JP2002516099A - 腫瘍サプレッサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト腫瘍サプレッサー（ＴＵＳＵＰ）及びＴＵＳＵＰを特定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＴＵＳＵＰの発現に関連する疾患の診断、処置、又は予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒト・腫瘍サプレッサーの核酸及びアミノ酸配列、及び癌の診断、
処置、及び予防におけるこれらの配列の使用法に関するものである。

【０００２】 （発明の背景） 癌抑制遺伝子は、それが失われたり不活性になることが細胞増殖の調節解除や
癌の病因及び進行の原因となる遺伝子エレメントとして一般的に定義される。癌
抑制遺伝子は、通常、ストレスに応答して細胞増殖を調節又は阻害し、細胞の増
殖期の寿命を制限するように機能する。網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質、ｐ５
３、及び乳癌１及び２タンパク質（ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２）をコードする遺
伝子等の、幾つかの癌抑制遺伝子が同定されてきた。これらの遺伝子における変
異は、ある種の癌の発生に対する後天的及び先天的な遺伝的素因と関連を有する
。

【０００３】 癌の病因におけるｐ５３の役割は、広く研究されてきた（Aggarwal, M. L.ら
(1998) J. Biol. Chem. 273:1-4; levine, A. (1997) Cell 88:323-331）。全て
のヒトの癌の約５０％は、ｐ５３遺伝子を含む。これらの変異によって、ｐ５３
の機能の消失、或いは、より一般的に過剰発現される不完全な形態のｐ５３の何
れかが生ずる。ｐ５３は、ＤＮＡの結合に必要な中心コアドメインを有する転写
制御因子である。ｐ５３における癌関連変異の大部分は、このドメインに局在し
ている。通常の増殖期の細胞では、ｐ５３は低いレベルで発現され、かつ速やか
に分解される。ｐ５３の発現及び活性は、ＤＮＡの損傷、頓挫性有糸分裂、及び
他のストレスとなる刺激に応答して誘導される。これらの例では、ｐ５３は、ア
ポトーシスを誘導するか、そのストレスが無くなるまで細胞増殖を停止させる。
ｐ５３の下流のエフェクターとしては、Ｒｂ，発癌遺伝子の産物、サイクリン、
及び細胞周期依存性キナーゼ等の細胞周期調節タンパク質及びアポトーシス特異
的タンパク質が挙げられる。

【０００４】 腫瘍サプレッサータンパク質である可能性のあるタンパク質をコードする新規
な遺伝子のＩＮＧ１がクローン化された（Garkavtsev, I.ら (1996) Nat. Genet
. 14:415-420）。正常な形質転換細胞系におけるＩＮＧ１の過剰発現は、in vit
roでそれらの増殖を阻害する。更に、アンチセンスＩＮＧ１の発現は、軟寒天に
おいて増殖し、免疫不全マウスに注射すると腫瘍発生を誘導するその能力によっ
て証明されるように、培養細胞の腫瘍性トランスフォーメーションを促進する。
ＩＮＧ１によってコードされるタンパク質であるｐ３３は核に局在し、網膜芽細
胞腫結合タンパク質２（ＲｂＢＰ２）及び亜鉛フィンガーモチーフに対して類似
性を有する。幾つかの乳癌細胞系においてｐ３３の発現の低下が観察され、また
神経芽細胞腫細胞系においてｐ３３の切断型が高いレベルで発現される。切断型
ｐ３３は、の遺伝子座におけるゲノムの転移によって生ずる。更に、ＲＮＡ及び
タンパク質のレベルは、老化した非増殖期の老化細胞においては、若い増殖期の
細胞における発現のレベルと比較して、約１０倍に増加する（Garkavtsev, I.及
びRiabowol, K. (1997) Mol. Cell Biol. 17:2014-2019）。これらの観察結果は
、ｐ３３が通常は、細胞増殖を阻害し、細胞の寿命を制限するように機能してい
ることを示している。

【０００５】 最近の研究から、ｐ３３が、細胞増殖の負の調節においてｐ５３と協働してい
ることが分かった（Garkavtsev, I.ら (1998) Nature 391:295-298）。ｐ５３と
ｐ３３の機能は独立しており、かつｐ３３は、ｐ５３依存性転写活性を直接変調
する。ｐ３３とｐ５３との直接の物理的な関連性は、ｐ３３が細胞周期の調節、
老化、及びアポトーシスにおいてｐ５３の活性に影響を与え得ること示す同時免
疫沈降によって証明された。

【０００６】 新規な腫瘍サプレッサー及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、癌
の診断、処置、及び予防において役立つ新規な組成物を提供することにより、当
分野における必要性を満たすものである。

【０００７】 （発明の概要） 本発明は、新規なヒト腫瘍サプレッサー（ＴＵＳＵＰ）、ＴＵＳＵＰをコード
するポリヌクレオチド、及び癌の診断、処置、又は予防のためのこれらの組成物
の使用法の発見に基づくものである。

【０００８】 本発明は、配列番号（SEQ ID NO）：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配
列を含む、実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【０００９】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列との少な
くとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実質的に精製された変異体を提供
する。また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリペ
プチドをコードする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本
発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドとの少なくとも９０％のポリヌクレオチド配列
同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体を包含する。

【００１０】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイ
ブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供すると共に、配列
番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供す
る。

【００１１】 また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片のポリヌクレオチド配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチド、及び配列番号：２又は配列番号：
２の断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの少なくとも９０％
のポリヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド
を提供する。また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片のポリヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有する、単離され精製され
たポリヌクレオチドを提供する。

【００１２】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを提供す
る。別の実施態様では、前記発現ベクターが宿主細胞内に含められる。

【００１３】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の
下で配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細
胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収す
る過程とを含む、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドの製造方法を提供する。

【００１４】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有する実質的に
精製されたポリペプチドを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物を提供す
る。

【００１５】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリペプチ
ドに結合する精製された抗体を包含すると共に、前記ポリペプチドの精製された
アゴニスト及び精製されたアンタゴニストを包含する。

【００１６】 本発明は、癌の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要な患者に、
配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する、実質的に精製さ
れたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含む、癌の処置
又は予防方法を提供する。

【００１７】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおける配列番号：１又は配列番
号：１の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の検出方法であって、（ａ）配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配
列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な分子と、前記生
物学的サンプルの核酸の少なくとも１つとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイ
ゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体
を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記生
物学的サンプルにおける配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相互関係を有する、該
過程とを含む、ポリヌクレオチドの検出方法を提供する。或る実施態様では、前
記ハイブリダイゼーションを行う過程の前に前記生物学的サンプルの核酸をポリ
メラーゼ連鎖反応法により増幅する。

【００１８】 （発明の実施の形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、及び方法について説明する前に、本
発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試
薬に限定されず、それらは様々に変更可能であることを理解されたい。また、本
明細書において用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いら
れたものであり、請求項の記載のみによって限定される本発明の範囲を限定する
ことを意図したものではないということも理解されたい。

【００１９】 本明細書の発明の詳細な説明又は図面及び特許請求の範囲において、単数を表
す「或る」及び「その（この）」と形容されたものは、前後関係でそうでないこ
とが明らかである場合以外は、複数の意味も含んでいることに注意しなければな
らない。従って、例えば「或る宿主細胞」なる表記が表すものには、複数のその
ような宿主細胞が含まれ、「或る抗体」なる表記は、１種または複数の種類の抗
体及び当業者に周知のその等価物等も表している。

【００２０】 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと
同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発
明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料を
本明細書において説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連
において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し
開示する目的で引用されたものであり、引用により本明細書の一部とする。また
本明細書のあらゆる開示内容を、本発明におけるそのような開示内容が従来技術
に先行しないということを認めるものと解釈してはならない。

【００２１】 （定義） 本明細書において、「ＴＵＳＵＰ」は、任意の種、具体的にはウシ、ヒツジ、
ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒト等のような哺乳動物に由来し、天然の
、合成の、半合成の、又は組換え体の何れかの起源から得られる実質的に精製さ
れたＴＵＳＵＰのアミノ酸配列である。

【００２２】 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＴＵＳＵＰに結合したときＴＵＳ
ＵＰの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニス
トには、ＴＵＳＵＰに結合し、その効果を変調するタンパク質、核酸、糖質や、
任意の他の分子が含まれ得る。

【００２３】 本明細書において「アレル変異体」とは、ＴＵＳＵＰをコードする遺伝子の対
立形である。アレル変異体は、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によって生じ
、変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、その変異したｍＲＮＡ或い
はポリペプチドの構造や機能が変わる場合もあれば変わらない場合もある。所定
の天然の遺伝子または組換え遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ存在
するもの、或いは多数存在するものがある。一般的にアレル変異体を生じる変異
はヌクレオチドの自然な欠失、付加並びに置換に因るものである。このタイプの
変異はそれぞれ単独で、或いは他の変異と同時に、所定の配列内で１回又は２回
以上生じ得る。

【００２４】 本明細書において、ＴＵＳＵＰをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ
クレオチド残基の置換、挿入や欠失を含み、結果的に同一のＴＵＳＵＰをコード
するポリヌクレオチド、又はＴＵＳＵＰの機能的な特徴を少なくとも１つ有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。この定義には、
ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド配列の通常の染色体上の遺伝子座以外
の座位を有する多型、アレル変異体との不適切な又は予期しないハイブリダイゼ
ーションによって起こる多型、及びＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドの
特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出が困
難な多型が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変異」したもので
あり得、サイレント変異を生じ、結果的に機能的に等価なＴＵＳＵＰとなるアミ
ノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含むものであり得る。意図的なアミノ酸の置
換は、ＴＵＳＵＰの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度
、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいて作り出すこと
ができる。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が
含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親水性
値を有する荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイ
シン、及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；セリ
ン及びスレオニン；及びフェニルアラニン及びチロシンが含まれる。

【００２５】 本明細書において「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペ
プチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、又はそれらの何れかの断片であ
り、自然発生の分子又は合成した分子である。この文脈で、「断片」、「免疫原
性断片」又は「抗原性断片」は、ＴＵＳＵＰの断片で、好ましくは約５個〜約１
５個のアミノ酸、最も好ましくは１４個のアミノ酸からなる長さを有し、かつＴ
ＵＳＵＰの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである。ここで、
「アミノ酸配列」が自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指している場合に
、「アミノ酸配列」や類似の用語は、そのアミノ酸配列を本明細書に記載のタン
パク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定する意味で用いられ
ているわけではない。

【００２６】 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なるコピーを生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて行われる
（例えばDieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp.1-5参照）。

【００２７】 本明細書において、用語「アンタゴニスト（拮抗物質）」は、ＴＵＳＵＰに結
合したとき、ＴＵＳＵＰの生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下させたり、
効果の継続時間を短縮させる分子である。アンタゴニストとしては、ＴＵＳＵＰ
の効果を低下させるタンパク質、核酸、糖質、抗体、または他の分子等が挙げら
れる。

【００２８】 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味するとともに、例
えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）₂、及びＦｖ断片のような抗原決定基と結合し得るその
断片を意味する。ＴＵＳＵＰポリペプチドに結合する抗体は、免疫化の抗原とし
て完全なポリペプチド又は目的の小ペプチドを含むその断片を用いることによっ
て作り出すことができる。動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫
化するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来する
もの、又は化学的に合成されたものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合
させることができる。ペプチドに化学的に結合する担体として通常用いられるも
のとしては、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及びキーホールリンペッ
トヘモシアニン（ＫＬＨ）等が挙げられる。この結合したペプチドを用いて動物
を免疫化する。

【００２９】 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と結びつく分子の断片
（即ちエピトープ）である。タンパク質又はその断片を用いてホストの動物を免
疫化すると、このタンパク質の様々な領域が、該タンパク質上の所定の領域また
は三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。このような領域また
は構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について元の抗原（
即ち免疫応答を誘導するに用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３０】 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「
センス」鎖に相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子としてはペ
プチド核酸があり、アンチセンス分子は合成や転写等の方法で作り出すことがで
きる。この相補的ヌクレオチドは、一旦細胞内に導入されると、細胞によって作
られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、これが更なる転写や翻訳を阻害す
る。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖の意味で用いられ、「プラス
（＋）」はセンス鎖の意味で用いられることがある。

