JP2001524312A - ヒトｃｄｃ１０相同体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体（ＧＲ−ＳＥＰ）及びＧＲ−ＳＥＰを同定かつコードするポリヌクレオチド配列を提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、アゴニスト、抗体及びアンタゴニストも提供する。また本発明はＧＲ−ＳＥＰの発現に関連する疾患を治療及び予防するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明はヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体の核酸配列及びアミノ酸配列に関連し
、神経疾患、生殖障害、免疫疾患及び腫瘍性疾患の診断、予防及び治療における
これらの配列の使用法に関連する。

【０００２】 背景技術 細胞分裂は、全ての生物が成長及び繁殖するための基本的なプロセスである。
酵母及び細菌のような単細胞生物では、各細胞分裂により生物の数が２倍になり
、一方多細胞種では、新しい組織及び器官を生成し、かつ老化及びプログラム細
胞死により失われた細胞の代わりをするために多数回の細胞分裂が必要となる。
細胞分裂サイクルの細部は変化する場合があるが、基本的なプロセスは主に３段
階の主なイベントからなる。第１のイベントは細胞間期であり、細胞分裂のため
の準備、ＤＮＡの複製及び不可欠なタンパク質の生成を含む。第２のプロセスは
有糸分裂であり、核物質が分割され、細胞の両側に分離される。最後のプロセス
は細胞質分裂であり、細胞質が分割及び分裂する。分割及び分裂は、母／娘細胞
が分離できるようにする細胞周囲の収縮性で縦方向の環状隔壁の形成を含む場合
がある。これらの細胞サイクルイベントの流れ及びタイミングは、種々のチェッ
クポイントでそのプロセスを調節する細胞サイクル制御系の制御下にある。過去
２０年間に渡って、多数の研究が、これらのイベントを調節する種々のタンパク
質の構造及び機能を研究することに向けられてきた。

【０００３】 細胞質分裂及び隔壁形成のプロセスは、植物、酵母及び昆虫において研究成果
が上がっている。セプテン（septin）は隔壁形成に関連する出芽酵母、サッカロ ミセスセルビシェ において最初に同定されたタンパク質のファミリである(Longf
ine, M.S.等,(1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8:106-I 19)。酵母では、４つの 遺伝子産物（ＣＤＣ３、ＣＤＣ１、ＣＤＣ１１及びＣＤＣ１２）がこのファミリ
のメンバであり、細胞質膜の直ぐ内側に位置する「出芽フィラメント」に関連す
る。ＣＤＣ遺伝子の突然変異は細胞質分裂を乱し、異常な出芽成長を伴う多核化
した細胞を生成する原因となる。

【０００４】 分裂酵母ＣＤＣ１０遺伝子の相同体は、カンジダアルビカンス（Candida albi cans ）（ＣａＣＤＣ１０）、キイロショウジョウバエ（Ｓｅｐ−１及びピーナツ
）及びヒト胎児肺（ｈＣＤＣ１０）において見出されている（DiDomenico, B.J.
等 (1994) Mol. Gen. Genet. 242:689-698; Faxes, H.等(1995) Mol. Biol. Cel
l 6:1843-1859;Neufeld, T.P.及びRubin, G.M. (1994) Cell 77:371-379; Nakat
suru, S.等(1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 202:82-87）。Ｓｅｐ１は分 裂細胞の分割溝のリーディングエッジに関連し、溝形成においてある役割を果た
すものと考えられる。ピーナツはハエ胚形成における細胞質分裂及び成虫原基の
ために必要である。ピーナツは、胞胚葉胎芽のシンシチウム核間の成長している
膜に局在する。細胞質分裂での役割に加えて、ピーナツ遺伝子は複眼の神経細胞
の運命決定のために必要とされる７つの欠乏した（seven in absentia）ハエ遺 伝子との遺伝的な相互作用を示す（Neufeld及びRubin、前掲）。

【０００５】 セプテンの大部分は、ＧＴＰ結合タンパク質及びＧＴＰ加水分解酵素スーパー
ファミリの共通のモチーフである基本的なアミノ酸が豊富な３つのドメインを共
有する。これらの３つのドメインの第１のドメインは配列ＧＸＸＧＸＧＫＳＴで
あり、セプテン構築或いは機能に関連する可能性があるＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位
及び加水分解部位（Ｐ−ループ）であると考えられる（Saraste, M.等(1990) Tr
ends Biochem. Sci. 15:430-434）。配列ＤＸＸＧ（Ｘ）_nＫＸＤ（ただしｎは約
７８アミノ酸残基である）を有する２つの付加的なＧＴＰ結合部位は、ＣＤＣ１
０相同体のあるものに存在する（Nakatsuru等、前掲）。細胞質分裂は、ＧＴＰ 結合タンパク質から形成されるフィラメント及び他の構成要素により媒介される
ものと考えられる。また既知のセプテンの大部分は、そのＣ末端付近に３５〜９
８アミノ酸からなる予測されるコイルドコイルドメインも含む（Nakatsuru等、 前掲）。これらのドメインは、セプテン自体間の、並びにまた他のタンパク質と
のホモタイプ或いはヘテロタイプの相互作用に関連する場合がある。細胞サイク
ル及び後続する細胞増殖の進行は、サイクリン、サイクリン依存タンパク質キナ
ーゼ及び関連するタンパク質からなるタンパク質複合体の複合的な相互作用によ
り支配される（Cordon-Cardo, C. (1995) Am. J.Pathol. 147:545-560）。癌は 非協調的な細胞増殖により特徴付けられ、いくつかの癌は細胞サイクル中の進行
を正常に調節するタンパク質複合体の変化により同定することができる（Nigg,
E.A. (1995) BioEssays 17:471-480）。癌に対する主な治療方策は、細胞サイク
ル調節に関連するタンパク質を操作することにより細胞サイクル進行に渡って調
節を回復する過程を含む（Neubauer, A.等(1996)Leukemia l 0:S2-S4）。例えば
Cordon-Cardo（前掲）は、Ｃｄｋ４の負の制御因子が腫瘍サプレッサとして作用
する場合があることを示唆した。

【０００６】 乳癌及び赤白血病細胞についての実験により、細胞成長を止めるある薬剤が、
恐らくＣｄｋ４活性の抑制を通して作用していることを示す（Watts,C.K.等(199
5) Mol. Endocrinol. 9:1804-1813; Marks, P.A.等(1994) Proc. Natl. Acad. S
ci. 91 :10251-10254）。ＴＡＴＡボックス依存転写機構も癌治療の可能性のあ るターゲットである。例えば腫瘍サプレッサタンパク質ｐ５３はプロモータの活
性を抑圧し、その開始はＴＡＴＡボックスの存在に依存している（Mack, D.H.等
(1993) Nature 363:281-283）。さらにMack等（前掲）は、ｐ５３の抑圧が、基 本転写因子とｐ５３との相互作用により媒介されることを観測した。

【０００７】 ヒト細胞分裂サイクルに協調して作用する因子の調節は、腫瘍起源を低減する
ための重要な手段を与える。従ってこのプロセスを調節する新しい細胞分裂サイ
クルタンパク質は、癌を診断及び治療する新規の手段を提供することにより、当
分野における著しい必要を満足することができる。

【０００８】 新規のヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体及びそれをコードするポリヌクレオチド
の発見は、神経疾患、生殖障害、免疫疾患及び腫瘍性疾患の診断、予防及び治療
において有用な新規の組成物を提供することができ、当分野における必要を満足
する。

【０００９】 発明の概要 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列或いはそのフラグメ
ントを有する実質的に精製されたポリペプチド、ヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体
（ＣＤＣ１０）を特徴とする。

【００１０】 さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメン
トを含むポリペプチドをコードする単離され、実質的に精製されたポリヌクレオ
チド配列及びそのポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。また本発明は、ア
ミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードするポリヌクレオチド配列或いはその
ポリヌクレオチド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ
酸配列をコードするポリヌクレオチド配列或いはそのポリヌクレオチド配列のフ
ラグメント又は変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１１】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む単離され、精製された配列或いはそ
の変異配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチ
ド配列に厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。また
本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異配列の相補配列
を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１２】 さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む発現ベクタを提供する。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド配列
を含む発現ベクタは宿主細胞に含まれる。

【００１３】 また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメント
を含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）そのポリペプチドの発
現に適した条件下で少なくともＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド配列
のフラグメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、ｂ）その宿
主細胞培養株からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法
を提供する。

【００１４】 また本発明は、適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配
列を有する実質的に精製されたＧＲ−ＳＥＰを含む医薬品組成物を提供する。

【００１５】 また本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアンタゴニス
トを提供する。一態様では本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含
むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。

【００１６】 さらに本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアゴニスト
を提供する。

【００１７】 また本発明は、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む神経疾患を治療或いは予防するための方法を提供する。

【００１８】 また本発明は、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む生殖障害を治療或いは予防するための方法を提供する。

