JP2002504366A - ヒトプロテインキナーゼｃインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトＣキナーゼインヒビター（ＨＰＫＣＩ）及びＨＰＫＣＩを特定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＨＰＫＣＩの発現に関連する疾病の処置又は予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ヒトＣキナーゼインヒビターの核酸及びアミノ酸配列、及び癌、自
己免疫異常、及び認知障害の診断、処置、及び予防におけるこれらの配列の使用
法に関するものである。

【０００２】 （発明の背景） Ｃキナーゼ即ちプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、細胞の成長、分化、及び
他の反応について重要な、広く分布するシグナル伝達タンパク質のファミリーに
属する。ＰＫＣは、ホスホリパーゼＣの刺激を介して成長因子、ホルモン、及び
他の外部メッセンジャーによって活性化され、二次メッセンジャー、イノシトー
ル三リン酸、及びジアシルグリセロールを生成させる。ＰＫＣファミリーのメン
バーは全て有意な配列相同性を共有しており、タンパク質のリン酸化を介しての
シグナル伝達を行う。殆ど全ての種類の細胞は、１種類又は２種類以上のＰＫＣ
のアイソフォームを発現する。

【０００３】 ＰＫＣの内生インヒビターの活性は、ウシ、トリ、ネズミ、及びヒトの組織で
検出された。初めて完全な一次構造が分かったプロテインキナーゼＣの内生イン
ヒビター（ＰＫＣＩ−１）は、ウシの脳に由来するものであった（Pearson, J.D
.ら(1990) J. Biol. Chem. 265: 4583-4591）。ＰＫＣＩ−１は、ＰＫＣと相互 作用する特定の部位を有し、ＰＫＣの能力を抑制してリン酸化を行う。ウシの配
列に加えて、トウモロコシ、ラット、及びヒトの遺伝子から、ＰＫＣＩ−１の完
全なアミノ酸配列が類推された（Simpson G.Gら(1994) Biochem. Biophys. Acta
. 1222: 306-308; Waller S.J.及びMurphy D (1994) GenBank受入番号GI 493051
; 及びBrzoska P.M.ら(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 7824-7828）。ウシ のＰＫＣＩ−１は、亜鉛（Ｚｎ）結合タンパク質であることが分かった（Simpso
nら, 前出）。Ｚｎ結合部位は、１１個のアミノ酸からなる断片に局在していた （Mozierら (1991) FEBS Lett. 279:14-18）。そのＺｎ結合ドメインは、他のＰ
ＫＣＩ−１分子においても保存されている。

【０００４】 ＰＫＣの活性化は、多くの化学療法的な癌に対する処置が失敗する場合の最も
大きな要因である多剤耐性（ＭＤＲ）において重要な役割を果たす（Grunicke H
.ら (1994) Ann. Hematol. 69:S1-S6）。ＰＫＣは、例えばｆｏｓ、ｊｕｎ、グ ルタチオンＳトランスフェラーゼ、デオキシ−チミジンモノフォスファーテシン
ターゼ、メタロチオネイン、及びｍｄｒ−１−コード化Ｐ−糖タンパク質等のよ
うな癌細胞の薬物耐性を生じさせるように作用するタンパク質を調節する。この
調節はリン酸化を介して機能を発揮し、これらのタンパク質をコードする遺伝子
の転写の増加をもたらす。逆に、ＰＫＣインヒビター又はアンタゴニストは、Ｐ
ＫＣのリン酸化機能を妨げ、ＭＤＲを媒介する遺伝子の発現を低下させる。その
ＭＤＲにおける役割に加えて、ＰＫＣの活性化は、多くの場合、腫瘍の促進にお
いて重要な事象である（O'Brian C.A.及びWard N.E. (1989) Cancer Metastasis
Rev. 8: 199-214; O'Brian C.A.ら (1995) Prog. Clin. Biol. Res. 391: 117-
120）。例えば、ＰＫＣ−αは、成長促進遺伝子Ｒａｆ−１をリン酸化し、活性 化する（Kolch W.ら (1993) Nature 364: 249-252）。ＰＫＣに誘導されたＲａ ｆ−１の活性化が無いと、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換する能力が著しく阻害さ
れる。従って、ＰＫＣインヒビター（ＰＫＣＩ）は、有望な癌の治療薬である。

【０００５】 ＰＫＣは、学習及び記憶の基礎となる分子の事象のシーケンスに関与する（Ol
ds J.L.及びAlkon D.L. (1991) New Biol. 3: 27-35）。ＰＫＣｓの細胞におけ る分布は細胞における記憶の蓄積の結果変化し、このことが記憶と学習における
作用を立証している（Saito N.ら (1994) Brain Res. 656: 245-256）。ＰＫＣ γ変異体マウスは、空間的な及び前後関係の学習における軽度の欠如を示し、こ
れも学習と記憶についてのＰＫＣｓの関与を示す（Abeliovich A.ら (1993) Cel
l 75: 1263-1273）。記憶力の低下は、アルツハイマー病の主な特徴及び初期の 徴候の一つである。

【０００６】 ＰＫＣは、様々な細胞の種類においてアポトーシスとしても知られるプログラ
ムされた細胞死を促進するべく様々な方式で作用し得る。ＰＫＣは、アポトーシ
スを引き起こす他のカルシウム依存性酵素の活性化を阻害し得る（Lucas M.ら (
1995) Gen. Pharmacol. 26: 881-887）。セラミド（ceramide）による脱リン酸 化酵素の活性化及びスフィンゴシン（sphingosine）によるＰＫＣの阻害は、ア ポトーシスに至るスフィンゴミエリン経路を媒介する。推定上のＰＫＣの標的ｐ
３４ｃｄｃ２は、その活性がＤＮＡ複製の完了から分離されたとき、アポトーシ
スを促進する。加えて、ｐ２１Ｒａｓは増殖応答を媒介し、かつＰＫＣ活性の阻
害の後に細胞がアポトーシスになり易くもする（Chen C.Y.ら (1996) J. Biol.
Chem. 271: 2376-2379）。Ｆａｓに媒介されるアポトーシス経路がノックアウト
されたマウスのＴリンパ球は、自己反応性Ｔ細胞に対するに対する選択について
ＰＫＣ依存性アポトーシス機構に依存している（Ohkusu Kら (1995) Eur. J. Im
munol. 25: 3180-3186）。従って、ＰＫＣは免疫細胞の八つにおける一定の役割
を有する。サイコスポニンｂ２（saikosponin b2）は、ＰＫＣ活性のダウンレギ
ュレーションによってＢ１６メラノーマ細胞におけるアポトーシスを誘導する（
Zongら (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 219: 480-485）。更に、ＩＣ Ｅ様プロテアーゼによるＰＫＣδのタンパク分解活性は、ヒト腫瘍細胞系Ｕ−９
３７におけるアポトーシスを促進する（Emoto Y.ら (1995) EMBO J. 14:6148-51
56）。

【０００７】 ＰＫＣインヒビターあ、正常な細胞及び疾病状態の細胞におけるＰＫＣ活性を
変化させ得ることを示唆する明らかな証拠が存在する。例えば、ＰＫＣインヒビ
ターは、in vitro及びin vinoの療法で癌細胞の成長を阻害することが分かった （Levetzki A. (1994) Eur. J. Biochem. 226: 1-13）。合成ＰＫＣインヒビタ ーであるビスインドリルマレイミド（bisindolylmaleimide）ＧＦ１０９２０３ Ｘ（ｂｉｓｉ）は、２つの経路の一方で神経芽細胞腫細胞系Ｎｅｕｒｏ−２Ａに
影響を及ぼし得る。血清が無い場合には神経突起の成長はｂｉｓｉによって増強
され、血清がある場合にはアポトーシスが生ずる（Behrens M.M.らCell Growth
Differ. (1995) 6: 1375-1380）。ヒペリシン、スタウロスポリン、タモシキフ ェン、及びホルボールエステルＰＭＡ等のような他のＰＫＣインヒビターは、ヒ
ト神経芽細胞腫細胞系ＳＫ−Ｎ−ＳＨにおいてアポトーシスを誘導する（Zhang
W.ら (1995) Cancer Lett. 96: 31-35）。ＰＫＣインヒビターは、免疫異常につ
いても用途を有し得る。ＰＫＣインヒビターＨ−７は、Ｆａｓ^-マウスＴリンパ 球においてアポトーシスを誘導する（Ohkusuら, 前出）。

【０００８】 新規なＣキナーゼインヒビター及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見
によって、癌、自己免疫異常、及び認知障害の診断、処置、及び予防において役
立つ新規な組成物が提供されて当分野における必要性が満たされる。

【０００９】 （発明の概要） 本発明は、新規なヒトＣキナーゼインヒビター（ＨＰＫＣＩ）、ＨＰＫＣＩを
コードするポリヌクレオチド、及び癌、自己免疫異常、及び認知障害の診断、処
置、及び予防のためのこれらの組成物の使用法の発見に基づくものである。

【００１０】 本発明は、配列番号（SEQ ID NO）：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配 列を有する実質的に精製されたポリペプチドを提供する。

【００１１】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列と少なく
とも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する
。また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有するポリペプ
チドをコードする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発
明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌクレオチド配列同
一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体を包含する。

【００１２】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハ
イブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供すると共に、配
列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提
供する。

【００１３】 また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片のポリヌクレオチド配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチド、及び配列番号：２又は配列番号：
２の断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと少なくとも９０％の
ポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異
体を提供する。また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片を含むポリ
ヌクレオチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１４】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを提供
する。別の実施態様では、前記発現ベクターが宿主細胞に含められる。

【００１５】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件
の下で、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿
主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回
収する過程とを含む、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有するポリ
ペプチドの製造方法を提供する。

【００１６】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有する実質的に
精製されたポリペプチドと、適切な医薬用担体とを含む医薬品組成物を提供する
。

【００１７】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を有するポリペプ
チドと結合する精製された抗体を包含すると共に、前記ポリペプチドの精製され
たアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを包含する。

【００１８】 また本発明は、癌の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要な患者
に、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製
されたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含む、癌の処
置又は予防方法を提供する。

【００１９】 また本発明は、自己免疫異常の処置又は予防方法であって、そのような処置が
必要な患者に、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する実
質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含
む、自己免疫異常の処置又は予防方法を提供する。

【００２０】 また本発明は、認知障害の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要
な患者に、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する実質的
に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含む、
認知障害の処置又は予防方法を提供する。

【００２１】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいて配列番号：１又は配列番
号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを検出する方法であって、（ａ）配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な分子と、
前記生物学的サンプルの前記核酸の少なくとも１種類とをハイブリダイズさせ、
ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼー
ション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存
在が、前記生物学的サンプルにおける配列番号：１又は配列番号：１の断片のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相互関
係を有する、該過程とを含む、核酸を含む生物学的サンプルにおいて配列番号：
１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを検出する方法を提供する。或る実施態様では、ハイブリダイゼ
ーションを行う過程の前に、前記生物学的サンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反
応法により増幅する。

【００２２】 （発明の実施の形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、及び方法について説明する前に、本
発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試
薬に限定されず、それらは様々に変更可能であることを理解されたい。また、本
明細書において用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いら
れたものであり、請求項の記載のみによって限定される本発明の範囲を限定する
ことを意図したものではないということも理解されたい。

【００２３】 本明細書の発明の詳細な説明又は図面及び特許請求の範囲において、単数を表
す「或る」及び「その（この）」と形容されたものは、前後関係でそうでないこ
とが明らかである場合以外は、複数の意味も含んでいることに注意しなければな
らない。従って、例えば「或る宿主細胞」なる表記が表すものには、複数のその
ような宿主細胞が含まれ、「或る抗体」なる表記は、１種または複数の種類の抗
体及び当業者に周知のその等価物等も表している。

【００２４】 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと
同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発
明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料を
本明細書において説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連
において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し
開示する目的で引用されたものであり、引用により本明細書の一部とする。また
本明細書のあらゆる開示内容を、本発明におけるそのような開示内容が従来技術
に先行しないということを認めるものと解釈してはならない。

【００２５】 （定義） 本明細書において、「ＨＰＫＣＩ」は、任意の種、具体的にはウシ、ヒツジ、
ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒト等のような哺乳動物に由来し、天然の
、合成の、半合成の、又は組換え体の何れかの起源から得られる実質的に精製さ
れたＨＰＫＣＩのアミノ酸配列である。

