JP2002519029A - アポトーシス関連分子 - Google Patents

アポトーシス関連分子

Info

Publication number
JP2002519029A
JP2002519029A JP2000557362A JP2000557362A JP2002519029A JP 2002519029 A JP2002519029 A JP 2002519029A JP 2000557362 A JP2000557362 A JP 2000557362A JP 2000557362 A JP2000557362 A JP 2000557362A JP 2002519029 A JP2002519029 A JP 2002519029A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polynucleotide
mapop
seq
sequence
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000557362A
Other languages
English (en)
Inventor
ヒルマン、ジェニファー・エル
ユエ、ヘンリー
タング、ワイ・トム
コーレイ、ニール・シー
ゲグラー、カール・ジェイ
パターソン、チャンドラ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Incyte Corp
Original Assignee
Incyte Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Incyte Pharmaceuticals Inc filed Critical Incyte Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2002519029A publication Critical patent/JP2002519029A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトのアポトーシス関連分子(MAPOP)及びMAPOPを特定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、MAPOPの発現に関連する疾患の診断、処置、又は予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 (技術分野) 本発明は、アポトーシス関連分子の核酸及びアミノ酸配列、及び細胞増殖の異
常及び自己免疫異常の診断、処置、及び予防におけるこれらの配列の使用法に関
するものである。
【0002】 (発明の背景) アポトーシスは、それによって不要な又は異常な細胞がプログラムされた細胞
死に至らしめられる遺伝的に調節されたプロセスである。アポトーシスの事象は
、多くの多細胞生物の正常な発達のプログラムの一部である。アポトーシスの事
象は、多くの多細胞生物の正常な発達のプログラムの一部である。細胞の選択的
除去は、細胞増殖及び分化にとって重要なのと同様に、形態形成及び組織の再構
成のためにも重要である。アポトーシスが無くなると、過形成及び細胞増殖の増
加に関連する他の疾患が引き起こされる。アポトーシスは、免疫応答の重要な要
素でもある。細胞障害性T細胞及びナチュラルキラー細胞のような免疫細胞は、
腫瘍細胞又はウイルス感染細胞におけるアポトーシスを誘導することによって、
疾病の拡大を防止する。加えて、自己の分子を外来分子から区別できない免疫細
胞は、自己免疫応答を避けるためにアポトーシスによって除去されなければなら
ない。
【0003】 アポトーシスの細胞は、個別の形態上の変化を生ずる。アポトーシスの特徴と
しては、細胞の収縮、核及び原形質の圧縮、及び原形質膜のトポロジーの変化等
がある。生化学的には、アポトーシスの細胞は、細胞内カルシウム濃度の上昇、
染色体DNAのヌクレオソーム長のユニットへの断片化、及び新規な細胞表面要
素の発現によって特徴付けられる。
【0004】 アポトーシスの分子メカニズムは高度に保存され、且つアポトーシスの重要な
タンパク質レギュレーター及びエフェクターの多くが特定されてきた。アポトー
シスは、通常細胞内に伝達され、遺伝子発現及びタンパク質活性のパターンを変
えるシグナルに応答して進行する。ホルモン及びサイトカインのようなシグナル
伝達分子は、正及び負の両方向にアポトーシスを調節することが知られている。
転写制御因子も、アポトーシスの開始において重要な役割を果たす。多くのダウ
ンストリームのエフェクター分子、特にプロテアーゼが、細胞の構成要素の分解
及び他のアポトーシスのエフェクターのタンパク分解による活性化に関与してい
る。
【0005】 ラットの腹側前立腺(RVP)は、ホルモン調節性のアポトーシスの実験に用
いられるモデル系である。RVP上皮細胞は、アンドロゲン不足に応じてアポト
ーシスを生ずる。アポトーシスのRVPにおいてアップレギュレートされるメッ
センジャーRNA(mRNA)転写物が特定された(Briehl, M. M.及びMiesfel
d, R. L. (1991) Mol. Endocrinol. 5:1381-1388.)。そのような転写物の1つ
は、RVP.1をコードしている。このRVP.1のアポトーシスにおける役割
は正確には分かっていない。RVP.1のヒトのホモログであるhRVP1は、
ラットのタンパク質との89%の同一性を有する(Katahira, J.ら (1997) J. B
iol. Chem. 272:26652-26658.)。hRVP1は220個のアミノ酸からなる長
さを有し、4つの膜貫通ドメインを有している。hRVP1は、肺、腸、及び肝
臓において高レベルで発現される。興味深いことに、hRVP1は、ヒト及び他
の動物における下痢症の原因物質であるクロストリジウム・パーフリンジェンス
(Clostridium perfringens)腸毒素に対して低い親和性を持つ受容体として機
能する。
【0006】 アポトーシスは、発達中の免疫系及び免疫応答のダウンレギュレーションにお
いても重要な役割を果たす。胸腺における未成熟なT細胞は、除去しないと自己
免疫応答を生ずる自己反応性のT細胞を除去するプロセスであるネガティブ選択
を受ける。ネガティブ選択は、T細胞表面上のT細胞受容体(TCR)の活性化
によって開始されるアポトーシスのメカニズムによって生ずる。免疫応答をダウ
ンレギュレートする必要があるときの成熟した抗原活性化T細胞の除去のために
、類似のメカニズムが存在する。この活性化に誘導されるアポトーシスは、他の
細胞表面受容体、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーであるFasによっ
て媒介される。Fasの発現は、TCRの刺激に応答してアップレギュレートさ
れ、また、その発現には更に別の遺伝子であるT細胞死関連遺伝子51(TDAG51
)の活性が必要である(Park, C. G.ら (1996) Immunity 4:583-591)。TDAG51
は261個のアミノ酸からなる新規なタンパク質をコードする。
【0007】 新規なヒトのアポトーシス関連分子及びそれをコードするポリヌクレオチドの
発見は、細胞増殖の異常及び自己免疫異常の診断、処置、及び予防において役立
つ新規な組成物を提供することにより、当分野における必要性を満たすものであ
る。
【0008】 (発明の概要) 本発明は、新規なアポトーシス関連分子(MAPOP)、MAPOPをコード
するポリヌクレオチド、及び細胞増殖の異常及び自己免疫異常の診断、処置、又
は予防のためのこれらの組成物の使用法の発見を基礎とするものである。
【0009】 本発明は、実質的に精製されたポリペプチド群、それぞれ「MAPOP−1」
、「MAPOP−2」、及び「MAPOP−3」と称し、集合的に「MAPOP
」と称するアポトーシス関連タンパク質を提供する。或る実施態様では、本発明
は、配列番号(SEQ ID NO):1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:1
の断片、配列番号:2の断片、及び配列番号:3の断片からなる群から選択され
たアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【0010】 更に本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの配列の何れかの断片
のアミノ酸配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、実質的に
精製された変異体を提供する。また本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及び
それらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、配列
番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの少なくとも70%のポ
リヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異
体を包含する。
【0011】 更に本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとス
トリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、単離され精製されたポリヌク
レオチドを提供すると共に、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片から
なる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【0012】 また本発明は、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:4の
断片、配列番号:5の断片、及び配列番号:6の断片からなる群から選択された
ポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
更に本発明は、配列番号:4〜配列番号:6及びそれらの断片からなる群から選
択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの少なくとも70%の
ポリヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチドを
提供すると共に、配列番号:4〜配列番号:6及びそれらの断片からなる群から
選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有す
る、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【0013】 更に本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少
なくとも断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、前記発現ベク
ターが宿主細胞内に含められる。
【0014】 また本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、(a)前記ポ
リペプチドの発現に適した条件の下で前記ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、
(b)前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含む、配列
番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配
列を含むポリペプチドの製造方法を提供する。
【0015】 また本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを、適切な医
薬用担体と共に含む医薬品組成物を提供する。
【0016】 更に本発明は、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体を包含す
ると共に、前記ポリペプチドの精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニ
ストを包含する。
【0017】 また本発明は、細胞増殖の異常の処置又は予防方法であって、そのような処置
が必要な患者に、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から
選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品
組成物を有効な量投与する過程を含む、細胞増殖の異常の処置又は予防方法を提
供する。
【0018】 本発明は、自己免疫異常の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要
な患者に、配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成
物を有効な量投与する過程を含む、自己免疫異常の処置又は予防方法を提供する
【0019】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおける配列番号:1〜配列番号
:3及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの検出方法であって、(a)配列番号:1〜配
列番号:3及びそれらの断片からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な分子と、前記生物学的サンプ
ルの核酸の少なくとも1つとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複
合体を形成する過程と、(b)前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過
程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプ
ルにおける配列番号:1〜配列番号:3及びそれらの断片からなる群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相
互関係を有する、該過程とを含む、ポリヌクレオチドの検出方法を提供する。或
る実施態様では、前記ハイブリダイゼーションを行う過程の前に前記生物学的サ
ンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅する。
【0020】 (発明の実施の形態) 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、及び方法について説明する前に、本
発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試
薬に限定されず、それらは様々に変更可能であることを理解されたい。また、本
明細書において用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いら
れたものであり、請求項の記載のみによって限定される本発明の範囲を限定する
ことを意図したものではないということも理解されたい。
【0021】 本明細書の発明の詳細な説明又は図面及び特許請求の範囲において、単数を表
す「或る」及び「その(この)」と形容されたものは、前後関係でそうでないこ
とが明らかである場合以外は、複数の意味も含んでいることに注意しなければな
らない。従って、例えば「或る宿主細胞」なる表記が表すものには、複数のその
ような宿主細胞が含まれ、「或る抗体」なる表記は、1種または複数の種類の抗
体及び当業者に周知のその等価物等も表している。
【0022】 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと
同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発
明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料を
本明細書において説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連
において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し
開示する目的で引用されたものであり、引用により本明細書の一部とする。また
本明細書のあらゆる開示内容を、本発明におけるそのような開示内容が従来技術
に先行しないということを認めるものと解釈してはならない。
【0023】 (定義) 本明細書において、「MAPOP」は、任意の種、具体的にはウシ、ヒツジ、
ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒト等のような哺乳動物に由来し、天然の
、合成の、半合成の、又は組換え体の何れかの起源から得られる実質的に精製さ
れたMAPOPのアミノ酸配列である。
【0024】 本明細書において、用語「アゴニスト」は、MAPOPに結合したときMAP
OPの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニス
トには、MAPOPに結合し、その効果を変調するタンパク質、核酸、糖質や、
任意の他の分子が含まれ得る。
【0025】 本明細書において「アレル変異体」とは、MAPOPをコードする遺伝子の対
立形である。アレル変異体は、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によって生じ
、変異したmRNA或いはポリペプチドを生ずるが、その変異したmRNA或い
はポリペプチドの構造や機能が変わる場合もあれば変わらない場合もある。所定
の天然の遺伝子または組換え遺伝子には、アレル形が存在しないもの、1つ存在
するもの、或いは多数存在するものがある。一般的にアレル変異体を生じる変異
はヌクレオチドの自然な欠失、付加並びに置換に因るものである。このタイプの
変異はそれぞれ単独で、或いは他の変異と同時に、所定の配列内で1回又は2回
以上生じ得る。
【0026】 本明細書において、MAPOPをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ
クレオチド残基の置換、挿入や欠失を含み、結果的に同一のMAPOPをコード
するポリヌクレオチド、又はMAPOPの機能的な特徴を少なくとも1つ有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。この定義には、
MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列の通常の染色体上の遺伝子座以外
の座位を有する多型、アレル変異体との不適切な又は予期しないハイブリダイゼ
ーションによって起こる多型、及びMAPOPをコードするポリヌクレオチドの
特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出が困
難な多型が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変異」したもので
あり得、サイレント変異を生じ、結果的に機能的に等価なMAPOPとなるアミ
ノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含むものであり得る。意図的なアミノ酸の置
換は、MAPOPの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度
、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいて作り出すこと
ができる。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が
含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親水性
値を有する荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイ
シン、及びバリン;グリシン及びアラニン;アスパラギン及びグルタミン;セリ
ン及びスレオニン;及びフェニルアラニン及びチロシンが含まれる。
【0027】 本明細書において「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペ
プチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、又はそれらの何れかの断片であ
り、自然発生の分子又は合成した分子である。この文脈で、「断片」、「免疫原
性断片」又は「抗原性断片」は、MAPOPの断片で、好ましくは約5個〜約1
5個のアミノ酸、最も好ましくは14個のアミノ酸からなる長さを有し、かつM
APOPの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである。ここで、
「アミノ酸配列」が自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指している場合に
、「アミノ酸配列」や類似の用語は、そのアミノ酸配列を本明細書に記載のタン
パク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定する意味で用いられ
ているわけではない。
【0028】 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なるコピーを生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)を用いて行われる
(例えばDieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp.1-5参照)。
【0029】 本明細書において、用語「アンタゴニスト(拮抗物質)」は、MAPOPに結
合したとき、MAPOPの生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下させたり、
効果の継続時間を短縮させる分子である。アンタゴニストとしては、MAPOP
の効果を低下させるタンパク質、核酸、糖質、抗体、または他の分子等が挙げら
れる。
【0030】 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味するとともに、例
えばFab、F(ab')2、及びFv断片のような抗原決定基と結合し得るその
断片を意味する。MAPOPポリペプチドに結合する抗体は、免疫化の抗原とし
て完全なポリペプチド又は目的の小ペプチドを含むその断片を用いることによっ
て作り出すことができる。動物(例えばマウス、ラット、またはウサギ)を免疫
化するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、RNAの翻訳に由来する
もの、又は化学的に合成されたものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合
させることができる。ペプチドに化学的に結合する担体として通常用いられるも
のとしては、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及びキーホールリンペッ
トヘモシアニン(KLH)等が挙げられる。この結合したペプチドを用いて動物
を免疫化する。
【0031】 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と結びつく分子の断片
(即ちエピトープ)である。タンパク質又はその断片を用いてホストの動物を免
疫化すると、このタンパク質の様々な領域が、該タンパク質上の所定の領域また
は三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。このような領域また
は構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について元の抗原(
即ち免疫応答を誘導するに用いられる免疫原)と競合し得る。
【0032】 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のDNAまたはRNA配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「
センス」鎖に相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子としてはペ
プチド核酸があり、アンチセンス分子は合成や転写等の方法で作り出すことがで
きる。この相補的ヌクレオチドは、一旦細胞内に導入されると、細胞によって作
られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、これが更なる転写や翻訳を阻害す
る。「マイナス(−)」なる表現がアンチセンス鎖の意味で用いられ、「プラス
(+)」はセンス鎖の意味で用いられることがある。
【0033】 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造上の機
能、調節の機能、又は生化学的な機能を有するタンパク質である。同様に「免疫
学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のMAPOP、若しくはそのオ
リゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗
体に結合する能力である。
【0034】 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩濃度及び
温度条件の下で、塩基対を形成してポリヌクレオチド同士が自然に結合すること
である。例えば、配列「A−G−T」は相補的な配列「T−C−A」に結合する
。2本の一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する「部分的」なも
のであるか、若しくは、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は「完全に
」相補的なものであり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブ
リダイゼーションの効率及び強さに有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同
士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸(PNA)分子の設計及
び使用において特に重要である。
【0035】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」又は「所定の
アミノ酸配列を含む組成物」とは、所定のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を
含むあらゆる物質をさす。この組成物は、粉末製剤、水溶液、又は滅菌組成物の
形態であり得る。MAPOP又はMAPOPの断片をコードするポリヌクレオチ
ド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用することが
できる。このプローブは凍結乾燥した状態で保存することができ、糖質のような
安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプ
ローブを、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばSDS)及び他の物質(
例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNA等)を含む水溶液に分散させておく
ことができる。
【0036】 本明細書において「コンセンサス配列」は、配列決定し直して不要な塩基を分
離し、XL-PCRTM(Perkin Elmer, Norwalk, CT)を用いて5′方向及び/または
3′方向に延長した上で再度配列決定し直した核酸配列か、または断片を組み合
わせるためのコンピュータプログラム、例えばGELVIEWTM Fragment Assembly sy
stem(GCG, Madison WI)を用いて2種以上のインサイト社クローンの重複した
配列を組み合わせて導き出した核酸配列である。延長と組み合わせの両方によっ
てコンセンサス配列が作られることもある。
【0037】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相互関係を有する」なる表現
は、ノーザン法による解析でMAPOPをコードする核酸と同一又は近縁関係に
ある核酸の存在が検出されることが、サンプル内のMAPOPをコードするmR
NAの存在を表し、従ってMAPOPをコードする遺伝子からの転写物の発現と
相互関係を有している、ということを表している。
【0038】 本明細書において「欠失」は、1個または2個以上のヌクレオチド若しくはア
ミノ酸残基が欠けるような、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
である。
【0039】 本明細書において、用語「誘導体」は、MAPOPをコードするポリヌクレオ
チド配列又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を化学的に修飾したものであ
る。このようなポリヌクレオチド配列の化学的修飾としては、例えば、水素から
アルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。誘導体ポリヌクレオチド
は、元の分子の生物学的又は免疫学的機能の少なくとも1つを保持しているポリ
ペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポリペプチドの生物学的又
は免疫学的機能の少なくとも1種類を保持しており、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(PEGylation)、又は他の何らかのプロセスで修飾されたもので
ある。
【0040】 本明細書において、用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的
類似性か完全な類似性があり得る。用語「(配列)同一性」は、用語「類似性」
と置換えることができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少
なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列を、「実質的に類似」という。
完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ストリン
ジェンシー(厳密さ)を低くした条件の下で、ハイブリダイゼーションアッセイ
(サザンブロット法またはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等
)を用いて調べることができる。実質的に類似な配列またはハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、低いストリンジェンシー条件の下で、標的の配列と完全に類似
(同一)な配列またはプローブとの結合について競合し、それを阻害する。この
ことは、低いストリンジェンシー条件が、非特異的な結合を許容するものである
ことを意味するわけではない。低いストリンジェンシー条件では、2つの配列の
相互の結合が特異的(即ち選択的)相互作用であることが必要だからである。非
特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性(即ち約30%未満の類
似性即ち同一性)も有していない第2の標的配列を用いることにより調べること
ができる。非特異的結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的標的配列
とハイブリダイズしない。
【0041】 「パーセント同一性」或いは「%同一性」という言葉は、2以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較した際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison WI)を用いるこ
とによって電子的に求めることができる。このMegAlignTMプログラムは、異なる
方法、例えばClustal 法(例えばHiggins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene 73
:237-244参照)に従って2以上の配列のアライメントを作成することができる。
このClustalのアルゴリズムでは、配列群を、全ての配列の対について両配列間
の距離を調べることによってクラスタ(集団)にグループ分けする。このクラス
タ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグループにおいてアライメン
トをとる。2つのアミノ酸配列、例えば配列Aと配列Bの間のパーセント類似性
は、(配列Aの長さ−配列Aにおけるギャップ残基の数−配列Bにおけるギャッ
プ残基の数)/(配列Aと配列Bとの間の残基の一致の総数)×100で計算す
る。2つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無いケースは、パーセント類
似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント同一性も、他の周知の方法
、例えばJotun Hein法(例えばHein J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645
参照)によってカウント即ち計算することができる。配列間の同一性は、他の周
知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変えることによっても決定する
ことができる。
【0042】 「ヒト人工染色体」(HACs)は約6kb〜10MbのサイズのDNA配列
を含んでいるものであり得、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての
要素を含む線状の小形染色体である(例えばHarrington, J.J.他 (1997) Nat Ge
net. 15:345-355参照)。
【0043】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、その元の結合能をそのまま保持し
つつ、ヒトの抗体により近づくように非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した
抗体分子である。
【0044】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は
、核酸の鎖が塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程である。
【0045】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なG塩
基とC塩基の間及び相補的なA塩基とT塩基の間での水素結合の形成によって、
2つの核酸配列で形成された複合体である。ハイブリダイゼーション複合体は、
溶液中で形成されるか(例えばC0t又はR0t解析の場合)、或いは核酸は溶液
中に存在する一方の核酸と、固体支持体(例えば細胞やその核酸が固定される紙
、メンブラン、フィルター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板
)に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。
【0046】 本明細書において、用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較し
て、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような
、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
【0047】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものであり得る。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する
様々な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産
生によって特性化され得る。
【0048】 本明細書において、用語「マイクロアレイ」は、個々のポリヌクレオチドを基
板上に配列したものである。基板としては、例えば紙、ナイロン又は他の種類の
メンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体
等がある。
【0049】 本明細書において、マイクロアレイに関連して用いられる用語「エレメント」
または「アレイエレメント」とは、基板の表面上に配列されたハイブリダイズ可
能なポリヌクレオチドである。
【0050】 本明細書において、用語「変調」は、MAPOPの活性を変化させることであ
る。例えば、変調によって、タンパク質の活性の増加や減少、結合特性の変化、
又は他のMAPOPの生物学的、機能的、免疫学的特性の変化がもたらされる。
【0051】 本明細書において「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、又はその断片を指すか、一本鎖か二本鎖であり、ま
たセンス鎖又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源の若しくは合成したDNA又
はRNAを指すか、又はペプチド核酸(PNA)、又は、DNA様又はRNA様
物質である。この文脈において、「断片(フラグメント)」は、翻訳されたとき
に、完全長ポリペプチドのいくつかの機能的特徴、例えば抗原性を保持するポリ
ペプチド、又は構造的ドメインの特徴、例えばATP結合部位を保持するポリペ
プチドを作り出す核酸配列を意味する。
【0052】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結びついた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモーターは、そのプロモーターが、コ
ードされるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列に機能的に関連
又は機能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸
配列は近接し読み枠にあり得るが、ある種のゲノムの配列、例えばリプレッサー
遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそのポリペプ
チドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。
【0053】 本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリ
ダイゼーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配
列であって、長さが約6ヌクレオチド以上、最大60ヌクレオチド程度、好適に
は15〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを
指す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野において一般
に定義されているような用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー
」、及び「プローブ」と実質的に同義である。
【0054】 本明細書において「ペプチド核酸」(PNA)は、末端がリジンであるアミノ
酸残基のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌ
クレオチドを含むアンチセンス分子即ち抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンが
この物質に溶解性を与えている。PNAは、相補的な一本鎖DNAやRNAに優
先的に結合して転写物の伸長を止め、かつPNAをポリエチレングリコール化す
ることにより、細胞でのその寿命を延ばすことができる(例えばNielsen, P.E.
他(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63参照)。
【0055】 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている
。MAPOPをコードする核酸またはその断片またはMAPOP自体を含む疑い
のある生物学的サンプルには、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官
、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、(溶液中の、または固体支持体に結合し
た)ゲノムのDNA、RNA、またはcDNAや、組織や、組織プリント(tiss
ue print)その他が含まれる。
【0056】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タン
パク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストとの相互作用を
意味する。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質上の特
定の構造(即ち抗原決定基、即ちエピトープ)の存在に左右される。例えば、抗
体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識した「A」及びその抗体
を含む反応において、エピトープA(つまり結合していない、非標識のA)を含
むタンパク質が存在すると、抗体が結合した標識したAの量が低下する。
【0057】 本明細書において、用語「ストリンジェントな(厳密な)条件」は、ポリヌク
レオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチド配列との間のハ
イブリダイゼーションを許容する条件を指す。ストリンジェントな条件は、例え
ば、塩又は有機溶媒(例えばホルムアミド)の濃度、温度、その他の公知の条件
によって決定することができる。詳述すると、ストリンジェンシー(厳密さ)は
、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇させること、又はハイ
ブリダイゼーション温度を高めることによって高めることができる。
【0058】 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、単
離または分離されて、自然にはそれが結合して存在する他の構成要素が60%以
上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上除去された核酸配列又は
アミノ酸配列である。
【0059】 本明細書において「置換」は、1個または2個以上のヌクレオチド或いはアミ
ノ酸を、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることである。
【0060】 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来DNAが入ってレシピエント細胞
を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた様々な方法を
用いて、自然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原
核生物または真核生物の宿主細胞に挿入するための既知の方法によって行うこと
ができる。この方法は形質転換される宿主細胞の型に基づいて選択され、以下に
限定するものではないが、ウイルスを感染させる方法、電気穿孔法(エレクトロ
ポレーション)、熱ショック、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法等
があり得る。用語「形質転換(された)」細胞は、そのなかで挿入されたDNA
が、自律的に複製するプラスミドか、または宿主の染色体の一部として複製でき
る、安定的に形質転換された細胞等である。またこのような細胞には、限られた
時間での挿入されたDNAやRNAの一過性の発現が起こる細胞もある。
【0061】 本明細書においてMAPOPポリペプチドの「変異体」は、1又は2箇所以上
のアミノ酸が変化したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含む
ものであり得、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き
換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する
。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合