【００１９】 また本発明は、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む免疫障害を治療或いは予防するための方法を提供する。

【００２０】 また本発明は、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者
に投与する過程を含む腫瘍性疾患を治療或いは予防するための方法を提供する。

【００２１】 また本発明は生物学的サンプルにおいてＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレ
オチドを検出するための方法であって、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１をコードする
ポリヌクレオチド配列の相補配列を生物学的サンプルの核酸物質にハイブリダイ
ズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）その
ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、その複合体の存在が生
物学的サンプルにおけるＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの存在と相
関をなすことを特徴とする方法を提供する。一態様では、生物学的サンプルの核
酸物質は、ハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される
。

【００２２】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。

【００２３】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。

【００２４】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味で用いられる。本明
細書で記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料を本発明
の検証に際して用いてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記
載される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる
場合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示す
るために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、
本発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを
容認するものと解釈されるべきではない。

【００２５】 定義 ここで用いるＧＲ−ＳＥＰは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任
意のソースからの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適に
はヒトを含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配
列である。

【００２６】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＧＲ−ＳＥＰに結合される際に、ＧＲ−
ＳＥＰの量を増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴ
ニストはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＧＲ−ＳＥＰに結合し、その作用を
調節する任意の他の分子を含む場合がある。

【００２７】 ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」はＧＲ−ＳＥＰをコードする遺
伝子の代替形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異か
ら生じ、変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変
化する場合もしない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレ
ル形を有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常
の突然変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。
これらの種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与
の配列において１回或いは２回以上生じる場合がある。

【００２８】 ここで用いるＧＲ−ＳＥＰをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは
機能的に等価なＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌ
クレオチドの欠失、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＧＲ−ＳＥＰをコード
するポリヌクレオチドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に
検出することができる場合もできない場合もある多形性及びＧＲ−ＳＥＰをコー
ドするポリヌクレオチド配列に対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する
、アレルへの不適当な或いは予想外のハイブリダイゼーションが含まれる。また
コードされたタンパク質は「変化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等
価なＧＲ−ＳＥＰをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合も
ある。故意のアミノ酸置換は、ＧＲ−ＳＥＰの生物活性が保持される限り、残基
の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基
づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及び
グルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同
様の親水値を有する帯電していない極性頭基（polar head group）有するアミノ
酸はロイシン、イソロイシン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン
及びグルタミン、セリン及びスレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含む
。

【００２９】 ここで用いる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド
或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成分子の
ことである。ＧＲ−ＳＥＰのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であり
、ＧＲ−ＳＥＰの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好まし
い。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとし
て表されるが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完
全な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。

【００３０】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般
に当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行され
る（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratgry M anual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

【００３１】 ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＧＲ−ＳＥＰに結合される際にＧＲ−Ｓ
ＥＰの生物学的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニ
ストはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＧＲ−ＳＥＰに結合し、その作用を減
少させる任意の他の分子を含む場合がある。

【００３２】 ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆ
ａ、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖのような完全な分子及びそのフラグメントのことで ある。ＧＲ−ＳＥＰポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小
さなペプチドを含む完全なポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことが
できる。動物を免疫するために用いられるポリペプチド或いはオリゴペプチドは
、ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望により担体タンパ
ク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される通常用いられる担
体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシ
アニンを含む。その後結合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット
或いはウサギ）を免疫する。

【００３３】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すな
わちエピトープ）のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿
主動物を免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或
いは三次元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの
領域或いは構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するため
に、無傷の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と
競合する場合がある。

【００３４】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補
的なヌクレオチド配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、
「センス」鎖に相補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペ
プチド核酸を含み、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができ
る。一度細胞内に導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然
配列と結合し、二重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「
負（マイナス）」はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プ
ラス）」はセンス鎖を示す場合に用いられることがある。

【００３５】 ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは
生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然
、組換え或いは合成ＧＲ−ＳＥＰ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動
物或いは細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力
のことである。

【００３６】 ここで用いる「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度
条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−
Ｔ」の場合、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性
は、核酸のあるものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が
一本鎖分子間に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度
合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。
これは核酸鎖間の結合に及びＰＮＡ分子の設計及び使用に依存する増幅反応にお
いて特に重要である。

【００３７】 ここで用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、所与のポリヌ
クレオチド配列を含む任意の組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態
或いは水溶液状態を含む。ＧＲ−ＳＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）をコードする
ポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメント（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及
びそのフラグメント）を含む組成物はハイブリダイゼーションプローブとして用
いることもできる。そのプローブは凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような
安定化剤と関連することもできる。ハイブリダイゼーションでは、そのプローブ
は塩類（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例え
ばデンハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散される場合もあ
る。

【００３８】 ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するた
めに再配列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer
, Norwalk, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント
構築用コンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GC
G, Madison WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築 されているもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コ
ンセンサス配列を生成している。

【００３９】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析
によるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に類似のリボ核酸の存在の検出がサンプルにおいて
ＧＲ−ＳＥＰをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す
。

【００４０】 ここで用いる「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにお
いて変化し、１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如する
ことである。

【００４１】 ここで用いる用語「誘導体」は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸配列或いはＧ
Ｒ−ＳＥＰ又はコードされたＧＲ−ＳＥＰの相補配列の化学修飾体のことである
。そのような修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換
することである。核酸誘導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持す
るポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポ
リエチレングリコール化（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的
或いは免疫学的機能を保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプ
チドである。

【００４２】 ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同
性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が
標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実
用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列
の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブ
リダイゼーション検定法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブ
リダイゼーション等）を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或
いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的
配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な
結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密性条件は、
２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを
必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（
例えば約３０％同一性より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合
もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配
列にハイブリダイズしないであろう。

【００４３】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、大きさが１０Ｋから１０ＭのＤＮＡ配列を含み
、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含む直鎖
状の小染色体である（Harrington等(1997) Nat Genet.15:345-355）。

【００４４】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合
領域内においてアミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持し
ている抗体分子のことである。

【００４５】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して
相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。

【００４６】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基
との間、並びに相補的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つ
の核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタ
ッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は
、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（
例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固
形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又
は細胞或いはその核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化さ
れる別の核酸配列との間に形成することもできる。

【００４７】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いは
それ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或い
はヌクレオチド配列における変化のことである。

【００４８】 ここで用いる「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィ
ルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持
体上で合成される個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるア
レイのことである。

【００４９】 ここで用いる用語「調節」は、ＧＲ−ＳＥＰの生物学的活性の変更ことである
。例えば調節により、ＧＲ−ＳＥＰのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的
、機能的或いは免疫学的特性が増減するようになる。

【００５０】 ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌ
クレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合がある
ゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアン
チセンス鎖を表す。「フラグメント」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸
配列であり、長さが少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌ
クレオチド、さらに少なくとも１０，０００ヌクレオチドであるフラグメントを
含むことが最も好ましい。

【００５１】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６
０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、
より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハ
イブリダイゼーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、
オリゴヌクレオチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アン
プリマ」、「プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である
。

【００５２】 ここで用いる「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡは、リジンにおいて終端する
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオ
チドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（an
ti-gene agent）ことである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の 寿命を延長し、その中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延
長を停止する（Nielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63）。

【００５３】 ここで用いる用語「部分」は、タンパク質に関して（「所与のタンパク質の一
部」をなすような）そのタンパク質のフラグメントを示す。そのフラグメントは
長さ５アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものにまで及
ぶ場合がある。こうして「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列の少なくとも一
部を含む」タンパク質は、完全長ＧＲ−ＳＥＰ及びそのフラグメントを含む。

【００５４】 ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＧＲ−ＳＥＰをコ
ードする核酸或いはそのフラグメント又はＧＲ−ＳＥＰ自体を含むと予想される
生検サンプルは、溶液中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（
tissue print）等に結合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官
或いは細胞から単離された膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含
む。

【００５５】 ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或
いはペプチドとアゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことであ
る。その相互作用は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すな
わち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトー
プ「Ａ」に対して特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけ
るエピトープＡ（或いは遊離し、標識されないＡ）及びその抗体を含むタンパク
質の存在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。

【００５６】 ここで用いる「厳密性条件」或いは「厳密性」は、核酸、塩類及び温度により
定義されるようなハイブリダイゼーションのための条件である。これらの条件は
当分野において周知であり、その条件を変更して、同一或いは関連するポリヌク
レオチド配列を同定或いは検出することができる。低い或いは高い厳密性のいず
れかを含む多くの等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さ及
び性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中或いは固形
基質上に固定）、塩類或いは他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン
並びに又ポリエチレングリコール）及び反応の温度（プローブの融解温度より約
５℃低い温度から溶融温度より約２０〜２５℃低い温度までの範囲にある）のよ
うな要因に依存する。１つ或いはそれ以上の要因を変更して、上記条件とは異な
るが、等価である低或いは高厳密性のいずれかの条件を発生させることもできる
。

