JP2003524383A - 成長因子関連分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト成長因子関連分子（GFRP）並びにGFRPを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はGFRPの発現に関わる疾患の診断、治療又は予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、ヒト成長因子関連分子の核酸配列およびアミノ酸配列、並びに発生
障害、癌を含めた細胞増殖障害、炎症を含めた免疫異常症、生殖及び心血管障害
並びに感染症の診断、予防及び治療におけるこれらの配列の利用法に関するもの
である。

【０００２】 発明の背景 細胞間伝達は、多細胞生物の発達及び生存にとって不可欠である。伝達は、シ
グナル細胞によるタンパク質の分泌及び標的細胞によるタンパク質のインターナ
リゼーションによって行われる。成長因子は、シグナル細胞と標的細胞との伝達
を仲介するような、分泌タンパク質の一例である。シグナル細胞内部において、
成長因子は合成され、分泌経路を通って輸送される。分泌経路への侵入は、殆ど
の分泌タンパク質のＮ末端においてモチーフを選別するようなタンパク質である
ところのシグナルペプチド配列によって仲介される。分泌経路内において、シグ
ナル配列はそれと同起源の成長因子からタンパク質分解的に除かれる。大部分の
成長因子も、分泌経路内において更に翻訳後の修飾をする。翻訳後修飾としては
、グリコシル化、リン酸エステル化、及び分子内ジスルフィド結合の形成等が挙
げられる。成長因子によっては、細胞外空間への分泌に引き続いてオリゴマー化
したり細胞外基質成分と結合したりするものもある。分泌成長因子は、標的細胞
の表面上で特定の受容体に結合し、結合した受容体は第２メッセンジャーシグナ
ルの形質導入経路を誘発する。このシグナル形質導入経路は、標的細胞における
特定の細胞反応を惹起する。特定の細胞反応としては、遺伝子発現の修飾及び、
細胞分裂、細胞分化、細胞運動の刺激や阻害等が挙げられる。

【０００３】 殆どの成長因子は、即時型環境において細胞に作用するような局在メディエイ
タである。このような局在活性は、シグナル細胞と標的細胞とが物理的に近接し
ていること、細胞外基質成分による成長因子の配列、標的細胞による成長因子の
インターナリゼーション及びデグラデーション、及び循環から成長因子を除外す
ることによって維持される。

【０００４】 成長因子は、３つの広範な且つ重複するクラスに分類される。第１の最も広範
なクラスは、効果が広範囲にわたるような大きなペプチド成長因子を含む。大き
なペプチド成長因子には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、インスリン様成長因子
（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が
含まれ、各因子は多数の関連する因子のファミリーを画定する。大きなペプチド
成長因子は一般に、創傷治癒、骨の合成及びリモデリング、細胞外基質の合成、
及び上皮、表皮、結合組織の増殖を刺激するような、多様な細胞タイプの分裂促
進因子として作用する。ＴＧＦ-βファミリー、ＥＧＦファミリー、及びＦＧＦ
ファミリーのメンバーの中には、塞栓性組織の分化における誘導シグナルとして
作用するものもある。しかしながら、標的細胞の拘束性セットに対して特定の機
能を発揮するような大きなペプチド成長因子もある。例えば、マウスの成長／分
化因子９（ＧＤＦ-９）は、卵巣に単独で発現するようなＴＧＦ-βファミリーの
メンバーである（McPherron. A.C.及びS.-J. Lee (1993) J. Biol. Chem 268:34
44-3449）。ＮＧＦは、具体的には、神経の成長及び分化を促進するような神経
栄養性因子として作用する。

【０００５】 フォリスタチン(follistatin)（ＦＳ）は特に、成長因子及び分化因子のトラ
ンスフォーミング成長因子βファミリーのメンバーであるようなアクチビンに結
合し且つ阻害するタンパク質である。アクチビンは、発育胎芽の中胚葉誘導、成
人の女性ホルモン分泌抑制等、成長及び分化に関連する様々な機能を発揮する（
de Krester, D.M. (1998) J. Reprod. Immunol. 39:1-12）。アクチビン及びＦ
Ｓは共に、多数のタイプの細胞において見られる。アクチビンとＦＳの相互作用
は、性腺組織、下垂体、妊娠に関連する膜、血管組織、肺等における様々な細胞
プロセスに影響を与える（Phillips, D.J.及びD.M. de Krester (1998) Front.
Neuroendocrinol. 19:287-322でレビューされている）。ＦＳも胚組織の神経化
において直接的な役割を果たす（Hemmati-Brivanlouら (1994) Cell 77:283-295
）。

【０００６】 ＦＳは、カエル、ニワトリ、ヒト等、多様な種の中に保存される。ヒトＦＳの
変異体は、２８８個のアミノ酸及び３１５個のアミノ酸アイソフォームを含む（
McConnell. D.S.ら(1998) J. Clin. Endocrinol. Metab. 83:851-858）。殆どの
フォリスタチンは、等間隔に位置するような１０個のシステイン残基を伴う保存
ドメインを有する。これらの残基は、ジスルフィド結合の形成及び陽イオンの架
橋に関係するであろう。類似のドメインは、Kazalプロテアーゼ阻害因子及び、
胚形成中及び修復中に種々の組織に発現するような細胞外基質関連のグリコプロ
テインであるオステオネクチン（ＳＰＡＲＫまたはＢＭ-１０とも称される）に
おいて観察される（Lane. T.F.及び E.H. Sage (1994) FASEB J. 8:l63-l73 で
レビューされている）。オステオネクチンは、ＦＳ様ポリシステイン（polycyst
eine）ドメインを有するのみならず、細胞と基質成分を結合するために独立して
機能することができ、且つ基質との細胞接触を選択的に崩壊させることにより細
胞の形状を変えることができるような他のモジュラードメインをも有する。高レ
ベルのオステオネクチンは、発達している骨及び歯に関連し、主として骨芽細胞
、造歯細胞、及び胎芽の軟骨膜線維芽細胞に関連する。細胞の接着及び増殖のオ
ステオネクチンの変調も、細胞リモデリング及び血管形成において機能すること
がある（Kupprionら(1998) J. Biol. Chem. 45:29635-29640）。

【０００７】 ＦＳは、様々な細胞増殖障害、生殖障害、及び発達障害に関連する。ＦＳが欠
如している遺伝子導入マウスは、多発性筋骨格異常を発症し、生後まもなく死亡
した（Matzuk, M.M.ら (l995) Nature 374:360-363）。ＦＳの異常発現及び局在
化は、良性前立腺肥大及び前立腺癌に関係していた（Thomas, T.Z.ら (1998) Pr
ostate 34:34-43）。ＦＳ様ポリシステインドメインを用いてタンパク質をコー
ドするような、フォリスタチンに関連する遺伝子は、白血病誘発において役割を
演じるような染色体の転座に関連する（Hayette. S. (1998) Oncogene 16:2949-
2954）。炎症反応において、ＦＳは、初期アテローム性動脈硬化症のマクロファ
ージ形状細胞形成特性を増加させる（Kozaki. K.ら (1997) Arterioscler. Thro
mb. Vasc. Biol. 17:2389-2394）。

【０００８】 骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、異所性化骨を誘発することができるよ
うな骨由来の因子である（Wozney. J.M. ら (1988) Science 242:1528-1534）。
ＢＭＰは、骨の生成及び再生と関係があるような疎水性グリコプロテインであり
、中にはＴＧＦ-βスーパーファミリーに関連するものもある。例えば、ＢＭＰ-
１は、骨の形成において固有の役割を外見上有し、プロコラーゲンＣプロティナ
ーゼ活性及び細胞外「ＣＵＢ」ドメインの存在によって特徴付けられる。ＣＵＢ
ドメインは、２個のジスルフィド架橋を形成するであろう４個のシステインを含
む１１０もの残基から形成され、機能的に多様な、主として発達的に調整される
ような様々なタンパク質に見られる（ExPASy PROSITEドキュメントPR00908）。

【０００９】 成長因子の第２のクラスには、標的特性が狭い造血成長因子が含まれる。造血
成長因子は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、血小板、好酸球、好塩基球、好
中球、マクロファージ、及び幹細胞前駆体のような血球の増殖及び分化を刺激す
る。造血成長因子には、コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-
ＣＳＦ、及びＣＳＦ１〜３）、エリスロポイエチン、サイトカイン等が含まれる
。

【００１０】 サイトカインは、免疫系及び炎症系を変調するようなシグナル分子のファミリ
ーから形成される。サイトカインは、組織の損傷やウイルス性感染、微生物感染
等の外的傷害に反応して、免疫系の細胞（通常は白血球）によって分泌されるよ
うな特殊造血因子である。しかしながら、他の組織も、疾患及び外的傷害に反応
してサイトカインを分泌することが可能である。サイトカインは、組織修復、炎
症、及び免疫反応の変調において機能する。サイトカインは主として、Ｂリンパ
球、Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球のような免疫系の細胞に影響を
与えるような成長因子及び分化因子として作用する。他のシグナル分子と同様に
、サイトカインは特定の細胞膜受容体に結合し、遺伝子発現パターンを変えるよ
うな細胞間シグナルの形質導入経路を誘発する。サイトカインを利用して炎症及
び免疫系異常症を治療することは大いに可能である。

【００１１】 サイトカインの構造及び機能は、in vitroで広範囲にわたって特徴付けられて
きた。大部分のサイトカインは約３０kDa或いはそれ以下の小ポリペプチドであ
る。ヒト及びげっ歯類を源とした５０個以上のサイトカインが同定されている。
サイトカインのサブファミリーの例として、インターフェロン（ＩＦＮ-α、Ｉ
ＦＮ-β、及びＩＦＮ-γ）、インターロイキン（ＩＬ１〜ＩＬ１３）、腫瘍壊死
因子（ＴＦＮ-α及びＴＦＮ-β）、ケモカイン等が挙げられる。多数のサイトカ
インは、組換えＤＮＡ技術を利用して製造されてきた。個々のサイトカインの活
性は、in vitroで定量されてきた。これらの活性には、白血球の増殖、分化、及
び運動の調整が含まれる。

【００１２】 in vitroでの個々のサイトカインの活性がin vivoでのサイトカインの活性の
全範囲を反映することはないであろう。サイトカインはin vivoでは個々に発現
しないが、その代わりに、生体が刺激によって誘発される時に多数の他のサイト
カインとの結合において発現する。合わせて、これらのサイトカインは、特定の
刺激に対して好適な方法で免疫反応を正確に変調する。従って、サイトカインの
生理的活性は、刺激自体及び、相乗的及び拮抗的関係の両方を実証するような、
共発現したサイトカイン間の複合相互反応ネットワークによって定量される。

【００１３】 最近、in vitroで抗腫瘍活性を有することが明らかになった独特なサイトカイ
ンが単離された（Ridge, R.J. 及び N.H. Sloane (1996) Cytokine 8:1-5）。こ
のサイトカインは、抗腫瘍性尿タンパク（ＡＮＵＰ）であり、当初はヒトの尿か
ら２量体として精製された。ＡＮＵＰは後になって、ＡＮＵＰがヒトの顆粒球に
発現することが局在の研究によって実証された時に、サイトカインとして分類さ
れた。ＡＮＵＰは、乳房、皮膚、肺、膀胱、膵臓、及び頚の腫瘍に由来する細胞
株の成長を阻害する。しかしながら、ＡＮＵＰはヒトの非腫瘍細胞株の成長には
影響を与えない。ＡＮＵＰのＮ末端の２２個のアミノ酸は、成熟プロテインから
分割されるようなシグナルペプチドから形成される。成熟プロテインの最初の９
個のアミノ酸は、約１０％の抗腫瘍活性を保持する。加えてＡＮＵＰは、或る細
胞表面グリコプロテインに典型的なＬｙ-６／ｕ-ＰＡＲ配列モチーフを含む。こ
のモチーフは、５０残基コンセンサス配列内の６システイン残基の異なるパター
ンによって特徴付けられる。Ｌｙ-６／ｕ-ＰＡＲモチーフは、Ｌｙ-６Ｔリンパ
球表面抗原及び、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性体である細胞外セリンプロ
テアーゼのための受容体（ｕ-ＰＡＲ）において見られる。

【００１４】 ケモカインは、３０以上のメンバーを擁するサイトカインのサブファミリーか
ら形成される（Wells, T.N.C.及びM.C. Peitsch (1997) J. Leukoc. Biol. 61:5
45-550）。ケモカインは当初、単球及びマクロファージを炎症部位へ補充するよ
うな走化性プロテインとして同定された。新しい証拠によれば、ケモカインも造
血及びＨＩＶ-１感染において鍵となる役割を果たすことがある。ケモカインは
、分子量が約６〜１５kDaの範囲にあるような小さなタンパク質である。ケモカ
インは更に、臨界システイン残基の数及び位置に基づいて、Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、
またはＣＸ_３Ｃに分類される。例えば各ＣＣケモカインは、各々２４残基及び１
６残基間隔で下流において発生するような２個の追加システインが後に続くよう
な、２個の連続したシステインからなる保存モチーフを含む（ExPASy PROSITE
データベース、ドキュメント P500472 及び PDOC00434）。これら４個のシステ
イン残基の存在及び間隔は高く保存されるが、介在する残基はかなりの数が分岐
する。しかしながら、システインの二重項の下流の１５残基付近に位置するよう
な保存チロシンは、走化性活性にとって重要なようである。ＣＣケモカインをコ
ードするようなヒト遺伝子の大部分は、染色体１７上でクラスター化される。染
色体１７以外の場所で遺伝地図を作成するようなＣＣケモカイン遺伝子の例も僅
かにある。

【００１５】 最近、マウス及びヒトの胸腺において新規なＣＣケモカインが同定された（Vi
cari.A.P.ら (1997) Immunity 7:291-301）。胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）
と称されるこのタンパク質はまた、小腸において低レベルで発現する。ＴＥＣＫ
は、２つの理由のためにＴリンパ球の発達において役割を演じるようである。第
１に、ＴＥＣＫは、Ｔリンパ球の成熟が発生するような主要なリンパ器官である
ところの胸腺において過剰に発現する。第２に、胸腺におけるＴＥＣＫの主たる
源は、Ｔリンパ球の発達における自己寛容の確立を助けるような白血球細胞であ
るところの樹状細胞である。それに加えて、ＴＥＣＫは、活性化マクロファージ
、樹状細胞、及び胸腺Ｔリンパ球のための走化性活性を実証する。ヒトのＴＥＣ
Ｋ（ｈＴＥＣＫ）をコードするようなｃＤＮＡは、１５１個のアミノ酸のタンパ
ク質を予測するような４５３塩基対のオープンリーディングフレームを有する。
ｈＴＥＣＫは、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ５８、及びＣ７５における４個の保存システ
インを含めて、上記のＣＣケモカインの保存機能を保持する。しかしながら、Ｃ
３１とＣ５８との間隔は３残基によって広げられ、Ｃ５８とＣ７５との間隔は１
残基によって広げられる。それに加えて、大部分のＣＣケモカインにおいて見ら
れる保存チロシンが、ｈＴＥＣＫには欠如している。