は、例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小さな変化として
、アミノ酸の欠失か挿入、若しくはその両方が含まれる。生物学的或いは免疫学
的活性を損なわずに置換、挿入、又は欠失させることができるアミノ酸は何れか
ということは、例えばLASERGENETMソフトウエアのような周知のコンピュータプ
ログラムを用いて決定することができる。
【0062】 用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、MAP
OPに近縁なポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「ア
レル変異体」(前に定義した)、「スプライスバリアント」、「種変異体」、ま
たは「多型変異体」も含まれる。スプライスバリアントは、基準の分子と有意な
同一性を有し得るが、mRNAのプロセシングの際にエキソンのスプライシング
部位が変わるためにポリヌクレオチドの数が多いか或いは少ないものである。対
応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有していたり、或いはドメイン
が欠けていることがある。種変異体は、種の間で異なるポリヌクレオチド配列で
ある。これから生ずるポリペプチドは、通常、互いに有意なアミノ酸同一性を有
している。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列の1箇所の塩基が異なっている
「一塩基多型」(SNPs)も包含している。SNPsが存在することが、例え
ば、一定の集団、疾病状態、または疾病状態の性向を示すことがある。
【0063】 (発明) 本発明は、新規なヒトアポトーシス関連分子(MAPOP)、MAPOPをコ
ードするポリヌクレオチド、及び細胞増殖の異常及び自己免疫異常の診断、処置
、及び予防におけるこれらの配列の使用法の発見を基礎とするものである。
【0064】 本発明のMAPOP−1をコードする核酸は、例えばBLASTのようなアミノ酸
配列アライメントのコンピュータ検索を用いて、胎児の結腸cDNAライブラリ
ー(COLNFET02)を起源とするインサイト社クローンNo. 1456746において初めに
同定された。コンセンサス配列の配列番号:4は、以下の重複及び/又は延長さ
れた核酸配列(配列番号:7〜配列番号:11)、即ちインサイト社クローンNo
. 1456746H1(COLNFET02が起源)、1512130H1(LUNGNOT14が起源)、1456746T6
(COLNFET02が起源)、2922036H1(SININOT04が起源)、及び1430349F1(SINTBS
T01が起源)から導き出されたものである。
【0065】 或る実施態様では、本発明は、配列番号:1のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを包含する。MAPOP−1は228個のアミノ酸からなる長さを有し、14
1番目の残基N(以下、「N141」のように表記する。)に1個のNグリコシ
ル化可能部位を有し、T43、T154、S187、及びS211に4個のカゼ
インキナーゼIIリン酸化可能部位を有し、S111及びS194に2個のプロ
テインキナーゼCリン酸化可能部位を有し、Y151に1個のチロシンキナーゼ
リン酸化可能部位を有する。シグナルペプチド配列は、M1〜P25と推定され
る。BLOCKS解析の結果、MAPOP−1のS2〜V31、I44〜L57、M6
8〜E109、L158〜C185の領域は、PMP−22/EMP/MP20
ファミリーモチーフに類似であることがわかった。そのようなモチーフは、神経
、腫瘍、及び上皮細胞に見出される小さい内在性膜糖タンパク質の特徴である。
加えて、PRINTS解析の結果、MAPOP−1のT7〜S32、Y74〜I105
、H124〜I142、及びL162〜C180の領域は、アカゲザル血液型タ
ンパク質における膜貫通ドメインに類似していることが分かった。図1A及び図
1Bに示すように、MAPOP−1は、hRVP1(GI 2570129;配列番号:2
9)と化学的及び構造的類似性を有する。詳述すると、MAPOP−1とhRV
P1は33%の配列同一性を共有している。疎水性プロット及び隠れマルコフモ
デル解析から、hRVP1の4つの膜貫通ドメインが、MAPOP−1の概ね1
番目のアミノ酸〜20番目のアミノ酸、概ね80番目のアミノ酸〜100番目の
アミノ酸、概ね125番目のアミノ酸〜140番目のアミノ酸、及び160番目
〜185番目のアミノ酸においてよく保存されていることが分かった。ノーザン
法による解析の結果から、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる
。そのようなライブラリーの少なくとも65%は癌又は増殖する細胞に関連する
ものであり、少なくとも29%は免疫応答または外傷に関連するものである。特
に注目すべきは、MAPOP−1を発現するライブラリーの35%が胃腸管組織
に由来し、29%が生殖器組織に由来することである。
【0066】 本発明のMAPOP−2をコードする核酸は、例えばBLASTのようなアミノ酸
配列アライメントのコンピュータ検索を用いて、気管支上皮cDNAライブラリ
ー(BEPINOT01)を起源とするインサイト社クローンNo. 2057608において初めに
同定された。コンセンサス配列の配列番号:5は、以下の重複及び/又は延長さ
れた核酸配列(配列番号:12〜配列番号:22)、即ちインサイト社クローン
No. 2662526F6(BEPINOT01が起源)、821149H1(KERANOT02が起源)、2662526F6
(ADRENOT08が起源)、ショットガン配列SAEB01552R1、2734032F6(OVARTUT04)
、2795896T6(NPOLNOT01)、2696284F6(UTRSNOT12)、2254004R6(OVARTUT01)
、1433735R1(BEPINON01)、1554306F6(BLADTUT04)、及び1554306T6(BLADTUT
04)から導き出されたものである。
【0067】 或る実施態様では、本発明は、配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを包含する。MAPOP−2は211個のアミノ酸からなる長さを有し、72
番目の残基N(以下、「N72」のように表記する。)に1個のNグリコシル化
可能部位を有し、T191に1個のcAMP−及びcGMP依存性プロテインキ
ナーゼリン酸化可能部位を有し、S206に1個のカゼインキナーゼIIリン酸
化可能部位を有し、T195及びS206に2個のプロテインキナーゼCリン酸
化可能部位を有する。MAPOP−2の配列の解析によって、MAPOP−1に
おいても同定された配列シグネチャ及びモチーフに対する類似性が分かった。M
APOP−2におけるシグナルペプチド配列は、N3〜A21と推定される。BL
OCKS解析の結果、MAPOP−2のN3〜I32、M46〜T59、L70〜D
111、及びF161〜R188の領域は、上述のようなPMP−22/EMP
/MP20ファミリーモチーフに類似であることがわかった。加えて、PRINTS解
析の結果、MAPOP−2のF11〜L27、M84〜L108、G123〜W
139、及びS173〜C186の領域は、アカゲザル血液型タンパク質におけ
る膜貫通ドメインに類似していることが分かった。図1A及び図1Bに示すよう
に、MAPOP−2は、hRVP1(GI 2570129;配列番号:29)と化学的及
び構造的類似性を有する。詳述すると、MAPOP−2とhRVP1は47%の
配列同一性を共有している。疎水性プロット及び隠れマルコフモデル解析から、
hRVP1の4つの膜貫通ドメインが、MAPOP−2の概ね1番目のアミノ酸
〜30番目のアミノ酸、概ね80番目のアミノ酸〜105番目のアミノ酸、概ね
115番目のアミノ酸〜140番目のアミノ酸、及び160番目〜185番目の
アミノ酸においてよく保存されていることが分かった。ノーザン法による解析の
結果から、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる。そのようなラ
イブラリーの少なくとも75%は癌又は増殖する細胞に関連するものであり、少
なくとも29%は免疫応答または外傷に関連するものである。特に注目すべきは
、MAPOP−2を発現するライブラリーの29%が生殖器組織に由来すること
である。
【0068】 本発明のMAPOP−3をコードする核酸は、例えばBLASTのようなアミノ酸
配列アライメントのコンピュータ検索を用いて、後根神経節cDNAライブラリ
ー(DRGLNOT01)を起源とするインサイト社クローンNo. 2840978において初めに
同定された。コンセンサス配列の配列番号:6は、以下の重複及び/又は延長さ
れた核酸配列(配列番号:23〜配列番号:28)、即ちインサイト社クローン
No. 2840978H1(DRGLNOT01が起源)、3415476H1(PTHYNOT04が起源)、2099593R
6(BRAITUT02が起源)、1441568F1(THYRNOT03)、893117R6(STOMTUT01)及び1
441568R1(THYRNOT03)から導き出されたものである。
【0069】 或る実施態様では、本発明は、配列番号:3のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドを包含する。MAPOP−3は127個のアミノ酸からなる長さを有し、19
番目のT(以下「T19」のように表記する。)、T34、T67、及びT11
3に4個のプロテインキナーゼCリン酸化可能部位を有する。Pfam解析によって
、MAPOP−3のT8〜T67の領域が、プレクストリン相同ドメインシグネ
チャと類似であることが分かった。このドメインは、膜及び受容体関連タンパク
質を含む、細胞内シグナル伝達に関与する様々なタンパク質において見出される
。図2に示すように、MAPOP−3は、TDAG51(GI 1469400;配列番号
:30)と化学的及び構造的類似性を有する。詳述すると、MAPOP−3とT
DAG51は44%の配列同一性を共有している。図2においては、明示のため
、TDAG51の初めの155個のアミノ酸のみのアライメントが示されている
ことに注意されたい。但し、MAPOP−3とのアミノ酸同一性の計算では、配
列表に示すTDAG51の全アミノ酸配列が含められている。ノーザン法による
解析の結果から、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる。そのよ
うなライブラリーの少なくとも69%は癌又は増殖する細胞に関連するものであ
り、少なくとも29%は免疫応答または外傷に関連するものである。特に注目す
べきは、MAPOP−3を発現するライブラリーの25%が生殖器組織に由来し
、23%が神経組織に由来することである。
【0070】 また本発明は、MAPOPの変異体を包含する。好ましいMAPOP変異体は
、MAPOPの機能的又は構造的特徴の少なくとも1種類を有し、MAPOPア
ミノ酸配列と、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最も
好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するものである。
【0071】 また本発明は、MAPOPをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の
実施態様では、本発明は、MAPOP−1をコードする、配列番号:4の配列を
含むポリヌクレオチド配列を包含する。別の実施態様では、本発明は、MAPO
P−2をコードする、配列番号:5の配列を含むポリヌクレオチド配列を包含す
る。更に別の実施態様では、本発明は、MAPOP−3をコードする、配列番号
:6の配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。
【0072】 また本発明は、MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列の変異体を包含
する。詳述すると、そのような変異体ポリヌクレオチド配列は、配列番号:4−
6からなる群から選択された、MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列と
の、少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約85%、最も好ましくは
少なくとも約95%のポリヌクレオチド配列同一性を有する。上述のポリヌクレ
オチド変異体の何れも、MAPOPの機能的又は構造的特徴の少なくとも1種類
を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【0073】 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の類似性しか有していないものも含めて、多
種のMAPOPをコードするヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明
は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作り出される
あらゆる可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは
、自然発生のMAPOPのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプ
レット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような変異は全てここ
に具体的に開示されたものと考えられたい。
【0074】 MAPOPをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適切に選択され
たストリンジェンシーの条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能であるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを有しているMAPO
P又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得
る。コドンの選択においては、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従
って、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を
高めるように選択することができる。MAPOP及びその誘導体をコードするヌ
クレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列が変わらないように実質的に改変
する他の理由として、例えば自然発生配列から作られる転写物より長い半減期の
ような、より望ましい特性を有するRNA転写物を作り出すことが挙げられる。
【0075】 本発明の範囲には、MAPOP又はその誘導体をコードするDNA配列又はそ
の断片の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製した後、この合成
遺伝子を、周知の試薬を用いて入手可能な様々な発現ベクター及び細胞系に挿入
することができる。更に、合成ケミストリを用いてMAPOPをコードする配列
又はその任意の断片に突然変異を導入することができる。
【0076】 また本発明の範囲に含まれるものとして、様々なストリンジェンシー条件の下
で請求項に記載のポリヌクレオチド配列、特に配列番号:4−6またはそれらの
断片に示すポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列
がある(例えばWahl, G.M. 及びS.L.Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-
407; 及びKimmel, A.R. (1987) Methods in Enzymol. 152:507-511参照)。例え
ば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM未満のNaCl及び75
mM未満の酢酸3ナトリウム、好ましくは約500mM未満のNaCl及び75
mM未満の酢酸3ナトリウム、最も好ましくは約250mM未満のNaCl及び
25mM未満の酢酸3ナトリウムである。低いレベルのストリンジェントな条件
でのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドが無い状態で得
られ、高いレベルのストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、少
なくとも約35%のホルムアミド、最も好ましくは約50%のホルムアミドの存
在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約
30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42
℃の温度である。別のパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、界面活
性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、及びキャリアDNAの
有無等を変えることも、当業者に公知である。様々なレベルのストリンジェンシ
ーを、必要に応じて上記の様々な条件を組み合わせることによって達成できる。
好ましい実施態様では、750mMのNaCl、75mMの酢酸3ナトリウム、
及び1%のSDSにおいて30℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。より好
ましい実施態様では、500mMのNaCl、50mMの酢酸3ナトリウム、1
%のSDS、35%のホルムアミド、及び100μg/mlの変性サケ精子DN
A(ssDNA)において37℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。最も好
ましい実施態様では、250mMのNaCl、25mMの酢酸3ナトリウム、1
%のSDS、50%のホルムアミド、及び200μg/mlのssDNAにおい
て42℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。有益なこれらの条件の変更は、
当業者には明らかであろう。
【0077】 ハイブリダイゼーションの後に行われる洗浄過程でも、ストリンジェンシーを
変えることができる。洗浄でのストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、及
び温度によって確定することができる。上述のように、洗浄過程でのストリンジ
ェンシーは、塩濃度を下げることによって、又は温度を上昇させることによって
高めることができる。例えば、洗浄過程のストリンジェントな塩濃度は、好まし
くは約30mM未満のNaCl及び3mM未満の酢酸3ナトリウムであり、最も
この好ましくは約15mM未満のNaCl及び1.5mM未満の酢酸3ナトリウ
ムである。洗浄過程のストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約25
℃、より好ましくは少なくとも約42℃、最も好ましくは少なくとも約68℃で
ある。好ましい実施態様では、洗浄過程を、30mMのNaCl、3mMの酢酸
3ナトリウム、及び0.1%のSDSにおいて42℃で行う。最も好ましい実施
態様では、洗浄過程を、15mMのNaCl、1.5mMの酢酸3ナトリウム、
及び0.1%のSDSにおいて68℃で行う。これらの条件の他の変更について
は、当業者には明らかであろう。
【0078】 DNAシークエンシング(配列決定)の方法は、周知で当業者が通常利用可能
であり、本発明の実施例の何れかの実施のために用いることができる。この方法
では、例えばDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントであるSequenase(US
Biochemical Corp. Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、熱安
定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago IL)、或いはGibco BRL(Gaithersb
urg MD)から発売されているELONGASE Amplification Systemに見られるものの
ような校正エキソヌクレアーゼと組換え体ポリメラーゼとの組み合わせたものの
ような酵素を用いることができる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab2200(
Hamilton, Reno, NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Reserch, Watert
own MA)並びにABI Catalyst 800(Perkin Elmer)のような装置を用いて自動化
するのが好ましい。次に、ABI377または377 DNA Sequencing System(Perkin El
mer)またはキャピラリー電気泳動装置(Molecular Dynamics)を用いて配列決
定を行う。得られた配列は、当分野で公知の様々なアルゴリズムを用いて解析す
る(例えば、Ausubel, 前出, ch. 7.7; 及びMeyers, R.A. (1995) Molecular Bi
ology and Biotechnology, Wiley VCH, Inc., New York, NY, pp. 856-853参照
)。
【0079】 MAPOPをコードする核酸配列を、部分的なヌクレオチド配列を利用して、
様々な公知のPCRをベースにした方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調
節エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、使用可能な
方法の一つである制限部位PCR法では、汎用プライマー及び入れ子プライマー
を用いてクローニングベクター内のゲノムのDNAから未知の配列を得る(例え
ばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322参照)。別の方法である逆
PCR法では、ばらばらな方向に伸長するプライマーを利用して、環状のテンプ
レートから未知の配列を増幅する。このテンプレートは、既知のゲノムの座位及
びその周りの配列を含む制限断片に由来するものである。(例えばTriglia, T.