【００２６】 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＨＰＫＣＩに結合したときＨＰＫ
ＣＩの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニス
トには、ＨＰＫＣＩに結合し、その効果を変調するタンパク質、核酸、糖質や、
任意の他の分子が含まれ得る。

【００２７】 本明細書において「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＨＰＫＣＩをコード
する遺伝子の対立形である。アレルは、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によ
って生じ、変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、その変異したｍＲ
ＮＡ或いはポリペプチドの構造や機能が変わる場合もあれば変わらない場合もあ
る。所定の天然の遺伝子または組換え遺伝子には、アレル形が存在しないもの、
１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレルを生じる変異
はヌクレオチドの自然な欠失、付加並びに置換に因るものである。このタイプの
変異はそれぞれ単独で、或いは他の変異と同時に、所定の配列内で１回又は２回
以上生じ得る。

【００２８】 本明細書において、ＨＰＫＣＩをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ
クレオチド残基の置換、挿入や欠失を含み、結果的に同一のＨＰＫＣＩ、または
ＨＰＫＣＩの機能的な特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドとなるものである。この定義には、ＨＰＫＣＩをコードするポリ
ヌクレオチド配列の通常の染色体上の遺伝子座以外の座位を有する多型、アレル
との不適切なまたは予期しないハイブリダイゼーションによって起こる多型、及
びＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて容易に検出可能な、或いは検出が困難な多型が含まれている。コード
されたタンパク質も同様に「変異」したものであり得、サイレント変異を生じ、
結果的に機能的に等価なＨＰＫＣＩとなるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換
を含むものであり得る。意図的なアミノ酸の置換は、ＨＰＫＣＩの生物学的活性
が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親
媒性についての類似性に基づいて生じさせることができる。例えば負に荷電した
アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸
にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親水性値を有する荷電していない極性
頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、及びバリン；グリシン及
びアラニン；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；及びフェニ
ルアラニン及びチロシンが含まれる。

【００２９】 本明細書において「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペ
プチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、又はそれらの何れかの断片であ
り、自然発生の分子又は合成した分子である。この文脈で、「断片」、「免疫原
性断片」又は「抗原性断片」は、ＨＰＫＣＩの断片で、好ましくは約５個〜約１
５個のアミノ酸からなる長さを有し、かつＨＰＫＣＩの生物学的活性又は免疫学
的活性を保持しているものである。ここで、「アミノ酸配列」が自然発生タンパ
ク質分子のアミノ酸配列を指している場合に、「アミノ酸配列」や類似の用語は
、そのアミノ酸配列を本明細書に記載のタンパク質分子に関連する完全で元のま
まのアミノ酸配列に限定する意味で用いられているわけではない。

【００３０】 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なるコピーを生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて行われる
（例えばDieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laborato ry Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp.1-5参照）。

【００３１】 本明細書において、用語「アンタゴニスト（拮抗物質）」は、ＨＰＫＣＩに結
合したとき、ＨＰＫＣＩの生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下させたり、
効果の継続時間を短縮させる分子である。アンタゴニストとしては、ＨＰＫＣＩ
の効果を低下させるタンパク質、核酸、糖質、抗体、または他の分子等が挙げら
れる。

【００３２】 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味するとともに、例
えばＦａ、Ｆ（ａｂ'）₂、及びＦｖ断片のような抗原決定基と結合し得るその断
片を意味する。ＨＰＫＣＩポリペプチドに結合する抗体は、免疫化の抗原として
完全なポリペプチド又は目的の小ペプチドを含むその断片を用いることによって
作り出すことができる。動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫化
するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来するも
の、又は化学的に合成されたものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合さ
せることができる。ペプチドに化学的に結合する担体として通常用いられるもの
としては、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及びキーホールリンペット
ヘモシアニン（ＫＬＨ）等が挙げられる。この結合したペプチドを用いて動物を
免疫化する。

【００３３】 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と結びつく分子の断片
（即ちエピトープ）である。タンパク質又はその断片を用いてホストの動物を免
疫化すると、このタンパク質の様々な領域が、該タンパク質上の所定の領域また
は三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。このような領域また
は構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について元の抗原（
即ち免疫応答を誘導するに用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３４】 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「
センス」鎖に相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子としてはペ
プチド核酸があり、アンチセンス分子は合成や転写を含む任意の方法で作り出す
ことができる。この相補的ヌクレオチドは、一旦細胞内に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、これが更なる転写や翻訳
を阻害する。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖の意味で用いられ、
「プラス（＋）」はセンス鎖の意味で用いられることがある。

【００３５】 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造上の機
能、調節の機能、又は生化学的な機能を有するタンパク質である。同様に「免疫
学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＨＰＫＣＩ、若しくはそのオ
リゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗
体に結合する能力である。

【００３６】 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩濃度及び
温度条件の下で、塩基対を形成してポリヌクレオチド同士が自然に結合すること
である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する
。２本の一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する「部分的」なも
のであるか、若しくは、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相
補的なものであり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダ
イゼーションの効率及び強さに有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の
結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使
用において特に重要である。

【００３７】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」又は「所定の
アミノ酸配列を含む組成物」とは、所定のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を
含むあらゆる物質をさす。この組成物は、粉末製剤、水溶液、又は滅菌組成物の
形態であり得る。ＨＰＫＣＩ又はＨＰＫＣＩの断片をコードするポリヌクレオチ
ド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用することが
できる。このプローブは凍結乾燥した状態で保存することができ、糖質のような
安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプ
ローブを、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（
例えばデンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させておく
ことができる。

【００３８】 本明細書において「コンセンサス配列」は、配列決定し直して不要な塩基を分
離し、XL-PCR^TM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５′方向及び／または ３′方向に延長した上で再度配列決定し直した核酸配列か、または断片を組み合
わせるためのコンピュータプログラム（例えばGELVIEW^TM Fragment Assembly sy
stem, GCG, Madison WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した 配列を組み合わせて導き出した核酸配列である。延長と組み合わせの両方によっ
てコンセンサス配列が作られることもある。

【００３９】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相互関係を有する」なる表現
は、ノーザン法による解析でＨＰＫＣＩをコードする核酸と同一又は近縁関係に
ある核酸の存在が検出されることが、サンプル内のＨＰＫＣＩをコードするｍＲ
ＮＡの存在を表し、従ってＨＰＫＣＩをコードする遺伝子からの転写物の発現と
相互関係を有している、ということを表している。

【００４０】 本明細書において「欠失」は、１個または２個以上のヌクレオチド若しくはア
ミノ酸残基が欠けるような、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
である。

【００４１】 本明細書において、用語「誘導体」は、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオ
チド配列又はそれに相補的なポリヌクレオチド配列を化学的に修飾したものであ
る。このようなポリヌクレオチド配列の化学的修飾としては、例えば、水素から
アルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。誘導体ポリヌクレオチド
は、元の分子の生物学的又は免疫学的機能の少なくとも１つを保持しているポリ
ペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポリペプチドの生物学的又
は免疫学的機能の少なくとも１種類を保持しており、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化（PEGylation）、又は他の何らかのプロセスで修飾されたもので
ある。

【００４２】 本明細書において、用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。用語「
（配列）同一性」は、用語「相同性」と置換えることができる。同一の配列が標
的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的
な配列を、「実質的に相同」という。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブ
リダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシー（厳密さ）を低くした条件の下
で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロッ
ト法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に
相同な配列またはプローブは、低いストリンジェンシー条件の下で、標的の配列
と完全に相同な配列またはプローブとの結合（即ちハイブリッド形成）について
競合し、それを阻害する。このことは、低いストリンジェンシー条件が、非特異
的な結合を許容するものであることを意味するわけではない。低いストリンジェ
ンシー条件では、２つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であ
ることが必要だからである。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の
相補性（即ち約３０％未満の相同性即ち同一性）も有していない第２の標的配列
を用いることにより調べることができる。非特異的結合が存在しない場合、プロ
ーブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。

【００４３】 「パーセント同一性」或いは「％同一性」という言いまわしは、２以上のアミ
ノ酸または核酸配列を比較した際の配列類似性のパーセンテージである。パーセ
ント同一性は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用 いることによって電子的に求めることができる。このMegAlign^TMプログラムは、
異なる方法、例えばCLUSTAL V法（例えばHiggins, D.G.及びP.M. Sharp (1988)
Gene 73:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメントを作成することが できる。このCLUSTAL Vのアルゴリズムでは、配列群を、全ての配列の対につい て両配列間の距離を調べることによってクラスタ（集団）にグループ分けする。
このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグループにおいて
アライメントをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列Ｂの間のパーセ
ント類似性は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基の数−配列Ｂにお
けるギャップ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基の一致の総数）×１０
０で計算する。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無いケースは、パ
ーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント同一性も、他の
周知の方法、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990) Methods Enzymol. 18
3: 626-645参照）によってカウント即ち計算することができる。配列間の同一性
は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変えることによって
も決定することができる。

【００４４】 「ヒト人工染色体」（ＨＡＣｓ）は約１０ｋｂ〜１０ｍｂのサイズのＤＮＡ配
列を含んでいるものであり得、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全て
の要素を含む線状の小形染色体である（例えばHarrington, J.J.他 (1997) Nat
Genet. 15:345-355参照）。

【００４５】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、その元の結合能をそのまま保持し
つつ、ヒトの抗体により近づくように非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した
抗体分子である。

【００４６】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は
、核酸の鎖が塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程である。

【００４７】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩
基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、
２つの核酸配列で形成された複合体である。ハイブリダイゼーション複合体は、
溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析の場合）、或いは核酸は溶液
中に存在する一方の核酸と、固体支持体（例えば細胞やその核酸が固定される紙
、メンブラン、フィルター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板
）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００４８】 本明細書において、用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較し
て、１個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような
、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００４９】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものであり得る。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する
様々な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産
生によって特性化され得る。

【００５０】 本明細書において、用語「マイクロアレイ」は、個々のポリヌクレオチド又は
オリゴヌクレオチドを基板上に高密度で配列したものである。基板としては、例
えば紙、ナイロン又は他の種類のメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、
又は他の任意の適切な固体支持体等がある。

【００５１】 本明細書において、マイクロアレイに関連して用いられる用語「エレメント」
または「アレイエレメント」とは、基板の表面上に配列されたハイブリダイズ可
能なポリヌクレオチドである。

【００５２】 本明細書において、用語「変調」は、ＨＰＫＣＩの活性の変化である。例えば
、変調によって、タンパク質の活性の増加や減少、結合特性の変化、又は他のＨ
ＰＫＣＩの生物学的、機能的、免疫学的特性の変化がもたらされる。

【００５３】 本明細書において「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、又はその断片を指すか、一本鎖か二本鎖であり、ま
たセンス鎖又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源の若しくは合成したＤＮＡ又
はＲＮＡを指すか、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、ＤＮＡ様又はＲＮＡ様
物質である。この文脈において、「断片（フラグメント）」は、長さが６０ヌク
レオチド以上の核酸配列であり、最も好ましくは、長さが１００ヌクレオチド以
上又は１０００ヌクレオチド以上、及び１００００ヌクレオチド以上の断片であ
る。

【００５４】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結びついた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモーターは、そのプロモーターが、コ
ードされるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列の機能的に関連
又は機能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸
配列は近接し読み枠にあり得るが、ある種のゲノムの配列、例えばリプレッサー
遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそのポリペプ
チドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。

【００５５】 本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリ
ダイゼーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配
列であって、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適に
は１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを
指す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野において一般
に定義されているような用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー
」、及び「プローブ」と実質的に同義である。

【００５６】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、末端がリジンであるアミノ
酸残基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌ
クレオチドを含むアンチセンス分子即ち抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンが
この物質に溶解性を与えている。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優
先的に結合して転写物の伸長を止め、かつＰＮＡをポリエチレングリコール化す
ることにより、細胞でのその寿命を延ばすことができる（例えばNielsen, P.E. 他(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63参照）。

【００５７】 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている
。ＨＰＫＣＩをコードする核酸またはその断片またはＨＰＫＣＩ自体を含む疑い
のある生物学的サンプルには、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官
、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または固体支持体に結合し
た）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、組織や、組織プリント（tiss
ue print）その他が含まれる。

【００５８】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タン
パク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストとの相互作用で
ある。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質上の特定の
構造（即ち抗原決定基、即ちエピトープ）の存在に左右される。例えば、抗体が
エピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した「Ａ」及びその抗体を含
む反応において、エピトープＡ（つまり結合していない、非標識のＡ）を含むタ
ンパク質が存在すると、抗体が結合した標識したＡの量が低下する。

