に従い使用して、各トランスジーンのmRNA発現レ
ベルを実施する。

【０３２５】 肝臓特異的アルブミン遺伝子エンハンサーおよび基底プロモーター（「AEOプ
ロモーター」と表示する）を使用して、アデノウイルスベクターを調製した。pA
LBdelta2L（Pinkert他、Genes Dev. 1：268−276、1987）からの2.5kbのNotI
／EcoRVフラグメントおよびラットインスリンIIイントロン、FseI／PmeI／AscI
ポリリンカー、およびヒト成長ホルモンポリA配列を含んでなる850bpのNruI／No
tI DNAセグメントを商業的に入手可能なファージミドベクター（pBluescript（
商標） KS（＋）；Stratagene、カリフォルニア州ラジョラ）の中に挿入するこ
とによって、アルブミンプロモーター構築物（pAEOと表示する）を構築した。マ
イクロインジェクションのために、プラスミドをNotIで消化して発現カセットを
遊離させる。

【０３２６】 上皮細胞特異的ケラチン遺伝子（K14）プロモーター（Vssar他、Proc. Natl'
l. Acad. Sci. USA 86：1563−1567、1989）を使用して、追加のアデノウイ
ルスベクターを構築した。プライマーZC20,180（配列番号34）およびZC20,181（
配列番号35）を使用してPCRにより、全長のヒトzvegf3をコードする1038bpのオ
ープンリーディングフレームを増幅して、最適化された開始コドンおよびフラン
キング5'PmeIおよび3'AscI部位を導入した。生ずるPmeI／AscIフラグメントをpK
FO114のポリリンカーの中にサブクローニングした。

【０３２７】 このポリリンカーは、ヒトケラチン14（K14）プロモーター、ヒトケラチン14
（K14）プロモーター（Staggers他、″Seqence of the promoter for the
epidermal keratin gene，K14″、GenBank accession ＃U11076、1994、
の配列に基づくヒトゲノムDNA［Clontech Laboratories，Inc.から入手した］
から増幅されたほぼ2.3kbのフラグメント）、次いで異種イントロン（pIRES1hyg
（Clontech Laboratories，Inc.；HuangおよびGorman，Nucleic Acids Res.
18：937−947、1990、参照、からの294bpのBstXIフラグメント）、PmeI／AscI
ポリリンカー、およびヒト成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナル（627b
pのSmaI／EcoRIフラグメント；Seeburg、DNA 1：239−249、1982、参照）を含
んでなる基底ケラチノサイト制限トランスジェニックベクターである。

【０３２８】 トランスジーンインサートをプラスミドバックボーンからNotI消化により分離
し、そしてB6C3F1Tacマウスまたは同系交配FVB／NTacマウスの交配から受精卵を
本質的に下記の文献に記載されているように擬妊娠雌の中にマイクロインジェク
トし、移植した：Malik他、Mol. Cell. Biol. 15：2349−2358、1995。368bp
の診断産物を増幅するためにヒト成長ホルモンポリAシグナル（ZC17,252、配列
番号31；およびZC17,251、配列番号30）に対して特異的なプライマーを使用して
、ゲノムテイルDNA上でPCRにより、トランスジェニックファウンダー（founders
）を同定した。ファウンダーをC57BL／6TacまたはFVB／NTacマウスと交配するこ
とによって、トランスジェニック系統を開始した。

【０３２９】 本質的に前述したようにMT−1、K14、およびAEOプロモーターを使用して、ト
ランスジェニックマウスを発生させた。4匹のMT−1／zvegf3トランスジェニック
マウスを発生させた。1匹の動物（雌）において、亜鉛誘導後にほぼ800個の分子
のzvegf3 RNA／細胞が肝臓において産生された。この動物は拡大した肝臓およ
び脾臓を有した。また、肝シヌソイド細胞の増殖および余分の髄質造血が観測さ
れた。1匹のK14／zvegf3トランスジェニックマウス（雌）は、小さい体重で低い
発現レベル、低いヘマトクリット、および低い血小板計数を示した。低い発現レ
ベルを有する1匹のAEO／zvegf3トランスジェニックマウス（雄）は、肝シヌソイ
ド細胞の増殖を示した。

【０３３０】実施例7 ． 相同的組換えにより、zvegf3をコードするポリヌクレオチドのすべてまたは一
部分を含んでなる発現プラスミドを構築する。zvegf3挿入点をフランクするベク
ター配列に対応する5'および3'末端にフランキング領域を有する配列番号1のポ
リヌクレオチド配列を使用して、zvegf3 cDNAのフラグメントをPCRにより単離
する。PCRプライマーの各々は、5'→3'の向きでベクターからの40bpのフランキ
ング配列およびzvegf3のオープンリーディングフレームからのアミノおよびカル
ボキシル末端に対応する17bpを包含する。

【０３３１】 0.8％の低融点アガロース（SeaPlaque GTG（商標）；FMC BioProducts、メ
イン州ロックランド）ゲル上で分析のために1×TBE緩衝液を使用して、100μlの
PCR反応のうちの10μlを実施する。5μlの1M NaClおよび250μlの無水エタノー
ルの添加により、PCR反応の残りの90μlを沈降させる。SmaIで切断したプラスミ
ドpZMP6をPCRフラグメントとの組換えのために使用する。

【０３３２】 pRS316（American Type Culture Collection、10801 University Boulev
ard、バージニア州20110−2209、マンナス、に受け入れ番号77145で受託された
）から取った酵母遺伝的因子、ポリオウイルスからの内部リボソームエントリー
部位（IRES）、およびトランスメンブランドメインのC末端においてトランケー
トされたCD8の細胞外ドメインを使用してpZP9（American Type Culture Coll
ection、10801 University Boulevard、バージニア州20110−2209、マンナス
、に受け入れ番号98668で受託された）から、プラスミドpZMP6を構築した。

【０３３３】 pZMP6は、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、コーディング配列の挿
入のための多重制限部位、停止コドン、およびヒト成長ホルモンターミネーター
を有する発現カセットを含有する、哺乳動物発現ベクターである。このプラスミ
ドは、また、大腸菌（E. coli）複製起点；SV40プロモーター、エンハンサーお
よび複製起点、DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを含んでなる、哺乳動物
選択可能なマーカー発現単位；ならびにサッカロマイセス・セレビシエ（S. ce
revisiae）における選択および複製に必要なURA3およびCEN−ARS配列を含有する
。

【０３３４】 100μlの競合酵母（S. cerevisiae）細胞を独立して10μlの前述のものから
の種々のDNA混合物と組合わせ、0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移
す。0.75kV（5kV／cm）、∽オーム、25μFの電力供給設定を使用して、酵母／DN
A混合物をエレクトロパルスする。各キュベットに600μlの1.2Mソルビトールを
添加し、酵母を2×300μlのアリコートで2つのURA−Dプレート上にプレートし、
30℃においてインキュベートする。約48時間後、単一プレートからのUra⁺形質転
換体を1mlのH₂Oの中に再懸濁させ、短時間回転させて酵母細胞を沈降させる。

【０３３５】 細胞ペレットを1mlの溶解緩衝液（2％トリトンX−100、1％SDS、100mM NaCl
、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA）の中に再懸濁させる。300μlの酸−洗浄ガラ
スビーズおよび200μlのフェノール−クロロホルムを含有するエッペンドルフ管
に、500μlの溶解混合物を添加し、1分の間隔で2または3回渦形成し、エッペン
ドルフ遠心機中で最大速度で5分間回転する。300μlの水性相を新鮮な管に移し
、DNAを600μlのエタノール（EtOH）で沈降させ、次いで4℃において10分間遠心
する。DNAペレットを10μlのH₂Oの中に再懸濁させる。

【０３３６】 0.5〜2mlの酵母DNAプレプおよび40μlの細胞を使用して、エレクトロコンピテ
ント大腸菌（E. coli）宿主細胞（Elecromax DH10B^TM細胞；Life Technologi
es，Inc.、マリイランド州ガイサースバーグ、から入手した）の形質転換を実施
する。細胞を1.7kV、25μF、および400オームにおいてエレクトロパルスする。
エレクトロポレーション後、1mlのSOC（2％Bacto（商標） Tryptone（Difco、
ミシガン州デトロイト）、0.5％酵母エキス（Difco）、10mM NaCl、2.5mM KCl
、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、20mM グルコース）を250μlのアリコートで4枚
のAMPプレート（LBブロス（Lennox），1.8％Bacto（商標） Agar（Difco）、10
0mg／l アンピシリン）上にプレートする。

【０３３７】 zvegf3についての正しい発現構築物を収容する個々のクローンを制限消化によ
り同定して、zvegf3インサートの存在を確認し、種々のDNA配列が互いに正しく
結合されていることを確証する。陽性クローンのインサートを配列分析に付す。
商業的に入手可能なキット（QIAGEN Plasmid Maxi Kit、Qiagen、カリフォル
ニア州バレンシア）を製造業者の使用説明書に従い使用して、大規模プラスミド
DNAを単離する。正しい構築物をpZMP6／zvegf3と表示する（第3図）。

【０３３８】実施例8 ． CHO DG44細胞（Chasin他、Somat. Cell. Mol. Genet. 12：555−666、19
86）を10cm組織培養皿の中に入れ、Ham's F12／FBS培地（Ham's F12培地、Lif
e Technologies）、5％胎仔ウシ血清（Hyclone、ユタ州ローガン）、1％L−グ
ルタミン（JRH Biosciences，カンサス州レネクサ）、1％ピルビン酸ナトリウ
ム（Life Technologies）中で37℃、5％CO₂において一夜ほぼ50％〜70％のコン
フルエンシーに成長させる。

【０３３９】 次いで無血清（SF）培地処方物（Ham's F12、10mg／mlのトランスフェリン、
5mg／mlのインスリン、2mg／mlのフェツイン、1％L−グルタミンおよび1％ピル
ビン酸ナトリウム）中で、膜濾過した水中のポリカチオン脂質2,3−ジオレイル
オキシ−N−［2（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−N,N−ジメチル−プ
ロパンイミニウム−トリフルオロアセテートおよび中性脂質ジオレイルホスファ
チジルエタノールアミンの3：1（w／w）リポソーム処方物を使用して、リポソー
ム仲介トランスフェクションによりプラスミドpZMP6／zvegf3で細胞をトランス
フェクトする。プラスミドpZMP6／zvegf3をSF培地で640μlの全最終体積に希釈
して15mlの管の中に入れる。

【０３４０】 35μlのLipofectamine（商標）を605μlのSF培地と混合する。Lipofectamine
（商標）混合物をDNA混合物に添加し、室温においてほぼ30分間インキュベート
する。5mlのSF培地をDNA：Lipofectamine（商標）混合物に添加する。細胞を1回
5mlのSF培地でリンスし、吸引し、DNA：Lipofectamine（商標）混合物を添加す
る。細胞を37℃において5時間インキュベートし、次いで6.4mlのHam's F12／10
％FBS、1％PSNを各プレートに添加する。プレートを37℃において一夜インキュ
ベートし、次の日にDNA：Lipofectamine（商標）混合物を新鮮な5％FBS／Ham's
培地と交換する。

【０３４１】 トランスフェクション後第3日に、細胞を成長培地中のT−175フラスコの中に
分割する。トランスフェクション後第7日に、細胞をFITC抗CD8モノクローナル抗
体（Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ）で染色し、次いで抗FITC複合
化磁気ビーズ（Miltenyl／Biotec）で染色する。商業的に入手可能なカラム（mi
ni−MACSカラム；Miltenyl Biotec）を製造業者の使用説明書に従い使用して、
CD8陽性細胞を分離し、ヌクレオシドを含むが、50nMのメトトレキセート（選択
培地）を含むDMEM／Ham's F12／5％FBSの中に入れる。