【００５７】 ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単
離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それら
は自然に関連する他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には
９０％含まないものである。

【００５８】 ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸
が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。

【００５９】 ここで定義する「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させ
るプロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或
いは人工的条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核
或いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。そ
の方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイル
ス感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合
がある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含
んでおり、その細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或い
はその宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞
は、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も
含む。

【００６０】 ここで用いるＧＲ−ＳＥＰの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸に
より変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合
があり、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き
換える場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにでは
あるが、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保
存的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿
入、又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことな
くアミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者
に周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR softwareを用いて見出すこと
ができる。

【００６１】 発明 本発明は新規のヒト成長関連ＧＲ−ＳＥＰ相同体（これ以降「ＧＲ−ＳＥＰ」
と呼ぶ）、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド及び神経疾患、生殖障害
、免疫疾患及び腫瘍性疾患の診断、予防及び治療のためのこれらの組成物の使用
法の発見に基づくものである。

【００６２】 本発明のＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対す
るコンピュータ検索を用いて胸腺由来リンパ球ｃＤＮＡライブラリ（ＴＬＹＭＮ
ＯＴ０６）からのインサイト社クローン３００３８２６において最初に同定され
た。コンセンサス配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、重複並びにまた伸長した核酸
配列、インサイト社クローン３００３８２６（ＴＬＹＭＮＯＴ０６）、１４３７
４１０（ＰＡＮＣＮＯＴ０８）及び１８７０９１（ＣＡＲＤＮＯＴ０１）に由来
した。

【００６３】 一実施例では、本発明は、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ及び図１Ｅに示さ
れるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。Ｇ
Ｒ−ＳＥＰは長さが４２４アミノ酸であり、残基Ｎ−３６３において１つの潜在
的なＮグリコシレーション部位、残基Ｓ−２７０において１つの潜在的なプロテ
インキナーゼＡ或いはＧリン酸化部位、残基Ｓ−５７、Ｔ−９１、Ｓ−１０３、
Ｓ−１１９、Ｔ−１６７、Ｔ−１９５、Ｓ−２１８、Ｔ−２８６、Ｓ−３３８、
及びＴ−３６５において１０の潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部、残基
Ｔ−７１、Ｔ−９１、Ｓ−１６０及びＳ−２５７を含む４つの潜在的なプロテイ
ンキナーゼＣリン酸化部位、残基Ｙ−１１４において１つの潜在的なチロシンキ
ナーゼリン酸化部位及び残基Ｓ−１４３において１つのグリコサミノグリカン付
着部位を有し、残基Ｇ−１４１とＳ−１４８との間に潜在的なＡＴＰ／ＧＴＰ−
結合部位モチーフ（Ｐ−ループ）を有し、それぞれＤ−１９８とＧ−２０１（Ｄ
ＴＰＧ）との間及びＫ−２８１とＤ−２８３（ＫＡＤ）との間に２つのＧＴＰ結
合ドメインを有する。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄに示されるように、Ｇ
Ｒ−ＳＥＰは、キイロショウジョウバエピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８２２
９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によ
りコードされる予測タンパク質（ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（ＧＩ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と
化学的及び構造的に相同である。詳細には、ＧＲ−ＳＥＰ、キイロショウジョウ バエ ピーナツタンパク質、カンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコ
ードされる予測タンパク質及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０はそれぞれ３４％、３９
％及び３４％同一性を有し、ＡＴＰ／ＧＴＰ−結合及び加水分解モチーフ（Ｐ−
ループ）と、２つのＧＴＰ結合ドメインと、１つのカゼインキナーゼＩＩリン酸
化部位と、グリコサミノグリカン付着部位とを共有する。さらにＧＲ−ＳＥＰ、 キイロショウジョウバエ ピーナツタンパク質及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０は１つ
のグリコシレーション部位と、１つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位とを共
有する。さらにＧＲ−ＳＥＰ、キイロショウジョウバエピーナツタンパク質及び
カンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコードされる予測タンパク質
は、プロテインキナーゼＡ或いはプロテインキナーゼＧリン酸化部位と、１つの
カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位とを共有する。さらにＧＲ−ＳＥＰ及びキイ ロショウジョウバエ ピーナツタンパク質は１つのチロシンキナーゼリン酸化部位
を共有する。さらにＧＲ−ＳＥＰ及びカンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝
子によりコードされる予測タンパク質は２つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部
位を共有し、それぞれ類似の等電点６．４及び６．７を有する。全ての場合にお
いて、化学修飾の独特の結合部位が、予測されたアミノ酸残基配列内の類似の位
置に存在する。ノーザン分析は種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示し
ており、少なくともその５３％は不死化或いは癌性であり、少なくともその２８
％は免疫反応に関連し、少なくともその２５％は生殖組織に関連し、少なくとも
その１６％は神経組織に関連する。特に注目すべきは、心臓、消化管、脳、乳房
、前立腺及び膵臓組織、さらに造血、免疫及び平滑筋組織におけるＧＲ−ＳＥＰ
の発現である。

【００６４】 また本発明はＧＲ−ＳＥＰ変異体を含む。好適なＧＲ−ＳＥＰ変異体は、ＧＲ
−ＳＥＰアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に少なくとも８０％、より好ま
しくは９０％アミノ酸配列同一性を有し、ＧＲ−ＳＥＰの活性の生物学的、免疫
学的或いは他の機能的特性を保持する変異体である。最も好ましいＧＲ−ＳＥＰ
変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有する変
異体である。

【００６５】 また本発明はＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＧＲ
−ＳＥＰのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＧＲ−ＳＥＰを
発現する組換え分子を生成することができる。ある特定の実施例では、本発明は
図１Ａ、図１B、図１C、図１Ｄ及び図１Ｅに示されるようなＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。

【００６６】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＧＲ−ＳＥＰをコードする多数のヌクレオ
チド配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配
列に最低限の相同性を示すものもあることは当業者には明らかであろう。このよ
うに本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成
されるようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これ
らの組み合わせは、自然発生ＧＲ−ＳＥＰのヌクレオチド配列に適用されるよう
な標準的なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形
例が明確に開示されているものと考慮されたい。

【００６７】 ＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択
された厳密性条件下で、自然発生ＧＲ−ＳＥＰのヌクレオチド配列にハイブリダ
イズできることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＧＲ−ＳＥ
Ｐをコードするヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合
もある。コドンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じ
て、ペプチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加
してもよい。コードされたアミノ酸配列を変更することなくＧＲ−ＳＥＰをコー
ドするヌクレオチド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長
い半減期のような、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有す
るＲＮＡ転写物を生成することを含む。

【００６８】 また本発明は、合成化学的に完全に、ＧＲ−ＳＥＰ及びその誘導体をコードす
るＤＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出
願の出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの
入手可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に
、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導
入することもできる。

【００６９】 また本発明にはWahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol. Vol. 152:39
9-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol 152: 507-511)に教示され
るような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレオチド配列、詳細にはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチド配列が含まれる。

【００７０】 当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或 いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。

【００７１】 ＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、か
つプロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野にお
いて既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場
合がある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置
に隣接する未知の配列を回収する（Sarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:31
8-322）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプライマ及び既知の 領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増幅された配列は、
同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用い
て第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリ
メラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。

【００７２】 また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅
或いは伸長することもできる（Triglia T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186 ）。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
nc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用
いて、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さ
らに約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。その方
法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域に適当なフラグメントを
生成する。その際そのフラグメントは、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣ
Ｒテンプレートとして用いられる。

【００７３】 用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配
列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lage
rstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-119）である。この方法では、多
数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二
本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置することができる。

【００７４】 未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD 等
(1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060)による方法である。さらにある方法 はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを用いて、ゲノムＤ
ＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスにより
ライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソン接合部
を見つける際に有用である。

【００７５】 完全長ｃＤＮＡのためのスクリーニングの際に、より長いｃＤＮＡを含むよう
に大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初回
抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むより
大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブ
ラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で
は特に好ましい。ゲノムライブラリは５´及び３´非転写制御領域に配列を伸長
するために有用な場合がある。

【００７６】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM 、Perkin Elmer）を用いて電
気信号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示ま
での全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプ
ルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好まし
い。

【００７７】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド配列或
いはそのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＧＲ−ＳＥＰ、そのフラグメ
ント或いはその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いら
れる場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に
等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いて
ＧＲ−ＳＥＰをクローニングし、発現することもできる。

【００７８】 非自然発生コドンを有するＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド配列を生成
することが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原
核或いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合を
増加したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような
所望の特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。

【００７９】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＧＲ−
ＳＥＰをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて
遺伝子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチド
のランダムな断片化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチド
配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、
新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の変
更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともできる
。