【００３１】 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造上の機
能、調節の機能、又は生化学的な機能を有するタンパク質である。同様に「免疫
学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＴＵＳＵＰ、若しくはそのオ
リゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗
体に結合する能力である。

【００３２】 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩濃度及び
温度条件の下で、塩基対を形成してポリヌクレオチド同士が自然に結合すること
である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する
。２本の一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する「部分的」なも
のであるか、若しくは、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は「完全に
」相補的なものであり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブ
リダイゼーションの効率及び強さに有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同
士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及
び使用において特に重要である。

【００３３】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」又は「所定の
アミノ酸配列を含む組成物」とは、所定のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を
含むあらゆる物質をさす。この組成物は、粉末製剤、水溶液、又は滅菌組成物の
形態であり得る。ＴＵＳＵＰ又はＴＵＳＵＰの断片をコードするポリヌクレオチ
ド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用することが
できる。このプローブは凍結乾燥した状態で保存することができ、糖質のような
安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプ
ローブを、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（
例えばデンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させておく
ことができる。

【００３４】 本明細書において「コンセンサス配列」は、配列決定し直して不要な塩基を分
離し、XL-PCR^TM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５′方向及び／または
３′方向に延長した上で再度配列決定し直した核酸配列か、または断片を組み合
わせるためのコンピュータプログラム、例えばGELVIEW^TM Fragment Assembly sy
stem（GCG, Madison WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した
配列を組み合わせて導き出した核酸配列である。延長と組み合わせの両方によっ
てコンセンサス配列が作られることもある。

【００３５】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相互関係を有する」なる表現
は、ノーザン法による解析でＴＵＳＵＰをコードする核酸と同一又は近縁関係に
ある核酸の存在が検出されることが、サンプル内のＴＵＳＵＰをコードするｍＲ
ＮＡの存在を表し、従ってＴＵＳＵＰをコードする遺伝子からの転写物の発現と
相互関係を有している、ということを表している。

【００３６】 本明細書において「欠失」は、１個または２個以上のヌクレオチド若しくはア
ミノ酸残基が欠けるような、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
である。

【００３７】 本明細書において、用語「誘導体」は、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオ
チド配列又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を化学的に修飾したものであ
る。このようなポリヌクレオチド配列の化学的修飾としては、例えば、水素から
アルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。誘導体ポリヌクレオチド
は、元の分子の生物学的又は免疫学的機能の少なくとも１つを保持しているポリ
ペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポリペプチドの生物学的又
は免疫学的機能の少なくとも１種類を保持しており、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化（PEGylation）、又は他の何らかのプロセスで修飾されたもので
ある。

【００３８】 本明細書において、用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的
類似性か完全な類似性があり得る。用語「（配列）同一性」は、用語「類似性」
と置換えることができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少
なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列を、「実質的に類似」という。
完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ストリン
ジェンシー（厳密さ）を低くした条件の下で、ハイブリダイゼーションアッセイ
（サザンブロット法またはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等
）を用いて調べることができる。実質的に類似な配列またはハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、低いストリンジェンシー条件の下で、標的の配列と完全に類似
（同一）な配列またはプローブとの結合について競合し、それを阻害する。この
ことは、低いストリンジェンシー条件が、非特異的な結合を許容するものである
ことを意味するわけではない。低いストリンジェンシー条件では、２つの配列の
相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要だからである。非
特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の類
似性即ち同一性）も有していない第２の標的配列を用いることにより調べること
ができる。非特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列
とハイブリダイズしない。

【００３９】 「パーセント同一性」或いは「％同一性」という言葉は、２以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較した際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用いるこ
とによって電子的に求めることができる。このMegAlign^TMプログラムは、異なる
方法、例えばClustal 法（例えばHiggins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene 73
:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメントを作成することができる。
このClustalのアルゴリズムでは、配列群を、全ての配列の対について両配列間
の距離を調べることによってクラスタ（集団）にグループ分けする。このクラス
タ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグループにおいてアライメン
トをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列Ｂの間のパーセント類似性
は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基の数−配列Ｂにおけるギャッ
プ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基の一致の総数）×１００で計算す
る。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無いケースは、パーセント類
似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント同一性も、他の周知の方法
、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645
参照）によってカウント即ち計算することができる。配列間の同一性は、他の周
知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変えることによっても決定する
ことができる。

【００４０】 「ヒト人工染色体」（ＨＡＣｓ）は約６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列
を含んでいるものであり得、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての
要素を含む線状の小形染色体である（例えばHarrington, J.J.他 (1997) Nat Ge
net. 15:345-355参照）。

【００４１】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、その元の結合能をそのまま保持し
つつ、ヒトの抗体により近づくように非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した
抗体分子である。

【００４２】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は
、核酸の鎖が塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程である。

【００４３】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩
基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、
２つの核酸配列で形成された複合体である。ハイブリダイゼーション複合体は、
溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析の場合）、或いは核酸は溶液
中に存在する一方の核酸と、固体支持体（例えば細胞やその核酸が固定される紙
、メンブラン、フィルター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板
）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００４４】 本明細書において、用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較し
て、１個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような
、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００４５】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものであり得る。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する
様々な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産
生によって特性化され得る。

【００４６】 本明細書において、用語「マイクロアレイ」は、個々のポリヌクレオチドを基
板上に配列したものである。基板としては、例えば紙、ナイロン又は他の種類の
メンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体
等がある。

【００４７】 本明細書において、マイクロアレイに関連して用いられる用語「エレメント」
または「アレイエレメント」とは、基板の表面上に配列されたハイブリダイズ可
能なポリヌクレオチドである。

【００４８】 本明細書において、用語「変調」は、ＴＵＳＵＰの活性を変化させることであ
る。例えば、変調によって、タンパク質の活性の増加や減少、結合特性の変化、
又は他のＴＵＳＵＰの生物学的、機能的、免疫学的特性の変化がもたらされる。

【００４９】 本明細書において「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、又はその断片を指すか、一本鎖か二本鎖であり、ま
たセンス鎖又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源の若しくは合成したＤＮＡ又
はＲＮＡを指すか、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、ＤＮＡ様又はＲＮＡ様
物質である。この文脈において、「断片（フラグメント）」は、翻訳されたとき
に、完全長ポリペプチドのいくつかの機能的特徴、例えば抗原性を保持するポリ
ペプチド、又は構造的ドメインの特徴、例えばＡＴＰ結合部位を保持するポリペ
プチドを作り出す核酸配列を意味する。

【００５０】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結びついた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモーターは、そのプロモーターが、コ
ードされるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列に機能的に関連
又は機能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸
配列は近接し読み枠にあり得るが、ある種のゲノムの配列、例えばリプレッサー
遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそのポリペプ
チドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。

【００５１】 本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリ
ダイゼーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配
列であって、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適に
は１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを
指す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野において一般
に定義されているような用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー
」、及び「プローブ」と実質的に同義である。

【００５２】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、末端がリジンであるアミノ
酸残基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌ
クレオチドを含むアンチセンス分子即ち抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンが
この物質に溶解性を与えている。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優
先的に結合して転写物の伸長を止め、かつＰＮＡをポリエチレングリコール化す
ることにより、細胞でのその寿命を延ばすことができる（例えばNielsen, P.E.
他(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63参照）。

【００５３】 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている
。ＴＵＳＵＰをコードする核酸またはその断片またはＴＵＳＵＰ自体を含む疑い
のある生物学的サンプルには、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官
、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または固体支持体に結合し
た）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、組織や、組織プリント（tiss
ue print）その他が含まれる。

【００５４】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タン
パク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストとの相互作用を
意味する。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質上の特
定の構造（即ち抗原決定基、即ちエピトープ）の存在に左右される。例えば、抗
体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した「Ａ」及びその抗体
を含む反応において、エピトープＡ（つまり結合していない、非標識のＡ）を含
むタンパク質が存在すると、抗体が結合した標識したＡの量が低下する。

【００５５】 本明細書において、用語「ストリンジェントな（厳密な）条件」は、ポリヌク
レオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチド配列との間のハ
イブリダイゼーションを許容する条件を指す。ストリンジェントな条件は、例え
ば、塩又は有機溶媒（例えばホルムアミド）の濃度、温度、その他の公知の条件
によって決定することができる。詳述すると、ストリンジェンシー（厳密さ）は
、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇させること、又はハイ
ブリダイゼーション温度を高めることによって高めることができる。

【００５６】 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、単
離または分離されて、自然にはそれが結合して存在する他の構成要素が６０％以
上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去された核酸配列又は
アミノ酸配列である。

【００５７】 本明細書において「置換」は、１個または２個以上のヌクレオチド或いはアミ
ノ酸を、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることである。

【００５８】 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入ってレシピエント細胞
を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた様々な方法を
用いて、自然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原
核生物または真核生物の宿主細胞に挿入するための既知の方法によって行うこと
ができる。この方法は形質転換される宿主細胞の型に基づいて選択され、以下に
限定するものではないが、ウイルスを感染させる方法、電気穿孔法（エレクトロ
ポレーション）、熱ショック、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法等
があり得る。用語「形質転換（された）」細胞は、そのなかで挿入されたＤＮＡ
が、自律的に複製するプラスミドか、または宿主の染色体の一部として複製でき
る、安定的に形質転換された細胞等である。またこのような細胞には、限られた
時間での挿入されたＤＮＡやＲＮＡの一過性の発現が起こる細胞もある。

【００５９】 本明細書においてＴＵＳＵＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が
変化したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得
、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合の
ように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異
体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例えばグ
リシンがトリプトファンで置換される。類似した小さな変化として、アミノ酸の
欠失か挿入、若しくはその両方が含まれる。生物学的或いは免疫学的活性を損な
わずに置換、挿入、又は欠失させることができるアミノ酸は何れかということは
、例えばLASERGENE^TMソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用
いて決定することができる。

【００６０】 用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、ＮＨＡ
Ｐに近縁なポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「アレ
ル変異体」（前に定義した）、「スプライスバリアント」、「種変異体」、また
は「多型変異体」も含まれる。スプライスバリアントは、基準の分子と有意な同
一性を有し得るが、ｍＲＮＡのプロセシングの際にエキソンのスプライシング部
位が変わるためにポリヌクレオチドの数が多いか或いは少ないものである。対応
するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有していたり、或いはドメインが
欠けていることがある。種変異体は、種の間で異なるポリヌクレオチド配列であ
る。これから生ずるポリペプチドは、通常、互いに有意なアミノ酸同一性を有し
ている。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列の１箇所の塩基が異なっている「
一塩基多型」（ＳＮＰｓ）も包含している。ＳＮＰｓが存在することが、例えば
、一定の集団、疾病状態、または疾病状態の性向を示すことがある。

【００６１】 （発明） 本発明は、新規なヒト腫瘍サプレッサー（ＴＵＳＵＰ）、ＴＵＳＵＰをコード
するポリヌクレオチド、及び細胞増殖障害、及び神経疾患の診断、処置、又は予
防のためのこれらの組成物の使用法の発見に基づくものである。

【００６２】 本発明のＴＵＳＵＰをコードする核酸は、例えばBLASTのようなアミノ酸配列
アライメントのコンピュータ検索を用いて、肺ｃＤＮＡライブラリー（LUNGAST0
1）を起源とするインサイト社クローンNo. 1988786において初めに同定された。
コンセンサス配列の配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列
、即ちインサイト社クローンNo. 1988786CT1（LUNGAST01が起源）及び3188119H1
（THYMNON04が起源）から導き出されたものである。

