JP2001520014A - 細胞分裂制御因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は３つのヒト細胞分裂制御因子（ＨＣＤＲ）及びＨＣＤＲを同定かつコードするポリヌクレオチド配列を提供する。また本発明は発現ベクタ、宿主細胞、アゴニスト、抗体及びアンタゴニストも提供する。また本発明はＨＣＤＲの発現に関連する疾患を予防及び治療するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は３つの新規のヒト細胞分裂制御因子の核酸配列及びアミノ酸配列に関
し、炎症及び細胞増殖並びにアポトーシスに関連する疾患の診断、予防及び治療
におけるこれらの配列の使用法に関する。

【０００２】 背景技術 細胞分裂は、生物が成長及び繁殖する際の基本的なプロセスである。細胞分裂
のサイクルは３つの主なイベント、すなわち分裂間期、有糸分裂及び細胞質分裂
からなる。分裂間期では、ＤＮＡの複製及び必須タンパク質の生成物が合成され
る。有糸分裂では、核物質が分裂し、細胞を半分に分離する。細胞質分裂では、
細胞質が分裂する。これらの細胞サイクルイベントは種々の細胞分裂制御因子に
より調節される。

【０００３】 分裂間期における一群の細胞分裂制御タンパク質活性は、核再分布及び調節に
関連する。これらの調節タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼ−δ補助タンパク質
（Prelich, G.等(1987) Nature 326: 517-520）、分裂酵母Ｃｄｃ２１ｐ遺伝子 （Coxon, A.等(1992) Nucleic Acids Res. 20: 5571-5577）及びマウス細胞サイ
クル特異性調節核タンパク質ｐ３８−２Ｇ４（Radomski, N.及びJost, E. (1995
) Exp. Cell Res. 220: 434-445）として同定される増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ ）を含む。ｐ３８−２Ｇ４は３８ｋＤａの核タンパク質であり、分裂酵母Ｃｄｃ
２１ｐ遺伝子産物のマウス相同体である。ｐ３８−２Ｇ４は、Ｇ１相とｍｉｄ Ｓ相との間で最も高い発現を示し、いくつかの推定リン酸化部位、潜在的な核局
在シグナル及び両親媒性のらせんドメインを含む。

【０００４】 細胞質分裂及び隔壁形成のプロセスがかなり研究されている。細胞質分裂は、
ＧＴＰ結合タンパク質から形成されるフィラメント及び他の成分により媒介され
るものと考えられる（Mori等(1996) Cytogenet. Cell Genet. 73: 224-227）。 セプテン（Septins）は、隔壁形成に関連するタンパク質のファミリである（Lon
gtine, M.S.等(1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:106-119）。酵母の場合、４つ
の遺伝子産物（ＣＤＣ３、ＣＤＣ１０、ＣＤＣ１１及びＣＤＣ１２）がこのファ
ミリのメンバであり、細胞質膜のすぐ内側に位置する「出芽フィラメント」と関
連する。ＣＤＣ遺伝子の任意の遺伝子における突然変異は細胞質分裂を乱し、異
常な出芽成長を伴う多核性の細胞を生み出す。

【０００５】 酵母セプテンの相同体は、黄色ショウジョウバエ（Ｓｅｐ２）、マウス（Ｈ５
、増殖関連タンパク質、Nakagawa, Y.等(1996) 未発表）及びヒト（ＫＩＡＡ０ １２８、細胞分裂制御関連タンパク質、Zieger, B.等(1997) J. Clin. Invest.
99: 520-525; Nagase, T.等(1996) DNA Res. 3: 321-329）において見い出され ている。これらのタンパク質の大部分は、ＧＴＰ結合タンパク質及びＧＴＰ加水
分解酵素スーパーファミリからなる共通モチーフである基本的なアミノ酸を豊富
に含む３つのドメインを共有する。３つのドメインのうちの第１のドメイン、す
なわち配列ＧＸＸＧＸＧＫＳＴは、セプテンの構築或いは機能に関連する場合が
あるＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位（Ｐ−ループ）であると考えられる（Saraste, M. 等(1990) Trends Biochem. Sci. 15:430-34）。またセプテンの大部分は、Ｃ末 端付近に３５〜９８アミノ酸からなる予測されたコイルドコイルドメインを含む
（Longtine等、前掲）。これらのドメインは、セプテン自体の間の相互作用並び
にまた他のタンパク質とのホモタイプ或いはヘテロタイプの相互作用に関連する
場合がある。

【０００６】 ３つの新規のヒト細胞分裂制御因子及びそれをコードするポリヌクレオチドの
発見は、炎症及び細胞増殖並びにアポトーシスに関連する疾患の診断、予防及び
治療において有用な新規の組成物を提供することができ、当分野における必要性
を満足するものである。

【０００７】 発明の概要 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５に示されるアミノ酸配列を有する、個別にＨＣＤＲ−１、ＨＣＤＲ−２及
びＨＣＤＲ−３と呼ばれ、集合的にＨＣＤＲと呼ばれる３つの実質的に精製され
たポリペプチドを特徴とする。

【０００８】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメン
トを含むポリペプチドＨＣＤＲ−１をコードする単離され、実質的に精製された
ポリヌクレオチド配列及びそのポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。また
本発明は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードするポリヌクレオチド配
列或いはそのポリヌクレオチド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌクレオ
チド配列のフラグメント又は変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を
提供する。

【０００９】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む単離され、精製された配列或いはそ
の変異配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチ
ド配列に厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。また
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異配列の相補配列
を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１０】 さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む発現ベクタを提供する。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド配列
を含む発現ベクタは宿主細胞に含まれる。

【００１１】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメント
を含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）そのポリペプチドの発
現に適した条件下で少なくともＨＣＤＲ−１をコードするポリヌクレオチド配列
のフラグメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、ｂ）その宿
主細胞培養株からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法
を提供する。

【００１２】 また本発明は、適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配
列を有する実質的に精製されたＨＣＤＲ−１を含む医薬品組成物を提供する。

【００１３】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアンタゴニス
トを提供する。一態様では本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含
むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。

【００１４】 さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアゴニスト
を提供する。

【００１５】 また本発明は、精製されたＨＣＤＲ−１の有効量を細胞に投与する過程を含む
細胞増殖を刺激するための方法を提供する。

【００１６】 また本発明は、精製されたＨＣＤＲ−１を含む医薬品組成物の有効量を治療を
要する被検者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或
いは治療するための方法を提供する。

【００１７】 また本発明は、ＨＣＤＲ−１のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００１８】 また本発明は、ＨＣＤＲ−１のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００１９】 また本発明は生物学的サンプルにおいてＨＣＤＲ−１をコードするポリヌクレ
オチドを検出するための方法であって、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードする
ポリヌクレオチド配列の相補配列を生物学的サンプルの核酸物質にハイブリダイ
ズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）その
ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、その複合体の存在が生
物学的サンプルにおけるＨＣＤＲ−１をコードするポリヌクレオチドの存在と相
関をなすことを特徴とする方法を提供する。一態様では、生物学的サンプルの核
酸物質は、ハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される
。

【００２０】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列或いはそのフラグメン
トを含むポリペプチドＨＣＤＲ−２をコードする単離され、実質的に精製された
ポリヌクレオチド配列及びそのポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。
また本発明は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３をコードするポリヌクレオチ
ド配列或いはそのポリヌクレオチド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブ
リダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌク
レオチド配列のフラグメント又は変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配
列を提供する。

【００２１】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはその変異配列を含む単離され、精製
された配列を提供する。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリヌクレオ
チド配列に厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する
。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはそのフラグメント又は変異配列の
相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００２２】 さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む発現ベクターを提供する。さらに別の態様では、そのポリヌクレオチ
ド配列を含む発現ベクターは宿主細胞に含まれる。

【００２３】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを
含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）そのポリペプチドの発現
に適した条件下で少なくともＨＣＤＲ−２をコードするポリヌクレオチド配列の
フラグメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、ｂ）その宿主
細胞培養株からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法を
提供する。

【００２４】 また本発明は、適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配
列を有する実質的に精製されたＨＣＤＲ−２を含む医薬品組成物を提供する。

【００２５】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のポリペプチドの精製されたアンタゴニス
トを提供する。一態様では本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含
むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。

【００２６】 さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のポリペプチドの精製されたアゴニスト
を提供する。

【００２７】 また本発明は精製されたＨＣＤＲ−２の有効量を細胞に投与する過程を含む細
胞増殖を刺激するための方法を提供する。

【００２８】 また本発明は、精製されたＨＣＤＲ−２を含む医薬品組成物の有効量を治療を
要する被検者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或
いは治療するための方法を提供する。

【００２９】 また本発明はＨＣＤＲ−２のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に
投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００３０】 また本発明はＨＣＤＲ−２のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に
投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００３１】 また本発明は、生物学的サンプルにおいてＨＣＤＲ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、ａ）ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３をコードするポリヌクレオチド配列の相補配列を生物学的サンプ
ルの核酸物質にハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体
を形成する過程と、ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを
有し、その複合体の存在が生物学的サンプルにおいてＨＣＤＲ−２をコードする
ポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法を提供する。一態様
では、生物学的サンプルの核酸物質はハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ
連鎖反応により増幅される。

【００３２】 さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列或いはそのフラグメント
を含むポリペプチドＨＣＤＲ−３をコードする単離され、実質的に精製されたポ
リヌクレオチド配列及びそのポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。ま
た本発明はアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードするポリヌクレオチド配
列或いはそのポリヌクレオチド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌクレオチ
ド配列のフラグメント又は変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提
供する。

【００３３】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６或いはその変異配列を含む単離され、精製
された配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のポリヌクレオチ
ド配列に厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。
また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６或いはそのフラグメント又は変異配列の相補
配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００３４】 さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む発現ベクタを提供する。さらに別の態様では、そのポリヌクレオチド
配列を含む発現ベクタは宿主細胞に含まれる。

【００３５】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを
含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）そのポリペプチドの発現
に適した条件下で少なくともＨＣＤＲ−３をコードするポリヌクレオチド配列の
フラグメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、ｂ）その宿主
細胞培養株からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法を
提供する。

【００３６】 また本発明は、適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配
列を有する実質的に精製されたＨＣＤＲ−３を含む医薬品組成物を提供する。

【００３７】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリペプチドの精製されたアンタゴニ
ストを提供する。一態様では本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含
むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。

【００３８】 さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリペプチドの精製されたアゴニスト
を提供する。