【００５９】 本明細書において、用語「ストリンジェントな（厳密な）条件」は、ポリヌク
レオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチド配列との間のハ
イブリダイゼーションを許容する条件を指す。適切なレベルのストリンジェント
な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション領
域における塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダイゼーション温度によっ
て決定することができ、当分野でよく知られている。詳述すると、ストリンジェ
ンシー（厳密さ）は、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇さ
せること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることによって高めることが
できる。

【００６０】 例えば、高いレベルのストリンジェントな条件の下でのハイブリダイゼーショ
ンは、約３７℃〜４２℃における約５０％のホルムアミド濃度で生じ得る。低い
レベルのストリンジェントな条件の下でのハイブリダイゼーションは、約３０℃
〜３５℃の温度での約３５％〜２５％のホルムアミド濃度で生じ得る。詳述する
と、高いストリンジェンシーの条件の下でのハイブリダイゼーションは、５０％
のホルムアミド濃度、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌ
の同じ長さに切り揃え変性させたサケ精子ＤＮＡを用いて４２℃で生じ得る。低
いストリンジェンシーの条件の下でのハイブリダイゼーションは、上述の条件で
、温度を３５℃に下げ、ホルムアミド濃度を３５％にした時に生じ得る。特定の
レベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的の核酸のプリン対ピリ
ミジン比を計算し、それに従って温度を調節することによって更に狭めることが
できる。上述の温度範囲及び条件の変更については当分野で周知である。

【００６１】 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、単
離または分離されて、自然にはそれが結合して存在する他の構成要素が６０％以
上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去された核酸配列又は
アミノ酸配列である。

【００６２】 本明細書において「置換」は、１個または２個以上のヌクレオチド或いはアミ
ノ酸を、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることである。

【００６３】 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入ってレシピエント細胞
を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた様々な方法を
用いて、自然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原
核生物または真核生物の宿主細胞に挿入するための既知の方法によって行うこと
ができる。この方法は形質転換される宿主細胞の型に基づいて選択され、以下に
限定するものではないが、ウイルスを感染させる方法、電気穿孔法（エレクトロ
ポレーション）、熱ショック、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法等
があり得る。用語「形質転換された」細胞は、そのなかで挿入されたＤＮＡが、
自律的に複製するプラスミドか、または宿主の染色体の一部として複製できる、
安定的に形質転換された細胞等である。またこのような細胞には、限られた時間
での挿入されたＤＮＡやＲＮＡの一過性の発現が起こる細胞もある。

【００６４】 本明細書においてＨＰＫＣＩの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が
変化したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得
、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合の
ように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異
体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例えばグ
リシンがトリプトファンで置換される。類似した小さな変化として、アミノ酸の
欠失か挿入、若しくはその両方が含まれる。生物学的或いは免疫学的活性を損な
わずに置換、挿入、又は欠失させることができるアミノ酸は何れかということは
、例えばLASERGENE^TMソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用 いて決定することができる。

【００６５】 （発明） 本発明は、新規なヒトＣキナーゼインヒビター（ＨＰＫＣＩ）、ＨＰＫＣＩを
コードするポリヌクレオチド、及び癌、自己免疫異常、及び認知障害の診断、処
置、又は予防のためのこれらの組成物の使用法の発見に基づくものである。

【００６６】 本発明のＨＰＫＣＩをコードする核酸は、肺癌ｃＤＮＡライブラリー（SININO
T04）を起源とするインサイト社クローンNo. 2922091において、アミノ酸配列ア
ライメントのコンピュータ検索を用いて初めに特定された。コンセンサス配列の
配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列、即ちインサイト社
クローンNo. 2922091（SININOT04が起源）、2516629（LIVRTUT04が起源）、及び
3363861（PROSBPT02が起源）から導き出されたものである。

【００６７】 或る実施態様では、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示す、配列番号
：１のアミノ酸を含むポリペプチドを包含する。ＨＰＫＣＩは１８２個のアミノ
酸からなる長さを有し、かつ、７番目のＮ（以下、Ｎ（７番）のように表記する
。）及びＮ（１２２番）に２個のＮグリコシル化可能部位を、Ｔ（１１６番）に
１個のカゼインキナーゼＩＩリン酸化可能部位を、Ｔ（９８番）に１個のプロテ
インキナーゼＣリン酸化可能部位を、及びＹ（４４番）に１個のチロシンキナー
ゼリン酸化可能部位を有する。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ＨＰＫＣＩは、
ヒト由来のＰＫＣＩ−１（GI 1256264；配列番号：３）及び線虫由来のＣＰＫＣ
Ｉ（GI 1255376；配列番号：４）と化学的及び構造的相同性を有する。詳述する
と、ＨＰＫＣＩとＰＫＣＩ−１とは２３％の配列同一性を有し、ＨＰＫＣＩとＣ
ＰＫＣＩとは２３％の配列同一性を有する。加えて、ＨＰＫＣＩは、ＰＫＣＩ−
１及びＣＰＫＣＩと幾つかのリン酸化可能部位を共通に有する。ノーザン法によ
る分析の結果から、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる。その
ようなライブラリーの少なくとも５０％は不死化又は癌性組織関連のものであり
、少なくとも２２％は免疫応答関連のものである。特に注目すべきは、乳房及び
前立腺の腫瘍におけるＨＰＫＣＩの発現である。

【００６８】 また本発明は、ＨＰＫＣＩの変異体を包含する。好ましいＨＰＫＣＩ変異体は
、ＨＰＫＣＩの機能的又は構造的特徴の少なくとも１種類を有し、ＨＰＫＣＩア
ミノ酸配列との、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最
も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。

【００６９】 また本発明は、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の
実施態様では、本発明は、ＨＰＫＣＩをコードする、配列番号：２の配列を含む
ポリヌクレオチド配列を包含する。

【００７０】 また本発明は、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド配列の変異体を包含
する。詳述すると、そのような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＨＰＫＣＩをコ
ードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約８０％、より好ましくは少な
くとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同
一性を有する。本発明の特定の実施態様は、配列番号：２との、少なくとも約８
０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％
のポリヌクレオチド配列同一性を有する配列番号：２の変異体を包含する。上述
のポリヌクレオチド変異体の何れかが、ＨＰＫＣＩの機能的又は構造的特徴の少
なくとも１種類を有するアミノ酸配列をコードし得る。

【００７１】 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多
種のＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明
は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作り出される
あらゆる可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは
、自然発生のＨＰＫＣＩのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプ
レット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような変異は全てここ
に具体的に開示されたものと考えられたい。

【００７２】 ＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列及びその変異体は、適切に選択され
たストリンジェンシーの条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズ可能であるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを有しているＨＰＫＣ
Ｉ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得
る。コドンの選択においては、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従
って、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を
高めるように選択することができる。ＨＰＫＣＩ及びその誘導体をコードするヌ
クレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列が変わらないように実質的に改変
する他の理由として、例えば自然発生配列から作られる転写物より長い半減期の
ような、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すことが挙げられる。

【００７３】 本発明の範囲には、ＨＰＫＣＩ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそ
の断片の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製した後、この合成
遺伝子を、周知の試薬を用いて入手可能な様々な発現ベクター及び細胞系に挿入
することができる。更に、合成ケミストリを用いてＨＰＫＣＩをコードする配列
又はその任意の断片に突然変異を導入することができる。

【００７４】 また本発明の範囲に含まれるものとして、様々なストリンジェンシーの条件の
下で請求項に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２又は配列番号：２の断
片のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列がある（例
えばWahl, G.M. 及びS.L.Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399-407; 及びK
immel, A.R. (1987) Methods in Enzymol. 152:507-511参照）。

【００７５】 ＤＮＡシークエンシングの方法は、周知で当業者が通常利用可能であり、本発
明の実施例の何れかの実施のために用いることができる。この方法では、例えば
ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントであるSequenase（US Biochemical
Corp. Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメ ラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）から発
売されているELONGASE Amplification Systemに見られるもののような校正エキ ソヌクレアーゼと組換え体ポリメラーゼとの組み合わせたもののような酵素を用
いることができる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno
, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch, Watertown MA）並びに
ABI Catalyst及びABI377及び377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）のような装置 を用いて自動化するのが好ましい。

【００７６】 ＨＰＫＣＩをコードする核酸配列を、部分的なヌクレオチド配列を利用して、
周知の様々な方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節エレメントのような
上流の配列を検出することができる。例えば、使用可能な方法の一つである制限
部位ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の位置に隣接する未知の配列を
得る（例えばSarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322参照）。詳述す
ると、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に特異的なプライマー及びリンカー配列
に対するプライマーの存在の下で増幅する。増幅された配列を、同じリンカープ
ライマーと最初のプライマーの内に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣ
Ｒの２回目を実施する。各回のＰＣＲの産物を、適切なＲＮＡポリメラーゼを用
いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。

【００７７】 既知の領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増幅、または延長のた
めに、逆ＰＣＲ法を用いることもできる（例えばTriglia, T.他（1988）Nucleic
Acids Res 16:8186参照）。プライマーは、OLIGO 4.06 Primer Analysis softw
are（National Biosciences Inc., Plymouth MN）のような市販のソフトウェア や他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が
５０％以上、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計す
る。この方法では数種の制限酵素を用いて遺伝子の既知の領域の適当な断片を作
り出す。次にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、ＰＣＲ用の鋳型
として使用する。

【００７８】 使用できる別の方法にキャプチャＰＣＲ法があり、この方法ではヒト及び酵母
菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅
する（例えばLagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119参照）。
この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素による消化及び連結によって
そのＤＮＡ分子の未知の断片のなかに、組換え二本鎖配列を組み入れておくこと
もできる。未知の配列を得るために別の方法を用いることができる（例えばPark
er, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res 19:3055-3060参照）。更に、ＰＣＲ、入
れ子プライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行
を行うことができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリ
ーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すの
に有用である。

【００７９】 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときには、より大きなｃＤＮＡを含むよ
うにサイズ選択されたライブラリーを用いるのが好ましい。またランダムプライ
ミングした（random primed）ライブラリーは、遺伝子の５′領域を含む配列を より多く含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライブラリーを
用いることは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーでは完全長ｃＤＮＡが得られない場
合に特に好ましい。またゲノムライブラリーは、転写されない５′調節領域まで
配列を延長するために有用であり得る。

【００８０】 シークエンシングやＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したりその
存在を確認するために、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることがで
きる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための
流動性ポリマー、レーザーで活性化される４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチ
ドに対して１種類）を使用し、ＣＣＤカメラを用いて放射された波長の検出を行
う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer製のGenotyper^TM 及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷から
コンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。
キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に少量しか存在しないようなＤＮ
Ａの小片の配列決定に特に適している。

【００８１】 本発明の別の実施例では、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド配列また
はその断片を組換えＤＮＡ分子に組み入れることにより、適切な宿主細胞内での
ＨＰＫＣＩ、その断片または機能的等価物の発現を誘導することができる。遺伝
暗号固有の縮重のために、実質的に同一即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコー
ドする他のＤＮＡ配列も作り出され得、これらの配列をＨＰＫＣＩのクローン化
や発現のために用いることができる。

【００８２】 当業者には理解されるように、非自然発生コドンを有するＨＰＫＣＩをコード
するヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原核細
胞或いは真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、タンパク質の発
現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半減期
のような望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すことができる。

【００８３】 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＨＰＫＣＩをコードする配列を改
変するために、周知の方法を用いて組換えることができる。この配列改変の目的
としては、限定するものではないが、例えば遺伝子産物のクローニング、プロセ
シング及び／又は発現を変えること等が挙げられる。無作為断片によるＤＮＡ再
編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる再構成（reassemb
ly）によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。例えば、特定部位突
然変異誘発によって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コ
ドン選好の変化、スプライスバリアントの作出、突然変異の導入その他を達成す
ることができる。

【００８４】 本発明の別の実施例では、元のＨＰＫＣＩコーディング配列、改変したＨＰＫ
ＣＩコーディング配列、或いは組換えＨＰＫＣＩコーディング配列を異種の配列
に結合して、融合タンパク質をコードする配列にすることができる。例えば、Ｈ
ＰＫＣＩ活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスクリーニングするた
めに、市販の抗体により認識されるキメラＨＰＫＣＩタンパク質をコードするこ
とが役立つことがある。融合タンパク質はＨＰＫＣＩをコードする配列と異種の
タンパク質配列との間の位置に切断部位を有する形に設計することもでき、これ
によってＨＰＫＣＩを切断して、異種の部分から分けて精製することが可能とな
る。