【０３４２】 細胞をサブクローニングのために選択培地中において96ウェルの皿中で0.5、1
および5細胞／ウェルの密度でプレートし、ほぼ2週間成長させた。ウェルを培地
の蒸発についてチェックし、このプロセスの間に必要に応じて200μl／ウェルに
戻す。プレート中のコロニーの大きい百分率がコンフルエンシー近くになったと
き、ドットブロットによる分析のために、各ウェルから100μlの培地を収集し、
細胞に選択培地を供給する。上清をドットブロット装置中のニトロセルロースフ
ィルターに適用し、フィルターを真空炉中で100℃において処理してタンパク質
を変性する。

【０３４３】 フィルターを625mM Tris−グリシン、pH9.1、5mM β−メルカプトエタノー
ル中で65℃において10分間インキュベートし、次いで2.5％の脱脂粉乳Western
A緩衝液（0.25％のゼラチン、50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、5mM EDT
A、0.05％のIgelpal CA−630）中で4℃において回転式震盪培養機上で一夜イン
キュベートする。フィルターを抗−HRP複合体と2.5％の脱脂粉乳Western A緩衝
液中で室温において回転式震盪培養機上で1時間インキュベートする。次いでフ
ィルターを室温においてPBS＋0.01％のTween 20中の15分／洗浄で3回洗浄する
。

【０３４４】 フィルターを化学発光試薬（ECL（商標）直接的標識化キット；Amersham Cor
p.、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者の使用説明書に従い使用して展
開し、フィルム（Hyperfilm ECL、Amersham）に対してほぼ5分間露出する。陽
性クローンを96ウェルの皿からトリプシン処理し、大規模化およびウェスタンブ
ロットによる分析のために選択培地中の6ウェルの皿に移す。

【０３４５】実施例9 ． pZMP6／zvegf3でトランスフェクトしたBHK細胞（実施例7）において、全長のz
vegf3タンパク質を産生させた。BHK570細胞（ATCC CRL−10314）を10cmの組織
培養皿の中にプレートし、37℃、5％CO₂においてDMEM／PBS培地（DMEM、Gibco／
BRL High Glucose；Life Technologies）、5％胎仔ウシ血清（Hyclone、ユタ
州ローガン）、1mM L−グルタミン（JRH Biosciences、カンサス州レネクサ）
、1mM ピルビン酸ナトリウム（Life Technologies）中で一夜ほぼ50〜70％の
コンフルエンシーに成長させた。

【０３４６】 次いで無血清（SF）培地（10mg／mlのトランスフェリン、5mg／mlのインスリ
ン、2mg／mlのフェツイン、1％L−グルタミンおよび1％ピルビン酸ナトリウムを
補充したDMEM）中において、細胞をリポソーム仲介トランスフェクション（Lipo
fectamine（商標）；Life Technologies、を使用する）によりpZMP6／zvegf3で
トランスフェクトした。プラスミドをSF培地で640μlの全最終体積に希釈して15
mlの管の中に入れた。35μlの脂質混合物を605μlのSF培地と混合し、この混合
物を室温においてほぼ30分間インキュベートした。5mlのSF培地をDNA：脂質混合
物に添加した。

【０３４７】 細胞を1回5mlのSF培地でリンスし、吸引し、DNA：脂質混合物を添加した。細
胞を37℃において5時間インキュベートし、次いで6.4mlのDMEM／10％FBS、1％PS
N培地を各プレートに添加した。プレートを37℃において一夜インキュベートし
、次の日にDNA：脂質混合物を新鮮な5％FBS／DMEM培地と交換した。トランスフ
ェクション後3日に、細胞を選択培地（DMEM＋5％FBS、1％L−Gln、1％NaPyr、1
μMメトトレキセート）中でT−175フラスコの中に分割した。トランスフェクシ
ョン後10日に、各トランスフェクションからのメトトレキセート耐性コロニーの
2つの150mmの培養皿をトリプシン処理し、細胞をプールし、T−162フラスコの中
に入れ、大規模培養に移した。

【０３４８】実施例10 ． 本質的に実施例7に開示されているようにして、zvegf3の成長因子ドメインの
哺乳動物細胞発現ベクターを構築した。最適化t−PA分泌シグナル配列をコード
する配列（米国特許第5,641,655号）に結合した成長因子ドメイン（配列番号2の
残基235〜345）のコーディング配列を、CMVプロモーターから下流の線状化pZMP1
1ベクターに結合した。プラスミドpZMP11は、CMV前初期プロモーター、マウス免
疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域からのコンセンサスイントロン、コーディ
ング配列の挿入のための多重制限部位、停止コドン、およびヒト成長ホルモンタ
ーミネーターを有する発現カセットを含有する、哺乳動物発現ベクターである。

【０３４９】 このプラスミドは、また、ポリオウイルスからのIRES因子、トランスメンブラ
ンドメインのC末端においてトランケートされたCD8の細胞外ドメイン、SV40プロ
モーターを有する選択可能なマーカー発現単位、エンハンサーおよび複製起点、
DHFR遺伝子、およびSV40ターミネーター、およびサッカロマイセス・セレビシエ
（S. cerevisiae）における選択および複製に必要なURA3およびCEN−ARS配列を
含有する。生ずるベクター、pZMP11／zv3GF−otPAと表示する、を第4図に示す。 BHK570を本質的に実施例8に開示されているようにpZMP11／zv3GF−otPAでトラ
ンスフェクトし、培養した。

【０３５０】実施例11 ． アデノウイルスベクターを構築するために、それぞれ5'および3'末端にPmeIお
よびAscI部位を添加するプライマーを使用してPCRにより、ヒトzvegf3のタンパ
ク質コーディング配列を増幅した。PCRプライマーZC20,180（配列番号34）およ
びZC（配列番号35）を次のようにしてPCR反応において全長のzvegf3 cDNA鋳型
とともに使用した：1サイクル、95℃で5分間；次いで15サイクル、95℃で1分間
、61℃で1分間、および72℃で1.5分間；次いで72℃で7分間；次いで4℃のソーク
。PCR反応生成物をTAE緩衝液（0.04M Tris−酢酸塩、0.001M EDTA）中の1.2％
の低融点アガロースゲル上に負荷した。

【０３５１】 zvegf3 PCR生成物を濾過から切除し、シリカゲル膜スピンカラムを含んでな
る（QIAuick（商標） PCR Purifcation Kit；Qiagen，Inc.）を製造業者の使
用説明書に従い使用して精製した。次いでPCR生成物をPmeIおよびAscIで消化し
、フェノール／クロロホルム抽出し、EtOH沈降させ、そして20mlのTE（Tris／ED
TA、pH8）中で再水和した。

【０３５２】 次いで1038bpのzvegf3フラグメントをトランスジェニックベクターpTG12−8（
また、pHB12−8として知られている；実施例6参照）のPmeI−AscI部位の中に結
合し、エレクトロポレーションにより大腸菌（E. coli）DH10B（商標）コンピ
テント細胞の中に形質転換した。zvegf3を含有するクローンをプラスミドDNAミ
ニプレプにより同定し、次いでPmeIおよびAscIで消化した。陽性クローンを配列
決定して、構築物の中に欠失または他の異常が存在しないことを保証した。zveg
f3 cDNAの配列が確証された。

【０３５３】 商業的に入手可能なキット（Maxi Kit、Qiagen，Inc.）を使用してDNAを調製
し、1038bpのzvegf3 cDNAをPmeIおよびAscI酵素によりpTG12−8ベクターから解
放させた。cDNAを1％の低融点アガロースゲル上で単離し、ゲルから切除した。
ゲルスライスを70℃において溶融し、DNAを等しい体積のTris緩衝化フェノール
で2回抽出し、EtOHで沈降させた。DNAを10μlのH₂Oの中に再懸濁させた。

【０３５４】 zvegf3 cDNAを修飾したpAdTrack−CMV（He、T−C他、Proc. Natl'l. Acad.
Sci. USA 95：2509−2514、1998）のEcoRV−AscI部位の中にクローニングし
た。この構築物は緑色蛍光タンパク質（GFP）マーカー遺伝子を含有する。GFP発
現を推進するCMVプロモーターをSV40プロモーターと置換し、そしてSV40ポリア
デニル化シグナルをヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルと置換した。さら
に、自然ポリリンカーをFseI、EcoRV、およびAscI部位と置換した。pAdTrack−C
MVのこの修飾された形態をpZyTrackと命名した。商業的に入手可能なDNA結合お
よびスクリーニングキット（Fast−Link（商標）キット；Epicentre Technolog
ies、ウイスコンシン州マディソン）を使用して、結合を実施した。

【０３５５】 ミニプレプDNAをFseIおよびAscIで消化することによって、zvegf3を含有する
クローンを同定した。プラスミドを線状化するために、生ずるpZyTrack zvegf3
プラスミドのほぼ5μgをPmeIで消化した。ほぼ1μgの線状化プラスミドを200ng
のスーパーコイルドpAdEasy（He他、前掲）とともに大腸菌（E. coli）BJ5183
細胞（He他、前掲）の中に共形質転換した。Bio−Rad Gene Pulserを2.5kV、2
00オームおよび25μFaにおいてｕｓｓｇ、共形質転換を実施した。25μg／mlの
カナマイシンを含有する4枚のLBプレート上に、全体の形質転換混合物をプレー
トした。

【０３５６】 最小のコロニーを取り上げ、LB／カナマイシン中で拡張させ、標準DNAミニプ
レプ手順により、組換えアデノウイルスDNAを同定した。FseIおよびAscIで組換
えアデノウイルスDNAを消化すると、zvegf3インサートが同定された。組換えア
デノウイルスDNAを大腸菌（E. coli）DH10B^TMコンピテント細胞の中に形質転換
し、Maxi Kit（Qiagen，Inc.）をキットの使用説明書に従い使用してDNAを調製
した。

【０３５７】 ほぼ5μgの組換えアデノウイルスDNAを、PacI酵素（New England Biolabs）
で、20〜30UｎｏPacIを含有する100μlの反応値で37℃において3時間消化した。
消化されたDNAを等しい体積のフェノール／クロロホルムで2回抽出し、エタノー
ルで沈降させた。DNAペレットを10μlの蒸留水の中に再懸濁させた。前日に接種
し、60〜70％のコンフルエンシーに成長させた、QBI−293A細胞（Quantum Biot
echnolgies，Inc.、Montreal、Qc. Canada）のT25フラスコをPacI消化DNAでト
ランスフェクトした。PacI消化DNAを無菌HBS（150mM NaCl、20mM HEPES）で50
μlの総体積まで希釈した。

【０３５８】 別々の管において、20μlの1mg／mlのN−［1−（2,3−ジオレオイルオキシ）
プロピル］−N,N,N,−トリメチル−アンモニウム塩（DOTAP）（Boehringer Man
nheim、インジアナ州インジアナポリス））をHBSで100μlの総体積に希釈した。
DNAをDOTAPに添加し、ピペットで上下させることによっておだやかに混合し、室
温において15分間放置した。培地を293A細胞から除去し、1mMのピルビン酸ナト
リウム、0.1mMのMEM非必須アミノ酸、および25mMのHEPES緩衝液（Life Technol
ogies、マリイランド州ガイサースバーグ、から入手した試薬）を含有する5mlの
無血清最小必須培地（MEM）アルファで洗浄した。

【０３５９】 5mlの無血清MEMを293A細胞に添加し、37℃に保持した。DNA／脂質混合物を293
A細胞のT25フラスコに滴下し、おだやかに混合し、37℃において4時間インキュ
ベートした。4時間後、DNA／脂質混合物を含有する培地を吸引除去し、5％の胎
仔ウシ血清を含有する5mlの完全MEMと置換した。トランスフェクトされた細胞を
GFP発現およびフォーカス（ウイルスプラーク）の形成についてモニターした。