【００１６】 成長因子の第３のクラスには、細胞増殖以外の高度に特殊化したプロセスを調
整する際に主としてホルモンとして機能するような小さなペプチド因子が含まれ
る。小さなペプチド因子は、一般的には長さにおいて２０個以下のアミノ酸であ
り、大きなタンパク質前駆体のタンパク質分解プロセスによって生成される。小
さなペプチド因子には、ボンベシン、バソプレシン、オキシトシン、エンドセリ
ン、トランスフェリン、アンギオテンシンII、血管作用性小腸ペプチド、ブラジ
キニン、及び関連するペプチドが含まれるものもある。（Pimentel, E. (1994) Handbook of Growth Factors , CRC Press. Ann Arbor MI、McKay, I.及びI. Lei
gh編 (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford University Pres
s, New York NY、及びHabenicht, A. 編 (1990) Growth Factors, Differentiat ion Factors, and Cvtokines , Springer-Verlag. New York NYを参照）。

【００１７】 新たなヒトの成長因子に関連するような分子及びそのような分子をコードする
ポリヌクレオチドの発見は、発達障害、癌を含む細胞増殖異常、炎症を含む免疫
異常症、生殖障害、心血管障害及び感染の診断、予防及び治療に役立つような新
たな成分を与えることにより、当業者の需要を満足させる。

【００１８】 発明の概要 本発明は、まとめて「GFRP」、個別には「GFRP-1」、「GFRP-2」、「GFRP-3」及び「GFR
P-4」と称される実質的に精製されたポリペプチドであるヒト成長因子関連分子を
特徴とする。一実施態様において、本発明はSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片か
らなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド
を提供する。また、本発明にはSEQ ID NO:1-4からなる一群より選択されたアミ
ノ酸配列から１又はそれ以上の保存的アミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが含まれる。

【００１９】 また、本発明はSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群より選択された
少なくとも1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有
する実質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はSEQ ID NO:1-4及びそ
れらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。更に本発明にはSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上のポリヌク
レオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列
が含まれる。

【００２０】 更に、本発明はSEQ ID NO: 1-4及びそれらの断片からなる一群より選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェ
ントな条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提
供する。また本発明はSEQ ID NO: 1-4及びそれらの断片からなる一群より選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相
補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００２１】 また、本発明は核酸を含むサンプルにおけるポリヌクレオチドの検出方法を提
供し、その方法には（ａ）サンプルの少なくとも1つのポリヌクレオチドとポリ
ヌクレオチドの相補配列とをハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複
合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過
程であって、該ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルに
おけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するよう
な検出過程とが含まれる。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの
前にポリヌクレオチドを増幅する過程を更に含む。

【００２２】 更に、本発明はSEQ ID NO:5-8及びそれらの断片からなる一群より選択された
ポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明はSEQ ID NO: 5-8及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリ
ヌクレオチド配列に対して少なくとも90%以上のポリヌクレオチド配列の同一性
を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列を提供する。更に本発
明はSEQ ID NO: 5-8及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製さ
れたポリヌクレオチドを提供する。

【００２３】 更に、本発明はSEQ ID NO:1-4からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベク
ターを提供する。別の実施態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される
。

【００２４】 また、本発明はポリペプチドの製造方法を提供し、その方法には（ａ）前記ポ
リペプチドの発現に適した条件の下で、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペ
プチドを回収する過程とが含まれる。

【００２５】 更に、本発明はSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群より選択された
のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と
共に含む医薬品成分を提供する。

【００２６】 更に、本発明にはSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群より選択され
たポリペプチドに結合する精製された抗体が含まれる。また本発明は前記ポリペ
プチドの精製されたアゴニストおよび精製されたアンタゴニストを提供する。

【００２７】 更に、本発明はGFRPの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又は予防
の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実
質的に精製されたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む有効な量の医薬品
組成物を投与する過程が含まれる。

【００２８】 更に、本発明はGFRPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又は予防
の方法を提供し、その方法には、そのような治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドの有効な量のアンタゴニストを投与する過程が含まれる。

【００２９】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の装置、材料、及び方法に限定されるものではなく、その実
施形態は変更可能であることを理解されたい。また、ここで使用した専門用語は
、特定の実施例のみを説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲のみで
限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも理解され
たい。

【００３０】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、1またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。

【００３１】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法、装
置、及び材料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書におい
ては好適な方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献
で報告された本発明に関して用いられ得る株化細胞、プロトコル、試薬、及びベ
クターを説明・開示するために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内
容は、本発明が従来発明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるもの
と解釈してはならない。

【００３２】 定義 用語「GFRP」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び
ヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天然、合成、半合成か
、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製されたGFRPのアミノ酸配列
を指す。

【００３３】 用語「アゴニスト」は、GFRPの生物学的活性を強化したり、模倣する分子を指
す。このアゴニストには、GFRPと直接相互作用するか、或いはGFRPが関与する生
物学的経路の成分と作用することによって、GFRPの活性を調節するタンパク質、
核酸、糖質、小分子又は他の任意の化合物や組成物が含まれ得る。

【００３４】 用語「アレル変異配列」は、GFRPをコードする遺伝子の対立形である。アレル変
異配列は、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し、変異したmR
NA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化する場合と変化
しない場合がある。遺伝子には、自然発生型のアレル形がないもの、1つ存在す
るもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列が生じる通常の
変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、または置換に因るものである。これ
らのタイプの変化の各々は、単独または他の変化と組み合わされて、所定の配列
において１またはそれ以上の回数で生じ得る。

【００３５】 ここで用いるGFRPをコードする「変異(altered)」核酸配列には、結果として同
一のGFRPまたはGFRPの機能的特徴の少なくとも1つをともなうポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、または
置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、GFRPの特定のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出困難な多型と、また
GFRPをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の位置とは別の所定の位
置を有する、アレル変異配列に対する不適切な或いは予期しないハイブリダイゼ
ーションとが含まれる。コード化されたタンパク質もまた「変異」したものであり
得て、サイレント変化(silent change)を生ずるアミノ酸残基の置換、欠失、ま
たは挿入を含み、結果的に機能的に等価GFRPとなるものである。意図的なアミノ
酸置換は、GFRPの生物学的または免疫学的活性が保持される限りにおいて、残基
の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質につい
ての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジンおよびア
ルギニンが含まれる。類似の親水性値を有する非電荷の極性側鎖を有するアミノ
酸には、ロイシン、イソロイシン及びバリン；グリシン及びアラニン；並びにフ
ェニルアラニン及びチロシンが含まれる。

【００３６】 ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド
、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、又はそれらの何れかの断片であり、自
然発生又は合成の分子を指す。「アミノ酸配列」が自然発生のタンパク質分子の
アミノ酸配列を指すのに用いられる場合は、「アミノ酸配列」及び類似の用語は
、アミノ酸配列を、記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ
酸配列に限定するものではない。

【００３７】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される。

【００３８】 用語「アンタゴニスト」は、GFRPに結合した場合にGFRPの生物学的又は免疫学
的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分子を指す。ア
ンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはGFRPの作用を低下させる任
意の他の分子が含まれ得る。

【００３９】 用語「アンタゴニスト」は、GFRPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子で
ある。アンタゴニストには、GFRPと直接相互作用するか、或いはGFRPが関与する
生物学的経路の成分と作用することによって、GFRPの活性を調節する抗体、核酸
、糖質、小分子又は他の任意の化合物や組成物などのタンパク質が含まれ得る。

【００４０】 用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa、F(ab)₂、及
びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。GFRPポリペプチドに結合する抗
体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原として関与する小
型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物（例えば、マ
ウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチドまたはオリ
ゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得られ、必要なら
ば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する通常用いられ
る担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペット
ヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を
免疫化する。

【００４１】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ち、エピトープ
）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動物を免疫化す
る場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域
または3次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は
抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために用いられる免
疫原）と競合し得る。

【００４２】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入されると、
細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げ
る。「ネガティブ」若しくは「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し
、「ポジティブ」若しくは「プラス（＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある
。

【００４３】 用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能、又は生
化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然の、
組換え体の、又は合成のGFRP、若しくはその任意のオリゴペプチドの能力を指し
、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する。

【００４４】 用語「相補的」または「相補性」は、任意の塩類及び温度条件の下での塩基対
によるポリヌクレオチド同士の自然な結合である。例えば、配列「5'A-G-T3'」
は相補的配列「3'T-C-A5'」に結合する。2つの1本鎖分子間の相補性は、幾つか
の核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、或いは1本鎖分子間に完
全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は
、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さに大きな影響を与える。
このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（
PNA）分子の設計及び使用において特に重要である。

【００４５】 ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」及び「所定のアミ
ノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミノ
酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤または水溶液
が含まれ得る。GFRPまたはGFRPの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成
物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。このプローブは凍結
乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させることが
できる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例えば、NaCl
）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）及び他の物質（例え
ば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液に分散させるこ
とができる。

【００４６】 用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分離された核酸
配列か、XL-PCR kit(The Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)を用いて5‘方向及
び／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメント
の組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment A
ssembly system, GCG, Madison WI）を用いて2種以上のインサイト社クローン、
また場合によっては１又はそれ以上の公有のESTの重複した配列から組み合わせ
て作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長され、かつ組み合わされてコ
ンセンサス配列が作られる。

【００４７】 用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換
を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、
そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。以下に、あるタンパク質の
元のアミノ酸が別のアミノ酸に置換される保存的なアミノ酸置換を示す。 元の残基 保存的な置換 Ala Gly, Set Arg His, Lys Asn Asp, Gln, His Asp Asn, Glu Cys Ala, Ser Gln Asn, Glu, His Glu Asp, Gln, His Gly Ala His Asn, Arg, Gln, Glu Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe His, Met, Leu, Trp, Tyr Ser Cys, Thr Thr Ser, Val Trp Phe, Tyr Tyr His, Phe, Trp Val Ile. Leu, Thr 一般に、保存されたアミノ酸置換の場合は、a）置換された領域のポリペプチ
ドの骨格構造、例えば、βシートやαヘリックス高次構造、b）置換された部位
の分子の電荷または疎水性、及び／または、c）側鎖の大半が維持される。

【００４８】 ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。

【００４９】 用語「誘導体」は、ポリペプチド配列、又はポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素からアルキル基、
アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体は、自然
発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持しているポリペプチドをコードす
る。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylat
ion)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的機能を保持する別の任意
のプロセスで修飾されたものである。

【００５０】 用語「断片」は、GFRPまたはGFRPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分
であって、その親配列（parent sequence）と同一であるがその配列より長さが
短いものを指す。「断片」の最大の長さは、親配列から１つのヌクレオチド／ア
ミノ酸残基を差し引いた長さである。例えば、ある断片は、5〜1000個の連続す
るヌクレオチド或いはアミノ酸残基を含む。プローブ、プライマー、抗原、治療
用分子、またはその他の目的に用いる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、2
5、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500個の連続するヌクレオチド
或いはアミノ酸残基の長さである。断片は、優先的に分子の特定の領域から選択
される場合もある。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示された最初の
250若しくは500のアミノ酸（或いは、ポリペプチドの最初の25%または50%）から
選択された連続するアミノ酸の所定の長さを含み得る。これらの長さは一例であ
り、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の任意の長さが、本発明の実施例に
含まれ得る。

【００５１】 SEQ ID NO:5-8のある断片は、例えば、同じゲノム内の他の配列とは異なる、S
EQ ID NO:5-8を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SE
Q ID NO:5-8のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、また
はSEQ ID NO:5-8を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用で
ある。ある断片と一致するSEQ ID NO:5-8の正確な断片やSEQ ID NO:5-8の領域の
長さは、その断片の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定
できる。

【００５２】 SEQ ID NO:1-4のある断片は、SEQ ID NO:5-8のある断片によってコードされる
。SEQ ID NO:1-4のある断片は、特異的にSEQ ID NO:1-4を同定する固有のアミノ
酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1-4のある断片は、特異的にSEQ ID NO
:1-4を認識する抗体の作製用の免疫原性ペプチドとして有用である。ある断片と
一致するSEQ ID NO:1-4の正確な断片やSEQ ID NO:1-4の領域の長さは、その断片
の目的に基づいて当分野で一般的な技術によって日常的に測定できる。

【００５３】 用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な類似性と、完全な
類似性の場合がある。用語「類似性」の代わりに「同一性」を用いることができる。
同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する
部分的に相補的な配列は、「実質的に類似な」ことを指す。完全に相補的な配列
と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性のもとで、ハ
イブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液ハイブリダイ
ゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に類似な配列またはハイブリダ
イゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に類似（同一）な配列との
結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな厳密
性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味する
わけではなく、緩やかな厳密性の条件では2つの配列の相互の結合が特異的（即
ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないことを
、部分的な程度の相補性（即ち約30%未満の類似性又は同一性）さえも有してい
ない第2の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が
存在しない場合、概ね類似な配列またはプローブは第2の非相補的な標的配列と
ハイブリダイズしない。

【００５４】 ポリヌクレオチド配列についての用語「同一性のパーセント」又は「同一性の
％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる、２つ以上
のポリヌクレオチド配列間の一致する残基の百分率のことである。このようなア
ルゴリズムは、標準化され再現できる方法で、２つの配列間のアラインメントを
最適化するべく、配列にギャップを挿入して、より意味をもつ２つの配列間の比
較を行うことができる。

【００５５】 ポリヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN version 3.12e配
列アラインメントプログラムに組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルト
パラメータを用いて決定可能である。このプログラムはLASERGENEソフトウェア
パッケージの一部であり、分子生物学分析プログラム一式（DNASTAR, Madison W
I）である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS
5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポ
リヌクレオチド配列の対のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Kt
uple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「重み
付けされた」残基重み付け表が、デフォルトとして選択された。同一性のパーセ
ントは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列の対の「類似性のパーセン
ト」としてCLUSTAL Vによって報告される。

【００５６】 別法では、一般に用いられ、無料で入手可能な配列比較アルゴリズム一式が、
NCBI、Bethesda、MD、及びインターネット（http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAS
T/）などから入手できるNational Center for Biotechnology Information（NCB
I）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul, S.F. 他 (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-410）によって得られる。このBLASTソフトウェア一式に
は、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド
配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログ
ラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールが入手可能であり、
２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequ
ences」は、http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにアクセスして、対話
形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（
以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、
デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば
、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに
設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（April-21-2000）でbl
astnを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下の
ようにする。 Matrix: BLOSUM62 Reward for match: 1 Penalty for mismatch: −2 Open Gap: 5 及び Extension Gap: 2 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 11 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の
全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大き
な所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、20、30、40、50
、70、100又は200のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このよ
うな長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任
意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことがで
きる。

【００５７】 高い同一性を示さない核酸配列でも、遺伝子コードが縮重するため、類似のア
ミノ酸配列をコードし得る。縮重を利用して核酸配列を変え、それぞれが実質的
に同じタンパク質をコードする多数の核酸配列を作ることができる。

【００５８】 ポリペプチド配列に用いられる用語「同一性のパーセント」又は「同一性の％
」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポ
リペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラ
インメントの方法は周知である。アラインメント方法の中には、保存的なアミノ
酸置換を考慮したものもある。詳細に上述したこのような保存的な置換は、一般
に、置換部位の電荷や疎水性が保存され、ポリペプチドの構造（従って機能も）
が保存される。

【００５９】 ポリペプチド配列間の同一性のパーセントは、MEGALIGN バージョン3.12e配列
アラインメントプログラム（上記）に組込まれるCLUSTAL Vアルゴリズムのデフ
ォルトパラメータを用いて決定可能である。CLUSTAL Vを用いる対方式のポリぺ
プチド配列のアライメントの場合、デフォルトパラメーターは、Ktuple=1、gap
penalty=3、window=5、及び「diagonals saved」=5と設定する。PAM250マトリク
スが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドアライ
ンメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の同一性のパー
セントは、「類似性のパーセント」としてCLUSTAL Vによって報告される。