【００８０】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードする自然、修飾或いは組換え
ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合される
こともできる。例えば、ＧＲ−ＳＥＰ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリ
をスクリーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＧＲ
−ＳＥＰタンパク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質
は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断
部位を含むように遺伝子操作されることもでき、それによりＧＲ−ＳＥＰは切断
され、概ね異種部分から離れて精製されるようになる。

【００８１】 別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＧＲ−ＳＥＰをコード
する配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（Caruthers MH 等
(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Symp
Ser 225-232参照）。別法では、タンパク質自体が、ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配 列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例え
ばペプチド合成は種々の固相技術（Roberge JY 等(1995) Science 269:202-204 ）を用いて実行することができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthes
izer (Perkin Elmer)を用いることにより実現することができる。

【００８２】 新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的
に精製されることができる（例えばCreighton (1983) Proteins, Structures an d Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。合成ペプチドの
組成物は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる（例えばEdma
n degradation procedure; Creighton、上記）。さらにＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸
配列或いはその任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタン
パク質或いはその任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変
異体ポリペプチドを生成することもできる。

【００８３】 生物学的に有効なＧＲ−ＳＥＰを発現するために、ＧＲ−ＳＥＰをコードする
ヌクレオチド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入
されたコード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に
挿入されてもよい。

【００８４】 当業者に周知の方法を用いて、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列及び適当な転写
或いは翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの
方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎ ｖｉｖｏゲ
ノム組換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY及びAusubel FM
等 (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
York NYに記載されている。

【００８５】 種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列を含有
し、発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファー
ジ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、
酵母発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞
系（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞
系（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス
ＴＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔ
ｉ或いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発
明は用いられる宿主細胞により制限されない。

【００８６】 「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン
ハンサ、プロモータ並びに５´及び３´非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及
び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成
的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用
いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc
ript ファージミド(Stratagene, LaJolla CA) のハイブリッドｌａｃＺプロモー
タ或いはpSport 1 プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用いることが
できる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に
用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば
熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに
由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリー
ダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺
乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＧＲ−
ＳＥＰをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合
には、ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いるこ
とができる。

【００８７】 バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＧＲ−ＳＥＰのための使用に応
じて選択されてもよい。例えば大量のＧＲ−ＳＥＰが抗体を誘導するために必要
とされるとき、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタ
を用いることができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＧＲ−
ＳＥＰをコードする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼ
の７残基に対する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタ
ンパク質が生成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript(Strat
agene)のような発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster (1989
) J Biol Chem 264:5503-5509）等を含む。またｐＧＥＸベクタ（Promega, Madi
son WI）を用いて、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融
合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそ
れに後続する遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精
製することができる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロ
ンビン或いは第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象のク
ローニングされたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。

【００８８】 酵母、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いる
ことができる。再確認する場合には、Ausubel 等 (上記)及びGrant等(1987) Met
hods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。

【００８９】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列の発現
は、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５
Ｓ及び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶ
からのω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J
6:307-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモ
ータ或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Br
oglie 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991)
Results Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体 は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入され
ることができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例
えば、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technol ogy (1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。

【００９０】 また昆虫系もＧＲ−ＳＥＰを発現するために用いることができる。例えばある
系では、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタと
して用いて、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイクラサキンウワ バ幼虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＧＲ−ＳＥＰ をコードする配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非
必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＧＲ
−ＳＥＰをコードする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は
非活性になり、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。その
後組換えウイルスを用いて、ＧＲ−ＳＥＰが発現される、例えばヨトウガ細胞或
いはイクラサキンウワバ幼虫を感染させる（Engelhard EK 等 (1994), Proc Nat
Acad Sci 91:3224-3227）。

【００９１】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＧＲ−ＳＥＰをコード
する配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写
／翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３
領域内の挿入により、感染した宿主細胞においてＧＲ−ＳＥＰを発現することが
できる生ウイルスを得ることができる（Logan and Shenk (1984) Proc Natl Aca
d Sci 81:3655-59）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような
転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させることができる
。

【００９２】 またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、６−１０ＭのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオ
ンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。

【００９３】 また特異な開始シグナルを用いて、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列のより効率
的な転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配
列を含む。ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当
な発現ベクタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不
要である。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合に
は、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。
さらに開始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置か
れなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方
の種々の起源からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、
使用される特定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場
合がある（Scharf D 等 (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-162）。

【００９４】 さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の
ように発現したタンパク質を処理できるように選択することができる。そのよう
なポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプ
ロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並
びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために特異な細胞機構及び
特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ
２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection（ATTC; Bethesda,
MD）から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確
実にするように選択することができる。

【００９５】 長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま
しい。例えば、ＧＲ−ＳＥＰを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現
エレメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺
伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタの導入に続い
て、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるよう
にする。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在
により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる
。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養
技術を用いて増殖させることができる。

【００９６】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ^-細胞或いはａｐｒｔ^-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎ ｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれ クロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移 酵素への耐性を与える（Murry、上記）。さらに選択可能遺伝子が記載されてお り、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan (1988) Pr
oc Natl Acad Sci 85:8047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニ ダーゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのよ
うなマーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定する
のみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の
量を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995) Methods Mol Biol 5
5:121-131）。

【００９７】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列
がマーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列を
含む組換え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別
法では、マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＧＲ−ＳＥＰをコードす
る配列と直列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、
同様に直列型遺伝子の発現を示す。

【００９８】 別法では、ＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸配列を含み、ＧＲ−ＳＥＰを発現す
る宿主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。こ
の手順は、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のた
めの膜、溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術
を含む。

【００９９】 ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＧＲ−ＳＥＰをコ
ードするポリヌクレオチドのプローブ或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮ
Ａ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されるこ
とができる。核酸増幅系アッセイは、ＧＲ−ＳＥＰをコードするＤＮＡ或いはＲ
ＮＡを含む形質転換体を検出するために、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列に基づ
くオリゴヌクレオチド或いはオリゴマを使用することを伴う。

【０１００】 ＧＲ−ＳＥＰの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタン
パク質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれか
を用いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などで
ある。ＧＲ−ＳＥＰにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナ
ル抗体を用いる２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based i
mmunoassay）が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここ
で記載した検定法及び他の検定法は、Hampton R 等(1990, Serological Methods , a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN)及びMaddox DE 等 (1983, J
Exp'Med 158:1211-1216)に記載される。

【０１０１】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチ
ドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲ
プローブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、
末端標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、Ｇ
Ｒ−ＳＥＰをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成
のためにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野
において知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮ
Ａポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒ ｏ でＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々
の市販のキット（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及 びUS Biochemical Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分
子或いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤
或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。

【０１０２】 ＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細
胞培養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されること
ができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びに
またベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＧＲ−ＳＥＰをコ
ードするポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を
介してＧＲ−ＳＥＰの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができ
ることは当業者には理解されよう。他の組換え構造を用いて、可溶性タンパク質
の精製を容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＧＲ−Ｓ
ＥＰをコードする配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域
は、限定はしないが、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプ
トファンモジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上
で精製できるようにするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製
系（Immunex Corp., Seatile, WA）において用いられるドメインを含む。精製ド
メインとＧＲ−ＳＥＰとの間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen
, San Diego, CA）に対して特異な配列のような分割可能リンカー配列を含有す ることにより、精製が容易になる場合もある。１つのそのような発現ベクタが、
ＧＲ−ＳＥＰ及びチオレドキシン或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６
ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒス
チジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Porath, J. 等 (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-2
81)に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトクグラフィ）において 精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのＧＲ−
ＳＥＰを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクタの議論は
Kroll,D.J.等(1993;DNA Cell Biol. 12:441-453)に与えられる。

【０１０３】 組換え生成物に加えて、ＧＲ−ＳＥＰのフラグメントは、固相技術（Merrifie
ld J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生
成される場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実
行されることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesize
r (Perkin Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることによ
り自動合成を実現してもよい。ＧＲ−ＳＥＰの種々のフラグメントは化学的に個
別に合成されるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成する
ことができる。

【０１０４】 治療 ＧＲ−ＳＥＰと、キイロショウジョウバエピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８
２２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子
によりコードされる予測タンパク質（ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
４）及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（ＧＩ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
）との間には化学的及び構造的相同性がある。さらに、ＧＲ−ＳＥＰは腫瘍及び
増殖性組織、心臓、消化管、脳、乳房、前立腺、膵臓組織、さらに造血、免疫及
び平滑筋組織において発現される。それゆえＧＲ−ＳＥＰは神経疾患、生殖障害
、免疫疾患及び腫瘍性疾患においてある役割を果たすものと考えられる。

【０１０５】 それゆえ一実施例では、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストを被検者に投与して神
経疾患を予防或いは治療することができる。そのような疾患は、限定はしないが
、静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊
張病、脳性腫瘍、痴呆、うつ病、ダウン症、遅発性ジスキネジア、ジストニア、
てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経繊維腫症、パーキンソン病
、妄想性精神症、精神分裂病及びトゥーレット病並びにアンギナ、アナフィラキ
シー性ショック、不整脈、喘息、心血管性ショック、クッシング症候群、高血圧
、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛及びクロム親和性細胞腫を含む。一態様では、Ｇ
Ｒ−ＳＥＰを特異に結合する抗体が、アンタゴニストとして直接或いは標的又は
送達機構として間接的に、ＧＲ−ＳＥＰを発現する細胞又は組織に医薬品因子を
運ぶために用いることができる。