【０３６０】 組換えアデノウイルスDNAで293A細胞をトランスフェクション後7日に、細胞を
GFPタンパク質を発現し、フォーカス（ウイルスの「プラーク」）を形成し始め
た。細胞スクレーパーを使用して粗製ウイルスライゼイトを収集して、293A細胞
のすべてを収集した。ライゼイトを50mlの円錐形管に移した。ウイルス粒子の大
部分を細胞から解放するために、3回の凍結／融解サイクルをドライアイス／エ
タノール浴および37℃の水浴中で実施した。

【０３６１】 粗製ライゼイトを増幅して（一次（1°）増幅）zvegf3 rAdVライゼイトの作
業「ストック」）を得た。ほとんどコンフルエント（80〜90％）293A細胞の10×
10cmのプレートを20時間前までに構成し、200μlの粗製rAdVライゼイトを各10cm
のプレートに添加し、白色光顕微鏡下にCPEおよび蛍光顕微鏡下にGFPの発現を見
ることによって48〜72時間モニターした。293A細胞のすべてがCPE（細胞変性作
用）を示したとき、粗製rAdVライゼイトについて記載したように、1°ストック
ライゼイトを収集し、凍結／融解サイクルを実施した。

【０３６２】 zvegf3 rAdVの二次（2°）増幅を次のようにして実施した：細胞が80〜90％
のコンフルエントであるようにして、293A細胞の20枚の15cmの組織培養皿を調製
した。20mlの５％MEM培地以外はすべて除去し、各皿を300〜500μlの1°増幅rAd
Vライゼイトを接種した。48時間後、293A細胞をウイルス産生から溶解し、ライ
ゼイトを250mlのポリプロピレン遠心びんの中に収集し、rAdVを精製した。 NP−40洗浄剤を0.5％の最終濃度で粗製ライゼイトのびんに添加して、すべて
の細胞を溶解した。びんが倒れないようにできるだけ速く撹拌するために、びん
を回転プラットフォーム上に10分間配置した。20,000×Gで15分間遠心すること
によって、破片を沈降させた。上清を250mlのポリカーボネート遠心びんに移し
、0.5体積の20％PEG8000／2.5M NaClを添加した。

【０３６３】 びん氷上で一夜震盪させた。びんを20,000×Gで15分間遠心し、表面を漂白溶
液の中に廃棄した。無菌細胞スクレーパーを使用して、2本のびんからの白色の
ウイルス／PEG沈降物を2.5mlのPBSの中に再懸濁させた。生ずるウイルス溶液を2
mlのマイクロフージ管の中に入れ、マイクロフージ中で14,000×Gで15分間遠心
して、追加の細胞破片を除去した。2mlのマイクロフージ管からの上清を15mlの
ポリプロピレンスナップキャップ管の中に移し、CsClで1.34g／mlの密度に調節
した。CsClを溶解し、1mlのこの溶液は1.34gであった。この溶液を3.2mlのポリ
カーボネートの厚い壁の遠心管に移し、25℃において348,000×Gで3〜４時間回
転した。ウイルスは白色バンドを形成した。広い孔のピペット先端を使用して、
ウイルスバンドを収集した。

【０３６４】 勾配からのウイルスは、細胞上で使用する前に除去しなくてはならなかったCs
Clを大量に有した。商業的に入手可能なイオン交換カラム（Sephadex^R G−25を
詰めたPD−10カラム；Pharmacia Biotech.、ニュージャージイ州ピスカタウェ
イ）を使用して、ウイルス調製物を脱塩した。カラムを20mlのPBSと平衡化した
。ウイルスを負荷し、コロニーの中に展開させた。5mlのPBSをカラムに添加し、
8〜10滴の画分を収集した。各画分の1：50希釈物の光学密度を分光光度計で260n
mにおいて測定した。

【０３６５】 明瞭な吸収ピークが画分7〜12の間に存在した。これらの画分をプールし、1：
25の希釈物の光学密度（OD）を測定した。ODを下記式を使用してウイルス濃度に
変換した：（260nmにおけるOD）（25）（1.1×10¹²）＝ヴィリオン／ml．zvegf3
rAdVの1：25希釈のODは0.145であり、4×10¹²ヴィリオン／mlのウイルス濃度
が得られた。 ウイルスを貯蔵するために、グリセロールを精製したウイルスに15％の最終濃
度に添加し、おだやかであるが、効果的に混合し、−80℃においてアリコートで
貯蔵した。

【０３６６】 Quantum Biotechnolgies，Inc.（カナダ国モントリオール）が開発したプロ
トコルに従い、組換えウイルスの感染性を測定した。簡単に述べると、アッセイ
すべき各組換えウイルスについて2％の胎仔ウシ血清を含有するMEM中において、
2枚の96ウェルの組織培養プレートに1×10⁴の293A細胞／ウェルを播種した。24
時間後、2％の胎仔ウシ血清を含有するMEM中において、1×10^-2から1×10^-14の
各ウイルスの10倍希釈物を調製した。100μlの各希釈物を20ウェルの各々の中に
入れた。37℃において5日後、ウェルが細胞変性作用（CPE）について陽性または
陰性であるかどうかを読み、そして「プラーク形成単位／ml」（PFU）を計算し
た。

【０３６７】 使用したTCID₅₀処方は前述のQuantum Biotechnolgies，Inc.に従った。力価
（T）をプレートから測定し、ここでウイルスを10^-2から10^-14に希釈し、そして
感染後5日に読んだ。各希釈において、CPEについて陽性のウェル／ウェルの総数
の比（R）を測定した。 未希釈ウイルス試料の力価を計算するために：ファクター、「F」＝1＋d（S−
0.5）；ここで「S」は比（R）の合計である；そして「d」は希釈系列のLog10で
あり、例えば、「d」は10倍の希釈系列について1に等しい。未希釈試料の力価は
T＝10^(1+F)＝TCID₅₀／mlである。TCID₅₀／mlをpfu／mlに変換するために、0.7を
力価（T）の計算における指数関数から減じられる。 zvegf3アデノウイルスは1.8×10¹⁰pfu／mlの力価を有した。

【０３６８】実施例12 ． zvegf3アデノウイルスを使用するマウスの処理は、肝臓および脾臓の変化に導
いた。肝臓は淡い色であり、非常に拡大されており、小葉の先端における血管は
拡大されていた。肝臓はまたシヌソイド細胞増殖を示した。また、変化は肝細胞
（栄養過度、変性、および壊死）において見られ、アデノウイルス感染の非特異
的作用である可能性が最も高かった。脾臓の変化は、髄質外の造血の増加から成
り、これは拡大した脾臓サイズに相関された。

【０３６９】実施例13 ． アデノウイルス処置マウスおよびトランスジェニックマウスからのデータは、
試験動物における造血および／または血管形成の増加と一致した。したがって、
末梢血の検査、組織学的検査、および組織の中へのブロモデオキシウリジン（Br
dU）の組込みにより決定して、アデノウイルス的に送出されたzvegf3が造血また
はリンパ球系区画における細胞の増殖を刺激するかどうか試験する研究を実施し
た。

【０３７０】 マウス（雄、C57B1、7週齢）を3つのグループに分割した。第0日に、親または
zvegf3アデノウイルスを第1（n＝11）および第2（n＝12）グループに、それぞれ
、尾静脈を介して投与し、各マウスは約0.1mlの体積の約1×10¹¹の粒子を受け取
った。各マウスに新しく調製したBrdU溶液の3mgを殺すほぼ24および12時間前に2
回腹腔内投与した。第2、4、6、8、および10日に、各処置グループから2匹のマ
ウスおよび1または2匹の未処置マウスを殺し、組織および血液を収集した。試料
を完全血液算定（CBC）および血清化学について分析し、そしてマニュアル示差
的血液および骨髄子孫細胞分析のためにスライドを調製した。1つの大腿、肺、
心臓、胸腺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、十二指腸、および腸間膜リンパ節を標準
的組織学的分析およびBrdU組込みの評価に付した。十二指腸のライニングをBrdU
組込みの対照組織として使用した。

【０３７１】 さらに、zvegf3アデノウイルス粒子の投与量のほぼ半分を受け取った2匹のマ
ウスおよび親アデノウイルスの全投与量受け取った1匹のマウスを殺し、第19日
に前述したように分析した。 各マウスからの肝臓片をアデノウイルスタンパク質のmRNAアッセイのために取
って置いて、アデノウイルス調製物の発現の時間経過を検査した。

【０３７２】 第6日に開始して、いずれかのアデノウイルスで処置した動物の大部分は、未
処置マウスに比較して、可視の拡大した肝臓および脾臓を有した。zvegf3アデノ
ウイルス処置マウスの肝臓は、親ウイルスで処置した動物よりも、淡い色に見え
る傾向を有した。シヌソイド細胞の増殖が肝臓において観測された。視的検査に
より、これらの細胞が星状細胞および／または線維芽細胞であることが示唆され
た。脾臓の色は両方のグループにおいて同一であった。zvegf3アデノウイルスを
受け取った動物の大部分は、より淡い大腿骨幹を有し、骨髄は薄い色を有した。

【０３７３】 zvegf3処置動物と親ウイルス処置動物との間において、末梢血CBCは血小板数
の起こりうる差を示したが、RBCまたはWBCの数において差を示さなかった。未処
置および親ウイルス処置グループに比較して、zvegf3グループは第2、4、6、お
よび8日においてにより低い血小板数を有したが、第10日においてそうではなか
った。zvegf3グループにおける平均血小板体積（個々の血小板の平均サイズ）は
、また、より大きい傾向があり、より大きい、未熟の血小板個体数の相対的増加
と一致した。

【０３７４】 BrdU標識化は、腎臓、主として髄質、より少ない程度に、皮質における細胞増
殖の増加を示した。増殖する細胞は間細胞であるように思われ、これらは線維芽
細胞および／または糸球体間質細胞を有することがある。

【０３７５】実施例14 ． zvegf3は大動脈リングアウトグロースアッセイにおいてアッセイした（Nicosi
aおよびOttinetti、Laboratory Investigation 63（1）：115、1990；Villasc
hiおよびNicosia、Am. J. Physiolgy 143（1）：181−190、1993）。胸郭大
動脈を1〜2月齢のSD雄ラットから分離し、ハンクス緩衝化塩溶液を含有するペト
リ皿に移した。大動脈を追加のハンクス緩衝化塩溶液でフラッシュして血液を除
去し、大動脈を取り囲む外膜組織を注意して除去した。清浄した大動脈を無血清
EBM基底培地（Clontech、カリフォルニア州サンディエゴ）を含有するペトリ皿
に移した。メスを使用してほぼ1mmの切片をスライスすることによって、大動脈
リングを得た。大動脈を所定位置に保持するために使用した大動脈の端を使用し
なかった。

【０３７６】 リングを新鮮なEBM基底培地中でリンスし、Matrigel（Becton Dickinson、マ
サチュセッツ州ベッドフォード）で被覆した24ウェルのプレートのウェルの中に
個々に入れた。リングを追加の50μlのMatrigelでオーバーレイし、37℃におい
て30分間配置して基質をゲル化した。100単位／mlのペニシリン、100μg／mlの
ストレプトマイシンおよびHEPES緩衝液を補充したEBM基底無血清培地中で被験試
料を希釈し、1ml／ウェルで添加した。バックグラウンドの対照はEBM基底無血清
培地単独であった。塩基性FGF（R & D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）
を20ng／mlで陽性対照として使用した。