【００３９】 また本発明は精製されたＨＣＤＲ−３の有効量を細胞に投与する過程を含む細
胞増殖を刺激するための方法を提供する。

【００４０】 また本発明は、精製されたＨＣＤＲ−３を含む医薬品組成物の有効量を治療を
要する被検者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或
いは治療するための方法を提供する。

【００４１】 また本発明はＨＣＤＲ−３のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に
投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００４２】 また本発明はＨＣＤＲ−３のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に
投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法を提供する。

【００４３】 また本発明は生物学的サンプルにおいてＨＣＤＲ−３をコードするポリヌクレ
オチドを検出するための方法であって、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５をコードする
ポリヌクレオチド配列の相補配列を生物学的サンプルの核酸物質にハイブリダイ
ズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）その
ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、その複合体の存在が生
物学的サンプルにおいてＨＣＤＲ−３をコードするポリヌクレオチドの存在と相
関をなすことを特徴とする方法を提供する。一態様では、生物学的サンプルの核
酸物質はハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。

【００４４】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。

【００４５】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。

【００４６】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料を本発明の検証
に際して用いてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載され
る。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場合が
ある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示するため
に、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本発明
が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容認す
るものと解釈されるべきではない。

【００４７】 定義 ここで用いるＨＣＤＲは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意の
ソースからの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒ
トを含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＨＣＤＲのアミノ酸配列である
。

【００４８】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＨＣＤＲに結合される際に、ＨＣＤＲの
量を増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストは
タンパク質、核酸、炭水化物或いはＨＣＤＲに結合し、その作用を調節する任意
の他の分子を含む場合がある。

【００４９】 ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」はＨＣＤＲをコードする遺伝子
の代替形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生
じ、変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化す
る場合もしない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形
を有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突
然変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これ
らの種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配
列において１回或いは２回以上生じる場合がある。

【００５０】 ここで用いるＨＣＤＲをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能
的に等価なＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチ
ドの欠失、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＨＣＤＲをコードするポリヌク
レオチドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出すること
ができる場合もできない場合もある多形性及びＨＣＤＲをコードするポリヌクレ
オチド配列に対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適
当な或いは予想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタン
パク質は「変化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＨＣＤＲをも
たらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸
置換は、ＨＣＤＲの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎
水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。
例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に
帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電し
ていない極性頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシ
ン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及
びスレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含む。

【００５１】 ここで用いる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド
或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成分子の
ことである。ＨＣＤＲのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であり、Ｈ
ＣＤＲの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好ましい。「ア
ミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして表され
るが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全な自然
アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。

【００５２】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般
に当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行され
る（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratgry M anual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

【００５３】 ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＨＣＤＲに結合される際にＨＣＤＲの生
物学的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタ
ンパク質、核酸、炭水化物或いはＨＣＤＲに結合し、その作用を減少させる任意
の他の分子を含む場合がある。

【００５４】 ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆ
ａ、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖのような完全な分子及びそのフラグメントのことで ある。ＨＣＤＲポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さな
ペプチドを含む完全なポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことができ
る。動物を免疫するために用いられるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、Ｒ
ＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望により担体タンパク質
に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される通常用いられる担体は
、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニ
ンを含む。その後結合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット或い
はウサギ）を免疫する。

【００５５】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すな
わちエピトープ）のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿
主動物を免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或
いは三次元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの
領域或いは構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するため
に、無傷の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と
競合する場合がある。

【００５６】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補
的なヌクレオチド配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、
「センス」鎖に相補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペ
プチド核酸を含み、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができ
る。一度細胞内に導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然
配列と結合し、二重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「
負（マイナス）」はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プ
ラス）」はセンス鎖を示す場合に用いられることがある。

【００５７】 ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは
生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然
、組換え或いは合成ＨＣＤＲ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或
いは細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のこ
とである。

【００５８】 ここで用いる「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度
条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−
Ｔ」の場合、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性
は、核酸のあるものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が
一本鎖分子間に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度
合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。
これは核酸鎖間の結合に及びＰＮＡ分子の設計及び使用に依存する増幅反応にお
いて特に重要である。

【００５９】 ここで用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、所与のポリヌ
クレオチド配列を含む任意の組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態
或いは水溶液状態を含む。ＨＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をコードするポリヌクレオチド配列或いはそ
のフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６及びそのフラグメント）を含む組成物はハイブリダイゼーション
プローブとして用いることもできる。そのプローブは凍結乾燥状態で保管され、
炭水化物のような安定化剤と関連することもできる。ハイブリダイゼーションで
は、そのプローブは塩類（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び
他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分
散される場合もある。

【００６０】 ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するた
めに再配列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer
, Norwalk, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント
構築用コンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GC
G, Madison WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築 されているもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コ
ンセンサス配列を生成している。

【００６１】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析
によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６に類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにおいてＨＣＤＲをコードするｍ
ＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドからの転写物の発現と相関があることを示す。

【００６２】 ここで用いる「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにお
いて変化し、１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如する
ことである。

【００６３】 ここで用いる用語「誘導体」は、ＨＣＤＲをコードする核酸配列或いはＨＣＤ
Ｒ又はコードされたＨＣＤＲの相補配列の化学修飾体のことである。そのような
修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することであ
る。核酸誘導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチ
ドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレング
リコール化（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学
的機能を保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。

【００６４】 ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同
性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が
標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実
用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列
の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブ
リダイゼーション検定法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブ
リダイゼーション等）を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或
いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的
配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な
結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密性条件は、
２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを
必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（
例えば約３０％同一性より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合
もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配
列にハイブリダイズしないであろう。

【００６５】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、大きさが１０Ｋから１０ＭのＤＮＡ配列を含み
、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含む直鎖
状の小染色体である（Harrington等(1997) Nat Genet.15:345-355）。

【００６６】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合
領域内においてアミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持し
ている抗体分子のことである。

【００６７】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して
相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。

【００６８】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基
との間、並びに相補的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つ
の核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタ
ッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は
、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（
例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固
形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又
は細胞或いはその核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化さ
れる別の核酸配列との間に形成することもできる。

【００６９】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いは
それ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或い
はヌクレオチド配列における変化のことである。

【００７０】 ここで用いる「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィ
ルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持
体上で合成される個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるア
レイのことである。

【００７１】 ここで用いる用語「調節」は、ＨＣＤＲの生物学的活性の変更ことである。例
えば調節により、ＨＣＤＲのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的
或いは免疫学的特性が増減するようになる。

【００７２】 ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌ
クレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合がある
ゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアン
チセンス鎖を表す。「フラグメント」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸
配列であり、長さが少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌ
クレオチド、さらに少なくとも１０，０００ヌクレオチドであるフラグメントを
含むことが最も好ましい。

【００７３】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６
０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、
より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハ
イブリダイゼーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、
オリゴヌクレオチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アン
プリマ」、「プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である
。

【００７４】 ここで用いる「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡは、リジンにおいて終端する
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオ
チドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（an
ti-gene agent）ことである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の 寿命を延長し、その中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延
長を停止する（Nielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63）。

【００７５】 ここで用いる用語「部分」は、タンパク質に関して（「所与のタンパク質の一
部」をなすような）そのタンパク質のフラグメントを示す。そのフラグメントは
長さ５アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものにまで及
ぶ場合がある。こうして「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列の少なくとも一
部を含む」タンパク質は、完全長ＨＣＤＲ−１及びそのフラグメントを含む。

【００７６】 ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＨＣＤＲをコード
する核酸或いはそのフラグメント又はＨＣＤＲ自体を含むと予想される生検サン
プルは、溶液中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（tissue p
rint）等に結合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細
胞から単離された膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含む。

【００７７】 ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或
いはペプチドとアゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことであ
る。その相互作用は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すな
わち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトー
プ「Ａ」に対して特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけ
るエピトープＡ（或いは遊離し、標識されないＡ）及びその抗体を含むタンパク
質の存在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。

【００７８】 ここで用いる「厳密性条件」或いは「厳密性」は、核酸、塩類及び温度により
定義されるようなハイブリダイゼーションのための条件である。これらの条件は
当分野において周知であり、その条件を変更して、同一或いは関連するポリヌク
レオチド配列を同定或いは検出することができる。低い或いは高い厳密性のいず
れかを含む多くの等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さ及
び性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中或いは固形
基質上に固定）、塩類或いは他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン
並びに又ポリエチレングリコール）及び反応の温度（プローブの融解温度より約
５℃低い温度から溶融温度より約２０〜２５℃低い温度までの範囲にある）のよ
うな要因に依存する。１つ或いはそれ以上の要因を変更して、上記条件とは異な
るが、等価である低或いは高厳密性のいずれかの条件を発生させることもできる
。

【００７９】 ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単
離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それら
は自然に関連する他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には
９０％含まないものである。

【００８０】 ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸
が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。

【００８１】 ここで定義する「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させ
るプロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或
いは人工的条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核
或いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。そ
の方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイル
ス感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合
がある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含
んでおり、その細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或い
はその宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞
は、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も
含む。

【００８２】 ここで用いるＨＣＤＲの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸により
変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があ
り、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換え
る場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではある
が、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的
に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、
又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくア
ミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に周
知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR softwareを用いて見出すことがで
きる。

【００８３】 発明 本発明は３つの新規のヒト細胞分裂制御因子（これ以降集合的に「ＨＣＤＲ」
と呼ぶ）、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド及び炎症並びに細胞増殖及び
アポトーシスに関連する疾患の診断、予防或いは治療のためのこれらの組成物の
使用法の発見に基づくものである。

【００８４】 本発明のＨＣＤＲ−１をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対す
るコンピュータ検索を用いて胎児脾臓組織ｃＤＮＡライブラリ（ＳＰＬＮＦＥＴ
０１）からのインサイト社クローン２６４５９において最初に同定された。コン
センサス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、重複並びにまた伸長した核酸配列、イ
ンサイト社クローン２６４５９（ＳＰＬＮＦＥＴ０１）、１００４６９（ＡＤＲ
ＥＮＯＴ０１）及び２４００１８（ＨＩＰＯＮＯＴ０１）に由来した。