他(1988)Nucleic Acids Res 16:8186参照)。第3の方法であるキャプチャP
CR法では、ヒト及び酵母菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA
断片をPCRによって増幅する(例えばLagerstrom, M.他(1991)PCR Methods
Applic 1:111-119参照)。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素に
よる消化及び連結によってそのDNA分子の未知の断片のなかに、組換え二本鎖
配列を組み入れておくこともできる。未知の配列を釣り上げるために用いること
ができる別の方法も公知となっている(例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic
Acids Res 19:3055-3060参照)。更に、PCR、入れ子プライマー、PromoterFi
nderTMライブラリーを用いて、ゲノムDNA内歩行を行うことができる(Clonte
ch, Palo Alto CA)。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要
がなく、イントロン/エクソン接合部を探し出すのに有用である。全てのPCR
をベースにした方法のために、プライマーを、OLIGO 4.06 Primer Analysis sof
tware(National Biosciences Inc., Plymouth MN)のような市販のソフトウェ
アや他の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチド、GC含量
が50%以上、かつ約68〜72℃の温度で標的配列にアニールするように設計
することができる。
【0080】 完全長cDNAをスクリーニングするときには、より大きなcDNAを含むよ
うにサイズ選択されたライブラリーを用いるのが好ましい。またランダムプライ
ミングした(random primed)ライブラリーは、多くの場合遺伝子の5′領域を
含み、オリゴd(T)ライブラリーでは完全長cDNAが得られない場合に特に
好ましい。またゲノムライブラリーは、転写されない5′調節領域まで配列を延
長するために有用であり得る。
【0081】 シークエンシングやPCRの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したりその
存在を確認するために、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることがで
きる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための
流動性ポリマー、レーザーで活性化される4種の異なる蛍光色素(各ヌクレオチ
ドに対して1種類)を使用し、CCDカメラを用いて放射された波長の検出を行
う。出力/光強度は適切なソフトウエア(例えばPerkin Elmer製のGenotyperTM
及びSequence NavigatorTM)を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷から
コンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。
キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に少量しか存在しないようなDN
Aの小片の配列決定に特に適している。
【0082】 本発明の別の実施例では、MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列また
はその断片を組換えDNA分子に組み入れることにより、適切な宿主細胞内での
MAPOP、その断片または機能的等価物の発現を誘導することができる。遺伝
暗号固有の縮重のために、実質的に同一又は機能的に等価なアミノ酸配列をコー
ドする他のDNA配列も作り出され得、これらの配列をMAPOPの発現のため
に用いることができる。
【0083】 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でMAPOPをコードする配列を改
変するために、周知の方法を用いて組換えることができる。この配列改変の目的
としては、限定するものではないが、例えば遺伝子産物のクローニング、プロセ
シング及び/又は発現を変えること等が挙げられる。無作為断片によるDNA再
編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCRによる再構成(reassemb
ly)によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。例えば、オリゴヌク
レオチド媒介特定部位突然変異誘発によって、新しい制限部位の挿入、グリコシ
ル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの作出、突然変
異の導入その他を達成することができる。
【0084】 本発明の別の実施例では、周知の化学的方法(例えばCaruthers. M.H.他(198
0)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980)Nucl. Acids
Res. Symp. Ser. 225-232参照)を用いて、MAPOPをコードする配列の全体
、或いはその一部を合成することができる。或いは、化学的方法を用いてタンパ
ク質自体を作り出して、MAPOPのアミノ酸配列またはその断片を合成するこ
とができる。例えば、様々な固相技術(例えばRoberge, J.Y.他(1995) Science
269:202-204参照)でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばA
BI 431Aペプチド合成機(Perkin Elmer)を用いることにより達成することがで
きる。更に、MAPOPのアミノ酸配列及びその任意の一部を、直接の合成の際
の変更し、かつ/又は他のタンパク質又はその任意の一部の配列と結合すること
によって、変異体ポリペプチドを作り出すことができる。
【0085】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製する
ことができる(例えば、Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol
. 182:392-421参照)。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いはシー
クエンシングにより確認することができる(例えばCreighton T.(1983)Protei
ns Structure and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY
参照)。
【0086】 生物学的に活性なMAPOPを発現させるためには、MAPOPをコードする
ヌクレオチド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内
で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な配列を含むベクタ
ーに挿入する。これらの配列としては、例えば、ベクターにおける、及びMAP
OPをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成的及び誘導
的プロモーター、及び5’及び3’末端非翻訳領域のような制御配列が挙げられ
る。このようなエレメントの作用の強さや特異性は様々に異なったものであり得
る。また、MAPOPをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の
開始シグナルも必要である。このようなシグナルとしては、ATG開始コドン及
び隣接する配列、例えばKozak配列が挙げられる。MAPOP及びその開始コド
ン及び上流の制御配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写
または翻訳の制御シグナルは不要である。しかし、コーディング配列又はその断
片のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを
与えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにす
るために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレ
メント及び開始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり
得る。使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現
の効率を高めることができる(例えば、Scharf,D.他(1994)Results Probl. Ce
ll Differ. 20:125-162参照)。
【0087】 MAPOPをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベク
ターを作製するために、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方
法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、並びにin vivo遺伝子組換
え技術が含まれる(例えば、Sambrook, J.他(1989)Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Planview NY, ch. 4, 8及びAusub
el, F.M.等(1995, 及び定期的な増補) Current Protocol in Molecular Biology
, John Wiley &Sons, New York, NY, ch. 9, 13,及び16を参照)。
【0088】 様々な発現ベクター/宿主系を、MAPOPをコードする配列の保持、発現の
ために利用することができる。このようなものとしては、以下に限定するもので
はないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベ
クターで形質転換した細菌のような微生物;酵母菌発現ベクターで形質転換した
酵母菌;ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細
胞系;ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、
タバコモザイクウイルス(TMV))或いは細菌の発現ベクター(例えばTi、或い
はpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系;或いは動物細胞系が挙げられ
る。本発明は、使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【0089】 細菌系では、MAPOPをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々な
クローニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、MAPOPを
コードするポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及
び成長(propagation)を、例えばBluescript(Stratagene)やpSport1TMプラス
ミド(GIBCO BRL)のような多機能大腸菌ベクターを用いて達成することができ
る。ベクターの様々なクローニング部位にMAPOPをコードする配列を組み入
れてlacZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質転換された細菌を特
定するための比色によるスクリーニングを行うことができるようになる。更に、
これらのベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシークエンシング、ヘルパ
ーファージによる一本鎖レスキュー(single strand rescue)、及びクローン化
した配列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る(例えばVan Heeke,
G.及びS.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509)。例えば抗体産
生のために大量のMAPOPが必要な場合には、MAPOPの高レベルで発現を
誘導するベクターを用いることができる。例えば、強い誘導性T5またはT7バ
クテリオファージプロモーターを含むベクターを用いることができる。
【0090】 MAPOPの産生のために、酵母発現系を用いることもできる。例えばα因子
、アルコールオキシダーゼ、及びPGHのような構成的または誘導的プロモータ
ーを含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyce
s cerevisiae)やメタノール資化酵母ピチアパストリス(Pichia pastoris)に
おいて用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパク
質の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現のた
めの外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする(例えばAusubel, 前出;
及びGrant他(1987)Methods Enzymol. 153:516-54; Scorer, C.A.他(1994) Bio/
Technology 12:181-184参照)。
【0091】 MAPOPの発現のために植物系も用いることができる。例えばCaMVの35S及
び19Sプロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV(Ta
kamatsu,N.他(1987)EMBO J 6:307-311)のオメガリーダー配列と共に用いて、
MAPOPをコードする配列の転写を促進することができる。或いは、RUBISCO
の小サブユニットや熱ショックプロモーターのような植物のプロモーターを用い
てもよい(例えばCoruzzi, G.他(1984)EMBO J 3:1671-1680; Broglie, R.他(
1984)Science 224:838-843; 及びWinter, J.他(1991)Results Probl. Cell D
iffer. 17:85-105参照)。これらの作製物は、直接的なDNA形質転換或いは病
原体によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる(例えばHobbs,
S.又はMurry, L.E. McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992
)McGraw Hill NY, pp191-196を参照されたい)。
【0092】 哺乳動物の細胞では、多種のウイルスをベースにした発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、MAPOPをコ
ードする配列を、後期プロモーター及び三連リーダー配列(tripartite leader
sequence)からなるアデノウイルスの転写/翻訳複合体に連結することが可能で
ある。ウイルスのゲノムの非必須のE1領域又はE3領域へ挿入することにより
、宿主細胞におけるMAPOPを発現する感染性のウイルスが得られる(例えば
Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。さら
に、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス(RSV)
エンハンサーのような転写エンハンサーを用いることができる。
【0093】 また、ヒト人工染色体(HAC)を用いることにより、プラスミドに組み入れ
られてそこから発現され得るものより大きいDNAの断片を供給することもでき
る。治療上の目的で、6kb〜10MbのHACを構築し、従来のデリバリー方
法(リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞)を利用して供給す
ることができる。
【0094】 哺乳動物系において長期間にわたる組換えタンパク質の産生を確保するために
は、細胞系におけるMAPOPの安定した発現が望ましい。例えば、ウイルスの
複製起源及び/または内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を同一のベ
クター上、或いは個別のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて、MAPO
Pをコードする配列を、細胞系に形質転換することができる。ベクターの導入の
後、細胞を濃縮培地内で概ね1〜2日間増殖させ、次に選択培地に切り替える。
選択マーカーの目的は、選択薬に対する耐性を与え、その存在に基づいて導入さ
れた配列を間違いなく発現する細胞を増殖させ、回収できるようにすることであ
る。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織
培養技術を用いて増殖させることができる。
【0095】 形質転換された細胞系を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系としては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子(tk)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(
apr)が挙げられ、それぞれtk-又はapr-細胞において用いられる(例えばWigler
, M.他 (1977) Cell 11:223-232、及びLowy, I.他 (1980) Cell 22:817-823参照
)。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用い
ることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはア
ミノ配糖体のネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え、als或いはpatは
クロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(例え
ば、Wigler, M.他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570、Colberre-Ga
rapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14、及びMurry (前出)参照)。別の
選択に利用できる遺伝子として、例えば、代謝のために細胞が要求する物質を変
える、trpBやhisDが文献に記載されている(例えばHartman, S.C.及びR.C. Mull
igan(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051)。可視マーカー、例えば
アントシアニン、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein;GFT)
、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−D−グルクロノシド、またはル
シフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマーカ
ーは、形質転換体を特定するためばかりでなく、特定の発現ベクター系によ一過
性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために藻い入ることができる
(例えばRhodes, C.A.他 (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131)。
【0096】 マーカー遺伝子の発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在も示唆され
るが、その存在及び発現は確認する必要があることがある。例えばMAPOPを
コードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、MAPOPをコー
ドする配列が組み入れられた形質転換された細胞を、マーカー遺伝子の機能の欠
如に基づいて確認できる。或いは、マーカー遺伝子はMAPOPをコードする配
列と直列に配置され得、両者が単一のプロモータの制御下となり得る。誘導に応
じたマーカー遺伝子の発現、即ち選択は、通常、直列に配置された配列の発現を
も同時に表す。
【0097】 一般的に、MAPOPをコードする核酸配列を含みMAPOPを発現する宿主
細胞は、当業者に周知の様々な方法により同定することができる。このような方
法としては、限定するものではないが、DNA−DNA或いはDNA−RNAハ
イブリダイゼーション、PCRによる増幅、及び核酸及びタンパク質を検出かつ
/または定量するための、膜、溶液、或いはチップを用いる技術を含むタンパク
質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ等が挙げられる。
【0098】 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いる、MAPOPの発現を検出、測定するための免疫学的方法は周知で
ある。このような方法としては、以下に限定するものではないが、酵素結合免疫
検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光表示式細胞分取器法(
FACS)等が挙げられる。MAPOPポリペプチド上の2つの非干渉なエピトープ
に対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイ
ムノアッセイ(two-site, monoclonal-based immunoassay)が好適であるが、競
合的結合アッセイを用いてもよい。これらアッセイの並びに他のアッセイは周知
である(例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manu
al, APS Press, St. Paul MN; Coligan, J.E.他(1997及び定期的に発行される補
遺)Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-In
terscience, New York, NY; 及びMaddox, D.E.他(1983) J. Exp. Med. 158:1211
-1216参照)。
【0099】 様々な標識・結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸のア
ッセイにおいて用いることができる。MAPOPをコードするポリヌクレオチド
に近縁な配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ・
PCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識法、ニックトランスレー
ション法、末端標識法、或いは標識したヌクレオチドを用いるPCR増幅が含ま
れる。或いは、MAPOPをコードする配列またはその任意の断片を、mRNA
プローブの作製のためのベクターにクローン化してもよい。そのようなベクター
は周知で、市販されており、これを用いて例えばT7、T3、或いはSP6のよ
うな適切なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによっ
て、in vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの方法は、種々
の市販のキット、例えばAmersham Pharmacia Biotech;Promega(Madison WI)
;及びU.S. Biochemical Corp.(Cleveland OH)から提供されているものを用い
て実施することができる。検出を容易にするために用いられ得る適切なリポータ
ー分子、すなわち標識としては、放射性核種、酵素、フルオレセント(蛍光剤)
、化学発光剤、或いは色素剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が
挙げられる。
【0100】 MAPOPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、この
タンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養
することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いら
れる配列及び/またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持さ
れる。当業者には理解されるように、MAPOPをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのMAPOP分泌
を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。
【0101】 加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパ
ク質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよ
うなポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カル
ボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)並びにアシル化が
含まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも
、タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び/又は作用を特定するために用
いることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有
している種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38)はAmerican
Type Culture Collection(ATCC; Bethesda, MD)より入手でき、導入される外
来タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかか
ら選択することができる。
【0102】 本発明の別の実施例では、MAPOPをコードする、天然の、修飾した、或い
は組換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける
融合タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって
認識され得る異種分子を含むキメラMAPOPタンパク質は、ペプチドライブラ
リーからのMAPOPの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分
子としては、限定するものではないが、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GS
T)、マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュ
リン結合ペプチド(CBP)、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素(HA)が挙
げられる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチ
オン、マルトース、酸化フェニルアルシン(phenylarsine oxide)、カルモジュ
リン、及び金属キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可
能となる。FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素(HA)によって、それらのエピトー
プのタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体
を用いた融合タンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク
質を、MAPOPをコードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク
分解酵素による切断部位を含むように組換えることによって、MAPOPを、精
製の後にヘテロの分子から切り離すことができるようになる。融合タンパク質の
発現及び精製のための方法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に
記載されている。融合タンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市
販のキットを用いてもよい。
【0103】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したMAPOPを、TNTTMウサギ網状
赤血球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系(Promega, Madison, WI)を用い
てin vitroで合成することができる。これらの系は、T7、T3、またはSP6
プロモーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結
びつける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは35S-メチオニンの
存在の下で生じる。
【0104】 MAPOPの断片の作製は、組換え体の産生によって行うのみならず、固相技
術を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる(例えばCreighton,
前出pp.55-60参照)。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動的に行う
ことができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチド合
成機 (The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) を用いて達成することができる
。MAPOPの様々な断片を個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出
すことができる。
【0105】 (治療) MAPOP−1、MAPOP−2、hRVP1、膜貫通タンパク質の領域のな
かに、例えば配列及びモチーフの関連で、部分的な化学的及び構造的類似性が存
在する。更に、MAPOP−3、TDAG51、及びプレクストリン相同ドメイ
ンの領域のなかに、部分的な化学的及び構造的類似性が存在する。更に、MAP
OPは、細胞増殖及び免疫系に関連する組織において発現される。従って、MA
POPは、細胞増殖の異常及び自己免疫異常において一定の役割を果たしている
と考えられる。
【0106】 従って、或る実施態様では、細胞増殖の異常の処置又は予防のために、MAP
OP又はその断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。そのような疾患としては
、以下に限定するものではないが、日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動
脈硬化症、滑液包炎、肝硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維
症、発作性夜間血色素尿症、真正赤血球増加症、乾癬、原発性血小板血症、及び
腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫等、具体的には、副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌を含む癌等が挙げられる。
【0107】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む細胞増
殖の異常の処置又は予防のために、MAPOP又はその断片若しくは誘導体を発
現し得るベクターを患者に投与し得る。
【0108】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む細
胞増殖の異常の処置又は予防のために、実質的に精製されたMAPOPを適切な
医薬用担体と共に含む医薬品組成物を患者に投与し得る。
【0109】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む細
胞増殖の異常の疾患の処置又は予防のために、MAPOPの活性を変調するアゴ
ニストを患者に投与し得る。
【0110】 別の実施態様では、自己免疫異常の処置又は予防のためにMAPOP又はその
断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。そのような疾患としては、以下に限定
するものではないが、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼
吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテ
ローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、
胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺
気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮
性胃炎、腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、
過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜
の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、乾癬、ライター症候群、リ
ウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身アナフィラキシー、全身性
エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ
膜炎、ウェルナー症候群、癌と血液透析と体外循環との合併症、ウイルス感染、
細菌感染、真菌感染、原虫感染、及び蠕虫感染、及び外傷等が挙げられる。
【0111】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自己免
疫異常の処置又は予防のために、MAPOPまたはその断片若しくは誘導体を発
現し得るベクターを患者に投与し得る。
【0112】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自
己免疫異常の処置又は予防のために、実質的に精製されたMAPOPを適切な医
薬用担体と共に含む医薬品組成物を患者に投与し得る。
【0113】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自
己免疫異常の処置又は予防のために、MAPOPの活性を変調するアゴニストを
患者に投与し得る。
【0114】 別の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補的配列、又はベクターの何れかを、他の適切な薬剤と組み合わせて投与する
ことができる。当業者であれば、従来の薬学上の原理に基づいて併用療法で用い
るための適切な薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の様々な疾患の治療又は予防に効果を奏する相乗作用が得られる。この
方法を用いることにより、より低い用量の各薬剤で治療効果を上げることができ
、副作用が生ずる可能性を低下させることができる。
【0115】 MAPOPのアンタゴニストは、周知の方法を用いて製造することができる。
詳述すると、精製されたMAPOPを用いることによって、抗体を作り出したり
、或いはMAPOPに特異的に結合するものを同定するために薬物のライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。MAPOPに対する抗体も、周知の方法
を用いて作り出すことができる。このような抗体としては、限定するものではな
いが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、F
abフラグメント、及びFab発現ライブラリーから作られたフラグメントが含
まれる。中和抗体(即ち二量体形成を阻害するもの)は治療の用途に特に好適で
ある。
【0116】 抗体を作り出すため、MAPOPか、免疫学的特性を有するその断片或いはオ
リゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の様々
なホストを免疫化することができる。モノクローナル抗体の産生を含むダウンス
トリームの用途のためには、ラット及びマウスが好適である。免疫学的反応を増
強するために、ホストの種に応じた様々なアジュバントを用いることができる。
そのようなアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイントのアジ
ュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような界面
活性物質、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプ
チド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、並びにジニト
ロフェノール等が挙げられる。ヒトで使用するアジュバントのなかでは、BCG
(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム−パルヴム(Corynebacter
ium parvum)が特に好適である(抗体の産生及び解析のための方法を再検討する
ため、例えば、Harlow, E.及びLane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Man
ual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照された
い。)。
【0117】 MAPOPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、またはその断片は、好ましくは5個以上のアミノ酸、より好ましくは14個
以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、元のタン
パク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小型の自然発生の分子の全アミノ酸
配列を含んでいるのが好ましい。MAPOPアミノ酸の短いストレッチを、キー
ホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような他のタンパク質のストレッチ
と融合し、そのキメラ分子に対する抗体を産生させることができる。
【0118】 MAPOPのモノクローナル抗体は、培地内の無制限増殖性細胞系(continuo
us cell line)に抗体分子を産生させる技術を用いて作製できる。このような技
術として、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリ
ドーマ技術、及びEBV−ハイブリドーマ技術等が挙げられる(例えば、Kohler
, G.他(1975) Nature 256:495-497;Kozbor, D.他 (1985) J. Immunol. Methods
81 :31-42;Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030;Col
e, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120参照)。
【0119】 加えて、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための、マウス
抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする技術のような「キメラ抗体」
の産生のために開発された技術を用いることができる(例えば、Morrison,S.L.