【００６０】 別法では、NCBI BLASTソフトウェア一式が用いられる。例えば、２つのポリペ
プチド配列を対で比較をする場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定され
た「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (April-21-2000)でblastpを使
用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにす
る。 Matrix: BLOSUM62 Open Gap: 11 及び Extension Gap: 1 penalties Gap x drop-off: 50 Expect: 10 Word Size: 3 Filter: on 同一性のパーセントは、例えば、特定の配列番号で決められた、所定のポリペ
プチド配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例え
ば、ある大きな所定のポリペプチド配列から得られた断片、例えば、連続する少
なくとも15、20、30、40、50、70又は150の残基の断片の長さに対して測定して
もよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に
記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さ
を示すことができる。

【００６１】 「ヒト人工染色体」（HAC）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である。

【００６２】 用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持しながらヒト抗
体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列を置換した抗
体分子を指す。

【００６３】 「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件の下で
、ある1本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な1本鎖と塩基対を形成するアニーリ
ングのプロセスである。特異的なハイブリダイゼーションとは、２つの核酸配列
が高い同一性を有することを意味する。アニーリングが許容される条件の下で、
特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成され、洗浄過程の後もハイブリダ
イズしたままである。洗浄過程は、ハイブリダイゼーションプロセスの厳密性即
ちストリンジェントな決定において特に重要であり、よりストリンジェントな条
件では、非特異的な結合、即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合が減少す
る。核酸配列間のアニーリングが許容される条件は、当業者によって日常的に決
定され、ハイブリダイゼーションの間は一定であるが、洗浄過程は、目的のスト
リンジェントにするためにその最中に条件の変更が可能であり、ハイブリダイゼ
ーション特異性が得られる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が
68℃で、約6×SSC、約1%（w/v）のSDS、並びに約100μg/mlのせん断して変性し
たサケ精子DNAが含まれる。

【００６４】 一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェントは、洗浄過程を行う温度
で部分的に表すことができる。この洗浄温度は通常、所定のイオン強度とｐＨに
おける特定の配列の熱融点（Tm）より約5〜20℃低く選択される。このTmは、（
所定のイオン強度とpHの下）標的の配列の50%が完全に一致するプローブとハイ
ブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション
の条件は、周知であり、Sambrook, J. 他による, 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 第2版の1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY;
特に2巻の9章に記載されている。

【００６５】 本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ンでは、約0.2×SSC及び約1%のSDSの存在の下、約68℃で１時間の洗浄過程を含
む。別法では、65℃、60℃、55℃、42℃の温度で行う。SSCの濃度は、約0.1%のS
DSが存在の下、約0.1〜2×SSCの範囲である。通常は、遮断剤を用いて非特異的
なハイブリダイゼーションを阻止する。このような遮断剤には、例えば、約100
〜200μg/mlの変性したサケ精子DNAが含まれる。約35〜50%v/vの濃度のホルムア
ミドなどの有機溶剤が、例えば、RNAとDNAのハイブリダイゼーションなどの特定
の場合に用いることができる。これらの洗浄条件の有用な改変は、当業者には周
知である。特に高いストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、ヌ
クレオチド間の進化における類似性を示唆し得る。このような類似性は、それら
のヌクレオチド及びコードされたポリペプチドが類似の役割を果たしていること
を強く示唆する。

【００６６】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の水素結合形成
の効力によって、2つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼー
ション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析）、或いは核
酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メンブラン、フィ
ルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその核酸が固定さ
れる他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００６７】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌ
クレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００６８】 「免疫応答」は、炎症、心的外傷、免疫異常症、又は伝染性もしくは遺伝性の疾
患に関連する容態を指す。これらの容態は、細胞および全身の防御系に作用する
種々の因子（例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子）の
発現によって特徴づけられる。

【００６９】 用語「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された種々のポリヌクレオチドを
指す。

【００７０】 マイクロアレイの文脈で使用する用語「エレメント」又は「アレイエレメント」は
、基板の表面に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを指す。

【００７１】 用語「調節(modulate)」は、GFRPの活性の変化を指す。例えば、調節によって
、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はGFRPの生物学的、機能的
、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。

【００７２】 ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチド、又はそれらの任意の断片を指す。また、これらの用語は
、1本鎖または2本鎖の、センス鎖又はアンチセンス鎖のゲノム起源又は合成起源
のDNA若しくはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様若しくはRNA様物質
も指す。

【００７３】 「機能的に結合した」は、第1の核酸配列と第2の核酸配列が機能的な関係にあ
る状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与
える場合、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に結合している。一般に
、機能的に結合したDNA配列は、同じ読み枠内で2つのタンパク質をコードする領
域が結合する必要がある場合は、非常に近接或いは連続する。

【００７４】 ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基
のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオ
チドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端の
リジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに優先
的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。

【００７５】 「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出
に用いる、GFRPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列
のことである。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子が結合され単
離されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドである。典型的な標識には、放
射性アイソトープ及びリガンド、化学発光試薬、酵素がある。「プライマー」と
は、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、
通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーがポリヌクレ
オチドにアニーリングした後、あるDNAポリメラーゼ酵素によって、標的のDNA鎖
に沿って延長される。プライマーの組は、例えば、PCR法における核酸配列の増
幅（及び同定）に用いることができる。

【００７６】 本発明に用いられるプローブ及びプライマーは、既知の配列の少なくとも15の
連続するヌクレオチドを含む。特異性を高めるために、より長いプローブ及びプ
ライマーが用いることも可能である。例えば、開示した核酸配列の連続する少な
くとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100又は150のヌクレオチドを含む
。プローブ及びプライマーは、上記した例より相当長いものも用いることができ
、本明細書の表及び図面、配列表に示された任意の長さのヌクレオチドも用いる
ことができることを理解されたい。

【００７７】 プローブ及びプライマーの準備及び使用方法については、例えば、Sambrook,
J.他による、1989年、名称「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2
版の1-3巻(Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)、またはAusubel, F.M.
他による、1987年、名称「Current Protocols in Molecular Biology」(Greene
Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY)、並びに Innis他による、
1990年、名称「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」(Acade
mic Press, San Diego CA.)を参照されたい。PCR用のプライマーの組は、例えば
、Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research
, Cambridge MA)などのそのような目的のためのコンピュータプログラムを用い
て、ある既知の配列から引き出すことができる。

【００７８】 プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、当分野で周知のプライマー選
択用のコンピュータプログラムで選択される。例えば、OLIGO 4.06ソフトウェア
は、それぞれが最大100ヌクレオチドまでのPCR用のプライマーの対の選択、及び
32,000塩基までの入力ポリヌクレオチド配列から最大5,000ヌクレオチドまでの
大きなポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの分析に有用である。類似のプ
ライマー選択用プログラムには、能力を拡大する追加の機能が含まれている。例
えば、PrimOUプライマー選択プログラム（Genome Center at University of Tex
as South West Medical Center, Dallas TXより入手可能）は、メガベース配列
から特定のプライマーを選択できるため、ゲノムワイドスコープ（genome-wide
scope）におけるプライマーの設計に有用である。Primer3プライマー選択プログ
ラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA1
より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列
を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libaray）」を入力でき
る。また、Primer3は、特にマイクロアレイのオリゴヌクレオチドの選択に有用
である（後の方の２つのプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれ
のソースから得ることができ、ユーザーのニーズを満たすように変更することも
できる）。PrimerGenプログラム（UK Human Genome Mapping Project Resource
Centre, Cambridge UK より入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づい
てプライマーを設計するため、アラインメントされた核酸配列の最も保存された
領域或いは最も保存されていない領域のどちらかとハイブリダイズするプライマ
ーを選択することができる。従って、このプログラムは、固有及び保存されたオ
リゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記した任意
の選択方法で同定されたオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドの断片は、例え
ば、PCR法やシークエンシングプライマー、マイクロアレイ要素、或いはサンプ
ルの核酸の完全或いは部分的に相補的なポリヌクレオチドを同定する特定のプロ
ーブなどの、ハイブリダイゼーション技術に有用である。オリゴヌクレオチドの
選択方法は、上記した方法に制限されるものではない。

【００７９】 本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離
れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人工の組み合せは、化
学合成によって作られる場合も多いが、前出のSambrook に記載されたような遺
伝子工学の技術を用いて核酸の離れたセグメントを人工的に操作する方がより一
般的である。この「組換え核酸」には、単に核酸の一部の追加または置換、欠失
によって変更された核酸も含む。組換え核酸は、あるプロモーター配列に機能的
に結合した核酸配列を含む場合もある。このような組換え核酸は、例えば、ある
細胞を形質転換するのに用いられるベクターの一部であり得る。

【００８０】 別法では、このような組換え核酸は、この組換え核酸を発現する哺乳動物のワ
クチン接種に用いると、その哺乳動物の防衛的な免疫応答を誘発する、ワクシニ
アウイルスに基づいたウイルスベクターの一部であり得る。

【００８１】 用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。GFRPをコードする核酸
、若しくはその断片、またGFRP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞
から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶
液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA、またはcDNAや、組織
や、組織プリントその他を含み得る。

【００８２】 用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプ
チドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子又は任意の天然若しくは合
成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の
構造（例えば、結合する分子が認識する抗原決定基、つまりエピトープ）の存在
に左右されることを意味している。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特
異的である場合、標識された遊離した「A」及びその抗体を含む反応において、
エピトープA（つまり遊離し、標識されていないA）を含むポリヌクレオチドが存
在することにより、抗体に結合した標識されたAの量が低下する。

【００８３】 用語「実質的に精製され」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列又はアミ
ノ酸配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から単離又は
分離されて、その構成要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%
以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。

【００８４】 用語「置換」は、1個または2個以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を、別のヌ
クレオチド或いはアミノ酸にそれぞれ置換することを指す。

【００８５】 用語「基板」は、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、
磁気或いは非磁気のビーズ、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を
含む適切な固体または半固体の支持体を指す。基板は、ポリヌクレオチドやポリ
ペプチドが結合する壁、溝、ピン、チャンネル及び孔などの様々な表面形態をと
ることが可能である。

【００８６】 用語「形質転換」は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細胞を変化させる
プロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を用いた天然また
は人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞または真核細胞の
宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質転換の方法は、
形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定はされないが、
ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェ
クション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「形質転換された
」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとして、または宿主
の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞が含まれ、また
それは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に発現する細胞を指す。

【００８７】 特定の核酸配列の「変異配列」とは、デフォルトパラメーター設定の「BLAST
2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastnによって、あ
る核酸配列のある長さに対する該特定の核酸配列の同一性が、少なくとも40%と
決定された核酸配列のことである。このような核酸の対は、ある長さにおいて、
例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%又は98%、或いはそれ以
上の同一性を示し得る。ある変異配列は、例えば、「アレル」変異配列（上述）
または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多形性」変異配列と表すこ
とができる。スプライス変異配列は基準分子と同一性が極めて高い可能性がある
が、mRNAプロセッシング中のエキソンの択一的スプライシングによってポリヌク
レオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、
基準分子に存在する追加の機能ドメインを有したり、基準分子に存在するドメイ
ンが欠落したりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列
である。得られるポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多形性
変異配列は、所定の種と種における特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異な
る。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異な
る「１つのヌクレオチド多形性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば、或
る集団(population)、病態、病態の特徴を表し得る。

【００８８】 特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、デフォルトパラメーター設定の「
BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9 (May-07-1999)を用いるblastpによっ
て、ある核酸配列のある長さに対する該特定のポリペプチド配列の同一性が、少
なくとも40%と決定された核酸配列のことである。このようなポリペプチドの対
は、ある長さにおいて、例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95
%又は98%、或いはそれ以上の同一性を示し得る。

【００８９】 発明 本発明は、新規のヒト成長因子関連分子（GFRP）、GFRPをコードするポリヌク
レオチド、並びに発生障害、癌を含めた細胞増殖障害、炎症を含めた免疫異常症
、生殖及び心血管障害並びに感染症の診断、治療又は予防のためのこれらの組成
物の利用法の発見に基づくものである。

【００９０】 本発明のGFRP-1をコードする核酸は、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列アライ
メントのためのコンピュータ検索を用いて、卵巣腫瘍のcDNAライブラリー（OVAR
TUT03）からのインサイト社クローン2777282H1において同定された。コンセンサ
ス配列、SEQ ID NO:5は、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、イン
サイト社クローン2777282H1 (OVARTUT03)及び2777282T6 (OVARTUT03)から導出さ
れた。

【００９１】 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を包含する。GFRP-1は、125個のアミノ酸の長さであり、残基N46における1つの
潜在的Nグリコシル化部位と、残基T44及びS80におけるカゼインキナーゼIIによ
る2つの潜在的リン酸化部位と、残基S122におけるプロテインキナーゼCによる1
つの潜在的リン酸化部位とを有する。MOTIFS分析によって、GFRP-1が残基R24か
らC73までのLy-6/u-PARドメインサイン(signature)を含むことが示されている。
同様に、BLOCKS分析によって、Ly-6/u-PARドメインの特徴である全ての3つのタ
ンパク質ブロックが、GFRP-1の残基L9からC28、残基Q87からN100並びに残基P105
からL118に見られることが示されている。SPSCAN及びHMM分析によって、GFRP-1
には残基M1からL19若しくはA22までのシグナルペプチド配列が含まれることが示
されている。図１に示すように、GFRP-1は、ANUP（ARSとして知られる；GI 1536
902; SEQ ID NO:9）と化学的及び構造的類似性を有する。GFRP-1及びANUPは、39
%の同一性を共有し、ボールド体で示すように、ANUPの全ての7つのシステイン残
基はGFRP-1において保存されている。また、GFRP-1には、残基C112における付加
的なC末端が含まれる。GFRP-1及びANUPは、5.8及び5.2の推定等電点を各々有す
る酸性タンパク質である。更に、GFRP-1及びANUPは125個及び103個のアミノ酸の
長さを各々有する比較的小さいタンパク質である。また、Ly-6/u-PARドメインサ
インは、2つのタンパク質の間で保存されている。更に、GFRP-1は、マウスARS成
分B前駆体（GI 4218459）と化学的及び構造的類似性を有する。約168番目のから
197番目のヌクレオチド並びに約390番目から419番目までのヌクレオチドのSEQ I
D NO:5の断片は、SEQ ID NO:5を同定するためや、SEQ ID NO:5と関連配列とを識
別するためのハイブリダイゼーション及び増幅技術において有用である。ノーザ
ン解析によって、この配列の卵巣腫瘍組織及び胸腺から得られたcDNAライブラリ
ーにおける発現が示されている。

【００９２】 本発明のGFRP-2をコードする核酸は、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列アライ
メントのためのコンピュータ検索を用いて、乳房組織のcDNAライブラリー（BRST
NOT31）からのインサイト社クローン4185824H1において同定された。コンセンサ
ス配列、SEQ ID NO:6は、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、イン
サイト社クローン4185824H1 (BRSTNOT31)及び4185824F6 (BRSTNOT31)から導出さ
れた。