【００８５】 一実施例では、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ及び図１Ｅに示さ
れるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドＨＣＤＲ−
１を含む。ＨＣＤＲ−１は長さが４７８アミノ酸である。ＨＣＤＲ−１は、他で
同定されたセプテンに類似の残基Ｇ１５１−Ｓ１５８を含む保存されたＡＴＰ／
ＧＴＰ結合部位を有する。ＨＣＤＲ−１は残基Ｒ３５６−Ｒ３５９を含む１つの
潜在的なアミド化部位、残基Ｎ４４−Ｃ４７及びＮ２１７−Ｅ２２０を含む２つ
の潜在的なＭグリコシレーション部位、残基Ｓ１１−Ｅ１４、Ｔ２８−Ｄ３１、
Ｓ１１７−Ｄ１２０、Ｓ１１８−Ｄ１２１、Ｔ２０５−Ｄ２０８、Ｔ２９５−Ｅ
２９８、Ｓ３２５−Ｄ３２８、Ｔ３５１−Ｅ３５４、Ｔ４０２−Ｅ４０５、Ｓ４
３２−Ｄ４３５及びＴ４４５−Ｅ４４８を含む１１の潜在的なカゼインキナーゼ
ＩＩリン酸化部位及び残基Ｓ１０２−Ｒ１０４、Ｓ１３８−Ｋ１４０及びＴ４４
９−Ｋ４５１を含む４つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する
。図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＨＣＤＲ−１は、マウスＨ５タンパク質
（ＧＩ ５１２０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びヒト細胞分裂制御関連タンパ
ク質（ＧＩ １８０９３１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）と化学的及び構造的に相
同である。詳細には、ＨＣＤＲ−１及びマウスＨ５タンパク質は９２％配列相同
性を有し、ＨＣＤＲ−１及びヒト細胞分裂制御関連タンパク質は８０％配列相同
性を有する。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＨＣＤＲ−１及びマウスＨ５
タンパク質は非常に類似の疎水性プロットを有する。ノーザン分析は、種々のｃ
ＤＮＡライブラリにおけるＨＣＤＲ−１の発現を示しており、少なくとも３４％
は不死化或いは癌性であり、少なくもと２０％は免疫反応に関連し、少なくとも
１４％は胎児／乳児組織或いは器官において発現する。

【００８６】 本発明のＨＣＤＲ−２をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対す
るコンピュータ検索を用いて心室組織ｃＤＮＡライブラリ（ＬＶＥＮＮＯＴ０１
）からのインサイト社クローン３４８４２９において最初に同定された。コンセ
ンサス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、重複並びにまた伸長した核酸配列、イン
サイト社クローン４０７７６５（ＥＯＳＩＨＥＴ０２）、２２６５４０６（ＵＴ
ＲＳＮＯＴ０２）及び３４８４２９（ＬＶＥＮＮＯＴ０１）に由来した。

【００８７】 一実施例では、本発明は図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ及び図４Ｅに示され
るようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドＨＣＤＲ−２
を含む。ＨＣＤＲ−２は長さが４２５アミノ酸である。ＨＣＤＲ−２は残基Ｇ４
８−Ｓ５５を含む保存されたＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位を有する。ＨＣＤＲ−２は
残基Ｎ１５−Ｌ１８、Ｎ３３−Ｔ３６及びＮ２２５−Ｍ２２８を含む３つの潜在
的なＮグリコシレーション部位、残基Ｓ９−Ｅ１２、Ｓ２６−Ｄ２９、Ｔ５６−
Ｄ５９、Ｔ６４−Ｅ６７、Ｔ７２−Ｅ７５、Ｔ９７−Ｄ１００、Ｔ２１６−Ｅ２
１９、Ｔ２２０−Ｅ２２３、Ｓ２３９−Ｅ２４２、Ｔ３１０−Ｄ３１３、Ｓ３１
８−Ｅ３２１、Ｔ３７３−Ｅ３７６及びＴ４１７−Ｄ４２０を含む１３の潜在的
なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位及び残基Ｓ１１３−Ｋ１１５、Ｓ１６０−
Ｋ１６２、Ｔ１６８−Ｋ１７０及びＴ４１７−Ｋ４１９を含む４つの潜在的なプ
ロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する。図５Ａ及び図５Ｂに示されるように
、ＨＣＤＲ−２はヒトＣＤＣ１０関連タンパク質、ＫＩＡＡ０１２８（ＧＩ １
４６９１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と化学的及び構造的に相同である。詳細
には、ＨＣＤＲ−２及びＫＩＡＡ０１２８は８２％配列相同性を有する。図６Ａ
及び図６Ｂに示されるように、ＨＣＤＲ−２及びＫＩＡＡ０１２８は非常に類似
の疎水性プロットを有する。ノーザン分析は、種々のｃＤＮＡライブラリにおけ
るＨＣＤＲ−２の発現を示しており、少なくとも３８％は不死化或いは癌性であ
り、少なくとも１４％は免疫反応に関連し、少なくとも２４％は胎児／乳児組織
或いは器官において発現する。

【００８８】 本発明のＨＣＤＲ−３をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対す
るコンピュータ検索を用いて大動脈内皮細胞ｃＤＮＡライブラリ（ＥＮＤＡＮＯ
Ｔ０１）からのインサイト社クローン２４５８４３８において最初に同定された
。コンセンサス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は重複並びにまた伸長した核酸配列
、インサイト社クローン１２８７５０８（ＢＲＡＩＮＯＴ１１）、１７４７３６
８（ＳＴＯＭＴＵＴ０２）、２６３６９４７（ＢＯＮＴＮＯＴ０１、２６３５４
７８（ＢＯＮＴＮＯＴ０１）、２３２５８８９（ＯＶＡＲＮＯＴ０２）及び２４
５８４３８（ＥＮＤＡＮＯＴ０１）に由来した。 （Ｐ１８） 一実施例では、本発明は図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ及び図７Ｄに示されるような
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドＨＣＤＲ−３を含む
。ＨＣＤＲ−３は長さが４１７アミノ酸である。ＨＣＤＲ−３は残基Ｔ１３６−
Ｋ１３９において１つの潜在的なアミド化部位、残基Ｎ３８０−Ｓ３８３におい
て１つの潜在的なＮグリコシレーション部位、残基Ｋ３７２−Ｓ３７５を含む１
つの潜在的なｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼリン酸化部位、
残基Ｓ２−Ｄ５、Ｔ１１−Ｅｌ４、Ｓ３４−Ｅ３７、Ｓ４７−Ｅ５０、Ｓ９４−
Ｄ９７、Ｔ１８０−Ｅｌ８３、Ｓ２３１−Ｅ２３４、Ｓ２６７−Ｅ２７０、Ｓ３
４５−Ｅ３４８、Ｔ３８２−Ｅ３８５及びＴ３８６−Ｅ３８９を含む１１の潜在
的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位及び残基Ｔ６０−Ｋ６２、Ｔ１３６−Ｒ
１３８、Ｔ２６１−Ｒ２６３、Ｔ２７９−Ｒ２８１、Ｓ３６３−Ｋ３６５、Ｔ３
６６−Ｋ３６９を含む６つの潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位を有す
る。図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ＨＣＤＲ−３はマウス増殖関連タンパ
ク質１（ＧＩ １１６７９６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と化学的及び構造的
に相同である。詳細には、ＨＣＤＲ及びマウス増殖関連タンパク質１は９８％配
列相同性を有する。図９Ａ及び図１０Ｂに示されるように、ＨＣＤＲ−３及びマ
ウスタンパク質は非常に類似の疎水性プロットを有する。ノーザン分析は、種々
のｃＤＮＡライブラリーにおけるＨＣＤＲ−３の発現を示しており、少なくとも
５９％は不死化或いは癌性であり、少なくとも１９％は免疫反応に関連し、少な
くとも２３％は胎児／乳児組織或いは器官によって発現する。

【００８９】 また本発明はＨＣＤＲ変異体を含む。好適なＨＣＤＲ変異体は、ＨＣＤＲアミ
ノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３或いはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５）に少なくとも８０％、より好ましくは９０％アミノ酸配列同一性を有し
、ＨＣＤＲの活性の生物学的、免疫学的或いは他の機能的特性を保持する変異体
である。最も好ましいＨＣＤＲ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有す
る変異体である。

【００９０】 また本発明はＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＨＣＤＲ
のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＨＣＤＲを発現する組換
え分子を生成することができる。ある特定の実施例では、本発明は図１Ａ〜図１
Ｅ、図４Ａ〜図４Ｅ或いは図７Ａ〜図７Ｄにそれぞれ示されるようなＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の核酸配列を 有するポリヌクレオチドを含む。

【００９１】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＨＣＤＲをコードする多数のヌクレオチド
配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に
最低限の相同性を示すものもあることは当業者には明らかであろう。このように
本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成され
るようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの
組み合わせは、自然発生ＨＣＤＲのヌクレオチド配列に適用されるような標準的
なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形例が明確
に開示されているものと考慮されたい。

【００９２】 ＨＣＤＲをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択され
た厳密性条件下で、自然発生ＨＣＤＲのヌクレオチド配列にハイブリダイズでき
ることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＨＣＤＲをコードす
るヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コド
ンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチド
の発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。
コードされたアミノ酸配列を変更することなくＨＣＤＲをコードするヌクレオチ
ド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期といった
、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を
生成することを含む。

【００９３】 また本発明は、合成化学的に完全に、ＨＣＤＲ及びその誘導体をコードするＤ
ＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願の
出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手
可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、Ｈ
ＣＤＲをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入するこ
ともできる。

【００９４】 また本発明にはWahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol. Vol. 152:39
9-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol 152: 507-511)に教示され
るような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレオチド配列、詳細にはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるヌ
クレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が含ま
れる。

【００９５】 当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或 いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。

【００９６】 ＨＣＤＲをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプ
ロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において
既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合が
ある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣
接する未知の配列を回収する（Sarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:318-32
2）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域 に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増幅された配列は、同じ
リンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用いて第
２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。

【００９７】 また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅
或いは伸長することもできる（Triglia T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186 ）。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
nc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用
いて、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さ
らに約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。その方
法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域に適当なフラグメントを
生成する。その際そのフラグメントは、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣ
Ｒテンプレートとして用いられる。

【００９８】 用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配
列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lage
rstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-119）である。この方法では、多
数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二
本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置することができる。

【００９９】 未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD 等
(1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060)による方法である。さらにある方法 はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを用いて、ゲノムＤ
ＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスにより
ライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソン接合部
を見つける際に有用である。

【０１００】 完全長ｃＤＮＡのためのスクリーニングの際に、より長いｃＤＮＡを含むよう
に大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初回
抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むより
大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブ
ラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で
は特に好ましい。ゲノムライブラリは５´及び３´非転写制御領域に配列を伸長
するために有用な場合がある。

【０１０１】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM 、Perkin Elmer）を用いて電
気信号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示ま
での全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプ
ルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好まし
い。

【０１０２】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列或いは
そのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＨＣＤＲ、そのフラグメント或い
はその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる場合
がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なア
ミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＨＣＤＲ
をクローニングし、発現することもできる。

【０１０３】 非自然発生コドンを有するＨＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を生成する
ことが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核或
いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増加
したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所望
の特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。

