JP2002508176A - ヒトホスファターゼ - Google Patents

ヒトホスファターゼ

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JP2002508176A JP2000539125A JP2000539125A JP2002508176A JP 2002508176 A JP2002508176 A JP 2002508176A JP 2000539125 A JP2000539125 A JP 2000539125A JP 2000539125 A JP2000539125 A JP 2000539125A JP 2002508176 A JP2002508176 A JP 2002508176A
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シャー、パルビ
ヒルマン、ジェニファー・エル
コーレイ、ニール・シー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトホスファターゼ（ＨＰＡ）及びＨＰＡを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また本発明はＨＰＡの発現に関連する障害を治療するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明はヒトホスファターゼの核酸配列及びアミノ酸配列に関し、免疫障害及
び癌に関連する疾患の診断、予防及び治療におけるこれらの配列の使用法に関す
る。
【０００２】 背景技術 タンパク質リン酸化／脱リン酸サイクルは、細胞活性化を制御するために真核
細胞により用いられる主な調節機能の１つである。典型的な哺乳動物細胞では活
性タンパク質の１０％以上がリン酸化される。タンパク質リン酸化／脱リン酸中
に、プロテインキナーゼによりリン酸基がアデノシン三リン酸分子からタンパク
質に移送され、プロテインホスファターゼによりタンパク質から除去される。
【０００３】 プロテインホスファターゼは、細胞増殖及び分化、細胞間接触、細胞サイクル
及び発癌を調節する細胞シグナル伝達イベントにおいて機能する。３つの進化上
異なるプロテインホスファターゼが同定されている。これらは、セリン／スレオ
ニンホスファターゼ、プロテインチロシンホスファターゼ及び酸性／アルカリ性
ホスファターゼを含む（Carbonneau H.及びTonks N.K. (1992) Annu. Rev. Cell Biol.8:463-93）。
【０００４】 ホスファチジン酸リン酸（ＰＡＰ）は、ホスファチジン酸リン酸を脱リン酸す
ることによりグリセロ脂質生合成の古典経路においてジアシルグリセロールに代
謝される。ホスファチジン酸及びその代謝誘導体、すなわちリゾホスファチジン
酸は、異なる細胞に外因的に加えられる場合に、タンパク質マイトジェン及び活
性化因子であることが知られている。ＰＡＰの２つのアイソフォームがラット肝
臓内に存在する。第１のアイソフォームは、ＰＡＰ１と呼ばれ、サイトゾル及び
ミクロソームに関連し、グリセロ脂質生合成の原因となるものと考えられる。第
２のアイソフォームＰＡＰ２は原形質膜に結合され、細胞シグナル伝達に関連す
る。２つのＰＡＰアイソフォームの活性化は、いくつかの肝臓疾患において異な
る活性変化を被るものと考えられる（Day, C. P (1993) Clin. Sci. (Lond.) 85
:281-287）。
【０００５】 ホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、ホルモン及び成長因子により種々の細胞に
おいて活性化される。ＰＬＤが活性化される結果、ＰＡＰの加水分解によりホス
ファチジン酸（ＰＡ）が生成され、さらにＰＡホスホヒドラーゼによりジアシル
グリセロール（ＤＧ）に代謝されるようになる。好中球におけるＰＬＤによるＰ
Ａの生成は、レスピラトリーバースト酵素、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化に
結び付いている。リン酸化依存オキシダーゼ活性化中に、ＤＧではなく、ＰＡが
広範なタンパク質のリン酸化を誘発し、その最も顕著なものはＮＡＤＰＨオキシ
ダーゼ成分ｐ４７−ｐｈｏｘ（食細胞オキシダーゼ成分）である。ｐ４７−ｐｈ
ｏｘの不在は、ｐ４７−ｐｈｏｘ欠乏性慢性肉芽腫症（Ｐ４７−ＧＣＤ）と呼ば
れる遺伝子欠陥に関係する。Ｐ４７−ＧＣＤはエクソン２の始まりにおけるＧＴ
欠失により引き起こされる。ＧＴ欠失は、１１バクテリオファージ及び１５ＹＡ
Ｃクローンにおいて見出されている。
【０００６】 ２つの新規のヒトプロテインホスファターゼ及びそれをコードするポリヌクレ
オチドの発見は、免疫障害及び癌に関連する疾患の診断、予防及び治療において
有用な新規の組成物を提供することができ、当分野における必要性を満足するも
のである。
【０００７】 発明の概要 本発明は、集合的に「ＨＰＡ」と呼ばれ、個別に「ＨＰＡ−１」及び「ＨＰＡ
−２」と呼ばれる実質的に精製されたポリペプチド、ヒトホスファターゼを特徴
とする。一態様では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメン
トからなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に精製されたポ
リペプチド、ＨＰＡを提供する。
【０００８】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、又はそ
れらの配列のいずれかのフラグメントからなるアミノ酸配列に少なくとも９０％
アミノ酸同一性を有する実質的に精製されたＰＨＡの変異体を提供する。また本
発明は、上記アミノ酸配列の任意のものを含むポリペプチドをコードする単離さ
れ、精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。また本発明は、これらのアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも９
０％ポリヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変
異配列も含む。
【０００９】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１のフラグメント或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメントからな るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。さ
らに本発明は、これらのポリヌクレオチド配列の１つに厳密性条件下でハイブリ
ダイズする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列、並びにこれらのポリヌ
クレオチド配列の１つに相補的な単離され、精製されたポリヌクレオチド配列を
提供する。
【００１０】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２のフラグメント及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のフラグメントからなるグル
ープから選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され、精製されたポリヌク
レオチド配列を提供する。さらに本発明は、これらのポリヌクレオチド配列の１
つに少なくとも９０％ポリヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポ
リヌクレオチド変異配列、並びにこれらのポリヌクレオチド配列の１つに相補的
な単離され、精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。
【００１１】 さらに本発明は、請求されるポリヌクレオチド配列の任意の配列の少なくとも
フラグメントを含む発現ベクタを提供する。別の態様では、そのポリヌクレオチ
ド配列を含む発現ベクタは、宿主細胞内に含まれる。
【００１２】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１のフラグメント及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメントのアミノ酸配
列を含むポリペプチドを生成するための方法であって、（ａ）ポリペプチドの発
現に適した条件下でＨＰＡをコードするポリヌクレオチド配列の少なくともフラ
グメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、その宿主細胞培養
株からポリペプチドを回収する過程とを有する方法を提供する。
【００１３】 また本発明は、適当な医薬品担体とともに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：４のフラグメントのアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＨＰＡを含む医
薬品組成物を提供する。
【００１４】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１のフラグメント或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメントのアミ ノ酸配列を含むポリペプチドに結合する精製された抗体、並びにそのポリペプチ
ドに対する精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを提供する。
【００１５】 また本発明は、ＨＰＡのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与
する過程を含む、免疫障害を治療或いは予防するための方法を提供する。
【００１６】 また本発明は、ＨＰＡのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与
する過程を含む、癌を治療或いは予防するための方法を提供する。
【００１７】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＨＰＡをコードするポリ
ヌクレオチドを検出するための方法であって、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント或いはＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４のフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
の相補配列を生物学的サンプルの核酸の少なくとも１つにハイブリダイズさせ、
それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、そのハイブリダイ
ゼーション複合体を検出する過程とを有し、そのハイブリダイゼーション複合体
の存在が、生物学的サンプルにおいてＨＰＡをコードするポリヌクレオチドの存
在と相関をなすことを特徴とする方法を提供する。
【００１８】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。
【００１９】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。
【００２０】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。
【００２１】 定義 ここで用いるＨＰＡは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソ
ースからの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒト
を含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＨＰＡのアミノ酸配列である。
【００２２】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＨＰＡに結合される際に、ＨＰＡの量を
増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタン
パク質、核酸、炭水化物或いはＨＰＡに結合し、その作用を調節する任意の他の
分子を含む場合がある。
【００２３】 ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」はＨＰＡをコードする遺伝子の
代替形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ
、変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化する
場合もしない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を
有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然
変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これら
の種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列
において１回或いは２回以上生じる場合がある。
【００２４】 ここで用いるＨＰＡをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能的
に等価なＨＰＡをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの
欠失、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチ
ドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができ
る場合もできない場合もある多形性及びＨＰＡをコードするポリヌクレオチド配
列に対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適当な或い
は予想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク質は
「変化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＨＰＡをもたらすアミ
ノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置換は、Ｈ
ＰＡの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性
並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に
帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミ
ノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性
頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン
、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含む。
【００２５】 ここで用いる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド
或いはタンパク質配列及びその断片、並びに自然発生或いは合成分子のことであ
る。ＨＰＡの断片は長さが約５〜約１５アミノ酸であり、ＨＰＡの生物学的活性
或いは免疫学的活性を保持していることが好ましい。「アミノ酸配列」は自然発
生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして表されるが、アミノ酸配列等
の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全な自然アミノ酸配列にそのア
ミノ酸配列を限定することを意味しない。
【００２６】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般
に当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行され
る（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratgry M anual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。
【００２７】 ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＨＰＡに結合される際にＨＰＡの生物学
的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパ
ク質、核酸、炭水化物或いはＨＰＡに結合し、ＨＰＡの作用を減少させる任意の
他の分子を含む場合がある。
【００２８】 ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆ
ａ、Ｆ（ａｂ′）2及びＦｖのような無傷の分子及びその断片のことである。Ｈ ＰＡポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さなペプチドを
含む無傷のポリペプチド或いは断片を用いて作製ことができる。動物を免疫する
ために用いられるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来す
るか、或いは化学的に合成され、所望により担体タンパク質に結合することがで
きる。ペプチドに化学的に結合される通常用いられる担体は、ウシ血清アルブミ
ン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニンを含む。その後結
合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット或いはウサギ）を免疫す
る。
【００２９】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すな
わちエピトープ）のことである。タンパク質或いはその断片を用いて宿主動物を
免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次
元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或い
は構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷
の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と競合する
場合がある。
【００３０】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補
的なヌクレオチド配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、
「センス」鎖に相補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペ
プチド核酸を含み、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができ
る。一度細胞内に導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然
配列と結合し、二重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「
負（マイナス）」はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プ
ラス）」はセンス鎖を示す場合に用いられることがある。
【００３１】 ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは
生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然
、組換え或いは合成ＨＰＡ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或い
は細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のこと
である。
【００３２】 ここで用いる「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度
条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−
Ｔ」の場合、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性
は、核酸のあるものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が
一本鎖分子間に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度
合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。
これは核酸鎖間の結合に及びＰＮＡ分子の設計及び使用に依存する増幅反応にお
いて特に重要である。
【００３３】 ここで用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、所与のポリヌ
クレオチド配列を含む任意の組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態
或いは水溶液状態を含む。ＨＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をコードするポリヌ
クレオチド配列或いはその断片（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びその断片）を