【００９３】 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を包含する。GFRP-2は、127個のアミノ酸の長さであり、残基N78における1つの
潜在的Nグリコシル化部位と、残基S110におけるcAMP及びcGMP依存性プロテイン
キナーゼによる1つの潜在的リン酸化部位と、残基S39、T80及びS110におけるプ
ロテインキナーゼCによる3つの潜在的リン酸化部位とを有する。SPSCAN及びHMM
分析によって、GFRP-2には残基M1からA19若しくはA22までのシグナルペプチド配
列が含まれることが示されている。GFRP-2の分析は、このタンパク質がCCケモカ
インであることを示唆している。GFRP-2の推定分子量は、14.3キロダルトンであ
り、それはケモカインに特有のものである。残基C30からV74までのGFRP-2のアミ
ノ酸配列は、CCケモカイン・コンセンサス配列（ExPASy PROSITE database, doc
uments PS00472, PDOC00434）と高い類似性を示す。このコンセンサス配列の特
徴である4つのシステインは、C30、C31、C58及びC73に保存されている。この領
域における1つの残存アミノ酸以外の全ては、コンセンサス配列に一致する。残
基C31とC58の間及び残基C58とC73の間のスペーシングは、コンセンサス配列から
僅かに変化している。しかしながら、hTECK等の他のCCケモカインにおいて、ス
ペーシングの同様の変化が観察されている。図２に示すように、GFRP-2はhTECK
（GI 2388627; SEQ ID NO:10）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、
GFRP-2及びhTECKは、CCケモカイン・コンセンサス配列の特徴である4つのシステ
イン（ボールド体で表示）を含めて、20%の同一性を共有する。更に、GFRP-2及
びhTECKは、10.1及び10.2の推定等電点を各々有する塩基性タンパク質である。
また、GFRP-2は、ヒトDvic-1 C-Cケモカイン（GeneSeq ID W60649）及びマウスC
Cケモカイン（GI 4140686）と化学的及び構造的類似性を有する。約287番目のか
ら316番目のヌクレオチドのSEQ ID NO:6の断片は、SEQ ID NO:6を同定するため
や、SEQ ID NO:6と関連配列とを識別するためのハイブリダイゼーション及び増
幅技術において有用である。ノーザン解析によって、この配列の5つのcDNAライ
ブラリーにおける発現が示され、そのうちの4つは乳房腫瘍組織又は正常組織か
ら得られるものである。

【００９４】 本発明のGFRP-3をコードする核酸は、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列アライ
メントのためのコンピュータ検索を用いて、平滑筋細胞のcDNAライブラリー（SM
CANOT01）からのインサイト社クローン2484440において同定された。コンセンサ
ス配列、SEQ ID NO:7は、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、イン
サイト社クローン2484440H1 (SMCANOT01)、4763347H1 (PLACNOT05)、961852R1 (
BRSTTUT03)、2026240X20C1 (KERANOT02)、867727R1 (BRAITUTO3)、1340443F1 (C
OLNTLITO3)並びに1513127T1 (PANCTUT01)及び1513127F1 (PANCTUT01)から導出さ
れた。

【００９５】 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を包含する。GFRP-3は、147個のアミノ酸の長さであり、残基N99における1つの
潜在的Nグリコシル化部位と、残基T130及びS139におけるカゼインキナーゼIIに
よる2つの潜在的リン酸化部位と、残基G4、G7、G8、G10、G24、G27及びG31にお
ける7つの潜在的Nミリストイル化部位とを有する。BLOCKS分析によって、残基E5
3からP85及び残基G91からS126のGFRP-3の領域がオステオネクチン・ドメインと
相同性を共有することが示されている。同様にPROFILESCAN分析によって、残基Q
64からC106までのGFRP-3の領域がオステオネクチン・ドメインと相同性を共有す
ることが示されている。PFAM分析によって、残基C76からC113までのGFRP-3の領
域がKazal型セリンプロテアーゼ・インヒビター・ドメインと相同性を共有する
ことが示されている。BLOCKS、PROFILESCAN及びPFAMによって同定された領域に
は、ポリシステイン・ホリスタチン(follistatin)・ドメインに類似のドメイン
が含まれる。GFRP-3には、残基M1からG31までの推定シグナルペプチドが含まれ
る。図３Ａ及び図３Ｂに示すように、GFRP-3はニワトリホリスタチン（GI 85383
4; SEQ ID NO:11）と化学的及び構造的類似性を有する。GFRP-3及びニワトリホ
リスタチンは、33%の同一性を共有する。更に、残基C55からG120までのGFRP-3の
領域は、残基C167からG231までのホリスタチンの領域と61%の同一性を共有する
。この領域には、概ね同一のスペーシングパターンを有するホリスタチンドメイ
ンに特有の10個のシステイン残基のうちの9個が含まれる。また、GFRP-3はヒト
ホリスタチン関連タンパク質FLRG（GI 3764055）と化学的及び構造的類似性を有
する。約110番目のから154番目のヌクレオチドのSEQ ID NO:7の断片は、例えば
、SEQ ID NO:7を同定するためや、SEQ ID NO:7と関連配列とを識別するためのハ
イブリダイゼーション及び増幅技術において有用である。コードされたポリペプ
チドは、例えば免疫原性ペプチドとして有用である。ノーザン解析によって、種
々のライブラリーにおけるこの配列の発現が示され、それらの少なくとも75%が
細胞増殖に関連し、また少なくとも23%が炎症に関連するものである。特に注目
すべきは、GFRP-3を発現するライブラリーの少なくとも29%が生殖組織に関連す
ることである。

【００９６】 本発明のGFRP-4をコードする核酸は、ヌクレオチド配列やアミノ酸配列アライ
メントのためのコンピュータ検索を用いて、病変乳房組織のcDNAライブラリー（
BRSTNOT32）からのインサイト社クローン4163378において同定された。コンセン
サス配列、SEQ ID NO:8は、次に挙げる重複且つ／又は伸長された核酸配列、イ
ンサイト社クローン4163378H1及び4163378F6 (BRSTNOT32)、3598059F6 (FIBPNOT
01)、2962366H1 (AORENOT09)、 3325672H2 (PTHYNOT03)、3073703H1 (BONEUNT01
)、1302516F1 (PLACNOT02)、2739211F6 (OVARNOT09)、877279T1 (LUNGAST01)及
び3094133F6 (BRSTNOTI 9)から導出された。

【００９７】 一実施例において、本発明はSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を包含する。GFRP-4は、345個のアミノ酸の長さであり、残基N25、N55及びN254
における3つの潜在的Nグリコシル化部位と、残基T20、S34、T89、T194、T195、S
258及びS323におけるカゼインキナーゼII による7つの潜在的リン酸化部位と、
残基S27、S34、S60、T251、S258及びT302におけるプロテインキナーゼCによる6
つの潜在的リン酸化部位とを有する。また、GFRP-4には、HMM分析によって決定
された残基M1とA14との間の潜在的シグナルペプチドと、ProfileScanによって決
定された残基F229とQ310との間のPDGFファミリーサインと、PFAMによって決定さ
れた残基R48とY160との間のCUBドメイン及び残基I269とC337との間のPDGFドメイ
ンとが含まれる。図４に示すように、GFRP-4は、ヒト骨形態形成タンパク質1、B
MP-1（GI 179500; SEQ ID NO:12）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細に
は、GFRP-4及びBMP-1は、BMP-1の残基599と718との間のBMP-1のC末端付近におい
て27%の同一性を共有する。GFRP-4の領域には、システイン−システイン・ジス
ルフィド結合に関与することが示唆されているBMP-1によって共有される残基C10
4及びC124における2つのシステイン残基、並びに前述の残基48と160の間で同定
されたCUBドメインが包含される。GFRP-4は、ニワトリ骨形態形成タンパク質1（
GI 2852121）と化学的及び構造的類似性を有する。約420番目のから467番目のヌ
クレオチドのSEQ ID NO:8の断片は、例えば、SEQ ID NO:8を同定するためや、SE
Q ID NO:8と関連配列とを識別するためのハイブリダイゼーション及び増幅技術
において有用である。コードされたポリペプチドは、例えば、免疫原性ペプチド
として有用である。ノーザン解析によって、種々のライブラリーにおけるこの配
列の発現が示され、それらの少なくとも57%が癌に関連し、また少なくとも30%が
炎症及び免疫反応に関連するものである。特に注目すべきは、生殖及び心血管組
織におけるGFRP-4の発現である。

【００９８】 また、本発明はGFRPの変異体を含む。好適なGFRP変異体は、GFRPアミノ酸配列
に対して少なくとも80%、90%又は95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またG
FRPの機能的もしくは構造的特徴の少なくとも1つを含む。

【００９９】 更に、本発明はGFRPをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施例
において、本発明はGFRPをコードするSEQ ID NO:5-8からなる一群より選択され
た配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。

【０１００】 更に、本発明はGFRPをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に、
そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、GFRPをコードするポリヌクレオチド
配列に対して少なくとも70%、85%又は95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性
を有する。本発明の特定の態様には、SEQ ID NO: 5-8からなる一群より選択され
た配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列が含まれ、それはSEQ ID NO: 5-8
からなる一群より選択された核酸配列に対して少なくとも70%、85%又は95%以上
のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。上記のポリヌクレオチドの変異配列
は何れもGFRPの機能的または構造的特徴の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を
コードすることが可能である。

【０１０１】 遺伝暗号の縮重の結果、既知の遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列に対する最小の類似性を有する幾つかのものを含め、多数のGFRPをコード
するポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであろ
う。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出さ
れ得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組合
せは自然発生のGFRPのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプレ
ット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はここ
に明確に開示されると考えられたい。

【０１０２】 GFRPをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳
密性の条件下に於いて、自然発生のGFRPのヌクレオチド配列に対してハイブリダ
イズ可能であることが好ましいが、それは非自然発生のコドンを含める等の実質
的に異なるコドンの用法を有するGFRP又はその誘導体をコードするヌクレオチド
配列を作り出すのに有利である。特定のコドンが宿主により利用される頻度に従
い、真核生物又は原核生物の宿主に於いてペプチドの発現が起こる割合を高める
ようにコドンを選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させる
ことなしにGFRP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更す
る別の理由は、自然発生の配列から作り出された転写物よりも長い半減期のよう
なより望ましい特性を有するRNA転写物を作り出すためである。

【０１０３】 また本発明は、GFRP及びGFRPの誘導体をコードするDNA配列、またはその断片
を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者に
よって周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿
入することが可能である。更に、合成化学を利用してGFRPをコードする配列又は
それらの任意のフラグメントに突然変異を導入し得る。

【０１０４】 また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、請求項に記載さ
れたポリヌクレオチド配列、また特にSEQ ID NO:5-8並びにそれらの断片に対し
てハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Wahl, G.M.
及びS.L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399-407；Kimmel, A.R.(1987) M
ethods Enzymol. 152:507-511参照）。ハイブリダイゼーション条件には、「定義」 に記載したアニーリング及び洗浄条件が含まれる。

【０１０５】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても
利用され得る。その方法は、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、SEQUEN
ASE（US Biochemical, Cleveland,OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐
熱性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）、或いは
ELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）に於いて発見
されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組合
せのような酵素を使用する。配列の準備は、MICROLAB 2200（Hamilton, Reno NV
）、PTC200 thermal cycler（MJ Research,Watertown MA）及びABI CATALYST 80
0 thermal cycler（Perkin-Elmer）のような装置によって自動化することが好ま
しい。次に、ABI 373若しくは377 DNAシークエンシングシステム（Perkin-Elmer
）、MEGABACE 1000 DNA配列決定システム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA
）又は他の周知の装置を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配
列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ausubei, F
.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnolo gy , Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853を参照）。

【０１０６】 GFRPをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に
於いて周知の種々のPCR法をベースとした方法で伸長し、プロモータ及び調節エ
レメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法
の1つである制限部位PCR法は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用
いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、S
arkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる
別の方法では、多岐に伸長して環状化鋳型から未知の配列を増幅するプライマー
を用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵
素断片に由来する。（Triglia, T.ら（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186）。
第3の方法として、キャプチャーPCR法(capture PCR)には、ヒト及び酵母菌の人
工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれる（例えば、Lag
erstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では
、多数の制限酵素の消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配
列の領域に組換え2本鎖配列を挿入することができる。また、未知の配列を回収
するのに用いられ得る他の方法が当業者に周知である（例えば、Parker, J.D.
ら (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-306を参照）。更に、PCR法、ネスト化プ
ライマー、PROMOTERFINDERライブラリー（Clonetech, Palo Alto, CA）を用いて
、ゲノムDNA内の歩行が可能である。この方法ではライブラリをスクリーニング
する必要がなく、イントロン／エキソン移行部の発見に有用である。全てのPCR
法をベースとした方法については、プライマーは、OLIGO^TM 4.06 Primer Analys
is software（National Biosciences Inc., Plymouth, MN）のような市販のソフ
トウェア又は別の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチド、GC含
有率が約50%以上、また約68℃〜72℃の温度で鋳型に対してアニーリングするよ
う設計され得る。

【０１０７】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。また、遺伝子の5’領域を配列を含
むことが多いランダムプライムド(random-primed)ライブラリーは、oligo d(T)
ライブラリーで完全な長さのcDNAを得られない場合に好適である。またゲノムラ
イブラリーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。

【０１０８】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、
市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラ
リーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、4つの異な
るヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、及び放射された波
長の検出を行うCCDカメラを使用し得る。出力／光強度は適切なソフトウエア（
例えば、GENOTYPER及びSEQUENCE NAVIGATOR (Perkin Elmer)）を用いて電気信号
に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子データ表示
までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法は、特定の
サンプル内に限られた量だけしか存在しないこともあるDNAの小片の配列決定に
特に好適である。

【０１０９】 本発明の別の実施例では、GFRPをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、GFRP、その断片またはその機能的等価物の適切
な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によ
って、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配
列が作り出され、GFRPの発現のために用いることができる。

【０１１０】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、GFRPをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再構
成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介
の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生成する突然変異の挿入、グリ
コシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生成
等が可能である。

【０１１１】 本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、GFRPをコード
する配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Caruthers.
M.H.ら(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn,T.ら(1980)Nucl.Acids R
es.Symp.Ser.225-232参照）。或いは、化学的手法を用いて、GFRPそのもの又は
その断片を合成することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合
成を行うことができる（例えば、Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204
参照）。また、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて合成の
自動化を行なうことができる。更に、GFRPのアミノ酸配列もしくはその任意の部
分を、直接の合成において改変することにより、並びに／又は他のタンパク質も
しくはその任意の部分に由来する配列と結合させることにより、変異体ポリペプ
チドを生成可能である。

【０１１２】 そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Methods Enzy
mol. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配
列決定法により確認することができる（Creighton,T.(1983) Proteins. Structu res avd Molecular Properties ,WH Freeman and Co.,New York,NY）。

【０１１３】 生物学的に活性なGFRPを発現させるために、GFRPをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を、適切な発現ベクター（即ち、適切な宿主に挿入されたコ
ーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入す
る。これらのエレメントには、ベクター及びGFRPをコードするポリヌクレオチド
配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5’及び3’
の非翻訳領域等の調節配列が含まれる。このようなエレメントの長さ及び特異性
は変化し得る。特定の開始シグナルを利用して、GFRPをコードする配列のより効
果的な翻訳を行なうことが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コド
ンや例えばコザック配列等の隣接する配列が含まれる。GFRPをコードする配列、
その開始コドン、及び上流の調節配列が、適切な発現ベクターに挿入された場合
は、付加的な転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは不用となり得る。しかしな
がら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、読み枠の中の
ATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターよって与えられ
なければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の
種々のものからなり得る。用いられる特定の宿主細胞株に適当なエンハンサーを
含むことにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Scharf, D.
ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照）。