【００８５】 本発明の別の実施例では、周知の化学的方法（例えばCaruthers. M.H.他（198
0）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他（1980）Nucl. Acids
Res. Symp. Ser. 225-232参照）を用いて、ＨＰＫＣＩをコードする配列の全体 、或いはその一部を合成することができる。或いは、化学的方法を用いてタンパ
ク質自体を作り出して、ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列またはその断片を合成するこ
とができる。例えば、様々な固相技術（例えばRoberge, J.Y.他(1995) Science
269:202-204参照）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばA
BI 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いることにより達成することがで きる。更に、ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列及びその任意の一部を、直接の合成の際
の変更し、かつ／又は他のタンパク質又はその任意の一部の配列と結合すること
によって、変異体ポリペプチドを作り出すことができる。

【００８６】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol
. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いはシー クエンシングにより確認することができる（例えばCreighton T.（1983）Protei ns Structure and Molecular Principles , WH Freeman and Co., New York, NY 参照）。

【００８７】 生物学的に活性なＨＰＫＣＩを発現させるためには、ＨＰＫＣＩをコードする
ヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿
入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要な配列を含むベクターに挿入す
る。

【００８８】 ＨＰＫＣＩをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベク
ターを作製するために当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法
としては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo遺伝子組換え 技術が挙げられる（例えば、Sambrook, J.他（1989）Molecular Cloning, A Lab oratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Planview NY及びAusubel, F.M.他 Current Protocol in Molecular Biology , John Wiley &Sons, New York, NY参 照）。

【００８９】 ＨＰＫＣＩコーディング配列の保持、発現のために様々な発現ベクター／宿主
系を用いることができる。このようなものとしては、限定するものではないが、
組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形
質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や
、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系や
、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモ
ザイクウイルスTMV）或いは細菌の発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラ スミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系等が挙げられる。本発
明は、使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００９０】 「調節領域」或いは「制御配列」とは、転写及び翻訳を行うために宿主細胞の
タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハンサー、プロモー
ター及び３′非翻訳領域である。このようなエレメントの作用の強さや特異性は
様々に異なったものであり得る。使用されるベクター系及び宿主に応じて、構成
的及び誘導的プロモーターを含む適切な転写及び翻訳エレメントを任意の数だけ
用いることができる。例えば、細菌系にクローン化する際には、Bluescript フ ァージミド（Stratagene, LaJolla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco/BRL
）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを用いること
ができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを用いる
ことができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサー（
例えば熱ショック RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルス
に由来するプロモーター或いはエンハンサー（例えばウイルス性プロモータ或い
はリーダー配列）を、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物の細胞系では
、哺乳動物の遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが適している。
ＨＰＫＣＩをコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を作る必要がある場合
には、ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを適切な選択マーカーと共
に用いることができる。

【００９１】 細菌系では、ＨＰＫＣＩの用途に応じて多種の発現ベクターを選択することが
できる。例えば抗体の誘発のために大量のＨＰＫＣＩが必要な場合には、精製が
容易であり得る融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターを用いることが
できる。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、多機能の大腸
菌クローニング・発現ベクターである、Bluescript（Stratagene）（このベクタ
ーでは、ＨＰＫＣＩをコードする配列を、アミノ末端メチオニン及び後続のβ−
ガラクトシダーゼの７個の残基からなる配列を備えたベクターのフレーム内に結
合してハイブリッドタンパク質を生成できる）や、pINベクター（例えばVan Hee
ke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509参照）等が挙 げられる。また、グルタチオンS−トランスファーゼ（GST）との融合タンパク質
として外来ポリペプチドを発現させるために、pGEXベクター（Promage、Madison
WI）を用いることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であ り、グルタチオンアガロースビーズに吸着させた後、フリーのグルタチオンの存
在下で溶出させることによって溶解した細胞から容易に精製できる。そのような
系において作り出されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはＸａ因子プ
ロテアーゼ切断部位を含むように設計し、目的のクローン化ポリペプチドをGST 部分から随意に放出させられるようにすることができる。

【００９２】 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター を含む多種のベクターを用いることができる（例えば、Ausubel,（前出）及びGr
ant他（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照）。

【００９３】 植物の発現ベクターを用いる場合、ＨＰＫＣＩをコードする配列の発現は、多
数のプロモーターの何れかによって促進され得る。例えばＣａＭＶの35S及び19S
プロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはＴＭＶ（Taka
matsu,N.他（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせ
て用いることができる。或いは、RUBISCOの小サブユニット、熱ショックプロモ ーターのような植物のプロモーターを用いてもよい（例えばCoruzzi, G.他 (198
4) EMBO J 3:1671-1680; Broglie, R.他 (1984) Science 224:838-843; 及びWin
ter, J.他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105参照）。これらの作
製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによ
り植物細胞内に導入できる。このような技術は、様々な一般に入手できる文献に
記載されている（例えばMcGraw Hill Yearbook of Science and Technology（19
92）McGraw Hill NY, pp191-196に記載のHobbs, S.又はMurry, L.E.を参照）。

【００９４】 ＨＰＫＣＩの発現のために昆虫系も用いることができる。例えば、そのような
系の一つでは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイラクサキンウ ワバ（Trichoplusia）幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターとして
、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）を用いる。ＨＰＫＣＩ をコードする配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非
必須領域にクローン化して、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことがで
きる。ＨＰＫＣＩコーディング配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が
失活し、コートタンパク質膜を欠く変異体ウイルスが生成される。次に、この変
異体ウイルスを、ヨトウガ（S.frugiperda）細胞或いはイラクサキンウワバ（Tr ichoplusia ）幼虫へ感染させ、その中でＨＰＫＣＩを発現させることができる（
例えば、Engelhard, E.K.他 (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227参照 ）。

【００９５】 哺乳動物の宿主細胞では、様々なウイルスをベースにした発現系を利用するこ
とができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＰＫ
ＣＩをコードする配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノ
ウイルス転写／翻訳コンプレックス（transcription/translation complex）の なかに結合することが可能である。ウイルスのゲノムにおける必須でないE1又は
E3領域へ挿入することにより、感染した宿主細胞でＨＰＫＣＩを発現できる生ウ
イルスが得られる（例えば、Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad
. Sci. 81:3655-3659参照）。加えて、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるた めにラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転写エンハンサーを用い ることができる。

【００９６】 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）を用いることにより、プラスミドに含めて
発現させることができるＤＮＡ断片より大きいＤＮＡの断片を供給することもで
きる。治療上の目的で、６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを構築し、それを従来のデ
リバリー方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用
して供給することができる。

【００９７】 また、ＨＰＫＣＩをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の開
始シグナルも必要である。このようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドン及び
隣接する配列が挙げられる。ＨＰＫＣＩ及びその開始コドン及び上流配列が適切
な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写または翻訳の制御シグナルは
不要である。しかし、コーディング配列又はその断片のみが挿入される場合には
、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さら に、全インサートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドンは正し
い読み枠に存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自
然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。使用される特定の細胞
系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の効率を高めることができる
（例えば、Scharf,D.他（1994）Results Probl. Cell Differ. 20:125-162参照 ）。

【００９８】 加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、若しくは
発現したタンパク質を望ましい形にプロセシングするその能力ついて選択するこ
とができる。このようなポリペプチドの修飾としては、以下のものに限定はしな
いが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipida
tion）並びにアシル化等が挙げられる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切
り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折り畳み、及び／又は機能の発揮の
ために重要である。そのような翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的
な機構を有している種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、及びWI3
8）は、American Type Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手で き、導入される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるよ
うに、このなかから選択することができる。

【００９９】 長期間にわたって組換えタンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し
た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起点及び／または内在性発現エレメ
ント及び選択マーカー遺伝子を同一のベクター上、或いは別のベクター上に含む
発現ベクターを用いることにより、ＨＰＫＣＩを安定的に発現する細胞系を形質
転換することができる。ベクターの導入の後、細胞は、選択培地に切り替える前
に濃縮培地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のための耐
性を与え、その存在に基づいて導入された配列を発現する細胞を増殖、回収でき
るようにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その
細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【０１００】 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系としては、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（tk）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（aprt）遺
伝子等があり、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において用いられる（例えば、Wigler
, M.他（1977）Cell 11:223-232; Lowy, I.他（1980）Cell 22:817-823参照）。
また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いるこ
とができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、nptはアミノ 配糖体のネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロルス ルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ （phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（例えば、Wigle
r, M.他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567; Colberre-Garapin, F.他（19
81）J. Mol. Biol. 150:1-14; Murry, (前出)参照）。選択に利用できる別の遺 伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるよ
うにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用で
きるようにするhisDが文献に記載されている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C.
Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51参照）。最近になって、 例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるGUS、及びル シフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンのような可視マーカーが頻用され
るようになってきた。また、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Clonetech, Palo
Alto, CA）を用いることもできる（例えば、Chalfie, M他 (1994) Science 263:
802-805参照）。これらのマーカーは、形質転換体を特定するためばかりではな く、特定ベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量す
るために用いることができる（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. B
iol. 55:121-131参照）。

【０１０１】 マーカー遺伝子の発現の存在／不存在が目的の遺伝子の存在をも示唆するが、
その存在及び発現を確認する必要がある場合がある。例えばＨＰＫＣＩをコード
する配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合は、ＨＰＫＣＩをコードする
配列を含む形質転換された細胞を、マーカー遺伝子の機能を欠いていることで確
認できる。或いは、マーカー遺伝子が、ＨＰＫＣＩをコードする配列と直列に配
置されて、両者が単一のプロモータの制御下となり得る。誘導または選択に応じ
てのマーカー遺伝子の発現は、通常、直列に配置された配列の発現をも同時に示
すことになる。

【０１０２】 或いは、当業者には周知の様々な方法により、ＨＰＫＣＩをコードする核酸配
列を含みＨＰＫＣＩを発現する宿主細胞を特定できる。このような方法としては
、以下に限定するものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リダイゼーションや、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するための膜、
溶液、或いはチップを用いる技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノ
アッセイ等が挙げられる ＨＰＫＣＩをコードする配列のプローブ、一部分、或いは断片を用いるＤＮＡ
−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により、ＨＰＫ
ＣＩをコードするポリヌクレオチド配列の存在を検出することができる。核酸増
幅を利用するアッセイでは、ＨＰＫＣＩをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む
形質転換体を検出するために、ＨＰＫＣＩをコードする配列をベースにしたオリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴマーを用いる。

【０１０３】 ＨＰＫＣＩの発現を検出、測定するための、このタンパク質に特異的なポリク
ローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いる様々なプロトコルが周
知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ
）が挙げられる。ＨＰＫＣＩポリペプチド上で２種の非干渉なエピトープに対し
て反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノア
ッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競合的結
合アッセイも用いることができる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、文
献に記載されている（例えば、Hampton, R.他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual , APS Press, St. Paul MN及びMaddox, D.E.他 (1983) J. Ex
p. Med. 158:1211-1216）。

【０１０４】 さらに様々な標識・結合技術が周知であり、様々な核酸及びアミノ酸のアッセ
イにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標識されたハイ
ブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作製するための手段としては、
オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識したヌクレオ
チドを用いるＰＣＲ増幅等が挙げられる。或いは、ＨＰＫＣＩをコードする配列
またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブの作製のためベクターにクローン化
する。そのようなベクターは周知で、市販されており、これを用いてT7、T3、或
いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加え ることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成することができる。このよう
な方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, MI）；Prome
ga（Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp.（Cleveland OH））を用いて実
施することができる。検出を容易にするために用いられる適切なリポーター分子
、即ち標識としては、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学発光
剤或いは色素剤のほか、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が挙げられ
る。