【００６３】 或る実施態様では、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示す配列番号：
１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＴＵＳＵＰは３２４０個のア
ミノ酸からなる長さを有し、１５２番目のＳ（以下、「Ｓ１５２」のように表記
する。）に１個のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化可能
部位を有し、Ｔ１９、Ｓ１０３、Ｓ１６１、Ｓ１８１、及びＴ２３３に５個のカ
ゼインキナーゼＩＩリン酸化可能部位を有し、Ｔ１９、Ｓ９１、Ｓ９５、Ｓ１０
８、Ｓ１０９、Ｓ１４５、Ｓ２０６、Ｓ２３０、及びＴ２３３に９個のプロテイ
ンキナーゼＣリン酸化可能部位を有し、Ｙ２７に１個のチロシンキナーゼリン酸
化可能部位を有する。ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列解析から、ＴＵＳＵＰが高いレ
ベルで荷電していることが分かった。加えて、BLOCKS解析の結果から、ＴＵＳＵ
ＰのＤ８７〜Ｍ１２６の領域が、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインの一部と類似性を
有していることが分かった。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ＴＵＳＵＰは、ｐ
３３（GI 2183221；配列番号：３）との化学的及び構造的類似性を有する。詳述
すると、ＴＵＳＵＰとｐ３３とは、５５％の配列同一性を共有している。ＴＵＳ
ＵＰのＹ２７、Ｓ１０９、Ｓ１４５、Ｓ１５２、Ｓ１６１、Ｓ１８１、及びＴ２
３３のリン酸化可能部位は、ｐ３３で保存されている。ＴＵＳＵＰにおける概ね
１２２番目から１３１番目のアミノ酸からなる独特の配列の領域は、配列番号：
２の概ね６０３番目から６３２番目のヌクレオチドからなる断片によってコード
されている。ノーザン法による解析の結果から、様々なライブラリーにおけるこ
の配列の発現が分かる。そのようなライブラリーの少なくとも５４％は癌又は細
胞増殖関連のものであり、少なくとも３１％は免疫応答関連のものである。詳述
すると、ＴＵＳＵＰを発現するライブラリーの３１％は生殖組織由来のものであ
り、２３％は胃腸管組織由来のものである。

【００６４】 また本発明は、ＴＵＳＵＰの変異体を包含する。好ましいＴＵＳＵＰ変異体は
、ＴＵＳＵＰの機能的又は構造的特徴の少なくとも１種類を有し、ＴＵＳＵＰア
ミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も
好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。

【００６５】 また本発明は、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の
実施態様では、本発明は、ＴＵＳＵＰをコードする配列番号：２の配列を含むポ
リヌクレオチド配列を包含する。

【００６６】 また本発明は、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異体を包含
する。詳述すると、そのような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＴＵＳＵＰをコ
ードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約８０％、より好ましくは少な
くとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同
一性を有する。本発明の特定の実施態様は、配列番号：２の配列との、少なくと
も約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約
９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列番号：２の変異体を包含する
。上述のポリヌクレオチド変異体の何れも、ＴＵＳＵＰの機能的又は構造的特徴
の少なくとも１種類を有するアミノ酸配列をコードし得る。

【００６７】 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の類似性しか有していないものも含めて、多
種のＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明
は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作り出される
あらゆる可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは
、自然発生のＴＵＳＵＰのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプ
レット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような変異は全てここ
に具体的に開示されたものと考えられたい。

【００６８】 ＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適切に選択され
たストリンジェンシーの条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能であるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを有しているＴＵＳＵ
Ｐ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得
る。コドンの選択においては、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従
って、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を
高めるように選択することができる。ＴＵＳＵＰ及びその誘導体をコードするヌ
クレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列が変わらないように実質的に改変
する他の理由として、例えば自然発生配列から作られる転写物より長い半減期の
ような、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すことが挙げられる。

【００６９】 本発明の範囲には、ＴＵＳＵＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそ
の断片の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製した後、この合成
遺伝子を、周知の試薬を用いて入手可能な様々な発現ベクター及び細胞系に挿入
することができる。更に、合成ケミストリを用いてＴＵＳＵＰをコードする配列
又はその任意の断片に突然変異を導入することができる。

【００７０】 また本発明の範囲に含まれるものとして、様々なストリンジェンシー条件の下
で請求項に記載のポリヌクレオチド配列、特に配列番号：２及び配列番号：２の
断片のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列があ
る（例えばWahl, G.M. 及びS.L.Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407;
及びKimmel, A.R. (1987) Methods in Enzymol. 152:507-511参照）。例えば、
ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭ
未満の酢酸３ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭ
未満の酢酸３ナトリウム、最も好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５
ｍＭ未満の酢酸３ナトリウムである。低いレベルのストリンジェントな条件での
ハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドが無い状態で得られ
、高いレベルのストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションは、少なく
とも約３５％のホルムアミド、最も好ましくは約５０％のホルムアミドの存在下
で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０
℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の
温度である。別のパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、界面活性剤
、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、及びキャリアＤＮＡの有無等
を変えることも、当業者に公知である。様々なレベルのストリンジェンシーを、
必要に応じて上記の様々な条件を組み合わせることによって達成できる。好まし
い実施態様では、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭの酢酸３ナトリウム、及び１
％のＳＤＳにおいて３０℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。より好ましい
実施態様では、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの酢酸３ナトリウム、１％のＳ
ＤＳ、３５％のホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓ
ｓＤＮＡ）において３７℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。最も好ましい
実施態様では、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭの酢酸３ナトリウム、１％のＳ
ＤＳ、５０％のホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡにおいて４２
℃で、ハイブリダイゼーションが生ずる。有益なこれらの条件の変更は、当業者
には明らかであろう。

【００７１】 ハイブリダイゼーションの後に行われる洗浄過程でも、ストリンジェンシーを
変えることができる。洗浄でのストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、及
び温度によって確定することができる。上述のように、洗浄過程でのストリンジ
ェンシーは、塩濃度を下げることによって、又は温度を上昇させることによって
高めることができる。例えば、洗浄過程のストリンジェントな塩濃度は、好まし
くは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭ未満の酢酸３ナトリウムであり、最も
この好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭ未満の酢酸３ナトリウ
ムである。洗浄過程のストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約２５
℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、最も好ましくは少なくとも約６８℃で
ある。好ましい実施態様では、洗浄過程を、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭの酢酸
３ナトリウム、及び０．１％のＳＤＳにおいて４２℃で行う。最も好ましい実施
態様では、洗浄過程を、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭの酢酸３ナトリウム、
及び０．１％のＳＤＳにおいて６８℃で行う。これらの条件のこの他の変更は、
当業者には明らかであろう。

【００７２】 ＤＮＡシークエンシング（配列決定）の方法は、周知で当業者が通常利用可能
であり、本発明の実施例の何れかの実施のために用いることができる。この方法
では、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントであるSequenase（US
Biochemical Corp. Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安
定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersbur
g MD）から発売されているELONGASE Amplification Systemに見られるもののよ
うな校正エキソヌクレアーゼと組換え体ポリメラーゼとの組み合わせたもののよ
うな酵素を用いることができる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab2200（Ha
milton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch, Watertow
n MA）並びにABI Catalyst及びABI377及び377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）
のような装置を用いて自動化するのが好ましい。

【００７３】 ＴＵＳＵＰをコードする核酸配列を、部分的なヌクレオチド配列を利用して、
様々な公知のＰＣＲをベースにした方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調
節エレメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、使用可能な
方法の一つである制限部位ＰＣＲ法では、汎用プライマー及び入れ子プライマー
を用いてクローニングベクター内のゲノムのＤＮＡから未知の配列を得る（例え
ばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322参照）。別の方法である逆
ＰＣＲ法では、ばらばらな方向に伸長するプライマーを利用して、環状のテンプ
レートから未知の配列を増幅する。このテンプレートは、既知のゲノムの座位及
びその周りの配列を含む制限断片に由来するものである。（例えばTriglia, T.
他（1988）Nucleic Acids Res 16:8186参照）。第３の方法であるキャプチャＰ
ＣＲ法では、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ
断片をＰＣＲによって増幅する（例えばLagerstrom, M.他（1991）PCR Methods
Applic 1:111-119参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素に
よる消化及び連結によってそのＤＮＡ分子の未知の断片のなかに、組換え二本鎖
配列を組み入れておくこともできる。未知の配列を釣り上げるために用いること
ができる別の方法も公知となっている（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic
Acids Res 19:3055-3060参照）。更に、ＰＣＲ、入れ子プライマー、PromoterFi
nder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行うことができる（Clonte
ch, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要
がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。全てのＰＣＲ
をベースにした方法のために、プライマーを、OLIGO 4.06 Primer Analysis sof
tware（National Biosciences Inc., Plymouth MN）のような市販のソフトウェ
アや他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量
が５０％以上、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計
することができる。

【００７４】 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときには、より大きなｃＤＮＡを含むよ
うにサイズ選択されたライブラリーを用いるのが好ましい。またランダムプライ
ミングした（random primed）ライブラリーは、多くの場合遺伝子の５′領域を
含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーでは完全長ｃＤＮＡが得られない場合に特に
好ましい。またゲノムライブラリーは、転写されない５′調節領域まで配列を延
長するために有用であり得る。

【００７５】 シークエンシングやＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したりその
存在を確認するために、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることがで
きる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための
流動性ポリマー、レーザーで活性化される４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチ
ドに対して１種類）を使用し、ＣＣＤカメラを用いて放射された波長の検出を行
う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer製のGenotyper^TM
及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷から
コンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。
キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に少量しか存在しないようなＤＮ
Ａの小片の配列決定に特に適している。

【００７６】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド配列また
はその断片を組換えＤＮＡ分子に組み入れることにより、適切な宿主細胞内での
ＴＵＳＵＰ、その断片または機能的等価物の発現を誘導することができる。遺伝
暗号固有の縮重のために、実質的に同一又は機能的に等価なアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ配列も作り出され得、これらの配列をＴＵＳＵＰの発現のため
に用いることができる。

【００７７】 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＴＵＳＵＰをコードする配列を改
変するために、周知の方法を用いて組換えることができる。この配列改変の目的
としては、限定するものではないが、例えば遺伝子産物のクローニング、プロセ
シング及び／又は発現を変えること等が挙げられる。無作為断片によるＤＮＡ再
編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる再構成（reassemb
ly）によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。例えば、オリゴヌク
レオチド媒介特定部位突然変異誘発によって、新しい制限部位の挿入、グリコシ
ル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの作出、突然変
異の導入その他を達成することができる。

【００７８】 本発明の別の実施例では、周知の化学的方法（例えばCaruthers. M.H.他（198
0）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他（1980）Nucl. Acids
Res. Symp. Ser. 225-232参照）を用いて、ＴＵＳＵＰをコードする配列の全体
、或いはその一部を合成することができる。或いは、化学的方法を用いてタンパ
ク質自体を作り出して、ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列またはその断片を合成するこ
とができる。例えば、様々な固相技術（例えばRoberge, J.Y.他(1995) Science
269:202-204参照）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばA
BI 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いることにより達成することがで
きる。更に、ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列及びその任意の一部を、直接の合成の際
の変更し、かつ／又は他のタンパク質又はその任意の一部の配列と結合すること
によって、変異体ポリペプチドを作り出すことができる。

【００７９】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol
. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いはシー
クエンシングにより確認することができる（例えばCreighton T.（1983）Protei
ns Structure and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY
参照）。

【００８０】 生物学的に活性なＴＵＳＵＰを発現させるためには、ＴＵＳＵＰをコードする
ヌクレオチド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内
で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な配列を含むベクタ
ーに挿入する。これらの配列としては、例えば、ベクターにおける、及びＴＵＳ
ＵＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成的及び誘導
的プロモーター、及び５’及び３’末端非翻訳領域のような制御配列が挙げられ
る。このようなエレメントの作用の強さや特異性は様々に異なったものであり得
る。また、ＴＵＳＵＰをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の
開始シグナルも必要である。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及
び隣接する配列、例えばKozak配列が挙げられる。ＴＵＳＵＰ及びその開始コド
ン及び上流の制御配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写
または翻訳の制御シグナルは不要である。しかし、コーディング配列又はその断
片のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを
与えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにす
るために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレ
メント及び開始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり
得る。使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現
の効率を高めることができる（例えば、Scharf,D.他（1994）Results Probl. Ce
ll Differ. 20:125-162参照）。

