JP2001508664A - ヒト由来のホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ（ＰＢＰＰ）及びＰＢＰＰを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は発現ベクタ、宿主細胞、アゴニスト、抗体及びアンタゴニストも提供する。また本発明はＰＢＰＰの発現に関連する疾患を治療するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト由来のホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸 ５−ホスファターゼ 技術分野 本発明は新規のホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファタ ーゼの核酸配列及びアミノ酸配列に関連し、細胞増殖及び細胞シグナル伝達の障 害の診断、予防及び治療におけるこれらの配列の使用法に関連する。 背景技術 タンパク質リン酸化は真核細胞の活性を制御するために用いられる遍在的な方 策である。典型的な哺乳動物細胞におけるタンパク質活性の１０％はリン酸化さ れているものと推定される。その後、活性化を与え、プロテインキナーゼにより アデノシン三リン酸分子からタンパク質に伝達される高エネルギーリン酸は、タ ンパク質ホスファターゼによりそのタンパク質から除去される。このようにして ホスファターゼは、細胞成長及び分化を調節する多くの細胞のシグナル伝達イベ ント、細胞−細胞間接触、細胞サイクル及び発癌を制御する。 イノシトールポリリン酸ホスファターゼは、イノシトールポリリン酸を加水分 解するいくつかの異なる分子量（１１５−１６０ｋＤ、６９−７５ｋＤ及び３２ −４３ｋＤ）の単量体酵素を含む。そのようなホスファターゼは、いくつかの異 なる基質のイノシトール環の３、４或いは５位置からリン酸を除去することが知 られている。例えば、ラット脳に由来する膜結合ポリホスホイノシチドホスファ ターゼは、基質としてホスファチジルイノシトール(４)リン酸、ホスファチジル イノシトール(３) リン酸及びホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）を利用す る。ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼは、ＰＩ Ｐ２から位置５リン酸を優先的に除去するが、他の位置或いは基質に対する親和 性は完全には分かっていない(Hope H.M及びL.J．Pike（1994）J．Biol．Chem．2 69:23648-54:Jefferson及びMajerus(1995:J.Biol.Chem.270:9370-9377))。 ＰＩＰ２の加水分解は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール三 リン酸（ＩＰ３）を生成し、そのいずれも細胞シグナル伝達経路において第２の メッセンジャとして機能する。ＤＡＧ及びＩＰ３は細胞内貯蔵体（小胞体及び筋 小胞体）からＣａ２＋を遊離し、細胞外体液からのＣａ２＋流入を促進する。リ ン酸の除去を触媒するホスファターゼは、Ｃａ^--、Ｍｇ⁺及びＬｉ^-を含む種々の イオンの局部的な濃度により正及び負に調節される。 Jefferson及びMajerus（上記）は、ヒト赤白血病細胞ｃＤＮＡライブラリから クローニングされたタイプＩＩポリリン酸５ホスファターゼを発現及び研究した 。これらのタンパク質は長さが９４２アミノ酸であり、イノシトール１，４，５ −三リン酸、イノシトール１、４−二リン酸及びＰＩＰ２を加水分解し、他のホ スファターゼと２つの潜在的な結合／触媒モチーフ（アミノ酸４７２−４８３及 び５４５−５７０）を共有し、さらにイソプレニル化及び膜関連を示す３’ＣＰ ＮＬモチーフを有する。それらは、組換え７５ｋＤイノシトール（１，４，５） 三リン酸５ホスファターゼに対して産生される抗体が血小板のサイトゾル及び膜 画分からホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５ホスファターゼ活性を 枯渇することを示し、また大きなホスファターゼの組織特異性発現並びにまたタ ンパク質分解処理がサイトゾルホスファターゼ源となることを示した。 新規のヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ 及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は、細胞増殖及び細胞シグナル伝 達の障害の診断、予防及び治療において有用である新規の組成物を提供すること ができ、当分野における必要性を満足するものである。 発明の開示 本発明は配列番号：１に示されるアミノ酸配列有する実質的に精製されたポリ ペプチド、ヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファター ゼ(ＰＢＰＰ)或いはそのフラグメントを特徴とする。 さらに本発明は配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする 単離され、実質的に精製されたポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメント及 びそのポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。また本発明はアミノ酸配 列、配列番号：１をコードするポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌクレオチ ド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配 列を提供する。また本発明は配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチド配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌクレオチ ド配列のフラグメント又は変異配列を提供する。 また本発明は配列番号：２を含む単離され、精製された配列或いはその変異配 列をを提供する。さらに本発明は配列番号：２のポリヌクレオチド配列に厳密性 条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、 本発明は配列番号：２の相補配列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド 配列或いはそのフラグメント又は変異配列含む組成物を提供する。また本発明は 配列番号：２の相補配列を含むポリヌクレオチド配列も提供する。 さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ ントを含む発現ベクタを提供する。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド配列 を含む発現ベクタは宿主細胞内に含まれる。 また本発明は配列番号：１のアミノ酸配列含むポリペプチド或いはそのフラグ メントを生成するための方法を提供する。その方法はａ）ポリペプチドの発現に 適した条件下で、少なくともＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド配列のフラ グメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、ｂ）その宿主細胞 培養株からポリペプチドを回収する過程とを有する。 また本発明は適当な医薬品担体と共に配列番号：１のアミノ酸配列を有する実 質的に精製されたＰＢＰＰを含む医薬品組成物を提供する。 また本発明は配列番号：１のポリペプチドの作用を減少させる精製されたアン タゴニストを提供する。一態様では、本発明は少なくとも配列番号：１のアミノ 酸配列のフラグメントを含むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する 。 またさらに本発明は配列番号：１のポリペプチドの活性を調節する精製された アゴニストを提供する。 また本発明は精製されたＰＢＰＰを含む医薬品組成物の有効量を治療を要する 被検者に投与する過程を含む免疫障害を治療或いは予防するための方法を提供す る。 また本発明はＰＢＰＰの活性を減少させるアンタゴニストの有効量を治療を要 する被検者に投与する過程を含む癌を治療或いは予防するための方法も提供する 。 また本発明はＰＢＰＰの活性を減少させるアンタゴニストの有効量を治療を要 する被検者に投与する過程を含む神経細胞障害を治療或いは予防するための方法 も提供する。 また本発明は生検サンプルにおいてＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドを 検出するための方法であって、ａ）生検サンプルの核酸材料にＰＢＰＰ（配列番 号：１）に相補的なポリヌクレオチド配列をハイブリダイズし、ハイブリダイゼ ーション複合体を形成する過程と、ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検 出する過程とを有し、その複合体の存在が生検サンプルにおいてＰＢＰＰをコー ドするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法を提供する。 好適な実施例では、ハイブリダイズする前に、生検サンプルの核酸材料はポリメ ラーゼ連鎖反応により増幅される。 図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図、第１Ｄ図、第１Ｅ図、第１Ｆ図及び第１Ｇ図 は、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ(ＰＢＰ Ｐ)のアミノ酸配列(配列番号：１)及び核酸配列(配列番号：２)を示す。そのア ライメントはMacDNASIS PRO^TMsoftware(Hitachi Software Engineering Co.Ltd. San Bruno.CA)を用いて生成された。 第２Ａ図、第２Ｂ図、第２Ｃ図、第２Ｄ図、第２Ｅ図、第２Ｆ図、第２Ｇ図及 び第２Ｈ図は、the multisequence alignment program of DNASTAR^TMsoftware(D NASTAR Inc.Madison WI)を用いて生成された、ＰＢＰＰ（配列番号：１）、部分 的ヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ（ＧＩ １３９９１０５、配列番号：３）、イノシトールポリリン酸５ホスファターゼ （ＧＩ １０１９１０３、配列番号：４）及びロー眼脳腎症候群タンパク質（Ｇ Ｉ １４２０９２０、配列番号：５）間のアミノ酸配列アライメントを示す。 第３Ａ図、第３Ｂ図及び第３Ｃ図は、LIFESEQ^TMdatabase(Incyte Pharmaceuticals，Palo Alto CA)を用いて生成されたＰＢＰＰに対するノーザン 分析を示す。 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定 の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを 意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること を理解されたい。 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「 その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の 指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の １つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発 明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で 記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証 に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載 される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場 合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本 発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容 認するものと解釈されるべきではない。 定義 ここで用いるＰＢＰＰは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意の ソースからの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒ トを含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＰＢＰＰのアミノ酸配列である 。 ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＰＢＰＰに結合される際に、ＰＢＰＰの 量を増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストは タンパク質、核酸、炭水化物或いはＰＢＰＰに結合し、その作用を調節する任意 の他の分子を含む場合がある。 ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」はＰＢＰＰをコードする遺伝子 の代替形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生 じ、変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化す る場合もあれば、変化しない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多 くのアレル形を有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起 こす通常の突然変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起 因する。これらの種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおい て、所与の配列において１回或いは２回以上生じる場合がある。 ここで用いるＰＢＰＰをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能 的に等価なＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチ ドの欠失、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＰＢＰＰをコードするポリヌク レオチドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出すること ができる場合、できない場合がある多形性及びＰＢＰＰをコードするポリヌクレ オチド配列に対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適 当な或いは予想外 のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク質は「変更さ れ」て、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＰＢＰＰをもたらすアミノ酸 残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置換は、ＰＢＰ Ｐの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並 びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯 電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ 酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性頭 基（polarhead group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン、 グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、 フェニルアラニン及びチロシンを含む。 ここで用いる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド 或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成分子の ことである。ＰＢＰＰのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であり、Ｐ ＢＰＰの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好ましい。「ア ミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして表され るが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全な自然 アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の付加的な複製の生成のことであり、一般 に当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行され る(Dieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer,a Laboratgry Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview,ＮＹ)。 ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＰＢＰＰに結合される際にＰＢＰＰの生 物学的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。ア ンタゴニストはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＰＢＰＰに結合し、その作用 を減少させる任意の他の分子を含む場合がある。 ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆ ａ、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことで ある。ＰＢＰＰポリペプチドを結合する抗体は、ポリペプチド或いは免疫性抗原 としてを対象の小さなペプチドを含む無傷のフラグメントを用いて生成されるこ とができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチド或いはオリゴペプチ ドは、ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望に応じて担体 タンパク質に抱合されることができる。ペプチドに化学的に結合される通常用い られる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペッ トヘモシアニンを含む。その後結合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス 、ラット或いはウサギ）を免疫する。 ここで用いる用語「抗原決定基」は、分子の特定の抗体と接触する部分（すな わちエピトープ）のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿 主動物を免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或 いは三次元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの 領域或いは構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するため に、無傷の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と 競合する場合がある。 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補 性をなすヌクレオチド配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」 は、「センス」鎖に相補性をなす核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス 分子はペプチド核酸を含み、合成或いは転写を含む任意の方法により生成される ことができる。一度細胞内に導入され れば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然配列と結合し、二重鎖を形 成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「負」はアンチセンス鎖を示 す際に用いられる場合があり、「正」はセンス鎖を示す場合に用いられることが ある。 ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは 生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然 、組換え体或いは合成ＰＢＰＰ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物 或いは細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力の ことである。 