【０３７７】 zvegf33pZyTrackアデノウイルス（実施例11）をウェルに添加し、500,000細胞
の細胞計数および5000粒子／細胞の感染多重度を仮定した。ヌルZyTrackアデノ
ウイルス（zPar）を対照として使用した。試料を最小四つ組で添加した。リング
を37℃において5〜7日間インキュベートし、成長について分析した。多数の、め
くらの観測者により、成長なしとして0および最大成長として4を使用して、大動
脈アウトグロースにスコアをつけた。zvegf3アデノウイルスは対照に比較してア
ウトグロースの有意な増加を生成し、他の潜在的成長因子（例えば、bFGF）に匹
敵した。追加の実験において、精製したzvegf3成長因子ドメインは、また、ほぼ
50ng／mlまで低い濃度においてアウトグロースの有意な増加を引き起こした。

【０３７８】 zvegf3応答性細胞をアルファ平滑筋アクチン（SMCの特徴を示す）、フォン・
ウィルブランド因子（内皮細胞の特徴を示す）、コラーゲン1型（繊維芽細胞の
特徴を示す）、およびビンメチン（すべての3つの細胞型を染色する）について
染色された。観測された染色パターンは細胞が繊維芽細胞および平滑筋細胞であ
ることを示し、周細胞を含むことがあった。

【０３７９】実施例15 ． 30匹のマウス（雄、c57BL6）の各々に2.5×10⁵のルイスラットの肺癌細胞（Am
erican Type Culture Collection、バージニア州マンナッサス、から入手し
た）を皮下注射した。細胞の移植後3日に、マウスを10匹の3グループに分割し、
生理食塩水、zvegf3アデノウイルス（1×10¹¹粒子）、または対照アデノウイル
ス（1×10¹¹粒子）を注射した。第14日に寸法の測定によりそして殺す時（第21
日）に全腫瘍重量により、腫瘍の成長をモニターした。肺、肝臓および腫瘍を組
織学的方法により検査した。腫瘍サイズは対照アデノウイルスグループに比較し
て有意に低かった（p＜0.007）、生理食塩水処置グループと有意に異ならなかっ
た（p＝0.6）。転移の発生率は低く、グループの間で異ならなかった。

【０３８０】実施例16 ． zvegf3の骨髄増殖活性を骨髄抑制のマウスモデルにおいて試験した。第0日に
、骨髄抑制グループにおけるマウス（雄C57B1）に450cGyの放射線および1.2mgの
カルボプラチンを投与する。マウスの第2組は未処置ままである。第0日および第
7日の間において、精製したzvegf3、トロンボポイエチン、またはベヒクル対照
を皮下投与する。第7、6、10、15、および20日に、マウスを麻酔下に眼窩後の穿
刺により採血する。血液試料をCBCについて分析し、そしてマニュアル示差的お
よび未熟細胞の分析のためにスライドを作る。

【０３８１】 血球系統の回復が観測されたとき、動物を殺す。顕微鏡分析および骨髄子孫ア
ッセイのために、骨髄を収集する。髄質外造血を測定する組織学的検査のために
、脾臓および肝臓を収集する。肺、胸腺、心臓、精巣、および腎臓を組織学的に
分析する。

【０３８２】実施例17 ． 2匹の雌ニュージーランド白ウサギをペプチドhuzvegf3−1（配列番号2の残基8
0〜104）、huzvegf3−2（配列番号2の残基299〜314）、huzvegf3−3（N末端にcy
s残基をもつ配列番号2の残基299〜326）、またはhuzvegf3−4（C末端にcys残基
をもつ配列番号2の残基195〜225）で免疫化することによって、ポリクローナル
抗ペプチド抗体を調製した。Applied Biosystems 431Aペプチド合成装置（App
lied Biosystems，Inc.、フォスターシティー、カリフォルニア州）を製造業者
の使用説明書に従い使用して、ペプチドを合成した。

【０３８３】 次いでペプチドhuzvegf3−1、huzvegf3−3、およびhuzvegf3−4を担体タンパ
ク質マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にシステイン
残基（Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード）を通して複合化し
た。グルタルアルデヒドを使用して、ペプチドhuzvegf3−2を担体タンパク質KLH
に複合化した。ウサギの各々に完全フロインドアジュバント（Pierce Chemical
Co.）中の200μgの複合体ペプチドを腹腔内（IP）注射し、次いで不完全フロ
インドアジュバント中の100μgのペプチドを3週毎にブースターIP注射した。第3
ブースター注射の投与後7〜10日に、動物から採血し、血清を収集した。次いで
ウサギにブースター投与し、3週毎に採血した。

【０３８４】 10mgのそれぞれのペプチド／gのCNBr−Sepharose（商標）を使用して調製した
CNBr−Sepharose（商標） 4Bペプチドカラム（Pharmacia Biotech）を使用し
て、huzvegf3ペプチド特異的抗体を精製し、次いでPBS中で一夜透析した。抗体
ターゲットとして1μg／mlの適当なペプチドを使用して、ELISA力価チェックに
よりペプチド特異的huzvegf3抗体を特性決定した。huzvegf3−1ペプチド特異的
抗体はELISAによりその適当な抗体ターゲットに対して500pg／mlの検出下限（LL
D）を有し、ELISAにより全長の組換えタンパク質（NBP−融合物；実施例28参照
）を認識する。huzvegf3−2はELISAにより1ng／mlのLLDを有した。huzvegf3−3
はELISAにより50ng／mlのLLDを有し、ウェスタンブロット分析により組換えタン
パク質を認識した。huzvegf3−4はELISAにより50ng／mlのLLDを有し、ウェスタ
ンブロット分析により組換えタンパク質を認識した。

【０３８５】実施例18 ． huzvegf3−1およびhuzvegf3−3ペプチドに対する抗体を使用してウェスタンブ
ロッティングにより、組換えzvegf3を分析した。上に開示したBHK細胞、および
慣用法に従いアデノウイルスベクターでトランスフェクトした293およびMVEC（
微小血管内皮）において、タンパク質を産生させた。試料を電気泳動させ、室温
においてHoeffer Scientific Instruments（カリフォルニア州サンフランシス
コ）TE22型ブロッターを撹拌しながら計器マニュアル中の使用説明書に従い使用
してニトロセルロース（0.2μm；Bio−Rad Laboratories、カリフォルニア州ハ
ーキュレス)に移した。

【０３８６】 25mMのTris塩基、200mMのグリシン、および20％のメタノールを含有する緩衝
液中で、500mAにおいて1時間または50mAにおいて12時間転移を実施した。次いで
フィルターを緩衝液A（50mM Tris（pH7.4）、5mM EDTA（pH8.0）、0.05％のIg
epal CA−630、150mM NaCl、0.25％のゼラチン）中の10％の脱脂粉乳で室温に
おいて10分間ブロックした。ニトロセルロースを急速にリンスし、次いで2.5％
の脱脂粉乳を含有する緩衝液A中で一次抗体を添加した。ブロットを室温におい
て1時間または4℃においておだやかに震盪または揺動しながら一夜インキュベー
トした。インキュベーション後、ブロットを緩衝液A中で各10分間3回洗浄した。

【０３８７】 2.5％の脱脂粉乳を含有する緩衝液A中で1：4000に希釈した二次抗体（セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼに対して複合化したヤギ抗ウサギIgG；Rockland Inc
.、ペンシルベニア州ギルバーツヴィレ）を添加し、ブロットを室温においてお
だやかに震盪または揺動しながら1時間インキュベートした。次いでブロットを
緩衝液A中で各回分間3回洗浄し、次いでH₂O中の急速にリンスした。商業的に入
手可能な化学発光基質試薬（1：1に混合されたSuperSignal^R ULTRA試薬1および
2；Pierce Chemical Co.から入手した試薬）を使用してブロットを展開し、フ
ィルム（Hyperfilm ECL（商標）；Amercham Pharmacia Biotec.、ニュージャ
ージイ州ピスカタウェイ）に1秒〜5分の範囲の時間の間または必要に応じて露出
した。

【０３８８】 3−1抗体を使用して、BHK細胞において産生された全長のzvegf3は還元性条件
下に2つのバンド（Mr≒46kDaおよび30kDa）を示した。より大きいバンドは全長
のzvegf3モノマーと一致し、そしてより小さいバンドはCUBドメイン＋ドメイン
間領域と一致した。還元性条件下に、Mr≒78kDaにおいて主要なバンドが存在し
、これはニ量体化した、全長の分子であるように見えた。2つのより小さい、少
量のバンドがまた観測された。同様な結果が3−3抗体を使用して得られたが、還
元性条件下に、より小さいバンドはMr≒22kDaにおいて展開した。より小さいバ
ンドを引き続いて分析すると、それが成長因子ドメインから単離されたことが示
された。

【０３８９】 3−3抗体を使用して分析した組換え成長因子ドメイン（BHK細胞において産生
された）は、還元性条件下にMr≒18kDaの広いバンドとして展開した。非還元性
条件下に、この前処理はMr≒16および28kDaの2つのバンドとして展開し、成長因
子ドメインの二量体およびモノマーの両方の形態を示した。 無血清培地中で増殖した293細胞において産生されたzvegf3タンパク質は、予
測された全長のタンパク質と一致するサイズを示した。ブロットを抗体3−1また
は3−3でプロービングしたとき、タンパク質は還元性条件下にMr≒47kDaにおい
て展開し、そして非還元性条件下にMr≒78において展開した。この培地に血清を
添加すると、BHK産生物質において見られるように、タンパク質は切断された。

【０３９０】 1％の血清の存在下に増殖したMVEC細胞は、3−3抗体を使用して、還元性条件
下にMr≒23kDaにおいて展開し、そして非還元性条件下にMr≒28において展開す
るzvegf3タンパク質を産生した。これらの結果が示すように、成長因子ドメイン
のモノマーおよび二量体の形態を認識する抗体を使用すると、タンパク質は切断
される。MVEC細胞を無血清培地に使用すると、全長のタンパク質が観測された。

【０３９１】実施例19 ． 組換えzvegf3成長因子ドメインは、細胞ファクトリー中で増殖したBHK570細胞
において産生された。3×15リットルの培養物を収集し、0.2μのフィルターを使
用して培地を濾過した。20×vs5Kカットオフに濃縮し、1.25×に2倍に連続希釈
した培地の試料をウェスタンブロット分析することによって、発現レベルを推定
した。タンパク質濃度をアミノ酸分析により測定した、MBP−zvegf3融合タンパ
ク質標準（実施例28参照）からの同一ブロット上のシグナルと、シグナル強度を
比較した。発現レベルは終始一貫して0.25〜0.35mg／lの培地であった。

【０３９２】 カチオン交換クロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーとの組
合わせにより、コンディショニングした培地からタンパク質を精製した。0.3M
NaClを含有する0.1Mの酢酸、pH3.0で60％：40％（培地：酢酸）の比で希釈して
、プロセス流れを14mSの導電度、pH4.0において送出した。この流れを強カチオ
ン交換樹脂（Poros（商標） HS；PerSeptive Biosystems、マサチュセッツ州
フラミンガム）に直径2cmのカラム中の50mlのベッド体積で20ml／分の流速で送
出した。50mlのベッドは45リットルの培地を処理しかつターゲットタンパク質の
すべてを捕捉するために十分であった。