【００８１】 ＴＵＳＵＰをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベク
ターを作製するために、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方
法としては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo遺伝子組換
え技術が含まれる（例えば、Sambrook, J.他（1989）Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Planview NY, ch. 4, 8及びAusub
el, F.M.等(1995, 及び定期的な増補) Current Protocol in Molecular Biology
, John Wiley &Sons, New York, NY, ch. 9, 13,及び16を参照）。

【００８２】 様々な発現ベクター／宿主系を、ＴＵＳＵＰをコードする配列の保持、発現の
ために利用することができる。このようなものとしては、以下に限定するもので
はないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベ
クターで形質転換した細菌のような微生物；酵母菌発現ベクターで形質転換した
酵母菌；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細
胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、
タバコモザイクウイルス（TMV））或いは細菌の発現ベクター（例えばTi、或い
はpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；或いは動物細胞系が挙げられ
る。本発明は、使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００８３】 細菌系では、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々な
クローニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、ＴＵＳＵＰを
コードするポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及
び成長（propagation）を、例えばBluescript（Stratagene）やpSport1^TMプラス
ミド（GIBCO BRL）のような多機能大腸菌ベクターを用いて達成することができ
る。ベクターの様々なクローニング部位にＴＵＳＵＰをコードする配列を組み入
れてlacZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質転換された細菌を特
定するための比色によるスクリーニングを行うことができるようになる。更に、
これらのベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシークエンシング、ヘルパ
ーファージによる一本鎖レスキュー（single strand rescue）、及びクローン化
した配列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る（例えばVan Heeke,
G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば抗体産
生のために大量のＴＵＳＵＰが必要な場合には、ＴＵＳＵＰの高レベルで発現を
誘導するベクターを用いることができる。例えば、強い誘導性Ｔ５またはＴ７バ
クテリオファージプロモーターを含むベクターを用いることができる。

【００８４】 ＴＵＳＵＰの産生のために、酵母菌発現系を用いることもできる。例えばα因
子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨのような構成的または誘導的プロモー
ターを含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）やメタノール資化酵母ピチアパストリス（Pichia pastoris）
において用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパ
ク質の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現の
ための外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする（例えばAusubel, 前
出; 及びGrant他(1987)Methods Enzymol. 153:516-54; Scorer, C.A.他(1994) B
io/Technology 12:181-184参照）。

【００８５】 ＴＵＳＵＰの発現のために植物系も用いることができる。例えばCaMVの35S及
び19Sプロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Ta
kamatsu,N.他（1987）EMBO J 6:307-311）のオメガリーダー配列と共に用いて、
ＴＵＳＵＰをコードする配列の転写を促進することができる。或いは、RUBISCO
の小サブユニットや熱ショックプロモーターのような植物のプロモーターを用い
てもよい（例えばCoruzzi, G.他（1984）EMBO J 3:1671-1680; Broglie, R.他（
1984）Science 224:838-843; 及びWinter, J.他（1991）Results Probl. Cell D
iffer. 17:85-105参照）。これらの作製物は、直接的なＤＮＡ形質転換或いは病
原体によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる（例えばHobbs,
S.又はMurry, L.E. McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992
）McGraw Hill NY, pp191-196を参照されたい）。

【００８６】 哺乳動物の細胞では、多種のウイルスをベースにした発現系を利用することが
できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、ＴＵＳＵＰをコ
ードする配列を、後期プロモーター及び三連リーダー配列（tripartite leader
sequence）からなるアデノウイルスの転写／翻訳複合体に連結することが可能で
ある。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１領域又はＥ３領域へ挿入することにより
、宿主細胞におけるＴＵＳＵＰを発現する感染性のウイルスが得られる（例えば
Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659）。さら
に、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
エンハンサーのような転写エンハンサーを用いることができる。

【００８７】 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに組み入れ
られてそこから発現され得るものより大きいＤＮＡの断片を供給することもでき
る。治療上の目的で、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣを構築し、従来のデリバリー方
法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用して供給す
ることができる。

【００８８】 哺乳動物系において長期間にわたる組換えタンパク質の産生を確保するために
は、細胞系におけるＴＵＳＵＰの安定した発現が望ましい。例えば、ウイルスの
複製起源及び／または内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を同一のベ
クター上、或いは個別のベクター上に含み得る発現ベクターを用いて、ＴＵＳＵ
Ｐをコードする配列を、細胞系に形質転換することができる。ベクターの導入の
後、細胞を濃縮培地内で概ね１〜２日間増殖させ、次に選択培地に切り替える。
選択マーカーの目的は、選択薬に対する耐性を与え、その存在に基づいて導入さ
れた配列を間違いなく発現する細胞を増殖させ、回収できるようにすることであ
る。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織
培養技術を用いて増殖させることができる。

【００８９】 形質転換された細胞系を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系としては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子（tk）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（
apr）が挙げられ、それぞれtk^-又はapr^-細胞において用いられる（例えばWigler
, M.他 (1977) Cell 11:223-232、及びLowy, I.他 (1980) Cell 22:817-823参照
）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用い
ることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはア
ミノ配糖体のネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、als或いはpatは
クロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（例え
ば、Wigler, M.他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570、Colberre-Ga
rapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14、及びMurry (前出)参照）。別の
選択に利用できる遺伝子として、例えば、代謝のために細胞が要求する物質を変
える、trpBやhisDが文献に記載されている（例えばHartman, S.C.及びR.C. Mull
igan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051）。可視マーカー、例えば
アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；ＧＦＴ）
、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−Ｄ−グルクロノシド、またはル
シフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマーカ
ーは、形質転換体を特定するためばかりでなく、特定の発現ベクター系によ一過
性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために藻い入ることができる
（例えばRhodes, C.A.他 (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。

【００９０】 マーカー遺伝子の発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示唆され
るが、その存在及び発現は確認する必要があることがある。例えばＴＵＳＵＰを
コードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＴＵＳＵＰをコー
ドする配列が組み入れられた形質転換された細胞を、マーカー遺伝子の機能の欠
如に基づいて確認できる。或いは、マーカー遺伝子はＴＵＳＵＰをコードする配
列と直列に配置され得、両者が単一のプロモータの制御下となり得る。誘導に応
じたマーカー遺伝子の発現、即ち選択は、通常、直列に配置された配列の発現を
も同時に表す。

【００９１】 一般的に、ＴＵＳＵＰをコードする核酸配列を含みＴＵＳＵＰを発現する宿主
細胞は、当業者に周知の様々な方法により同定することができる。このような方
法としては、限定するものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼーション、ＰＣＲによる増幅、及び核酸及びタンパク質を検出かつ
／または定量するための、膜、溶液、或いはチップを用いる技術を含むタンパク
質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ等が挙げられる。

【００９２】 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いる、ＴＵＳＵＰの発現を検出、測定するための免疫学的方法は周知で
ある。このような方法としては、以下に限定するものではないが、酵素結合免疫
検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取器法（
FACS）等が挙げられる。ＴＵＳＵＰポリペプチド上の２つの非干渉なエピトープ
に対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイ
ムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競
合的結合アッセイを用いてもよい。これらアッセイの並びに他のアッセイは周知
である（例えばHampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manu
al, APS Press, St. Paul MN; Coligan, J.E.他(1997及び定期的に発行される補
遺）Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-In
terscience, New York, NY; 及びMaddox, D.E.他(1983) J. Exp. Med. 158:1211
-1216参照）。

【００９３】 様々な標識・結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸のア
ッセイにおいて用いることができる。ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド
に近縁な配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ・
ＰＣＲプローブを作製するための手段には、オリゴ標識法、ニックトランスレー
ション法、末端標識法、或いは標識したヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含ま
れる。或いは、ＴＵＳＵＰをコードする配列またはその任意の断片を、ｍＲＮＡ
プローブの作製のためのベクターにクローン化してもよい。そのようなベクター
は周知で、市販されており、これを用いて例えばＴ７、Ｔ３、或いはＳＰ６のよ
うな適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによっ
て、in vitroでＲＮＡプローブを合成することができる。これらの方法は、種々
の市販のキット、例えばPharmacia Upjohn（Kalamazoo, MI）；Promega（Madiso
n WI）；及びU.S. Biochemical Corp.（Cleveland OH）から提供されているもの
を用いて実施することができる。検出を容易にするために用いられ得る適切なリ
ポーター分子、すなわち標識としては、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍
光剤）、化学発光剤、或いは色素剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒
子等が挙げられる。

【００９４】 ＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、この
タンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養
することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いら
れる配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持さ
れる。当業者には理解されるように、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＴＵＳＵＰ分泌
を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。

【００９５】 加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパ
ク質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよ
うなポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カル
ボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が
含まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも
、タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び／又は作用を特定するために用
いることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有
している種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38）はAmerican
Type Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手でき、導入される外
来タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかか
ら選択することができる。

【００９６】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰをコードする、天然の、修飾した、或い
は組換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける
融合タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって
認識され得る異種分子を含むキメラＴＵＳＵＰタンパク質は、ペプチドライブラ
リーからのＴＵＳＵＰの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分
子としては、限定するものではないが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GS
T）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュ
リン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）が挙
げられる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチ
オン、マルトース、酸化フェニルアルシン（phenylarsine oxide）、カルモジュ
リン、及び金属キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可
能となる。FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素（HA）によって、それらのエピトー
プのタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体
を用いた融合タンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク
質を、ＴＵＳＵＰをコードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク
分解酵素による切断部位を含むように組換えることによって、ＴＵＳＵＰを、精
製の後にヘテロの分子から切り離すことができるようになる。融合タンパク質の
発現及び精製のための方法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に
記載されている。融合タンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市
販のキットを用いてもよい。

【００９７】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したＴＵＳＵＰを、TNT^TMウサギ網状
赤血球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系（Promega, Madison, WI）を用い
てin vitroで合成することができる。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６
プロモーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結
びつける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは³⁵S-メチオニンの
存在の下で生じる。

【００９８】 ＴＵＳＵＰの断片の作製は、組換え体の産生によって行うのみならず、固相技
術を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる（例えばCreighton,
前出pp.55-60参照）。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動的に行う
ことができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプチド合
成機 (The Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) を用いて達成することができる
。ＴＵＳＵＰの様々な断片を個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出
すことができる。

【００９９】 （治療） ＴＵＳＵＰと、ヒトｐ３３（GI 2183221）との間に化学的及び構造的類似性が
存在する。加えて、ＴＵＳＵＰは、生殖器系、免疫系、及び胃腸管に関連する腫
瘍において発現される。従って、ＴＵＳＵＰは、細胞周期の調節、アポトーシス
、及び老化プロセスに関与する生化学的経路における異常に関連する癌において
一定の役割を果たすと考えられる。詳述すると、ＴＵＳＵＰは、生殖器系、免疫
系、及び胃腸管に関連するそのような癌において一定の役割を果たすと考えられ
る。

【０１００】 従って、或る実施態様では、癌の処置又は予防のために、ＴＵＳＵＰまたはそ
の断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。そのような癌としては、以下に限定
するものではないが、子宮、子宮頚、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、及び乳房の癌
等の生殖器に関連する癌；白血病及びリンパ種等の免疫系関連の癌；食道、胃、
結腸、肝臓、及び膵臓の癌等の胃腸管関連の癌等を挙げることができる。

【０１０１】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の処
置又は予防のために、ＴＵＳＵＰまたはその断片若しくは誘導体を発現し得るベ
クターを患者に投与し得る。

【０１０２】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の処
置又は予防のために、実質的に精製されたＴＵＳＵＰを適切な医薬用担体と共に
含む医薬品組成物を患者に投与し得る。

【０１０３】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む細
胞増殖障害の処置又は予防のために、ＴＵＳＵＰの活性を変調するアゴニストを
患者に投与し得る。

【０１０４】 別の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補的配列、又はベクターの何れかを、他の適切な薬剤と組み合わせて投与する
ことができる。当業者であれば、従来の薬学上の原理に基づいて併用療法で用い
るための適切な薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の様々な疾患の治療又は予防に効果を奏する相乗作用が得られる。この
方法を用いることにより、より低い用量の各薬剤で治療効果を上げることができ
、副作用が生ずる可能性を低下させることができる。