ここで用いる「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度 条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ− Ｔ」の場合、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性 は、核酸のあるものだけが結合する「部分的」であるか、或いは全相補性が一本 鎖分子間に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合い は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これ は核酸鎖間の結合に及びＰＮＡ分子の設計及び使用に依存する増幅反応において 特に重要である。 ここで用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、所与のポリヌ クレオチド配列を含む任意の組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態 或いは水溶液状態を含む。ＰＢＰＰ（配列番号：１）をコードするポリヌクレオ チド配列或いはそのフラグメント（例えば配列番号：２及びそのフラグメント） を含む組成物はハイブリダイゼーションプローブとして用いられる場合がある。 そのプローブは凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と付随する ことができる。ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類（例えばＮａ Ｃｌ）、 界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、サケ 精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散される場合がある。 ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するた めに再配列されているもの、或いは５’或いは３’方向にXL-PCR(Perkin Elmer, Norwalk,CT)を用いて伸展され、再配列されているもの、或いはフラグメント構 築用コンピュータプログラム(GELVIEW Fragment Assembly System、GCG,Madison WI)を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されているも ののことである。ある配列は伸展及び構築のいずれもが施され、コンセンサス配 列を生成している。 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析 による配列番号：２に類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプル内のＰＢＰＰを コードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパク質をコードす るポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す。 ここで用いる「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにお いて変化し、１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如する ことである。 ここで用いる用語「誘導体」は、ＰＢＰＰをコードする核酸配列或いはＰＢＰ Ｐの相補配列又はコードされたＰＢＰＰの化学修飾体のことである。そのような 修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することであ る。核酸誘導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチ ドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレング リコール形成（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫 学的機能を保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである 。 ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同 性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が 標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実 用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補性の配列 の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブ リダイゼーション検定法を用いて検査されることができる（サザンブロット或い はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）。実質的に相同性の配列 或いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同性の配列及びプローブの標 的配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異 な結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密性条件は 、２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であること を必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない (例えば約３０％同一性より小さい)第２の標的配列の使用により検査される場合 もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配 列にハイブリダイズしないであろう。 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、大きさが１０Ｋから１０ＭのＤＮＡ配列を含み 、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含む（Ha rrington等(1997)Nat Genet.15:345-355）。 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるためにアミノ酸が 非抗原結合領域内において置換されているが、その一方で元の結合能力を保持し ている抗体分子のことである。 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して 相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補性のＧ とＣ塩基との間に、並びに相補性のＡとＴ塩基との間に水素結合を形成すること により２つの核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は 、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補性 核酸配列は、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体 は、溶液（例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する核酸配列 と固形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス 、又は細胞或いはその核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定 化される別の核酸配列との間に形成されることもできる。 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いは それ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或い はヌクレオチド配列における変化のことである。 ここで用いる「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィ ルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持 体上で合成される個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるア レイのことである。 ここで用いる用語「調節」は、ＰＢＰＰの生物学的活性の変化ことである。例 えば調節により、ＰＢＰＰのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的 或いは免疫学的特性が増減するようになる。 ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌ クレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合がある ゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアン チセンス鎖を表す。「フラグメント」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸 配列であり、長さが少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌ クレオチド、さらに少なくとも１０，０００ヌクレオチドであるフラグメントを 含むことが最も好 ましい。 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６ ０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、 より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハ イブリダイゼーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、 オリゴヌクレオチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アン プライマ」、「プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価であ る。 ここで用いる「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡは、リジンにおいて終端する アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオ チドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（an ti-geneagent）ことである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の寿 命を延長し、その中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延長 を停止する(Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63)。 ここで用いる用語「部分」は、タンパク質に関して（「所与のタンパク質の一 部」をなすような）そのタンパク質のフラグメントを示す。そのフラグメントは 長さ５アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものにまで及 ぶ場合がある。こうして「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む 」タンパク質は、完全長ＰＢＰＰ及びそのフラグメントを含む。 ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＰＢＰＰ或いはそ のフラグメントをコードする核酸、又はＰＢＰＰ自体を含むと予想される生検サ ンプルは体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から分離された 膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡ(溶液中に存在するか、或いは 固形支持体、組織、組織転写物(tissue print)等に結合されている)を含む。 ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或 いはペプチドとアゴニスト、抗体及びアンタゴニストとの間の相互作用のことで ある。その相互作用は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（す なわち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピト ープ「Ａ」に対して特異である場合に、標識された「Ａ」及びその抗体を含む反 応におけるエピトープＡ(或いは遊離し、標識されないＡ)を含むタンパク質の存 在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を低減するであろう。 ここで用いる「厳密性条件」或いは「厳密性」は、核酸、塩類及び温度により 定義されるようなハイブリダイゼーションのための条件である。これらの条件は 当分野において周知であり、その条件を変更して、同一或いは関連するポリヌク レオチド配列を同定或いは検出することができる。低い或いは高い厳密性のいず れかを含む多くの等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さ及 び性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中或いは固形 基質上に固定）、塩類或いは他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン 並びに又ポリエチレングリコール）及び反応の温度（プローブの融解温度より５ ℃低い温度から溶融温度より約２０〜２５℃低い温度までの範囲にある）のよう な要因に依存する。１つ或いはそれ以上の要因を変更して、上記条件とは異なる が、等価である低或いは高厳密性のいずれかの条件を発生させることもできる。 ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単 離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それら は自然に関連する他の成分から少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適に は９０％遊離したものである。 ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸 が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。 ここで用いる「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させる プロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或い は人工的条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或 いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その 方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス 感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合が ある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含ん でおり、その細胞では挿入されたＤＮＡが自動的に複製するプラスミド或いはそ の宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、 限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含む 。 ここで用いるＰＢＰＰの「変異配列」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸によ り変更されるアミノ酸配列のことである。変異配列は「保存的に」変化する場合 があり、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き 換える場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにでは あるが、変異配列は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非 保存的に」変化する場合がある。また類似の少数変異配列は、アミノ酸欠失或い は挿入、又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすこ となくアミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを確定する際の指標は、当 業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR softwareを用いて見出す ことができる。 発明 本発明は、新規のヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホス ファターゼ（これ以降「ＰＢＰＰ」と呼ぶ）、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレ オチドの発見及び細胞増殖並びに細胞シグナル伝達の障害の診断、予防或いは治 療に対するこれらの組成物の使用法に基づくものである。 本発明のＰＢＰＰをコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対するコ ンピュータ検索を用いて乳房ｃＤＮＡライブラリ（ＢＲＳＴＮＯＴ０３）からの インサイト社クローン６３８７８９において最初に同定された。コンセンサス配 列、配列番号：２は重複並びにまた伸展した核酸配列、インサイト社クローン３ ４４２５８（ＴＨＹＭＮＯＴ０２）、６３８７８９及び１００４１１７（ＢＲＳ ＴＮＯＴ０３）、１４４０２４６（ＴＨＹＲＮＯＴ０３）及び１６８４７０９（ ＰＲＯＳＮＯＴ１５）に由来した。 一実施例では、本発明は第１Ａ図−第１Ｇ図に示されるような配列番号：１の アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ＰＢＰＰは長さが３７２アミノ酸で あり、Ｓ３８、Ｓ１３２、Ｔ１７０、Ｓ１８３、Ｔ１９２、Ｓ２７５、Ｓ２８２ 、Ｒ２９５、Ｓ３１２、Ｔ３２９、Ｔ３３０及びＳ３５９において潜在的なリン 酸化部位を有する。第２Ａ図−第２Ｆ図に示されるように、ＰＢＰＰは、部分的 ヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ（ＧＩ １３９９１０５、配列番号：３）、イノシトールポリリン酸５ホスファターゼ( ＧＩ １０１９１０３、配列番号:４)及びロー癌脳腎症候群タンパク質(ＧＩ １４２０９２０、配列番号：５)と化学的及び構造的相同性を有する。これらの 関連する分子間で保存される２つの潜在的な触媒或いは結合部位 はＮ１０４−Ｄ１２３及びＤ１８１−Ｋ２００である。ＰＢＰＰは、部分的ヒト ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼに対して公表 された配列の１２４の固有の残基５’を有し、残基Ｓ１２４の範囲外において、 それらは６４％同一性を共有する。イソプレニル化モチーフの欠如は、ＰＢＰＰ がサイトゾル酵素であることを示す。ノーザン分析は種々のライブラリにおける この配列の発現を示しており、その少なくとも３１％は炎症或いは免疫障害に関 連し、少なくとも２６％は不死化或いは癌性細胞又は組織に由来し、その１１％ は胎児或いは乳児組織に由来し、その少なくとも１１％は神経細胞組織からの組 織を含む（第３Ａ図−第３Ｃ図）。細胞増殖を起こす或いは細胞増殖に関連する ライブラリとＰＢＰＰの関連に特に注目されたい。 また本発明はＰＢＰＰ変異配列を含む。好適なＰＢＰＰ変異配列は、ＰＢＰＰ アミノ酸配列（配列番号：１）に少なくとも８０％、より好ましくは９０％アミ ノ酸配列同一性を有し、ＰＢＰＰの活性の生物学的、免疫学的或いは他の機能的 特性を保持する変異配列である。最も好ましいＰＢＰＰ変異配列は、配列番号： １に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有する変異配列である。 また本発明はＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＰＢＰＰ のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＰＢＰＰを発現する組換 え分子を生成することができる。ある特定の実施例では、本発明は第１図に示さ れるような配列番号：２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。 遺伝子コードの縮重の結果として、ＰＢＰＰをコードする多数のヌクレオチド 配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に 最低限の相同性を示すものもあることは当業者には明らかであろう。このように 本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合 わせを選択することにより形成されるようになるヌクレオチド配列のあらゆる可 能な変異配列を考慮する。これらの組み合わせは、自然発生ＰＢＰＰのヌクレオ チド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝子コードに従って形成さ れ、全てのそのような変形例が明確に開示されているものと考慮されたい。 ＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択され た厳密性条件下で、自然発生ＰＢＰＰのヌクレオチド配列にハイブリダイズでき ることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＰＢＰＰをコードす るヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コド ンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチド の発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。 コードされたアミノ酸配列を変更することなくＰＢＰＰをコードするヌクレオチ ド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期といった 、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を 生成することを含む。 また本発明は、合成化学的に完全に、ＰＢＰＰ及びその誘導体をコードするＤ ＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願の 出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手 可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、Ｐ ＢＰＰをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入するこ ともできる。 また本発明には、Wahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.Vol152:399 -407)及びKimmel，A.R.(1987;Methods Enzymol.Vol 152:507-511)に教示される ような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレオチド配列、詳細には配列番号 ：２に示されるヌクレオチド配 列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が含まれる。 当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発 明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase I，Sequenase（登録商標）(US Biochemical Corp，Cleveland OH))のKlenow fr agment、Taq polymerase(Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase(Amersham，Chic ago IL)或いはGibco BRL(Gaithersburg MD）により市販されているELONGASE Amp lification Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソ ヌクレアーゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton M icro Lab 2200(Hamilton，Reno NV)，Peltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Resea rch,Watertown MA)及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers(Perkin Elmer)のような機器を用いて自動化することが好ましい。 ＰＢＰＰをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプ ロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において 既知の種々の方法を用いて伸展させることができる。例えば、用いられる場合が ある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣 接する未知の配列を回収する(Sarkar．G(1993)PCR Methods Applic 2:318-322) 。詳細には、ゲノムＤＮＡはリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域に特 異なプライマの存在時に最初に増幅される。その後増幅された配列は、同じリン カープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用いて第２巡 目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラーゼ を用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。 また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅 或いは伸展することもできる(Triglia T等(1988)Nucleic Acids Res 16:8186)。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software(Nationa l Biosciences Inc,Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムを用いて設計され 、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さらに 約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールすることができる。その方法はいく つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域内に適当なフラグメントを生成す る。その際そのフラグメントは、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣＲテン プレートとして用いられる。 用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の 配列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ(Lag erstrom M等(1991)PCR Methods Applic 1:111-19)である。この方法では、多数 の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二本 鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置することができる。 未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD等( 1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060)による方法である。さらにある方法はＰ ＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinder（登録商標）ライブラリを用いて、 ゲノムＤＮＡに歩行することができる（Clontech，Palo Alto CA）。このプロセ スによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソ ン接合部を見つける際に有用である。完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングす る際に、より長いｃＤＮＡを含むように大きさを選択されたライブラリを用いる ことが好ましい。またランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが 遺伝子の５’及び上流領域を含むより大きな配列を含むという点で好ましい。ラ ンダムに初回抗原刺激を受けたライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリ が完全長ｃＤＮＡを産生しない状況では特に 好ましい。ゲノムライブラリは５’及び３’非転写制御領域に伸展するために有 用な場合がある。 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解 析したり、或いはヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細管配 列決定は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化される（各 ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメラによ る放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエア（例 えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM、Perkin Elmer）を用いて電気信号 に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全 プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの限 定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド配列或いは そのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＰＢＰＰ、そのフラグメント或い はその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる場合 がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なア ミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＰＢＰＰ をクローニングし、発現することもできる。 非自然発生コドンを有するＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列を生成する ことが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核或 いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合の増大 したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所望 の特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング 、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＰＢＰ Ｐをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝 子操作されることができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドの ランダムなフラグメント化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレ オチド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用 いて、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先 度の変更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うことも できる。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰをコードする自然、修飾或いは組換えポリ ヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されること もできる。例えば、ＰＢＰＰ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをスクリ ーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＰＢＰＰタン パク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、ＰＢＰＰ をコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように 遺伝子操作されることもでき、それによりＰＢＰＰは切断され、概ね異種部分か ら離れて精製されるようになる。 別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＰＢＰＰをコードする 配列が、全体的に或いは部分的に合成されることができる（Caruthers MH等(198 0)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23,Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225 -32参照）。別法では、タンパク質自体が、ＰＢＰＰのアミノ酸配列或いは一部 を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えばペプチド合 成は種々の固相技術（Roberge JY等(1995)Science 269:202-204）を用いて実行 される ことができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer) を用いることにより実現することができる。 新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的 に精製されることができる(例えばCreighton(1983)Proteins，Structures and M olecular Principles,WH Freeman and Co,New York NY)。合成ペプチドの組成物 は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる(例えばEdman degra dation procedure;Creighton、上記)。さらにＰＢＰＰのアミノ酸配列或いはそ の任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いは その任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異配列ポリペ プチドを生成することもできる。 生物学的に有効なＰＢＰＰを発現するために、ＰＢＰＰをコードするヌクレオ チド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコ ード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入され てもよい。 当業者に周知の方法を用いて、ＰＢＰＰをコードする配列及び適当な転写或い は翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを構成することができる。これらの方法 は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲノム 再組換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989)Molecular Cloning，A Lab oratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview NY及びAusubel FM等（ 1989）Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New Yor k NYに記載されている。 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＰＢＰＰをコードする配列を含有し、 発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換え体バクテリオファージ 、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質 転換されたバクテリア、酵母菌発現ベクタと形質転換された酵母菌、ウイルス発 現ベクタで感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベク タと形質転換された植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭ Ｖ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換さ れた植物細胞系（例えば、Ｔｉ或いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系 のような微生物を含む。本発明は用いられる宿主細胞により制限されない。 「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン ハンサ、プロモータ並びに５’及び３’非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行 するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及 び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成 的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用 いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc ript（登録商標）ファージミド(Stratagene,LaJolla CA)のハイブリッドｌａｃ Ｚプロモータ或いはpSport 1プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用 いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは 昆虫細胞に用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハン サ（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物 ウイルスに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ 或いはリーダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞 系では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好まし い。ＰＢＰＰをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要があ る場合には、ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用 いることができる。 バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＰＢＰＰのための使用に応じて 選択されてもよい。例えば大量のＰＢＰＰが抗体を誘導するために必要とされる とき、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いる ことができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＰＢＰＰをコー ドする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対 する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生 成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商 標）(Stratagene)のような発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ(Van Heeke & Schus ter(1989)J Biol Chem 264:5503-5509)等を含む。またｐＧＥＸベクタ(Promega ，Madison WI)を用いて、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェ ラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのよ うな融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収 及びそれに後続する遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容 易に精製することができる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン 、トロンビン或いは第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対 象のクローニングされたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるように する。 酵母菌、サッカロミセス-セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ 及びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用い ることができる。