【０１０４】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＨＣＤ
Ｒをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝
子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのラ
ンダムな断片化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチド配列
を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新し
い制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の変更、
スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともできる。

【０１０５】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲをコードする自然、修飾或いは組換えポリ
ヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されること
もできる。例えば、ＨＣＤＲ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをスクリ
ーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＨＣＤＲタン
パク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、ＨＣＤＲ
をコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように
遺伝子操作されることもでき、それによりＨＣＤＲは切断され、概ね異種部分か
ら離れて精製されるようになる。

【０１０６】 別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＨＣＤＲをコードする
配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（Caruthers MH 等 (198
0) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Symp Ser
225-232参照）。別法では、タンパク質自体が、ＨＣＤＲのアミノ酸配列或いは 一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えばペプチ
ド合成は種々の固相技術（Roberge JY 等(1995) Science 269:202-204）を用い て実行することができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer (Pe
rkin Elmer)を用いることにより実現することができる。

【０１０７】 新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的
に精製されることができる（例えばCreighton (1983) Proteins, Structures an d Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。合成ペプチドの
組成物は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる（例えばEdma
n degradation procedure; Creighton、上記）。さらにＨＣＤＲのアミノ酸配列
或いはその任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク
質或いはその任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異配
列ポリペプチドを生成することもできる。

【０１０８】 生物学的に有効なＨＣＤＲを発現するために、ＨＣＤＲをコードするヌクレオ
チド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコ
ード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入され
てもよい。

【０１０９】 当業者に周知の方法を用いて、ＨＣＤＲをコードする配列及び適当な転写或い
は翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方法
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲノム
組換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989) Molecular Cloning, A Labo ratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY及びAusubel FM 等 (
1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yor
k NYに記載されている。

【０１１０】 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨＣＤＲをコードする配列を含有し、
発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、
プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母
発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系（
例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系（
例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭ
Ｖ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ或
いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明は
用いられる宿主細胞により制限されない。

【０１１１】 「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン
ハンサ、プロモータ並びに５´及び３´非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及
び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成
的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用
いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc
ript ファージミド(Stratagene, LaJolla CA) のハイブリッドｌａｃＺプロモー
タ或いはpSport 1 プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用いることが
できる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に
用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば
熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに
由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリー
ダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺
乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＨＣＤ
Ｒをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合には
、ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いることが
できる。

【０１１２】 バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＨＣＤＲのための使用に応じて
選択されてもよい。例えば大量のＨＣＤＲが抗体を誘導するために必要とされる
とき、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いる
ことができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＨＣＤＲをコー
ドする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対
する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生
成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript(Stratagene)のよう
な発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Che
m 264:5503-5509）等を含む。またｐＧＥＸベクタ（Promega, Madison WI）を用
いて、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を
有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融合タンパク質
は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそれに後続する
遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精製することが
できる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは
第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象のクローニングさ
れたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。

【０１１３】 酵母、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いる
ことができる。再確認する場合には、Ausubel 等 (上記)及びGrant等(1987) Met
hods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。

【０１１４】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨＣＤＲをコードする配列の発現は、
いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及
び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶから
のω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6:3
07-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ
或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Brogli
e 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Resu
lts Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、 直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されるこ
とができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例えば
、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology
(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。

【０１１５】 また昆虫系もＨＣＤＲを発現するために用いることができる。例えばある系で
は、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして
用いて、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイクラサキンウワバ幼 虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＨＣＤＲをコード する配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域
にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＨＣＤＲをコ
ードする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり
、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。その後組換えウイ
ルスを用いて、ＨＣＤＲが発現される、例えばヨトウガ細胞或いはイクラサキン
ウワバ幼虫を感染させる（Engelhard EK 等 (1994), Proc Nat Acad Sci 91:322
4-3227）。

【０１１６】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨＣＤＲをコードする
配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻
訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域
内の挿入により、感染した宿主細胞においてＨＣＤＲを発現することができる生
ウイルスを得ることができる（Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81
:3655-59）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エン
ハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させることができる。

【０１１７】 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、６−１０ＭのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオ
ンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。

【０１１８】 また特異な開始シグナルを用いて、ＨＣＤＲをコードする配列のより効率的な
転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を
含む。ＨＣＤＲをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベ
クタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要である
。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに開
始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなけれ
ばならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の
起源からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、使用され
る特定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある
（Scharf D 等 (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-162）。

【０１１９】 さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の
ように発現したタンパク質を処理できるように選択することができる。そのよう
なポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプ
ロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並
びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために特異な細胞機構及び
特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ
２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection（ATTC; Bethesda,
MD）から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確
実にするように選択することができる。

【０１２０】 長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま
しい。例えば、ＨＣＤＲを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エレ
メントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝子
を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタの導入に続いて、
細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるようにす
る。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在によ
り、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安
定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技術
を用いて増殖させることができる。

【０１２１】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ^-細胞或いはａｐｒｔ^-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎ ｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれ クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移 酵素への耐性を与える（Murry、上記）。さらに選択可能遺伝子が記載されてお り、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan (1988) Pr
oc Natl Acad Sci 85:8047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニ ダーゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのよ
うなマーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定する
のみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の
量を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995) Methods Mol Biol 5
5:121-131）。

【０１２２】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＨＣＤＲをコードする配列がマ
ーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＨＣＤＲをコードする配列を含む組換
え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、
マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨＣＤＲをコードする配列と直列
に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列型
遺伝子の発現を示す。

【０１２３】 別法では、ＨＣＤＲをコードする核酸配列を含み、ＨＣＤＲを発現する宿主細
胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は
、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、
溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダ
イゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。

【０１２４】 ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＣＤＲをコードする
ポリヌクレオチドのプローブ或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されることができ
る。核酸増幅系アッセイは、ＨＣＤＲをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形
質転換体を検出するために、ＨＣＤＲをコードする配列に基づくオリゴヌクレオ
チド或いはオリゴマを使用することを伴う。

【０１２５】 ＨＣＤＲの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパク
質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用
いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである
。ＨＣＤＲにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を
用いる２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based immunoass
ay）が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここで記載し
た検定法及び他の検定法は、Hampton R 等(1990, Serological Methods, a Labo ratory Manual, APS Press, St. Paul MN)及びMaddox DE 等 (1983, J Exp'Med
158:1211-1216)に記載される。

【０１２６】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドに
関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロ
ーブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端
標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨＣＤ
Ｒをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のために
ベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において
知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメ
ラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮ
Ａプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販の
キット（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Bioc
hemical Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは 標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色
素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。

【０１２７】 ＨＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞培
養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることがで
きる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまた
ベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＨＣＤＲをコードする
ポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＨ
ＣＤＲの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは当業
者には理解されよう。他の組換え構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を容易
にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＨＣＤＲをコードする
配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定はしない
が、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュー
ルのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるよう
にするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immunex Corp
., Seatile, WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＨＣＤＲ
との間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に 対して特異な配列のような分割可能リンカー配列を含有することにより、精製が
容易になる場合もある。１つのそのような発現ベクタが、ＨＣＤＲ及びチオレド
キシン或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードす
る核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ
（Porath, J. 等 (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)に記載されるような固 定化金属イオン親和性クロマトクグラフィ）において精製を容易にし、一方エン
テロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのＨＣＤＲを精製するための手段を
提供する。融合タンパク質を含むベクタの議論はKroll,D.J.等(1993;DNA Cell B
iol. 12:441-453)に与えられる。

【０１２８】 組換え生成物に加えて、ＨＣＤＲのフラグメントは、固相技術（Merrifield J
(1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成さ
れる場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行さ
れることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (P
erkin Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることにより自
動合成を実現してもよい。ＨＣＤＲの種々のフラグメントは化学的に個別に合成
されるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成することがで
きる。

【０１２９】 治療 ＨＣＤＲ−１、マウスＨ５タンパク質（ＧＩ ５１２０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：７）及びヒト細胞分裂制御関連タンパク質（ＧＩ １８０９３１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）間には化学的及び構造的相同性があり、ＨＣＤＲ−２とヒトＣ ＤＣ１０関連タンパク質、ＫＩＡＡ０１２８（ＧＩ １４６９１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）との間、またＨＣＤＲ−３とマウス増殖関連タンパク質１（Ｇ Ｉ １１６７９６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）との間にも化学的及び構造的相
同性がある。ノーザン分析は、ＨＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の発現が癌及び胎児／乳児の発育に関連す
ることを示す。これら３つ全てのポリペプチドの治療用途が以下にまとめて示さ
れる。

【０１３０】 胎児発育中に、ＨＣＤＲの発現が減少することにより、有害反応を伴わずにア
ポトーシスは増加する。しかしながら他の状況及び成体では、ＨＣＤＲの発現が
減少することにより、有害なアポトーシスが増加する。それゆえ一実施例では、
ＨＣＤＲ或いはそのフラグメント又は誘導体が被検者に投与され、アポトーシス
の増加に関連する疾患を予防或いは治療することができる。そのような疾患は、
限定はしないが、エイズ及び他の感染性或いは遺伝性免疫不全症、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症及び小脳変性症の
ような神経変性疾患、再生不良性貧血のような脊髄形成異常症候群、心筋梗塞、
脳卒中及び再潅流障害のような虚血性障害、アルコール誘発肝障害、肝硬変及び
ラチリスムのような毒素誘発障害、悪液質のような萎縮病、Ｂ型肝炎及びＣ型肝
炎のようなウイルス性感染及び骨粗鬆症を含む。

【０１３１】 別の実施例では、ＨＣＤＲを含む医薬品組成物を被検者に投与して、限定はし
ないが上記疾患を含むアポトーシスの増加に関連する障害を予防或いは治療する
ことができる。

【０１３２】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲに特異なアゴニストを投与して、限定はしな
いが、上記疾患を含むアポトーシスに関連する疾患を予防或いは治療することが
できる。

【０１３３】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現す
ることができるベクタを用いて、限定はしないが上記疾患を含むアポトーシスの
増加に関連する疾患を予防或いは治療することができる。

【０１３４】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲ或いはそのフラグメント又は誘導体を細胞に
加えて、細胞増殖を刺激することができる。詳細には、ＨＣＤＲは、細胞の再生
或いは分化を促すために、リポソーム、ウイルス系ベクタ或いはエレクトロイン
ジェクションのような送達機構を用いてin vivoで細胞に加えられることができ る。さらにＨＣＤＲを細胞、細胞株、組織或いは器官培養物をin vitro或いはex
vivoで加えて、異種或いは自己移植に用いるために細胞増殖を刺激することが できる。ある場合にはその細胞は、感染症或いは癌を抑制できるように、又は鎌
形赤血球貧血症、βサラセミア、嚢胞性繊維症、ハンチントン舞踏病のような疾
患における遺伝性欠陥を補正できるように選択されているであろう。