【０１０５】 ＴＵＳＵＰのアンタゴニストは、周知の方法を用いて製造することができる。
詳述すると、精製されたＴＵＳＵＰを用いることによって、抗体を作り出したり
、或いはＴＵＳＵＰに特異的に結合するものを同定するために薬物のライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。ＴＵＳＵＰに対する抗体も、周知の方法
を用いて作り出すことができる。このような抗体としては、限定するものではな
いが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆ
ａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーから作られたフラグメントが含
まれる。中和抗体（即ち二量体形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適で
ある。

【０１０６】 抗体を作り出すため、ＴＵＳＵＰか、免疫学的特性を有するその断片或いはオ
リゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の様々
なホストを免疫化することができる。免疫学的反応を増強するために、ホストの
種に応じた様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバント
としては、限定するものではないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ
ニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
ポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、並びにジニトロフェノール等が挙げられる。ヒト
で使用するアジュバントのなかでは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコ
リネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好適である。

【０１０７】 ＴＵＳＵＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、またはその断片は、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個
以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、元のタン
パク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸
配列を含んでいるのが好ましい。ＴＵＳＵＰアミノ酸の短いストレッチを、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような他のタンパク質のストレッチ
と融合し、そのキメラ分子に対する抗体を産生させることができる。

【０１０８】 ＴＵＳＵＰのモノクローナル抗体は、培地内の無制限増殖性細胞系（continuo
us cell line）に抗体分子を産生させる技術を用いて作製できる。このような技
術として、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術等が挙げられる（例えば、Kohler
, G.他(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D.他 (1985) J. Immunol. Methods
81 :31-42；Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Col
e, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120参照）。

【０１０９】 加えて、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための、マウス
抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする技術のような「キメラ抗体」
の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L.
他（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855；Neuberger, M.S.他（1984）
Nature 312:604-608；Takeda, S.他（1985）Nature 314:452-454参照）。或いは
、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、周知の方法によりＴＵＳＵＰ
に特異的な一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有しているが
イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブ
ラリーからの鎖再編成（chain shuffling）によって作り出すことができる（例
えば、Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3参照）。

【０１１０】 また、文献（例えば、Orlandi, R.他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:383
3-3837；Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299参照）に開示されているよう
に、高度に特異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをス
クリーニングすることによって、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘導
することによって抗体を作り出すこともできる。

【０１１１】 ＴＵＳＵＰに対する特異結合部位を含む抗体断片を作り出すこともできる。こ
のような断片としては、以下に限定するものではないが、抗体分子のペプシンに
よる消化で生成することができるＦ（ａｂ′）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより作り出すことができるＦａ
ｂフラグメント等が挙げられる。或いは、所望の特異性を有するモノクローナル
Ｆａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリ
ーを作製してもよい（例えば、Huse, W.D.他（1989）Science 256:1275-1281参
照）。

【０１１２】 様々なイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗
体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いはラジ
オイムノアッセイの、様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイム
ノアッセイでは、ＴＵＳＵＰとその特異的抗体との複合体の形成量の測定を行う
。２つの互いに非干渉なエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる二部
位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイ（two sites monoclonal based imm
unoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイを用いてもよい（Maddox, 前出
）。

【０１１３】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド、または
その任意の断片や相補配列を、治療上の目的で用いることができる。或る実施態
様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましいような状況において、ＴＵＳ
ＵＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳
述すると、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形
質転換することができる。従って、相補的分子または断片を用いて、ＴＵＳＵＰ
の活性を変調、即ち遺伝子の機能を調節することができる。このような技術は現
在周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、若しくはより大き
な断片は、ＴＵＳＵＰコーディング配列のコード領域や調節領域の様々な位置か
ら設計することができる。

【０１１４】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の
発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターを、標的
の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いることが
できる。ＴＵＳＵＰをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列
を発現するベクターは、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例
えば、Sambrookら（前出）及びAusubelら（前出）参照）。

【０１１５】 ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現す
る発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより、ＴＵＳＵＰをコー
ドする遺伝子を機能停止させることができる。このような作製物を用いて、翻訳
不可能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。こ
のようなベクターは、ＤＮＡへ組み入れられない場合でも、そのベクターが内在
性ヌクレアーゼにより破壊されるまでＲＮＡ分子の転写を続ける。このような一
過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクタ
ー系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。

【０１１６】 上述のように、ＴＵＳＵＰをコードする遺伝子の制御領域、５′領域、または
調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）に相
補的な配列、即ちアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計する
ことにより遺伝子の発現の仕方を変えることができる。転写開始部位、例えば開
始部位の概ね＋１０〜−１０の間の位置にある領域に由来するオリゴヌクレオチ
ドが好適である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成することが
できる。三重らせん対合が有用なのは、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、
或いは調節分子の結合のために十分にほどける能力を、それが阻害するからであ
る。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については、文献に記載され
ている（例えば、Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Appr
oaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NYにおけるGee, J.E.他(1994)参照）
。また、転写物のリボソームへの結合を妨げてｍＲＮＡの転写を阻害するために
、相補的配列、即ちアンチセンス分子を設計することもできる。

【０１１７】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムを、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることもできる。リボザイムの作用機構では、リボザイム分子が相補的標的
ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイズし、その後エンドヌクレアーゼによる切断
（endonucleolytic cleavage）がなされる。使用できるリボザイムの例として、
ＴＵＳＵＰをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果
的に触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子がある。

【０１１８】 標的となり得るＲＮＡ内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、標的の分
子における配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位をスキャンするこ
とによって同定する。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０個のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列について、その
オリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴を評価することができる
。候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ribonucl
ease protection assay）によって、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションについての接触性（accessibility）を測定することにより評価
することができる。

【０１１９】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための周知
の方法により作製することができる。これらの技術としては、固相ホスホラミダ
イト化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの化学合成技術等がある。或いは、
ＲＮＡ分子は、in vivo及びin vitroでのＴＵＳＵＰをコードするＤＮＡ配列の
転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６
のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する様々なベクターに組み
入れることができる。或いは、構成的ＲＮＡを合成するｃＤＮＡ作製物を、細胞
系、細胞或いは組織内に導入することができる。

【０１２０】 ＲＮＡ分子はその細胞内での安定性を高めたり、半減期を長くするために修飾
することができる。可能な修飾としては、限定するものではないが、その分子の
５′末端か３′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバ
ックボーン内でホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosph
orothioate）或いは２′Ｏ−メチルを使用すること等が挙げられる。この方式（
concept）は本来ＰＮＡの作製において用いられるもので、以下のようにこれら
の分子全てに拡張することができる。即ち、内在性エンドヌクレアーゼにより容
易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、ア
セチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の形態の修飾によるだけでなく、イ
ノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）のような
従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら分子全てにこの
方式を拡張することができる。

【０１２１】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、
それらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivoでの使用についても同様に適
している。ex vivo治療の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導
入し、自家移植用にクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またト
ランスフェクションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミ
ノポリマーによるデリバリー（Goldman, C.K.他(1997) Nature Biotechnology 1
5:462-66; 引用により本明細書の一部とする）は、当分野で周知の方法を用いて
実施することができる。

【０１２２】 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び
最も好ましくはヒトのような哺乳動物を含む、任意の適切な被験体に適用するこ
とができる。

【０１２３】 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果をあげるために、医薬品組成物
を医薬上許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成物は、ＴＵＳ
ＵＰ、ＴＵＳＵＰに対する抗体、ＴＵＳＵＰの模擬体（mimetics）、アゴニスト
、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成
物は、単独で、或いは例えば安定化剤のような１種以上の他の薬剤とともに、滅
菌した生体適合性の医薬用担体を用いて投与する。このような担体としては、限
定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水等が挙げられる。こ
のような組成物は、単体で、或いは他の薬剤やホルモンと組み合わせた形で患者
に投与することができる。

【０１２４】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路としては、以下に限定するもので
はないが、経口投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、髄腔内投
与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局
所投与、舌下投与、或いは直腸内投与等が挙げられる。

【０１２５】 これらの医薬品組成物は、主成分に加えて、作用物質を医薬上使用可能な製剤
にするための処理を容易にする、賦形剤及び添加剤のような適切な医薬上許容さ
れる担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、Remington's Phar
maceutical Sciences（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版において見
ることができる。

【０１２６】 経口投与用の医薬品組成物は、当分野で周知の医薬上に許容される担体を用い
て適切な剤形に製剤することができる。このような担体により、この医薬品組成
物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤
、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤することができる。

【０１２７】 経口投与するための医薬製剤は、主成分と固形の賦形剤とを組み合わせた上で
、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、錠剤或いは糖衣剤コア（dragee core
）を作るために、（所望に応じて粉砕した後に）顆粒の混合物を加工することに
よって得られる。必要ならば適切な添加剤を添加することができる。適切な添加
剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む
砂糖のような糖質或いはタンパク質の賦形剤（filler）、トウモロコシ、コムギ
、コメ、ジャガイモ等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロー
ス、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラ
ーゲンのようなタンパク質がある。必要ならば、崩壊剤または可溶化剤、或いは
橋かけ結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなア
ルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を加えてもよい。

【０１２８】 糖衣剤コアは、濃縮砂糖溶液等により適切な錠皮を塗布して用いられる。錠皮
を作るための溶液としては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ
ルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物等が挙げられる。錠剤の識別のため
、或いは主成分の量即ち投与量を表示するために染料或いは色素を錠剤或いは錠
皮に加えてもよい。

【０１２９】 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル、ゼラチ
ンからなる柔軟な密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトール
のような錠皮を有する。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷ
んのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、並びに所望に応じて安定化剤と混合された主成分を含み得る。柔軟な
カプセルでは、主成分が、安定化剤とともに或いは安定化剤なしで、脂肪油、液
体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸
濁されている。

【０１３０】 非経口投与用の医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液
或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において配合すること
ができる。水性の注射用懸濁剤には、 例えばカルボキシルメチルセルロースナ
トリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質
を含めることができる。更に、主成分の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤とし
て調製することができる。適切な親油性の溶媒或いは担体としては、胡麻油のよ
うな脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合
成脂肪酸エステルがある。脂質でないポリカチオンのアミノポリマーをデリバリ
ーのために用いることもできる。懸濁剤には、溶解度を高め濃縮度の高い溶液の
調製を可能にする適切な薬剤または安定剤を、所望に応じて加えることができる
。

【０１３１】 局所適用または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸
透剤を用いて製する。このような浸透剤は、当技術分野において周知である。

【０１３２】 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来通りの混合、溶解、顆粒化、
糖衣形成、微粒子化（levigating）、乳化、カプセル化、捕捉（entrapping）、
或いは凍結乾燥により製造される。

【０１３３】 この医薬品組成物は塩として提供することもでき、限定するものではないが塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む種々の酸とともに
形成することができる。塩は、水性或いはプロトニック溶剤において、対応する
フリーの塩基形態より可溶性が高くなる傾向がある。この他、好ましい製剤には
、ｐＨ４．５〜５．５の範囲にあって、使用前に緩衝剤を配合した、１ｍＭ〜５
０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、及び２％〜７％のマンニトール
の全てまたは何れかを含む凍結乾燥粉末がある。

【０１３４】 医薬品組成物は、調製した後に適切な容器内に入れ、さらに提示した状態の処
置に用いられるようにラベル付けすることができる。ＴＵＳＵＰの投与の場合、
このようなラベルには、投与の量、頻度、及び方法が表示される。

【０１３５】 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、有効成分を所望の目的
を達成するために有効な量含む組成物である。有効な量の決定は、当業者の能力
の範囲内で十分行うことができる。