他(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855;Neuberger, M.S.他(1984)
Nature 312:604-608;Takeda, S.他(1985)Nature 314:452-454参照)。或いは
、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、周知の方法によりMAPOP
に特異的な一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有しているが
イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブ
ラリーからの鎖再編成(chain shuffling)によって作り出すことができる(例
えば、Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3参照)。
【0120】 また、文献(例えば、Orlandi, R.他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:383
3-3837;Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299参照)に開示されているよう
に、高度に特異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをス
クリーニングすることによって、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘導
することによって抗体を作り出すこともできる。
【0121】 MAPOPに対する特異結合部位を含む抗体断片を作り出すこともできる。こ
のような断片としては、以下に限定するものではないが、抗体分子のペプシンに
よる消化で生成することができるF(ab′)2フラグメントや、F(ab′)2 フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより作り出すことができるFa
bフラグメント等が挙げられる。或いは、所望の特異性を有するモノクローナル
Fabフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Fab発現ライブラリ
ーを作製してもよい(例えば、Huse, W.D.他(1989)Science 256:1275-1281参
照)。
【0122】 様々なイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗
体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いはラジ
オイムノアッセイの、様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイム
ノアッセイでは、MAPOPとその特異的抗体との複合体の形成量の測定を行う
。2つの互いに非干渉なエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる二部
位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイ(two sites monoclonal based imm
unoassay)が好適であるが、競合的結合アッセイを用いてもよい(Maddox, 前出
)。
【0123】 ラジオイムノアッセイ技術と合わせて用いるスキャッチャード解析のような様
々な方法を用いて、MAPOPの抗体の親和性(アフィニティー)を評価するこ
とができる。親和性は、MAPOP−抗体複合体のモル濃度を、平衡条件の下で
遊離した抗原のモル濃度と遊離した抗体のモル濃度とで除したものとして定義さ
れる結合定数Kaで表される。複数種のMAPOPエピトープに対するその親和
性が一様でないポリクローナル抗体の調製物について決定されたKaは、MAP
OPに対するその抗体の平均親和性、即ち親和力(アビディティー)を表す。特
定のMAPOPエピトープに対して単一特異的なモノクローナル抗体の調製物に
対して決定されるKaは、親和性の真の測定値を表す。約109〜1012L/モル
の範囲のKa値を有する親和性の高い抗体の調製物は、MAPOP−抗体複合体
が厳密な操作に耐えなければならないイムノアッセイにおいて使用するのに適し
ている。Kaが約106〜107L/モルの範囲の親和性の低い抗体の調製物は、
最終的に抗体からMAPOP(好ましくは活性の形態)を分離することが必要な
免疫精製法及び類似の手順において使用するのに使用するのに適している(Catt
y, D. (1988) Antibodies. Volume I: A Practical Anoroach, IRL Press, Wash
ington. D. C.; 及びLiddell, J. E.及びCryer, A. (1991) A Practical Guide
to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York, NY.)。
【0124】 ポリクローナル抗体調製物の力価及び親和力を更に評価して、そのような調製
物の下流部門における一定の用途に対する適合性及び品質を決定することができ
る。例えば、1ml当たり少なくとも1〜2mgの特異的抗体、好ましくは1m
l当たり5〜10mgの特異的抗体を含むポリクローナル抗体調製物は、MAP
OP抗体複合体の調製物を必要とする方法で用いるのに適している。抗体の特異
性、力価、及び親和力を評価するための手順、及び様々な用途における抗体の品
質及び使用法についてのガイドラインは周知となっている(例えばCatty, (前出
)及びColigan等(前出)参照)。
【0125】 本発明の別の実施例では、MAPOPをコードするポリヌクレオチド、または
その任意の断片や相補配列を、治療上の目的で用いることができる。或る実施態
様では、mRNAの転写を阻害することが望ましいような状況において、MAP
OPをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳
述すると、MAPOPをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形
質転換することができる。従って、相補的分子または断片を用いて、MAPOP
の活性を変調、即ち遺伝子の機能を調節することができる。このような技術は現
在周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、若しくはより大き
な断片は、MAPOPコーディング配列のコード領域や調節領域の様々な位置か
ら設計することができる。
【0126】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の
発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターを、標的
の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いることが
できる。MAPOPをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列
を発現するベクターは、当業者に周知の方法を用いて作製することができる(例
えば、Sambrookら(前出)及びAusubelら(前出)参照)。
【0127】 MAPOPをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現す
る発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより、MAPOPをコー
ドする遺伝子を機能停止させることができる。このような作製物を用いて、翻訳
不可能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。こ
のようなベクターは、DNAへ組み入れられない場合でも、そのベクターが内在
性ヌクレアーゼにより破壊されるまでRNA分子の転写を続ける。このような一
過性の発現は、非複製ベクターでも1ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクタ
ー系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。
【0128】 上述のように、MAPOPをコードする遺伝子の制御領域、5′領域、または
調節領域(シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン)に相
補的な配列、即ちアンチセンス分子(DNA、RNAまたはPNA)を設計する
ことにより遺伝子の発現の仕方を変えることができる。転写開始部位、例えば開
始部位の概ね+10〜−10の間の位置にある領域に由来するオリゴヌクレオチ
ドが好適である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成することが
できる。三重らせん対合が有用なのは、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、
或いは調節分子の結合のために十分にほどける能力を、それが阻害するからであ
る。三重らせんDNAを用いた最近の治療上の進歩については、文献に記載され
ている(例えば、Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Appr
oaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NYにおけるGee, J.E.他(1994)参照)
。また、転写物のリボソームへの結合を妨げてmRNAの転写を阻害するために
、相補的配列、即ちアンチセンス分子を設計することもできる。
【0129】 酵素性RNA分子であるリボザイムを、RNAの特異的切断を触媒するために
用いることもできる。リボザイムの作用機構では、リボザイム分子が相補的標的
RNAに配列特異的にハイブリダイズし、その後エンドヌクレアーゼによる切断
(endonucleolytic cleavage)がなされる。使用できるリボザイムの例として、
MAPOPをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果
的に触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子がある。
【0130】 標的となり得るRNA内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、標的の分
子における配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位をスキャンするこ
とによって同定する。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する15〜20個のリボヌクレオチドからなる短いRNA配列について、その
オリゴヌクレオチドの機能を停止させる2次構造の特徴を評価することができる
。候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(ribonucl
ease protection assay)によって、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションについての接触性(accessibility)を測定することにより評価
することができる。
【0131】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための周知
の方法により作製することができる。これらの技術としては、固相ホスホラミダ
イト化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの化学合成技術等がある。或いは、
RNA分子は、in vivo及びin vitroでのMAPOPをコードするDNA配列の
転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6
のような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを有する様々なベクターに組み
入れることができる。或いは、構成的RNAを合成するcDNA作製物を、細胞
系、細胞或いは組織内に導入することができる。
【0132】 RNA分子はその細胞内での安定性を高めたり、半減期を長くするために修飾
することができる。可能な修飾としては、限定するものではないが、その分子の
5′末端か3′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバ
ックボーン内でホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート(phosph
orothioate)或いは2′O−メチルを使用すること等が挙げられる。この方式(
concept)は本来PNAの作製において用いられるもので、以下のようにこれら
の分子全てに拡張することができる。即ち、内在性エンドヌクレアーゼにより容
易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、ア
セチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の形態の修飾によるだけでなく、イ
ノシン、キュエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような
従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら分子全てにこの
方式を拡張することができる。
【0133】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、
それらの方法は、in vivoin vitro、及びex vivoでの使用についても同様に適
している。ex vivo治療の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導
入し、自家移植用にクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またト
ランスフェクションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミ
ノポリマーによるデリバリー(Goldman, C.K.他(1997) Nature Biotechnology 1
5:462-66; 引用により本明細書の一部とする)は、当分野で周知の方法を用いて
実施することができる。
【0134】 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び
最も好ましくはヒトのような哺乳動物を含む、任意の適切な被験体に適用するこ
とができる。
【0135】 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果をあげるために、医薬品組成物
を医薬上許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成物は、MAP
OP、MAPOPに対する抗体、MAPOPの模擬体(mimetics)、アゴニスト
、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成
物は、単独で、或いは例えば安定化剤のような1種以上の他の薬剤とともに、滅
菌した生体適合性の医薬用担体を用いて投与する。このような担体としては、限
定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水等が挙げられる。こ
のような組成物は、単体で、或いは他の薬剤やホルモンと組み合わせた形で患者
に投与することができる。
【0136】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路としては、以下に限定するもので
はないが、経口投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、髄腔内投
与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局
所投与、舌下投与、或いは直腸内投与等が挙げられる。
【0137】 これらの医薬品組成物は、主成分に加えて、作用物質を医薬上使用可能な製剤
にするための処理を容易にする、賦形剤及び添加剤のような適切な医薬上許容さ
れる担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、Remington's Phar
maceutical Sciences(Maack Publishing Co, Easton PA)の最新版において見
ることができる。
【0138】 経口投与用の医薬品組成物は、当分野で周知の医薬上に許容される担体を用い
て適切な剤形に製剤することができる。このような担体により、この医薬品組成
物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤
、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤することができる。
【0139】 経口投与するための医薬製剤は、主成分と固形の賦形剤とを組み合わせた上で
、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、錠剤或いは糖衣剤コア(dragee core
)を作るために、(所望に応じて粉砕した後に)顆粒の混合物を加工することに
よって得られる。必要ならば適切な添加剤を添加することができる。適切な添加
剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む
砂糖のような糖質或いはタンパク質の賦形剤(filler)、トウモロコシ、コムギ
、コメ、ジャガイモ等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロー
ス、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラ
ーゲンのようなタンパク質がある。必要ならば、崩壊剤または可溶化剤、或いは
橋かけ結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなア
ルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を加えてもよい。
【0140】 糖衣剤コアは、濃縮砂糖溶液等により適切な錠皮を塗布して用いられる。錠皮
を作るための溶液としては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ
ルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール、及び/または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物等が挙げられる。錠剤の識別のため
、或いは主成分の量即ち投与量を表示するために染料或いは色素を錠剤或いは錠
皮に加えてもよい。
【0141】 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル、ゼラチ
ンからなる柔軟な密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトール
のような錠皮を有する。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷ
んのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、並びに所望に応じて安定化剤と混合された主成分を含み得る。柔軟な
カプセルでは、主成分が、安定化剤とともに或いは安定化剤なしで、脂肪油、液
体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸
濁されている。
【0142】 非経口投与用の医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液
或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において配合すること
ができる。水性の注射用懸濁剤には、 例えばカルボキシルメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質
を含めることができる。更に、主成分の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤とし
て調製することができる。適切な親油性の溶媒或いは担体としては、胡麻油のよ
うな脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合
成脂肪酸エステルがある。脂質でないポリカチオンのアミノポリマーをデリバリ
ーのために用いることもできる。懸濁剤には、溶解度を高め濃縮度の高い溶液の
調製を可能にする適切な薬剤または安定剤を、所望に応じて加えることができる
【0143】 局所適用または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸
透剤を用いて製する。このような浸透剤は、当技術分野において周知である。
【0144】 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来通りの混合、溶解、顆粒化、
糖衣形成、微粒子化(levigating)、乳化、カプセル化、エントラッピング(en
trapping)、或いは凍結乾燥により製造される。
【0145】 この医薬品組成物は塩として提供することもでき、限定するものではないが塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む種々の酸とともに
形成することができる。塩は、水性或いはプロトニック溶剤において、対応する
フリーの塩基形態より可溶性が高くなる傾向がある。この他、好ましい製剤には
、pH4.5〜5.5の範囲にあって、使用前に緩衝剤を配合した、1mM〜5
0mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、及び2%〜7%のマンニトール
の全てまたは何れかを含む凍結乾燥粉末がある。
【0146】 医薬品組成物は、調製した後に適切な容器内に入れ、さらに提示した状態の処
置に用いられるようにラベル付けすることができる。MAPOPの投与の場合、
このようなラベルには、投与の量、頻度、及び方法が表示される。
【0147】 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、有効成分を所望の目的
を達成するために有効な量含む組成物である。有効な量の決定は、当業者の能力
の範囲内で十分行うことができる。
【0148】 あらゆる化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通
常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセ
イから推定することができる。この動物モデルを、適切な濃度範囲や投与経路を
決定するために用いることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトに
おける有効な量や投与経路を決定することができる。
【0149】 治療上有効な量とは、症状や状態を改善する有効成分、例えばMAPOPまた
はその断片、MAPOPの抗体、MAPOPのアゴニスト、アンタゴニスト、ま
たはインヒビターの量である。そのような化合物の治療上の有効性及び毒性は、
細胞培地における或いは実験動物を用いた標準的な薬学的手順によって、例えば
ED50(集団の50%における治療上の有効量、50%有効量)及びLD50(集
団の50%の致死投与量)として決定することができる。毒性と治療有効性との
間の投与量の比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる
。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ
及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用における投与量の範囲を決め
る際に利用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或
いは全くなく、ED50を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与
量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変わ
ってくる。
【0150】 正しい投与量は、処置が必要な患者に関連する要因を考慮して担当医師が選択
する。用量及び投与は、主成分を十分なレベルだけ与え、かつ所望の効果を維持