【０１０６】 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記疾患を含む神経疾患を
治療或いは予防することができる。

【０１０７】 一実施例では、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストを被検者に投与して、生殖障害
を予防或いは治療することができる。そのような障害は、限定はしないが、プロ
ラクチン生成の障害と、卵管障害、排卵欠陥及び子宮内膜症を含む不妊症と、発
情周期の破壊、月経周期の破壊、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺激症候群、子
宮外妊娠及び奇形発生と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症及び乳汁漏出症と、精子形成
の破壊、異常精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、前立腺肥大症及び前立腺炎と、
男性乳房及び女性乳房の癌とを含む。一態様では、ＧＲ−ＳＥＰを特異に結合す
る抗体が、アンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構として間接的に、
ＧＲ−ＳＥＰを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いることがで
きる。

【０１０８】 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記疾患を含む生殖障害を
治療或いは予防することができる。

【０１０９】 一実施例では、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストを被検者に投与して、免疫疾患
を予防或いは治療することができる。そのような疾患は、限定はしないが、ＡＩ
ＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテロー
ム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮
膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、腎炎、グレーブス病、過好酸球
増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心
筋または心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関
節炎、強皮症、シェーグレン症候群、及び自己免疫性甲状腺炎；癌、血液透析、
体外循環の合併症；ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染
、及び蠕虫感染；及び外傷が含まれる。一態様では、ＧＲ−ＳＥＰを特異に結合
する抗体が、アンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構として間接的に
、ＧＲ−ＳＥＰを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いることが
できる。

【０１１０】 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記疾患を含む免疫疾患を
治療或いは予防することができる。

【０１１１】 一実施例では、ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストを被検者に投与して、腫瘍性疾
患を予防或いは治療することができる。そのような疾患は、限定はしないが、腺
癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎
、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝
臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精
巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。一態様では、ＧＲ−ＳＥＰを特異
に結合する抗体が、アンタゴニストとして直接或いは標的又は送達機構として間
接的に、ＧＲ−ＳＥＰを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いる
ことができる。

【０１１２】 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発
現するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記疾患を含む腫瘍性疾患
を治療或いは予防することができる。

【０１１３】 他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。

【０１１４】 ＧＲ−ＳＥＰのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成され
ることができる。詳細には、精製されたＧＲ−ＳＥＰを用いて抗体を生成するか
、或いは医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＧＲ−ＳＥＰと特異に結
合するものを同定することができる。

【０１１５】 ＧＲ−ＳＥＰに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができ
る。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キ
メラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成される
フラグメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特
に治療上の使用に適している。

【０１１６】 抗体を産生する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＧＲ−ＳＥＰ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリ
ゴペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々
のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュ
バントは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのよ
うなミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、
ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール
のような表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ
（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい
。

【０１１７】 ＧＲ−ＳＥＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプ
チド、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有
し、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。そ
れらは自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子
からなる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＧＲ−ＳＥＰアミノ酸の短
い伸展部はキーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して生成され
る抗体のような別のタンパク質の伸展部と融合されることもできる。

【０１１８】 ＧＲ−ＳＥＰに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体
分子の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技
術は、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及
びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、
Kozbor 等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad
Sci 80:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。

【０１１９】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術が、Ｇ
Ｒ−ＳＥＰ特異性一本鎖抗体を生成するように、当分野で知られた方法を用いて
適合されてもよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物か
らなる抗体が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合に
より生成されることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120
-3）。

【０１２０】 また抗体は、リンパ球集団においてｉｎ ｖｉｖｏで生成を誘発することによ
り、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc
Natl Acad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:29
3-299)に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングする
ことにより生成することもできる。

【０１２１】 またＧＲ−ＳＥＰに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させ
ることもできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分
子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及び
Ｆ（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成する
ことができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構
成して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしか
も容易に同定できるようにする（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281） 。

【０１２２】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＧＲ−ＳＥＰとその特異的抗体との間の複合形成体
を測定することを含む。２つの非干渉性ＧＲ−ＳＥＰエピトープに反応するモノ
クローナル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが
、結合タンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。

【０１２３】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド或いは
その任意のフラグメント、又は相補配列が治療のために用いられる場合がある。
一態様では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、
ｍＲＮＡの転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、
細胞は、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換
されることができる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＧＲ−
ＳＥＰ活性を調節するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そ
のような技術は当分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレ
オチド又はより大きなフラグメントを、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列のコード
化或いは調節領域に沿った種々の位置から設計することができる。

【０１２４】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＧＲ−ＳＥＰをコードする遺伝子のポリヌク
レオチドに相補的な核酸配列を発現する組換えベクタを構成することができる。
これらの技術は、Sambrook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)の両方に記載される
。

【０１２５】 ＧＲ−ＳＥＰをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＧＲ−ＳＥＰをコー
ドする高レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベク
タと形質転換することにより遮断されるようになる。そのような構成体は、翻訳
できないセンス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。
ＤＮＡ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレア
ーゼにより無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性
の発現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製
エレメントがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。

【０１２６】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする遺伝子の制御、
５´或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）
に対する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設
計することにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位
置−１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に三重
らせん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑
制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよ
うになるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進
歩は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immun ologic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY)に記載されている。 また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防
ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる。

【０１２７】 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列のヌクレオチ
ド鎖切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作された
ハンマヘッドモチーフリボザイムを含む。

【０１２８】 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補標
的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価する
ことができる。

【０１２９】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＧＲ−ＳＥＰをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成することができる。そのようなＤ
ＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを
用いて種々のベクタ内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ構
成体は、相補ＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導
的に導入することができる。

【０１３０】 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別さ
れないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された
形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に拡
張することができる。

【０１３１】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、ｉ ｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに同様に適し
ている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞
内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンのように繁殖す
ることができる。形質移入、リポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマに
よる送達（Goldman, C.K. 等(1997）Nature Biotechnology 15:462-66、参照し て本明細書の一部としている)は、当分野で周知の方法を用いて実現することが できる。

【０１３２】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検者に適用
されることができる。

【０１３３】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＧＲ−ＳＥＰ、ＧＲ−ＳＥＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタ
ゴニスト或いはＧＲ−ＳＥＰのインヒビタからなることができる。組成物は単独
で、或いは限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む
任意の滅菌の生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合
物のような少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる
。これらの組成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせ
て患者に投与してもよい。

【０１３４】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与することができる。

【０１３５】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。

【０１３６】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。

【０１３７】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。

【０１３８】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。

【０１３９】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。

【０１４０】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。

【０１４１】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。

【０１４２】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、閉込め処理（entrappi
ng）或いは凍結乾燥処理による方法で製造される。

【０１４３】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク
ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。

【０１４４】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＧＲ−ＳＥＰの投与の場合、そのような
ラベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。

【０１４５】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。

【０１４６】 任意の化合物の場合に、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養ア
ッセイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにお
いて最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経
路が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び
経路を確定することができる。

【０１４７】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＧＲ−ＳＥＰ或いは
そのフラグメント、ＧＲ−ＳＥＰの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いは
ＧＲ−ＳＥＰのインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対す
る有効度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例
えばＥＤ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の
５０％が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与
量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな
治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得
られるデータは、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そ
のような化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含
む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患
者の感度及び投与経路によりこの範囲内で変化する。

【０１４８】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。

【０１４９】 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。

【０１５０】 診断 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰを特異に結合する抗体を、ＧＲ−ＳＥＰの発現
により特徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＧＲ−ＳＥＰ、アゴ
ニスト、アンタゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするた
めの検定法において用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場
合に上記した方法と同様の方法で調製することができる。ＧＲ−ＳＥＰに対する
診断検定法は、抗体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物に
おいてＧＲ−ＳＥＰを検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても
用いることができ、リポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合す
ることにより標識されることができる。当分野において知られる種々のリポータ
分子を用いることができ、そのいくつかが上記される。

【０１５１】 ＧＲ−ＳＥＰを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々の
プロトコルが当分野において知られており、ＧＲ−ＳＥＰ発現の変更されたレベ
ル或いは異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＧＲ−ＳＥＰ発現のた
めの正常或いは標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り
出された体液或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＧＲ−ＳＥＰに対
する抗体と結合することにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法
により定量することができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において
発現したＧＲ−ＳＥＰの量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と
比較される。標準値と被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータ
を確立する。