【０１０５】 ＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、この
タンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養
することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いら
れる配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、或いは細胞内に含めら
れる。当業者には理解されるように、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＨＰＫＣＩの分
泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。また他の構築物
を用いて、ＨＰＫＣＩをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にす
るポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる
。そのような精製を容易にするドメインとしては、限定するものではないが、固
定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような
金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテイ
ンＡドメイン、並びにFLAGS 延長／アフィニティ精製システム（Immunex Corp.,
Seattle WA）において用いられるドメイン等が挙げられる。精製ドメインとＨ ＰＫＣＩの間に、例えばＸａ因子またはエンテロキナーゼに特異的な配列（Invi
trogen, San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含めることによって
、精製を促進することができる。このような発現ベクターの１つは、ＨＰＫＣＩ
をコードする配列とともに、６個のヒスチジン残基をコードする核酸配列、それ
に続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする配列を発現さ
せて、融合タンパク質を作り出す。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニ
ティクロマトグラフィー（IMIAC）（例えば、Porath, J.他（1992）Prot. Exp.
Purif. 3: 263-281参照）での精製を容易にするとともに、エンテロキナーゼ切 断部位が融合タンパク質からＨＰＫＣＩを精製するための手段となる（例えば、
Kroll, D.J.他 (1993) DNA Cell Biol. 12:441-453参照）。

【０１０６】 ＨＰＫＣＩの断片は、組換え体の作製による方法のみならず、固相技術を用い
た直接的なペプチド合成によってもを作り出すことができる（例えば、Creighto
n, T.E. (1984) Protein: Structures and Molecular Properties, pp. 50-60,
W.H. Freeman and Co., New York, NY参照）。タンパク質合成は手作業で行える
が、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 43
1Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。様々なＨＰＫＣ
Ｉの断片を個別に化学的に合成し、それを化学的方法で結合して完全長分子を作
り出すことも可能である。

【０１０７】 （治療） ＨＰＫＣＩ、ＨＰＫＣＩ、ヒト由来のＰＫＣＩ−１（GI 1256265）、及び線虫
由来のＣＰＬＣＩ（GI 1255376）の間に化学的及び構造的相同性が存在する。加
えて、ＨＰＫＣＩは、癌の組織や、免疫応答の関連組織において発現される。従
って、ＨＰＫＣＩは、癌、自己免疫異常、及び認知障害において一定の役割を果
たしていると考えられる。

【０１０８】 従って、或る実施態様では、癌の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はその
断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。そのような癌としては、以下に限定す
るものではないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫
、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸
管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液
腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等を挙げることができる。

【０１０９】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の処
置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はその断片若しくは誘導体を発現し得るベク
ターを患者に投与し得る。

【０１１０】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の処
置又は予防のために、実質的に精製されたＨＰＫＣＩを適切な医薬用担体と共に
含む医薬品組成物を患者に投与する。

【０１１１】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌
の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩの活性を変調するアゴニストを患者に投与
し得る。

【０１１２】 別の実施態様では、自己免疫異常の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はそ
の断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。そのような免疫疾患としては、以下
に限定するものではないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレ
ルギー、強直性脊椎炎、アミロイド沈着症、貧血症、喘息、アテローム性硬化症
、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚
炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、
萎縮性胃炎、腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺
炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症
筋無力症、心筋炎又は心膜炎、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、リ
ウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身
性エリテマトーデス、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌
と血液透析と体外循環の合併症；ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感
染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷等を挙げることができる。

【０１１３】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自己免
疫異常の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はその断片若しくは誘導体を発現
し得るベクターを患者に投与し得る。

【０１１４】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自己免
疫異常の処置又は予防のために、実質的に精製されたＨＰＫＣＩを適切な医薬用
担体と共に含む医薬品組成物を患者に投与する。

【０１１５】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む自
己免疫異常の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩの活性を変調するアゴニストを
患者に投与し得る。

【０１１６】 更に別の実施態様では、認知障害の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はそ
の断片若しくは誘導体を寛恕に投与し得る。そのような疾患としては、以下に限
定するものではないが、アルツハイマー病、痴呆、及び学習障害等を挙げること
ができる。

【０１１７】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む認知障
害の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩ又はその断片若しくは誘導体を発現し得
るベクターを患者に投与し得る。

【０１１８】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む認知障
害の処置又は予防のために、実質的に精製されたＨＰＫＣＩを適切な医薬用担体
と共に含む医薬品組成物を患者に投与する。

【０１１９】 更に別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む認
知障害の処置又は予防のために、ＨＰＫＣＩの活性を変調するアゴニストを患者
に投与し得る。

【０１２０】 別の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補的配列、又はベクターの何れかを、他の適切な薬剤と組み合わせて投与する
ことができる。当業者であれば、従来の薬学上の原理に基づいて併用療法で用い
るための適切な薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の様々な疾患の治療又は予防に効果を奏する相乗作用が得られる。この
方法を用いることにより、より低い用量の各薬剤で治療効果を上げることができ
、副作用が生ずる可能性を低下させることができる。

【０１２１】 ＨＰＫＣＩのアンタゴニストは、周知の方法を用いて製造することができる。
詳述すると、精製されたＨＰＫＣＩを用いることによって、抗体を作り出したり
、或いはＨＰＫＣＩに特異的に結合するものを同定するために薬物のライブラリ
ーをスクリーニングすることができる。ＨＰＫＣＩに対する抗体も、周知の方法
を用いて作り出すことができる。このような抗体としては、限定するものではな
いが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆ
ａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーから作られたフラグメントが含
まれる。中和抗体（即ち二量体形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適で
ある。

【０１２２】 抗体を作り出すため、ＨＰＫＣＩか、免疫学的特性を有するその断片或いはオ
リゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の様々
なホストを免疫化することができる。免疫学的反応を増強するために、ホストの
種に応じた様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバント
としては、限定するものではないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ
ニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
ポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ ールリンペットヘモシアニン、並びにジニトロフェノール等が挙げられる。ヒト
で使用するアジュバントのなかでは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコ
リネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好適である。

【０１２３】 ＨＰＫＣＩに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、またはその断片は、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個
以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、元のタン
パク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸
配列を含んでいるのが好ましい。ＨＰＫＣＩアミノ酸の短いストレッチを、キー
ホールリンペットヘモシアニンのような他のタンパク質のストレッチと融合し、
そのキメラ分子に対する抗体を産生させることができる。

【０１２４】 ＨＰＫＣＩのモノクローナル抗体は、培地内の無制限増殖性細胞系（continuo
us cell line）に抗体分子を産生させる技術を用いて作製できる。このような技
術として、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術等が挙げられる（例えば、Kohler
, G.他(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D.他 (1985) J. Immunol. Methods
81 :31-42；Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Col
e, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120参照）。

【０１２５】 加えて、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための、マウス
抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする技術のような「キメラ抗体」
の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L. 他（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855；Neuberger, M.S.他（1984）
Nature 312:604-608；Takeda, S.他（1985）Nature 314:452-454参照）。或いは
、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、周知の方法によりＨＰＫＣＩ
に特異的な一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有しているが
イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブ
ラリーからの鎖再編成（chain shuffling）によって作り出すことができる（例 えば、Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3参照）。

【０１２６】 また、文献（例えば、Orlandi, R.他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:383
3-3837；Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299参照）に開示されているよう
に、高度に特異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをス
クリーニングすることによって、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘導 することによって抗体を作り出すこともできる。

【０１２７】 ＨＰＫＣＩに対する特異結合部位を含む抗体断片を作り出すこともできる。こ
のような断片としては、以下に限定するものではないが、抗体分子のペプシンに
よる消化で生成することができるＦ（ａｂ′）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ′）₂ フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより作り出すことができるＦａ
ｂフラグメント等が挙げられる。或いは、所望の特異性を有するモノクローナル
Ｆａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリ
ーを作製してもよい（例えば、Huse, W.D.他（1989）Science 256:1275-1281参 照）。

【０１２８】 様々なイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗
体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いはラジ
オイムノアッセイの、様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイム
ノアッセイでは、ＨＰＫＣＩとその特異的抗体との複合体の形成量の測定を行う
。２つの互いに非干渉なエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる二部
位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイ（two sites monoclonal based imm
unoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイを用いてもよい（Maddox, 前出
）。

【０１２９】 本発明の別の実施例では、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド、または
その任意の断片や相補配列を、治療上の目的で用いることができる。或る実施態
様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましいような状況において、ＨＰＫ
ＣＩをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることができる。詳
述すると、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形
質転換することができる。従って、相補的分子または断片を用いて、ＨＰＫＣＩ
の活性を変調、即ち遺伝子の機能を調節することができる。このような技術は現
在周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、若しくはより大き
な断片は、ＨＰＫＣＩコーディング配列のコード領域や調節領域の様々な位置か
ら設計することができる。

【０１３０】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の
発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターを、標的
の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いることが
できる。ＨＰＫＣＩをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列
を発現するベクターは、当業者に周知の方法を用いて作製することができる（例
えば、Sambrook他（前出）及びAusubel他（前出）参照）。

【０１３１】 ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現す
る発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより、ＨＰＫＣＩをコー
ドする遺伝子を機能停止させることができる。このような作製物を用いて、翻訳
不可能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。こ
のようなベクターは、ＤＮＡへ組み入れられない場合でも、そのベクターが内在
性ヌクレアーゼにより破壊されるまでＲＮＡ分子の転写を続ける。このような一
過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクタ
ー系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。

【０１３２】 上述のように、ＨＰＫＣＩをコードする遺伝子の制御領域、５′領域、または
調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）に相
補的な配列、即ちアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計する
ことにより遺伝子の発現の仕方を変えることができる。転写開始部位、例えば開
始部位の概ね＋１０〜−１０の間の位置にある領域に由来するオリゴヌクレオチ
ドが好適である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成することが
できる。三重らせん対合が有用なのは、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、
或いは調節分子の結合のために十分にほどける能力を、それが阻害するからであ
る。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については、文献に記載され
ている（例えば、Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Appr oaches , Futura Publishing Co, Mt Kisco NYにおけるGee, J.E.他(1994)参照）
。また、転写物のリボソームへの結合を妨げてｍＲＮＡの転写を阻害するために
、相補的配列、即ちアンチセンス分子を設計することもできる。

【０１３３】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムを、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることもできる。リボザイムの作用機構では、リボザイム分子が相補的標的
ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイズし、その後エンドヌクレアーゼによる切断
（endonucleolytic cleavage）がなされる。使用できるリボザイムの例として、
ＨＰＫＣＩをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果
的に触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子がある。

【０１３４】 標的となり得るＲＮＡ内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、標的の分
子における配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位をスキャンするこ とによって同定する。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０個のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列について、その
オリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴を評価することができる
。候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ribonucl
ease protection assay）によって、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ ダイゼーションについての接触性（accessibility）を測定することにより評価 することができる。

【０１３５】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための周知
の方法により作製することができる。これらの技術としては、固相ホスホラミダ
イト化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの化学合成技術等がある。或いは、
ＲＮＡ分子は、in vivo及びin vitroでのＨＰＫＣＩをコードするＤＮＡ配列の 転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６
のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する様々なベクターに組み
入れることができる。或いは、構成的ＲＮＡを合成するｃＤＮＡ作製物を、細胞
系、細胞或いは組織内に導入することができる。

【０１３６】 ＲＮＡ分子はその細胞内での安定性を高めたり、半減期を長くするために修飾
することができる。可能な修飾としては、限定するものではないが、その分子の
５′末端か３′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバ
ックボーン内でホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosph
orothioate）或いは２′Ｏ−メチルを使用すること等が挙げられる。この方式（
concept）は本来ＰＮＡの作製において用いられるもので、以下のようにこれら の分子全てに拡張することができる。即ち、内在性エンドヌクレアーゼにより容
易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、ア
セチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の形態の修飾によるだけでなく、イ
ノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）のような
従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら分子全てにこの
方式を拡張することができる。

【０１３７】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、
それらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivoでの使用についても同様に適
している。ex vivo治療の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導 入し、自家移植用にクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またト
ランスフェクションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミ
ノポリマーによるデリバリー（Goldman, C.K.他(1997) Nature Biotechnology 1
5:462-66; 引用により本明細書の一部とする）は、当分野で周知の方法を用いて
実施することができる。

【０１３８】 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び
最も好ましくはヒトのような哺乳動物を含む、任意の適切な被験体に適用するこ
とができる。

【０１３９】 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果をあげるために、医薬品組成物
を医薬上許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成物は、ＨＰＫ
ＣＩ、ＨＰＫＣＩに対する抗体、ＨＰＫＣＩの模擬体（mimetics）、アゴニスト
、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成
物は、単独で、或いは例えば安定化剤のような１種以上の他の薬剤とともに、滅
菌した生体適合性の医薬用担体を用いて投与する。このような担体としては、限
定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水等が挙げられる。こ
のような組成物は、単体で、或いは他の薬剤やホルモンと組み合わせた形で患者
に投与することができる。