【０１３５】 さらにの別の実施例では、ＨＣＤＲに特異なアゴニストが細胞に投与され、上
記のような細胞増殖を刺激することができる。

【０１３６】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現す
ることができるベクタを、上記のように、送達機構を用いてin vivoで細胞に、 すなわち細胞増殖を刺激するために細胞に投与することができる。

【０１３７】 ＨＣＤＲの発現の増加は、細胞増殖の増加に関連して現れる。それゆえ一実施
例では、ＨＣＤＲのアンタゴニスト、或いはそのフラグメント又は誘導体が被検
者に投与され、細胞増殖に関連する疾患を予防或いは治療することができる。そ
のような疾患は、限定はしないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、
肉腫及び奇形腫、並びに詳細には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆
嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰
茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺及び子宮の癌を含む種々
の種類の癌を含む。一態様では、ＨＣＤＲに特異な抗体がアンタゴニストとして
直接或いは標的又は送達機構として間接的に、ＨＣＤＲを発現する細胞又は組織
に医薬品因子を運ぶために用いることができる。

【０１３８】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド或いはそのフ
ラグメント又は誘導体の相補配列を発現するベクタが被検者に投与され、限定は
しないが上記種類の癌を含む細胞増殖に関連する疾患を予防或いは治療すること
ができる。

【０１３９】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲのアンタゴニスト或いはそのフラグメント又
は誘導体を被検者に投与して、炎症を予防或いは治療することができる。炎症に
関連する疾患は、限定はしないが、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギ
ー、貧血症、喘息、アテローム性硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍
性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体
腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多
発性硬化症、重症筋無力症、心筋或いは心膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵
臓炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーングレーン症候群及び自
己免疫性甲状腺炎、さらに癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性、細菌
性、真菌性、寄生性、原生動物性及び寄生虫様性感染及び外傷を含む。一態様で
は、ＨＣＤＲに特異な抗体はアンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構
として間接的に、ＨＣＤＲを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用
いることができる。

【０１４０】 さらに別の実施例では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド或いはそのフ
ラグメント又は誘導体の相補配列を発現するベクタが被検者に投与され、限定は
しないが、上記炎症を含む任意の種類の炎症を予防或いは治療することができる
。

【０１４１】 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。

【０１４２】 ＨＣＤＲのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されるこ
とができる。詳細には、精製されたＨＣＤＲを用いて抗体を生成するか、或いは
医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＨＣＤＲと特異に結合するものを
同定することができる。

【０１４３】 ＨＣＤＲに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる。
そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ
、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラ
グメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治
療上の使用に適している。

【０１４４】 抗体を産生する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＨＣＤＲ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペ
プチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のア
ジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバン
トは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような
ミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプ
チド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよ
うな表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。

【０１４５】 ＨＣＤＲに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、
より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それら
は自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子から
なる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＨＣＤＲアミノ酸の短い伸展部
はキーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して生成される抗体の
ような別のタンパク質の伸展部と融合されることもできる。

【０１４６】 ＨＣＤＲに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子
の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技術は
、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozb
or 等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci
80:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。

【０１４７】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術が、Ｈ
ＣＤＲ特異性一本鎖抗体を生成するように、当分野で知られた方法を用いて適合
されてもよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からな
る抗体が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により
生成されることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-3）
。

【０１４８】 また抗体は、リンパ球集団においてｉｎ ｖｉｖｏで生成を誘発することによ
り、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc
Natl Acad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:29
3-299)に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングする
ことにより生成することもできる。

【０１４９】 またＨＣＤＲに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させるこ
ともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子の
ペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ（
ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成すること
ができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成し
て、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容
易に同定できるようにする（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）。

【０１５０】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＨＣＤＲとその特異的抗体との間の複合形成体を測
定することを含む。２つの非干渉性ＨＣＤＲエピトープに反応するモノクローナ
ル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タ
ンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。

【０１５１】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド或いはその
任意のフラグメント、又は相補配列が治療のために用いられる場合がある。一態
様では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡ
の転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、
ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることが
できる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＨＣＤＲ活性を調節
するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当
分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大
きなフラグメントを、ＨＣＤＲをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿
った種々の位置から設計することができる。

【０１５２】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＨＣＤＲをコードする遺伝子のポリヌクレオ
チドに相補的な核酸配列を発現する組換えベクタを構成することができる。これ
らの技術は、Sambrook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)の両方に記載される。

【０１５３】 ＨＣＤＲをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＨＣＤＲをコードする高
レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質
転換することにより遮断されるようになる。そのような構成体は、翻訳できない
センス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内
に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼによ
り無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は
、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメン
トがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。

【０１５４】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ＨＣＤＲをコードする遺伝子の制御、５´
或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に対
する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計す
ることにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−
１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に三重らせ
ん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制が
ポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるように
なるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は
、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immunolog ic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY)に記載されている。また 相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐこ
とによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる。

【０１５５】 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＨＣＤＲをコードする配列のヌクレオチド鎖
切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハン
マヘッドモチーフリボザイムを含む。

【０１５６】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補標
的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価する
ことができる。

【０１５７】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨＣＤＲをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉ ｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用い
て種々のベクタ内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ構成体
は、相補ＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に
導入することができる。

【０１５８】 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別さ
れないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された
形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に拡
張することができる。

【０１５９】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、ｉ ｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに同様に適し
ている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞
内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンのように繁殖す
ることができる。形質移入、リポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマに
よる送達（Goldman, C.K. 等(1997）Nature Biotechnology 15:462-66、参照し て本明細書の一部としている)は、当分野で周知の方法を用いて実現することが できる。

【０１６０】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検者に適用
されることができる。

【０１６１】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＨＣＤＲ、ＨＣＤＲに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト
或いはＨＣＤＲのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限
定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の滅菌の
生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少
なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組
成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与
してもよい。

【０１６２】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与することができる。

【０１６３】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。

【０１６４】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。

【０１６５】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。

【０１６６】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。

【０１６７】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。

【０１６８】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。

【０１６９】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。

【０１７０】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、包括（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。

【０１７１】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク
ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。

【０１７２】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＨＣＤＲの投与の場合、そのようなラベ
ル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。

【０１７３】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。

【０１７４】 任意の化合物の場合に、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養ア
ッセイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにお
いて最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経
路が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び
経路を確定することができる。

【０１７５】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＨＣＤＲ或いはその
フラグメント、ＨＣＤＲの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＨＣＤＲ
のインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び
毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０
（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死
する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指
数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示
す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータ
は、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合
物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中濃度の
範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び
投与経路によりこの範囲内で変化する。

【０１７６】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。

【０１７７】 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。

【０１７８】 診断 別の実施例では、ＨＣＤＲを特異に結合する抗体を、ＨＣＤＲの発現により特
徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＨＣＤＲ、アゴニスト、アン
タゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法に
おいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した
方法と同様の方法で調製することができる。ＨＣＤＲに対する診断検定法は、抗
体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＨＣＤＲを
検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いることができ、リ
ポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することにより標識され
ることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることがで
き、そのいくつかが上記される。

【０１７９】 ＨＣＤＲを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロ
トコルが当分野において知られており、ＨＣＤＲ発現の変更されたレベル或いは
異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＨＣＤＲ発現のための正常或い
は標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液
或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＨＣＤＲに対する抗体と結合す
ることにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量するこ
とができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＨＣＤＲ
の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と
被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。

【０１８０】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配
列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを
用いて、ＨＣＤＲの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現
を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＨＣＤＲの存否及び過
剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＨＣＤＲレベルの調節をモニ
タすることができる。

【０１８１】 一態様では、ＨＣＤＲ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブ
リダイゼーションにより、ＨＣＤＲをコードする核酸配列を同定することができ
る。非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、
或いは特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプロー
ブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中
間或いは低）が、そのプローブがＨＣＤＲをコードする自然発生配列、アレルの
みを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。

【０１８２】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＨＣＤＲをコードす
る配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好まし
い。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のヌク
レオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及び自然発生ＨＣＤ
Ｒのイントロンを含むゲノム配列に由来する。

【０１８３】 ＨＣＤＲをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプローブ
を生成するための手段は、ＨＣＤＲ或いはＨＣＤＲ誘導体をコードする核酸配列
を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そ
のようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリメラー
ゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ
プローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプロー
ブは、種々のリポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射性核種、又は
アビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスフ
ァターゼのような酵素標識により標識されることができる。

【０１８４】 ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列はＨＣＤＲの発現に関連する状態
或いは疾患の診断のために用いることができる。そのような状態或いは疾患の例
は、限定はしないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫及び奇形
腫、並びに詳細には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、
消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、
唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺及び子宮の癌のような細胞増殖に関連
する障害、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテ
ローム性硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス
病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋或いは心膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵臓炎、多発性筋炎、リウ
マチ様関節炎、強皮症、シェーングレーン症候群及び自己免疫性甲状腺炎、さら
に癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生性、原
生動物性及び寄生虫様性感染及び外傷のような炎症に関連する障害、エイズ及び
他の感染性或いは遺伝性免疫不全症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎
縮性側索硬化症、網膜色素変性症及び小脳変性症のような神経変性疾患、再生不
良性貧血のような脊髄形成異常症候群、心筋梗塞、脳卒中及び再潅流障害のよう
な虚血性障害、アルコール誘発肝障害、肝硬変及びラチリスムのような毒素誘発
障害、悪液質のような萎縮病、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のようなウイルス性感染及
び骨粗鬆症のようなアポトーシスに関連する障害を含む。ＨＣＤＲをコードする
ポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又
は他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＨＣＤＲ発
現を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティッ
ク、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができ
る。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。

【０１８５】 特定の態様では、ＨＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に
上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。Ｈ
ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブ
リダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サン
プルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは
洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽
出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく
変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配
列とハイブリダイズされており、サンプル内のＨＣＤＲをコードするヌクレオチ
ド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法
を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の
治療措置の有効度を評価することができる。

【０１８６】 ＨＣＤＲの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する
正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検
者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適し
た条件下でＨＣＤＲをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することに
より与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られ
た値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得ら
れた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される
。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。