【０１３６】 あらゆる化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通
常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセ
イから推定することができる。この動物モデルを、適切な濃度範囲や投与経路を
決定するために用いることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトに
おける有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１３７】 治療上有効な量とは、症状や状態を改善する有効成分、例えばＴＵＳＵＰまた
はその断片、ＴＵＳＵＰの抗体、ＴＵＳＵＰのアゴニスト、アンタゴニスト、ま
たはインヒビターの量である。そのような化合物の治療上の有効性及び毒性は、
細胞培地における或いは実験動物を用いた標準的な薬学的手順によって、例えば
ＥＤ５０（集団の５０％における治療上の有効量、５０％有効量）及びＬＤ５０
（集団の５０％の致死投与量）として決定することができる。毒性と治療有効性
との間の投与量の比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すこと
ができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地の
アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用における投与量の範
囲を決める際に利用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほ
とんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ま
しい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範
囲内で変わってくる。

【０１３８】 正しい投与量は、処置が必要な患者に関連する要因を考慮して担当医師が選択
する。用量及び投与は、主成分を十分なレベルだけ与え、かつ所望の効果を維持
するべく調節する。考慮すべき要素としては、疾病状態の重症度、患者の全身の
健康状態、患者の年齢、体重、並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用す
る薬剤、反応感受性、並びに治療に対する耐性／反応等が挙げられる。長期的に
作用する医薬品組成物は、その特定の製剤のクリアランス率に応じて、３〜４日
毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与することができる。

【０１３９】 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いはデリバリー
方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献に見出すことがで
きる。当業者であれば、ヌクレオチドでは、タンパク質やインヒビター用の剤形
とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのデリバリーの方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。

【０１４０】 （診断） 別の実施例では、ＴＵＳＵＰに特異的に結合する抗体を、ＴＵＳＵＰの発現に
よって特性化される疾病の診断、或いは、ＴＵＳＵＰやＴＵＳＵＰのアゴニスト
、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリング
のためのアッセイにおいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、上
述の治療用のものと同一の方法で作り出すことができる。ＴＵＳＵＰの診断アッ
セイとして、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＴＵＳＵＰを検出す
るために抗体或いは標識を利用する方法がある。この抗体は、修飾して用いても
、修飾なしで用いてもよく、共有結合または非共有結合の何れかでリポーター分
子と結合させることにより標識することができる。幾つかは上記したが種々のリ
ポーター分子が知られており、それを用いることができる。

【０１４１】 例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）
並びにＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器法）のようなＴＵＳＵＰを測定するため
の種々のプロトコルが当分野では周知であり、これによってＴＵＳＵＰ発現の変
化や異常を診断するための基礎が得られる。ＴＵＳＵＰの発現の正常値、即ち標
準値は、哺乳動物、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは細胞
抽出物とＴＵＳＵＰの抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合させること
によって確立する。標準の複合体形成量は、様々な方法、好ましくは測光手段を
用いることにより定量することができる。被験者の生検組織の患部組織サンプル
及び対照サンプルにおいて発現されたＴＵＳＵＰの量を、標準値と比較する。標
準値と被験者の値との偏差から、疾病の診断のためのパラメータを確立する。

【０１４２】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドを診断目
的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡ等がある。このポリヌク
レオチドは、ＴＵＳＵＰの発現が疾病と関係がある可能性がある生検組織におけ
る遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセイは、ＴＵＳＵ
Ｐが存在する状態か、存在しない状態か、過剰発現している状態の何れの状態に
あるかを区別したり、治療的な介入においてＴＵＳＵＰレベルの調節をモニタリ
ングするために利用することができる。

【０１４３】 或る実施態様では、ＴＵＳＵＰまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを利用して、ＴＵＳＵＰをコードする核酸配列を同定することができる。そ
のプローブの特異性、即ちそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば５
′調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）、或いは特異性の低い領域（
例えば特に３′コーディング領域）の何れに由来するのかということ、及びハイ
ブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度の或いは低い）ストリンジェン
シーにより、そのプローブが自然発生ＴＵＳＵＰのみを同定するものであるか、
或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まる。

【０１４４】 プローブは、近縁な配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、
ＴＵＳＵＰをコードする任意の配列に基づくヌクレオチドを少なくとも５０％含
むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａであり得、また配列番号：２の配列か、自然発生ＴＵＳＵＰ遺伝子のイントロ
ン、プロモータ、及びエンハンサーエレメントを含むゲノムの配列に由来するも
のであり得る。

【０１４５】 ＴＵＳＵＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロ
ーブを作製するための手段としては、ＴＵＳＵＰやＴＵＳＵＰ誘導体をコードす
る核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法が
ある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ
や適切な標識ヌクレオチドを付加することによりin vitroでのＲＮＡプローブ合
成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは様々なリポ
ータ分子により標識することができる。例えば、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射性核種
により、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスフ
ァターゼのような酵素標識等により標識することができる。

【０１４６】 ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＴＵＳＵＰの発現に関連す
る疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下
に限定するものではないが、子宮、子宮頚、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、及び乳
房の癌等の生殖器に関連する癌；白血病及びリンパ種等の免疫系関連の癌；食道
、胃、結腸、肝臓、及び膵臓の癌等の胃腸管関連の癌等を挙げることができる。
ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の組織や体液を利用する
、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜
をベースにした技術や、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、
ピン技術、及びＥＬＩＳＡアッセイや、或いはマイクロアレイにおいて用いるこ
とによって、ＴＵＳＵＰ発現の変化を検出することができる。このような定性的
或いは定量的試験法は当分野では周知である。

【０１４７】 特定の実施態様では、特に上に列挙したもののような関連疾患の存在を検出す
るアッセイにおいてＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る
。ＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加
えることができる。適当なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗
浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプル
におけるシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっ
ている場合、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダ
イズしており、サンプルのなかのＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチド配列のレ
ベルの変化が生じていることは、関連する疾患の存在を示している。このような
アッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにお
いて特定の治療上の処置の有効性を評価するために用いることもできる。

【０１４８】 ＴＵＳＵＰの発現に関連する疾病の診断の基礎とするために、正常な、即ち標
準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト何
れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞の抽出物を、ハイブリダイゼ
ーション或いは増幅に適した条件下でＴＵＳＵＰをコードする配列又はその断片
と結合することにより確立し得る。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実
質的に精製されたＴＵＳＵＰが用いられる実験で得られる値と、正常被験者で得
られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得
られた標準値は、疾病の症状を呈する患者のサンプルから得られる値と比較する
ことができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。

【０１４９】 一旦疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを定期的に反復して行って、患者における発現のレベルが正常な患者
において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。継続
的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月にわたる期間での
治療の効果を知ることができる。

【０１５０】 癌については、患者の生検組織において転写物が異常な量で存在することが、
疾病の発生の素因を示す。つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出する
手段となり得る。このタイプの確定診断により、医療従事者が予防的処置を講じ
たり、より早期に積極的な治療を開始し、癌の発生や更なる進行を予防すること
が可能となる。

【０１５１】 ＴＵＳＵＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの別の診断目
的の使用法では、ＰＣＲ法での利用があり得る。このようなオリゴマーは化学的
に合成したり、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作製することができ
る。オリゴマーは、好ましくは、ＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドの断
片又はＴＵＳＵＰをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
含み、特定の遺伝子或いは状態を特定するために最適な条件下で用いられる。ま
た、オリゴマーは、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出または定量のため低い
厳密さの条件の下で用いることもできる。

【０１５２】 ＴＵＳＵＰの発現を定量するために用いることができる方法として、放射標識
（radiolabeling）或いはビオチン標識したヌクレオチドの利用、対照の核酸の
同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準
のグラフ曲線の利用等もある（例えば、Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Meth
ods, 159:235-44；Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236参照）。多数の
サンプルの定量では、目的のオリゴマーが複数の希釈溶液中に存在し、分光光度
計を用いたり比色定量により迅速に定量することができるようなＥＬＩＳＡ形式
のアッセイを行うことによって一層定量のスピードを上げることができる。

【０１５３】 別の実施例では、ここに開示するポリヌクレオチド配列の何れかに由来するオ
リゴヌクレオチドまたはより大形の断片を、マイクロアレイにおけるターゲット
（標的）として用いることができる。マイクロアレイを用いることにより、多く
の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺
伝子の変異体、変異及び多型を同定することができる。この情報は、遺伝子の機
能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の診断、及び治療薬の開発やその
活性のモニタリングのために利用することができる。

【０１５４】 マイクロアレイを準備し、周知の方法を用いて解析してもよい（例えば、Bren
nan, T.M.ら(1995)米国特許No. 5,474,796; Schena, M.ら (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweilerら, (1995) PCT出願WO95/251116;
Shalon, Dら(1995) PCT出願WO95/35505; Heller, R.A.ら(1997) Proc. Natl. A
cad. Sci. 94:2150-2155; Heller, M.J.ら(1997)米国特許No. 5,605,662参照）
。

【０１５５】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列マッピングのために有用なハイブリダイゼーションプローブを作
り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人
工染色体作製物にマッピングし得る。人工染色体作製物としては、例えばヒト人
工染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡ
Ｃｓ）、細菌性Ｐ１作製物又は単染色体ｃＤＮＡライブラリー等がある（例えば
、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends
Genet. 7:149-154参照）。

【０１５６】 蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッ
ピング技術及び遺伝子地図データと相互関係を有し得る（Meyers, R. A. (ed.)
Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers New York, NY, pp. 96
5-968に記載のHeinz-Ulrichら (1995)参照）。遺伝子地図データの例は、種々の
科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）に見ることができる
。物理的染色体地図上でのＴＵＳＵＰをコードする配列の位置と特定の疾病（ま
たは特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、或る遺伝病に関連するＤＮ
Ａの領域を決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者
、キャリア、または患者の遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１５７】 染色体調製物のin situハイブリダイゼーションや、確立された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡大するた
めに用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知で
あっても、マウスのような別の哺乳動物の染色体上の遺伝子配置から、関連する
マーカーがわかる。新たな配列は、物理的マッピングにより染色体のアームまた
はその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング或いは他の
遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供するこ
とができる。例えば毛細血管拡張性運動失調（AT）が11q22-23に位置決定された
ように（例えば、Gatti, R.A.他（1988）Nature 336:577-580参照）、一旦疾患
或いは症候群が特定のゲノム領域に粗く位置決定されたならば、その領域にマッ
ピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節
遺伝子を表し得ることになる。本発明のヌクレオチド配列を、転座、逆位等によ
って生じた、正常者、キャリア、及び患者の間の染色体の位置の違いを検出する
ために用いることもできる。

【０１５８】 本発明の別の実施例では、ＴＵＳＵＰや、その触媒作用性または免疫原性断片
、オリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において化合物のスクリー
ニングのために用いることができる。このようなスクリーニングにおいて用いら
れる断片は、溶液に遊離した形態で存在するか、固体支持体へ付着した形態で存
在するか、細胞表面へ付着した形態で存在するか、或いは細胞内に存在するもの
であり得る。ＴＵＳＵＰと試験対象の薬剤との結合複合体形成を測定することが
できる。

【０１５９】 別の薬物スクリーニング技術によって、対象のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットのスクリーニングを行うことができる（
例えば、Geysenら (1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法では、ＴＵＳＵ
Ｐに適用する場合、多数の異なる小形の試験対象の化合物を、プラスチックピン
或いは他の表面のような固体基板上で合成する。この試験対象の化合物をＴＵＳ
ＵＰ又はその断片と反応させ、洗浄する。次に結合したＴＵＳＵＰを当分野で周
知の方法により検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術において使用す
るために、精製したＴＵＳＵＰをプレート上に直接コーティングすることもでき
る。或いは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定するこ
とができる。

【０１６０】 別の実施例では、ＴＵＳＵＰに結合し得る中和抗体が、ＴＵＳＵＰとの結合に
ついて試験対象の化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイ
を用いることができる。この方法では、抗体を用いて、ＴＵＳＵＰの１または２
以上の抗原決定基を共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる
。

【０１６１】 更に別の実施例では、現在までに開発されていない分子生物学上の技術であっ
ても、その新技術がヌクレオチド配列の現在までに知られている特性（例えば、
以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合のような特性）に
基づく技術であるならば、その技術においてＴＵＳＵＰをコードするヌクレオチ
ド配列を用いることができる。

【０１６２】 以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明をこの実施例に限定しよ
うとするものではない。