【０１４０】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路としては、以下に限定するもので
はないが、経口投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、髄腔内投
与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局
所投与、舌下投与、或いは直腸内投与等が挙げられる。

【０１４１】 これらの医薬品組成物は、主成分に加えて、作用物質を医薬上使用可能な製剤
にするための処理を容易にする、賦形剤及び添加剤のような適切な医薬上許容さ
れる担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、Remington's Phar maceutical Sciences （Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版において見 ることができる。

【０１４２】 経口投与用の医薬品組成物は、当分野で周知の医薬上に許容される担体を用い
て適切な剤形に製剤することができる。このような担体により、この医薬品組成
物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤
、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤することができる。

【０１４３】 経口投与するための医薬製剤は、主成分と固形の賦形剤とを組み合わせた上で
、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、錠剤或いは糖衣剤コア（dragee core ）を作るために必要ならば適切な添加剤を添加した後、顆粒の混合物を加工する
ことによって得られる。適切な添加剤としては、ラクトース、スクロース、マン
ニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質の賦形剤
（filler）、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ等のデンプン、メチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセル
ロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのよう
なゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質がある。必要なら
ば、崩壊剤または可溶化剤、或いは橋かけ結合したポリビニルピロリドン、寒天
、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのよう
なその塩を加えてもよい。

【０１４４】 糖衣剤コアは、濃縮砂糖溶液等により適切な錠皮を塗布して用いられる。錠皮
を作るための溶液としては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ
ルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物等が挙げられる。錠剤の識別のため
、或いは主成分の量即ち投与量を表示するために染料或いは色素を錠剤或いは錠
皮に加えてもよい。

【０１４５】 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル、ゼラチ
ンからなる柔軟な密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトール
のような錠皮を有する。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷ
んのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、並びに所望に応じて安定化剤と混合された主成分を含み得る。柔軟な
カプセルでは、主成分が、安定化剤とともに或いは安定化剤なしで、脂肪油、液
体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸
濁されている。

【０１４６】 非経口投与用の医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液
或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において配合すること
ができる。水性の注射用懸濁剤には、 例えばカルボキシルメチルセルロースナ トリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質
を含めることができる。更に、主成分の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤とし
て調製することができる。適切な親油性の溶媒或いは担体としては、胡麻油のよ
うな脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合
成脂肪酸エステルがある。脂質でないポリカチオンのアミノポリマーをデリバリ
ーのために用いることもできる。懸濁剤には、溶解度を高め濃縮度の高い溶液の
調製を可能にする適切な薬剤または安定剤を、所望に応じて加えることができる
。

【０１４７】 局所適用または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸
透剤を用いて製する。このような浸透剤は、当技術分野において周知である。

【０１４８】 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来通りの混合、溶解、顆粒化、
糖衣形成、微粒子化（levigating）、乳化、カプセル化、捕捉（entrapping）、
或いは凍結乾燥により製造される。

【０１４９】 この医薬品組成物は塩として提供することもでき、限定するものではないが塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む種々の酸とともに
形成することができる。塩は、水性或いはプロトニック溶剤において、対応する
フリーの塩基形態より可溶性が高くなる傾向がある。この他、好ましい製剤には
、ｐＨ４．５〜５．５の範囲にあって、使用前に緩衝剤を配合した、１ｍＭ〜５
０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、及び２％〜７％のマンニトール
の全てまたは何れかを含む凍結乾燥粉末がある。

【０１５０】 医薬品組成物は、調製した後に適切な容器内に入れ、さらに提示した状態の処
置に用いられるようにラベル付けすることができる。ＨＰＫＣＩの投与の場合、
このようなラベルには、投与の量、頻度、及び方法が表示される。

【０１５１】 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、有効成分を所望の目的
を達成するために有効な量含む組成物である。有効な量の決定は、当業者の能力
の範囲内で十分行うことができる。

【０１５２】 あらゆる化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通
常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセ
イから推定することができる。この動物モデルを、適切な濃度範囲や投与経路を
決定するために用いることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトに
おける有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１５３】 治療上有効な量とは、症状や状態を改善する有効成分、例えばＨＰＫＣＩまた
はその断片、ＨＰＫＣＩの抗体、ＨＰＫＣＩのアゴニスト、アンタゴニスト、ま
たはインヒビターの量である。そのような化合物の治療上の有効性及び毒性は、
細胞培地における或いは実験動物を用いた標準的な薬学的手順によって、例えば
ＥＤ５０（集団の５０％における治療上の有効量、５０％有効量）及びＬＤ５０
（集団の５０％の致死投与量）として決定することができる。毒性と治療有効性
との間の投与量の比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すこと
ができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地の
アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用における投与量の範
囲を決める際に利用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほ
とんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ま
しい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範
囲内で変わってくる。

【０１５４】 正確な投与量は、処置が必要な患者に関連する要因を考慮して担当医師が選択
する。用量及び投与は、主成分を十分なレベルだけ与え、かつ所望の効果を維持
するべく調節する。考慮すべき要素としては、疾病状態の重症度、患者の全身の
健康状態、患者の年齢、体重、並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用す
る薬剤、反応感受性、並びに治療に対する耐性／反応等が挙げられる。長期的に
作用する医薬品組成物は、その特定の製剤のクリアランス率に応じて、３〜４日
毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与することができる。

【０１５５】 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いはデリバリー
方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献に見出すことがで
きる。当業者であれば、ヌクレオチドでは、タンパク質やインヒビター用の剤形
とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのデリバリーの方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。

【０１５６】 （診断） 別の実施例では、ＨＰＫＣＩに特異的に結合する抗体を、ＨＰＫＣＩの発現に
よって特性化される疾病の診断、或いは、ＨＰＫＣＩやＨＰＫＣＩのアゴニスト
、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療を受けている患者のモニタリング
のためのアッセイにおいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、上
述の治療用のものと同一の方法で作り出すことができる。ＨＰＫＣＩの診断アッ
セイとして、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＨＰＫＣＩを検出す
るために抗体或いは標識を利用する方法がある。この抗体は、修飾して用いても
、修飾なしで用いてもよく、共有結合または非共有結合の何れかでリポーター分
子と結合させることにより標識することができる。幾つかは上記したが種々のリ
ポーター分子が知られており、それを用いることができる。

【０１５７】 例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）
並びにＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器法）のようなＨＰＫＣＩを測定するため
の種々のプロトコルが当分野では周知であり、これによってＨＰＫＣＩ発現の変
化や異常を診断するための基礎が得られる。ＨＰＫＣＩの発現の正常値、即ち標
準値は、哺乳動物、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは細胞
抽出物とＨＰＫＣＩの抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合させること
によって確立する。標準の複合体形成量は、様々な方法、好ましくは測光手段を
用いることにより定量することができる。被験者の生検組織の患部組織サンプル
及び対照サンプルにおいて発現されたＨＰＫＣＩの量を、標準値と比較する。標
準値と被験者の値との偏差から、疾病の診断のためのパラメータを確立する。

【０１５８】 本発明の別の実施例では、ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチドを診断目
的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレ
オチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡ等がある。このポリヌク
レオチドは、ＨＰＫＣＩの発現が疾病と関係がある可能性がある生検組織におけ
る遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセイは、ＨＰＫＣ
Ｉが存在する状態か、存在しない状態か、過剰発現している状態の何れの状態に
あるかを区別したり、治療的な介入においてＨＰＫＣＩレベルの調節をモニタリ
ングするために利用することができる。

【０１５９】 或る実施態様では、ＨＰＫＣＩまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを利用して、ＨＰＫＣＩをコードする核酸配列を同定することができる。そ
のプローブの特異性、即ちそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば５
′調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）、或いは特異性の低い領域（
例えば特に３′コーディング領域）の何れに由来するのかということ、及びハイ
ブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度の或いは低い）ストリンジェン
シーにより、そのプローブが自然発生ＨＰＫＣＩのみを同定するものであるか、
或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まる。

【０１６０】 プローブは、近縁な配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、
ＨＰＫＣＩをコードする任意の配列に基づくヌクレオチドを少なくとも５０％含
むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌ
クレオチド配列か、自然発生ＨＰＫＣＩのイントロン、プロモータ、及びエンハ
ンサーエレメントを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。

【０１６１】 ＨＰＫＣＩをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロ
ーブを作製するための手段としては、ＨＰＫＣＩやＨＰＫＣＩ誘導体をコードす
る核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法が
ある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ
や適切な標識ヌクレオチドを付加することによりin vitroでのＲＮＡプローブ合
成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは様々なリポ
ータ分子により標識することができる。例えば、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射性核種
により、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するアルカリホスフ
ァターゼのような酵素標識等により標識することができる。

【０１６２】 ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＰＫＣＩの発現に関連す
る疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下
に限定するものではないが、 例えば、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、具体的
には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓
、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚
、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等の癌、 例えば、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊
椎炎、アミロイド沈着症、貧血症、喘息、アテローム性硬化症、自己免疫性溶血
性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、
アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎
、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加
症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎
又は心膜炎、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、リウマチ性関節炎、
強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデ
ス、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌と血液透析と体外
循環の合併症；ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及
び蠕虫感染；及び外傷等の自己免疫異常、及び 例えば、アルツハイマー病、痴呆、及び学習障害等の認知障害が挙げられる。
ＨＰＫＣＩをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の組織や体液を利用する
、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜
をベースにした技術や、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、
ピン技術、及びＥＬＩＳＡアッセイや、或いはマイクロアレイにおいて用いるこ
とによって、ＨＰＫＣＩ発現の変化を検出することができる。このような定性的
或いは定量的試験法は当分野では周知である。

【０１６３】 特定の実施態様では、特に上に列挙したもののような関連疾患の存在を検出す
るアッセイにおいてＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る
。ＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加
えることができる。適当なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗
浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプル
におけるシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっ
ている場合、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダ
イズしており、サンプルのなかのＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチド配列のレ
ベルの変化が生じていることは、関連する疾患の存在を示している。このような
アッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにお
いて特定の治療上の処置の有効性を評価するために用いることもできる。

【０１６４】 ＨＰＫＣＩの発現に関連する疾病の診断の基礎とするために、正常な、即ち標
準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト何
れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞の抽出物を、ハイブリダイゼ
ーション或いは増幅に適した条件下でＨＰＫＣＩをコードする配列又はその断片
と結合することにより確立し得る。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実
質的に精製されたＨＰＫＣＩが用いられる実験で得られる値と、正常被験者で得
られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得
られた標準値は、疾病の症状を呈する患者のサンプルから得られる値と比較する
ことができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。

【０１６５】 一旦疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを定期的に反復して行って、患者における発現のレベルが正常な患者
において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。継続
的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月にわたる期間での
治療の効果を知ることができる。

【０１６６】 癌については、患者の生検組織において転写物が比較的多量に存在することが
、疾病の発生の素因を示す。つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す
る手段となり得る。このタイプの確定診断により、医療従事者が予防的処置を講
じたり、より早期に積極的な治療を開始し、癌の発生や更なる進行を予防するこ
とが可能となる。

【０１６７】 ＨＰＫＣＩをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの別の診断目
的の使用法では、ＰＣＲ法での利用があり得る。このようなオリゴマーは化学的
に合成したり、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作製することができ
る。オリゴマーは、好ましくは、特定の遺伝子或いは状態を特定するために最適
な条件下で用いられる２種のヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５′→３′）
のヌクレオチド配列及びアンチセンス方向（３′←５′）のヌクレオチド配列か
らなる。また、同一の２種のオリゴマーや入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴ
マーの縮重プールを、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出及び／または定量の
ため低いレベルのストリンジェントな条件の下で用いることもできる。

【０１６８】 ＨＰＫＣＩの発現を定量するために用いることができる方法として、放射標識
（radiolabeling）或いはビオチン標識したヌクレオチドの利用、対照の核酸の 同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準 のグラフ曲線の利用等がある（例えば、Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Meth
ods, 159:235-44；Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236参照）。多数の
サンプルの定量では、目的のオリゴマーが複数の希釈溶液中に存在し、分光光度
計を用いたり比色定量により迅速に定量することができるようなＥＬＩＳＡ形式
のアッセイを行うことによって一層定量のスピードを上げることができる。