【０３９３】 0.15M NaClを含有する10mMの酢酸、pH4.0中で10カラム体積でカラムを洗浄し
た後、10mMの酢酸、pH4.0中の2M NaClに対する線状勾配を形成することによっ
て、結合したタンパク質を溶離した。2mlのTris、pH8.0を含有する管の中に、10
mlの画分を捕捉した。カチオン交換クロマトグラフィーからの試料を、SDS−PAG
Eと銀染色およびウェスタンブロッティングとの組合わせによりzvegf3について
分析した。zvegf3成長ドメインは0.2〜0.5M NaClにおいて溶離された。タンパ
ク質含有画分をプールした。直径2cmのカラム中の25mlのベッドのクロマトグラ
フィー媒質（Toso Haas Etherクロマトグラフィーカラム）を、25mMのリン酸
ナトリウム緩衝液中の1.8Mの(NH₄)₂SO₄中でpH7.4において平衡化した。

【０３９４】 カチオン交換工程からのプールしたタンパク質を、25mMのリン酸ナトリウム緩
衝液、pH7.0中で1.8Mの(NH₄)₂SO₄に調節した。この流れをカラムの上に10ml／分
で流した。いったん負荷が完結したとき、カラムを10カラム体積の平衡化緩衝液
で洗浄した後、平衡化緩衝液および40mMのホウ酸、pH8.8の間で形成した10カラ
ム体積の勾配で溶離した。zvegf3成長因子ドメインタンパク質は、1.5〜1.0Mの(
NH₄)₂SO₄の勾配においてかなり早く溶離された。この時点において、タンパク質
は40〜60％の純度であり、主要な汚染物質はインスリン様成長因子結合性タンパ
ク質4（IGFBP4）であった。

【０３９５】 HIC（Ether）クロマトグラフィーからのタンパク質をC4逆相HPLCカラムに適用
した。zvegf3成長因子ドメインタンパク質は、36％のアセトニトリルにおいて溶
離された。この物質はほぼ20％のIGFBP4をまだ含有した。

【０３９６】実施例20 ． カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およ
びニッケルアフィニティークロマトグラフィーの組合わせにより、組換えzvegf3
成長因子ドメインを細胞コンディショニングした培地から精製する。タンパク質
を強カチオン交換媒質上に捕捉し、本質的に実施例19に開示したように溶離する
。溶離されたタンパク質をエーテル樹脂（Poros（商標） ET；PerSeptive Bio
systems）上の疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製する。次い
で、0.25M NaClを含有する25mMのリン酸ナトリウム緩衝液中でpH7.0〜8.0にお
いて、部分的に精製されたzvegf3タンパク質をニッケルキレート樹脂に結合させ
た。

【０３９７】 結合したタンパク質をpH5.0にまで下降するpH勾配またはイミダゾール勾配で
溶離する。ニッケルカラムからの溶出液をpH6.0において1Mの(NH₄)₂SO₄、20mMの
MES（モルフィリノエタンスルホン酸）に調節し、1Mの(NH₄)₂SO₄、20mMのMES、p
H6.0中で平衡化されたフェニルエーテル疎水性相互作用クロマトグラフィーカラ
ム（Poros^R PE、PerSeptive Biosystems）に通過させる。IGFBP4および少量の
汚染物質はカラム上に保持される。通過した画分は高度に精製されたzvegf3を含
有し、これを収集する。収集したタンパク質を慣用法（例えば、透析、イオン交
換クロマトグラフィー）に従い脱塩する。

【０３９８】実施例21 ． 組換えzvegf3を、ヒト大動脈平滑筋細胞（HAoSMC；Clontech Corp.、マリイ
ランド州ウォークスビレ）およびヒト臍静脈内皮細胞（UHVEC；Clontech Corp.
）に対する有糸分裂誘発活性について分析した。HAoSMCおよびUHVECを96ウェル
の培養プレートの中に5,000細胞／ウェルの密度でプレートし、10％のウシ胎児
血清を含有するDMEM中で37℃においてほぼ24時間成長させた。インスリン（5μg
／ml）、トランスフェリン（20μg／ml）、およびセレン（16pg／ml）を含有す
る無血清DMEM／Ham's F−12（ITS）中で細胞を24時間インキュベートすること
によって、細胞を休止させた。アッセイ時に、培地を除去し、試験試料をウェル
にトリプリケートで添加した。

【０３９９】 試験試料は全長のzvegf3を発現するアデノウイルス感染HaCaTヒトケラチノサ
イト細胞（Boukamp他、J. Cell. Biol. 106：761−771、1988）からのコンデ
ィショニングされた培地（CM）、BHK細胞中で発現された精製成長因子ドメイン
、または親アデノウイルス感染細胞（Zpar）からの対照培地のいずれかから成っ
ていた。10K膜フィルターを装備した15mlの遠心フィルター装置を使用して、CM
を10倍に濃縮し、次いでITSで3×に希釈し、細胞に添加した。親緑色蛍光タンパ
ク質発現アデノウイルスで感染したHaCaT細胞から、対照CMを発生させ、zvegf3C
Mと同じように処理した。

【０４００】 0.1％のBSAを含有する緩衝液中の精製タンパク質をITS培地中で1μg／ml〜1ng
／mlの濃度に連続希釈し、試験プレートに添加した。0.1％のBSAの対照緩衝液を
最高濃度のzvegf3タンパク質と同様に希釈し、プレートに添加した。［³H］チミ
ジンの組込みを測定するために、1μCi／ウェルの最終活性のために、20μlのDM
EM中の50μCi／mlのストックを細胞に直接添加した。さらに24時間後、［³H］チ
ミジンの吸収を測定することによって、有糸分裂誘発活性を評価した。

【０４０１】 培地を除去し、細胞が分離するまで、細胞を0.1mlのトリプシンとインキュベ
ートした。試料収集装置（FlterMate^TM；Packard Instrument Co.、コネチカ
ット州メリデン）を使用して、細胞を96ウェルのフィルタープレート上に収集し
た。次いでプレートを65℃において15分間乾燥し、40μl／ウェルのシンチレー
ションカクテル（Microscint^TM O；Packard Instrument Co.）を添加した後
、シールし、マイクロプレートシンチレーションカウンター（Topcount^TM；Pack
ard Instrument Co.）で計数した。

【０４０２】 表8に記載する結果が証明するように、zvegf3 CMはHAoSM細胞に対して対照CM
よりもほぼ1.5倍高い有糸分裂誘発活性を有し、そして精製したタンパク質は緩
衝液対照よりも最大1.8倍の［³H］チミジンに組込みを引き起こした。

【０４０３】

【表８】

【０４０４】 表9に記載する結果が証明するように、zvegf3 CMは対照CMに比較してHUVECに
対して有糸分裂誘発活性をもたず、そして精製したタンパク質は緩衝液対照より
も最大1.3倍の［³H］チミジンに組込みを引き起こした。

【０４０５】

【表９】

【０４０６】実施例22 ． レセプターの結合および活性化のインデューサーとして、組換えzvegf3タンパ
ク質を細胞内カルシウム放出の刺激についてアッセイした。空洞のあるホウケイ
酸塩カバーガラスのスライド中で細胞を培養した。アッセイの日に、2μMのfura
−2AM（Molecular Probes Inc.、オレゴン州エウジーン、から入手した）を含
有するKRW緩衝液（KrebsRingerWollheim；140mMのNaCl、3.6mMのKCl、0.5mMのNa
H₂PO₄、0.5mMのMgSO₄、2mMのNaHCO₃、3mMのグルコース、1.5mMのCaCl₂、10mMのH
EPES、pH7.4）中で細胞を室温において30分間インキュベートし、KRW緩衝液で2
回洗浄し、室温において少なくとも15分間放置した後、試験すべき成長因子また
は細胞コンディショニングした培地（CM）を添加した。

【０４０７】 蛍光比イメージング（340nmにおける励起を380nmにおける励起で割った値）に
より、細胞質ゾルのカルシウムの変化を測定した。油対物レンズ（Nikon 40×
Plan Fluor）を装備した倒立蛍光顕微鏡（Nikon TE300）を使用して、ディ
ジタルイメージングを実施した。Princeton CCDディジタルカメラを使用して影
像を獲得し、ソフトウェア（Universal Imaging Metaflourソフトウェア）を
使用して解析した。データを表10に記載する。

【０４０８】

【表１０】

【０４０９】実施例23 ． ヒトニューロンおよびグリア細胞系統A172（グリア芽細胞腫）、NTera 2（テ
ラトカルシノーマニューロン前駆体；Stratagene Cloning Systems、カリフォ
ルニア州ラジョラ、から入手した）、U−87 MG（グリア芽細胞腫／星状細胞腫
）、U−118 MG（グリア芽細胞腫）、U138 MG（グリア芽細胞腫）、U373 MG（
グリア芽細胞腫）からのRNAを使用して、ノザンブロット分析を実施した。記載
したものを除外して、細胞系統はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（American Type Culture Collection、バージニア州マンナッサス）から
入手した。10μgのRNA／レーンを使用してブロットを調製した。

【０４１０】 ヒトzvegf3 cDNAをEcoRIおよびBgIIIで消化することによって、ほぼ400bpのD
NAプローブを発生させた。DNAプローブをゲル電気泳動させ、次いでシリカゲル
膜を含有するスピンカラム（QIAquick（商標） Gel Extraction Kit；Qiagen
，Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出を実施した。商業的に入
手可能なキット（Rediprime（商標） II ランダムプライム標識化システム；A
mersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者の使用説明書に従
い使用して、プローブを³²Pで放射能標識化した。プッシュカラムを使用して、
プローブを精製した。商業的に入手可能な溶液（ExpressHyb（商標） Hybridiz
ation Solution；Clontech Laboratories，Inc.）中で、ハイブリダイゼーシ
ョンを65℃において一夜実施した。

【０４１１】 次いでブロットを2×SSCおよび0.05％SDS中で室温において4×洗浄し、次いで
0.1×SSCおよび0.1％SDS中で50℃において2×洗浄した。A172、U−87 MG、U−1
18 MG、U−138 MG、およびU373 MG試料において、1つの転写物のサイズがほ
ぼ4kbにおいて検出された。シグナル強度は、U373 MG、U−118 MG、およびU−
87 MGについて最高であった。

【０４１２】実施例24 ． 1mCiのNa−¹²⁵I（Amersham Corp.）を含有する438μlのPBSと、10μgの組換
えzvegf3成長因子ドメインタンパク質と組合わせた。1つの誘導化、非多孔質ポ
リスチレンビーズ（IODO−Beads；Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフ
ォード）を添加し、反応混合物を氷上で1分間インキュベートした。ヨウ素化タ
ンパク質を非組込み¹²⁵Iからゲル濾過、緩衝液PBS、0.25％ゼラチンを使用する
溶離により分離した。活性画分は4.9μg／mlの¹²⁵I−zvegf3と組合わせ、比活性
は4.3×10⁴cpm／ngであった。

【０４１３】 下記の細胞系統を24ウェルの組織培養皿のウェルの中にプレートし、3日間成
長培地中で培養した： 1. ラット大動脈リングのプール（ARC） 2. リング大動脈リングのクローン（ARC＃14B） 3. ヒト臍静脈内皮細胞、継代培養5（HUVEC） 4. ヒト外膜繊維芽細胞、継代培養4（AOAF） 5. ヒト大動脈平滑筋細胞、継代培養5（AOSMC） 6. ヒト網膜周細胞、継代培養4（周細胞）

【０４１４】 細胞を氷冷結合緩衝液（0.1％のBSA、20mMのTris：HCl、pH7.2を含有するRPMI
）で1回洗浄し、次いで試験細胞を含有する培養皿の3つのウェルの各々に250μl
の下記の溶液を添加した。 10ng／mlの¹²⁵I−zvegf3を含む5mlの結合緩衝液中で結合溶液を調製し、そし
て： 1. 添加せず。 2. 1μg／mlのzvegf3。 3. 1μg／mlのVEGF（R & D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）。 4. 1μg／mlのPDGF−BB。 5. 5μg／mlのPDGFレセプターα（R & D Systems）。 6. 5μg／mlのPDGFレセプターβ（IgG Fc−レセプター細胞外ドメイン融合
物）。