含む組成物はハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。その
プローブは凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と関連すること
もできる。ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類（例えばＮａＣｌ
）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、
サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散される場合もある。
【００３４】 ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するた
めに再配列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer
, Norwalk, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いは断片構築用コ
ンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GCG, Madis
on WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されてい るもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コンセンサ
ス配列を生成している。
【００３５】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析
によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に類似のリボ核酸の存
在の検出が、サンプルにおいてＨＰＡをコードするｍＲＮＡの存在を示しており
、それによりそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現
と相関があることを示す。
【００３６】 ここで用いる「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにお
いて変化し、１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如する
ことである。
【００３７】 ここで用いる用語「誘導体」は、ＨＰＡをコードする核酸配列或いはＨＰＡ又
はコードされたＨＰＡの相補配列の化学修飾体のことである。そのような修飾の
例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核
酸誘導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチドをコ
ードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレングリコー
ル形成（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学的機
能を保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。
【００３８】 ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同
性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が
標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実
用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列
の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブ
リダイゼーション検定法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブ
リダイゼーション等）を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或
いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的
配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な
結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密性条件は、
２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを
必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（
例えば約３０％同一性より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合
もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配
列にハイブリダイズしないであろう。
【００３９】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、大きさが１０Ｋから１０ＭのＤＮＡ配列を含み
、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含む直鎖
状の小染色体である（Harrington等(1997) Nat Genet.15:345-355）。
【００４０】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合
領域内においてアミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持し
ている抗体分子のことである。
【００４１】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して
相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。
【００４２】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基
との間、並びに相補的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つ
の核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタ
ッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は
、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（
例えばＣ0ｔ或いはＲ0ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固
形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又
は細胞或いはその核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化さ
れる別の核酸配列との間に形成することもできる。
【００４３】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いは
それ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或い
はヌクレオチド配列における変化のことである。
【００４４】 ここで用いる「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィ
ルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持
体上で合成される個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるア
レイのことである。
【００４５】 ここで用いる用語「調節」は、ＨＰＡの生物学的活性の変更ことである。例え
ば調節により、ＨＰＡのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的或い
は免疫学的特性が増減するようになる。
【００４６】 ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌ
クレオチド並びにその断片、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合があるゲノム或
いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアンチセンス
鎖を表す。「断片」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸配列であり、長さ
が少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌクレオチド、さら
に少なくとも１０，０００ヌクレオチドである断片を含むことが最も好ましい。
【００４７】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６
０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、
より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハ
イブリダイゼーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、
オリゴヌクレオチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アン
プリマ」、「プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である
。
【００４８】 ここで用いる「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡは、リジンにおいて終端する
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオ
チドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（an
ti-gene agent）ことである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の 寿命を延長し、その中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延
長を停止する（Nielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63）。
【００４９】 ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＨＰＡをコードす
る核酸或いはその断片又はＨＰＡ自体を含むと予想される生物学的サンプルは、
溶液中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（tissue print）等
に結合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から単
離された膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含む。
【００５０】 ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或
いはペプチドとアゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことであ
る。その相互作用は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すな
わち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトー
プ「Ａ」に対して特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけ
るエピトープＡ（或いは遊離し、標識されないＡ）及びその抗体を含むタンパク
質の存在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。
【００５１】 ここで用いる「厳密性条件」或いは「厳密性」は、核酸、塩類及び温度により
定義されるようなハイブリダイゼーションのための条件である。これらの条件は
当分野において周知であり、その条件を変更して、同一或いは関連するポリヌク
レオチド配列を同定或いは検出することができる。低い或いは高い厳密性のいず
れかを含む多くの等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さ及
び性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中或いは固形
基質上に固定）、塩類或いは他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン
並びに又ポリエチレングリコール）及び反応の温度（プローブの融解温度より約
５℃低い温度から溶融温度より約２０〜２５℃低い温度までの範囲にある）のよ
うな要因に依存する。１つ或いはそれ以上の要因を変更して、上記条件とは異な
るが、等価である低或いは高厳密性のいずれかの条件を発生させることもできる
。
【００５２】 例えば、高い厳密性条件の下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２
℃における約５０％のホルムアミド濃度で生じるようになる。低い厳密性条件の
下でのハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃の温度での約３５％〜２５
％のホルムアミド濃度で生じるようになる。詳細には、高い厳密性条件の下での
ハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミド濃度、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．
３％ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌの剪断された変性サケ精子ＤＮＡを用いて４
２℃で生じるようになる。低い厳密性条件の下でのハイブリダイゼーションは、
上記の条件で、温度を３５℃に下げ、ホルムアミド濃度を３５％にする際に生じ
るようになる。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、目的の核酸のプリ
ン対ピリミジン比を計算し、それに従って温度を調節することによってさらに狭
めることができる。上記の温度範囲及び条件の変更については当分野で周知であ
る。
【００５３】 ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単
離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それら
は自然に関連する他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には
９０％含まないものである。
【００５４】 ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸
が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。
【００５５】 ここで定義する「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させ
るプロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或
いは人工的条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核
或いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。そ
の方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイル
ス感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合
がある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含
んでおり、その細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或い
はその宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞
は、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も
含む。
【００５６】 ここで用いるＨＰＡの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸により変
更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があり
、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換える
場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあるが
、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的に
」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、又
はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくアミ
ノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に周知
のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR softwareを用いて見出すことができ
る。
【００５７】 発明 本発明は、２つの新規のヒトホスファターゼＨＰＡ−１及びＨＰＡ−２（これ
以降集合的に「ＨＰＡと呼ばれる」）並びに免疫障害及び癌に関連する疾患の診
断、予防或いは治療におけるこれらの組成物の使用法の発見に基づくものである
。
【００５８】 本発明のＨＰＡ−１をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対する
コンピュータ検索を用いて、膀胱ｃＤＮＡライブラリ（ＢＬＡＤＮＯＴ０６）か
らのインサイト社クローン１７１９４１８において最初に同定された。コンセン
サス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、重複並びにまた伸長した核酸配列、インサ
イト社クローン１７１９４１８（ＢＬＡＤＮＯＴ０６）、１９８５９４８（ＬＵ
ＮＧＡＳＴ０１）、１７２３９３７（ＰＲＧＳＮＯＴ１４）、０３１１８７（Ｔ
ＨＰ１ＮＯＢ０１）及び１１７７７６（ＫＩＤＮＮＯＴ０１）に由来した。
【００５９】 一実施例では、本発明は、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに示されるような、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＨＰＡ−１は長
さが２８５アミノ酸であり、残基Ｓ115、Ｓ256及びＴ268において３つの潜在的 なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を、残基Ｎ143において１つの潜在的なＮ グリコシレーション部位を、残基Ｆ256において１つの潜在的なプロテインキナ ーゼＣリン酸化部位を有する。図２に示されるように、ＨＰＡ−１はホスファチ
ジン酸ホスファターゼ（ＧＩ １４８７８７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と化学
的及び構造的相同性を有する、詳細には、ＨＰＡ−１及びホスファチジン酸ホス
ファターゼは７２％同一性を有し、残基Ｓ115及びＴ268においてカゼインキナー
ゼＩＩリン酸化部位を共有する。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＨＰＡ−
１及びホスファチジン酸ホスファターゼは、類似の疎水性プロットを有する。ノ
ーザン分析は種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示しており、その少な
くとも４８％は不死化或いは癌性であり、その少なくとも２５％は免疫反応に関
連する。
【００６０】 本発明のＨＰＡ−２をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対する
コンピュータ検索を用いて、胃腸ｃＤＮＡライブラリ（ＣＯＬＮＮＯＴ２２）か
らのインサイト社クローン１７３４４５２において最初に同定された。コンセン
サス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、重複並びにまた伸長した核酸配列、インサ
イト社クローン１７３４４５２（ＣＯＬＮＮＯＴ２２）、２０９９４６６（ＢＲ
ＡＩＴＵＴ０２）、１５２８３２２（ＵＣＭＣＬ５Ｔ０１）、８０９２５６（Ｌ
ＵＮＧＮＯＴ０４）、８８７２０２（ＰＡＮＣＮＯＴ０５）、１８５１１８６（
ＬＵＮＧＦＥＴ０３）、５１３１４５（ＭＰＨＧＮＯＴ０３）、１６７６４２１
（ＢＬＡＤＮＯＴ０５）及び１４４３４８５（ＴＨＹＲＮＯＴ０３）に由来した
。
【００６１】 一実施例では、本発明は、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ及び４Ｇに