するべく調節する。考慮すべき要素としては、疾病状態の重症度、患者の全身の
健康状態、患者の年齢、体重、並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用す
る薬剤、反応感受性、並びに治療に対する耐性/反応等が挙げられる。長期的に
作用する医薬品組成物は、その特定の製剤のクリアランス率に応じて、3〜4日
毎に、1週間毎に、或いは2週間に1度投与することができる。
【0151】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲にあって、全投与量は最大
約1gであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いはデリバリー
方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献に見出すことがで
きる。当業者であれば、ヌクレオチドでは、タンパク質やインヒビター用の剤形
とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのデリバリーの方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。
【0152】 (診断) 別の実施例では、MAPOPに特異的に結合する抗体を、MAPOPの発現に
よって特性化される疾病の診断、或いは、MAPOPやMAPOPのアゴニスト
、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリング
のためのアッセイにおいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、上
述の治療用のものと同一の方法で作り出すことができる。MAPOPの診断アッ
セイとして、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてMAPOPを検出す
るために抗体或いは標識を利用する方法がある。この抗体は、修飾して用いても
、修飾なしで用いてもよく、共有結合または非共有結合の何れかでリポーター分
子と結合させることにより標識することができる。幾つかは上記したが種々のリ
ポーター分子が知られており、それを用いることができる。
【0153】 例えばELISA(酵素結合免疫測定法)、RIA(ラジオイムノアッセイ)
並びにFACS(蛍光表示式細胞分取器法)のようなMAPOPを測定するため
の種々のプロトコルが当分野では周知であり、これによってMAPOP発現の変
化や異常を診断するための基礎が得られる。MAPOPの発現の正常値、即ち標
準値は、哺乳動物、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは細胞
抽出物とMAPOPの抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合させること
によって確立する。標準の複合体形成量は、様々な方法、好ましくは測光手段を
用いることにより定量することができる。被験者の生検組織の患部組織サンプル
及び対照サンプルにおいて発現されたMAPOPの量を、標準値と比較する。標
準値と被験者の値との偏差から、疾病の診断のためのパラメータを確立する。
【0154】 本発明の別の実施例では、MAPOPをコードするポリヌクレオチドを診断目
的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNA等がある。このポリヌク
レオチドは、MAPOPの発現が疾病と関係がある可能性がある生検組織におけ
る遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセイは、MAPO
Pが存在する状態か、存在しない状態か、過剰発現している状態の何れの状態に
あるかを区別したり、治療的な介入においてMAPOPレベルの調節をモニタリ
ングするために利用することができる。
【0155】 或る実施態様では、MAPOPまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出できるPCRプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを利用して、MAPOPをコードする核酸配列を同定することができる。そ
のプローブの特異性、即ちそのプローブが非常に高度に特異的な領域(例えば5
′調節領域における10個の独特のヌクレオチド)、或いは特異性の低い領域(
例えば特に3′コーディング領域)の何れに由来するのかということ、及びハイ
ブリダイゼーション或いは増幅の(高い、中程度の或いは低い)ストリンジェン
シーにより、そのプローブが自然発生MAPOPのみを同定するものであるか、
或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まる。
【0156】 プローブは、近縁な配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、
MAPOPをコードする任意の配列に基づくヌクレオチドを少なくとも50%含
むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRN
Aであり得、また配列番号:4、配列番号:5、又は配列番号:6の配列か、自
然発生MAPOP遺伝子のイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメン
トを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。
【0157】 MAPOPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプロ
ーブを作製するための手段としては、MAPOPやMAPOP誘導体をコードす
る核酸配列を、mRNAプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法が
ある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なRNAポリメラーゼ
や適切な標識ヌクレオチドを付加することによりin vitroでのRNAプローブ合
成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは様々なリポ
ータ分子により標識することができる。例えば、32Pや35Sのような放射性核種
により、アビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスフ
ァターゼのような酵素標識等により標識することができる。
【0158】 MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列を、MAPOPの発現に関連す
る疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下
に限定するものではないが、 日光性角化症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、滑液包炎、肝硬変、肝
炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間血色素尿症、真正
赤血球増加症、乾癬、原発性血小板血症、及び腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫
、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫等、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、
子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副
甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の
癌を含む癌等の細胞増殖の異常;及び 後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレ
ルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症
、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚
炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素
性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎、グッ
ドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過
敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節
炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ性関節炎、強
皮症、シェーグレン症候群、全身アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、
全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症
候群、癌と血液透析と体外循環との合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染
、原虫感染、及び蠕虫感染、及び外傷等の自己免疫異常 等が挙げられる。MAPOPをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の組織
や体液を利用する、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロッ
ト法或いは他の膜をベースにした技術や、PCR技術、ディップスティック試験
法(試験紙法)、ピン技術、及びELISAアッセイや、或いはマイクロアレイ
において用いることによって、MAPOP発現の変化を検出することができる。
このような定性的或いは定量的試験法は当分野では周知である。
【0159】 特定の実施態様では、特に上に列挙したもののような関連疾患の存在を検出す
るアッセイにおいてMAPOPをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る
。MAPOPをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加
えることができる。適当なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗
浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプル
におけるシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっ
ている場合、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダ
イズしており、サンプルのなかのMAPOPをコードするヌクレオチド配列のレ
ベルの変化が生じていることは、関連する疾患の存在を示している。このような
アッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにお
いて特定の治療上の処置の有効性を評価するために用いることもできる。
【0160】 MAPOPの発現に関連する疾病の診断の基礎とするために、正常な、即ち標
準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト何
れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞の抽出物を、ハイブリダイゼ
ーション或いは増幅に適した条件下でMAPOPをコードする配列又はその断片
と結合することにより確立し得る。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実
質的に精製されたMAPOPが用いられる実験で得られる値と、正常被験者で得
られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得
られた標準値は、疾病の症状を呈する患者のサンプルから得られる値と比較する
ことができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。
【0161】 一旦疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを定期的に反復して行って、患者における発現のレベルが正常な患者
において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。継続
的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月にわたる期間での
治療の効果を知ることができる。
【0162】 癌については、患者の生検組織において転写物が比較的多量に存在することが
、疾病の発生の素因を示す。つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す
る手段となり得る。このタイプの確定診断により、医療従事者が予防的処置を講
じたり、より早期に積極的な治療を開始し、癌の発生や更なる進行を予防するこ
とが可能となる。
【0163】 MAPOPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの別の診断目
的の使用法では、PCR法での利用があり得る。このようなオリゴマーは化学的
に合成したり、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作製することができ
る。オリゴマーは、好ましくは、MAPOPをコードするポリヌクレオチドの断
片又はMAPOPをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
含み、特定の遺伝子或いは状態を特定するために最適な条件下で用いられる。ま
た、オリゴマーは、近縁なDNAまたはRNA配列の検出または定量のため低い
厳密さの条件の下で用いることもできる。
【0164】 MAPOPの発現を定量するために用いることができる方法として、放射標識
(radiolabeling)或いはビオチン標識したヌクレオチドの利用、対照の核酸の
同時増幅(coamplification)の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準
のグラフ曲線の利用等もある(例えば、Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Meth
ods, 159:235-44;Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236参照)。多数の
サンプルの定量では、目的のオリゴマーが複数の希釈溶液中に存在し、分光光度
計を用いたり比色定量により迅速に定量することができるようなELISA形式
のアッセイを行うことによって一層定量のスピードを上げることができる。
【0165】 別の実施例では、ここに開示するポリヌクレオチド配列の何れかに由来するオ
リゴヌクレオチドまたはより大形の断片を、マイクロアレイにおけるターゲット
(標的)として用いることができる。マイクロアレイを用いることにより、多く
の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし(転写物イメージを生成する)、また遺
伝子の変異体、変異及び多型を同定することができる。この情報は、遺伝子の機
能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の診断、及び治療薬の開発やその
活性のモニタリングのために利用することができる。
【0166】 マイクロアレイを準備し、周知の方法を用いて解析してもよい(例えば、Bren
nan, T.M.ら(1995)米国特許No. 5,474,796; Schena, M.ら (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweilerら, (1995) PCT出願WO95/251116;
Shalon, Dら(1995) PCT出願WO95/35505; Heller, R.A.ら(1997) Proc. Natl. A
cad. Sci. 94:2150-2155; Heller, M.J.ら(1997)米国特許No. 5,605,662参照)
【0167】 本発明の別の実施例では、MAPOPをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列マッピングのために有用なハイブリダイゼーションプローブを作
り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人
工染色体作製物にマッピングし得る。人工染色体作製物としては、例えばヒト人
工染色体(HACs)、酵母菌人工染色体(YACs)、細菌人工染色体(BA
Cs)、細菌性P1作製物又は単染色体cDNAライブラリー等がある(例えば
、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends
Genet. 7:149-154参照)。
【0168】 蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、他の物理的染色体マッ
ピング技術及び遺伝子地図データと相互関係を有し得る(Meyers, R. A. (ed.)
Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers New York, NY, pp. 96
5-968に記載のHeinz-Ulrichら (1995)参照)。遺伝子地図データの例は、種々の
科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)に見ることができる
。物理的染色体地図上でのMAPOPをコードする配列の位置と特定の疾病(ま
たは特定の疾病の素因)との相関関係を助けとして、或る遺伝病に関連するDN
Aの領域を決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者
、キャリア、または患者の遺伝子配列の違いを検出することができる。
【0169】 染色体調製物のin situハイブリダイゼーションや、確立された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡大するた
めに用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知で
あっても、マウスのような別の哺乳動物の染色体上の遺伝子配置から、関連する
マーカーがわかる。新たな配列は、物理的マッピングにより染色体のアームまた
はその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング或いは他の
遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供するこ
とができる。例えば毛細血管拡張性運動失調(AT)が11q22-23に位置決定された
ように(例えば、Gatti, R.A.他(1988)Nature 336:577-580参照)、一旦疾患
或いは症候群が特定のゲノム領域に粗く位置決定されたならば、その領域にマッ
ピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節
遺伝子を表し得ることになる。本発明のヌクレオチド配列を、転座、逆位等によ
って生じた、正常者、キャリア、及び患者の間の染色体の位置の違いを検出する
ために用いることもできる。
【0170】 本発明の別の実施例では、MAPOPや、その触媒作用性または免疫原性断片
、オリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において化合物のスクリー
ニングのために用いることができる。このようなスクリーニングにおいて用いら
れる断片は、溶液に遊離した形態で存在するか、固体支持体へ付着した形態で存
在するか、細胞表面へ付着した形態で存在するか、或いは細胞内に存在するもの
であり得る。MAPOPと試験対象の薬剤との結合複合体形成を測定することが
できる。
【0171】 別の薬物スクリーニング技術によって、対象のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットのスクリーニングを行うことができる(
例えば、Geysenら (1984) PCT出願WO84/03564参照)。この方法では、MAPO
Pに適用する場合、多数の異なる小形の試験対象の化合物を、プラスチックピン
或いは他の表面のような固体基板上で合成する。この試験対象の化合物をMAP
OP又はその断片と反応させ、洗浄する。次に結合したMAPOPを当分野で周
知の方法により検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術において使用す
るために、精製したMAPOPをプレート上に直接コーティングすることもでき
る。或いは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定するこ
とができる。
【0172】 別の実施例では、MAPOPに結合し得る中和抗体が、MAPOPとの結合に
ついて試験対象の化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイ
を用いることができる。この方法では、抗体を用いて、MAPOPの1または2
以上の抗原決定基を共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる
【0173】 更に別の実施例では、現在までに開発されていない分子生物学上の技術であっ
ても、その新技術がヌクレオチド配列の現在までに知られている特性(例えば、
以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合のような特性)に
基づく技術であるならば、その技術においてMAPOPをコードするヌクレオチ
ド配列を用いることができる。
【0174】 以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明をこの実施例に限定しよ
うとするものではない。
【0175】
【実施例】
1 cDNAライブラリーの作製 COLNFET02 cDNAライブラリーを、妊娠20週目に死亡した白人女子胎児の
結腸組織から単離されたRNAを用いて作製した。
【0176】 BEPINOT01 cDNAライブラリーを、年齢54歳の白人男性に由来する気管支
上皮の初代細胞系から単離されたRNAを用いて作製した。
【0177】 DRGLNOT01 cDNAライブラリーは、急性肺水腫及び気管支肺炎、両側胸膜及
び心膜滲出液、及び悪性リンパ腫(ナチュラルキラー細胞型)で死亡した年齢3
2歳の白人男性の胸部下側/腰部上側領域から採取した後根神経節組織から単離
されたRNAを用いて作製した。被検体の既往症には、サイトメガロウイルス感
染の疑い、肝臓うっ血及び脂肪症、脾腫、出血性膀胱炎、甲状腺出血、及びベル
麻痺等があった。被検体の受けていた外科的処置としては、結腸鏡検査、大腸の
生検、アデノイド口蓋扁桃摘出、及び鼻咽頭の内視鏡検査及び生検等があり、放
射線療法の処置も受けていた。
【0178】 COLNFET02及びBEPINOT01 cDNAライブラリーの作製のため、冷凍組織を、B
rinkmann Homogenizer Polytron PT-3000(Brinkmann Instruments, Westbury,
NY)を用いてホモジナイズし溶解した。溶解物を、塩化セシウムのクッション上
で遠心分離してRNAを単離した。RNAをフェノールで抽出し、酢酸ナトリウ
ム及びエタノールを用いて沈殿させた。DRGLNOT01 cDNAライブラリーについ
ては、冷凍組織を、TRIzol試薬(1gの組織/10mlのTRIzol;Life Technologies)
、即ち単一組成細胞の(monoplastic)フェノール及びグアニジンイソチオシア
ネートの溶液においてホモジナイズし溶解した。氷冷しながら短時間インキュベ
ートした後、クロロホルムを加え(1:5 v/v)、混合物を遠心分離して、相を分
離した。上側の液層を取り除いて新しい試験管に移し、イソプロパノールでRN
Aを沈殿させた。全てのRNA沈殿物をRNアーゼの無い水に再懸濁し、DNア
ーゼ処理して酸性フェノールで再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで再度
沈殿させた。
【0179】 各RNA調製物について、Qiagen OLIGOTEX kit(QIAGEN, Inc., Chatsworth,
CA)を用いてポリ(+A)RNAを単離した。このポリ(+A)RNAを、SUP