再確認する場合には、Ausubel等(上記)及びGrant等(1987)Meth ods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＰＢＰＰをコードする配列の発現は、 いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及 び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは 単独で、或いはＴＭＶからのω−リーダ配列と共に用いることができる（Takama tsu等(1987)EMBO J 6:307-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット のような植物プロモータ或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi等（1984）EMBO J 3:1671-1680;Broglie等（1984）Science 224:838-843及びWinter J and Sinib aldi RM(1991)Results Probl Cell Differ 17:85-105)を用いる場合もある。こ れらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞 内に導入されることができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記 載される（例えば、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill New York NY,pp．191-196を参照されたい） 。 また昆虫系もＰＢＰＰを発現するために用いることができる。例えばある系で は、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして 用いて、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫 （Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＰＢＰＰをコードす る配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域に クローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＰＢＰＰをコー ドする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり、 コートタンパク質を欠如する組換え体ウイルスが生成される。その後組換え体ウ イルスを用いて、ＰＢＰＰが発現される、例えばヨトウガ細胞或いはイクラサキ ンウワバ幼虫を感染させる（Engelhard EK等(1994)，Proc Nat Acad Sci 91:322 4-3227）。 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。 アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＰＢＰＰをコードする 配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からな るアデノウイルス転写／翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの 非必須Ｅ１或いはＥ３領域内の挿入により、感染した宿主細胞においてＰＢＰＰ を発現することができる生ウイルスを得ることができる（Logan and Shenk(1984 )Proc Natl Acad Sci 81:3655-59）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エン ハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させ ることができる。 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた め、６−１０ＭのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオ ンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。 また特異な開始シグナルを用いて、ＰＢＰＰをコードする配列のより効率的な 転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を 含む。ＰＢＰＰをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベ クタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要である 。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴ Ｇ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに開 始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなけれ ばならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の 起源からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、使用され る特定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある （Scharf D等(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-162）。 さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の ように発現したタンパク質を処理できるように選択されること ができる。そのようなポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カ ルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタ ンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な 挿入、折りたたみ並びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために 特異な細胞機構及び特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ 、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection (ATTC;Bethesda，MD)から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプ ロセッシングを確実にするように選択することができる。 長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま しい。例えば、ＰＢＰＰを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エレ メントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝子 を含む発現ベクタを用いて形質転換されことができる。ベクタの導入に続いて、 細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるようにす る。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在によ り、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安 定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技術 を用いて増殖させることができる。 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。 これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ−細胞或いはａｐｒｔ−細胞において 用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) Cell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I 等(1980)Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性 を選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキ セートへの耐性を与 え（Wigler Ｍ等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70)、ｎｐｔはアミノグリ コシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colbere-Garapin F等(19 81)J Mol Biol 150:1-14)、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれクロルスルフロン及 びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与え る（Murry、上記）。さらに選択可能遺伝子が記載されており、例えば、ｔｒｐ Ｂにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようになり、 ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用で きるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc Natl Acad Sci 85:8 047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵ Ｓ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカと共に可視マ ーカを使用することが普及しており、転換体を同定するのみならず、特異なベク タ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の量を定量するために幅広 く用いられる（Rhodes CA等(1995)Methods Mol Biol 55:121-131）。 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その 存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＰＢＰＰをコードする配列がマ ーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＰＢＰＰをコードする配列を含む組換 え体細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では 、マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＰＢＰＰをコードする配列と直 列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列 の遺伝子の発現を示す。 別法では、ＰＢＰＰをコードする核酸配列を含み、ＰＢＰＰを発現する宿主細 胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は 、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並び にまた定量化のための膜、溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いは ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイ ムノアッセイ技術を含む。 ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＰＢＰＰをコードする ポリヌクレオチドのプローブ或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いは ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されることができ る。核酸増幅系アッセイは、ＰＢＰＰをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形 質転換体を検出するために、ＰＢＰＰをコードする配列に基づくオリゴヌクレオ チド或いはオリゴマを使用することを伴う。 ＰＢＰＰの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパク 質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用 いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである 。ＰＢＰＰにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を 用いる２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based immunoass ay)が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここで記載し た検定法及び他の検定法は、Hampton R等(1990，Serological Methods，a Labor atory Manual，APS Press，St．Paul MN)及びMaddox DE等(1983,J Exp'Med 158: 1211-1216)に記載される。 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸 検定法において用いることができる。ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドに 関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロ ーブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端 標識化或いは標識化ヌクレオチドを用 いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＰＢＰＰをコードする配列或いはその任意の 一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタ内にクローニングされる場合も ある。そのようなベクタが当分野において知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３ 或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを 加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いるこ とができる。これらの手順は種々の市販のキット(Pharmacia&upjohn(Kalamazoo, MI)、Promega(Madison WI)及びUS Biochemical Corp(Cleveland OH))を用いて行 われる。適当なリポータ分子或いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、 酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビ タ、磁気粒子等を含む。 ＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞培 養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることがで きる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまた ベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＰＢＰＰをコードする ポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＰ ＢＰＰの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは当業 者には理解されよう。他の組換え体構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を容 易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＰＢＰＰをコードす る配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定はしな いが、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュ ールのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるよ うにするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸展／親和性精製系（Immunex Co rp.,Seatile,WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＰＢＰＰ との間に第ＸＡ因子或いはエ ンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego,CA）に対して特異な配列のような分割 可能リンカー配列を含有することにより、精製が容易になる場合もある。１つの そのような発現ベクタが、ＰＢＰＰ及びチオレドキシン或いはエンテロキナーゼ 切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の 発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Porath，J．等(1992，Prot． Exp．Purif．3:263-281)に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトク グラフィ）において精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切断部位は融合タン パク質からのＰＢＰＰを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含む ベクタの議論はKroll,D.J.等(1993;DNA Cell Biol．12:441-453)に与えられる。 組換え生成物に加えて、ＰＢＰＰのフラグメントは、固相技術（Merrifield J (1963)J Am Chem Soc85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成され る場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行され ることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perk in Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることにより自動 合成を実現してもよい。ＰＢＰＰの種々のフラグメントは化学的に個別に合成さ れるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成することができ る。 治療 ＰＢＰＰ部分的ヒトホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスフ ァターゼ（ＧＩ １３９９１０５、配列番号：3)、イノシトールポリリン酸５ホ スファターゼ（ＧＩ １０１９１０３、配列番号：４)及びロー眼脳腎症候群タ ンパク質（ＧＩ １４２０９２０、配列番号：５）間には化学的及び構造的相同 性がある。さらにＰＢＰＰは多く の癌性及び胎児並びに乳児発育において発現する。それゆえＰＢＰＰは細胞増殖 或いは細胞シグナル伝達においてある役割を有する。 一実施例では、ＰＢＰＰのアンタゴニストを被検者に投与して、免疫障害を予 防或いは治療することができる。そのような障害は、限定はしないが、ＡＩＤＳ 、アジソン病、ＡＩＤＳ、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、ア テローム性硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性 皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブ ス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無 力症、心筋或いは心膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵臓炎、多発性嚢胞腎、 多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーングレーン症候群及び自己免疫 性甲状腺炎、さらに癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性、細菌性、真 菌性、寄生性、原生動物性及び寄生虫様性感染及び外傷を含む。一態様では、Ｐ ＢＰＰに特異な抗体をアンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構として 間接的に、ＰＢＰＰを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いるこ とができる。 別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す るベクタが被検者に投与され、限定はしないが、上記障害を含む免疫障害を治療 或いは予防することができる。 