示されるような、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含
む。ＨＰＡ−２は長さが３７０アミノ酸であり、残基Ｓ111において１つの潜在 的なｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼリン酸化部位を、残基Ｎ 313 において１つの潜在的なＮグリコシレーション部位を、残基Ｔ16、Ｓ40、Ｓ7 4 、Ｓ114、Ｓ140、Ｓ176、Ｓ200及びＴ354において８つの潜在的なカゼインキナ
ーゼＩＩリン酸化部位を、残基Ｓ74、Ｓ99、Ｓ144、Ｓ212、Ｓ315及びＴ354にお
いて６つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する。図２に示され
るように、ＨＰＡ−２はｐ４７−ｐｈｏｘ（ＧＩ ２２８５７９０、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：６）と化学的及び構造的相同性を有する、詳細には、ＨＰＡ−２及び ｐ４７−ｐｈｏｘは９６％同一性を有し、ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存プロテ
インキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位のうちの６つ、
及び全てのプロテインＣリン酸化部位を共有する。図６Ａ及び図６Ｂに示される
ように、ＨＰＡ−２及びｐ４７−ｐｈｏｘは、類似の疎水性プロットを有する。
ノーザン分析は種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示しており、その少
なくとも５１％は不死化或いは癌性であり、その少なくとも２１％は免疫反応に
関連する。
【００６２】 また本発明はＨＰＡ変異体を含む。好適なＨＰＡ変異体はＨＰＡアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０
％のアミノ酸配列同一性を有し、ＨＰＡの少なくとも１つの生物学的、免疫学的
或いは他の機能的な特徴又は活性を保持するものである。最も好ましいＨＰＡ変
異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有するもので
ある。
【００６３】 また本発明はＨＰＡをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＨＰＡのア
ミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いてＨＰＡを発現する組換え分子を
生成することができる。特定の実施例では本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ及
び図１Ｄに示されるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の核酸配列を含むポリヌクレオ
チドを含む。
【００６４】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＨＰＡをコードする多数のヌクレオチド配
列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最
低限の相同性を示すものもあることは当業者には明らかであろう。このように本
発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成される
ようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの組
み合わせは、自然発生ＨＰＡのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なト
リプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形例が明確に開
示されているものと考慮されたい。
【００６５】 ＨＰＡをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択された
厳密性条件下で、自然発生ＨＰＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズできるこ
とが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＨＰＡをコードするヌク
レオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コドンを選
択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチドの発現
が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。コード
されたアミノ酸配列を変更することなくＨＰＡをコードするヌクレオチド配列及
びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期のような、自然発
生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を生成する
ことを含む。
【００６６】 また本発明は、合成化学的に完全に、ＨＰＡ及びその誘導体をコードするＤＮ
Ａ配列或いはその断片を生成することを含む。生成後、本特許出願の出願時点で
当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手可能な発現
ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、ＨＰＡをコー
ドする配列或いは任意のその断片に突然変異を導入することもできる。
【００６７】 また本発明にはWahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol. Vol. 152:39
9-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol 152: 507-511)に教示され
るような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレオチド配列、詳細にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される
ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が含
まれる。
【００６８】 当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或 いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。
【００６９】 ＨＰＡをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプロ
モータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において既
知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合があ
る１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣接
する未知の配列を回収する（Sarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:318-322 ）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域に
特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増幅された配列は、同じリ
ンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用いて第２
巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラー
ゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。
【００７０】 また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅
或いは伸長することもできる（Triglia T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186 ）。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
nc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用
いて、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さ
らに約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。その方
法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域に適当な断片を生成する
。その際その断片は、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣＲテンプレートと
して用いられる。
【００７１】 用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配
列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lagerstrom M
等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19）である。この方法では、多数の制限 酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二本鎖配列
をＤＮＡ分子の未知の断片に配置することができる。
【００７２】 未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD 等
(1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060)による方法である。さらにある方法 はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを用いて、ゲノムＤ
ＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスにより
ライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソン接合部
を見つける際に有用である。完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする際に、
より長いｃＤＮＡを含むように大きさを選択されたライブラリを用いることが好
ましい。またランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の
５´及び上流領域を含むより大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに
初回抗原刺激を受けたライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長
ｃＤＮＡを産生しない状況では特に好ましい。ゲノムライブラリは５´非転写制
御領域に配列を伸長するために有用な場合がある。
【００７３】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyperTM及びSequence NavigatorTM 、Perkin Elmer）を用いて電
気信号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示ま
での全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプ
ルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好まし
い。
【００７４】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチド配列或いはそ
の断片が、適当な宿主細胞においてＨＰＡ、その断片或いはその機能的等価物の
発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる場合がある。ゲノムコード
の固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードす
る他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＨＰＡをクローニングし、発現
することもできる。
【００７５】 非自然発生コドンを有するＨＰＡをコードするヌクレオチド配列を生成するこ
とが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核或い
は真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増加し
たり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所望の
特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。
【００７６】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＨＰＡ
をコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝子
操作することができる。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムな断
片化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチド配列を遺伝子操
作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限部位
の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の変更、スプライシ
ング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともできる。
【００７７】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡをコードする自然、修飾或いは組換えポリヌ
クレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されることも
できる。例えば、ＨＰＡ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをスクリーニ
ングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＨＰＡタンパク質
をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、ＨＰＡをコード
する配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように遺伝子操
作されることもでき、それによりＨＰＡは切断され、異種部分から離れて精製さ
れるようになる。
【００７８】 別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＨＰＡをコードする配
列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（Caruthers MH 等 (1980)
Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 22
5-232参照）。別法では、タンパク質自体が、ＨＰＡのアミノ酸配列或いは一部 を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えばペプチド合
成は種々の固相技術（Roberge JY 等(1995) Science 269:202-204）を用いて実 行することができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin
Elmer)を用いることにより実現することができる。
【００７９】 新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的
に精製されることができる（例えばCreighton (1983) Proteins, Structures an d Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。合成ペプチドの
組成物は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる（例えばEdma
n degradation procedure; Creighton、上記）。さらにＨＰＡのアミノ酸配列或
いはその任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質
或いはその任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異体ポ
リペプチドを生成することもできる。
【００８０】 生物学的に活性のＨＰＡを発現するために、ＨＰＡをコードするヌクレオチド
配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコード
化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入されても
よい。
【００８１】 当業者に周知の方法を用いて、ＨＰＡをコードする配列及び適当な転写或いは
翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲノム組
換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989) Molecular Cloning, A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY及びAusubel FM 等 (19
89) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York
NYに記載されている。
【００８２】 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨＰＡをコードする配列を含有し、発
現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、プ
ラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母発
現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系（例
えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例
えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ
）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ或い
はｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明は用
いられる宿主細胞により制限されない。
【００８３】 「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン
ハンサ、プロモータ並びに５´及び３´非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及
び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成
的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用
いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc
ript ファージミド(Stratagene, LaJolla CA) のハイブリッドｌａｃＺプロモー
タ或いはpSport 1 プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用いることが
できる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に
用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば
熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに
由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリー
ダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺
乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＨＰＡ
をコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合には、
ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いることがで
きる。
【００８４】 バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＨＰＡのための使用に応じて選
択されてもよい。例えば大量のＨＰＡが抗体を誘導するために必要とされるとき
、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いること
ができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＨＰＡをコードする
配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対する配
列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生成され
る、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript(Stratagene)のような発現
ベクタ、並びにｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:
5503-5509）等を含む。またｐＧＥＸベクタ（Promega, Madison WI）を用いて、
外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する
融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融合タンパク質は可溶
性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそれに後続する遊離グ
ルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精製することができる
。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは第ＸＡ
因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象のクローニングされたポ
リペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。
【００８５】 酵母、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いる
ことができる。再確認する場合には、Ausubel 等 (上記)及びGrant等(1987) Met
hods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。
【００８６】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨＰＡをコードする配列の発現は、い
くつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及び
１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶからの
ω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6:307
-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ或
いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Broglie
等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Result
s Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、直 接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されること
ができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例えば、
Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1
992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。
【００８７】 また昆虫系もＨＰＡを発現するために用いることができる。例えばある系では
、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして用
いて、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫 （Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＨＰＡをコードする 配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域にク
ローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＨＰＡをコードす
る配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり、コー
トタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。その後組換えウイルスを
用いて、ＨＰＡが発現される、例えばヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバ幼
虫を感染させる（Engelhard EK 等 (1994), Proc Nat Acad Sci 91:3224-3227）
。
【００８８】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨＰＡをコードする配
列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳
複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域内
の挿入により、感染した宿主細胞においてＨＰＡを発現することができる生ウイ
ルスを得ることができる（Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:365
5-59）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハン
サを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させることができる。
【００８９】 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きな断片を送達することもできる。治療のため、６−
１０ＭのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノ
ポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。
【００９０】 また特異な開始シグナルを用いて、ＨＰＡをコードする配列のより効率的な転
写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含
む。ＨＰＡをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベクタ
内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要である。し
かしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開
始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに開始コ
ドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなければな
らない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の起源
からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、使用される特
定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある（Sc
harf D 等 (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-162）。
【００９１】 さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の
ように発現したタンパク質を処理できるように選択することができる。そのよう
なポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプ
ロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並
びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために特異な細胞機構及び
特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ
２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection（ATTC; Bethesda,
MD）から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確
実にするように選択することができる。
【００９２】 長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま
しい。例えば、ＨＰＡを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エレメ
ントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝子を
含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタの導入に続いて、細
胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるようにする
。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在により
、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安定
して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技術を
用いて増殖させることができる。
【００９３】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ-細胞或いはａｐｒｔ-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎ ｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれ クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移 酵素への耐性を与える（Murry、上記）。さらに選択可能遺伝子が記載されてお り、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニダー
ゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのような
マーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定するのみ
ならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の量を
定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995) Methods Mol Biol 55:12
1-131）。
【００９４】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＨＰＡをコードする配列がマー
カ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＨＰＡをコードする配列を含む組換え細
胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、マー
カ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨＰＡをコードする配列と直列に配置
される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列型遺伝子
の発現を示す。
【００９５】 別法では、ＨＰＡをコードする核酸配列を含み、ＨＰＡを発現する宿主細胞は
、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は、限
定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、溶液
或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ
ーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。
【００９６】 ＨＰＡをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＰＡをコードするポリ
ヌクレオチドのプローブ或いは断片を用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮ
Ａハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されることができる。核酸増幅
系アッセイは、ＨＰＡをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出
するために、ＨＰＡをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴ
マを使用することを伴う。
【００９７】 ＨＰＡの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパク質
に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用い
ており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである。
ＨＰＡにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用い
る２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した検
定法及び他の検定法は、Hampton R 等(1990, Serological Methods, a Laborato ry Manual, APS Press, St. Paul MN)及びMaddox DE 等 (1983, J Exp'Med 158:
1211-1216)に記載される。
【００９８】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＨＰＡをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロー
ブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標
識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨＰＡを
コードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベク
タ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において知ら
れ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラー
ゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販のキッ
ト（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Biochemi
cal Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは標識 が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生
産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。
【００９９】 ＨＰＡをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞培養
からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることができ
る。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベ
クタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＨＰＡをコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＨＰＡ
の分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは当業者には
理解されよう。他の組換え構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を容易にする
ポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＨＰＡをコードする配列を結
合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定はしないが、固定
化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュールのよう
な金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるようにするタ
ンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immunex Corp., Seati
le, WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＨＰＡとの間に第
ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に対して特異 な配列のような分割可能リンカー配列を含有することにより、精製が容易になる
場合もある。１つのそのような発現ベクタが、ＨＰＡ及びチオレドキシン或いは
エンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸を含む
融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ（Porath, J. 等 (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)に記載されるような固定化金属イオン
親和性クロマトクグラフィ）において精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切
断部位は融合タンパク質からのＨＰＡを精製するための手段を提供する。融合タ
ンパク質を含むベクタの議論はKroll,D.J.等(1993;DNA Cell Biol. 12:441-453)
に与えられる。
【０１００】 組換え生成物に加えて、ＨＰＡの断片は、固相技術（Merrifield J (1963) J
Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成される場合も
ある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行されることが
できる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elme
r)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることにより自動合成を実
現してもよい。ＨＰＡの種々の断片は化学的に個別に合成されるか、或いは化学
的方法を用いて結合され、完全長分子を生成することができる。
【０１０１】 治療 ＨＰＡ−１とマウスからのホスファチジル酸ホスファターゼ（ＧＩ １４８７
８７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の間、ＨＰＡ−２とラットからのｐ４７−ｐｈ
ｏｘ（ＧＩ ２２８５７８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）との間には、化学的及び
構造的相同性がある。またノーザン分析の結果から、組織におけるＨＰＡ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の発現が、免疫障害及び癌に
関連する疾患に関係することがわかる。
【０１０２】 それゆえ一実施例では、ＨＰＡのアンタゴニスト或いはそのフラグメント又は
誘導体が被検者に投与され、癌を治療或いは予防することができる。そのような
癌は、限定はしないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び
奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節
、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺
、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一態様
では、ＨＰＡを特異に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接或いは標的又
は送達機構として間接的に、ＨＰＡを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶ
ために用いることができる。
【０１０３】 さらに別の実施例では、ＨＰＡのアンタゴニストを被検者に投与して免疫障害