【０１６９】 別の実施例では、ここに開示するポリヌクレオチド配列の何れかに由来するオ
リゴヌクレオチドまたはより大形の断片を、マイクロアレイにおけるターゲット
（標的）として用いることができる。マイクロアレイを用いることにより、多く
の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺
伝子の変異体、変異及び多型を同定することができる。この情報は、遺伝子の機
能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の診断、及び治療薬の開発やその
活性のモニタリングのために利用することができる。

【０１７０】 マイクロアレイを準備し、周知の方法を用いて解析してもよい（例えば、Bren
nan, T.M.ら(1995)米国特許No. 5,474,796; Schena, M.ら (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweilerら, (1995) PCT出願WO95/251116;
Shalon, Dら(1995) PCT出願WO95/35505; Heller, R.A.ら(1997) Proc. Natl. A
cad. Sci. 94:2150-2155; Heller, M.J.ら(1997)米国特許No. 5,605,662参照） 。

【０１７１】 本発明の別の実施例では、ＨＰＫＣＩをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列マッピングのために有用なハイブリダイゼーションプローブを作
り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人
工染色体作製物にマッピングし得る。人工染色体作製物としては、例えばヒト人
工染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡ
Ｃｓ）、細菌性Ｐ１作製物又は単染色体ｃＤＮＡライブラリー等がある（例えば
、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends
Genet. 7:149-154参照）。

【０１７２】 蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッ ピング技術及び遺伝子地図データと相互関係を有し得る（Meyers, R. A. (ed.)
Molecular Biology and Biotechnology, VCH Publishers New York, NY, pp. 96
5-968に記載のHeinz-Ulrichら (1995)参照）。遺伝子地図データの例は、種々の
科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）に見ることができる 。物理的染色体地図上でのＨＰＫＣＩをコードする配列の位置と特定の疾病（ま
たは特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、或る遺伝病に関連するＤＮ
Ａの領域を決定することができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者
、キャリア、または患者の遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１７３】 染色体調製物のin situハイブリダイゼーションや、確立された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡大するた
めに用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知で
あっても、マウスのような別の哺乳動物の染色体上の遺伝子配置から、関連する
マーカーがわかる。新たな配列は、物理的マッピングにより染色体のアームまた
はその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング或いは他の
遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供するこ
とができる。例えば毛細血管拡張性運動失調（AT）が11q22-23に位置決定された
ように（例えば、Gatti, R.A.他（1988）Nature 336:577-580参照）、一旦疾患 或いは症候群が特定のゲノム領域に粗く位置決定されたならば、その領域にマッ
ピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節
遺伝子を表し得ることになる。本発明のヌクレオチド配列を、転座、逆位等によ
って生じた、正常者、キャリア、及び患者の間の染色体の位置の違いを検出する
ために用いることもできる。

【０１７４】 本発明の別の実施例では、ＨＰＫＣＩや、その触媒作用性または免疫原性断片
、オリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において化合物のスクリー
ニングのために用いることができる。このようなスクリーニングにおいて用いら
れる断片は、溶液に遊離した形態で存在するか、固体支持体へ付着した形態で存
在するか、細胞表面へ付着した形態で存在するか、或いは細胞内に存在するもの
であり得る。ＨＰＫＣＩと試験対象の薬剤との結合複合体形成を測定することが
できる。

【０１７５】 別の薬物スクリーニング技術によって、対象のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットのスクリーニングを行うことができる（
例えば、Geysenら (1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法では、ＨＰＫＣ Ｉに適用する場合、多数の異なる小形の試験対象の化合物を、プラスチックピン
或いは他の表面のような固体基板上で合成する。この試験対象の化合物をＨＰＫ
ＣＩ又はその断片と反応させ、洗浄する。次に結合したＨＰＫＣＩを当分野で周
知の方法により検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術において使用す
るために、精製したＨＰＫＣＩをプレート上に直接コーティングすることもでき
る。或いは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定するこ
とができる。

【０１７６】 別の実施例では、ＨＰＫＣＩに結合し得る中和抗体が、ＨＰＫＣＩとの結合に
ついて試験対象の化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイ
を用いることができる。この方法では、抗体を用いて、ＨＰＫＣＩの１または２
以上の抗原決定基を共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる
。

【０１７７】 更に別の実施例では、現在までに開発されていない分子生物学上の技術であっ
ても、その新技術がヌクレオチド配列の現在までに知られている特性（例えば、
以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合のような特性）に
基づく技術であるならば、その技術においてＨＰＫＣＩをコードするヌクレオチ
ド配列を用いることができる。

【０１７８】 以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明をこの実施例に限定しよ
うとするものではない。

【０１７９】

【実施例】

１ SININOT04 ｃＤＮＡライブラリーの作製 SININOT04 ｃＤＮＡライブラリーを、年齢２６歳の白人男子得から部分的結腸
切除、永久盲腸切除、及び随伴性虫垂切除の際に採取された顕微鏡検査で正常な
回腸から作製した。病変は、末端回腸の中央区域、盲腸、及び上行結腸に及ぶ中
程度から重度のクローン病を示していた。目視によれば、標本にはむらのある併
発部、縦走する隆起部、最小管腔径２ｃｍ程度の狭窄部形成、及び多数の炎症性
偽ポリープが見られた。顕微鏡検査によれば、標本には、とび石状の経壁炎症、
壁在繊維症、亀裂した潰瘍、腸管壁の全ての層に存在するリンパ様凝集塊が見ら
れた。失語症は認められなかった。虫垂及び外科的縁には併発が見られなかった
。

【０１８０】 この冷凍組織を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Inst
ruments, Westbury, NY）を用いてTrizol試薬（１ｇの組織／１０ｍｌのTrizol ；Gibco/BRL^TM Gaithersburg, MD）、即ちフェノール及びグアニジンイソチオシ
アネートの単一組成細胞の溶液（monoplastic solution）においてホモジナイズ
し溶解した。氷冷しながら短時間にインキュベートした後、クロロホルムを加え
（1:5 v/v）、混合物を遠心分離した。上側のクロロホルム層を取り除いて新し い試験管に移し、イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させ、ＤＥＰＣ処理した水に
再懸濁し、３７℃で２５分間ＤＮアーゼ処理した。このＲＮＡを酸性フェノール
クロロホルムｐＨ４．７で２回再抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５
倍量のエタノールで沈殿させた。次にこのｍＲＮＡをQiagen Oligotex kit（QIA
GEN, Inc., Chatsworth, CA）を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製に 用いた。

【０１８１】 このｍＲＮＡを、SuperScript Plasmid System（Gibco/BRL）の推奨プロトコ ルに従って取り扱った。ｃＤＮＡを、Sepharose CL4Bカラム（品番275105-01; P
harmacia, Piscataway, NJ）上で分画化し、４００ｂｐを越える大きさのｃＤＮ
ＡをpINCY 1に連結した。次にこのプラスミドpINCY 1をDH5a^TMコンピテント細胞
（Gibco/BRL）に形質転換した。

【０１８２】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡはこの細胞から放出され、これをREAL Prep 96 Plasmid Kit
（QIAGEN）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変更した
。（１）２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを含む１ｍ
ｌの滅菌Terrific Broth （品番22711, Gibco/BRL）において細菌を培養した。 （２）接種の後、培溶液を１９時間インキュベートし、インキュベーションの終
了時に、この細胞を０．３ｍｌの溶解バッファーに溶解した。（３）イソプロパ
ノール沈殿を行った後、プラスミドＤＮＡのペレットを０．１ｍｌの蒸留水に再
懸濁した。このＤＮＡサンプルを、９６穴ブロックに移し４℃で保管した。

【０１８３】 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers （MJ Research, Water
town, MA製のPTC200）及びApplied Biosystems社製の377 DNA Sequencing Syste
msと組み合わせてHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV）を用いて、
Sangerらの方法（1975, J. Mol. Biol.94:441f）により行い、読み枠を決定した
。

【０１８４】 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列を問い合わせ配列として用
いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのようなデータベース を検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が注釈付きで含めら
れており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用いて相同性（類似 性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（例えば、Altschul.
S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul他(1990) J. Mol. Biol. 215
:403-410参照）。

【０１８５】 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配 列の類似性を決定する。そのアライメントの局所的性質のために、BLASTは正確 な一致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源
とするホモログを特定する際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造の
ギャップペナルティを処理する際には、他のアルゴリズムを用いることができる
（例えば、Smith Tら (1992) Protein Engineering 5:35-51参照）。本明細書に
開示された配列の長さは少なくとも４９ヌクレオチドであり、不必要な塩基は１
２％以下である（ここでＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ以外と記録されたものである）
。

【０１８６】 BLAST法は、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索し、発見した あらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値
を満たす一致のみを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25、ペ プチドで１０^-8に設定した。

【０１８７】 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、次に同じクローンから
類推されるアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳類 （mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索し
た。

【０１８８】 加えて、ｃＤＮＡライブラリーから特定された配列を、適切な解析用プログラ
ム、例えばBlock 2 Bioanalysisプログラム（Incyte, Palo Alto, CA）を用いて
解析して、保存タンパク質モチーフを有する遺伝子配列を特定する。このモチー
フ解析プログラムは、Swiss-Protデータベース及びPROSITEに含められた配列情 報に基づいており、ゲノムの又はｃＤＮＡの配列から翻訳された、特性化されて
いないタンパク質の機能を決定するメソッドである（例えば、Bairoch, A.ら (1
997) Nucleic Acids Res. 25:217-221; 及びAttwood, T. K.ら (1997) J. Chem.
Inf. Comput. Sci. 37:417-424参照）。様々なタンパク質における機能的又は 構造的ドメインを特定するために、PROSITEを用いることができる。この方法は 、加重マトリクスに基づくものである。次に、この方法によって特定されたモチ
ーフを、SWISS-PROTデータベースに対して較正して、一致の可能性の分布の測定
値を得る。

【０１８９】 別の実施態様では、隠れマルコフモデル（ＨＭＭｓ；Hidden Markov models）
を用いて、共通のモチーフ、特にコンセンサス配列を見出すことができる（例え
ば、Pearson, W.R.及びD.J. Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2
448；及びSmith, T.F.及びM.S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197参
照）。ＨＭＭｓは、当初は音声認識パターンを調べるために開発されたが、現在
では生物学的な面でタンパク質や核酸の配列解析や、タンパク質の構造のモデリ
ングのために用いられている（例えば、Krogh, A.ら (1994) J. Mol. Biol. 235
:1501-1531；及びCollin, M.ら (1993) Protein Sci. 2:305-314参照）。ＨＭＭ
ｓは、形式的確率論に基づいており、アミノ酸又はヌクレオチドについての位置
特異的なスコアを用いる。このアルゴリズムは、継続的に新規に特定された配列
からの情報を組み込んで、そのモチーフ解析能を高める。

【０１９０】 ４ ノーザン法による解析 ノーザン法解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、標識されたヌクレオチド配列と、特定の細胞タイプまたは組織のＲＮ
Ａが結合しているメンブランとのハイブリダイゼーションを行う（例えば、Samb
rook, 前出, ch. 7; 及びAusubel, F.M.ら 前出, ch. 4及び16参照）。

【０１９１】 BLASTに適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank又はLIFESEQ^TMデ ータベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベースにおいて同一の
又は近縁な分子を検索する。この解析にかかる時間は、複数回の膜をベースにし
たハイブリダイゼーションより非常に短時間である。加えて、特定の一致が正確
な一致に分類されるか、或いは相同なものに分類されるかを決定するべく、コン
ピュータ検索の感度を変えることができる。

【０１９２】 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義 されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
が考慮される。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、これ
よりスコアの低いものは近縁な分子として同定される。

【０１９３】 ノーザン法による解析の結果は、ＨＰＫＣＩをコードする転写物が発生するラ
イブラリーのリストとして報告される。存在量（abundance）及びパーセント存 在率（percent abundance）も報告される。存在量は、ｃＤＮＡライブラリーに 特定の転写物が存在する回数を直接的に反映し、パーセント存在率は、存在量を
ｃＤＮＡライブラリーにおいて検出された配列の総数で除したものである。