【０１５２】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドを診断
のために用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチ
ドを用いて、ＧＲ−ＳＥＰの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺
伝子発現を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＧＲ−ＳＥＰ
の存否及び過剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＧＲ−ＳＥＰレ
ベルの調節をモニタすることができる。

【０１５３】 一態様では、ＧＲ−ＳＥＰ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列
を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハ
イブリダイゼーションにより、ＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸配列を同定するこ
とができる。非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレ
オチド、或いは特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからな
るプローブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大
、高、中間或いは低）が、そのプローブがＧＲ−ＳＥＰをコードする自然発生配
列、アレルのみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであ
ろう。

【０１５４】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＧＲ−ＳＥＰをコー
ドする配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好
ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサ
エレメント及び自然発生ＧＲ−ＳＥＰのイントロンを含むゲノム配列に由来する
。

【０１５５】 ＧＲ−ＳＥＰをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプロ
ーブを生成するための手段は、ＧＲ−ＳＥＰ或いはＧＲ−ＳＥＰ誘導体をコード
する核酸配列を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過
程を含む。そのようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮ
Ａポリメラーゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔ ｒｏ でＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼー
ションプローブは、種々のリポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射
性核種、又はアビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカ
リ性フォスファターゼのような酵素標識により標識されることができる。

【０１５６】 ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチド配列はＧＲ−ＳＥＰの発現に関連
する状態或いは疾患の診断のために用いることができる。そのような状態或いは
疾患の例は、限定はしないが、静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性
側索硬化症、双極性障害、緊張病、脳性腫瘍、痴呆、うつ病、ダウン症、遅発性
ジスキネジア、ジストニア、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神
経繊維腫症、パーキンソン病、妄想性精神症、精神分裂病及びトゥーレット病並
びにアンギナ、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心血管性ショック
、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛及びクロム親和性細
胞腫と、プロラクチン生成の障害と、卵管障害、排卵欠陥及び子宮内膜症を含む
不妊症と、発情周期の破壊、月経周期の破壊、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過剰刺
激症候群、子宮外妊娠及び奇形発生と、乳癌、線維嚢胞性乳腺症及び乳汁漏出症
と、精子形成の破壊、異常精子生理、精巣の癌、前立腺の癌、前立腺肥大症及び
前立腺炎と、男性乳房及び女性乳房の癌と、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮
迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆
嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気
腫、萎縮性胃炎、腎炎、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリ
テマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関
節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症
候群、及び自己免疫性甲状腺炎；癌、血液透析、体外循環の合併症；ウイルス感
染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷と、
腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリ
ヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は他
の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＧＲ−ＳＥＰ発
現を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティッ
ク、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができ
る。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。

【０１５７】 特定の態様では、ＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、
特に上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である
。ＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され
、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは
組織サンプルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サ
ンプルは洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された
或いは抽出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量か
ら著しく変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレ
オチド配列とハイブリダイズされており、サンプル内のＧＲ−ＳＥＰをコードす
るヌクレオチド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またその
ような検定法を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタす
る際に特定の治療措置の有効度を評価することができる。

【０１５８】 ＧＲ−ＳＥＰの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対
する正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な
被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に
適した条件下でＧＲ−ＳＥＰをコードする配列或いはそのフラグメントと結合す
ることにより与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者か
ら得られた値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる
実験から得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプル
から得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比
較される。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する
。

【０１５９】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。

【０１６０】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。

【０１６１】 ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさ
らなる診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは
化学的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成
されてもよい。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方
向（５´−＞３´）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３´＜−５´）を有
するヌクレオチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化
された条件下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の
組のオリゴマ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ
或いはＲＮＡ配列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いるこ
とができる。

【０１６２】 またＧＲ−ＳＥＰの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレ
オチドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結
果が書き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Method
s, 159:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サン プルを定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより
加速することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、ス
ペクトル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化をもたらすようになる。

【０１６３】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイの標的として用いることもでき
る。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転
写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突然変異及び多形性を同定するこ
とができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、疾患の遺伝的基礎を理解し、か
つ疾患を診断する際に有用であり、また治療薬剤の活性を発生及びモニタする際
に有用であろう（Heller.R.等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。

【０１６４】 一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願
ＷＯ９５／１１９９５（Chee等）、Lockhart, D.J.等（1996; Nat. Biotech. 14
:1675-1680）及びSchena, M等（1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619
）に記載される方法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。

【０１６５】 マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され
るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ
がからなることが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは長さが約６−６０ヌクレ
オチドであることが好ましく、１５−３０ヌクレオチドであることがより好まし
く、約２０−２５ヌクレオチドであることが最も好ましい。ある種のマイクロア
レイの場合、長さが７−１０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを用いる
ことが好ましいこともある。マイクロアレイは、既知の５´或いは３´配列に及
ぶオリゴヌクレオチド、完全長配列に及ぶ連続的なオリゴヌクレオチド、或いは
その配列の長さに沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを
含む場合がある。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは対象の遺伝子
に特異なオリゴヌクレオチドであり、その中では少なくともその配列のフラグメ
ントが既知であるか、或いは特定の細胞タイプ、発生的或いは疾患状態に共通の
１つ或いはそれ以上の未同定のｃＤＮＡに特異である。

【０１６６】 あるマイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成するた
めに、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５´或いはより好ましくは３´末端
で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズムは
、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内にＧＣ含
有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉することがある予測される副構造体
のない所定の長さのオリゴマを同定する。ある状況では、マイクロアレイにおい
てオリゴヌクレオチドの対を用いることが適切である。その「対」は、好ましく
は中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて同一であろう。その対の第２の（
１つだけ一致しない）ヌクレオチドは、制御体として機能する。オリゴヌクレオ
チド対の数は２−１００万の範囲にある。そのオリゴマは、光配向化学処理（li
ght-directed chemical process）を用いて支持体上の指定された領域で合成さ れる。支持体は紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ、スライド
ガラス或いは任意の他の適切な固定支持体である。

【０１６７】 別の態様では、オリゴヌクレオチドは、参照してその全体を本明細書の一部と
しているＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載される
ような、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体
の表面上で合成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット）
ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外 線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡ
フラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することができる。アレ
イは手動で或いは市販の開発された（スロットブロット或いはドットブロット装
置）機器及び装置（ロボット式機器を含む）を用いて生成され、８ドット、２４
ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドット、又
は市販の機器を有効に使用するのに適した任意の他の数量のグリッドを含む。

【０１６８】 マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生物学的サンプルから
のＲＮＡ或いはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブに加工される。ｍＲＮ
Ａが単離され、ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を形成するためのテ
ンプレートとして作製及び使用される。ａＲＮＡは、蛍光性ヌクレオチドの存在
下で増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイでインキュベートされ、プ
ローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする
ようにする。インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相
補的一致或いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される。ハイブリダ
イズされなかったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光のレベル及びパ
ターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイクロアレイ上の
各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確定する。生検
サンプルは任意の体液（例えば血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、培養された細
胞、バイオプシ或いは他の組織標本から得ることができる。同時に、個々の配列
の全てに対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否或いは量を測
定することができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異、変異配列或
いは多形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができる。

【０１６９】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰをコードする核酸配列を用いて、自然
発生ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を生成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に
、又はPrice CM (1993; Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ (1991; Trends Gene
t 7:149-154)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人
工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単
一染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造に遺伝子座が決定されるよ
うになる。

【０１７０】 蛍光ｉｎ ｓｉｔuハイブリダイゼーション（Verma 等(1988) Human Chromoso mes : A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NYに記載され
るＦＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相
関をなす。遺伝子マップデータの例は種々の科学雑誌或いはOnline Mendelian I
nheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上 のＧＲ−ＳＥＰをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対す
る素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定める
ことを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と保菌者、すな
わち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる。

【０１７１】 染色体標本のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マ
ーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張す
るために用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝
子の配置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカ
を明らかにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体
腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは
他の遺伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える
。一度疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２
３まで(Gatti等(1998) Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局
在されていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のた
めの関連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列
を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等に
より染色体位置内の差を検出することができる。

【０１７２】 本発明の別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰ、その触媒作用或いは免疫原性フラグ
メント又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のも
のにおいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのような
スクリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支
持体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよ
い。ＧＲ−ＳＥＰと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合
もある。

【０１７３】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０
３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する
化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＧＲ−ＳＥ
Ｐに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或い
はある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物はＧＲ−ＳＥＰ
或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＧＲ−ＳＥＰ
が当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＧＲ−ＳＥＰは、上記
の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーティング
されることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、そ
れを固体支持体上に固定化することもできる。

【０１７４】 別の実施例では、ＧＲ−ＳＥＰを特異に結合することができる中和性抗体がＧ
Ｒ−ＳＥＰを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングア
ッセイを使用する。この方法では、抗体を用いて、ＧＲ−ＳＥＰと１つ或いはそ
れ以上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる
。

【０１７５】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＧＲ−ＳＥＰをコードするヌクレオチド
配列を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。