【０１６３】

【実施例】

１ LUNGAST01 ｃＤＮＡライブラリーの作製 LUNGAST01 ｃＤＮＡライブラリーを、頭部の外傷で死亡した年齢１７歳の白人
男性の肺組織から作製した。患者の既往症には、喘息が含まれていた。

【０１６４】 この冷凍組織を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000 （Brinkmann Ins
truments, Inc., Westbury, NJ）を用いて、グアニジニウムイソチオシアネート
溶液の中でホモジナイズし溶解した。溶解物を塩化セシウムクッションの上で遠
心分子し、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを酸性フェノールで抽出し、酢酸ナトリウ
ム及びエタノールを用いて沈殿させ、ＲＮアーゼの無い水に再懸濁し、ＤＮアー
ゼ処理した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、Qiagen Oligotex kit（QIAGEN, Inc., Cha
tsworth, CA）を用いて単離した。

【０１６５】 ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを合成し、SuperScript^TM Plasmid Sy
stem for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（品番18248-013; Gibco/BRL, G
aithersburg, MD）の推奨プロトコルに従ってLUNGAST01 ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム（品番275105, Pharmacia Amersh
am Biotech, Piscataway, NJ）上で分画化し、４００ｂｐを越えるサイズのｃＤ
ＮＡをpSport I（品番15382-013, Gibco BRL）に連結した。次にこの組換えたプ
ラスミドをDH12Sコンピテント細胞（品番18312-017, Gibco/BRL）に形質転換し
た。

【０１６６】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 プラスミドＤＮＡはこの細胞から放出され、これをREAL Prep 96 Plasmid Kit
（品番26173; QIAGEN, Inc.）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、
以下の点を変更した。（１）２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリ
セロールを含む１ｍｌの滅菌Terrific Broth （品番22711, Gibco/BRL）におい
て細菌を培養した。（２）培溶液を１９時間インキュベートした後、この細胞を
０．３ｍｌの溶解バッファーに溶解した。（３）イソプロパノール沈殿を行った
後、プラスミドＤＮＡのペレットを０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。このＤＮ
Ａサンプルは４℃で保管した。

【０１６７】 ３ 配列決定及び解析 ABI Catalyst 800（）またはHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV
）をPeltier Thermal Cyclers （MJ Research, Watertown, MA製のPTC200）と組
み合わせて用いて配列決定するためにｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡの配列
決定は、標準的なABIプトロコル、ベースコーリング（base-calling）ソフトウ
ェア及びキットを用いて、Sanger及びA.R. Coulsonの方法（1975, J. Mol. Biol
.94:441-448）によりABI 373または377 DNA Sequencing System（Perkin Elmer
）において行った。或いは、Amersham Pharmacia Biotech製の溶液及び色素を用
いてｃＤＮＡを配列決定した。リーディングフレームは、標準的な方法（Ausube
l. 前出）を用いて決定した。

【０１６８】 このｃＤＮＡ配列及び配列表の完全長ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配
列を問い合わせ配列として用いて、GenBankの霊長類（pri）、齧歯類（rod）、
哺乳動物（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）のデータベース、
SwissProt、BLOCKS、及び既に同定されたモチーフ及び配列が注釈付きで含めら
れている他のデータベース等のデータベースを検索した。一次配列パターン及び
二次構造ギャップペナルティを処理するSmith Waterman（Smith, T.ら (1992) P
rotein Engineering 5:35-51）のようなアルゴリズム及びBLAST （Basic Local
Alignment Search Tool; Altschul, S.F. (1993)J. Mol. Evol 36:290-300；及
びAltschui他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、及びHMM （隠れマルコフ
モデル（Hidden Markov Models）; Eddy, S.R.(1996) Cur. Opin. Str. Biol. 6
:361-365及びSonnhammer, E.L.L.他 (1997) Proteins 28:405-420）のようなプ
ログラム及びアルゴリズムを用いて、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の組立
て及び解析を行った。これらのデータベース、プログラム、アルゴリズム、方法
及びツールは既存の利用可能のものであり、Ausubel（前出, unit 7.7）、Meyer
s, R.A.（1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, Inc, New
York NY, p 856-853）、ソフトウェア（Genetics Computer Group (GCG), Madis
on Wl）によって提供される文書や、インターネットのウェブサイト上の文書に
記載されている。多くのデータベース及びツールをリストし、記述し、及び／リ
ンクしている２つの総合的なウェブサイトは、（１）the www resource in prac
tical sequence analysis（http://genome.wusti.edu/）、及び（２）the bibli
ography of computational gene recognition（http://linkage. rockefeiler.
edu/wli/gene/programs.html）である。例えば、第１のウェブサイトは、データ
ベースとしてPFAM（http://genome.wustl.edu/Pfam/）にリンクしており、HMMサ
ーチツール（http://genome.wustl.edu/eddy/cgi-bin/hmm_page.cgi）にもリン
クしている。

【０１６９】 表１には、ここで用いるデータベース及びツールの概要が記載されている。表
１の第１列には、ツール、プログラム、又はアルゴリズムが、表の第２列にはデ
ータベース名が、第３列には簡単な説明が記載されており、第４列には、（そこ
に記載がある場合は）２つの配列の間の一致度を決定するスコア（この値が高く
なる程相同性が高くなる）が記載されている。

【０１７０】 ４ ノーザン法による解析 ノーザン法解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、標識されたヌクレオチド配列と、特定の細胞タイプまたは組織のＲＮ
Ａが結合しているメンブランとのハイブリダイゼーションを行う（例えば、Samb
rook, 前出, ch. 7; 及びAusubel, F.M.ら 前出, ch. 4及び16参照）。

【０１７１】 BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank又はLIFESEQ^TMデ
ータベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベースにおいて同一の
又は近縁な分子を検索する。この解析にかかる時間は、複数回の膜をベースにし
たハイブリダイゼーションより非常に短時間である。加えて、特定の一致が正確
な一致に分類されるか、或いは類似なものに分類されるかを決定するべく、コン
ピュータ検索の感度を変えることができる。

【０１７２】 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義
されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
が考慮される。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。類似な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、これ
よりスコアの低いものは近縁な分子として同定される。

【０１７３】 ノーザン法による解析の結果は、ＴＵＳＵＰをコードする転写物が発生するラ
イブラリーのリストとして報告される。存在量（abundance）及びパーセント存
在率（percent abundance）も報告される。存在量は、ｃＤＮＡライブラリーに
特定の転写物が存在する回数を直接的に反映し、パーセント存在率は、存在量を
ｃＤＮＡライブラリーにおいて検出された配列の総数で除したものである。

【０１７４】 ５ ＴＵＳＵＰをコードする配列の延長 インサイト社クローンNo. 1988786の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド
配列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
一方のプライマーはアンチセンス方向の延長を開始するために合成し、他方のプ
ライマーはセンス方向に配列を延長するために合成した。これらのプライマーを
用いて、既知のＴＵＳＵＰ配列を「外側に」延長し、興味の対象の領域の新しい
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初めのプライマーは、
OLIGO^TM 4.06（National Biosciences, Plymouth, MN）、或いは他の適切なプロ
グラムを用いて設計したもので、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる
長さで、５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列
にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量
体化を生じるようなあらゆるヌクレオチドのストレッチは除いた。

【０１７５】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて、この配列を延
長した。２段階以上の延長が必要または望ましい場合は、既知領域をさらに延長
するための追加のプライマーの組を設計する。

【０１７６】 XL-PCR^TMキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物
とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。４０ｐｍｏｌ
の各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始
する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Reserch, Watertown MA）を
用いて、以下のパラメータ、即ち ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行った。

【０１７７】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、配列を延長する反応が成功したか
否かを決定した。最も大きな生成物即ちバンドを選択して、ゲルから切り出し、
QIAQuick^TM（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製し、Klenow酵素を用
いて一本鎖ヌクレオチドの延び出し（overhang）を切り取って、再結合及びクロ
ーニングを容易にする平滑末端を作った。

【０１７８】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トした。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な培養液内にある）を、３
μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地で培養
した（例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 1）。３７℃で１時間のイン
キュベーションの後、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani（L
B）寒天（例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 2）上にのせた。後日、
いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６
穴マイクロタイタープレートの各のウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ
／２ｘＣａｒｂ培地で培養した。さらに後日、各５μｌの終夜の培養物を非滅菌
９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、それぞれ５μｌのサンプ
ルをＰＣＲアレイに移した。

【０１７９】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のrTth ＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃縮
ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いら
れる遺伝子に特異的なプライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は
、以下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行った。

【０１８０】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上を走ら
せた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的ｃＤＮＡと比較して、適切なクローン
を選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。

【０１８１】 同様に、配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順を用いて５′
調節配列を得ること、５′方向の延長のために設計されたオリゴヌクレオチドを
得ること、及び適切なゲノムライブラリーを得ることが可能である。

【０１８２】 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列から作られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対
からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフ
ラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。OLIGO4.06（National Bioscience
）のような最新式のソフトウェアを用いてオリゴヌクレオチドを設計し、それぞ
れ５０ｐｍｏｌのオリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸
（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, B
oston, MA）とを結合することによって標識する。標識されたオリゴヌクレオチ
ドを、Sephadex G-25超微粒子樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI
）を用いて精製する。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコッ
トを、エンドヌクレアーゼAseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuP
ont NEN, Boston, MA）の１つを用いて消化したヒトゲノムＤＮＡの一般的な膜
を用いるハイブリダイゼーション解析において用いる。

【０１８３】 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）にトランスファーする。
ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取
り除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム水及び０．５％ドデシル
硫酸ナトリウムまでの、段階的にストリンジェンシーが増す条件下で室温にて順
次洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）をブロットに数時間
露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１８４】 ７ マイクロアレイ 化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でオリ
ゴマーを合成する（例えば、Baldeschweilerら, 前出, 参照）。更に別の方法で
は、ドットブロット法（スロットブロット法）で用いるものに類似したアレイを
用いて、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを用いて
、ｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に配置し結合させる。一般
的なアレイは、手作業により、又は市販の材料及び機械を用いることによって製
作することができ、適切な数のエレメントを有し得る。ハイブリダイゼーション
の後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き
、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた画像
を解析して、マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする核プローブの
相補性の程度及び相対的な存在量を評価することができる。

【０１８５】 完全長ｃＤＮＡまたは発現される配列タグ（ＥＳＴｓ）が、マイクロアレイの
エレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、例えばLASERG
ENE^TMのような周知のソフトウェアを用いて選択することができる。本発明のヌ
クレオチド配列の１つに対応する、又は本発明に関連するｃＤＮＡライブラリー
から無作為に選択された完全長ｃＤＮＡ又はＥＳＴｓを、適切な基板、例えばス
ライドガラス上に配置する。そのｃＤＮＡは、例えば、ＵＶ架橋処理の後に熱及
び化学薬品による処理を行って乾燥することによってスライドガラス上に固定す
る（例えば、Schena. Mら (1995) Science 270:467-470; 及びShalon, D.ら (19
96) Genome Res. 6:639-645）。基板上のエレメントへのハイブリダイゼーショ
ンのために蛍光プローブを作製して使用する。この基板を、上述の手順によって
解析する。

【０１８６】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＴＵＳＵＰをコードする配列或いはその任意の一部分に相補的な配列は、自然
発生のＴＵＳＵＰの発現を低下、即ち阻害するために用られる。約１５〜約３０
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より小さな或い
はより大きな配列フラグメントの場合でも基本的に同じ方法を用いることができ
る。OLIGO^TM4.06ソフトウェア及びＴＵＳＵＰのコーディング配列を用いて、適
切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが結
合しないようにする。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを
設計して、リボソームがＴＵＳＵＰをコードする転写物に結合しないようにする
。