【０１１４】 GFRPをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる（例え
ば、Sambrook, J.ら(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Press, Plainview, NY, ch.4,8,及び16-17；Ausubel,F.M.ら(1995) Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY,
ch.9,13,及び16参照）。

【０１１５】 GFRPをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主
系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような
微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター
（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）またはタバコモザイクウイル
ス（TMV））或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）
で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用さ
れる宿主細胞によって限定されるものではない。

【０１１６】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、GFRPをコード
するポリヌクレオチド配列の使用の目的に応じて選択できる。例えば、GFRPをコ
ードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、及
び増殖は、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）又はpSportl plasmid （Li
fe Technologies）等の多機能性E.coliベクターを用いて実施することが可能で
ある。ベクターの多数のクローニング部位へのGFRPをコードする配列のライゲー
ションによりlacZ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同
定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターは、ク
ローニングされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシークエンシング、ヘルパ
ーファージによる1本鎖の救出、入れ子状態の欠失の生成に有用である（例えば
、Van Heeke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参
照）。例えば、抗体産生の目的等に多量のGFRPが必要な場合、ハイレベルなGFRP
の発現をもたらすベクターが用いられ得る。例えば、強力な誘発性のT5又はT7バ
クテリオファージプロモーターを含むベクターが用いられ得る。

【０１１７】 GFRPの生成に酵母の発現系を利用できる。酵母菌Saccharomyces cerevisiae又
はPichia pastorisにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びPGHなどの
構成型又は誘導型のプロモーターを含む多種のベクターを使用可能である。更に
、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌若しくは細胞内保持の何れ
かを導き、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来性の配列を組込みを可能
とする（例えば、上記のAusubel, 前出; 及び Grantら(1987) Methods Enzymol.
153:516-54；Scorer, C.A.ら(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照）。

【０１１８】 植物系もGFRPの発現に使用できる。GFRPをコードする配列の転写は、ウイルス
性のプロモータ（例えば、CaMVの35S及び19Sプロモーター単独、又はTMV由来の
オメガリーダー配列との組合わせ）で促進され得る（Takamatsu, N.ら(1987) EM
BO J. 6:307-311）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換または病原体媒介の
形質移入によって、植物細胞中に導入可能である。（例えば、The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York; pp.191-1
96を参照）。

【０１１９】 哺乳動物の細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、GFRPをコードす
る配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転
写／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域に
おける挿入により、宿主細胞においてGFRPを発現する感染性のウイルスが得られ
る（例えば、Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3
659を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転写エ
ンハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることができ
る。また、タンパク質の高レベルの発現のために、SV40またはEBVをベースとし
たベクターを用いることができる。

【０１２０】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現
され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目
的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる（例えば、
Harrington, J. J.ら(1997) Nat Genet. 15:345-355）。

【０１２１】 哺乳類系の組換え型タンパク質の産生を長期間にわたり確保するためには、細
胞株におけるGFRPの安定した発現が好ましい。例えば、発現ベクターを用いてGF
RPをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能であり、その発現ベクタ
ーには、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性の発現エレメント並びに同一
或いは個別のベクターの上の選択マーカー遺伝子が含まれる。ベクターの導入の
後、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択可
能なマーカーの目的は、選択的な媒介物に対して耐性を与えることであり、また
その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能
とすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の
型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【０１２２】 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれは、
tk⁻及びapr⁻細胞において用いられる（例えば、Wigler,M.ら(1977)Cell 11:22
3-32；Lowy,I.ら(1980)Cell 22:817-23参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは
除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトトレ
キセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418に
対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase
)に対する耐性を与える（例えば、Wigler, M.ら(1980) Proc. Natl. Acad. Sci.
77:3567-70；Colberre-Garapin, F. ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照
）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、代謝産物に対する細胞の必要性を
変更するtrpB及びhisDが文献に記載されている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C
. Mulligan(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051参照）。例えば、アン
トシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP; Clontech）、β-グルクロニダーゼ及び
その基質β-グルクロニド、又はルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等の
可視マーカーを利用できる。これらのマーカーは形質転換体を同定するだけでな
く、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量
するために広く用いられる（例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Methods Mol. Biol.
55:121-131参照）。

【０１２３】 マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばGFRPをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、GFRPをコードする配列
を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同
定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、GFRPをコードする配列
とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識
遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。

【０１２４】 一般に、当業者に周知の様々な方法により、GFRPをコードする核酸配列を含み
GFRPを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR増幅、並びに核酸と
タンパク質配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若
しくはチップを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。

【０１２５】 特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれかを用いる
GFRPの発現を検出・測定するための免疫学的手法は、当業者に周知のものである
。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッ
セイ（RIAs）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。GFRP上において2つの
非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモノ
クローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay
）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これらアッセイおよび他のア
ッセイは、当業者によって開示されている（例えば、Hampton, R.ら(1990);Sero logical Methods, a Laboratory Manual , APS Press,St Paul,MN Section IV；C
oligan, J. E.ら(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Assoc
iates and Wiley-lnterscience, New York, NY; 及びPound, J.D.(1998) Immuno chemical Protocols , Humana Press, Totowa NJを参照）。

【０１２６】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。GFRPをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識(oligolabeling)、ニ
ックトランスレーション法、末端標識(end-labeling)、或いは標識ヌクレオチド
を用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、GFRPをコードする配列、又はその任
意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そのよ
うなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例えばT7
、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加え
ることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの方法
は、種々の市販のキット（Amersham Pharmacia Biotech、Promega (Madison WI)
、及びUS Biochemical提供）を用いて実施することができる。検出を容易にする
ために用いる適切なレポーター分子、即ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤
、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コファクター、インヒビター、磁性粒
子等が含まれる。

【０１２７】 細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、GFRPを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／ま
たはベクターに応じて分泌されるか、又は細胞内に保持され得る。当業者に理解
されるように、GFRPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核
生物か真核生物の細胞膜を通してGFRP分泌を指向するシグナル配列を含むように
設計することができる。

【０１２８】 更に、宿主細胞株は、挿入した配列の発現の調節能力または発現したタンパク
質を所望の形にプロセシングする能力によって選択される。このようなポリペプ
チドの修飾には、以下に限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、及びアシル化が含まれる。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、タンパク質の
標的、折り畳み及び／又は活性を特定することができる。翻訳後の活性のための
特定の特徴的な機構及び細胞装置を有する種々の宿主細胞（例えば、CHO、HeLa
、MDCK、MEK293、及びWI38）は、American Type Culture Collection（ATCC, M
anassas, VA）より入手可能であり、外来性のタンパク質の正しい修飾及びプロ
セシングを確実にするために選択され得る。

【０１２９】 本発明の別の実施例では、GFRPをコードする天然の核酸、改変された核酸、又
は組換えの核酸配列を、前述の任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種
配列に結合させ得る。例えば、市販の抗体によって識別できる異種部分を含むキ
メラGFRPタンパク質が、GFRPの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリ
のスクリーニングを促進し得る。また、市販の親和性の基質を用いて、異種タン
パク質及びペプチド部分が、融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部
分には、以下に限定されるものではないが、グルタチオンSトランスフェラーゼ
（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモ
ジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）が含
まれる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、固定されたグルタチオン、
マルトース、フェニルアルシン酸化物、カルモジュリン、及び金属キレート樹脂
の各々で同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、c-mc、及び赤血球凝
集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的に識別する市販のモノク
ロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性の
精製が可能である。また、GFRPをコードする配列と異種タンパク質配列との間に
位置するタンパク質切断部位を融合タンパク質が含むように、融合タンパク質が
操作されて、精製の後にGFRPが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発
現及び精製方法については、Ausubelの文献（1995, 前出, ch 10）に記載されて
いる。また、融合タンパク質の発現及び精製の促進のために、種々の市販のキッ
トを用いることができる。

【０１３０】 本発明の更に別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚
芽抽出系（Promega）を用いてin vitroで放射能標識したGFRPの合成を行なうこ
とができる。これらの系は、T7、T3、又はSP6プロモーターと機能的に結合した
タンパク質をコードする配列の転写と翻訳を結びつける。転写は放射能標識され
たアミノ酸前駆体（好ましくは³⁵S-メチオニン）の存在の下で起こる。

【０１３１】 組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
GFRPの断片を作り出すことができる（例えば、Creighton, 前出 pp.55-60を参照
）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができる。自動化された合
成は、例えば、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うこ
とができる。GFRPの種々の断片を個別に合成して、次に結合させて完全長分子を
作り出すことも可能である。

【０１３２】 治療 成長因子関連分子とGFRPの領域との間には、（例えば、配列およびモチーフの
前後関係において）化学的および構造的類似性が存在する。詳細には、ANUPとGF
RP-1の領域との間、CCケモカインとGFRP-2の領域との間、ニワトリホリスタチン
とGFRP-3の領域との間、並びに成長因子関連分子とGFRP-4との間には化学的及び
構造的類似性が存在する。更に、GFRP-1の発現は卵巣腫瘍及び胸腺組織と密接に
関連し、GFRP-2の発現は腫瘍状及び非腫瘍状乳房組織と密接に関連し、GFRP-3の
発現は細胞増殖、炎症及び免疫反応と密接に関連し、GFRP-4の発現は癌、炎症及
び免疫反応、生殖及び心血管組織と密接に関連する。従って、GFRPは発生障害、
癌を含めた細胞増殖障害、炎症を含めた免疫異常症、生殖及び心血管障害並びに
感染症において一定の役割を果たしていると考えられる。従って、GFRPの発現若
しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、GFRPの発現若しくは活性を
低下させることが望ましい。GFRPの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治
療においては、GFRPの発現若しくは活性を増大させることが望ましい。

【０１３３】 従って、一実施例においては、GFRPの発現若しくは活性の低下に関連する疾患
の治療または予防のためにGFRP又はその断片若しくは誘導体を患者に投与するこ
とができる。そのような疾患の例には、以下に限定しないが、尿細管性アシドー
シス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカ
ー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹
彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis
syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャ
ルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低
下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、
脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損
失等の発生障害；並びに日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑
液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモ
グロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、
リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、
骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、
卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮
の癌等の細胞増殖障害；並びに炎症、日光性角化症、後天性免疫不全症候群（AI
DS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミ
ロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性
貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、
クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性
紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病
、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症
候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（MCTD）、多発性
硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう
症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎
、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトー
デス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェル
ナー症候群や、癌、血液透析及び体外循環の合併症や、外傷や、リンパ腫、白血
病及び骨髄腫を含めた造血性の癌等の免疫疾患；並びにプロラクチン産生異常や
、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症や、発情周期の混乱、月経
周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、
子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生や、乳房の癌、乳房線維嚢
胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、
良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病(Peyronie's disease)、男性の乳
房の癌及び女性化乳房症等の生殖障害；並びにうっ血性心不全、虚血性心疾患、
狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症
、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral annular calcification）、
僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性
心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、
心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心疾患及び心臓移植の合併症等の心血管
障害；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、カリチウイル
ス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、
フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、
パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、レ
トロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類されるウイルス病原体に
よる感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、コリネバクテリウム、ク
ロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラクセラ属、キンゲラ、ヘ
モフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸内細菌（赤痢菌属及びサ
ルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス、ビブリオ属、ブルセラ
、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、norcardium、アクチノミセス、ミコ
バクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジア及びマイコプラズマに
分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラストマイセス、皮膚糸状
菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia、ヒストプラスマ及び様
々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類される真菌病原体による感染
や、プラスモディウムまたはマラリアを引き起こす体内寄生性アメーバ、レーシ
ュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニューモシスチス‐カリニ、ジ
アルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫などの組織線形動物、回
虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動物並びに住血吸虫及び条
虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫による感染等の感染症が含
まれる。

【０１３４】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むGFRPの発現若しくは
活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、GFRP又はその断片もしく
は誘導体を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。

【０１３５】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むGFRPの発現若し
くは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、適切な医薬用担体と
共に精製されたGFRPを含む医薬品組成物を患者に投与してもよい。

【０１３６】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むGFRPの発現若し
くは活性の低下に関連する疾患の治療または予防のために、GFRPの活性を調節す
るアゴニストを患者に投与してもよい。

【０１３７】 更に別の実施例においては、GFRPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の
治療または予防のために、GFRPのアンタゴニストを患者に投与してもよい。その
ような疾患の例には、以下に限定はしないが、上述の発生障害、癌を含めた細胞
増殖障害、炎症を含めた免疫異常症、生殖及び心血管障害並びに感染症が含まれ
る。一実施態様では、GFRPと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接
用いるか、或いはGFRPを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構またはタ
ーゲティングとして間接的に用いることができる。

【０１３８】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含むGFRPの発現若しくは
活性の増大に関連する疾患の治療または予防のために、GFRPをコードするポリヌ
クレオチドの相補配列を発現可能なベクターを患者に投与してもよい。

【０１３９】 他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的配列またはベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与
することもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するた
めの適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることに
より、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し
得る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上
げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。 GFRPのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたGFRPを用いて抗体を作り出したり、或いはGFRPに特異的
に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。GFRPの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生することが
できる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライ
ブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形成
を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。

【０１４０】 抗体を産生するために、GFRPか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。ラット及びマウスは、モノ
クロナール抗体生成を含むダウンストリーム適用のための宿主として好ましい。
宿主の種に応じて、免疫学的反応を増強するために種々のアジュバントを用いる
ことができる。そのようなアジュバントには、以下に限定しないが、フロイント
のアジュバント、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチンの
ような界面活性剤、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン
、ペプチド、オイルエマルジョン、KLH及びジニトロフェノールが含まれる。ヒ
トで使用するアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びCoryn ebacterium parvum が特に好ましい。

【０１４１】 GFRPの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド又はその断
片は、少なくとも5個のアミノ酸、また一般的には少なくとも10個のアミノ酸か
らなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペプチド、または
断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形の自然発生の分
子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。GFRPアミノ酸の短い伸展部が
、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の抗体が産生され
得る。

【０１４２】 GFRPのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分子
を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限定
しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハイ
ブリドーマ技術が含まれる（例えば、Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497
；Kozbor, D. ら(1985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 6
2:109-120参照）。

【０１４３】 更に、適切な抗原特異性および生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗体
遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体」
の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L.
ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Natu
re 312:604-608;Takeda, S. ら(1985)Nature 314:452-454参照）。或いは、当業
者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、GFRPに特異
的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタイ
プ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリーか
らの鎖混合(chain shuffling)によって産生することができる（例えば、Burton
D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10134-10137参照）。

【０１４４】 抗体は、免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネル
をスクリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘
導することにより産生することができる（例えば、Orlandi,R.ら(1989), Proc.
Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Winter, G.ら(1991) Nature 349:293-299参照
）。

【０１４５】 またGFRPに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプシ
ン消化により生成することができるF(ab')₂フラグメントや、F(ab')₂フラグメン
トのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメン
トが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメント
を迅速かつ容易に同定可能なように、Fab発現ライブラリーを構成し得る（例え
ば、Huse,W.D.ら(1989) Science 246:1275-1281参照）。