【０１７６】 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。

【０１７７】

【実施例】 １ ＴＬＹＭＮＯＴ０６ｃＤＮＡライブラリ作製 ＴＬＹＭＮＯＴ０６ｃＤＮＡライブラリは、抗ＩＬ−１２抗体及びＢ７形質移
入ＣＯＳ細胞の存在下でＩＬ−４で臍帯ＣＤ４⁺Ｔから分化し、抗ＣＤ−３及び 抗ＣＤ−２８抗体で６時間活性化されたＴｈ２細胞（試料＃Ｔ２−３）から作製
された。HISTOPAQUETM (Sigma,St. Louis, MO)の２倍の勾配に渡って勾配濃度遠
心分離を用いて、一単位のバッフィコートから全白血球細胞が単離された。顆粒
球系の細胞が、末梢血単核細胞で貯蔵された。Ｔｈ２細胞（５０−１００ｍｇ）
が０．４ｍｌＧＴＣ均質化バッファ（４．０Ｍグアニジニウムイソシアネート、
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、メルカプトエタノール）に１〜２分間ホ
モジナイズされた。２倍量の結合バッファ（0.4 M LiCI, 0.1 M Tris-HCl pH 7.
5,0.02 M EDTA）が加えられ、その結果生成された混合物がボルテックスされた 。４５〜９０秒間毎分１３，０００回転で遠心分離した後、上澄みが除去され、
ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）₂₅(product # MBOLG; CPG Inc., Lincoln Park, N J)結合MP
Gストレプトアビジン粒子(product # MSTR0502; CPG Inc.)と結合された。周囲 温度で２５〜３０分間で３６０°回転させた後、上澄みを粒子から除去するため
の各過程において磁気分離を用いて、ｍＲＮＡｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）₂₅ストレプト
アビジン粒子が上澄みから分離され、ハイブリダイゼーションバッファＩ（0.15
M NaCI, 0.01 M Tris-HCl,pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1% laurel sarcosinate）で ２回洗浄され、ハイブリダイゼーションバッファＩＩ（0.15 M NaCI, 0.01 M Tr
is-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA）で２回洗浄された。結合したｍＲＮＡは、遊離溶 液（5 mM Tris-HCl, pH 7.5）でＭＰＧストレプトアビジン粒子から溶出され、 ２分間６５℃に加熱された。溶出したｍＲＮＡを含む上澄みはＭＰＧストレプト
アビジン粒子から磁気的に分離され、ｃＤＮＡライブラリを作製するために用い
られた。

【０１７８】 そのｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System(Cat. #18248-013, Gibco/BRL)
の推奨プロトコルに従って処理された。ｃＤＮＡ合成はNotl-oligo d(T) primer
で開始された。二本鎖ｃＤＮＡは平滑末端化され、ＥｃｏＲＩアダプタに結合さ
れ、ＮｏｔＩで消化され、ｃＤＮＡはSepharose CL4B column (Cat. #275105-01
, Pharmacia)上で分画され、４００ｂｐより大きいｃＤＮＡがｐＩＮＣＹ１ベク
タ（Incyte）のＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位に結合された。その後プラスミドｐ
ＩＮＣＹ１はDH5α^TM competent cells (Cat. #18258-012, Gibco /BRL)に形質 転換された。

【０１７９】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞が遊離され、REAL Prep 96 Plasmid Kit (Catalog #2
6173, QIAGEN)を用いて精製された。その推奨プロトコルを用いたが、以下の点 を変更した。１）細菌は、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセ
ロールを有する１ｍｌの滅菌のTerrific Broth（Catalog #22711, Gibco/BRL） において培養された。２）接種後、その培養株は１９時間インキュベートされ、
その細胞は０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解された。３）イソプロパノール沈殿後
、プラスミドＤＮＡペレットが０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁された。プロトコル
の最後のステップを終了した後、サンプルは４℃で保管するために９６穴ブロッ
クに移された。

【０１８０】 ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers (PTC200; MJ Research, Watertown, M
A)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems或いはPerkin Elmer 37
3 DNA Sequencing SystemとともにPerkin Elmer Catalyst 800或いはHamilton M
icro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV)を用いて、Sanger等(1975, J. Mol. Biol.
94:441 f)の方法に従って配列決定され、読み枠が確定された。

【０１８１】 ３ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列は、GenBank、Swi
ssProt, BLOCKS及びPima IIのようなデータベースへの問合せ配列として用いら れた。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、Ｂ
ＬＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域の検索が行われた。ＢＬＡＳＴはBasi
c Local Alignment Search Tool（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300,
Altschul等(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410）を表している。

【０１８２】 ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作製し、
配列類似性を確定する。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは
厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植
物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。ここで他のアルゴリズ
ム、例えば参照して本明細書の一部としているSmith T.等(1992, Protein Engin
eering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムを、主要配列パターン及び副次的な 構造間隙の問題を取り扱う際に用いることができる。本特許出願において開示さ
れるように、配列は少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１
２％未満である（この場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。

【０１８３】 ＢＬＡＳＴアプローチはKarlin.S.及びS.F.Atschul (1993; Proc.Nat. Acad.S
ci. 90:5873-7)に詳述され、参照して本明細書において用いており、問合せ配列
とデータベース配列との間の一致を検索し、見い出されたあらゆる一致の統計的
有意性を評価し、ユーザにより選択された有意な閾値を満足する一致のみを報告
する。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０^-25、ペプチドの場合１ ０^-14に設定された。

【０１８４】 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び哺
乳動物（ｍａｍ）配列の場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して検索され、
その後同じクローンから推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質デ ータベース、哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ）及び真核生物（ｅｕ
ｋｐ）に対して相同性を検索された。

【０１８５】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、前掲）。

【０１８６】 ＢＬＡＳＴ(Altschul, S.F. (1993) J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul, S.F.
等(1990) J.MoI.Evol. 215:403-410)を用いる類似のコンピュータ技術を用いて 、GenBank或いはLIFESEQ^TM database （インサイト社）のようなヌクレオチドデ
ータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイ
ブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変
更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類さ
れるかを確定することができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は
通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、
それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１８７】 ノーザン分析の結果は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする転写物が発生するライブラ
リのリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、
特定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在
量をｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０１８８】 ５ ＧＲ−ＳＥＰをコードするポリヌクレオチドの伸長 インサイト社クローン３００３８２６の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド
配列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つ
のプライマを合成してアンチセンス方向の伸長を開始し、他のプライマを合成し
てセンス方向の配列を伸長した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で
未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列
の伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (National Biosciences)或 いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２−３０
のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度
で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライ
マ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。

【０１８９】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。 ２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。

【０１９０】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完 全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ １５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） のパラメータで実行された。

【０１９１】 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A Quick^TM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクロー ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。

【０１９２】 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（Sambrook J 等、前掲）。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅ．ｃ ｏｌｉ 混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani (LB)-agar (Sambrook J 等
、上記)上に蒔かれた。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選 び取られ、適当な市販の無菌９６穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれ
た１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μ
ｌの一晩おいた培養株が有菌の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希釈さ
れた後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイに移された。

【０１９３】 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） の条件で実行された。

【０１９４】 ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。

【０１９５】 同様にして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、
５´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用い
て５´調節配列を得る。

【０１９６】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２
０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きな
ヌクレオチドフラグメントにも概ね同じ手順が用いられる。オリゴヌクレオチド
は、OLIGO 4.06 (National Biosciences)のような最新のソフトウエアを用いて 設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０μＣｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン三 リン酸 (Amersham)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)
とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Se
phadex G-25 super fine resin column (Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に 精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれの毎分１０⁷ カウント含む部分標本は、エンドヌクレアーゼ(Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst I,
Xba 1.或いは Pvu II、DuPont NEN)の１つで消化されるヒトゲノムＤＮＡの典 型的な膜系ハイブリダイゼーション分析において用いられる。

【０１９７】 各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに上で分画され、ナイロン
膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写される。ハイブリダ
イゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異的シグナルを除去するため
に、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XO
MAT AR^TM film (Kodak, Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molec
ular Dynamics, Synnyvale CA)内でブロットに露出された後、ハイブリダイゼー
ションパターンが視覚的に比較される。

【０１９８】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを生成するために、上記ヌクレオチド
配列が、そのヌクレオチド配列の３´末端で開始するコンピュータアルゴリズム
を用いて検査される。そのアルゴリズムは、その遺伝子に固有で、ハイブリダイ
ゼーションに適した範囲内のＧＣ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉
すると考えられる予測された副構造体がない所定の長さのオリゴマを同定する。
そのアルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチドからなる２０の特異な配列のオリ
ゴヌクレオチド（２０量体）を同定する。各配列の中央の１つのヌクレオチドが
変化している、一致したオリゴヌクレオチドの組みが形成される。このプロセス
はマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰り返され、２０個の２０量体からなる
二重の組みが、光照射化学処理（Chee, M.等、PCT/WO95/11995、参照して本明細
書の一部としている）を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。