一実施例では、ＰＢＰＰのアンタゴニストが被検者に投与され、癌を予防或い は治療することができる。細胞増殖に関する疾患は、限定はしないが、腺癌、白 血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫及び奇形腫、並びに詳細には副腎、膀胱 、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺 、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸 腺、甲状腺及び子宮の癌を含む種々のタイプの癌を含む。一態様では、ＰＢＰＰ に特異な抗体をア ンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構として間接的に、ＰＢＰＰを発 現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いることができる。 別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す るベクタが被検者に投与され、限定はしないが上記癌を含む癌を予防或いは治療 することができる。 一実施例では、ＰＢＰＰのアンタゴニストが被検者に投与され、神経細胞障害 を予防或いは治療することができる。このような障害は、限定はしないが静座不 能、アルツハイマ病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊張病、脳性 腫瘍、痴呆、鬱病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジア、ジストニア、てんかん 、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経線維腫症、パーキンソン病、妄想性 精神病、分裂病及びトゥーレット症候群を含む。一態様では、ＰＢＰＰと特異に 結合する抗体がアンタゴニストとして直接、或いは標的又は送達機構として間接 的に、ＰＢＰＰを発現する細胞或いは組織に製薬因子を運ぶために用いられるこ とができる 別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す るベクタが被検者に投与され、限定はしないが上記障害を含む神経細胞障害を治 療或いは予防することができる。 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、 相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与 される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製 薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは 相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる 。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに より有害な副作用に 対する危険性を低減することができる。 ＰＢＰＰのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されるこ とができる。詳細には、精製されたＰＢＰＰを用いて抗体を生成するか、或いは 医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＰＢＰＰと特異に結合するものを 同定することができる。 ＰＢＰＰに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる。 そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ 、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラ グメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治 療上の使用に適している。 抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿 主を、ＰＢＰＰ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペ プチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のア ジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバン トは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような ミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプ チド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよ うな表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カ ルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム-パルヴムが特に好ましい。 ＰＢＰＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド 、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、 より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それら は自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子から なる完全なアミノ酸配列を含むこと が好ましい。ＰＢＰＰアミノ酸の短い伸展部はキーホールリンペットヘモシアニ ン及びキメラ分子に対して生成される抗体のような別のタンパク質の伸展部と融 合されるようになる。 ＰＢＰＰに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子 の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技術は 、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥ ＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む(Koehler等（1975）Nature 256:495-497、Kozb or等（1985）J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 8 0:2026-2030、Cole,S.P等(1984)Mol.CellBiol.62:109-120）。 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及 び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス プライシングを用いることができる（Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855:Neuberger等(1984)Nature 312:604-608;Takeda等(1985)Nature 314:4 52-454)。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術が、ＰＢＰＰ特 異性一本鎖抗体を生成するように、当分野で知られた方法を用いて適合されても よい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が 、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成され ることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-3）。 また抗体は、リンパ球集団においてｉｎ ｖｉｖｏで生成を誘発することによ り、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文(Orlandi等(1989,Proc Nat l Acad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C(1991;Nature 349:293-299 )に開示されるような非常に特異性の結合剤のパネルをスクリーニングすること により生成することもできる。 またＰＢＰＰに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させるこ ともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子の ペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成すること ができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成し て、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容 易に同定できるようにする（Huse WD等(1989)Science 256:1275-1281)。 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗 体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは 免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ ムノアッセイは典型的には、ＰＢＰＰとその特異的抗体との間の複合形成体を測 定することを含む。２つの非干渉性ＰＢＰＰエピトープに反応するモノクローナ ル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タ ンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox上記）。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド或いはその 任意のフラグメント、又は相補配列が治療のために用いられる場合がある。一態 様では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡ の転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、 ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることが できる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＰＢＰＰ活性を調節 するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当 分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大 きなフラグメントが、ＰＢＰＰをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿 った種々の位置から設計されることができる。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、 組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある 。当業者には周知の方法を用いて、ＰＢＰＰをコードする遺伝子のポリヌクレオ チドに相補的な核酸配列を発現する組換えベクタを構成することができる。これ らの技術は、Sambrook等(上記)及びAusubel等(上記)の両方に記載される。 ＰＢＰＰをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＰＢＰＰをコードする高 レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質 転換することにより遮断されるようになる。そのような構成体は、翻訳できない センス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内 に統台されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼによ り無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は 、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメン トがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。 上記のように遺伝子発現の調節は、ＰＢＰＰをコードする遺伝子の制御、５’ 或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に対 する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計す ることにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置− １０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に三重らせ ん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制が ポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるように なるため、 三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は、論文(Gee JE等(1994)In:Huber BE and BI Carr，Molecular and Immunologic Approaches ,Futura Publishing Co.Mt Kisco NY)に記載されている。また相補配列或いはア ンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡ の翻訳を遮断するように設計することができる。 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖 切断分割が伴う。用いられる例は、ＰＢＰＰをコードする配列のヌクレオチド鎖 切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハン マヘッドモチーフリボザイムを含む。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対 応する１５〜２０の問のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ チドを無能にする副構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補標 的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオ チドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価する ことができる。 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分 野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を 含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＰＢＰＰを コードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成す ることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲ ＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ内に組み込むことができる。 別法では、これらのｃＤＮＡ構成体は、相補ＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或い は組織内に構成的に或いは誘導的に導入することができる。 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能 な修飾は、限定はしないが、分子の５’並びにまた３’末端でのフランキング配 列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな くホスホロチオネート或いは２’Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの 生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別さ れないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された 形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に拡 張されることができる。 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、ｉ ｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに同様に適し ている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞 内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンのように繁殖す ることができる。形質移入、リポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマに よる送達(Goldman，C.K.等(1997)Nature Biotechnology 15:462-66、参照して本 明細書の一部としている)は、当分野で周知の方法を用いて実現することができ る。 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル 、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要 する被検者に適用されることができる。 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可 能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組 成物は、ＰＢＰＰ、ＰＢＰＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト 或いはＰＢＰＰのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限 定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の無菌の 生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少 なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組 成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与 してもよい。 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内 、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局 所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含 む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す る技術についての詳細は、Remington'sPharmaceutical Sciences(Maack Publish ing Co．Easton PA)の最新版に見出される。 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の 製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により 、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤 、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ る。 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合 して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは 糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得 られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは 他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、 架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮 糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び 適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別 、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣 錠コーティングに加えられる場合もある。 