【０１９４】 ５ ＨＰＫＣＩをコードする配列の延長 インサイト社クローンNo. 2922091の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド 配列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
一方のプライマーはアンチセンス方向の延長を開始するために合成し、他方のプ
ライマーはセンス方向に配列を延長するために合成した。これらのプライマーを
用いて、既知のＨＰＫＣＩ配列を「外側に」延長し、興味の対象の領域の新しい
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初めのプライマーは、
OLIGO 4.06（National Biosciences, Plymouth, MN）、或いは他の適切なプログ
ラムを用いて設計したもので、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長
さで、５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列に
アニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体
化を生じるようなあらゆるヌクレオチドのストレッチは除いた。

【０１９５】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて、この配列を延 長した。２段階以上の延長が必要または望ましい場合は、既知領域をさらに延長
するための追加のプライマーの組を設計する。

【０１９６】 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と
を徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。４０ｐｍｏｌの
各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始す
る場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Reserch, Watertown MA）を用
いて、以下のパラメータ、即ち ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行った。

【０１９７】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、配列を延長する反応が成功したか
否かを決定した。最も大きな生成物即ちバンドを選択して、ゲルから切り出し、
QIAQuick^TM（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製し、Klenow酵素を用 いて一本鎖ヌクレオチドの延び出し（overhang）を切り取って、再結合及びクロ
ーニングを容易にする平滑末端を作った。

【０１９８】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トした。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な培養液内にある）を、３
μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地で培養
した（例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 1）。３７℃で１時間のイン
キュベーションの後、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani（L
B）寒天（例えば、Sembrook他, 前出, Appendix A, p. 2）上にのせた。後日、 いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６
穴マイクロタイタープレートの各のウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ
／２ｘＣａｒｂ培地で培養した。さらに後日、各５μｌの終夜の培養物を非滅菌
９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、それぞれ５μｌのサンプ
ルをＰＣＲアレイに移した。

【０１９９】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のrTth ＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃縮 ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いら
れる遺伝子に特異的なプライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は
、以下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行った。

【０２００】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上を走ら
せた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的ｃＤＮＡと比較して、適切なクローン
を選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。

【０２０１】 同様に、配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順を用いて５′
調節配列を得ること、５′方向の延長のために設計されたオリゴヌクレオチドを
得ること、及び適切なゲノムライブラリーを得ることが可能である。

【０２０２】 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列から作られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対
からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフ
ラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。OLIGO4.06（National Bioscience
）のような最新式のソフトウェアを用いてオリゴヌクレオチドを設計し、それぞ
れ５０ｐｍｏｌのオリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸
（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, B
oston, MA）とを結合することによって標識する。標識されたオリゴヌクレオチ ドを、Sephadex G-25超微粒子樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて精製
する。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌ クレアーゼAseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN, Bosto
n, MA）の１つを用いて消化したヒトゲノムＤＮＡの一般的な膜を用いるハイブ リダイゼーション解析において用いる。

【０２０３】 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）にトランスファーする。
ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取
り除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム水及び０．５％ドデシル
硫酸ナトリウムまでの、段階的にストリンジェンシーが増す条件下で室温にて順
次洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager カセット（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露 光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０２０４】 ７ マイクロアレイ 化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でオリ
ゴマーを合成する（例えば、Baldeschweiler他, 前出, 参照）。更に別の方法で
は、ドットブロット法（スロットブロット法）で用いるものに類似したアレイを
用いて、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを用いて
、ｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に配置し結合させる。一般
的なアレイは、手作業により、又は市販の材料及び機械を用いることによって製
作することができ、適切な数のエレメントを有し得る。ハイブリダイゼーション
の後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き
、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた画像
を解析して、マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする核プローブの
相補性の程度及び相対的な存在量を評価することができる。

【０２０５】 完全長ｃＤＮＡまたは発現される配列タグ（ＥＳＴｓ）が、マイクロアレイの
エレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、例えばLASERG
ENE^TMのような周知のソフトウェアを用いて選択することができる。本発明のヌ クレオチド配列の１つに対応する、又は本発明に関連するｃＤＮＡライブラリー
から無作為に選択された完全長ｃＤＮＡ又はＥＳＴｓを、適切な基板、例えばス
ライドガラス上に配置する。そのｃＤＮＡは、例えば、ＵＶ架橋処理の後に熱及
び化学薬品による処理を行って乾燥することによってスライドガラス上に固定す
る（例えば、Schena. Mら (1995) Science 270:467-470; 及びShalon, D.ら (19
96) Genome Res. 6:639-645）。基板上のエレメントへのハイブリダイゼーショ ンのために蛍光プローブを作製して使用する。この基板を、上述の手順によって
解析する。

【０２０６】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＰＫＣＩをコードする配列或いはその任意の一部分に相補的な配列は、自然
発生のＨＰＫＣＩの発現を低下、即ち阻害するために用られる。約１５〜約３０
塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より小さな或い
はより大きな配列フラグメントの場合でも基本的に同じ方法を用いることができ
る。Oligo4.06ソフトウェア及びＨＰＫＣＩのコーディング配列を用いて、適切 なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配
列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが結合
しないようにする。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設
計して、リボソームがＨＰＫＣＩをコードする転写物に結合しないようにする。

【０２０７】 ９ ＨＰＫＣＩの発現 ＨＰＫＣＩの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そ
のベクターを宿主細胞に形質転換することによって達成される。このベクターは
、例えばクローニング部位の上流のβガラクトシダーゼのような、目的のｃＤＮ
Ａと機能的に結びついた適切なプロモーターを有する（例えば、Sambrook, 前出
, pp. 404-433; 及びRosenberg, Mら(1983) Methods Enzymol. 101:123-138）。

【０２０８】 単離され、形質転換された細菌株を、標準的な方法を用いてイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導すると、βガラクトシダーゼ
の第１の８個の残基、概ね５個乃至１５個の残基からなるリンカー、及び完全長
タンパク質からなる融合タンパク質が得られる。シグナル残基群は、培地へのＨ
ＰＫＣＩの分泌を誘導し、この培地は次の活性のアッセイにおいて直接用いるこ
とができる。

【０２０９】 １０ ＨＰＫＣＩの活性の立証 ＨＰＫＣＩの活性は、ＰＫＣの阻害によって測定する。ＰＫＣの活性を、[γ −³²Ｐ]−ＡＴＰから、タンパク質基質、例えばIII型ヒストン、ミエリン塩基性
タンパク質、又はＥＧＦ受容体ペプチドへの放射能の移動によって測定する（Ke
nnelly P.J.ら (1991) J. Biol. Chem. 266: 15555-15558）。反応の条件（Ｃａ ²⁺ 、リン脂質、ホルボールエステル等の添加）は、使用されるＰＫＣのアイソフ
ォームに従って調節する。ＨＰＫＣＩは、基質を加える前に反応混合物に添加す
る。様々なＨＰＫＣＩの濃度においてＰＫＣ活性を測定し、ＨＰＣＣＩの無いサ
ンプルと比較する。このアッセイにおいて、ＰＫＣの阻害量はＨＰＫＣＩに活性
に比例する。

【０２１０】 １１ ＨＰＫＣＩ特異的抗体の産生 ＰＡＧＥ電気泳動法（例えば、Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 1
82:488-495参照）、又は他の精製技術を用いて実質的に精製したＨＰＫＣＩを用
いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化し、抗体を作り出す。

【０２１１】 或いは、ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列をLASERGENE^TMソフトウエア（DNASTAR Inc
.）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを 合成し、当業者に周知の方法でこれを用いて抗体を産生させる。適切なペプチド
配列の選択及び抗体の産生の技術は当業者に周知である。Ｃ末端付近のエピトー
プ或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択については
、文献に記載されている（例えば、Ausubelら, 前出, ch. 11参照）。

【０２１２】 一般的に、１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsの
ペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し
、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ
）を用いる反応によってキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma, S
t. Louis, MO）に結合する（例えば、Ausubel他 (前出)参照）。フロイントの完
全アジュバント中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する
。得られた抗血清の抗ペプチド活性を試験するには、例えばペプチドをプラスチ
ックに結合し、１％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さ
らに放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０２１３】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＰＫＣＩの精製 自然発生のＨＰＫＣＩ或いは組換えＨＰＫＣＩを、ＨＰＫＣＩに特異的な抗体
を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イム
ノアフィニティーカラムは、CnBr-活性化 Sepharose（Pharmacia & Upjohn）の ような活性化クロマトグラフィーレジンとＨＰＫＣＩ抗体とを共有結合で結合さ
せることにより構築する。結合の後、そのレジンを使用説明書の指示に従って、
ブロックし洗浄する。

【０２１４】 ＨＰＫＣＩを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを
ＨＰＫＣＩを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において
高イオン強度バッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＨＰＫＣＩとの結
合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素ま
たはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＨＰＫ
ＣＩを回収する。

【０２１５】 １３ ＨＰＫＣＩと相互作用する分子の同定 ＨＰＫＣＩ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（ 例えば、Bolton 他 (1973) Biochem. J. 133:529参照）で標識する。マルチウェ
ルプレートのウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＰＫＣＩと
ともにインキュベートし、洗浄して、標識ＨＰＫＣＩ複合体を有するウェルをア
ッセイする。異なる濃度のＨＰＫＣＩを用いて得られたデータを用いて、候補の
分子とＨＰＫＣＩの会合、親和性、数の数値を計算する。

【０２１６】 本発明の範囲及び精神から逸脱しない本明細書に記載した本発明の方法及びシ
ステムの様々な改変は、当業者には明らかであろう。本発明は、特に好適な実施
例に関連して説明されているが、本発明の真の範囲は、そのような特定の実施例
に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或い
は関連分野の専門家には明らかな本発明の実施形態の様々な改変は、請求の範囲
内に含まれるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の
一部を示す図である。配列のアライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（H
itachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｂ】 ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の
一部を示す図である。配列のアライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（H
itachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｃ】 ＨＰＫＣＩのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の
一部を示す図である。配列のアライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（H
itachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図２Ａ】 ＨＰＫＣＩ（インサイトクローンNo. 2922091；配列番号：１）、及びヒト由 来のＰＫＣインヒビターＰＫＣＩ−１（GI 1256265；配列番号：３）及び線虫由
来のＰＫＣインヒビターＣＰＫＣＩ（GI 1255376；配列番号：４）の間の配列ア
ライメントの一部を示す図である。配列のアライメントは、LASERGENE^TMソフト ウェア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシーケンスアライメントプログラ ムを用いて作成した。

【図２Ｂ】 ＨＰＫＣＩ（インサイトクローンNo. 2922091；配列番号：１）、及びヒト由 来のＰＫＣインヒビターＰＫＣＩ−１（GI 1256265；配列番号：３）及び線虫由
来のＰＫＣインヒビターＣＰＫＣＩ（GI 1255376；配列番号：４）の間の配列ア
ライメントの一部を示す図である。配列のアライメントは、LASERGENE^TMソフト ウェア（DNASTAR Inc, Madison WI）のマルチシーケンスアライメントプログラ ムを用いて作成した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA06 EA04 GA11 HA03 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QS39 QX02 QX10 4B064 AG21 AG27 CA01 CA02 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CE12 CE14 DA01 DA13 4B065 AA01X AA26X AA57X AA58X AA72X AA88X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA152 ZB072 ZB262 ZC192 ZC202 ZC782 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA55 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74 GA26 GA31

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号（SEQ ID NO）：１又は配列番号：１の断片のア ミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性
   を有する、実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする、単離され精製され
   たポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌ
   クレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の
   下でハイブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製さ
   れたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 配列番号：２又は配列番号：２の断片の配列を含む、単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌ
   クレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する
   、単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリ
    ペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする配列番号：１又は配列番号：１の断片の配列を含むポリペプチドの
    製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項１のポリペプチドを、適切な医薬用担体と共に含
    む医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する、精製され
    た抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの、精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの、精製されたアンタゴニスト
    。
17. 【請求項１７】 癌の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む癌の処置又は予防方法。
18. 【請求項１８】 自己免疫異常の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む自己免疫異常の処置又は予防方法。
19. 【請求項１９】 認知障害の処置又は予防方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効な量投与す
    る過程を含む認知障害の処置又は予防方法。
20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおいて配列番号：１のア
    ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法で
    あって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドと、前記生物学的サンプルの核酸の少なく
    とも１つとをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過
    程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおける前記ポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相互関係を有する、該過程とを含
    むことを特徴とする核酸を含む生物学的サンプルにおいて配列番号：１のアミノ
    酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法。
21. 【請求項２１】 ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生物学
    的サンプルの前記核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅することを特徴とす
    る請求項２０に記載の方法。