【０１９９】 別法では、化学的結合手順及びインクジェット吐出装置を用いることにより支
持体の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler等、PCT出願WO95/25116、 参照してその全体を本明細書の一部としている）。別の方法では、ドット（或い
はスロット）ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空 系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表
面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することが
できる。アレイは手動で或いは市販の機器及び装置を用いて生成され、８ドット
、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドッ
トのグリッドを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかった
プローブを除去するためにマイクロアレイは洗浄され、スキャナを用いて蛍光の
レベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイク
ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量を確
定する。

【０２００】 ８ 相補ポリヌクレオチド ＧＲ−ＳＥＰをコードする配列或いはその任意の一部に相補的な配列用いて、
自然発生ＧＲ−ＳＥＰの発現を減少或いは抑制する。約１５−約３０塩基対を含
むオリゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より小さな或いはより大きな
ｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。適当なオリゴヌクレオチ
ドはOligo4.06ソフトウエア及びＧＲ−ＳＥＰ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のコード 配列を用いて設計される。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは最
も固有の５´配列から設計され、コード配列へのプロモータ結合を防ぐために用
いられる。翻訳を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは、ＧＲ−ＳＥＰを
コードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐように設計される。

【０２０１】 ９ ＧＲ−ＳＥＰの発現 ＧＲ−ＳＥＰの発現は、ｃＤＮＡを適当なベクタにサブクローニングし、ベク
タを宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合には、クローニン
グベクタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＧＲ−ＳＥＰを発現する。クローニング部
位の上流では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、
それにアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ−ガラクトシダーゼの７残基を含
む配列が続く。これらの８残基の直後は、転写のために有用なバクテリオファー
ジプロモータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。

【０２０２】 単離され、標準的な方法を用いてＩＰＴＧと形質転換された細菌株の誘発は、
β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び完全長タ
ンパク質からなる融合タンパク質を生成する。シグナル残基は、活性用の以下の
検定法に直接用いることができる細菌成長培地へのＧＲ−ＳＥＰの分泌を促す。

【０２０３】 １０ ＧＲ−ＳＥＰ活性の実証 ヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体（ＧＲ−ＳＥＰ）活性は、内因性セプテンＣＤ
Ｃ３、ＣＤＣ１０、ＣＤＣ１１及びＣＤＣ１２において欠乏し、ＧＲ−ＳＥＰを
コードするポリヌクレオチドで形質移入される突然変異体サッカロミセスセルビ シェ 細胞において測定できる。セプテンの不在時には、これらの突然変異細胞は
、限定された温度において多出芽、多核細胞を形成する(Longtine等、前掲)。Ｇ
Ｒ−ＳＥＰ活性は、ＧＲ−ＳＥＰをコードする遺伝子で形質移入し、どの細胞タ
イプが正常な出芽表現型に復帰するかを判定することにより、こらの突然変異細
胞において測定することができる。ＧＲ−ＳＥＰ形質移入細胞は限定された温度
にされ、正常出芽対異常出芽が、顕微鏡を用いて評価される。正常出芽細胞と異
常出芽細胞との比がＧＲ−ＳＥＰの存在量に比例する。

【０２０４】 １１ ＧＲ−ＳＥＰ特異的抗体の生成 ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、上記)、或いは他の精製技術を用いて実質的に
精製されるＧＲ−ＳＥＰを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用い
て抗体を生成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱから推定されるアミノ酸配列
は、DNAStar software (DNASTAR Inc)を用いて分析され、免疫原性の高い領域を
確定し、対応するオリゴポリペプチドを合成かつ使用して、当業者に知られた手
段により抗体を産生させる。Ｃ−末端付近、或いは親水性領域内のエピトープの
ような適当なエピトープの選択は、Ausubel等（前掲）などに記載される。

【０２０５】 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前掲）との反応によりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH
, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバン
ト内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血清は、
例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ抗血清
と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応さ
せることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２０６】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＧＲ−ＳＥＰの精製 自然発生或いは組換えＧＲ−ＳＥＰは、ＧＲ−ＳＥＰに対して特異な抗体を用
いる免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラム
が、ＧＲ−ＳＥＰ抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のよ
うな活性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより作製される。
結合後、製造者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。

【０２０７】 ＧＲ−ＳＥＰを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＧＲ−
ＳＥＰを選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れた
もの）で洗浄される。カラムは、抗体／ＧＲ−ＳＥＰ結合を分裂させる条件下（
ｐＨ２−３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカ
オトロープ）で溶出され、ＧＲ−ＳＥＰが回収される。

【０２０８】 １３ ＧＲ−ＳＥＰと相互作用する分子の同定 ＧＲ−ＳＥＰ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試
薬(Bolton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多数のウエル
プレートのウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＧＲ−ＳＥＰで
インキュベートされ、洗浄され、標識されたＧＲ−ＳＥＰ複合体を有する任意の
ウエルが検定される。種々のＧＲ−ＳＥＰ濃度から得られたデータを用いて、数
、親和性及びＧＲ−ＳＥＰと候補分子との関係を示す値を計算する。

【０２０９】 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入ることを意図
するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｂ】 ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｃ】 ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｄ】 ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図１Ｅ】 ＧＲ−ＳＥＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM software (Hita
chi Software Engineering Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて生成された。

【図２Ａ】 ＧＲ−ＳＥＰ（３００３８２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、キイロショウジョ ウバエ ピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８２２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カ
ンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコードされる予測タンパク質（
ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（Ｇ
Ｉ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の間のアミノ酸配列アライメントを
示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison W
I)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

【図２Ｂ】 ＧＲ−ＳＥＰ（３００３８２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、キイロショウジョ ウバエ ピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８２２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カ
ンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコードされる予測タンパク質（
ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（Ｇ
Ｉ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の間のアミノ酸配列アライメントを
示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison W
I)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

【図２Ｃ】 ＧＲ−ＳＥＰ（３００３８２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、キイロショウジョ ウバエ ピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８２２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カ
ンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコードされる予測タンパク質（
ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（Ｇ
Ｉ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の間のアミノ酸配列アライメントを
示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison W
I)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

【図２Ｄ】 ＧＲ−ＳＥＰ（３００３８２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、キイロショウジョ ウバエ ピーナツタンパク質（ＧＩ ５０８２２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、カ
ンジダアルビカンスＣａＣＤＣ１０遺伝子によりコードされる予測タンパク質（
ＧＩ ５７８１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及びヒト胎児肺ｈＣＤＣ１０（Ｇ
Ｉ ５６０６２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の間のアミノ酸配列アライメントを
示しており、そのアライメントはDNASTAR^TM software (DNASTAR Inc, Madison W
I)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/475 37/00 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 カイザー、マシュー・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94546− 1017・カストロバレー・ユーイングロード 4793 (72)発明者 マーサー、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州94539・ フリモント・グリーンヒルズ 43733 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA10 CA20 DA06 EA04 GA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 4B065 AA01X AA57X AA58X AA72X AA88X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA20 BA22 NA14 ZA012 ZA812 ZB012 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74 GA26

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメ
   ントを含む実質的に精製されたヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体。
2. 【請求項２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％アミノ酸同一性
   を有し、ヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体の少なくとも１つの機能的な特徴を保持
   するヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体の実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体をコードする単
   離され、精製されたポリヌクレオチド配列、或いは前記ポリヌクレオチド配列の
   フラグメント又は変異配列。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする単
   離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメント
   又は変異配列に相補的な単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
7. 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異配
   列含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、精
   製されたポリヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】 少なくとも請求項３のポリヌクレオチド配列のフラグメン
   トを含む発現ベクタ。
10. 【請求項１０】 請求項９の発現ベクタを含む宿主細胞。
11. 【請求項１１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグ
    メントを含むポリペプチドを生成するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１０の宿主細胞を培養する
    過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを
    特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 適当な医薬品担体とともにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミ
    ノ酸配列を有する実質的に精製されたヒト成長関連ＣＤＣ１０相同体を含む医薬
    品組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗
    体。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１５のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む神経疾患を治療或いは予防するための方法。
17. 【請求項１７】 請求項１５のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む生殖障害を治療或いは予防するための方法。
18. 【請求項１８】 請求項１５のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む免疫疾患を治療或いは予防するための方法。
19. 【請求項１９】 請求項１５のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
    検者に投与する過程を含む腫瘍性疾患を治療或いは予防するための方法。
20. 【請求項２０】 生物学的サンプルにおいてヒト成長関連ＣＤＣ１０相同
    体をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、 ａ）請求項６のポリヌクレオチドに生物学的サンプルの核酸物質をハイブリダイ
    ズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイブリ
    ダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおけるヒト成長関連ＣＤ
    Ｃ１０相同体をコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とす
    る方法。
21. 【請求項２１】 前記核酸物質が、ハイブリダイゼーション前にポリメラ
    ーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。