【０４１５】 反応混合物を氷上で2時間インキュベートし、次いで1mlの氷冷結合緩衝液で3
回洗浄した。細胞のNaOH抽出物をガンマ計数することによって、結合した¹²⁵I−
zvegf3を定量した。 第5図に示す結果は、PDGFレセプターαに対するzvegf3の結合を示す。データ
を結合した¹²⁵I−zvegf3／ウェルとしてグラフにする。エラーのバーは標準偏差
を示す。 ラット肝臓星細胞、継代培養6（Greenwel他、Laboratory Ivestigation 69
：210−216、1993）を添加して、実験を反復した。星細胞は周細胞に匹敵するレ
ベルでzvegf3に結合した。

【０４１６】実施例25 ． 表面増強レーザー脱着およびイオン化（SELDI）計器（ProteinChip^TM、Cipher
gen Biosystems、カリフォルニア州パロアルト）を使用して質量分析により、P
DGFアルファおよびベータレセプターに対する組換えzvegf3の結合を測定した。
この実験のために、8スポットの前もって活性化した表面アレイを使用した。こ
のアミン活性化されたチップに、プロテイン−A（Zymed Laboratories，Inc.、
カリフォルニア州サンフランシスコ）を1mg／mlの濃度で添加し、チップを4℃に
おいて4時間インキュベートした。

【０４１７】 1MのエタノールアミンpH8.0でブロックし、引き続いて洗浄（PBS中の0.1％の
トリトンX−100中で1回；100mMの酢酸ナトリウム、pH4.5中で1回；100mMのTris
−HCl、pH8.5、0.5MのNaCl中で1回；PBS中で1回）した後、IgG Fc−レセプター
細胞外ドメイン融合タンパク質（PDGFアルファレセプター、PDGFベータレセプタ
ー、または非標識化対照レセプター）を添加し、チップを4℃において一夜イン
キュベートした。PBS中で3回洗浄した後、250μlのzvegf3（300ng／ml）、PDGF
−AA、またはPDGF−BBを添加し、チップを4℃において一夜インキュベートした
。チップを0.05％のトリトンX100、100mMのHEPES、pH7.2で2回、次いで脱イオン
水で2回洗浄した。

【０４１８】 チップを室温において乾燥させた後、アセトニトリルおよび1％のトリフルオ
ロ酢酸の50：50混合物中の0.3μlのシナピンＡＣＤ（Ciphergen Biosystems）
を2回添加した。レセプターに結合したリガンドは洗浄後チップ上に保持され、
引き続いて質量分析により分析した。各リガンドについてのFcのみの対照に対し
てPDGFレセプターの質量分析を比較することによって、結合についての＋または
−の帰属を行った。データを表11に示す。

【０４１９】

【表１１】

【０４２０】実施例26 ． ノザンブロット分析を下記の細胞系統からのポリ（A）RNAを使用して実施した
：ヒト血管細胞系統HUVEC（ヒト臍静脈内皮細胞；Cascade Biolgics，Inc.、オ
レゴン州ポートランド）、HPAEC（ヒト肺動脈内皮細胞；Cascade Biolgics）、
HAEC（ヒト大動脈内皮細胞；Cascade Biolgics）、AoSMC（大動脈平滑筋細胞；
Clontech Corporation、マリイランド州ウォークスビレ）、UASMC（臍動脈平滑
筋細胞；Clontech Corp.）、HISM（ヒト間質性平滑筋；American Type Cultu
re Collection、CRL 7130）、SK5（ヒト皮膚繊維芽細胞；Dr. Russel Ross
、University of Washington、から入手した）、NHLF（正常ヒト肺繊維芽細胞
；Clontech Corp.）、NHDF−neo（正常ヒト皮膚繊維芽細胞−新生児；Clontech
Corp.）；および白血病細胞系統Daudi、Raji、Molt−4、K562（すべてはClont
ech Laboratories，I c.から入手した）、HL60、Jurkat、およびHut 78。

【０４２１】 RNAを2μg／レーンで負荷した。全長のzVEGF3クローンをPvuIおよびSfuIで消
化することによって、ほぼ490bpのDNAプローブを発生させた。DNAプローブを電
気泳動させ、シリカゲル膜を含有するスピンカラム（QIAquick（商標） Gel E
xtraction Kit；Qiagen，Inc.、カリフォルニア州バレンシア）を使用して精製
した。商業的に入手可能なキット（Rediprime（商標） II ランダムプライム
標識化システム；Amersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業
者の使用説明書に従い使用して、プローブを³²Pで放射能標識化した。プッシュ
カラムを使用して、プローブを精製した。Expresshyb（Clontech、カリフォルニ
ア州パロアルト）をブロットのハイブリダイゼーション溶液のために使用した。

【０４２２】 商業的に入手可能な溶液（ExpressHyb（商標） Hybridization Solution；C
lontech Laboratories，Inc.、カリフォルニア州パロアルト）中で、ハイブリ
ダイゼーションを65℃において一夜実施した。次いでブロットを2×SSCおよび0.
05％SDS中で室温において4回洗浄し、次いで0.1×SSCおよび0.1％SDS中で50℃に
おいて2回洗浄した。NHLF、NHDF−neo、SK5、UASMC、HAEC、AoSMC、Jurkat、Hut
78において、1つの転写物のサイズがほぼ4kbにおいて検出された。シグナル強度
は、UASMC、SK5、NHLF、およびNHDF−neoについて最高であった。

【０４２３】実施例27 ． 血管内皮再生および内膜過形成に対するzvegf3の作用を、バルーン損傷頸動脈
モデルにおいて試験する。デリバリーベクターとして、アデノウイルスを使用す
る。

【０４２４】 アデノウイルスの感染性および血管壁において得られた遺伝子の発現レベルを
測定するために、ラットを後に開示するようにバルーン損傷させ、緑色蛍光タン
パク質（GFT）についての発現単位を含んでなるアデノウイルスベクターを注入
した。各3匹のラットのグループの3つに1.5×10¹⁰pfu／ml、3×10¹⁰pfu／ml、お
よび6×10¹⁰pfu／mlの投与量を注入する。損傷および非損傷頸動脈を感染後48時
間に収集し、10％の緩衝化ホルマリン中で24時間固定する。抗GFP抗体を使用し
て組織を処理し、分析して感染％を決定する。

【０４２５】 GFP研究から決定された最適投与量を使用して、14日の研究においてzvegf3の
作用を決定する。各14匹の動物のグループの2つをバルーン損傷し、zvegf3アデ
ノウイルスまたは対照アデノウイルスで感染させる。左の総頸動脈を単離し、内
部頸動脈、外部頸動脈、および近位に、総頸動脈を結ぶことによって、血管を通
る血流を停止させた。動脈切除を外部頸動脈上の結束と分岐との間で行い、血管
を乳酸加リンガー溶液でリンスする。2F−塞栓切除カテーテルを挿入し、膨張さ
せ、ねじりながら、取出して、内皮細胞を除去する；このプロセスを3回実施す
る。

【０４２６】 次いで血管を再びリンスし、サイラスティック管のカテーテルを使用して、ほ
ぼ50μlのアデノウイルス溶液を血管の中に挿入する。分岐に対してちょうど遠
位にカテーテルを結束して血管の中に入れ、ほぼ20分間所定位置に放置する。次
いでカテーテルを取出し、近位の結束をゆるめることによって血管を血液で短時
間フラッシュする。分岐に対してちょうど遠位に結束を形成する。内部の頸動脈
上の結束および総頸動脈上の近位の結束を除去することによって、血流を回復さ
せる。外部頸動脈上の結束を残留させる。血管壁におけるzvegf3タンパク質の産
生を測定するために、各グループからの2匹の動物を第1日および第7日に殺す。

【０４２７】 組織を免疫組織化学的分析およびウェスタンブロット分析のためにプロセシン
グする。免疫組織化学的分析のために、組織をホルマリンの中に24時間保持し、
次いで70％のエチルアルコールに移す。ウェスタンブロット分析のために、組織
をフラッシュ凍結させ、−80℃において貯蔵する。13日において、動物にBrdUタ
ブレットを皮下投与する。14日（BrdU挿入後24時間）に、エバンスブルー色素を
静脈内投与して、非内皮化セグメントを染色し、動物を放血し、殺す。次いで動
物を瀉血させ、10％の緩衝化ホルマリンで灌流固定する。両方の頸動脈、肝臓、
腎臓および脾臓を収集する。

【０４２８】 頸動脈を視的に検査し、分岐から遠位色素（白色／青色）境界までの距離を測
定することによって、再内皮化を定量する。すべての組織をホルマリンの中に24
時間保持し、次いで70％のエチルアルコールに移す。頸動脈の各々を3つの片に
切断し、パラフィンブロックの中に埋め込む。肝臓、腎臓および脾臓を視的に検
査し、プロセシングする。頸動脈の断面からスライドを作り、ヘマトキシリンお
よびエオシンで染色し、次いでSPOT^R診断プログラム（Diagnostic Instruments
，Inc.、ミシガン州スターリングハイツ）を使用して測定する。測定は内部弾性
薄板の長さおよび中膜、内膜、および管腔の面積を包含する。ICC分析は、感染
した細胞の数（抗gfp抗体を使用する）、細胞増殖（BrdU標識化）、および細胞
死％を包含する。

【０４２９】 第3研究を実施して、バルーン損傷後のzvegf3遺伝子の発現の時間経過を測定
する。頸動脈をバルーン損傷動物（5匹の動物／時点）からT＝0（非損傷）、T＝
6時間、1、4、7、および14日に収集する。ノザンブロット分析のために、頸動脈
をフラッシュ凍結させ、−80℃において貯蔵する。

【０４３０】実施例28 ． N末端においてマルトース結合性タンパク質（MBP）に融合したヒトzvegf3をコ
ードするポリヌクレオチドを含有する発現プラスミドを、相同的組換えにより構
築した。

【０４３１】 PCRを使用して、ヒトzvegf3のフラグメントを単離した。PCR反応においてヒト
zvegf3フラグメントを調製するとき、2つのプライマーを使用した。プライマーZ
C20,572（配列番号44）は40bpのベクターフランキング配列およびヒトzvegf3の
アミノ末端に対応する25bpを含有し、そしてプライマーZC20,573（配列番号45）
は40bpのベクターフランキング配列に対応する3'末端およびヒトzvegf3のカルボ
キシル末端に対応する25bpを含有した。

【０４３２】 二重反復試験において実施したPCR反応の条件は次の通りであった：25サイク
ル、94℃において30秒間、50℃において30秒間、および72℃において1.5分間；
次いで4℃のソーキング。100μlの反応混合物の2μlのアリコートを分析のため
にTris／ホウ酸塩／EDTA緩衝液を使用して1.0％のアガロースゲル上で展開し、
ほぼ1000bpの期待したバンドが見られた。見られた。反応混合物の残りの90μl
を第2PCR管と組合わせ、400μlの無水エタノールで沈降させ、SmaI切断レシピエ
ントベクターpTAP98の中に組換えてMBP−zvegf3融合物をコードする構築物を産
生するために使用した。

【０４３３】 プラスミドpTAP98をプラスミドpRS316（Saccharomyces cerevisiaeのシャト
ルベクター；HieterおよびSikorski、Genetics 122：19−27、1989参照）およ
びpMAL^TM−c2X（New England Biolabs；マサチュセッツ州ベバーリイ）誘導し
た。後者のベクターはMalE（MBPをコードする遺伝子）を推進するtacプロモータ
ー、次いでHisタグ、トロンビン切断部位、クローニング部位、およびrrnBター
ミネーターを担持する。酵母相同的組換えを使用して、ベクターpTAP98を構築し
た。