ERSCRIPT Plasmid System(Life Technologies)の推奨プロトコルに従ってcD
NAの合成及び各cDNAライブラリーの作製のために用いた。cDNAを、SE
PHAROSE CL4Bカラム(Amersham Pharmacia Biotech)上で分画化し、400bp
を越える大きさのcDNAを、pINCY 1プラスミド(Incyte Pharmaceuticals, I
nc., Palo Alto, CA)(COLNFET02及びDRGLNOT01の場合)またはpSPORT1プラス
ミド(Life Technologies)(BEPINOT01の場合)に連結した。次に組換えたプラ
スミドを、DH5aTMコンピテント細胞(Life Technologies)に形質転換した。
【0180】 2 cDNAクローンの単離 プラスミドDNAはその細胞から放出され、これをREAL Prep 96 Plasmid Kit
(QIAGEN, Inc.)を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変
更した。(1)25mg/lのカルベニシリン及び0.4%のグリセロールを含む1mlの滅
菌Terrific Broth (Life Technologies)において細菌を培養した。(2)培溶
液を19時間インキュベートした後、この細胞を0.3mlの溶解バッファーに溶解
した。(3)イソプロパノール沈殿を行った後、プラスミドDNAのペレットを
0.1mlの蒸留水に再懸濁した。このプラスミドDNAサンプルは4℃で保管した
【0181】 3 配列決定及び解析 そのcDNAを、Peltier PTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Watert
own, MA)と組み合わせたMICROLAB(登録商標) 2200 (Hamilton, Reno, NV)又
はABI CATALYSTTM 800(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)
の何れかを用いて配列決定するために調製した。cDNAの配列決定は、ABI PR
ISMTM 373又は377シークエンシングシステム及びABIプロトコル、base calling
ソフトウェア、及びキット(Perkin-Elmer Applied Biosystems)を用いて行っ
た。或いは、Amersham Phamacia Biotech, Ltd.製の溶液及び色素を用いた。標
準的な方法を用いてリーディングフレームを決定した(Ausubel, 前出)。cD
NA配列のうち、幾つかを実施例5に開示した技術を用いて延長するために選択
した。
【0182】 cDNAに由来するポリヌクレオチド配列、延長、及びショットガン配列決定
の結果を、当業者によく知られたアルゴリズムを用いるソフトウェアプログラム
の組み合わせを用いて組み立て、解析した。表1には、そのソフトウェアプログ
ラム、参考文献、及び適用可能な場合の閾値パラメータが要約されている。表1
の第3列に示した引用文献は、この引用により本明細書の一部とする。MACDNASI
S PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering CO., Ltd. San Bruno, CA
)及びLASERGENEソフトウェア(DNASTAR Inc.)を用いた配列の解析も行った。
【0183】 そのポリヌクレオチド配列は、BLAST、動的プログラミング、及びジヌクレオ
チド隣接部解析(dinucleotide nearest neighbor analysis)を用いて、ベクタ
ー、リンカー、及びポリAテール配列を取り除き、あいまいな塩基をマスクする
ことによって確認した。次にその配列を、BLAST、FASTA、及びBLIMPSに基づくプ
ログラムを用いて、例えばGenBankの霊長類(primate)、げっ歯類(rodent)、
哺乳動物(mammalian)、脊椎動物(vertebrate)、及び真核生物データベース
のような公的データベースのなかなら選択したものに照会したり、BLOCKSに照会
して注釈付けを行った。その配列は、Phred、Phrap、及びClonsedを用いて組み
立て、GeneMark、BLAST、及びFASTAに基づくプログラムを用いてリーディングフ
レームを解析した。次に、完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳して、対応する完
全長アミノ酸配列を導き出した。次いでこれらの完全長ポリヌクレオチド及びア
ミノ酸配列を、上述のようなGenBankデータベース及びSwissProt、BLOCKS、PRIN
TS、PFAM、及びPrositeのようなデータベースに照会することによって解析した
【0184】 4 ノーザン法による解析 ノーザン法解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、標識されたヌクレオチド配列と、特定の細胞タイプまたは組織のRN
Aが結合しているメンブランとのハイブリダイゼーションを行う(例えば、Samb
rook, 前出, ch. 7; 及びAusubel, F.M.ら 前出, ch. 4及び16参照)。
【0185】 類似のコンピュータ技術を用いて電子的なノーザン解析の結果を生成した。こ
れらの技術をBLASTに適用して、GenBank又はLIFESEQTMデータベース(インサイ
ト社)のようなヌクレオチドデータベースにおいて同一の又は近縁な分子を検索
する。またコンピュータ検索の感度を変えて、一致の特定性を決定した。検索の
基準値は、積スコア(product score)であり、これは以下の式で定義されるも
のである。 (配列の一致(%)×最大BLASTスコア(%))/100 この積スコアでは、2つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
が考慮される。例えば、積スコアが40の場合は、一致は誤差が1〜2%の範囲
で正確であり、スコアが70の場合は正確に一致している。類似な分子は、通常
積スコアとして15〜40を示すものを選択することにより同定されるが、これ
よりスコアの低いものは近縁な分子として同定される。
【0186】 電子的ノーザン法解析では、更に器官/組織及び疾病によってcDNAライブ
ラリーを分類する。器官/組織の分類としては、心血管、外皮、発達、内分泌、
胃腸、造血/免疫、筋骨格、神経、生殖、及び泌尿器等があった。疾病の分類と
しては、癌、炎症/外傷、胎児、神経、及びプール(pooled)等があった。各分
類について、目的の配列を発現するライブラリーの数を、全分類にわたるライブ
ラリーの総数で除した。前記結果がパーセンテージ分布として報告された。
【0187】 5 MAPOPをコードする配列の延長 本明細書に開示した構成要素断片の延長によって、完全長核酸配列を生成した
。構成要素断片の少なくとも1つから設計したオリゴヌクレオチドプライマーの
対を用いて、センス及びアンチセンスのポリヌクレオチド鎖を延長を開始させた
。プライマーを用いて、既知の配列を「外側に」延長させ、目的の領域の新しい
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初めのプライマーは、
OLIGOTM 4.06(National Biosciences, Plymouth, MN)、或いは他の適切なプロ
グラムを用いて設計したもので、約22個から約30個のヌクレオチドからなる
長さで、50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜約72℃の温度で標的配列
にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量
体化を生じるようなあらゆるヌクレオチドのストレッチは除いた。
【0188】 選択されたヒトcDNAライブラリー(Life Technologies)を用いて、この
配列を延長した。2段階以上の延長が必要または望ましい場合は、既知領域をさ
らに延長するための追加のプライマーの組を設計する。
【0189】 XL-PCRTMキット(Perkin Elmer)の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物
とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。40pmol
の各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始
する場合、Peltier Thermal Cycler(PTC200;M.J. Reserch, Watertown MA)を
用いて、以下のパラメータ、即ち ステップ1 94℃で1分間(初期変性) ステップ2 65℃で1分間 ステップ3 68℃で6分間 ステップ4 94℃で15秒間 ステップ5 65℃で1分間 ステップ6 68℃で7分間 ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル反復 ステップ8 94℃で15秒間 ステップ9 65℃で1分間 ステップ10 68℃で7分15秒間 ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル反復 ステップ12 72℃で8分間 ステップ13 4℃(その温度を保持) でPCRを行った。
【0190】 反応混合物の5〜10μlのアリコットを、低濃度(約0.6〜0.8%)ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、配列を延長する反応が成功したか
否かを決定した。最も大きな生成物即ちバンドを選択して、ゲルから切り出し、
QIAQuickTM(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA)を用いて精製し、Klenow酵素を用
いて一本鎖ヌクレオチドの延び出し(overhang)を切り取って、再結合及びクロ
ーニングを容易にする平滑末端を作った。
【0191】 エタノール沈殿の後、生成物を13μlの連結バッファーに再溶解し、1μl
のT4−DNAリガーゼ(15単位)及び1μlのT4ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で2〜3時間、或いは16℃で終夜インキュベー
トした。コンピテントな大腸菌細胞(40μlの適切な培養液内にある)を、3
μlのライゲーション混合物を用いて形質転換し、80μlのSOC培地で培養
した(例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 1)。37℃で1時間のイン
キュベーションの後、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani(L
B)寒天(例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 2)上にのせた。後日、
いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の96
穴マイクロタイタープレートの各のウェル内に入れられた150μlの液状LB/2
xCarb培地で培養した。さらに後日、各5μlの終夜の培養物を非滅菌96穴プ
レート内に移し、水で1:10に希釈した後、それぞれ5μlのサンプルをPC
Rアレイに移した。
【0192】 PCR増幅のため、4単位のrTth DNAポリメラーゼを含む18μlの濃縮
PCR反応混合物(3.3x)、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いら
れる遺伝子に特異的なプライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は
、以下の条件、即ち ステップ1 94℃で60秒間 ステップ2 94℃で20秒間 ステップ3 55℃で30秒間 ステップ4 72℃で90秒間 ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル反復 ステップ6 72℃で180秒間 ステップ7 4℃(そのまま保持) で行った。
【0193】 PCR反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上を走ら
せた。PCR生成物のサイズを元の部分的cDNAと比較して、適切なクローン
を選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。
【0194】 同様に、配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6のヌクレオチド配列
を用いて、上述の手順を用いて5′調節配列を得ること、5′方向の延長のため
に設計されたオリゴヌクレオチドを得ること、及び適切なゲノムライブラリーを
得ることが可能である。
【0195】 6 ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号:4、配列番号:5、及び配列番号:6の配列から作られたハイブリ
ダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA並びにゲノムDNAをス
クリーニングする。約20の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について
特に記すが、より大きなcDNAフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる
。OLIGOTM 4.06(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用い
てオリゴヌクレオチドを設計し、それぞれ50pmolのオリゴマーと、250
μCiの[γ‐32P]アデノシン三リン酸(Amersham, Chicago, IL)及びT4
ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston, MA)とを結合することによっ
て標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超微粒子樹脂カ
ラム(Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI)を用いて精製する。毎分107カウ
ントの標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼAseI,Bgl
II,EcoRI,Pst I,Xba1或いはPvuII(DuPont NEN, Boston, MA)の1つを用い
て消化したヒトゲノムDNAの、一般的な膜を用いるハイブリダイゼーション解
析において用いる。
【0196】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)にトランスファーする。
ハイブリダイゼーションは40℃で16時間かけて行う。非特異的シグナルを取
り除くため、ブロットを、0.1xクエン酸ナトリウム水及び0.5%ドデシル
硫酸ナトリウムまでの、段階的にストリンジェンシーが増す条件下で室温にて順
次洗浄する。XOMAT ARTMフィルム(Kodak, Rochester, NY)をブロットに数時間
露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【0197】 7 マイクロアレイ 化学的結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でオリゴマー
を合成する(例えば、Baldeschweilerら, 前出, 参照)。更に別の方法では、ド
ットブロット法(スロットブロット法)で用いるものに類似したアレイを用いて
、真空システム、熱、UV、機械的又は化学的結合プロシージャを用いて、cD
NA断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に配置し結合させる。一般的なア
レイは、手作業により、又は市販の材料及び機械を用いることによって製作する
ことができ、適切な数のエレメントを有し得る。ハイブリダイゼーションの後、
マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキ
ャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた画像を解析
して、マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする核プローブの相補性
の程度及び相対的な存在量を評価することができる。
【0198】 完全長cDNAまたはESTが、マイクロアレイのエレメントを含み得る。ハ
イブリダイゼーションに適した断片は、例えばLASERGENETMのような周知のソフ
トウェアを用いて選択することができる。本発明のヌクレオチド配列の1つに対
応する、又は本発明に関連するcDNAライブラリーから無作為に選択された完
全長cDNA又はESTsを、適切な基板、例えばスライドガラス上に配置する
。そのcDNAは、例えば、UV架橋処理の後に熱及び化学薬品による処理を行
って乾燥することによってスライドガラス上に固定する(例えば、Schena. Mら
(1995) Science 270:467-470; 及びShalon, D.ら (1996) Genome Res. 6:639-64
5)。基板上のエレメントへのハイブリダイゼーションのために蛍光プローブを
作製して使用する。この基板を、上述の手順によって解析する。
【0199】 8 相補的ポリヌクレオチド MAPOPをコードする配列或いはその任意の一部分に相補的な配列は、自然
発生のMAPOPの発現を低下、即ち阻害するために用られる。約15〜約30
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より小さな或い
はより大きな配列フラグメントの場合でも基本的に同じ方法を用いることができ
る。OLIGOTM4.06ソフトウェア及びMAPOPのコーディング配列を用いて、適
切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが結
合しないようにする。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを
設計して、リボソームがMAPOPをコードする転写物に結合しないようにする
【0200】 9 MAPOPの発現 MAPOPの発現及び精製は、細菌又はウイルスをベースにした発現系を用い
て達成される。細菌におけるMAPOPの発現のためには、cDNAを、高いレ
ベルのcDNAの転写を誘導する誘導性プロモーターや構成物質耐性遺伝子を含
む適切な発現ベクター内にサブクローニングする。そのようなプロモーターの例
としては、以下に限定するものではないが、trp-lac(tac)ハイブリッドプロモ
ーター及びT5又はT7バクテリオファージプロモーターや、lacオペレーター制御
配列等が挙げられる。組換えベクターを、例えばBL21(DE3)のような適切な細
菌のホストに形質転換する。イソプロピル-1-チオ‐β-D-ガラクトシド(IPT
G)で誘導すると、構成物質耐性の細菌がMAPOPを発現する。真核細胞にお
けるMAPOPの発現は、バキュロウイルスとしてよく知られている、組換えAu
tographica californica多核体病ウイルス(AcMNPV)を、昆虫または哺乳動物の
細胞系に感染させることによって達成される。バキュロウイルスの非必須のポリ
へドリン遺伝子を、相同的組換えか、転移プラスミドによる媒介を用いる細菌媒
介遺伝子転移の何れかによってMAPOPをコードするcDNAで置換する。ウ
イルスの感染力は維持され、かつ強力なポリヘドリンプロモーターが、高レベル
のcDNAの転写を誘導する。組換えバキュロウイルスを用いて、大抵の場合は Spondoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に、場合によってはヒト肝細胞に感染
させる。後者の場合には、バキュロウイルスに追加の遺伝子の修飾を加えること
が必要である(Engelhard, E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3
224-3227; Sandig, V.ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945参照)。
【0201】 大部分の発現系においては、例えば、粗製の細胞溶解物からの速やかな1ステ
ップでの組換え融合タンパク質のアフィニティ精製を可能にする、FLAG又は6-Hi
sのようなペプチドエピトープタグまたはグルタチオンSトランスフェラーゼ(
GST)を用いて、MAPOPが融合タンパク質として合成される。日本住血吸
虫(Schistosoma japonicum)に由来する26キロダルトンの酵素であるGST
によって、タンパク質の活性及び抗原性を維持する条件の下で固定化グルタチオ
ン(Pharmacia, Piscataway, NJ)上での融合タンパク質の精製が可能となる。
精製の後、GST分子を、特異的に組換えられた部位において、タンパク分解に
よりMAPOPから切り離すことができる。8個のアミノ酸からなるペプチドで
あるFLAGによって、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗
体(Eastman Kodak, Rochester, NY)を用いるイムノアフィニティ精製が可能と
なる。6個の連続したヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金属
キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatworth, CA)上での精製が可能となる。タンパ
ク質の発現及び精製のための方法は、Ausubel. F. M.ら(1995及び定期的な補遺)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY
, ch 10, 16に記載されている。これらの方法によって得られた精製MAPOP
を、以下の活性のアッセイにおいて直接用いることができる。
【0202】 10 MAPOPの活性の立証 MAPOPの活性のアッセイでは、哺乳動物細胞培養系において、MAPOP
が生理学的に高いレベルで発現されたときのアポトーシスの誘導を測定する。c
DNAを、それを高レベルで発現させる強力なプロモーターを有する哺乳動物の
発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、pCMV SPO
RTTM(Life Technologies)及びpCRTM 3. 1(Invitrogen, Carlsbad, CA)等が
あり、両ベクターは共にサイトメガロウイルスのプロモーターを有している。5
〜10μgの組換えベクターをリポソーム製剤又はエレクトロポレーションの何れ
かを利用してヒトの細胞系、好ましくは内皮細胞又は造血細胞を起源とする細胞
系に一時的にトランスフェクトする。またマーカータンパク質をコードする配列
を有する別のプラスミドを1〜2μg同時感染させる。マーカータンパク質の発現
は、トランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から区別するための手段と
なり、組換えベクターからのcDNAの発現の信頼できる予測が可能となる。選
択できるマーカータンパク質としては、例えばGreen Fluorescent Protein(GFP
)(Clontech, Palo Alto, CA)、CD64又はCD64-GFP融合タンパク質等が挙げら
れる。GFP又はCD64−GFPを発現するトランスフェクト細胞を特定し、その特性、
例えばそのアポトーシス状態を評価するために、自動式のレーザー光を用いる技
術であるフローサイトメトリー(流動細胞計測法)(FCM)を用いる。FCM
によって蛍光分子の取込みを検出し、定量細胞死の前又は細胞死と同時におこる
事象を診断する。このような事象としては、ヨウ化プロピジウムでDNAを染色
することによって測定される核のDNA含量の変化、散乱光及び90度横向きの
散乱光を当てることによって測定される細胞のサイズ及び粒状度の変化、ブロモ
デオキシウリジンの取込みの低下によって測定されるDNA合成のダウンレギュ
レーション、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞内のタ
ンパク質の発現の変化、及びフルオレセイン結合アネキシンVタンパク質と細胞
表面との結合によって測定される原形質膜の組成の変化等がある。フローサイト
メトリーの方法は、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York
, NYに記載されている。
【0203】 11 MAPOPに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)(例えば、Harrington, M.G.