を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限定はしないが、ＡＩ
ＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテロー
ム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風
、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症
、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発
筋炎、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性甲状腺炎、
及び癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄
生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷を含む場合もある。
【０１０４】 さらに別の実施例では、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む障害を治療或
いは予防することができる。 それゆえ一実施例では、ＨＰＡのアンタゴニスト
を被検者に投与して免疫障害を治療或いは予防することができる。免疫障害は、
限定はしないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧
血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性
大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃
炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅班
性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節炎、
骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、
自己免疫性甲状腺炎、及び癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス感染、細
菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷を含む場合
もある。一態様では、ＨＰＡを特異に結合する抗体が、アンタゴニストとして直
接或いは標的又は送達機構として間接的に、ＨＰＡを発現する細胞又は組織に医
薬品因子を運ぶために用いることができる。
【０１０５】 さらに別の実施例では、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む障害を治療或
いは予防することができる。
【０１０６】 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。
【０１０７】 ＨＰＡのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されること
ができる。詳細には、精製されたＨＰＡを用いて抗体を生成するか、或いは医薬
品因子のライブラリをスクリーニングし、ＨＰＡと特異に結合するものを同定す
ることができる。
【０１０８】 ＨＰＡに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる。そ
のような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、
一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグ
メントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治療
上の使用に適している。
【０１０９】 抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＨＰＡ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペプ
チドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジ
ュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバント
は、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミ
ネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチ
ド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよう
な表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カル
メット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。
【０１１０】 ＨＰＡに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、
或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、よ
り好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それらは
自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子からな
る完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＨＰＡアミノ酸の短い伸展部はキ
ーホールリンペットヘモシアニンのような別のタンパク質の伸展部及びキメラ分
子に対して生成される抗体と融合されることもできる。
【０１１１】 ＨＰＡに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子の
生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は、限
定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ
−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozbor 等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci 80
:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。
【０１１２】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ＨＰＡ特異性一本鎖抗体を生成してもよ
い。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が、
ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成される
こともできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-11123）。
【０１１３】 また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或 いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。
【０１１４】 またＨＰＡに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させること
もできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子のペ
プシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ（ａ
ｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することが
できるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを、所望の
特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定で
きるように作製してもよい（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）。
【０１１５】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＨＰＡとその特異的抗体との間の複合形成体を測定
することを含む。２つの非干渉性ＨＰＡエピトープに反応するモノクローナル抗
体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タンパ
ク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。
【０１１６】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチド或いはその任
意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様では、
ＨＰＡをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡの転写を遮
断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、ＨＰＡをコ
ードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることができる。この
ように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＨＰＡ活性を調節するか、或いは
遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当分野では周知で
あり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大きなフラグメン
トを、ＨＰＡをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿った種々の位置か
ら設計することができる。
【０１１７】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＨＰＡをコードする遺伝子のポリヌクレオチ
ドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる。これらの技術
は、Sambrook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)の両方に記載される。
【０１１８】 ＨＰＡをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＨＰＡをコードする高レベ
ルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質転換
することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳できないセン
ス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内に統
合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼにより無
能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非
複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメントが
ベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。
【０１１９】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ＨＰＡをコードする遺伝子の制御、５´或
いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に対す
る相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計する
ことにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−１
０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重らせ
ん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制
がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよう
になるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩
は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immunol ogic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY)に記載されている。ま た相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐ
ことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる。
【０１２０】 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＨＰＡをコードする配列のヌクレオチド鎖切
断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハンマ
ヘッドモチーフリボザイムを含む。
【０１２１】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。
【０１２２】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨＰＡをコードするＤＮＡ配列のin vitro及び in vivo転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或い はＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ内
に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ作成物は、相補ＲＮＡを
合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入することがで
きる。
【０１２３】 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。
【０１２４】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の 場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達（Goldman, C.K. 等(1
997）Nature Biotechnology 15:462-66、参照して本明細書の一部としている)は
、当分野で周知の方法を用いて実現することができる。
【０１２５】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検体に適用
されることができる。
【０１２６】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＨＰＡ、ＨＰＡに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト或い
はＨＰＡのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限定はし
ないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の滅菌の生体適
合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少なくと
も１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組成物は
単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与しても
よい。
【０１２７】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。
【０１２８】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。
【０１２９】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。
【０１３０】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。
【０１３１】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。
【０１３２】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。
【０１３３】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。
【０１３４】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３５】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。
【０１３６】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク
ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。
【０１３７】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＨＰＡの投与の場合、そのようなラベル
貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。
【０１３８】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。
【０１３９】 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。
【０１４０】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＨＰＡ或いはそのフ
ラグメント、ＨＰＡの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＨＰＡのイン
ヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び毒性は
、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０（集団
の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死する量
）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数であ
り、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬
品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒ
トに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投
与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内
にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び投与経
路によりこの範囲内で変化する。
【０１４１】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。
【０１４２】 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。
【０１４３】 診断 別の実施例では、ＨＰＡを特異に結合する抗体を、ＨＰＡの発現により特徴付
けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＨＰＡ、アゴニスト、アンタゴニ
スト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法において
用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した方法と
同様の方法で調製することができる。ＨＰＡに対する診断検定法は、抗体及び標
識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＨＰＡを検出する方
法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いることができ、リポータ分子
と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することにより標識されることがで
きる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることができ、そのい
くつかが上記される。
【０１４４】 ＨＰＡを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロト
コルが当分野において知られており、ＨＰＡ発現の変更されたレベル或いは異常
なレベルを診断するための方法を提供する。ＨＰＡ発現のための正常或いは標準
的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液或いは