【０１８７】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。

【０１８８】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。

【０１８９】 ＨＣＤＲをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらな
る診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学
的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され
てもよい。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向（
５´−＞３´）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３´＜−５´）を有する
ヌクレオチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化され
た条件下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組の
オリゴマ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或い
はＲＮＡ配列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いることが
できる。

【０１９０】 またＨＣＤＲの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチ
ドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果が
書き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods, 1
59:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプル を定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速
することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペク
トル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化をもたらすようになる。

【０１９１】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイの標的として用いることもでき
る。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転
写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突然変異及び多形性を同定するこ
とができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、疾患の遺伝的基礎を理解し、か
つ疾患を診断する際に有用であり、また治療薬剤の活性を発生及びモニタする際
に有用であろう（Heller.R.等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。

【０１９２】 一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願
ＷＯ９５／１１９９５（Chee等）、Lockhart, D.J.等（1996; Nat. Biotech. 14
:1675-1680）及びSchena, M等（1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619
）に記載される方法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。

【０１９３】 マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され
るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ
がからなることが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは長さが約６−６０ヌクレ
オチドであることが好ましく、１５−３０ヌクレオチドであることがより好まし
く、約２０−２５ヌクレオチドであることが最も好ましい。ある種のマイクロア
レイの場合、長さが７−１０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを用いる
ことが好ましいこともある。マイクロアレイは、既知の５´或いは３´配列に及
ぶオリゴヌクレオチド、完全長配列に及ぶ連続的なオリゴヌクレオチド、或いは
その配列の長さに沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを
含む場合がある。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは対象の遺伝子
に特異なオリゴヌクレオチドであり、その中では少なくともその配列のフラグメ
ントが既知であるか、或いは特定の細胞タイプ、発生的或いは疾患状態に共通の
１つ或いはそれ以上の未同定のｃＤＮＡに特異である。

【０１９４】 あるマイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成するた
めに、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５´或いはより好ましくは３´末端
で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズムは
、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内にＧＣ含
有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉することがある予測される副構造体
のない所定の長さのオリゴマを同定する。ある状況では、マイクロアレイにおい
てオリゴヌクレオチドの対を用いることが適切である。その「対」は、好ましく
は中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて同一であろう。その対の第２の（
１つだけ一致しない）ヌクレオチドは、制御体として機能する。オリゴヌクレオ
チド対の数は２−１００万の範囲にある。そのオリゴマは、光配向化学処理（li
ght-directed chemical process）を用いて支持体上の指定された領域で合成さ れる。支持体は紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ、スライド
ガラス或いは任意の他の適切な固定支持体である。

【０１９５】 別の態様では、オリゴヌクレオチドは、参照してその全体を本明細書の一部と
しているＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載される
ような、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体
の表面上で合成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット）
ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外 線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡ
フラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することができる。アレ
イは手動で或いは市販の開発された（スロットブロット或いはドットブロット装
置）機器及び装置（ロボット式機器を含む）を用いて生成され、８ドット、２４
ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドット、又
は市販の機器を有効に使用するのに適した任意の他の数量のグリッドを含む。

【０１９６】 マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生物学的サンプルから
のＲＮＡ或いはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブに加工される。ｍＲＮ
Ａが単離され、ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を形成するためのテ
ンプレートとして作製及び使用される。ａＲＮＡは、蛍光性ヌクレオチドの存在
下で増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイでインキュベートされ、プ
ローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする
ようにする。インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相
補的一致或いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される。ハイブリダ
イズされなかったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光のレベル及びパ
ターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイクロアレイ上の
各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確定する。生検
サンプルは任意の体液（例えば血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、培養された細
胞、バイオプシ或いは他の組織標本から得ることができる。同時に、個々の配列
の全てに対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否或いは量を測
定することができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異、変異配列或
いは多形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができる。

【０１９７】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲをコードする核酸配列を用いて、自然発生
ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又
はPrice CM (1993; Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ (1991; Trends Genet 7:
149-154)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染
色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染
色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造に遺伝子座が決定されるように
なる。

【０１９８】 蛍光ｉｎ ｓｉｔuハイブリダイゼーション（Verma 等(1988) Human Chromoso mes : A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NYに記載され
るＦＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相
関をなす。遺伝子マップデータの例は種々の科学雑誌或いはOnline Mendelian I
nheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上 のＨＣＤＲをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対する素
因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めること
を可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と保菌者、すなわち
感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる。

【０１９９】 染色体標本のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マ
ーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張す
るために用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝
子の配置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカ
を明らかにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体
腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは
他の遺伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える
。一度疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２
３まで(Gatti等(1998) Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局
在されていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のた
めの関連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列
を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等に
より染色体位置内の差を検出することができる。

【０２００】 本発明の別の実施例では、ＨＣＤＲ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメン
ト又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものに
おいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスク
リーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体
に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。
ＨＣＤＲと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。

【０２０１】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０
３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する
化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＨＣＤＲに
適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或いはあ
る他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物はＨＣＤＲ或いはそ
のフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＨＣＤＲが当分野で周
知の方法により検出される。また精製されたＨＣＤＲは、上記の薬物スクリーニ
ング技術において用いるためのプレート上に直接コーティングされることもでき
る。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上
に固定化することもできる。

【０２０２】 別の実施例では、ＨＣＤＲを特異に結合することができる中和性抗体がＨＣＤ
Ｒを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを
使用する。この方法では、抗体を用いて、ＨＣＤＲと１つ或いはそれ以上の抗原
決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。

【０２０３】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＨＣＤＲをコードするヌクレオチド配列
を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。

【０２０４】 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。

【０２０５】

【実施例】 １ ｃＤＮＡライブラリ作製 ヒト脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリ、ＳＰＬＮＦＥＴ０１はStratagene社により
特別に作成された。ＳＰＬＮＦＥＴ０１ライブラリ用の組織は、種々のソースか
ら貯蔵された胎児脾臓から得られ、多くの異なる種類の細胞を含んでいた。ポリ
（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）用の組織が精製され、ｃＤＮＡライブラリはｍＲＮ
Ａから合成された。合成アダプタオリゴヌクレオチドはｃＤＮＡ端部に結合され
、Uni-ZAP^TMベクター系（Stratagene）への挿入を可能とし、一方向性（センス 方向）λライブラリ作成の効率を高め、ｃＤＮＡ挿入物を有するクローンを検出
するための青色／白色選択でプラスミド系の便利性を向上した。別の一方向性ベ
クトルはｐｃＤＮＡ１(Invitrogen, San Diego CA)及びｐＳＨｌｏｘ−１ (Nova
gen, Madison WI)である。

【０２０６】 特別に作成されたライブラリファージ粒子は、高い形質転換効率を有する大腸
菌宿主株XL1-Blueョ (Stratagene)に形質移入され、ｃＤＮＡライブラリにおいて 非常に少ない比率のクローンを得る確率を高めた。

【０２０７】 ＬＶＥＮＮＯＴ０１ｃＤＮＡライブラリは５１歳白人女性の左側心室から作成
された。組織は凍結され、粉砕され、グアニジニウムイソチアネートを含む緩衝
液に即座に溶解され、塩化セシウムを用いてスピン処理された。その沈殿物は、
ｐＨ８で数回のフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行うことによ
り処理された。その結果精製されたサンプルはデオキシリボヌクレアーゼ処理さ
れ、その後ポリアデニル化ｍＲＮＡがQiagen Oligotex (Qiagen, Chatsworth, C
A)を用いて単離され、精製された。

【０２０８】 第１鎖のｃＤＮＡ合成は、ＸｈｏＩ制限部位を含むオリゴｄ（Ｔ）プライマ／
リンカーを用いて行われた。第２鎖の合成はＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌リガ
ーゼ及びリボヌクレアーゼＨの組み合わせを用いて行われ、その後ＥｃｏＲＩア
ダプタを平滑末端化されたｃＤＮＡに加えた。その後ＥｃｏＲＩと結合された二
本鎖ｃＤＮＡはＸｈｏＩ制限酵素で消化され、大きさが８００ｂｐを超えた配列
を得るために分画された。ｃＤＮＡはLambdaZapベクタ系（Stratagene）に挿入 された。その後pBluescript^TM phagemid (Stratagene)を含むベクタが大腸菌宿 主細胞株XL 1-BlueMRF (Stratagene)に形質転換された。

【０２０９】 ＥＮＤＡＮＯＴ０１ｃＤＮＡライブラリは、男性から得られた外殖された心臓
／大動脈組織に由来する大動脈内皮細胞株から作製された。凍結組織はホモジナ
イズされ、グラジニウムイソチアネート溶液に、Brinkmann Homogenizer Polytr
on PT-3000 (Brinkmann Instruments, Westbury, NJ)を用いて溶解された。その
溶解産物は、Beckman L8-70M Ultracentrifuge (Beckman Instruments)のBeckma
n SW28 rotorを用いて、周囲温度において毎分２５０００回転で１８時間、５．
７Ｍ ＣｓＣｌクッション上で遠心分離された。そのＲＮＡは酸性フェノールｐ
Ｈ４．７で抽出され、０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用
いて沈殿され、ＲＮＡ分解酵素を含まない水に再懸濁され、３７℃でデオキシリ
ボヌクレアーゼ処理された。ＲＮＡの抽出及び沈殿は上記のように繰り返された
。その後ｍＲＮＡがQiagen Oligotex kit (QIAGEN)を用いて単離され、ｃＤＮＡ
ライブラリを作製するために用いられた。

【０２１０】 そのｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用のSuperScript
Plasmid System(Cat. #18248-013, Gibco/BRL)の推奨プロトコルに従って処理さ
れた。ｃＤＮＡはSepharose CL4B column (Cat. #275105-01, Pharmacia)上で分
画され、４００ｂｐより大きいｃＤＮＡがｐＩＮＣＹ１に結合された。その後プ
ラスミドｐＩＮＣＹ１はDH5α^TM competent cells (Cat. #18258-012, Gibco /B
RL)に形質転換された。

【０２１１】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 ＳＰＬＮＦＥＴ０１或いはＬＶＥＮＮＯＴ０１用の個々のｃＤＮＡクローンの
ファージミド形態がin vivo切除プロセスにより得られた。そのプロセスでは宿 主菌株がλライブラリファージ及びｆ１ヘルパーファージの両方と同時感染され
た。ライブラリ含有ファージ及びヘルパーファージの両方に由来するタンパク質
がλＤＮＡにニックを入れ、λ標的ＤＮＡ上で画定された配列から新規のＤＮＡ
合成を開始し、pBluescriptプラスミド及びｃＤＮＡ挿入物の全ＤＮＡ配列を含 む小さな一本鎖の環状ファージミドＤＮＡ分子を作製した。ファージミドＤＮＡ
は細胞から分泌かつ精製され、その後それを用いて新鮮な宿主細胞を再感染し、
二本鎖ファージミドＤＮＡが作製された。ファージミドはβラクタマーゼのため
の遺伝子を運ぶため、新規に形質転換された細菌がアンピシリンを含む培地上で
選択された。