(1990) Methods Enzymol. 182:488-495参照)、又は他の精製技術を用いて実質
的に精製したMAPOPを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化
し、抗体を作り出す。
【0204】 或いは、MAPOPのアミノ酸配列をLASERGENETMソフトウエア(DNASTAR Inc
.)を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを
合成し、当業者に周知の方法でこれを用いて抗体を産生させる。適切なペプチド
配列の選択及び抗体の産生の技術は当業者に周知である。C末端付近のエピトー
プ或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択については
、文献に記載されている(例えば、Ausubelら, 前出, ch. 11参照)。
【0205】 一般的に、15残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsの
ペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてfmoc法のケミストリにより合成し
、M−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS
)を用いる反応によってキーホールリンペットヘモシニアン(KLH、Sigma, S
t. Louis, MO)に結合する(例えば、Ausubel他 (前出)参照)。フロイントの完
全アジュバント中のオリゴペプチド−KLH複合体を用いてウサギを免疫化する
。得られた抗血清の抗ペプチド活性を試験するには、例えばペプチドをプラスチ
ックに結合し、1%BSAでブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さ
らに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【0206】 12 特異的抗体を用いる自然発生MAPOPの精製 自然発生のMAPOP或いは組換えMAPOPを、MAPOPに特異的な抗体
を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イム
ノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化 SEPHAROSE(Amersham Pharmacia Biot
ech)のような活性化クロマトグラフィーレジンとMAPOP抗体とを共有結合
で結合させることにより構築する。結合の後、そのレジンを使用説明書の指示に
従って、ブロックし洗浄する。
【0207】 MAPOPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを
MAPOPを優先的に吸着できる条件下で(例えば界面活性剤の存在下において
高イオン強度バッファーで)洗浄する。このカラムを、抗体とMAPOPとの結
合を切るような条件下(例えばpH2〜3のバッファー、或いは高濃度の尿素ま
たはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン)で溶出させ、MAP
OPを回収する。
【0208】 13 MAPOPと相互作用する分子の同定 MAPOP又は生物学的に活性なその断片を、125Iボルトンハンター試薬(
例えば、Bolton 他 (1973) Biochem. J. 133:529参照)で標識する。マルチウェ
ルプレートのウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したMAPOPと
ともにインキュベートし、洗浄して、標識MAPOP複合体を有するウェルをア
ッセイする。異なる濃度のMAPOPを用いて得られたデータを用いて、候補の
分子とMAPOPの会合、親和性、数の数値を計算する。
【0209】 本発明の範囲及び精神から逸脱しない本明細書に記載した本発明の方法及びシ
ステムの様々な改変は、当業者には明らかであろう。本発明は、特に好適な実施
例に関連して説明されているが、本発明の真の範囲は、そのような特定の実施例
に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或い
は関連分野の専門家には明らかな本発明の実施形態の様々な改変は、請求の範囲
内に含まれるものである。
【0210】 (表の簡単な説明) 以下の表1(表1−1及び表1−2)は、MAPOPの特定し、特性化するた
めに(適切な場合に)用いられたプログラム、それらの説明、参考文献、及び閾
値パラメータを示す。
【表1】
【表2】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1A】 MAPOP−1(1456746;配列番号:1)、MAPOP−2(2057608;配列
番号:2)、及びヒトhRVP1(GI 2570129;配列番号:29)の間のアミノ
酸配列アライメントを示す図。配列のアライメントは、LASERGENETMソフトウェ
アのマルチシーケンスアライメントプログラム(DNASTAR Inc, Madison WI)を
用いて作成した。
【図1B】 MAPOP−1(1456746;配列番号:1)、MAPOP−2(2057608;配列
番号:2)、及びヒトhRVP1(GI 2570129;配列番号:29)の間のアミノ
酸配列アライメントを示す図。配列のアライメントは、LASERGENETMソフトウェ
アのマルチシーケンスアライメントプログラム(DNASTAR Inc, Madison WI)を
用いて作成した。
【図2】 MAPOP−3(2840978)と、マウスTDAG51(GI 1469400)との間の
アミノ酸配列アライメントを示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 43/00 111 C07K 14/705 4H045 C07K 14/47 16/18 14/705 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/68 A 5/10 C12N 15/00 ZNAA C12P 21/02 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB ,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE,G H,GM,HR,HU,ID,IL,IS,JP,KE ,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS, LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE ,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT, UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・#30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・レランドアベニュー 2189 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 CA01 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA08 BA20 BA21 MA01 NA14 ZA022 ZA452 ZA552 ZA592 ZA662 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZA962 ZA972 ZB052 ZB072 ZB132 ZB152 ZB212 ZB332 ZB352 ZB372 ZC062 ZC212 ZC352 ZC552 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA01 EA28 EA50 FA74

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 配列番号(SEQ ID NO):1、配列番号:2、配列番号:
    3、配列番号:1の断片、配列番号:2の断片、及び配列番号:3の断片からな
    る群から選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
  2. 【請求項2】 請求項1の配列との少なくとも90%のアミノ酸配列同一
    性を有する、実質的に精製された変異体。
  3. 【請求項3】 請求項1のポリペプチドをコードする、単離され精製され
    たポリヌクレオチド。
  4. 【請求項4】 請求項3のポリヌクレオチドとの少なくとも70%のポリ
    ヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体
  5. 【請求項5】 請求項3のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の
    下でハイブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチド。
  6. 【請求項6】 請求項3のポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製さ
    れたポリヌクレオチド。
  7. 【請求項7】 配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:
    4の断片、配列番号:5の断片、及び配列番号:6の断片からなる群から選択さ
    れたポリヌクレオチド配列を含む、単離され精製されたポリヌクレオチド。
  8. 【請求項8】 請求項7のポリヌクレオチドとの少なくとも70%のポリ
    ヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体
  9. 【請求項9】 請求項7のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する、単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
  10. 【請求項10】 請求項3のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
  11. 【請求項11】 請求項10の発現ベクターを含む宿主細胞。
  12. 【請求項12】 ポリペプチドの製造方法であって、 (a)前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項11の宿主細胞を
    培養する過程と、 (b)前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含む、ポ
    リペプチドの製造方法。
  13. 【請求項13】 請求項1のポリペプチドを適切な医薬用担体と共に含む
    医薬品組成物。
  14. 【請求項14】 請求項1のポリペプチドに特異的に結合する、精製され
    た抗体。
  15. 【請求項15】 請求項1のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
  16. 【請求項16】 請求項1のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
  17. 【請求項17】 細胞増殖の異常の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項13の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む、細胞増殖の異常の処置又は予防方法。
  18. 【請求項18】 自己免疫異常の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項16のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含む、自己免疫異常の処置又は予防方法。
  19. 【請求項19】 核酸を含む生物学的サンプルにおいて、ポリヌクレオチ
    ドを検出する方法であって、 (a)請求項6のポリヌクレオチドと、前記生物学的サンプルの核酸材料の少
    なくとも1つとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成す
    る過程と、 (b)前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおける前記ポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相互関係を有する、該過程とを含
    む、核酸を含む生物学的サンプルにおいてポリヌクレオチドを検出する方法。
  20. 【請求項20】 前記ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生
    物学的サンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅することを特徴とす
    る請求項19に記載の方法。
JP2000557362A 1998-06-29 1999-06-23 アポトーシス関連分子 Pending JP2002519029A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10692098A 1998-06-29 1998-06-29
US09/106,920 1998-06-29
PCT/US1999/014188 WO2000000609A2 (en) 1998-06-29 1999-06-23 Molecules associated with apoptosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002519029A true JP2002519029A (ja) 2002-07-02

Family

ID=22313973

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000557362A Pending JP2002519029A (ja) 1998-06-29 1999-06-23 アポトーシス関連分子

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6590089B1 (ja)
EP (1) EP1092023A2 (ja)
JP (1) JP2002519029A (ja)
AU (1) AU4709899A (ja)
CA (1) CA2332379A1 (ja)
WO (1) WO2000000609A2 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999007893A1 (en) * 1997-08-08 1999-02-18 University Of Washington ISOLATION OF A NOVEL SENESCENCE-FACTOR GENE, p23
AU750296B2 (en) * 2000-06-23 2002-07-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against SEMP1, methods for their production and uses thereof
EP1325020A4 (en) * 2000-09-20 2004-12-15 Human Genome Sciences Inc 21 HUMANE SECONDED PROTEINS
US20060130157A1 (en) 2004-10-22 2006-06-15 Kevin Wells Ungulates with genetically modified immune systems
ES2548377T3 (es) 2008-10-27 2015-10-16 Revivicor, Inc. Ungulados inmunodeprimidos

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5672686A (en) * 1994-08-09 1997-09-30 Immunogen, Inc. Bcl-Y - specific antibodies
US5763220A (en) * 1996-12-12 1998-06-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human apoptosis-related calcium-binding protein
ES2330903T3 (es) * 1997-12-17 2009-12-16 Serono Genetics Institute S.A. Adncs extendidos para proteinas secretadas.

Also Published As

Publication number Publication date
AU4709899A (en) 2000-01-17
WO2000000609A3 (en) 2000-03-30
US6590089B1 (en) 2003-07-08
EP1092023A2 (en) 2001-04-18
CA2332379A1 (en) 2000-01-06
WO2000000609A2 (en) 2000-01-06
US6500642B1 (en) 2002-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002522075A (ja) 細胞外接着性タンパク質、exadh1及びexadh2
US6590077B1 (en) Human ankyrin family protein
US20080182977A1 (en) Molecules associated with cell proliferation
JP2002510478A (ja) ヒト・ガラクトシルトランスフェラーゼ
JP2002514430A (ja) ヒト・アポトーシス関連タンパク質
JP2002513553A (ja) 成長関連プロテアーゼインヒビタ重鎖前駆体
JP2002507420A (ja) ヒトカルシウム結合タンパク質
US6391580B1 (en) Ras proteins
US6348576B1 (en) Human cornichon molecule
WO2000015794A1 (en) Human cell junction pdz protein
WO1999061614A2 (en) Human socs proteins
US20050042653A1 (en) Human transport protein homologs
US6077693A (en) Polynucleotide encoding a promonocyte associated protein
JP2002519029A (ja) アポトーシス関連分子
EP1097203A1 (en) Human presenilin-associated protein
JP2002518046A (ja) ヒトarf関連タンパク質
JP2002516099A (ja) 腫瘍サプレッサー
US20030113844A1 (en) Delayed rectifier potassium channel subunit
JP2002517190A (ja) カルバモイルリン酸シンターゼホモログ
JP2002516097A (ja) ヒト・カルモジュリン関連タンパク質
JP2002519028A (ja) 免疫系分子
US20020110858A1 (en) Lymphocytic membrane proteins
WO2000018924A1 (en) Human small proline-rich molecule
JP2005502301A (ja) ヒトisre結合タンパク質
US20030148934A1 (en) Growth factor modulators