細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＨＰＡに対する抗体と結合することに
より確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量することができ
るが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＨＰＡの量、制御
及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被検者値と
の間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。
【０１４５】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡをコードするポリヌクレオチドを診断のため
に用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列
、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを用
いて、ＨＰＡの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現を検
出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＨＰＡの存否及び過剰発現
を識別することができ、さらに治療処置中のＨＰＡレベルの調節をモニタするこ
とができる。
【０１４６】 一態様では、ＨＰＡ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブリ
ダイゼーションにより、ＨＰＡをコードする核酸配列を同定することができる。
非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、或い
は特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプローブの
特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中間或
いは低）が、そのプローブがＨＰＡをコードする自然発生配列、アレルのみを同
定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。
【０１４７】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＨＰＡをコードする
配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ましい
。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメ
ント及び自然発生ＨＰＡのイントロンを含むゲノム配列に由来する。
【０１４８】 ＨＰＡをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプローブを
生成するための手段は、ＨＰＡ或いはＨＰＡ誘導体をコードする核酸配列を、ｍ
ＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そのよう
なベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリメラーゼ及び
適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプローブを合成
するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のリ
ポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射性核種、又はアビジン／ビオ
チン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファターゼのよう
な酵素標識により標識されることができる。
【０１４９】 ＨＰＡをコードするポリヌクレオチド配列はＨＰＡの発現に関連する障害の診
断のために用いることができる。そのような障害は、限定はしないが、腺癌、白
血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱
、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺
、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸
腺、甲状腺、及び子宮のような癌、並びにＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫
症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢
炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫
、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症
、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜
の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関節炎、強皮症
、シェーグレン症候群、自己免疫性甲状腺炎、及び癌、血液透析、体外循環の合
併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感
染；及び外傷のような免疫障害とを含む。ＨＰＡをコードするポリヌクレオチド
配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜系技術に
おいて、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＨＰＡ発現を検出するために
患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティック、ｐｉｎ、ＥＬＩ
ＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができる。そのような定性
的或いは定量的方法は当分野において周知である。
【０１５０】 特定の態様では、ＨＰＡをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に上
記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。ＨＰ
Ａをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブリダ
イゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サンプル
に加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは洗浄
され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽出さ
れたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく変更
されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列と
ハイブリダイズされており、サンプル内のＨＰＡをコードするヌクレオチド配列
の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法を用い
て、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の治療措
置の有効度を評価することができる。
【０１５１】 ＨＰＡの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する正
常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検者
から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適した
条件下でＨＰＡをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することにより
与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られた値
を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から得ら
れた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得られた
標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される。標
準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。
【０１５２】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。
【０１５３】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。
【０１５４】 ＨＰＡをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらなる
診断上の使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学的
に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよい。
オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向（５´−＞３
´）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３´＜−５´）を有するヌクレオチ
ド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下で
用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ、
或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配
列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いることができる。
【０１５５】 またＨＰＡの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチド
の放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果が書
き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods, 159
:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプルを 定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速す
ることができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペクト
ル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。
【０１５６】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチド或いはその長寸のフラグメントをマイクロアレイ
の標的として用いることもできる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタし（転写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突
然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、
疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断する際に有用であり、また治療薬剤
の活性を発生及びモニタする際に有用であろう。
【０１５７】 一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願
ＷＯ９５／１１９９５（Chee等）、Lockhart, D.J.等（1996; Nat. Biotech. 14
:1675-1680）及びSchena, M等（1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619
）に記載される方法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。
【０１５８】 マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され
るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ
がからなることが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは長さが約６−６０ヌクレ
オチドであることが好ましく、１５−３０ヌクレオチドであることがより好まし
く、約２０−２５ヌクレオチドであることが最も好ましい。ある種のマイクロア
レイの場合、長さが７−１０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを用いる
ことが好ましいこともある。マイクロアレイは、既知の５´或いは３´配列に及
ぶオリゴヌクレオチド、完全長配列に及ぶ連続的なオリゴヌクレオチド、或いは
その配列の長さに沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを
含む場合がある。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは対象の遺伝子
に特異なオリゴヌクレオチドであり、その中では少なくともその配列のフラグメ
ントが既知であるか、或いは特定の細胞タイプ、発生的或いは疾患状態に共通の
１つ或いはそれ以上の未同定のｃＤＮＡに特異である。
【０１５９】 あるマイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成するた
めに、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５´或いはより好ましくは３´末端
で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズムは
、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内にＧＣ含
有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉することがある予測される副構造体
のない所定の長さのオリゴマを同定する。ある状況では、マイクロアレイにおい
てオリゴヌクレオチドの対を用いることが適切である。その「対」は、好ましく
は中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて同一であろう。その対の第２の（
１つだけ一致しない）ヌクレオチドは、制御体として機能する。オリゴヌクレオ
チド対の数は２−１００万の範囲にある。そのオリゴマは、光照射化学処理（li
ght-directed chemical process）を用いて支持体上の指定された領域で合成さ れる。支持体は紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ、スライド
ガラス或いは任意の他の適切な固定支持体である。
【０１６０】 別の態様では、オリゴヌクレオチドは、参照してその全体を本明細書の一部と
しているＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載される
ような、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体
の表面上で合成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット）
ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイ(HYBRIDOT apparatus, Life T
echnologies)を用いて、真空系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合
手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチ
ドを配列及び結合することができる。さらに別の態様では、アレイは手動で或い
は市販の装置、材料及び機器(including Brinkmann multichannel pipettors or
robotic instruments)を用いて生成され、８ドット、２４ドット、９６ドット 、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４オリゴヌクレオチド、又は市販
の機器を有効に使用するのに適した２〜１，０００，０００の任意の他の数量を
含む。
【０１６１】 マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生物学的サンプルから
ポリヌクレオチドが抽出される。生物学的サンプルは任意の体液（例えば血液、
尿、唾液、粘液、胃液等）、培養された細胞、バイオプシ或いは他の組織標本か
ら得ることができる。プローブを作製するために、サンプルから抽出されたポリ
ヌクレオチドを用いて、マイクロアレイ上の核酸に相補的な核酸配列を生成する
。マイクロアレイがｃＤＮＡからなる場合には、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ
）がプローブに適している。それゆえ一態様では、ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを
生成し、さらに蛍光性ヌクレオチドの存在下で、ｃＤＮＡを用いてフラグメント
或いはオリゴヌクレオチドａＲＮＡプローブを作製する。これらの蛍光標識され
たプローブは、マイクロアレイでインキュベートされ、プローブ配列がマイクロ
アレイのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするようにする。別の態
様では、相補的な核酸配列をプローブとして用いて、ハイブリダイゼーション技
術の領域で周知の制限酵素、ＰＣＲ技術及びオリゴ標識化（Oligolabelling）或
いはTransProbe kits (Amersham Pharmacia)を用いて、核酸配列としてポリヌク
レオチド、フラグメント、相補的或いはアンチセンス配列を作製することができ
る。
【０１６２】 インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的一致或
いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される。ハイブリダイズされな
かったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光のレベル及びパターンを確
定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイクロアレイ上の各オリゴヌ
クレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確定する。同時に、個々の
配列の全てに対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否或いは量
を測定することができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異、変異配
列或いは多形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができる。
【０１６３】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡをコードする核酸配列を用いて、自然発生ゲ
ノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生成
することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又は
Price CM (1993; Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ (1991; Trends Genet 7:14
9-154)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色
体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色
体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造にマッピンクされてもよい。
【０１６４】 蛍光in situハイブリダイゼーション（Verma 等(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NYに記載されるＦＩ
ＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関をな
す。遺伝子マップデータの例は種々の科学雑誌或いはOnline Mendelian Inherit
ance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＨＰ Ａをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対する素因との間