【０１４６】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射
線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイムノア
ッセイには、一般にGFRPとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が含ま
れる。2つの非干渉GFRPエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用い
る2部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ(two sites monoclonal b
ased immunoassay)が通常は用いられるが、競合的結合アッセイも用いられ得る
（Pound, 前出）。

【０１４７】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析等の種々の方法を用いて、GFR
P抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態
におけるOP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったもの
として定義される。多数のGFRPエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナ
ール抗体試薬に対して測定されたKaは、GFRP抗体の平均親和性または結合活性を
表す。特定のGFRPエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬に対して測
定されたKaは、親和性の真の測定値を表す。Kaの値が10⁹〜10¹²L/molの高い親和
性の抗体試薬は、GFRP抗体複合体が厳密な操作に耐えなければならないイムノア
ッセイに用いるのが好ましい。Kaの値が10⁶〜10⁷L/molの低い親和性の抗体試薬
は、最終的にGFRPが活性化状態で抗体から解離する必要がある免疫精製(immunop
urification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Catty, D. (1988) Antib odies, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddel
l, J. E.及びCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。

【０１４８】 ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、ある一定の
ダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適合性を判定する。例
えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な
抗体を含むポリクロナール抗体試薬が、GFRP抗体複合体の沈殿を必要とする方法
に通常は使用される。種々の適用における抗体の特異性、タイター、及び結合活
性に対する処理、並びに抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である （
例えば、Catty, 前出、及びColiganら, 前出を参照）。

【０１４９】 本発明の別の実施例では、GFRPをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、GFRPをコードするポリヌクレ
オチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、GFRPをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、GF
RPの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子また
は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、GFRPをコードする配
列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。

【０１５０】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、GFRPをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を
発現するためのベクターを産生することができる（例えば、Sambrook, 前出、及
びAusubel, 1995, 前出 参照）。

【０１５１】 GFRPをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、GFRPをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込
みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続け得る。一過性の発現は、非複製
ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合
にはさらに長い期間持続し得る。

【０１５２】 前述のように、GFRPをコードする遺伝子の制御、5’、又は調節領域に対する
相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによ
って、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から
+10〜-10の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせ
ん体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ
、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能
力を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Gee, J.E.ら(1994)I
n: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futur
a Publishing Co.,Mt.Kisco,NY,pp.163-177参照）。転写物のリボソームへの結
合を阻止することによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチ
センス分子を設計し得る。

【０１５３】 リボザイム、つまり酵素RNA分子を用いてRNAの特異的切断を触媒することがで
きる。リボザイム作用機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異
的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる
。例えば、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、GFRPをコード
する配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。

【０１５４】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す
る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す
ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ
クレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価するこ
とができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(ribon
uclease protection assay)を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションに対する接触性(accessibility)の検査により評価することがで
きる。

【０１５５】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、GFRPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo
の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが
できる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作
製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。

【０１５６】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ
とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及
び／又は3’末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ
るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを
使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌク
レアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子に拡張可
能である。

【０１５７】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療
法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（例えば、Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466参照
）。

【０１５８】 前述の治療法は何れも、例えばヒト、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ及び
サル等の哺乳類を含む、治療が必要な任意の対象に適用することができる。

【０１５９】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、GFRP、GFRPの
抗体、GFRPの模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなる
ものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような1以上の
他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担体
には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖或いは水
が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホルモンと
結合した形で患者に投与されうる。

【０１６０】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれ得る。

【０１６１】 有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤に
するための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認め
られる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Remingto ns Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton, PA）の最新版に
記載されている。

【０１６２】 経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められ
る担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により
、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。

【０１６３】 経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望によ
り、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア(dra
gee core)を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えるこ
とができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤や、トウモロコシ
、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並
びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架
橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムの
ようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。

【０１６４】 糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらには
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効
成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。

【０１６５】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソ
ルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる
。軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂
肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解
或いは懸濁される。

【０１６６】 非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液、リンゲル
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中で配合す
ることができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウ
ム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含み
うる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい
。適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂肪性の油や、オレイ
ン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含
まれる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。
所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可
能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。

【０１６７】 局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。

【０１６８】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤と
しては、使用前に緩衝剤配合したpH4.5〜5.5の範囲にある1mM〜50mMのヒスチジ
ン、0.1%〜2%のショ糖、2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結
乾燥粉末でもよい。

【０１６９】 医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治
療のためにラベル付けできる。GFRPの投与の場合では、このようなラベルには、
投与量、投与頻度、投与方法が表示される。

【０１７０】 本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するた
めに有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。

【０１７１】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ
、ブタのような動物モデルまたは腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにお
いて見積もることができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するた
めに動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトに
おける投与量や投与経路を決定することができる。

【０１７２】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるGFRPまたはその断片
、GFRPの抗体、GFRPのアゴニスト、GFRPのアンタゴニスト、又はGFRPのインヒビ
ターの有効成分の量を指す。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動
物における標準的な製薬方法により、例えばED₅₀(母集団の50%における治療的な
有効投与量)またはLD₅₀(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによっ
て決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、LD ₅₀ / ED₅₀比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すこ
とが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの
使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分
の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ED₅₀を含む循環する濃度の
範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応
じて、投与量はこの範囲内で変化する。

【０１７３】 正確な用量は、治療が必要な患者に関連する要因を考慮して医師が決定する。
投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持す
るために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な患
者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬剤、
反応感受性、および治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物は、
半減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて3〜4日毎に、1週間毎に、或いは
2週間に1度投与してもよい。

【０１７４】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投
与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。

【０１７５】 診断 別の実施例においては、GFRPに特異的に結合する抗体を、GFRPの発現によって
特徴づけられる疾患の診断や、GFRP又はGFRPのアゴニスト、アンタゴニスト若し
くはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのものと
同様の方法で作製することができる。GFRPの診断のアッセイには、ヒトの体液、
細胞或いは組織の抽出物においてGFRPを検出するために抗体および標識を用いる
方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有
結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識する
ことができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのうちの幾
つかについては前述の通りである。

【０１７６】 ELISA、RIA及びFACSを含む、GFRPを測定するための種々のプロトコルが当技術
分野では周知であり、またこれによりGFRP発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。GFRPの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類（例えば、人間の被検者）の正常な患者から得られる体液
或いは細胞抽出物とGFRPの抗体を結合させることによって確立できる。標準の複
合体形成量は、測光手段等の種々の方法を用いて定量化できる。患者の生検組織
からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたGFRPの量を、標準値と
比較する。標準値と患者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメータを確
立する。

【０１７７】 本発明の別の実施例において、GFRPをコードするポリヌクレオチドを、診断の
目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチド
は、GFRPの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検出や
定量のために用いられる。診断アッセイは、GFRPが存在、非存在、過剰発現の何
れの状態かを識別したり、治療の処置の際にGFRPレベルの調節をモニタリングす
るために用いることができる。

【０１７８】 一態様では、GFRPまたは密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用い
て、GFRPをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性
、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5’調節領域）に
由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存されたモチー
フ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増幅の（
最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブがGFRPを
コードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列も同
定するかが決定される。

【０１７９】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はGFRPをコードする任意の配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有するべ
きである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNA若しくはRNAか、ま
たSEQ ID NO:5-8の配列に由来するものか、或いはGFRP遺伝子のイントロン、エ
ンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列に由来するものでもよい。

【０１８０】 GFRPをコードするDNAのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを作
製するための手段には、mRNAプローブを作り出すためにGFRP又はGFRP誘導体をコ
ードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。こ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、適切なRNAポリメラ
ーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroでRNAプ
ローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブ
は種々のリポータグループにより標識され、例えば、その標識は、³²Pや³⁵Sのよ
うな放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結
合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等である。

【０１８１】 GFRPをコードするポリヌクレオチド配列を、GFRPの発現に関連する疾患の診断
のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限定はしな
いが、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症
、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群
（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス
症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形
成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝
性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小
児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白
内障、感覚神経性聴力損失等の発生障害；並びに日光性角化症及び動脈硬化、ア
テローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄
線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、
並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的
には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、
腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、
脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌等の細胞増殖障害；並びに炎症、日光性角化症、後
天性免疫不全症候群（AIDS）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギ
ー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬
化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢
炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺
気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候
群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸
球増加症、過敏性大腸症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結
合織病（MCTD）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症
、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症
候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ
ー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症
、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群や、癌、血液透析及び体外循環の合併症や、
外傷や、リンパ腫、白血病及び骨髄腫を含めた造血性の癌等の免疫疾患；並びに
プロラクチン産生異常や、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症や
、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、
子宮内膜や卵巣の腫瘍、子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生や
、乳房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生理、
精巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病(Peyroni
e's disease)、男性の乳房の癌及び女性化乳房症等の生殖障害；並びにうっ血性
心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患
、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪状石灰化（mitral ann
ular calcification）、僧帽弁脱出、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心
内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチ
ノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心疾患及び心臓
移植の合併症等の心血管障害；並びにアデノウイルス、アレナウイルス、ブンヤ
ウイルス、カリチウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、ヘパドナウイル
ス、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パルボウイル
ス、パポーバウイルス、パラミキソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイ
ルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス及びトガウイルスに分類
されるウイルス病原体による感染や、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、
コリネバクテリウム、クロストリジウム属、髄膜炎菌、淋菌、リステリア、モラ
クセラ属、キンゲラ、ヘモフィルス属、レジオネラ、ボルデテラ、グラム陰性腸
内細菌（赤痢菌属及びサルモネラ、カンピロバクターを含む）、シュードモナス
、ビブリオ属、ブルセラ、フランシセラ、エルシニア、バルトネラ、norcardium
、アクチノミセス、ミコバクテリア、スピロヘターレス、リケッチア、クラミジ
ア及びマイコプラズマに分類される細菌病原体による感染や、コウジカビ、ブラ
ストマイセス、皮膚糸状菌、クリプトコッカス、コクシジオイデス、malasezzia
、ヒストプラスマ及び様々な真菌症を引き起こすその他の真菌病原体に分類され
る真菌病原体による感染や、プラスモディウムまたはマラリアを引き起こす体内
寄生性アメーバ、レーシュマニア、トリパノソーマ属、トキソプラズマ、ニュー
モシスチス‐カリニ、ジアルジア属などの腸内原生動物、トリコモナス、旋毛虫
などの組織線形動物、回虫属などの腸内線形動物、リンパのフィラリア性線形動
物並びに住血吸虫及び条虫（サナダムシ）などの線形動物に分類される寄生虫に
よる感染等の感染症が含まれる。GFRPをコードするポリヌクレオチド配列を、患
者の生検組織や体液を利用するサザンブロット法またはノーザン解析、ドットブ
ロット法或いは他の膜をベースとした技術や、PCR技術や、ディップスティック
試験法(dipstick)、ピン及びマルチフォーマットELISA様アッセイや、マイクロ
アレイにおいて用いて、GFRP発現の変化を検出することができる。このような定
性的または定量的試験法は当業者に周知のものである。

【０１８２】 特定の態様では、特に上述のような関連疾患の存在を検出するアッセイにおい
て、GFRPをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。GFRPをコードするヌ
クレオチド配列を標準的な方法で標識し、またハイブリダイゼーション複合体の
形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることができる。
適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、シグナルを定量し
て標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、対照サンプルに
比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのGFRPをコードするヌクレオチ
ド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。また、このような
アッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリン
グにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもできる。

【０１８３】 GFRPの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な患者から採取された体
液或いは細胞抽出物をGFRPをコードする配列又はその断片と結合させることによ
り達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な患者から得られる値と
、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験から得られる値
とを比較することにより定量することができる。このように正常なサンプルから
得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較する
ことができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。

【０１８４】 一旦疾患の存在が確認されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者で観
察されるレベルに近づき始めたか否かを評価できる。連続的なアッセイから得ら
れる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示すことができる。

【０１８５】 癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（不十分もしく
は過剰に発現されたもの）の存在が、疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨
床的症状が現れる前に疾病を検出するための手段となり得る。このタイプのより
決定的な診断により、健康の専門家が予防的処置を講じたり、より早期に積極的
な治療を行なうことが可能となり、故に癌の発生や更なる進行を予防することが
できる。

【０１８６】 GFRPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの更なる診断のため
の使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成さ
れるか、酵素を用いて作製されるか、或いはin vitroで作製されてもよい。オリ
ゴマーは、好ましくはGFRPをコードするポリヌクレオチドの断片、またはGFRPを
コードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の
遺伝子或いは状態を同定するための最適化された条件の下で用いられる。また密
接に関連するDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩
やかな厳密性の条件で用いることができる。

【０１８７】 またGFRP発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及
び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(
1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Bioche
m. 229-236参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが種々の
希釈溶液中に存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELIS
A形式のアッセイを実施することによって加速することができる。

【０１８８】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる
。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並び
に治療薬の開発およびその活性のモニタリングにおいて有用である。

【０１８９】 マイクロアレイが準備され、それを用いて当業者に周知の方法で分析してもよ
い（例えば、Brennan, T.M.ら(1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M.
ら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweilerら(1995) P
CT application WO95/251116; Shalom D.ら (1995) PCT application WO95/355
05: Heller. R.A. ら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 並びにHel
ler. M.J.ら(1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照）。

【０１９０】 本発明の別の実施例においては、GFRPをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを
作り出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の部分、又は
人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、例
えば、ヒト人工染色体（HACs）、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体（
BACs）、細菌性P1作製物又は一本鎖染色体cDNAライブラリーがある（例えば、Ha
rrington. J.J.ら(1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood R
ev. 7:I27-134; 並びにTrask. B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照）
。

【０１９１】 蛍光性in situハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的な染色体マッ
ピング技術や遺伝地図データと関連し得る（例えば、Heinz-Ulrichら(1995)in M
eyers, 前出, pp.965-968を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、ま
たはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）World Wide Webサイトに見
られる。物理的な染色体地図上のGFRPをコードする配列の位置および特定の疾病
、もしくは特定の疾病の素因との関連性が、疾患に関係するDNAの領域の範囲を
定めるのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、ま
た発症した個体との間の遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１９２】 遺伝地図を拡大するために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション
及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術
を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知であ
っても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連するマ
ーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新たな配列を染色体のアー
ム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニングま
たは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値ある情報
を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域（例えば、11q2
2-23に対する毛細血管拡張性運動失調 ）への遺伝連鎖による不完全な位置ぎめ
がなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のため
の関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る（例えば、Gatti, R.A.ら（1988
）Nature 336:577-580参照）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常
者の染色体の位置と、キャリア、又は発症した個体の、転座、逆位等によって生
じた染色体の位置との違いを検出することもできる。

【０１９３】 本発明の別の実施例においては、GFRPや、その触媒作用性または免疫原性断片
、又はそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のであり得る。GFRPと試験する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。

【０１９４】 別の薬物スクリーニング技術によって、目的のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、
Geysenら(1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法においては、多くの異なる
小形の試験化合物が固体基板において合成される。試験化合物をGFRP又はその断
片と反応させ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合GFRPを検
出する。また、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製さ
れたGFRPをプレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性
抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。

【０１９５】 別の実施例においては、GFRPの結合のためにGFRPと結合可能な中和抗体が試験
化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることがで
きる。この方法において、抗体を用いて、1以上の抗原決定基をGFRPと共有する
任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１９６】 更に別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレット
遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含め現在周知のヌクレオチ
ド配列の特性に基づくものであれば、GFRPをコードするヌクレオチド配列を、未
だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。