【０４３４】 100ngのEcoRI切断pMAL（商標）−c2Xを１，μgのPvuI切断pRS316、1μgのリン
カー、および1μgのSma1／EcoRI切断pRS316と組合わせた。PCR反応において10サ
イクル、94℃において30秒間、50℃において30秒間、および72℃において30秒間
；次いで4℃のソーキングの間、オリゴヌクレオチドZC19,372（配列番号46）（1
00pmole）、ZC19,351（配列番号47）（1pmole）、ZC19,352（配列番号48）（1pm
ole）、およびZC19,371（配列番号49）（100pmole）を組合わせることによって
、リンカーを構築した。PCR生成物を100％のエタノール沈降により濃縮した。

【０４３５】 MBP−zvegf3融合配列を含有するベクターを相同的組換えにより構築した。ほ
ぼ1μgのヒトzvegf3インサートおよび100ngのSmaI消化pTAP98ベクターを含有す
る混合物の10μlと、コンピテント酵母細胞（S. cerevisiae）の100μlを組合
わせ、直径0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／DNA混合
物を0.75kV（5kV／cm）、無限オーム、25μFにおいてエレクトロパルスした。各
キュベットに、600μlの1.2Mのソルビトールを添加した。次いで酵母を2×300μ
lのアリコートで2つのURA Dプレート上にプレートし、30℃においてインキュベ
ートした。

【０４３６】 約48時間後、単一プレートからのUra⁺酵母形質転換体を1mlのH₂Oの中に再懸濁
させ、短時間回転した。細胞ペレットを1mlの溶解緩衝液）2％のトリトンX−100
、1％のSDS、100mMのNaCl、10mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA）の中に再懸濁させ
た。300μlの酸洗浄ガラスビーズおよび200μlのフェノール−クロロホルムを含
有するエッペンドルフ管に500μlの溶解混合物を添加し、1分の間隔で2または3
回渦形成し、次いでマイクロフージ中で最大速度で5分間回転した。300μlの水
性相を新鮮な管に移し、DNAを600μlのエタノール（EtOH）で沈降させ、次いで4
℃において10分間遠心した。

【０４３７】 DNAペレットを100μlのH₂Oの中に再懸濁させた。エレクトロコンピテント大腸
菌（E. coli）細胞（MC1061；Casadaban他、J. Mol. Biol. 138：179−207
）を、40μlの体積において1μlの酵母DNAプレプで形質転換した。細胞を2.0ktu
p値、25μF、400オームにおいてエレクトロパルスした。エレクトロポレーショ
ン後、0.6mlのSOS（2％のBacto^TM Trypton（Difco Laboratories、ミシガン州
デトロイト）、0.5％の酵母エキス（Difco Laboratories）、10mMのNaCl、2.5m
MのKCl、10mMのMgCl₂、10mMのMgSO₄、20mMのグルコース）をアリコートでLB AM
Pプレート（LBブロス（Lennox）、1.8％の寒天（Bacto（商標）、Difco Labora
tories）、100mg／lのアンピシリン）上にプレートした。

【０４３８】 zvegf3のための正しい発現構築物を収容する個々のクローンを発現により同定
した。カサアミノ酸および100μg／mlのアンピシリンを補充した最小培地中で細
胞を一夜成長させた。50μlの一夜培養物を使用して、2mlの新鮮な培地を接種し
た。培養物を37℃において成長させ、2時間震盪させた。1mlの培養物を1mMのIPT
Gで誘導した。

【０４３９】 2〜4時間後、5％のα−MEおよび色素を補充した250μlの酸洗浄ガラスビーズ
および250μlのThorner緩衝液（８Mの尿素、100mMのTris pH7.0、10％のグリセ
ロール、2mMのEDTA、5％のSDS）と、250μlの各培養物を混合した。試料を1分間
渦形成し、65℃に5〜10分間加熱した。20μl／レーンを4％〜12％のPAGEゲル（N
OVEX、カリフォルニア州サンディエゴ）上に負荷した。ゲルを1MES緩衝液中で展
開した。陽性クローンをpCZR236と表示し、配列分析に付した。pCZR236中のMBP
−zvegf3融合物のポリヌクレオチド配列を配列番号50に示す。

【０４４０】 融合タンパク質を発現させるために、1μlのシークエンシングDNAを使用して
大腸菌（E. coli）株W3110（American Type Culture Collection、バージニ
ア州マンナッサス、から入手した）を形質転換した。細胞を2.0ktup値、25μFお
よび400オームにおいてエレクトロパルスした。エレクトロポレーション後、0.6
mlのSOS（2％のBacto（商標） Trypton（Difco Laboratories）、0.5％の酵母
エキス（Difco Laboratories）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl₂、10mM
のMgSO₄、20mMのグルコース）をアリコートでLB AMPプレート（LBブロス（Lenn
ox）、1.8％のBacto^TM寒天（Difco Laboratories）、100mg／lのアンピシリン
）上にプレートした。

【０４４１】 細胞をプレートから取り上げ、カサアミノ酸を含有する最小培地中で一夜成長
させた。50μlのアリコートの一夜培養物を使用して、2mlの新鮮な培地を接種し
た。培養物を37℃において成長させ、2時間震盪させた。1mlの培養物を1mMのIPT
Gで誘導し、細胞を本質的に前述したように溶解した。ライゼイトの20μlのアリ
コートを前述したようにゲル電気泳動により分析した。

【０４４２】実施例29 ． 組換えzvegf3をラット星細胞（N. Fausto、University Of Washington、か
ら入手した）に対する有糸分裂誘発活性について分析した。星細胞を96ウェルの
培養プレートの中に2,000細胞／ウェルの密度でプレートし、10％のウシ胎児血
清を含有するDMEM中で37℃においてほぼ72時間インキュベートした。インスリン
（5μg／ml）、トランスフェリン（20μg／ml）、およびセレン（16pg／ml）を
含有する無血清DMEM／Ham's F−12（ITS）中で細胞を20時間インキュベートす
ることによって、細胞を休止させた。アッセイ時に、培地を除去し、試験試料を
ウェルにトリプリケートで添加した。

【０４４３】 試験試料は全長のzvegf3を発現するアデノウイルス感染HaCaTヒトケラチノサ
イト細胞（Boukamp他、J. Cell. Biol. 106：761−771、1988）からのコンデ
ィショニングされた培地（CM）、BHK細胞中で発現された精製成長因子ドメイン
、または緑色蛍光タンパク質の発現単位を含有する親アデノウイルス感染細胞（
Zpar）からの対照培地のいずれかから成っていた。10K膜フィルターを装備した1
5mlの遠心フィルター装置（Ultrafree^R；Millipore Corp．、マサチュセッツ州
ベッドフォード）を使用して、CMを10倍に濃縮し、次いでITSで3×に希釈し、細
胞に添加した。

【０４４４】 0.1％のBSAを含有する緩衝液中の精製タンパク質をITS培地中で1μg／ml〜1ng
／mlの濃度に連続希釈し、試験プレートに添加した。0.1％のBSAの対照緩衝液を
最高濃度のzvegf3タンパク質と同様に希釈し、プレートに添加した。［³H］チミ
ジンの組込みを測定するために、1μCi／ウェルの最終活性のために、20μlのDM
EM中の50μCi／mlのストックを細胞に直接添加した。さらに24時間後、［³H］チ
ミジンの吸収を測定することによって、有糸分裂誘発活性を評価した。

【０４４５】 培地を除去し、細胞が分離するまで、細胞を0.1mlのトリプシンとインキュベ
ートした。試料収集装置（FlterMate^TM；Packard Instrument Co.、コネチカ
ット州メリデン）を使用して、細胞を96ウェルのフィルタープレート上に収集し
た。次いでプレートを65℃において15分間乾燥し、40μl／ウェルのシンチレー
ションカクテル（Microscint^TM O；Packard Instrument Co.）を添加した後
、シールし、マイクロプレートシンチレーションカウンター（Topcount（商標）
；Packard Instrument Co.）で計数した。

【０４４６】 表12に記載する結果が証明するように、zvegf3 CMは星細胞に対して対照CMよ
りもほぼ4.4倍高い有糸分裂誘発活性を有し、そして精製したタンパク質は緩衝
液対照よりも最大14倍の［³H］チミジンに組込みを引き起こした。

【０４４７】

【表１２】

【０４４８】 以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、
本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の修飾が可能である。したがって
、本発明は、添付された請求の範囲による以外、限定されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 第1図は、配列番号2に示すアミノ酸配列のHopp／Woods親水性プロファイルで
ある。プロファイルはスライディング6残基ウィンドウに基づく。埋没G、S、お
よびT残基および露出H、Y、およびW残基は無視されている。これらの残基は図面
において小文字で示されている。