の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを可能に
する。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と保菌者、すなわち感染した
個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる。
【０１６５】 染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを 用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２３まで
(Gatti等(1998) Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局在され
ていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のための関
連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列を用い
て、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等により染
色体位置内の差を検出することができる。
【０１６６】 本発明の別の実施例では、ＨＰＡ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメント
又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものにお
いて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスクリ
ーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体に
付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。Ｈ
ＰＡと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。
【０１６７】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０
３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する
化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＨＰＡに適
用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或いはある
他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物はＨＰＡ或いはそのフ
ラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＨＰＡが当分野で周知の方
法により検出される。また精製されたＨＰＡは、上記の薬物スクリーニング技術
において用いるためのプレート上に直接コーティングされることもできる。別法
では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化
することもできる。
【０１６８】 別の実施例では、ＨＰＡを特異に結合することができる中和性抗体がＨＰＡを
結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用
する。このようにして、抗体を用いて、ＨＰＡと１つ或いはそれ以上の抗原決定
基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
【０１６９】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＨＰＡをコードするヌクレオチド配列を
、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。
【０１７０】 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。
【０１７１】
【実施例】
１ ｃＤＮＡライブラリーの作製 ＢＬＡＤＮＯＴ０６ ＢＬＡＤＮＯＴ０６ｃＤＮＡライブラリは、根治的膀胱切除、前立腺切除及び
尿路変更中の６６歳白人男性から得られた微視的に正常な膀胱及び関連する膀胱
腫瘍組織から作製された。非腫瘍組織（ＢＬＡＤＮＯＴ０６）は、膀胱の後壁か
ら除去された。またこれは、前方及び後方に前立腺の実質に対する広汎性の浸潤
を有する、前立腺及び尿道前立腺部のグレード３移行上皮癌に関連していた。外
科治療周辺部及び多数の骨盤リンパ節は腫瘍に対して陰性であった。患者は、前
立腺炎症性疾患を示した。患者には、経尿道前立腺切除、肺腫瘍、良性高血圧症
及び喫煙の病歴があった。家族には、母親に悪性の乳癌、父親に結核、兄弟に悪
性肺腫瘍、別の兄弟に高血圧症、脳血管障害及び動脈硬化性冠動脈疾患の病歴が
あった。
【０１７２】 ＣＯＬＮＮＯＴ２２ ＣＯＬＮＮＯＴ２２ライブラリは、小腸切除中の５６歳白人女性から切除され
た微視的に正常な結腸組織から作製された。患者は、回腸及び回腸結腸吻合を含
むクローン病と診断された。患者には、胆嚢切除及び乳房病変の病歴があった。
家族には、祖父にアテローム性動脈硬化症、母親に腸の機能障害の病歴があった
。
【０１７３】 ＢＬＡＤＮＯＴ０６＆ＣＯＬＮＮＯＴ２２ 冷凍組織をBrinkmann Homogenizer Polytron-PT 3000（Brinkmann Instrument
s, INC., Westbury, NJ）を用いてグアニジウムイソチオシアネート溶液の中で ホモジナイズし溶解した。この溶解産物を、Beckman L8-70M超遠心分離器におい
てBeckman SW28ロータを用いて（Beckman Instruments）、５．７Ｍの塩化セシ ウムクッションを用いて周囲温度で１８時間、１分当たり２５，０００回転の回
転数で遠心分離した。酸性フェノールｐＨ４．７を用いてＲＮＡを抽出し、０．
３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、ＲＮアー
ゼの無い水に再懸濁し、３７℃でＤＮアーゼ処理した。ＲＮＡの抽出及び沈殿を
上述したのと同様に反復した。次にこのｍＲＮＡをQiagen Oligotex kit（QIAGE
N, Chatsworth, CA）を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製のために用 いた。
【０１７４】 このｍＲＮＡを、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plas
mid Cloning (Cat. #18248-013, Gibco/BRL)における推奨プロトコルに従って取
り扱った。ｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム（Cat. #275105-01, Pharmacia）上
で分画化し、４００ｂｐを越えるサイズのｃＤＮＡをplNCYにリゲートした。次 いで、プラスミドplNCYをDH5αTMコンピテント細胞（Cat. #18258-012, Gibco/B
RL）に形質転換した。
【０１７５】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit（Catalog
#26173,QIAGEN, Inc.）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の 点を変更した。（１）２５mg/Lのカルベニシリン及び０．４%のグリセロールと 共に１mlの滅菌Terrific Broth （Catalog#22711, Life TechnologiesTM, Gaith
ersburg, MD）において細菌を培養した。（２）植菌の後、培地を１９時間イン キュベートし、インキュベーションの終わりに、細胞を０．３mlの溶解バッファ
に溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０
．１mlの蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９６
穴ブロックに移し４℃で保管した。
【０１７６】 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers （PTC200 from MJ Res
earch, Watertown, MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems と組み合わせてHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV）を用いてSang
er F.及びA.R. Coulsonの方法（1975, J. Mol. Biol.94:441f）により行い、読 み枠を決定した。
【０１７７】 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合
わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのよ うなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が
注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用 いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al
tschul. S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschulら(1990) J. Mol. B
iol. 215:403-10）。
【０１７８】 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配 列の類似性を決定する。そのアライメントの局所的性質のために、BLASTは厳密 な一致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源
とするホモログを求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャ
ップペナルティを処理する際には、この引用により本明細書の一部とするSmith
R.F.及びT.F. Smith（1992, Protein Engineering 5:35-51）に記載のもののよ うな他のアルゴリズムを用いることができる。本明細書に開示された配列の長さ
は少なくとも４９ヌクレオチドであり、不必要な塩基は１２％以下である（ここ
で、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ以外と記録されたものである）。
【０１７９】 BLAST法は、この引用により本明細書の一部とするKarlin. S.及びS.F. Altsch
ul（1993: Proc. Nat. Acad. Sci. 90:5873-7）に詳細に記載されているように 、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索し、発見したあらゆる配列
の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致
のみを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０-25、ペプチドで１０- 14 に設定した。
【０１８０】 ４ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術
であり、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞タイプまたは組織に由来する
ＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリダイゼーションを行う（Sambrook等、
前出）。
【０１８１】 BLAST（Altschul, S.F. 1993及び1990, 前出）を用いる類似のコンピュータ技
術で、GenBankまたはLIFESEQTMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）のよう
なデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多く
の膜ベースのハイブリダイゼーションと比較して極めて短時間で行うことができ
る。更に、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同
的であるかの分類を決定することができる。
【０１８２】 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義 されるものである。 （配列の一致率（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方を
考慮に入れている。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の
範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、
通常積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、
スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。
【０１８３】 ノーザン解析の検索の結果は、ＨＰＡをコードする転写物が発生するライブラ
リーのリストとして報告される。配列の存在量（abundance）、及びパーセント 存在率（percent abundance）のリストも報告される。存在量は、特定の転写物 の検出回数を直接反映し、パーセント存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラリー
内で検出された配列の総数で除したものである。
【０１８４】 ５ ＨＰＡをコードする配列の延長 インサイト社クローン１７１９４１８及び１７３４４５３の核酸配列を用いて
、部分的ヌクレオチド配列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプ
ライマーを設計した。一方のプライマーはアンチセンス方向の延長を開始するた
めに合成し、他方のプライマーはセンス方向に配列を延長するために合成した。
これらのプライマーを用いて、既知の配列を「外側に」延長し、対象の領域の新
しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを作り出した。初めのプライマ
ーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社）或いは他の適切なプログラムを用
いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長さで、５０％以上のＧＣ
含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計
した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じるようなヌクレ
オチドのストレッチは避けた。
【０１８５】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて配列を延長した 。２段階以上の延長が必要な場合は、既知領域をさらに延長するための別のプラ
イマーの組を設計する。
【０１８６】 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と
を徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。それぞれ４０ｐ
ｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅
を開始する場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Reserch, Watertown
MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行った。
【０１８７】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長するこ
とに成功したかを決定した。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか
ら切り出し、QIAQuickTM（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製し、ク レノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの突出を切り取って、再結合及びクロー
ニングを容易にする平滑末端を作った。
【０１８８】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのライゲーションバッファーに再溶解
し、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜イ
ンキュベートした。（４０μｌの適切な培養液のなかの）コンピテントな大腸菌
細胞を、３μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ
培養液（Sembrook等、上記）で培養した。３７℃で１時間のインキュベーション
の後、全ての形質転換した混合物を、２ｘ Ｃａｒｂを含むLuria Bertani（Ｌ Ｂ）アガー（Sembrook等、上記）上にプレートした。後日、いくつかのコロニー
を各プレートから無作為に選択し、適切な市販の滅菌した９６穴マイクロタイタ
ープレートの各ウェル内に入れられた１５０μｌの液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培
養液で培養した。さらに後日、５μｌの各一昼夜の培養物を非滅菌９６穴プレー
ト内に移し、水で１：１０に希釈した後、それぞれ５μｌのサンプルをＰＣＲア
レイに移した。
【０１８９】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行った。
【０１９０】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ
ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。
【０１９１】 同様に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順によ
って５′調節配列、５′延長のために設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切
なゲノムライブラリーを得る。
【０１９２】 ６ 各ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを用い
て、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基
対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラ
グメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO4.06（N
ational Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０
ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐32Ｐ]アデノシン三リン酸（Am
ersham）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組 み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Seph
adex G-25超精細樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて精製する。毎分１
０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、以下のエンドヌクレア ーゼ（AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII；DuPont NEN）の１つを 用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション
解析において用いる。
【０１９３】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン膜
（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）にトランスファーする。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシ
ル硫酸ナトリウムまでの、段階的に厳密性が増す条件で順次室温にて洗浄する。
XOMAT ARTMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager cassette（Mo
lecular Dynamics, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露光した後、ハ イブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０１９４】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作るために、本明細書に記載のヌク
レオチド配列を、ヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリズムを
用いて調べる。このアルゴリズムは、その遺伝子に独特で、ハイブリダイゼーシ
ョンに適した範囲内のＧＣ含量を有し、且つハイブリダイゼーションを妨げるよ
うな推定される２次構造が存在しない、決まった長さの各オリゴマーを同定する
。このアルゴリズムは、長さ２０ヌクレオチドの２０個の配列特異的オリゴヌク
レオチド（２０量体）を同定する。各配列の中央の１個のヌクレオチドだけが変
化している点を除いて一致しているオリゴヌクレオチドの組を作製する。このプ
ロセスはマイクロアレイにおける各遺伝子について反復され、２０個の２０量体
の組が二組、光照射化学プロセスを用いてシリコンチップの表面上で合成され配
列される（Chee, M. 等, PCT/WO95/11995、この引用により本明細書の一部とす る）。
【０１９５】 或いは、化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表面
上でオリゴマーを合成する（Baldeschweiler, J.D. 等, PCT/WO95/25116、この 引用により本明細書と一体にされたものとする）。更に別の形態では、ドットブ
ロット法（またはスロットブロット法）に類似した「格子型」アレイを用いて、
真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを利用してｃＤＮ
Ａ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に配置し結合させる。アレイは、手
を用いることにより、又は市販の材料及び機械を用いることによって製造するこ
とができ、８ドット、２４ドット、９４ドット、３８４ドット、１５３６ドット
、又は６１４４ドットの格子を有し得る。ハイブリダイゼーションの後、マイク
ロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキャナー
を用いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンされた画像を調べて、
マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量を
求める。
【０１９６】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＰＡをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然
発生のＨＰＡの発現を低下又は阻害するために用られる。約１５〜約３０個の塩
基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より小さな或いはよ
り大きな配列フラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いることができる。Olig
o4.06ソフトウェア及びＨＰＡのコーディング配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を用いて、適切なオリゴヌ
クレオチドを設計することができる。転写を阻害するためには、最も独特な５′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＨＰＡをコードする転写物に結合す
るのを阻害する。
【０１９７】 ９ ＨＰＡの発現 ＨＰＡの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そのベ
クターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって達成される。この場合、
大腸菌においてＨＰＡを発現させるためにクローニングベクターも用いられる。
クローニング部位の上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモーターが存
在し、その後ろにはアミノ末端Met及びβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配 列が存在する。後続のこれら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプ
ロモーターであり、多くの独特の制限部位を含むリンカーである。
【０１９８】 単離されたトランスフェクト菌株を、ＩＰＴＧを用いて標準的な方法で誘導し
、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長
タンパク質からなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列が細菌増殖培
地へのＨＰＡの分泌を誘導し、この培地を以下に記載の活性のアッセイにおいて
直接用いることができる。
【０１９９】 １０ ＨＰＡ活性の存在の立証 反応混合物（全１５０μｌ）は、50 mM NaxPO4 (pH 7.0)、 1 mM EGTA、5 mM MgCI2と、サイトゾル及び膜画分の組み合わせ（２５：１タンパク質：タンパ
ク質比）、サイトゾル画分のみ、膜画分のみ、部分的に精製された酵素或いはカ
ラム画分のうちの１つを含む。ＧＳＴ−ｐ４７−ｐｈｏｘ（１μｇ／反応）或い
は組換えｐ４７−ｐｈｏｘ（Ｒｐ４７、１μｇ／反応）が混合物に加えられる。
６μｌの［γ−32Ｐ］ＡＴＰが加えられ、その直後活性化因子が加えられる。そ
の混合物は、４５分間、２５℃でインキュベートされる。その後反応は、Ｌａｅ
ｍｍｌｉサンプルバッファを加えることにより終了され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
のために準備される。そのタンパク質は８〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
され、銀染色され、乾燥され、オートラジオグラフィにより解析される。［γ− 32 Ｐ］ＡＴＰを加える前に、プロテインキナーゼインヒビタが５ｍｉｎ加えられ
る。例えばそれはウエスタンブロットにより解析され、反応は、以下の修飾を用
いて上記のように実行される。低温ＡＴＰ（１０μｌ）が放射標識ＡＴＰの適所
に用いられる。タンパク質は９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、その後二フ
ッ化ポリビニリデンに移入される（Kristin, A.W. (1997) J. Biol. Chem. 272
(24):15569-15578）。
【０２００】 １１ ＨＰＡ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（Sambrook前出）または他の精製技術を用いて実質的に精製されたＨＰ
Ａを用いる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から類推されるアミノ酸配列をDNAStarソフ トウエア（DNASTAR社）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応す るオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法
で抗体を産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内の
エピトープのような、適切なエピトープの選択については、Ausubel等（前出） の論文他に記載されている。
【０２０１】 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ
プチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、
Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：
Ausubel等、前出）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（Ｋ ＬＨ、Sigma, St. Louis, MO）に結合する。フロイントの完全アジュバントにお
いてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血
清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、
１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射
性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２０２】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＰＡの精製 自然発生ＨＰＡ或いは組換えＨＰＡは、ＨＰＡに特異的な抗体を用いるイムノ
アフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製することができる。イムノ
アフィニティーカラムは、CnBr-activated Sepharose（Pharmacia & Upjohn）の
ような活性化クロマトグラフィ用レジンとＨＰＡ抗体とを共有結合させることに
より構築される。結合後、そのレジンを使用説明書の指示に従って、ブロックし
洗浄する。
【０２０３】 ＨＰＡを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨＰ
Ａを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオン
強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＰＡ結合を切るような
条件下（例えばｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＨＰＡを回収する。
【０２０４】 １３ ＨＰＡと相互作用する分子の同定 ＨＰＡ又は生物学的に活性なその断片を、125Ｉボルトンハンター試薬（Bolto
n他 (1973) Biochem. J. 133:529）で標識する。マルチウェルプレートに予め配
列しておいた候補の分子を、標識したＨＰＡとともにインキュベートし、洗浄し
て、標識したＨＰＡ複合体を有するウェルをアッセイする。異なる濃度のＨＰＡ
を用いて得られたデータを用いて、候補の分子とＨＰＡの会合、親和性、数の数
値を計算する。
【０２０５】 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、引用により本明細書の一部とする。
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及
びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明は特に好適な実施
例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施
例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実
施するために記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の
専門家には明らかなように、特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 ＨＰＡ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA）を用いて生成され
た。
【図１Ｂ】 ＨＰＡ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA）を用いて生成され
た。
【図１Ｃ】 ＨＰＡ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA）を用いて生成され
た。
【図１Ｄ】 ＨＰＡ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA）を用いて生成され
た。
【図２】 DNASTARTM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＨＰＡ−１（１７１９４１８、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１）とホスファチジン酸ホスファターゼ（ＧＩ １４８７８７３、Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）との間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図３Ａ】 ＨＰＡ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する疎水性プロットを示す図である
。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PR
O software）。
【図３Ｂ】 ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対する疎水性プ
ロットを示す図である。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性
を表す（MacDNASIS PRO software）。
【図４Ａ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｂ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｃ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｄ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｅ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｆ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図４Ｇ】 ＨＰＡ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PROTM softwar
e (Hitachi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno. CA)を用いて生成され た。
【図５】 DNASTARTM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて生成された、ＨＰＡ−２（１７３４４５２、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：４）とｐ４７−ｐｈｏｘ（ＧＩ ２２８５７９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：５）との間のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図６Ａ】 ＨＰＡ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に対する疎水性プロットを示す図である
。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PR
O software）。
【図６Ｂ】 ｐ４７−ｐｈｏｘ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に対する疎水性プロットを示す図
である。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNA
SIS PRO software）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ 37/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 16/40 9/16 Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/54 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 CA04 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA30 DC02 MA01 NA14 ZB091 ZB092 ZB261 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB22 CC32 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメントからな るグループから選択されるアミノ酸を含む実質的に精製されたヒトホスファター
    ゼ（ＨＰＡ）。
  2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸に少なくとも９０％アミノ酸同一性を
    有するＨＰＡの実質的に精製された変異体。
  3. 【請求項３】 請求項１のＨＰＡをコードする単離され、精製されたポリ
    ヌクレオチド配列。
  4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％ポリ
    ヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
  5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
  6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列に厳密性条件下でハイブ
    リダイズする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
  7. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、精
    製されたポリヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のフラグメント及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のフラグメントからな るグループから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離され、精製されたポ
    リヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】 請求項８のポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％ポリ
    ヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
  10. 【請求項１０】 請求項８のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、
    精製されたポリヌクレオチド配列。
  11. 【請求項１１】 少なくとも請求項３のポリヌクレオチド配列のフラグメ
    ントを含む発現ベクタ。
  12. 【請求項１２】 請求項１１の発現ベクタを含む宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のフラグメント或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のフラグメントから
    なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１２の宿主細胞を培養す
    る過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
    を特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 適当な医薬品担体とともに請求項１のＨＰＡを含む医薬
    品組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１のＨＰＡに特異に結合する精製された抗体。
  16. 【請求項１６】 請求項１のＨＰＡの精製されたアゴニスト。
  17. 【請求項１７】 請求項１のＨＰＡの精製されたアンタゴニスト。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む免疫障害を治療或いは予防するための方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１７のアンタゴニストの有効量を治療を要する彼
    検者に投与する過程を含む癌を治療或いは予防するための方法。
  20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおいてＨＰＡをコードす
    るポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 ａ）請求項７のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの前記核酸の１つに
    ハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
    と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイブ
    リダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルのＨＰＡをコードする
    ポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
  21. 【請求項２１】 前記生物学的サンプルの前記核酸が、ハイブリダイゼー
    ション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項２０
    に記載の方法。
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