【０１９７】 当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用でき
るであろう。従って、以下に記す特定の実施例は、単なる例示であって本発明を
限定するものではない。

【０１９８】 本明細書に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに米国特許出願[代
理人明細書番号PF-0627P]（1998年10月28日出願）、米国特許出願[代理人明細書
番号PF-0644P]（1998年12月11日出願）及び米国特許出願[代理人明細書番号PF-0
688P]（1999年5月17日出願）については、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。

【０１９９】

【実施例】

１ cDNAライブラリーの作製 OVARTUT03 cDNAライブラリーは、52歳の混血人種の女性の腹式子宮全摘出、両
側卵管卵巣摘出、腹膜及びリンパ構造の生検、局所的リンパ節切除並びに腹膜組
織破壊の際に採取された卵巣腫瘍組織から単離したRNAを用いて作製した。病変は
、左卵巣に腫瘤を形成する浸潤性グレード（4の）3のseroanaplastic carcinoma
を示していた。複数の腫瘍インプラントが、卵巣及び卵管、子宮の後面及び盲管
に存在していた。複数の平滑筋腫(leiomyomata)が確認された。また、病変は、
網、盲管腹膜(periotoneum)、左広間腹膜並びに結腸間膜に関わる転移性グレー
ド3のseroanaplastic carcinomaを示していた。患者の病歴には、乳癌、慢性消
化性潰瘍及び関節痛が含まれていた。家族歴には、大腸癌、脳血管障害、乳癌、
II型糖尿病、食道癌及び抑うつ障害が含まれていた。

【０２００】 BRSTNOT31 cDNAライブラリーは、57歳の白人女性の片側拡大単純乳房切除術の
歳に採取された右乳房組織から単離したRNAを用いて作製した。関連する病変腫瘍
組織は、残留性の顕微鏡的な浸潤性グレード3管型腺癌及び広汎性グレード2管内
癌腫を示していた。複数の腋窩リンパ節は、極小の結節外伸展を伴う転移性腺癌
に陽性であった。エストロゲン及びプロゲステロン受容体に対する免疫ペルオキ
シダーゼ染色は陽性であった。患者の病歴には、良性高血圧症、高脂血症、心臓
のリズム障害、良性結腸腫瘍、乳房嚢腫及び乳房腫瘍が含まれていた。家族的に
は、良性高血圧症、急性白血病、初期の肝臓癌及び肺癌が含まれていた。

【０２０１】 SMCANOT01ライブラリーは、心臓移植の際に男性の移植心臓から採取された大
動脈の平滑筋細胞株から単離したRNAを用いて作製した。 BRSTNOT32ライブラリーは、46歳の白人女性の両側皮下乳房切除術の際に採取
された右乳房病変組織から単離したRNAを用いて作製した。病変は、両側に非増殖
性の線維嚢胞症を示していた。患者は、乳房の線維性硬化症を示していた。患者
の病歴には、尿路感染症が含まれていた。家族歴には、乳癌、良性高血圧症及び
アテローム性冠状動脈疾患が含まれていた。

【０２０２】 OVARTUT03及びBRSTNOT31の場合、凍結組織はPolytron PT-3000（Brinkmann In
struments, Westbury, NY）を用いて、TRIZOL試薬（1mg tissue/10ml TRIZOL; L
ife Technologies）、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相性の
溶液にホモジナイズして溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロロ
ホルムを加えて（1:5 v/v）混合物を遠心分離して相を分離した。上側の水相を
新しい管に移し、イソプロパノールを加えてRNAを沈澱させた。RNAをRNアーゼを
含まない水に再懸濁し、DNアーゼで処理した。RNAをフェーノール-クロロホルム
で1回再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで再沈澱させた。

【０２０３】 SMCANOT01ライブラリーの場合、冷凍組織をPolytron PT-3000 homogenizer（B
rinkmann Instruments）を用いて、グアニジニウムイソチオシアネート溶液中で
ホモジナイズ及び溶解した。RNAをStratagene社のRNA単離プロトコル（Stratage
ne, La Jolla CA）に従って単離した。RNAを酸性フェノールで2回抽出し、酢酸
ナトリウム及びエタノールで沈澱させ、RNアーゼを含まない水で再懸濁させ、DN
アーゼで処理した。

【０２０４】 BRSTNOT32ライブラリーの場合、凍結組織はPolytron PT-3000（Brinkmann Ins
truments, Westbury, NY）を用いて、TRIZOL試薬（0.8mg tissue/12ml TRIZOL;
Life Technologies）、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートの単相性
の溶液にホモジナイズして溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロ
ロホルムを加えて（1:5 v/v）溶解物を遠心分離した。クロロホルムの上層を新
しい管に移し、RNAをイソプロパノールで抽出し、DEPC処理した水に再懸濁させ
、37℃で25分間かけてDNアーゼで処理した。mRNAを酸性フェノール-クロロホル
ム（pH4.7）で1回抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノールを用
いて沈澱させた。

【０２０５】 OVARTUT03、BRSTNOT31、SMCANOT01及びBRSTNOT32 cDNAライブラリーを作製す
るために、mRNAをQIAGEN OLIGOTEX kit（QIAGEN, Inc., Chatsworth CA）を用い
て単離した。mRNAは、cDNA合成及びプラスミドクローニングのためのSUPERSCRIP
T プラスミドシステムを（Life Technologies）の推奨プロトコルに従って処理
した。cDNAをSEPHAROSE CL4Bカラム（Pharmacia）上で分画し、400bpを超える大
きさのcDNAをpINCY又はpINCY1プラスミドに結び付けた。その後、組換えプラス
ミドをDH5αコンピテント細胞（Life Technologies）に形質転換した。

【０２０６】 ２ cDNAクローンの単離 プラスミドDNAをその細胞から放出させ、これをR.E.A.L PREP 96 Plasmidキッ
ト（QIAGEN, Inc.）を用いて精製した。このキットにより、マルチチャネル試薬
ディスペンサを利用して96ウエルブロックで96個のサンプルの精製が同時に可能
である。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変更した。（１）25mg/lのカル
ベニシリン及び0.4%のグリセロールを含む1mlの滅菌Terrific Broth （Life Tec
hnologies）において細菌を培養した。（２）接種の後に培溶液を19時間インキ
ュベートし、その後この細胞を0.3mlの溶解バッファーに溶解した。（３）イソ
プロパノール沈殿を行った後、プラスミドDNAのペレットを0.1mlの蒸留水に再懸
濁した。そのプロトコルの最終ステップの後、サンプルを96ウェルブロックに移
して4℃で保管した。

【０２０７】 或いは、高スループットフォーマットの直接結合PCR法によって、宿主細胞溶
解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1-1
4）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。サ
ンプルを処理して384ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度を
PICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene, OR）及びFLUOROSKAN II蛍光スキャ
ナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量的に測定した。

【０２０８】 ３ 配列決定および分析 cDNAシークエンシング反応は、標準的な方法或いはABI CATALYST 800 （Perki
n-Elmer）thermal cycler若しくはPTC-200 thermal cycler（MJ Research）等の
高スループットの機器とHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）
若しくはMICROLAB 2200（Hamilton）liquid transfer systemとを共に用いて処
理した。cDNAシークエンシング反応は、Amersham Pharmacia Biotech社によって
提供された試薬か、又はABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready
reaction kit（Perkin-Elmer）のようなABIシークエンシングキットに供給され
た試薬を用いて準備した。cDNAシークエンシング反応の電気泳動的な分別および
標識したポリヌクレオチドの検出は、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシス
テム（Molecular Dynamics）；ABI PRISM 373若しくは377シークエンシングシス
テム（Perkin-Elmer）と標準的なABIプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェ
アとの組合せ；又は当業者に周知の他の配列分析システムを用いて実施した。cD
NA配列中の読み枠は、標準的な方法を用いて識別した（Ausubel, 1997, 前出, u
nit 7.7のレビュー）。cDNA配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した
方法で伸長した。

【０２０９】 周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて用いて、cD
NAシークエンシングから得られたポリヌクレオチド配列を構築および分析した。
表１は、利用したツール、プログラム、及びアルゴリズムの概要、並びに適切な
説明、引用文献、及び閾値パラメータを示す。表１の第1列は用いたツール、プ
ログラム、及びアルゴリズムであり、第2列はそれらの簡単な説明であり、第3列
は引用文献（それらの全てはここで言及することにより本明細書の一部とする）
であり、第4列は2つの配列間の一致の程度の評価に用いた適切なスコア、確率値
、及び他のパラメータである（スコアが高いほど2つの配列間の相同性が高い）
。配列は、MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineering, South
San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析した
。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アライメントは、整列した配列間の同
一性%を計算するMEGALIGNマルチシーケンス・アライメント・プログラム（DNAST
AR）に組込まれたclustalアルゴリズムによって指定されたデフォルトのパラメ
ータを用いて作成した。

【０２１０】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST、動的計画法及びジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー及
びポリA配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実施した。次
に、配列をBLAST、FASTA及びBLIMPSに基づくプログラムを用いてGenBankの霊長
類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物及び真核生物のデータベースや、BLOCKS、PRIN
TS、DOMO、PRODOM及びPFAM等の公共のデータベースでから選択した配列に対して
問合わせて注釈を得た。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて配
列を完全長のポリヌクレオチドに構築し、GeneMark、BLAST及びFASTAに基づいた
プログラムを用いて読み枠にスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチド配
列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いてその完全長のポ
リヌクレオチド配列をGenBankデータベース（前述）、SwissProt、BLOCKS、PRIN
TS、DOMO、PRODOM、Prosite及び隠れマルコフモデル（HMM）に基づくPFAMなどの
タンパク質ファミリーデータベースに問い合わせることによって分析した。HMM
は、遺伝子ファミリーの共通一次構造を解析する確率的アプローチである（例え
ば、Eddy, S.R. (1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6:361-365を参照）。

【０２１１】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築および分析のための上
述のプログラムは、SEQ ID NO:5-8からのポリヌクレオチド配列の断片の同定に
も使用した。ハイブリダイゼーション及び増幅に有用な約20から約4000までのヌ
クレオチドの断片については、前述の「発明」の部分で説明した。

【０２１２】 ４ ノーザン解析 ノーザン解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合しているメンブレンと
、標識されたヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションに関わる（例えば、
Sambrookら、前出, ch.7；並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16参照）。

【０２１３】 BLASTを使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ（I
ncyte Pharmaceuticals）等のヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連す
る分子を検索する。この分析は、多くのメンブレンをベースとしたハイブリダイ
ゼーションに比べてより高速である。さらにコンピュータ検索の感度を変更して
、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは類似の何れとして分類されるかを決定
することができる。 検索の基準は、以下で定義される積スコア(product score
)である。 （配列一致%×最大BLASTスコア%）／100 積スコアは、2つの配列間の類似の程度および配列一致の長さの両方を考慮に入
れる。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり
、積スコア70の場合は正確な一致となる。類似の分子は通常15〜40間の積スコア
を示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでは関連し
た分子として同定される。

【０２１４】 ノーザン解析の結果は、GFRPをコードする転写物が発生したライブラリーの割
合の分布として報告される。分析には、器官／組織および疾患によるcDNAライブ
ラリーの分類が含まれる。器官／組織の分類には、心血管、皮膚、発生、内分泌
、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖及び泌尿器が含まれる。疾病／症状の
分類には、癌、炎症／心的外傷、細胞増殖、神経及び貯留(pooled)が含まれる。
各カテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリーを数えて、カテゴリ
ー全体にわたるライブラリーの合計数で割った。各組織に特異的な発現ならびに
疾病、疾患若しくは症状に特異的な発現の割合を前述の「発明」の項に示した。

【０２１５】 ５ GFRPをコードするポリヌクレオチドの伸長 SEQ ID NO:5-8の完全長の核酸配列は、完全長分子の適切な断片を伸長してこ
の断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生成した。一方のプ
ライマーは既知の断片の5'の伸展を開始するために合成し、他方のプライマーは
既知の断片の3'の伸展を開始するために合成した。開始プライマーは、OLIGO 4.
06ソフトウェア（National Biosciences）或いは他の適切なプログラムを用いて
、約22〜30個のヌクレオチドからなる長さであって50%以上のGC含有物を有し、
且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにcDNAから設計した。
ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を生ずるようなヌクレオチドの
如何なる伸長も回避した。

【０２１６】 選択されたヒトcDNAライブラリーを用いてこの配列を伸長した。2段階以上の
伸長が必要であるか、又は望ましい場合には、プライマーの付加的な或いはネス
トした組を設計する。

【０２１７】 当業者に周知の方法を利用したPCR法で高い忠実度の増幅を実施した。PCRは、
PTC-200 thermal cycler（MJ Research, Inc.）用いて96ウェルプレートにおい
て行った。反応混合液には、DNA鋳型、200nmolの各プライマーと、Mg²⁺、(NH₄)₂ SO₄及びβ−メルカプトエタノールを含む反応緩衝液と、Taq DNAポリメラーゼ（
Amersham Pharmacia Biotech）と、ELONGASE酵素（Life Technologies）と、Pfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）とが含まれる。プライマーの組PCI A及びPCI B
に対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 或いは、プライマーの組T7及びSK+に対して以下のパラメータを用いた。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で15秒 ステップ3 57℃で1分間 ステップ4 68℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を20回繰り返す ステップ6 68℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 各ウェルのDNA濃度は、0.5μlの希釈していないPCR生成物及び1X TEに溶解し
た100μlのPICOGREEN定量試薬（0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eu
gene OR）を不透明な蛍光光度計プレート（Coming Costar, Acton MA）の各ウェ
ルに分配し、DNAが試薬と結合可能なようにして測定した。このプレートをFluor
oskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンして、サンプルの
蛍光を計測し、またDNA濃度を定量化する。反応混合物の5〜10μlの一定分量を1
%のアガロースミニゲル上での電気泳動法によって解析し、何れの反応物が配列
の伸長に成功したかを決定する。

【０２１８】 伸長したヌクレオチドを脱塩および濃縮し、384ウェルプレートに移し、CviJI
コレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI
）で消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結する前に
音波処理またはせん断を実施した。ショットガン配列決定のために、消化したヌ
クレオチドを低濃度（0.6〜0.8%）のアガロースゲル上に分離し、断片を切除し
、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New
England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia
Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部
位のオーバーハングを満たし、更にコンピテントE.coli細胞に形質移入した。形
質移入した細胞を抗生物質を含む培地において選択し、個々のコロニーを選択し
てLB/2X carb培養液の384ウェルプレートに37℃で終夜培養した。

【０２１９】 細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）及びPfu
DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した
。 ステップ1 94℃で3分間 ステップ2 94℃で１５秒 ステップ3 60℃で1分間 ステップ4 72℃で2分間 ステップ5 ステップ2、3、及び4を29回繰り返す ステップ6 72℃で5分間 ステップ7 4℃で保管 前述のようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）でDNAを定量化した。DNA回収
率の低いサンプルは、上記の条件で再度増幅した。サンプルを20%のジメチルス
ルホキシド(dimethysulphoxide)（1:2, v/v）で希釈し、DYENAMIC energy trans
fer sequencingプライマー並びにDYENAMIC DIRECTキット（Amersham Pharmacia
Biotech）若しくはABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reac
tion kit（Perkin-Elmer）を用いて配列決定した。

【０２２０】 同様に、SEQ ID NO:5-8のヌクレオチド配列を使用し、上記手順、5’伸長用に
設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲノムライブラリーを用いて5’調
節配列が得られる。