【０１８７】 ９ ＴＵＳＵＰの発現 ＴＵＳＵＰの発現及び精製は、細菌又はウイルスをベースにした発現系を用い
て達成される。細菌におけるＴＵＳＵＰの発現のためには、ｃＤＮＡを、高いレ
ベルのｃＤＮＡの転写を誘導する誘導性プロモーターや構成物質耐性遺伝子を含
む適切な発現ベクター内にサブクローニングする。そのようなプロモーターの例
としては、以下に限定するものではないが、trp-lac（tac）ハイブリッドプロモ
ーター及びT5又はT7バクテリオファージプロモーターや、lacオペレーター制御
配列等が挙げられる。組換えベクターを、例えばBL21（DE3）のような適切な細
菌のホストに形質転換する。イソプロピル-1-チオ‐β-D-ガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）で誘導すると、構成物質耐性の細菌がＴＵＳＵＰを発現する。真核細胞にお
けるＴＵＳＵＰの発現は、バキュロウイルスとしてよく知られている、組換えAu
tographica californica多核体病ウイルス（AcMNPV）を、昆虫または哺乳動物の
細胞系に感染させることによって達成される。バキュロウイルスの非必須のポリ
へドリン遺伝子を、相同的組換えか、転移プラスミドによる媒介を用いる細菌媒
介遺伝子転移の何れかによってＴＵＳＵＰをコードするｃＤＮＡで置換する。ウ
イルスの感染力は維持され、かつ強力なポリヘドリンプロモーターが、高レベル
のｃＤＮＡの転写を誘導する。組換えバキュロウイルスを用いて、大抵の場合は Spondoptera frugiperda （Sf9）昆虫細胞に、場合によってはヒト肝細胞に感染
させる。後者の場合には、バキュロウイルスに追加の遺伝子の修飾を加えること
が必要である（Engelhard, E. K.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3
224-3227; Sandig, V.ら (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945参照）。

【０１８８】 大部分の発現系においては、例えば、粗製の細胞溶解物からの速やかな１ステ
ップでの組換え融合タンパク質のアフィニティ精製を可能にする、FLAG又は6-Hi
sのようなペプチドエピトープタグまたはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（
ＧＳＴ）を用いて、融合タンパク質が合成される。日本住血吸虫（Schistosoma
japonicum）に由来する２６キロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパ
ク質の活性及び抗原性を維持する条件の下で固定化グルタチオン（Pharmacia, P
iscataway, NJ）上での融合タンパク質の精製が可能となる。精製の後、ＧＳＴ
分子を、特異的に組換えられた部位において、タンパク分解によりＴＵＳＵＰか
ら切り離すことができる。８個のアミノ酸からなるペプチドであるＦＬＡＧによ
って、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Koda
k, Rochester, NY）を用いるイムノアフィニティ精製が可能となる。６個の連続
したヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金属キレート樹脂（QIA
GEN Inc, Chatworth, CA）上での精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製
のための方法は、Ausubel. F. M.ら(1995及び定期的な補遺) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10, 16に記載
されている。これらの方法によって得られた精製ＴＵＳＵＰを、以下の活性のア
ッセイにおいて直接用いることができる。

【０１８９】 １０ ＴＵＳＵＰの活性の立証 ＴＵＳＵＰの活性のin vitroアッセイでは、アンチセンスＴＵＳＵＰ ＲＮＡ
を過剰発現する正常なヒト線維芽細胞のトランスフォメーションを測定する（Ga
rkavtsev (1997), 前出）。ＴＵＳＵＰをコードするｃＤＮＡを、アンチセンス
ＴＵＳＵＰ ＲＮＡを発現させ得るpLNCXレトロウイルスベクターにサブクロー
ニングする。得られた作製物を、自己向性BOSC23ウイルスパッケージング細胞系
にトランスフェクトする。BOSC23培地の上清に含められたウイルスを用いて、両
栄養性AK8ウイルスパッケージング細胞系に感染させる。感染細胞を、以下の、
形質転換細胞の定量可能な特性、即ち接触阻害の消失に関連する培地における増
殖密度の増加、懸濁液または軟寒天における増殖、コロニーまたは中心（foci）
の形成、血清必要量の低下、及び免疫不全マウスに注射したときに腫瘍を誘導す
る能力について評価する。ＴＵＳＵＰの活性は、Ｈｓ６８細胞のトランスフォー
メーションの程度に比例する。

【０１９０】 １１ 機能分析アッセイ（Functianl assays） ＴＵＳＵＰの機能を、哺乳動物細胞培養系において、ＴＵＳＵＰをコードする
配列を生理学的に高いレベルで発現させることによって評価する。ｃＤＮＡを、
それを高レベルで発現させる強力なプロモーターを有する哺乳動物の発現ベクタ
ーにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、pCMV SPORT^TM（Life
Technologies, Gaithersburg, MD）及びpCR^TM 3. 1（Invitrogen, Carlsbad, C
A）等があり、両ベクターは共にサイトメガロウイルスのプロモーターを有して
いる。5〜10μgの組換えベクターをリポソーム製剤又はエレクトロポレーション
の何れかを利用してヒトの細胞系、好ましくは内皮細胞又は造血細胞を起源とす
る細胞系に一時的にトランスフェクトする。またマーカータンパク質をコードす
る配列を有する別のプラスミドを1〜2μg同時感染させる。マーカータンパク質
の発現は、トランスフェクト細胞を非トランスフェクト細胞から区別するための
手段となり、組換えベクターからのｃＤＮＡの発現の信頼できる予測が可能とな
る。選択できるマーカータンパク質としては、例えばGreen Fluorescent Protei
n（GFP）（Clontech, Palo Alto, CA）、CD64又はCD64-GFP融合タンパク質等が
挙げられる。GFP又はCD64−GFPを発現するトランスフェクト細胞を特定し、その
特性、例えばそのアポトーシス状態を評価するために、自動式のレーザー光を用
いる技術であるフローサイトメトリー（流動細胞計測法）（ＦＣＭ）を用いる。
ＦＣＭによって蛍光分子の取込みを検出し、定量細胞死の前又は細胞死と同時に
おこる事象を診断する。このような事象としては、ヨウ化プロピジウムでＤＮＡ
を染色することによって測定される核のＤＮＡ含量の変化、散乱光及び９０度横
向きの散乱光を当てることによって測定される細胞のサイズ及び粒状度の変化、
ブロモデオキシウリジンの取込みの低下によって測定されるＤＮＡ合成のダウン
レギュレーション、特異的抗体との反応性によって測定される細胞表面及び細胞
内のタンパク質の発現の変化、及びフルオレセイン結合アレキシンＶタンパク質
と細胞表面との結合によって測定される原形質膜の組成の変化等がある。フロー
サイトメトリーの方法は、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry, Oxford, Ne
w York, NYに記載されている。

【０１９１】 遺伝子の発現に対するＴＵＳＵＰの影響は、ＴＵＳＵＰをコードする配列及び
CD64又はCD64-GFPの何れかをトランスフェクトした高度に精製された細胞の集団
を用いて評価することができる。CD64及びCD64-GFPはトランスフェクト細胞の表
面で発現され、ヒト免疫グロブリンＧ（IgG）の保存領域に結合する。トランス
フェクト細胞は、ヒトIgG又はCD64に対する抗体の何れかでコーティングされた
磁性ビーズ（DYNAL, Lake Success, NY）を用いて非トランスフェクト細胞から
効率的に分離する。ｍＲＮＡの細胞からの精製は、当業者に周知の方法を用いて
行うことができる。ＴＵＳＵＰをコードするｍＲＮＡ及び目的の他の遺伝子の発
現は、ノーザンブロット法による解析又はマイクロアレイ技術によって解析する
ことができる。

【０１９２】 １２ ＴＵＳＵＰに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）（例えば、Harrington, M.G.
(1990) Methods Enzymol. 182:488-495参照）、又は他の精製技術を用いて実質
的に精製したＴＵＳＵＰを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化
し、抗体を作り出す。

【０１９３】 或いは、ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列をLASERGENE^TMソフトウエア（DNASTAR Inc
.）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを
合成し、当業者に周知の方法でこれを用いて抗体を産生させる。適切なペプチド
配列の選択及び抗体の産生の技術は当業者に周知である。Ｃ末端付近のエピトー
プ或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択については
、文献に記載されている（例えば、Ausubelら, 前出, ch. 11参照）。

【０１９４】 一般的に、１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsの
ペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し
、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ
）を用いる反応によってキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma, S
t. Louis, MO）に結合する（例えば、Ausubel他 (前出)参照）。フロイントの完
全アジュバント中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する
。得られた抗血清の抗ペプチド活性を試験するには、例えばペプチドをプラスチ
ックに結合し、１％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さ
らに放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０１９５】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＴＵＳＵＰの精製 自然発生のＴＵＳＵＰ或いは組換えＴＵＳＵＰを、ＴＵＳＵＰに特異的な抗体
を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イム
ノアフィニティーカラムは、CnBr-活性化 Sepharose（Pharmacia & Upjohn）の
ような活性化クロマトグラフィーレジンとＴＵＳＵＰ抗体とを共有結合で結合さ
せることにより構築する。結合の後、そのレジンを使用説明書の指示に従って、
ブロックし洗浄する。

【０１９６】 ＴＵＳＵＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを
ＴＵＳＵＰを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において
高イオン強度バッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＴＵＳＵＰとの結
合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素ま
たはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＴＵＳ
ＵＰを回収する。

【０１９７】 １４ ＴＵＳＵＰと相互作用する分子の同定 ＴＵＳＵＰ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（
例えば、Bolton 他 (1973) Biochem. J. 133:529参照）で標識する。マルチウェ
ルプレートのウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＴＵＳＵＰと
ともにインキュベートし、洗浄して、標識ＴＵＳＵＰ複合体を有するウェルをア
ッセイする。異なる濃度のＴＵＳＵＰを用いて得られたデータを用いて、候補の
分子とＴＵＳＵＰの会合、親和性、数の数値を計算する。

【０１９８】 本発明の範囲及び精神から逸脱しない本明細書に記載した本発明の方法及びシ
ステムの様々な改変は、当業者には明らかであろう。本発明は、特に好適な実施
例に関連して説明されているが、本発明の真の範囲は、そのような特定の実施例
に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或い
は関連分野の専門家には明らかな本発明の実施形態の様々な改変は、請求の範囲
内に含まれるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を
示す図。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TMソフトウェア（Hitachi Softwar
e Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｂ】 ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を
示す図。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TMソフトウェア（Hitachi Softwar
e Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｃ】 ＴＵＳＵＰのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を
示す図。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TMソフトウェア（Hitachi Softwar
e Engineering Co., Ltd., San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図２Ａ】 LASERGENE^TMソフトウェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を用いて作成した、ＴＵＳＵＰ（1988786；配列番号：１
）とｐ３３（GI 2183221；配列番号：３）との間のアミノ酸配列アライメントを
示す図。

【図２Ｂ】 LASERGENE^TMソフトウェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を用いて作成した、ＴＵＳＵＰ（1988786；配列番号：１
）とｐ３３（GI 2183221；配列番号：３）との間のアミノ酸配列アライメントを
示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・レランドアベニュー 2189 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B063 QA01 QA13 QQ02 QQ42 QQ53 QR55 QS34 4B064 AG01 AG26 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZB262 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号（SEQ ID NO）：１又は配列番号：１の断片のア
   ミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列との少なくとも９０％のアミノ酸配列同一
   性を有する、実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする、単離され精製され
   たポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドとの少なくとも９０％のポリ
   ヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体
   。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の
   下でハイブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製さ
   れたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 配列番号：２又は配列番号：２の断片のポリヌクレオチド
   配列を含む、単離され精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドとの少なくとも９０％のポリ
   ヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体
   。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する、単
   離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリ
    ペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含む、配
    列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリペプチドの製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項１のポリペプチドを適切な医薬用担体と共に含む
    医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する、精製され
    た抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 癌の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む、癌の処置又は予防方法。
18. 【請求項１８】 核酸を含む生物学的サンプルにおいて、配列番号：１の
    アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法
    であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドと、前記生物学的サンプルの核酸材料の少
    なくとも１つとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成す
    る過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおける前記ポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相互関係を有する、該過程とを含
    む、核酸を含む生物学的サンプルにおいて配列番号：１のアミノ酸配列を含むポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法。
19. 【請求項１９】 前記ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生
    物学的サンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅することを特徴とす
    る請求項１８に記載の方法。