【０２１２】 ファージミドＤＮＡは、QIAwell-8 Plasmid, QIAwell PLUS或いはQIAwell ULT
RA DNA精製システム(QIAGEN)を用いて精製された。その製造ラインは、多穴形式
のEMPORE^TM膜技術(3M, Minneapolis, MN)とともにQIAGEN陰イオン交換樹脂分子 を用いて細菌細胞を溶解し、概ね精製されたファージミドＤＮＡを単離するため
の便利で、高速で、しかも信頼性が高い高スループットの方法を提供する。ＤＮ
Ａは、ＤＮＡ配列決定及び他の解析操作のために既に準備されている精製樹脂か
ら溶出された。

【０２１３】 ＥＮＤＡＮＯＴ０１用のプラスミドＤＮＡは細胞が遊離され、REAL Prep 96 P
lasmid Kit (Catalog #26173, QIAGEN)を用いて精製された。このキットにより 、多チャネル試薬ディスペンサを用いて９６穴ブロックの９６サンプルを同時に
精製することができる。その推奨プロトコルを用いたが、以下の点が変更した。
１）細菌は、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有す
る１ｍｌの滅菌のTerrific Broth（Catalog #22711, Gibco/BRL）において培養 された。２）接種後、その培養株は１９時間インキュベートされ、その細胞は０
．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解された。３）イソプロパノール沈殿後、プラスミド
ＤＮＡペレットが０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁された。プロトコルの最後のステ
ップを終了した後、サンプルは４℃で保管するために９６穴ブロックに移された
。

【０２１４】 ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers (PTC200; MJ Research, Watertown, M
A)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems或いはPerkin Elmer 37
3 DNA Sequencing SystemとともにPerkin Elmer Catalyst 800或いはHamilton M
icro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV)を用いて、Sanger等(1975, J. Mol. Biol.
94:441 f)の方法に従って配列決定され、読み枠が確定された。

【０２１５】 ３ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列は、GenBank、Swi
ssProt, BLOCKS及びPima IIのようなデータベースへの問合せ配列として用いら れた。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、Ｂ
ＬＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域の検索が行われた。ＢＬＡＳＴはBasi
c Local Alignment Search Tool（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300,
Altschul等(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410）を表している。

【０２１６】 ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作製し、
配列類似性を確定する。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは
厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植
物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。ここで他のアルゴリズ
ム、例えば参照して本明細書の一部としているSmith T.等(1992, Protein Engin
eering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムを、主要配列パターン及び副次的な 構造間隙の問題を取り扱う際に用いることができる。本特許出願において開示さ
れるように、配列は少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１
２％未満である（この場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。

【０２１７】 ＢＬＡＳＴアプローチはKarlin.S.及びS.F.Atschul (1993; Proc.Nat. Acad.S
ci. 90:5873-7)に詳述され、参照して本明細書において用いており、問合せ配列
とデータベース配列との間の一致を検索し、見い出されたあらゆる一致の統計的
有意性を評価し、ユーザにより選択された有意な閾値を満足する一致のみを報告
する。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０^-25、ペプチドの場合１ ０^-14に設定された。

【０２１８】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、前掲）。

【０２１９】 ＢＬＡＳＴ(Altschul, S.F. (1993) J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul, S.F.
等(1990) J.MoI.Evol. 215:403-410)を用いる類似のコンピュータ技術を用いて 、GenBank或いはLIFESEQ^TM database （インサイト社）のようなヌクレオチドデ
ータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイ
ブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変
更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類さ
れるかを確定することができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は
通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、
それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０２２０】 ノーザン分析の結果は、ＨＣＤＲをコードする転写物が発生するライブラリの
リストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定
の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量を
ｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０２２１】 ５ ＨＣＤＲをコードするポリヌクレオチドの伸長 インサイト社クローン２６４５９、３４８４２９或いは２４５８４３８の核酸
配列を用いて、部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレ
オチドプライマを設計した。１つのプライマを合成してアンチセンス方向の伸長
を開始し、他のプライマを合成してセンス方向の配列を伸長した。プライマを用
いて、対象の領域に対する新規で未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを
「外側に」発生させる既知の配列の伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO
4.06 (National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡか ら設計され、長さが約２２−３０のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有
物を有し、約６８−７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘ
アピン構造及びプライマ−プライマ２量体化をもたらすことになるヌクレオチド
の伸展は避けられた。

【０２２２】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。 ２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。

【０２２３】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完 全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ １５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） のパラメータで実行された。

【０２２４】 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A Quick^TM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクロー ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。

【０２２５】 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（Sambrook J 等、前掲）。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅ．ｃ ｏｌｉ 混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani (LB)-agar (Sambrook J 等
、上記)上に蒔かれた。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選 び取られ、適当な市販の無菌９６穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれ
た１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μ
ｌの一晩おいた培養株が有菌の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希釈さ
れた後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイに移された。

【０２２６】 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） の条件で実行された。

【０２２７】 ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。

【０２２８】 同様にして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：６のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、５´伸長用に設計された オリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用いて５´調節配列を得る。

【０２２９】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に
由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ或いはｍ
ＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対からなるオリゴヌ
クレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなヌクレオチドフラグメント
にも概ね同じ手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06 (National
Biosciences)のような最新のソフトウエアを用いて設計され、５０ｐｍｏｌの 各オリゴマと２５０μＣｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸 (Amersham)及びＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを組み合わせることによ り標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine r
esin column (Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に精製される。センス及びア ンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれの毎分１０⁷カウント含む部分標本は、 エンドヌクレアーゼ(Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I, Xba 1.或いは Pvu II、Du
Pont NEN)の１つで消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼ ーション分析において用いられる。

【０２３０】 各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに上で分画され、ナイロン
膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写される。ハイブリダ
イゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異的シグナルを除去するため
に、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XO
MAT AR^TM film (Kodak, Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molec
ular Dynamics, Synnyvale CA)内でブロットに露出された後、ハイブリダイゼー
ションパターンが視覚的に比較される。

【０２３１】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを生成するために、上記ヌクレオチド
配列が、そのヌクレオチド配列の３´末端で開始するコンピュータアルゴリズム
を用いて検査される。そのアルゴリズムは、その遺伝子に固有で、ハイブリダイ
ゼーションに適した範囲内のＧＣ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉
すると考えられる予測された副構造体がない所定の長さのオリゴマを同定する。
そのアルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチドからなる２０の特異な配列のオリ
ゴヌクレオチド（２０量体）を同定する。各配列の中央の１つのヌクレオチドが
変化している、一致したオリゴヌクレオチドの組みが形成される。このプロセス
はマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰り返され、２０個の２０量体からなる
二重の組みが、光配向化学処理（Chee, M.等、PCT/WO95/11995、参照して本明細
書の一部としている）を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。

【０２３２】 別法では、化学的結合手順及びインクジェット吐出装置を用いることにより支
持体の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler等、PCT出願WO95/25116、 参照してその全体を本明細書の一部としている）。別の方法では、ドット（或い
はスロット）ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空 系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表
面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することが
できる。アレイは手動で或いは市販の機器及び装置を用いて生成され、８ドット
、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドッ
トのグリッドを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかった
プローブを除去するためにマイクロアレイは洗浄され、スキャナを用いて蛍光の
レベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイク
ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量を確
定する。

【０２３３】 ８ 相補ポリヌクレオチド ＨＣＤＲをコードする配列或いはその任意の一部に相補的な配列用いて、自然
発生ＨＣＤＲの発現を減少或いは抑制する。約１５−約３０塩基対を含むオリゴ
ヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より小さな或いはより大きなｃＤＮＡ
フラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。適当なオリゴヌクレオチドはOlig
o4.06ソフトウエア及びＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のコード配列を用いて設計される。転写を抑制す
るために、相補オリゴヌクレオチドは最も固有の５´配列から設計され、コード
配列へのプロモータ結合を防ぐために用いられる。翻訳を抑制するために、相補
オリゴヌクレオチドは、ＨＣＤＲをコードする転写物へのリボソーム結合を防ぐ
ように設計される。

【０２３４】 ９ ＨＣＤＲの発現 ＨＣＤＲの発現は、ｃＤＮＡを適当なベクタにサブクローニングし、ベクタを
宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合には、クローニングベ
クタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＨＣＤＲを発現する。クローニング部位の上流
では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それにア
ミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配列が
続く。これらの８残基の直後は、転写のために有用なバクテリオファージプロモ
ータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。

【０２３５】 単離され、標準的な方法を用いてＩＰＴＧと形質転換された細菌株の誘発は、
β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び完全長タ
ンパク質からなる融合タンパク質を生成する。シグナル残基は、活性用の以下の
検定法に直接用いることができる細菌成長培地へのＨＣＤＲの分泌を促す。

【０２３６】 １０ ＨＣＤＲ活性の実証 ＨＣＤＲはＣＯＳ７、ＨｅＬａ或いはＣＨＯのような哺乳動物細胞株をＨＣＤ
Ｒを発現する真核発現ベクタと転換することにより発現させることができる。真
核発現ベクタは市販されており、それを細胞に導入するための技術は当業者には
周知である。細胞は、その細胞株に適した条件下で転換した後４８〜７２時間イ
ンキュベートされ、ＨＣＤＲが発現できるようにする。その後位相差顕微鏡を用
いて、制御細胞に対する転換細胞の分裂指数を比較する。分裂指数の増加がＨＣ
ＤＲ活性を示す。

【０２３７】 １１ ＨＣＤＲ特異的抗体の生成 ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、上記)、或いは他の精製技術を用いて実質的に
精製されるＨＣＤＲを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて抗
体を生成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：６から推定されるアミノ酸配列は、DNAStar software (DNASTAR Inc) を用いて分析され、免疫原性の高い領域を確定し、対応するオリゴポリペプチド
を合成かつ使用して、当業者に知られた手段により抗体を産生させる。Ｃ−末端
付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適当なエピトープの選択は、Au
subel等（前掲）などに記載される。

【０２３８】 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前掲）との反応によりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH
, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバン
ト内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血清は、
例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ抗血清
と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応さ
せることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２３９】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＣＤＲの精製 自然発生或いは組換えＨＣＤＲは、ＨＣＤＲに対して特異な抗体を用いる免疫
親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＨＣ
ＤＲ抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活性化さ
れたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより作製される。結合後、製造
者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。