【０２２１】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO: 5-8から得られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA
、ゲノムDNA又はmRNAをスクリーニングする。約20の塩基対からなるオリゴヌク
レオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片にも概ね
同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア（National
Biosciences）のような当技術分野のソフトウエアを用いて設計し、50pmolの各
オリゴマー、250μCiの[γ-³²P]アデノシン3リン酸 （Amersham Pharmacia Biot
ech）及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を結びつける
ことにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPHADEX G-25超微細
分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用
いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコッ
トを、以下のエンドヌクレアーゼ、即ちAse I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1又
はPvu II（DuPont NEN）の中の1つで消化されたヒトゲノムDNAの典型的なメンブ
レンに基づくハイブリダイゼーション解析に用いる。

【０２２２】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロンメンブ
レン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイ
ゼーションは40℃で16時間かけて実施する。非特異的シグナルを除去するために
、0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に
厳密性を増す条件下で、ブロットを室温にて順次洗浄する。ハイブリダイゼーシ
ョンパターンをオートラジオグラフィー若しくは代替イメージング手段を用いて
視覚化して比較する。

【０２２３】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の
表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Baldeschweiler
, 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定の
アレイを用いて、熱、UV、化学的もしくは機械的結合プロシージャを利用して、
基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製
で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメン
トを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取
除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレ
イ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な
存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。

【０２２４】 完全長cDNA、発現された配列タグ（ESTs）、又はそれらの断片は、マイクロア
レイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者
に周知のLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）のようなソフトウェアを用いて選択
可能である。本発明のヌクレオチド配列の1つに対応する完全長cDNA、EST、若し
くはそれらの断片を、又は本発明に関連するcDNAライブラリーから無作為に選択
されたものを、例えばスライドガラスのような適切な基板に配置する。そのcDNA
を、例えばUV架橋の後に熱的および化学的に処置し、さらに乾燥することによっ
て、スライドガラスに固定する（例えば、Schena, M.ら (1995) Science 270:46
7-470; 並びにShalon, D.ら(1996) Genome Res. 6:639-645参照）。蛍光プロー
ブを作製し、基板上のエレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は
前述の方法によって解析する。

【０２２５】 ８ 相補的ポリヌクレオチド GFRPをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生GF
RPの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約15〜30塩基対を
含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大
きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。OLIGO 4.06ソ
フトウェア及びGFRPのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設
計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な5’配列
から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用いる
。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してGFRPをコード
する転写物へのリボソームの結合を防ぐ。

【０２２６】 ９ GFRPの発現 GFRPの発現及び精製は、細菌またはウイルスに基づく発現系を用いて実施され
る。細菌におけるGFRPの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とcDNAの転写レベルを
高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにcDNAをサブクローニング
する。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、lacオペレ
ーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及
びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、BL
21(DE3)などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプ
ロピルβ−Dチオガラクトピラノシド（IPTG）での誘発によりGFRPを発現する。
真核生物の細胞におけるGFRPの発現は、昆虫または哺乳動物の細胞株に、一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体ウイ
ルス（AcMNPV）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺
伝子転移の何れかによって、GFRPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染
力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのcDNAの転写が
行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Spodoptera frugiperda
（Sf9）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染に
も用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が
必要となる。（例えば、Engelhard. E. K.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 91:3224-3227; Sandig, V.ら(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945を参照）。

【０２２７】 殆どの発現系において、GFRPは、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ（G
ST）、またはFLAG若しくは6-His等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質
として合成され、粗製の細胞溶解物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベー
スの精製を迅速に1段階で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26キ
ロダルトンの酵素のGSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条件
の下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる（Am
ersham Pharmacia Biotech）。精製の後に、特定の操作部位においてGFRPからGS
T部分をタンパク分解的に切断可能である。8個のアミノ酸のペプチドであるFLAG
により、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いて免疫親和
性の精製が可能となる（Eastman Kodak）。6個の連続したヒスチジン残基のスト
レッチである6-Hisによって、金属キレート樹脂（QIAGEN）における精製が可能
となる。タンパク質の発現及び精製の方法については、Ausubelが（1995年, 前
出, ch 10 and 16）論じている。これらの方法によって得られた精製されたGFRP
を、以下のアッセイで直接用いることができる。

【０２２８】 １０ GFRP活性の実証 GFRPのサイトカイン活性のためのアッセイは、白血球の増殖を測定する。この
アッセイにおいて、新たに合成されるDNAに取り込まれるトリチウム化チミジン
の量は、増殖活性を評価するために用いられる。GFRPは、放射性DNAの前駆体で
あるところの[³H] チミジン存在下で、顆粒球、単球、またはリンパ球のような
培養白血球に量を変えて加えられる。GFRPの成長因子活性のための類似のアッセ
イは、スイスマウス3T3細胞におけるDNA合成の刺激作用を測定する（McKay, I.
及びI. Leigh編 (1993) Growth Factors: A Practical Approach, Oxford Unive
rsity Press, New York NY）。DNA合成の開始は、細胞の分裂周期突入と、後の
分裂を経るための細胞の拘束を示す。3T3細胞は、ミトゲンであるのみならず胎
芽の誘導にも関係するような、大部分の成長因子に応答するための受容能がある
。成長因子によって実証されるようなin vivoでの特異性は、必ずしも遺伝的な
ものである必要がなく、対応する組織によって決定されるものなので、このよう
な能力がありうる。従って、このアッセイは一般的にGFRPに適用可能である。こ
の成長因子アッセイにおいて、GFRPは、[³H] チミジン存在下で静止性の3T3培養
細胞に量を変えて加えられる。サイトカインアッセイ及び成長因子アッセイのた
めのGFRPは、組換え手法または最前線の生化学的調製法によって得ることができ
る。酸で沈殿可能なDNAへの[³H] チミジンの取込みは好適な時間間隔で測定され
、チミジン取込量は新たに合成されるDNAの量に正比例する。投与量と反応の、
少なくとも１００倍のGFRP濃度範囲に対する一次曲線は、サイトカインまたは成
長因子を好適に表示する。酸で沈殿可能なDNAへの[³H] チミジンの最大取込みを
100%反応レベルとして表すと、従来は１ml当たり１ユニットの活性が50%反応レ
ベルを作り出すようなGFRPの濃度として画定されていた。

【０２２９】 GFRPのケモカイン活性のためのアッセイは、ボイデンミクロチェンバー（Neur
oprobe, Cabin John MD）を利用して白血球の走化性を測定する（Vicari、上述
）。本アッセイにおいて、マクロファージや単球等の約10⁵個の遊走細胞が、チ
ェンバー上部区画の細胞培養媒質内に与えられる。GFRPは希釈度を変えて、下部
区画に与えられる。これら２つの区画は、５μ孔または８μ孔のポリカーボネー
トフィルタによって仕切られる（Nucleopore, Pleasanton CA）。３７℃で８０
分から１２０分間インキュベートした後、フィルタはメタノール内に固定し、好
適な標識物質を用いて染色する。フィルタの反対側に移動するような細胞は、標
準顕微鏡法を用いて計数する。走化性指数を求めるには、下部区画にGFRPがある
時に計数された遊走細胞数を、下部区画に媒質しかない時に計数された遊走細胞
数で割ればよい。このようにして求められる走化性指数は、GFRP活性に比例する
。

【０２３０】 GFRPのフォリスタチン活性は、Demuraらによって開発されたアクチビン-フォ
リスタチン結合のための鋭敏で特異性が高いアッセイを用いて、フォリスタチン
をアクチビンに結合することによって測定される（1992. Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 185:1148-1154）。アクチビンは¹²⁵Iによって標識され、生物サンプ
ルに結合される。混合物は、結合アクチビンから遊離アクチビンを分離するよう
なクロマトグラフ法と共に50%アセトニトリルを用いて処理される。アクチビン
に結合するGFRPの量は、GFRPのフォリスタチン活性に正比例する。

【０２３１】 １１ 機能的アッセイ GFRPの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのGF
RPをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでcDNAを発現する強
力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。
選り抜きのベクターには、pCMV SPORT（Life Technologie）及びpCR3.1 （Invit
rogen, Carlsbad, CA）が含まれ、その各々にはサイトメガロウイルスプロモー
ターが含まれる。5〜10μgの組換えベクターを、リポソーム製剤或いは電気穿孔
法によって、例えば内皮若しくは造血細胞株に瞬間的に形質移入する。また、標
識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgの付加的なプラスミドを同時形質
移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されて
いない細胞とを区別することができ、また組換えベクターからのcDNAの発現を確
実に予測できる。選り抜きの標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（GFP; C
lontech）、CD64、又はCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。自動化されたレー
ザー光学に基づいた技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFP又は
CD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、また細胞の特性（例えば、ア
ポトーシスの状態）を評価する。FCMによって、先行する或いは同時の細胞死の
現象を診断する蛍光分子の取込みを検出及び定量化する。これらの現象には、プ
ロピジウムヨウ化物でのDNAの染色によって測定される核DNA内容物の変化、ブロ
モデオキシウリジンの取込み量の低下によって測定されるDNA合成の下方制御、
特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面および細胞内のタンパンク質
の発現の変化、並びにフルオレセイン結合アネキシンVタンパク質の細胞表面へ
の結合によって測定される原形質膜組成の変化が含まれる。フローサイトメトリ
ーの方法については、Ormerod, M. G.の (1994) Flow Cytometry, Oxford, New
York, NYに記載されている。

【０２３２】 遺伝子発現におけるGFRPの影響は、GFRPをコードする配列並びにCD64若しくは
CD64-GFPの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価する
ことができる。CD64及びCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG（IgG）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、ヒ
トIgG若しくはCD64の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転換
されていない細胞から分離することができる（DYNAL, Lake Success, NY）。mRN
Aは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。GFRP及び目的とす
る他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン解析やマイクロアレイ技術で
解析することが可能である。

【０２３３】 １２ GFRP特異的抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990
) Methods Enzymol. 182:488-495参照）、或いは他の精製技術を使用して実質的
に精製されたGFRPを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して抗
体を生成する。

【０２３４】 或いは、GFRPのアミノ酸配列をLASERGENE software（DNASTAR）を用いて解析
して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成し、これ
を用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。C-末端付近または親水
性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細については当
業者の文献に記載されている（例えば、Ausubel, 1995, 前出, ch.11参照）。

【０２３５】 通常、15残基の長さのオリゴペプチドを、fmoc法の化学作用を利用するABI 431
A Peptide Synthesizer（Perkin-Elmer）を用いて合成し、MBS（N-maleimidoben
zoyl-N-hydroxysuccinimide ester）を用いた反応によりKLH(Sigma, St.Louis,
MO)に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ausubel前出 参照）。ウサ
ギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化す
る。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%
BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素
標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検
査される。

【０２３６】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生GFRPの精製 GFRPに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより、
自然発生或いは組換えGFRPを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、GFRP抗体を、CNBr-活性化セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）のよ
うな活性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製す
る。結合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。

【０２３７】 GFRPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、GFRPを優先的に吸着
させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファー
）でそのカラムを洗浄する。抗体／GFRP結合を分裂させる条件下（例えば、pH2
〜3のバッファー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカ
オトロープ(chaotrope)）でカラムを溶出させ、GFRPを回収する。

【０２３８】 １４ GFRPと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬を用いて、GFRP或いはその生物学的に活性な断片を標
識する（例えば、Bolton A.E. 及びW. M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-
539）。マルチウエルプレートのウエル内に予め配置した候補分子を、標識したG
FRPと共にインキュベートし、洗浄し、標識したGFRP複合体を有する任意のウエ
ルをアッセイする。種々のGFRP濃度で得られたデータを用いて、GFRPと候補分子
との結合、親和性及び数についての値を計算する。

【０２３９】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に記載した方
法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を特定の好適
実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実施例に過度
に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本発明の実施
のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明ら
かであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。

【０２４０】 表の簡単な説明 表１には、GFRPの解析に用いたツール、プログラム及びアルゴリズム、並びに
それらの説明、引用文献及びパラメーター閾値を示す。

【表１】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】 GFRP-1（Incyte Clone 2777282; SEQ ID NO:1）及びANUP（GI 1536902; SEQ I
D NO:9）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作成
にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケンス・アライメント・プログラム（D
NASTAR, Madison WI）を使用した。

【図２】 GFRP-2（Incyte Clone 4185824; SEQ ID NO:2）及びhTECK（GI 2388627; SEQ
ID NO:10）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。アライメントの作
成にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケンス・アライメント・プログラム
（DNASTAR）を使用した。

【図３Ａ】 GFRP-3（Incyte Clone 2484440; SEQ ID NO:3）及びニワトリホリスタチン（G
I 853834; SEQ ID NO:11）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。ア
ライメントの作成にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケンス・アライメン
ト・プログラム（DNASTAR）を使用した。

【図３Ｂ】 GFRP-3（Incyte Clone 2484440; SEQ ID NO:3）及びchicken follistatin（GI 853834; SEQ ID NO:11）の間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。ア
ライメントの作成にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケンス・アライメン
ト・プログラム（DNASTAR）を使用した。

【図４】 GFRP-4（Incyte Clone 4163378; SEQ ID NO:4）及びヒト骨形態形成タンパク
質1、BMP-1（GI 179500; SEQ ID NO:12）の間のアミノ酸配列アライメントを示
す図である。アライメントの作成にはLASERGENEソフトウエアのマルチシーケン
ス・アライメント・プログラム（DNASTAR）を使用した。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８５ 48/00 15/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/00 29/00 ４Ｈ０４５ 15/00 31/00 29/00 35/00 31/00 37/02 35/00 43/00 １０７ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/475 43/00 １０７ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/24 (31)優先権主張番号 ０９／２０９，５４７ (32)優先日 平成10年12月11日(1998．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１５５，２１６ (32)優先日 平成10年12月11日(1998．12．11) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／３１３，４５７ (32)優先日 平成11年５月17日(1999．5．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７２，２３３ (32)優先日 平成11年５月17日(1999．5．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 オウ−ヤング、ジャニス アメリカ合衆国カリフォルニア州94702・ バークレイ・カインズアベニュー 1419 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA09 HA14 HA17 4B063 QA13 QQ43 QQ53 QR32 QR35 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02 4B064 AG02 CA19 CE12 DA01 DA14 4B065 AA93Y AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 DB52 MA01 NA14 ZA362 ZA812 ZB072 ZB112 ZB222 ZB262 ZB322 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 DD63 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA36 ZA81 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 ZB32 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA01 DA75 EA28 EA29 EA51 FA74 GA26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1-4及びそれらの断片からなる一群より選択さ
   れたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上のア
   ミノ酸配列の同一性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上
   のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド
   の変異配列。
5. 【請求項５】 ストリンジェントな条件の下で請求項３のポリヌクレオチ
   ドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有す
   る単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも1つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が前記サンプルにおけるポリヌクレオチドの存
   在と相関性を有するような検出過程とを含むことを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増
   幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:5-8及びそれらの断片からなる一群より選択さ
   れたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以
    上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチ
    ド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有
    する単離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 GFRPの発現若しくは活性の低下に関連する疾患の治療又
    は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求
    項１５の医薬品組成物を投与する過程を含む方法。
20. 【請求項２０】 GFRPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療又
    は予防の方法であって、そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求
    項１８のアンタゴニストを投与する過程を含む方法。