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤 、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定 化剤と混合された活性処方 成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、パラ フィン油、或いは安定化剤を用いる場合、用いない場合があるが液体ポリエチレ ングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁される場合がある。 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー 溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注 入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合 物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親 油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応 じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製 において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶 解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、包括（entrapping）或 いは凍結乾燥処理による方法で製造される。 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳 酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩 類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶 性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ −５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトールの 任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末である。 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条 件の治療のためにラベルを貼付される。ＰＢＰＰの投与の場合、そのようなラベ ル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の 能力内で果たすことができる。 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路 が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経 路を確定することができる。 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＰＢＰＰ或いはその フラグメント、ＰＢＰＰの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＰＢＰＰ のインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び 毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０ （集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死 する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指 数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示 す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータ は、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合 物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中濃度の 範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び 投与経路によりこの範囲内で変化する。 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或 いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の 重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び 頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含 む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは ２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手 引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、 タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合 に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の 細胞、状態、位置等に対して特異であろう。 診断 別の実施例では、ＰＢＰＰを特異に結合する抗体が、ＰＢＰＰの発現により特 徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＰＢＰＰ、アゴニスト、アン タゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法に おいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した 方法と同様の方法で調製することができる。ＰＢＰＰに対する診断検定法は、抗 体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＰＢＰＰを 検出する方法を含む。抗体は、修飾と共に、或いは修飾を用いずに用いられる場 合があり、リポータ分子と共有結合で、或いは非共有結合での何れかで結合する こ とにより標識化されることができる。当分野において知られる種々のリポータ分 子を用いることができ、そのいくつかが上記される。 ＰＢＰＰを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロ トコルが当分野において知られており、ＰＢＰＰ発現の変更されたレベル或いは 異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＰＢＰＰ発現のための正常或い は標準的な値は、正常な哺乳被検者、好ましくはヒトから取り出された体液或い は細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＰＢＰＰに対する抗体と結合するこ とにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量することが できるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＰＢＰＰの量 、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被検 者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドを診断のた めに用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配 列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを 用いて、ＰＢＰＰの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現 を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＰＢＰＰの存否及び過 剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＰＢＰＰレベルの調節をモニ タすることができる。 一態様では、ＰＢＰＰ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含 むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブ リダイゼーションにより、ＰＢＰＰをコードする核酸配列を同定することができ る。非常に特異な領域、例えば５’調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、 或いは特異性の低い領域、例えば特に３’ード化領域の何れかからなるプローブ の特異性及びそのハイブ リダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中間或いは低）が、そのプロ ーブがＰＢＰＰをコードする自然発生配列のみを同定するか、或いは関連する配 列を同定するかを確定するであろう。 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＰＢＰＰをコードす る配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好まし い。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、配 列番号：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及 び自然発生ＰＢＰＰのイントロンを含むゲノム配列に由来する。 ＰＢＰＰをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプローブ を生成するための手段は、ＰＢＰＰ或いはＰＢＰＰ誘導体をコードする核酸配列 を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そ のようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリメラー ゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ プローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプロー ブは、種々のリポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射性核種、又は アビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスフ ァターゼのような酵素標識により標識されることができる。 ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド配列はＰＢＰＰの発現に関連する状態 或いは疾患の診断のために用いることができる。そのような状態或いは疾患の例 は、ＡＩＤＳ、アジソン病、ＡＩＤＳ、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血 症、喘息、アテローム性硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎 、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛 風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化 症、重症筋無力症、 心筋或いは心膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵臓炎、多発性脳胞腎、多発性 筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーングレーン症候群及び自己免疫性甲状 腺炎、さらに癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性、細菌性、真菌性、 寄生性、原生動物性及び寄生虫様性感染及び外傷、また腺癌、白血病、リンパ腫 、黒色腫、骨髄腫、肉腫及び奇形腫、並びに詳細には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳 、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、 膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺及び 子宮の癌、また静座不能、アルツハイマ病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極 性障害、緊張病、脳性腫瘍、痴呆、鬱病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジア、 ジストニア、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経線維腫症、パ ーキンソン病、妄想性精神病、分裂病及びトゥーレット症候群のような神経障害 を含む。ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノー ザン分析、ドットブロット、又は他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術におい て、又は変更されたＰＢＰＰ発現を検出するために患者生検からの体液或いは組 織を利用するディップスティック、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロア レイにおいて用いることができる。そのような定性的或いは定量的方法は当分野 において周知である。 特定の態様では、ＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に 上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。Ｐ ＢＰＰをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブ リダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サン プルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは 洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽 出されたサンプル のシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく変更されている場 合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列とハイブリダイ ズされており、サンプル内のＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列の変更レベ ルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法を用いて、動物実 験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の治療措置の有効度 を評価することができる。 ＰＢＰＰの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する 正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検 者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適し た条件下でＰＢＰＰをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することに より与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られ た値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から 得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得ら れた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される 。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと ができる。 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の 発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検 出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予 防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生 を予防したり、或いは進行するのを防 ぐこともできる。 ＰＢＰＰをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらな る診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学 的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され てもよい。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向（ ５’−＞３’）を有し、もう１つがアンチセンス方向(３′＜−５’)を有するヌ クレオチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された 条件下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオ リゴマ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いは ＲＮＡ配列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いることがで きる。 またＰＢＰＰの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチ ドの放射標識化或いはビオチン標識化、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結 果が書き込まれる標準曲線を含む（Melby，P.C．等(1993)J.Immunol.Methods,15 9:235-244;Duplaa,C．等(1993)Anal.Blochem.229-236）。多数サンプルを定量す る速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速すること ができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペクトル光計 測反応或いは色計測反応が迅速な定量化をもたらすようになる。 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの に由来するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイの標的として用いることもでき る。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転 写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突然変異及び多形性を同定するこ とができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、疾患の遺伝的基礎を理解し、か つ疾患を診断する際に有用で あり、また治療薬剤の活性を発生及びモニタする際に有用であろう（Heller.R. 等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:2150-55）。 一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願 ＷＯ９５／１１９９５(Chee等)、Lockhart,D.J.等(1996;Nat.Biotech.14:1675-1 680)及びSchena,M等(1996:Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614-10619)に記載される方 法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。 マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ がからなることが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは長さが約６−６０ヌクレ オチドであることが好ましく、１５−３０ヌクレオチドであることがより好まし く、約２０−２５ヌクレオチドであることが最も好ましい。ある種のマイクロア レイの場合、長さが７−１０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを用いる ことが好ましいこともある。マイクロアレイは、既知の５’或いは３’配列に及 ぶオリゴヌクレオチド、完全長配列に及ぶ連続的なオリゴヌクレオチド、或いは その配列の長さに沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを 含む場合がある。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは対象の遺伝子 に特異なオリゴヌクレオチドであり、その中では少なくともその配列のフラグメ ントが既知であるか、或いは特定の細胞タイプ、発生的或いは疾患状態に共通の １つ或いはそれ以上の未同定のｃＤＮＡに特異である。 あるマイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成するた めに、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５’或いはより好ましくは３’末端 で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズムは 、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイ ゼーションに適した範囲内にＧＣ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉 することがある予測される副構造体のない所定の長さのオリゴマを同定する。あ る状況では、マイクロアレイにおいてオリゴヌクレオチドの対を用いることが適 切である。その「対」は、好ましくは中央に位置する１つのヌクレオチドを除い て同一であろう。その対の第２の(１つだけ一致しない)ヌクレオチドは、制御体 として機能する。オリゴヌクレオチド対の数は２−１００万の範囲にある。その オリゴマは、光配向化学処理（light-directed chemical process）を用いて支 持体上の指定された領域で合成される。支持体は紙、ナイロン或いは他の種類の 膜、フィルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適切な固定支持体であ る。 別の態様では、オリゴヌクレオチドは、参照してその全体を本明細書の一部と しているＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載される ような、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体 の表面上で合成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット） ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外 線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡ フラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することができる。アレ イは手動で或いは市販の開発された（スロットブロット或いはドットブロット装 置）機器及び装置（ロボット式機器を含む）を用いて生成され、８ドット、２４ ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドット、又 は市販の機器を有効に使用するのに適した任意の他の数量のグリッドを含む。 マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生検サンプルからのＲ ＮＡ或いはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブに加工さ れる。ｍＲＮＡが単離され、ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を形成 するためのテンプレートとして生成及び使用される。ａＲＮＡは、蛍光性ヌクレ オチドの存在下で増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイでインキュベ ートされ、プローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブ リダイズするようにする。インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーショ ンが正確な相補的一致或いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される 。ハイブリダイズされなかったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光の レベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイク ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確 定する。生検サンプルは任意の体液（例えば血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、 培養された細胞、バイオプシ或いは他の組織標本から得ることができる。同時に 、個々の配列の全てに対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否 或いは量を測定することができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異 、変異配列或いは多形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができ る。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生 ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生 成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又 はPrice CM(1993;Blood Rev7:127-34)及びTrask BJ(1991;Trends Genet 7:149-1 54)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体 （ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色体 ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造に遺伝子座が決定されるようになる 。 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Verma等(1988)Human Chromosom es :A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press,New York NYに記載されるＦＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング 技術及び遺伝マップデータと相関をなす。遺伝子マップデータの例は種々の科学 雑誌或いはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことが できる。物理的染色体マップ上のＰＢＰＰをコードする遺伝子の位置と特定の疾 患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤ ＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用い て、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出する ことができる。 染色体標本のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マ ーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張す るために用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝 子の配置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカ を明らかにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体 腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは 他の遺伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える 。一度疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２ ３まで(Gatti等(1998)Nature 336:577.580)への遺伝子連鎖により自然のまま局 在されていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のた めの関連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列 を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等に より染色体位置内の差を検出することができる。 本発明の別の実施例では、ＰＢＰＰ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメン ト又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技 術の任意のものにおいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる 。そのようなスクリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離す るか、固形支持体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配 置されてもよい。ＰＢＰＰと被試験薬剤との間に形成される結合複合体が測定さ れる場合もある。 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０ ３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する 化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＰＢＰＰに 適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或いはあ る他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物はＰＢＰＰ或いはそ のフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＰＢＰＰが当分野で周 知の方法により検出される。また精製されたＰＢＰＰは、上記の薬物スクリーニ ング技術において用いるためのプレート上に直接コーティングされることもでき る。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上 に固定化することもできる。 別の実施例では、ＰＢＰＰを特異に結合することができる中和性抗体がＰＢＰ Ｐを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを 使用する。この方法では、抗体を用いて、ＰＢＰＰと１つ或いはそれ以上の抗原 決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝 子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ オチド配列の特性に依存する場合には、ＰＢＰＰをコードするヌクレオチド配列 を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも のではない。 実施例 Ｉ ＢＲＳＴＮＯＴ０３ｃＤＮＡライブラリ構成 ＢＲＳＴＮＯＴ０３ｃＤＮＡライブラリは５４歳女性の正常な乳房から切除さ れた組織から構成された。凍結組織は直ちにBrinkmann Homogenizer Polytron P T-3000(Brinkmann Instruments，Westbury NY)を用いてグアニジニウムイソチオ シアネート溶液中に均質化かつ溶解された。 ＢＲＳＴＴＵＴ０２ｃＤＡＮライブラリは５４歳女性から切除された乳房組織 から構成された。凍結組織は直ちにBrinkmann Homogenizer Polytron PT-3000(B rinkmann Instruments,Westbury NY)を用いてグアニジニウムイソチオシアネー ト溶液中に均質化かつ溶解された。その後溶解生成物は５．７Ｍ ＣｓＣｌクッ ションに載置され、周囲温度において毎分２５，０００回転で１８時間ＳＷ２８ スイングバケットロータを用いて遠心分離された。ＲＮＡは、酸性フェノールｐ Ｈ４．０を用いて一度、ｐＨ８．０フェノールクロロホルムで一度抽出され、０ ．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿され、ジエチル ピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処置水内に再懸濁され、３７℃で２５分間デオキ シリボヌクレアーゼで処理された。その反応は酸性フェノールの等倍量で停止さ れ、ＲＮＡはQiagen Oligotex kit(QIAGEN Inc.;Chatsworth，CA)を用いて単離 され、ｃＤＮＡライブラリを構成するために用いられた。 ＲＮＡは、ｃＤＡＮ合成及びプラスミドクローニングのためのSuperScript Pl asmid System(Cat.No.18248-013:Gibco/BRL)の推奨プ ロトコルに従って処理された。ｃＤＮＡはSepharose CL4B column(Cat.No.27510 5 Pharmacia)上で分画され、４００ｂｐを超えるそのｃＤＮＡがｐＳｐｏｒｔＩ に結合された。その後プラスミドｐＳｐｏｒｔＩはDH5a（登録商標）コンピテン ト細胞(Cat．No.18258-012 Gibco/BRL)に転換された。 ＩＩ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から遊離され、Miniprep Kit(Catalog #77468，Advan ced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)を用いて精製され た。このキットは９６０精製のための試薬を有する９６ウエルブロックからなる 。推奨プロトコルを用いたが、以下の点が異なった。１）最初に９６ウエルはそ れぞれ２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有する１ｍ ｌの滅菌のTerrific Broth（Catalog#22711，Gibco/BRLのみを充填された。２） ウエルが接種された後、細菌は24時間培養され、その後６０μｌの溶解緩衝液で 溶解された。３）ブロックの内容物が主要フィルタプレートに加えられる前に、 ５分間、毎分２９００回転でBeckman GS-6Rを用いて遠心分離ステップが実行さ れた。４）ＴＲＩＳ緩衝液にイソプロパノールを加える追加のステップは繰返し て実行はしなかった。プロトコルの最後のステップを終了した後、サンプルは保 管するためにBeckman ９６−ウエルブロックに移された。 ｃＤＮＡは、４つのPeltier Thermal Cyclers（PTC200 from MJ Research，Wa tertown MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems(Perkin Elm er)と共にHamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を用いて、Sanger F等(1 975;J Mol Biol 94:441f)の方法により配列決定され、読み枠が確定された。 ＩＩＩ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列は、GenBank、Swi ssProt,BLOCKS及びPima IIのようなデータベースへの問合せ配列として用いられ た。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、ＢＬ ＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域の検索が行われた。ＢＬＡＳＴはBasic Local Alignment Search Tool（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300,Al tschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410）を表している。 ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、 配列類似性を確定した。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは 厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植 物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用であった。ここで他のアルゴリ ズム、例えば参照して本明細書の一部としているSmith T.等(1992,Protein Engi neering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムが、主要配列パターン及び副次的な 構造間隙の問題を取り扱う際に用いられる。本出願において開示される配列は少 なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１２％未満である（この 場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。 ＢＬＡＳＴアプローチはKarlin.S.及びS.F.Atschul(1993;Proc.Nat.Acad.Sci. 90:5873-7)に詳述され、参照して本明細書において用いられており、問合せ配列 とデータベース配列との間の一致を検索し、見い出されたあらゆる一致の統計的 有意性を評価し、ユーザにより選択された有意な閾値を満足する一致のみを報告 した。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０−２５、ペプチドの場合 １０−１４に設定された。 インサイト社ヌクレオチド配列がｐｒｅ＝霊長類、ｒｏｄ＝齧歯類及 びｍａｍ＝哺乳類配列の場合にGenBankデータベースに対して検索され、その後 同じクローンから推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質データベ ース、ｍａｍｐ＝哺乳動物、ｖｒｔｐ＝脊椎動物及びｅｕｋｐ＝真核生物に対し て相同性を検索された。ある特定の一致に対して関連したデータベースがGixxx ±pとして報告された（ここでxxxはpri、rod等であり、存在する場合にはｐはペ プチドである）。 ＩＶ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技 術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、上記）。 ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993及び1990上記）を用いる類似のコンピュータ技 術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはLIFESEQ^TM database（インサイト社）のよう なヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析 は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュー タ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の 何れとして分類されるかを確定することができる。 検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列 一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２ ％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は 通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、 それより低いスコアでも関連した分 子が同定される場合もある。 ノーザン分析の結果は、ＰＢＰＰをコードする転写物が発生するライブラリの リストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定 の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量を ｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。 Ｖ ＰＢＰＰをコードするポリヌクレオチドの伸展 インサイト社クローン３６８７８９の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配 列を完全長まで伸展するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つの プライマを合成してアンチセンス方向の伸展を開始し、他のプライマを合成して センス方向の配列を伸展した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未 知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の 伸展を容易にした。初期プライマは、OLIGO 4.06(National Biosciences)或いは 他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２−３０のヌ クレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で標 的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ２ 量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸展した。 ２つ以上の伸展が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸展させるた めに、追加のプライマの組が設計される。 XL-PCR kit(Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完全 に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍｏ ｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPeltie r Thermal Cycler(PTC200;MJ Research, Watertown MA）及び以下のパラメータを用いて実行された。 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ 1５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸展に成功した かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI A Quick^TM（QIAGEN Inc.Chatsworth，CA）を用いて精製され、再結合及びクロー ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され た。 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ れた（Sambrook J等、上 記）。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ混合物が、２ｘＣａ ｒｂを含むLuria Bertani(LB)-agar(Sambrook J等、上記）上に蒔かれた。翌日 、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の無菌 ９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に置かれた１５０μｌの液体ＬＢ ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μｌの一晩おいた培養株が 有菌の９６ウエルプレートに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各 サンプルがＰＣＲアレイ内に移された。 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ マ及び伸展反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異性プライマを含 む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅 は以下の条件で実行された。 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。 同様にして、配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、５’伸展 用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用いて５’調 節配列を得る。 ＶＩ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 配列番号：２に由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対 からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなヌクレオ チドフラグメントにも概ね同じ手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIG O 4.06(National Biosciences)のような最新のソフトウエアを用いて設計され、 ５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０μＣｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸(Amer sham)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN，Boston MA)とを組み合わ せることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine resin column(Pharmacia&Upjohn)を用いて実質的に精製される。セ ンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれの毎分１０⁷カウント含む部 分標本は、エンドヌクレアーゼ(AseI，Bgl II,Eco RI,Pst I,Xba 1.或いはPvu I I、DuPont NEN(登録商標))の１つで消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系 ハイブリダイゼーション分析において用いられる。 各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに上で分画され、ナイロン 膜(Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH)に転写される。ハイブリダイ ゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異性シグナルを除去するために 、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナ トリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XOMA T AR^TM film(Kodak，Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette(Molecular Dynamics，Synnyvale CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーショ ンパターンが視覚的に比較される。 ＶＩＩ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを生成するために、上記ヌクレオチド 配列が、そのヌクレオチド配列の３’末端で開始するコンピュータアルゴリズム を用いて検査される。そのアルゴリズムは、その遺伝子に固有で、ハイブリダイ ゼーションに適した範囲内のＧＣ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉 すると考えられる予測された副構造体がない所定の長さのオリゴマを同定する。 そのアルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチドからなる２０の特異な配列のオリ ゴヌクレオチド（２０量体）を同定する。各配列の中央の１つのヌクレオチドが 変化している、一致したオリゴヌクレオチドの組みが形成される。このプロセス はマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰り返され、２０個の２０量体からなる 二重の組みが、光配向化学処理（Chee，M.等、PCT/WO95/11995、参照して本明細 書の一部としている）を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。 別法では、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支 持体の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler等、PCT出願WO95/25116、 参照してその全体を本明細書の一部としている）。別の方法では、ドット（或い はスロット）ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空 系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表 面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することが できる。アレイは手動で或いは市販の機器及び装置を用いて生成され、８ドット 、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドッ トのグリッドを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかった プローブを除去するためにマイクロアレイは洗浄され、スキ ャナを用いて蛍光のレベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像 は検査され、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び 相対的な存在量を確定する。 ＶＩＩＩ 相補ポリヌクレオチド ＰＢＰＰをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部用いて、自然 発生ＰＢＰＰの発現を減少或いは抑制する。約１５−約３0塩基対を含むオリゴ ヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より小さな或いはより大きなｃＤＮＡ フラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。適当なオリゴヌクレオチドはOlig o4.06ソフトウエア及びＰＢＰＰ、配列番号：１のコード配列を用いて設計され る。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは最も固有の５’配列から 設計され、コード配列へのプロモータ結合を防ぐために用いられる。翻訳を抑制 するために、相補オリゴヌクレオチドは、ＰＢＰＰをコードする転写物へのリボ ソーム結合を防ぐように設計される。 ＩＸ ＰＢＰＰの発現 ＰＢＰＰの発現は、ｃＤＮＡを適当なベクタにサブクローニングし、ベクタを 宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合には、クローニングベ クタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＰＢＰＰを発現する。クローニング部位の上流 では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それにア ミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配列が 続く。これらの８残基の直後は、転写のために有用なバクテリオファージプロモ ータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。 単離され、標準的な方法を用いてＩＰＴＧと形質転換された細菌株の 誘発は、β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び 完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成する。シグナル残基は、活性に 対する後続の検定法において直接用いることができるバクテリア成長媒質内への ＰＢＰＰの分泌を促す。 Ｘ ＰＢＰＰ活性の例示 トリチウム化ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸を用いて、５−ホスフ ァターゼ活性を室温で検定する方法がMatzuaris等(1994;J．Biol．Chem269:3397 -3402)に記載される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｍｇ＋及びジシオスレイトールの存 在が加水分解を促進するようになる。 ＸＩ ＰＢＰＰ特異的抗体の生成 ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、上記)、或いは他の精製技術を用いて実質的に 精製されるＰＢＰＰを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて抗 体を生成する。配列番号：２から推定されるアミノ酸配列は、DNAStar software (DNASTAR Inc)を用いて分析され、免疫原性の高い領域を確定し、対応するオリ ゴポリペプチドを合成かつ使用して、当業者に知られた手段により抗体を産生さ せる。Ｃ−末端付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適当なエピトー プの選択は、Ausubel等（上記）などに記載される。 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（ MBS:Ausubel等、上記）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ ン(KLH，Sigma，St.Louis，MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ ュバント内でオリ ゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血清は、例えば、プ ラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ抗血清と反応させ 、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることに より、抗ペプチド活性に対して検査される。 ＸＩＩ 特異的抗体を用いる自然発生ＰＢＰＰの精製 自然発生或いは組換えＰＢＰＰは、ＰＢＰＰに対して特異な抗体を用いる免疫 親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＰＢ ＰＰ抗体を、CnBr-activated Sepharose(Pharmacia&Upjohn)のような活性化され たクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後、製造者 の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。 ＰＢＰＰを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＰＢＰＰを 選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で 洗浄される。カラムは、抗体／ＰＢＰＰ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２−３の 緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ） で溶出され、ＰＢＰＰが回収される。 ＸＩＩＩ ＰＢＰＰと相互作用する分子の同定 ＰＢＰＰ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(B olton AE等(1973)Biochem J 133:529)を用いて標識される。多数のウエルプレー トのウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＰＢＰＰでインキュベ ートされ、洗浄され、標識されたＰＢＰＰ複合体を有する任意のウエルが検定さ れる。種々のＰＢＰＰ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＰＢＰ Ｐと候補分子との関係を示す値を計算する。 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部 としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は 、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発 明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に 、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは 関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものである 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 21/00 Ａ６１Ｐ 21/00 25/08 25/08 25/18 25/18 25/22 25/22 25/24 25/24 25/26 25/26 25/28 25/28 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 シャー、パルビ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・＃５・クイーンシャルロッ トドライブ 1608

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸を含む実質的に精製されたホスファチジルイノシト ール４，５−二リン酸５−ホスファターゼ或いはそのフラグメント。 ２．配列番号：１に少なくとも９０％アミノ酸同一性を有し、ホスファチジルイ ノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼの少なくとも１つの機能的特徴 を保持するホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼの 変異配列。 ３．請求項１のホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファター ゼをコードする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列或いは前記ポリヌク レオチド配列のフラグメント又は変異配列。 ４．請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ５．請求項３のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配 列。 ６．請求項３のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列或いはそ のフラグメント又は変異配列。 ７．配列番号：２を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列或いはその フラグメント又は変異配列。 ８．請求項７のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ９．請求項７のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列。 １０．少なくとも請求項３のポリヌクレオチド配列のフラグメントを含む発現ベ クタ。 １１．請求項１０のベクタを含む宿主細胞。 １２．配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド或いはそのフラグメント を生成するための方法であって、前記方法が、 （ａ）前記ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で請求項１１の宿 主細胞を培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞培養株からポリペプチドを回収する過程とを有することを 特徴とする方法。 １３．適当な医薬品担体と共に配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精 製されたホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５−ホスファターゼを含 む医薬品組成物。 １４．請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗体。 １５．請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。 １６．請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。 １７．請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過 程を含む免疫障害を治療するための方法。 １８．請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過 程を含む癌を治療するための方法。 １９．請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過 程を含む神経細胞障害を治療するための方法。 ２０．生検サンプルにおいてホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸５− ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 （ａ）生検サンプルの核酸材料に請求項６のポリヌクレオチドをハイブリダイ ズし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記複合 体の存在が前記生検サンプルにおけるホスファチジルイノシトール４，５−二リ ン酸５−ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすこと を特徴とする方法。 ２１．前記核酸材料がハイブリダイズする前にポリメラーゼ連鎖反応に より増幅されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。