【０２４０】 ＨＣＤＲを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＨＣＤＲを
選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で
洗浄される。カラムは、抗体／ＨＣＤＲ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２−３の
緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）
で溶出され、ＨＣＤＲが回収される。

【０２４１】 １３ ＨＣＤＲと相互作用する分子の同定 ＨＣＤＲ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(B
olton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多数のウエルプレ
ートのウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＨＣＤＲでインキュ
ベートされ、洗浄され、標識されたＨＣＤＲ複合体を有する任意のウエルが検定
される。種々のＨＣＤＲ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＨＣ
ＤＲと候補分子との関係を示す値を計算する。

【０２４２】 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入ることを意図
するものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＨＣＤＲ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｂ】 ＨＣＤＲ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｃ】 ＨＣＤＲ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｄ】 ＨＣＤＲ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｅ】 ＨＣＤＲ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図２Ａ】 ＨＣＤＲ−１（２６４５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、マウスＨ５タンパク質
（ＧＩ ５１２０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びヒト細胞分裂制御関連タンパ
ク質（ＧＩ １８０９３１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の間のアミノ酸配列アラ
イメントを示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc,
Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

【図２Ｂ】 ＨＣＤＲ−１（２６４５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、マウスＨ５タンパク質
（ＧＩ ５１２０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及びヒト細胞分裂制御関連タンパ
ク質（ＧＩ １８０９３１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の間のアミノ酸配列アラ
イメントを示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc,
Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

【図３Ａ】 ＨＣＤＲ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する疎水性プロットを示す。正方
向Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PRO so
ftware）。

【図３Ｂ】 マウスＨ５タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）に対する疎水性プロットを示
す。正方向Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASI
S PRO software）。

【図４Ａ】 ＨＣＤＲ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図４Ｂ】 ＨＣＤＲ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図４Ｃ】 ＨＣＤＲ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図４Ｄ】 ＨＣＤＲ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図４Ｅ】 ＨＣＤＲ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図５Ａ】 DNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて作成された、ＨＣＤＲ−２（３４８４２９、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：３）とＣＤＣ１０のヒト相同体、すなわちＫＩＡＡ０１２８（ＧＩ １４６９１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）との間のアミノ酸配列アライメントを
示す。

【図５Ｂ】 DNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて作成された、ＨＣＤＲ−２（３４８４２９、ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：３）とＣＤＣ１０のヒト相同体、すなわちＫＩＡＡ０１２８（ＧＩ １４６９１７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）との間のアミノ酸配列アライメントを
示す。

【図６Ａ】 ＨＣＤＲ−２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対する疎水性プロットを示す。正方
向Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PRO so
ftware）。

【図６Ｂ】 ＫＩＡＡ０１２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）に対する疎水性プロットを示す。
正方向Ｘ軸はアミノ酸の位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PR
O software）。

【図７Ａ】 ＨＣＤＲ−３のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図７Ｂ】 ＨＣＤＲ−３のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図７Ｃ】 ＨＣＤＲ−３のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図７Ｄ】 ＨＣＤＲ−３のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA)を用いて作成された。

【図８Ａ】 DNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて作成された、ＨＣＤＲ−３（２４５８４３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）とマウス増殖関連タンパク質１（ＧＩ １１６７９６７、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０）との間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図８Ｂ】 DNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメ
ントプログラムを用いて作成された、ＨＣＤＲ−３（２４５８４３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）とマウス増殖関連タンパク質１（ＧＩ １１６７９６７、ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：１０）との間のアミノ酸配列アライメントを示す。

【図９Ａ】 ＨＣＤＲ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に対する疎水性プロットを示す。正方
向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PRO soft
ware）。

【図９Ｂ】 マウス増殖関連タンパク質１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）に対する疎水性プロッ
トを示す。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacD
NASIS PRO software）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 シャー、パルビ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・＃５・クイーンシャルロッ トドライブ 1608 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA04 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 4B064 AG02 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93Y AC14 BA25 CA24 CA44 4C084 AA01 AA06 AA07 AA17 BA01 BA22 CA53 DA01 ZB112 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 BB17 DD63 DD88 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA76 EA22 EA28 FA74

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメ
   ントを含む実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子。
2. 【請求項２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％アミノ酸同一性
   を有し、ヒト細胞分裂制御因子の少なくとも１つの機能的な特徴を保持するヒト
   細胞分裂制御因子の変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のヒト細胞分裂制御因子をコードする単離され、
   精製されたポリヌクレオチド配列或いは前記ポリヌクレオチド配列のフラグメン
   ト又は変異配列。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む単離され、精製さ
   れた組成物。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポ
   リヌクレオチド配列。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメント
   又は変異配列に相補的なポリヌクレオチド配列。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異配
   列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、精
   製されたポリヌクレオチド配列。
10. 【請求項１０】 少なくとも請求項３のポリヌクレオチド配列のフラグメ
    ントを含む発現ベクタ。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクタを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含むポリペプチドを精製するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１１の宿主細胞を培養す
    る過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
    を特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミ
    ノ酸配列を有する実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子を含む医薬品組成物
    。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗
    体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの有効量を細胞に投与する過程
    を含む細胞増殖を刺激するための方法。
18. 【請求項１８】 請求項１３の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或いは治療す
    るための方法。
19. 【請求項１９】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法。
20. 【請求項２０】 請求項１６のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法。
21. 【請求項２１】 生物学的サンプルにおいてヒト細胞分裂制御因子をコー
    ドするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 ａ）請求項６のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの核酸物質にハイブ
    リダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイブ
    リダイゼーション複合体の存在が生物学的サンプルにおいて前記ヒト細胞分裂制
    御因子をコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法
    。
22. 【請求項２２】 前記核酸物質がハイブリダイゼーション前にポリメラー
    ゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含む実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子。
24. 【請求項２４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも９０％アミノ酸同一
    性を有し、ヒト細胞分裂制御因子の少なくとも１つの機能的特徴を保持するヒト
    細胞分裂制御因子の変異体。
25. 【請求項２５】 請求項２３のヒト細胞分裂制御因子をコードする単離さ
    れ、精製されたポリヌクレオチド配列或いは前記ポリヌクレオチド配列のフラグ
    メント又は変異配列。
26. 【請求項２６】 請求項２５のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
27. 【請求項２７】 請求項２５のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズす
    る単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
28. 【請求項２８】 請求項２５のポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメ
    ント又は変異配列に相補的な単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
29. 【請求項２９】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４或いはそのフラグメント又は変異
    配列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
30. 【請求項３０】 請求項２９のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
31. 【請求項３１】 請求項２９のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され
    、精製されたポリヌクレオチド配列。
32. 【請求項３２】 少なくとも請求項２５のポリヌクレオチド配列のフラグ
    メントを含む発現ベクタ。
33. 【請求項３３】 請求項３２の発現ベクタを含む宿主細胞。
34. 【請求項３４】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含むポリペプチドを精製するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項３３の宿主細胞を培養す
    る過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
    を特徴とする方法。
35. 【請求項３５】 適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミ
    ノ酸配列を有する実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子を含む医薬品組成物
    。
36. 【請求項３６】 請求項２３のポリペプチドに特異に結合する精製された
    抗体。
37. 【請求項３７】 請求項２３のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
38. 【請求項３８】 請求項２３のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト
    。
39. 【請求項３９】 請求項２３のポリペプチドの有効量を細胞に投与する過
    程を含む細胞増殖を刺激するための方法。
40. 【請求項４０】 請求項３５の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或いは治療す
    るための方法。
41. 【請求項４１】 請求項３８のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法。
42. 【請求項４２】 請求項３８のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法。
43. 【請求項４３】 生物学的サンプルにおいてヒト細胞分裂制御因子をコー
    ドするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 ａ）請求項２８のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの核酸物質にハイ
    ブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記複合体
    の存在が前記生物学的サンプルにおいてヒト細胞分裂制御因子をコードするポリ
    ヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
44. 【請求項４４】 前記核酸物質がハイブリダイゼーション前にポリメラー
    ゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
45. 【請求項４５】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含む実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子。
46. 【請求項４６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に少なくとも９０％アミノ酸同一
    性を有し、ヒト細胞分裂制御因子の少なくとも１つの機能的な特徴を保持するヒ
    ト細胞分裂制御因子の変異体。
47. 【請求項４７】 請求項４５のヒト細胞分裂制御因子をコードする単離さ
    れ、精製されたポリヌクレオチド配列或いは前記ポリヌクレオチド配列のフラグ
    メント又は変異配列。
48. 【請求項４８】 請求項４７のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
49. 【請求項４９】 請求項４７のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズす
    る単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
50. 【請求項５０】 請求項４７のポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメ
    ント又は変異配列に相補的なポリヌクレオチド配列。
51. 【請求項５１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６或いはそのフラグメント又は変異
    配列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
52. 【請求項５２】 請求項５１のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
53. 【請求項５３】 請求項５１のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され
    、精製されたポリヌクレオチド配列。
54. 【請求項５４】 少なくとも請求項４７のポリヌクレオチド配列のフラグ
    メントを含む発現ベクタ。
55. 【請求項５５】 請求項５４の発現ベクタを含む宿主細胞。
56. 【請求項５６】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含むポリペプチドを精製するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項５５の宿主細胞を培養す
    る過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
    を特徴とする方法。
57. 【請求項５７】 適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミ
    ノ酸配列を有する実質的に精製されたヒト細胞分裂制御因子を含む医薬品組成物
    。
58. 【請求項５８】 請求項４７のポリペプチドに特異に結合する精製された
    抗体。
59. 【請求項５９】 請求項４７のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
60. 【請求項６０】 請求項４７のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト
    。
61. 【請求項６１】 請求項４５のポリペプチドの有効量を細胞に投与する過
    程を含む細胞増殖を刺激するための方法。
62. 【請求項６２】 請求項５７の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
    者に投与する過程を含むアポトーシスの増加に関連する疾患を予防或いは治療す
    るための方法。
63. 【請求項６３】 請求項６０のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む癌を予防或いは治療するための方法。
64. 【請求項６４】 請求項６０のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む炎症を予防或いは治療するための方法。
65. 【請求項６５】 生物学的サンプルにおいてヒト細胞分裂制御因子をコー
    ドするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 ａ）請求項５０のポリヌクレオチドを生物学的サンプルの核酸物質にハイブリ
    ダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイブ
    リダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおいてヒト細胞分裂制
    御因子をコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法
    。
66. 【請求項６６】 前記核酸材料がハイブリダイゼーション前にポリメラー
    ゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項６５に記載の方法。