【図２】 第2図は、トランスジェニック動物においてcDNAを発現するために使用するベ
クターpHB12−8の図解である。

【図３】 第3図は、ベクターpZMP6／zvegf3の図解である。

【図４】 第4図は、ベクターpZMP11／zv3GF−otPAの図解である。

【図５】 第5図は、zvegf3のレセプター結合アッセイの結果を示す。

【図６】 第6図は、ヒト（配列番号2）およびマウス（配列番号43）アミノ酸配列の整列
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８５ 48/00 9/10 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 3/10 9/14 ４Ｈ０４５ 9/10 19/02 9/14 27/06 19/02 29/00 27/06 35/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 35/00 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/475 19/00 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１６１，６５３ (32)優先日 平成11年10月21日(1999．10．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６５，２５５ (32)優先日 平成11年11月12日(1999．11．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハート，チャールズ イー． アメリカ合衆国，ワシントン 98072，ウ ッディンビル，ワンハンドレッドエイティ ーサード プレイス ノースイースト 20114 (72)発明者 ピディントン，クリストファー エス． アメリカ合衆国，カリフォルニア 91362， サウザンド オークス，アイロンゲイト プレイス 2838 (72)発明者 シェパード，ポール オー． アメリカ合衆国，ワシントン 98252，グ ラニト フォールズ，トゥーハンドレッズ セブンティーエイス ドライブ ノースイ ースト 13532 (72)発明者 シューメイカー，キンバリー イー． アメリカ合衆国，ワシントン 98006，ベ ルビュー，ソマーセット アベニュ サウ スイースト 4634 (72)発明者 ギルバートソン，デブラ ジー． アメリカ合衆国，ワシントン 98155，シ アトル，ノースイースト ワンハンドレッ ドナインティーフィフス プレイス 4025 (72)発明者 ウエスト，ジェイムズ ダブリュ． アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ナインティーンス ノースイース ト 7539 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA01 CA04 CA07 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA02 FA07 GA03 GA11 HA01 HA03 HA12 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG13 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA22 BA23 CA53 DB52 DB57 NA14 ZA33 ZA36 ZA44 ZA45 ZA96 ZB15 ZB26 ZC35 4C085 AA14 BB11 CC21 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZA33 ZA36 ZA45 ZA96 ZB15 ZB26 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２または配列番号４３のタンパク質のエピトープ担
   持部分を含んでなる少なくとも１５のアミノ酸残基の単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが下記の配列： （ａ） 配列番号２の残基４６〜１６３；および （ｂ） 配列番号２の残基２３５〜３４５； から成る群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるセグメント
   を含んでなる、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記ペプチドが下記のペプチド： 配列番号２の残基１５〜１６３； 配列番号２の残基４６〜１６３； 配列番号２の残基１５〜１７０； 配列番号２の残基４６〜１７０； 配列番号２の残基１５〜２３４； 配列番号２の残基４６〜２３４； 配列番号２の残基１５〜２２９アミド； 配列番号２の残基１５〜２３０； 配列番号２の残基１５〜３４５； 配列番号２の残基４６〜３４５； 配列番号２の残基１６４〜３４５； 配列番号２の残基２３５〜３４５；および 配列番号２の残基２２６〜３４５； から成る群から選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 式Ｒ１ｘ−Ｒ２ｙ−Ｒ３ｚ： 〔式中、 Ｒ１は配列番号２の残基４６〜１６３に対して少なくとも９０％同一である１
   ００〜１２０残基長さのポリペプチドを含んでなり、そして配列番号２の残基１
   ０４〜１２４に対応する配列モチーフＣ［ＫＲ］Ｙ［ＤＮＥ］［ＷＹＦ］Ｘ｛１
   １，１５｝Ｇ［ＫＲ］［ＷＹＦ］Ｃ（配列番号４）を含んでなり、 Ｒ２は配列番号２の残基１６４〜２３４に対して少なくとも９０％同一である
   ポリペプチドであり、 Ｒ３は配列番号２の残基２３５〜３４５に対して少なくとも９０％同一である
   ポリペプチドであり、そして配列番号２の残基２５０、２８０、２８４、２９６
   、３３５、および３３７に対応する位置におけるシステイン残基；配列番号２の
   残基２８２に対応する位置におけるグリシン残基；および配列番号２の残基２５
   ０〜３３７に対応する配列モチーフＣＸ｛１８，３３｝ＣＸＧＸＣＸ｛６，３３
   ｝ＣＸ｛２０，４０｝ＣＸＣ（配列番号３）を含んでなり、そして ｘ、ｙ、およびｚの各々は独立して０または１であり、ただしｘおよびｚの少
   なくとも１つは１であり、そして ｘおよびｚの各々が１である場合、ｙは１である〕 のアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 ｘ＝１である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
6. 【請求項６】 Ｒ１が配列番号２の残基４６〜１６３を含んでなる、請求項
   ５に記載の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 Ｒ１が配列番号２の残基１８〜１６３に対して少なくとも９
   ０％同一である、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
8. 【請求項８】 ｙ＝１である、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 ｚ＝１である、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 前記ペプチドが配列番号２の残基４６〜２２９、配列番号
    ２の残基１６４〜３４５、または配列番号２の残基４６〜３４５を含んでなる、
    請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 ｚ＝１である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド
    。
12. 【請求項１２】 Ｒ３が配列番号２の残基２３５〜３４５を含んでなる、請
    求項１１に記載の単離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 ｙ＝１である、請求項１１に記載の単離されたポリペプチ
    ド。
14. 【請求項１４】 ｘ＝１である、請求項１３に記載の単離されたポリペプチ
    ド。
15. 【請求項１５】 配列番号２の２８６、２８７、２９１、および２９４に対
    応する位置にシステインをさらに含んでなる、請求項１１に記載の単離されたポ
    リペプチド。
16. 【請求項１６】 親和標識をさらに含んでなる、請求項４〜１５のいずれか
    一項に記載の単離されたポリペプチド。
17. 【請求項１７】 免疫グロブリンの定常ドメインをさらに含んでなる、請求
    項４〜１５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
18. 【請求項１８】 第２ポリペプチドに作用可能に連鎖されている第１ポリペ
    プチドを含んでなり、前記第１ポリペプチドが式Ｒ１ｘ−Ｒ２ｙ−Ｒ３ｚ： 〔式中、 Ｒ１は配列番号２の残基４６〜１６３に対して少なくとも９０％同一である１
    ００〜１２０残基長さのポリペプチドを含んでなり、そして配列番号２の残基１
    ０４〜１２４に対応する配列モチーフＣ［ＫＲ］Ｙ［ＤＮＥ］［ＷＹＦ］Ｘ｛１
    １，１５｝Ｇ［ＫＲ］［ＷＹＦ］Ｃ（配列番号４）を含んでなり、 Ｒ２は配列番号２の残基１６４〜２３４に対して少なくとも９０％同一である
    ポリペプチドであり、 Ｒ３は配列番号２の残基２３５〜３４５に対して少なくとも９０％同一である
    ポリペプチドであり、そして配列番号２の残基２５０、２８０、２８４、２９６
    、３３５、および３３７に対応する位置におけるシステイン残基；配列番号２の
    残基２８２に対応する位置におけるグリシン残基；および配列番号２の残基２５
    ０〜３３７に対応する配列モチーフＣＸ｛２５，３３｝ＣＸＧＸＣＸ｛１０，３
    ３｝ＣＸ｛２０，４０｝ＣＸＣ（配列番号３）を含んでなり、そして ｘ、ｙ、およびｚの各々は独立して０または１であり、ただしｘおよびｚの少
    なくとも１つは１であり、そして ｘおよびｚの各々が１である場合、ｙは１である〕 により表わされるアミノ酸配列を有し、そして細胞の増殖、分化、代謝、または
    移動をモジュレートするタンパク質。
19. 【請求項１９】 前記タンパク質がヘテロダイマーである、請求項１８に記
    載の単離されたタンパク質。
20. 【請求項２０】 ｚが１であり、そして前記第２ポリペプチドがＶＥＧＦ、
    ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ、および
    ＰＤＧＦ−Ｂから成る群から選択される、請求項１９に記載の単離されたタンパ
    ク質。
21. 【請求項２１】 前記タンパク質がホモダイマーである、請求項１８に記載
    の単離されたタンパク質。
22. 【請求項２２】 ｚ＝１である、請求項２１に記載の単離されたタンパク質
    。
23. 【請求項２３】 前記第１および第２のポリペプチドが、配列番号２の残基
    ２３５〜３４５を含んでなる、単離されたタンパク質。
24. 【請求項２４】 ｘ＝１である、請求項２１に記載の単離されたタンパク質
    。
25. 【請求項２５】 前記第１および第２のポリペプチドが配列番号２の残基４
    ６〜１６３を含んでなる、単離されたタンパク質。
26. 【請求項２６】 式Ｒ１ｘ−Ｒ２ｙ−Ｒ３ｚ： 〔式中、 Ｒ１は配列番号２の残基４６〜１６３に対して少なくとも９０％同一である１
    ００〜１２０残基長さのポリペプチドを含んでなり、そして配列番号２の残基１
    ０４〜１２４に対応する配列モチーフＣ［ＫＲ］Ｙ［ＤＮＥ］［ＷＹＦ］Ｘ｛１
    １，１５｝Ｇ［ＫＲ］［ＷＹＦ］Ｃ（配列番号４）を含んでなり、 Ｒ２は配列番号２の残基１６４〜２３４に対して少なくとも９０％同一である
    ポリペプチドであり、 Ｒ３は配列番号２の残基２３５〜３４５に対して少なくとも９０％同一である
    ポリペプチドであり、そして配列番号２の残基２５０、２８０、２８４、２９６
    、３３５、および３３７に対応する位置におけるシステイン残基；配列番号２の
    残基２８２に対応する位置におけるグリシン残基；および配列番号２の残基２５
    ０〜３３７に対応する配列モチーフＣＸ｛２５，３３｝ＣＸＧＸＣＸ｛１０，３
    ３｝ＣＸ｛２０，４０｝ＣＸＣ（配列番号３）を含んでなり、そして ｘ、ｙ、およびｚの各々は独立して０または１であり、ただしｘおよびｚの少
    なくとも１つは１であり、そして ｘおよびｚの各々が１である場合、ｙは１である〕 のアミノ酸配を含んでなるポリペプチドをコードするほぼ４ｋｂまでの長さの単
    離されたポリヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２６に記載
    のポリヌクレオチド。
28. 【請求項２８】 配列番号６のヌクレオチド１〜１０３５を含んでなる、請
    求項２７に記載のポリヌクレオチド。
29. 【請求項２９】 配列番号１のヌクレオチド１５４〜１１８８を含んでなる
    、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
30. 【請求項３０】 配列番号４２のヌクレオチド１０４９〜２０８３を含んで
    なる、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
31. 【請求項３１】 下記の作用可能に連鎖された因子： 転写プロモーター； 請求項２７に記載のＤＮＡポリヌクレオチド；および 転写ターミネーター； を含んでなる発現ベクター。
32. 【請求項３２】 ＤＮＡポリヌクレオチドに作用可能に連鎖された分泌シグ
    ナル配列をさらに含んでなる、請求項３１に記載の発現ベクター。
33. 【請求項３３】 請求項３１または３２に記載の発現ベクターが導入されて
    おり、ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する、培養され
    た細胞。
34. 【請求項３４】 薬学上許容されるビヒクルと組み合わせて請求項１８〜２
    ５のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる組成物。
35. 【請求項３５】 請求項３１または３２に記載の発現ベクターが導入された
    細胞を培養し、これにより前記細胞はＤＮＡセグメントによりコードされるポリ
    ペプチドを発現し；そして 発現されたタンパク質を回収する、 ことを含んでなる、タンパク質を製造する方法。
36. 【請求項３６】 請求項４に記載のポリペプチドのエピトープに特異的に結
    合する抗体。
37. 【請求項３７】 モノクローナル抗体である、請求項３６に記載の抗体。
38. 【請求項３８】 一本鎖抗体である、請求項３６に記載の抗体。
39. 【請求項３９】 リポーター分子に作用可能に連鎖された請求項３６〜３８
    のいずれか一項に記載の抗体。
40. 【請求項４０】 患者から遺伝的試料を採取し、 上記遺伝的試料を配列番号１または配列番号１の相補体の少なくとも１４の隣
    接ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドが相補
    的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする条件下に、インキュベート
    して第１反応生成物を生成し；そして 前記第１反応生成物を対照反応生成物と比較し、ここで前記第１反応生成物と
    前記第２反応生成物との間の差が患者における遺伝的異常を示す； ことを含んでなる、患者において遺伝的異常を検出する方法。
41. 【請求項４１】 繊維芽細胞または平滑筋細胞に有効量の請求項１８〜２５
    のいずれか一項に記載のタンパク質を適用することを含んでなる、前記細胞の成
    長を刺激する方法。
42. 【請求項４２】 細胞表面のＰＤＧＦアルファレセプターを含んでなる細胞
    を請求項２〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質に対し
    て暴露し、これによりポリペプチドまたはタンパク質をレセプターに結合させか
    つレセプターを活性化することを含んでなる、細胞表面のＰＤＧＦアルファレセ
    プターを活性化する方法。
43. 【請求項４３】 請求項２〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドまた
    はタンパク質が細胞表面のＰＤＧＦアルファレセプターに結合するのを阻害する
    化合物に、細胞表面のＰＤＧＦアルファレセプターを含んでなる細胞を暴露する
    ことを含んでなる、ＰＤＧＦアルファレセプター仲介細胞プロセスを阻害する方
    法。
44. 【請求項４４】 有効量のｚｖｅｇｆ３アンタゴニストを哺乳動物に投与す
    ることを含んでなる、哺乳動物におけるｚｖｅｇｆ３活性を阻害する方法。
45. 【請求項４５】 アンタゴニストが、抗体、レセプター、リガンド結合性レ
    セプターフラグメント、またはレセプターＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質である、
    請求項４４に記載の方法。
46. 【請求項４６】 請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチドの補体で
    ある、単離された、アンチセンスポリヌクレオチド。
47. 【請求項４７】 作用可能に連鎖された転写プロモーターおよびターミネー
    ター配列をさらに含んでなる、請求項４６に記載のアンチセンスポリヌクレオチ
    ド。
48. 【請求項４８】 細胞に請求項４７に記載のアンチセンスポリヌクレオチド
    を投与することを含んでなる、細胞においてｚｖｅｇｆ３の産生を阻害する方法
    。