JP2001513997A

JP2001513997A - 新規のヒトｇタンパク質結合受容体

Info

Publication number: JP2001513997A
Application number: JP2000507799A
Authority: JP
Inventors: ラル、プリーティ; ゲグラー、カール・ジェイ; シャー、パルビ; コーレイ、ニール・シー
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1997-08-28
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2001-09-11
Also published as: US5994097A; EP1009828A1; WO1999010491A1; CA2301498A1; AU8921198A

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトＧタンパク質結合受容体（ＧＲｅｃＨ）及びＧＲｅｃＨを同定かつコードするポリヌクレオチド配列を提供する。また本発明は発現ベクタ、宿主細胞、アゴニスト、抗体及びアンタゴニストも提供する。また本発明はＧＲｅｃＨの発現に関連する障害を治療するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は新規のヒトＧタンパク質結合受容体の核酸配列及びアミノ酸配列に関
し、内分泌障害、神経障害及び心血管障害の診断、予防及び治療におけるこれら
の配列の使用法に関する。

【０００２】背景技術Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、原形質膜に及び、逆平行αヘリック
スの束を形成する７つの疎水性膜貫通ドメインの存在により特徴付けられる複合
的な膜タンパク質である。膜貫通ドメインは受容体の構造的及び機能的特徴を説
明する。大抵の場合に、そのヘリックスの束は結合ポケットを形成する。しかし
ながら、その結合部位がより大量の分子を収容しなければならない場合、細胞外
Ｎ末端セグメント或いは３つの細胞外ループの内の１つ以上が、結合及びその後
の受容体の細胞内部分の高次構造上の変化の誘導に関係する。活性化された受容
体は、さらに細胞内シグナル伝達活性化と、全般的なグアニンヌクレオチド結合
（Ｇ）タンパク質との相互作用と、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、ホスホリ
パーゼＣ、イノシトール三リン酸或いはイオンチャネルタンパク質のような第２
のメッセンジャの生成とを媒介する細胞内ヘテロトリマＧタンパク質複合体と順
次相互作用する（Baldwin, J.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:180-190）。

【０００３】ＧＰＣＲのアミノ末端は細胞外にあり、可変長からなり、グリコシル化されて
いる場合が多く、一方カルボキシ末端は細胞質内にあり、概ねリン酸化されてい
る。ＧＰＣＲの細胞外ループは細胞内ループと入れ替わり、膜貫通ドメインを結
合する。ＧＰＣＲの最も多く保存されたドメインは膜貫通ドメイン及び最初の２
つの細胞質内ループである。ＧＰＣＲの大きさは４００未満のアミノ酸から１０
００以上のアミノ酸にまで及ぶ（Coughlin, S.R. (1994) Curr. Opin. Cell Bio
l. 6:191-197）。

【０００４】ＧＰＣＲは脂質類似体、アミノ酸及びその誘導体、ペプチド、サイトカインを
含むリガンドの多様なアレイ、及び光、食味、匂いのような特定の刺激に反応す
る。ＧＰＣＲは、視覚（ロドプシン）、臭覚（臭覚受容体）、神経伝達（ムスカ
リン様アセチルコリン受容体、ドーパミン及びアドレナリン受容体）及びホルモ
ン反応（黄体形成ホルモン及び甲状腺刺激ホルモン）を含む生理学的プロセスに
おいて機能する。

【０００５】ＧＰＣＲ突然変異は、機能の消失及び活性化多様性の両方からなり、多くのヒ
ト疾患に関連している（Coughlin,、前出）。例えば網膜色素変性症はロドプシン遺伝子における機能の消失或いは活性化突然変異の何れかから生じる場合があ
る。甲状腺刺激ホルモンにおける体細胞活性化突然変異により、機能亢進性甲状
腺腫が生じる（Parma, J.等(1993) Nature 365:649-651）。Parma等は、構造的活性化を受けやすい一定のＧタンパク質結合受容体がプロトオンコジーンとして
振る舞う場合があることを示唆する。

【０００６】神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）及びペプチドＹＹ（Ｐ
ＹＹ）はより高等な脊椎動物において見られる構造的に関連したペプチドである
。ＮＰＹは中央及び末梢神経性において生成される。ＮＰＹは食物摂取の刺激、
不安、学習及び記憶の促進、並びに神経内分泌系及び心血管系の調節において役
割を果たす。またＮＰＹは血管平滑筋収縮を刺激し、ホルモン分泌を調節し、高
血圧、うっ血性心不全、情動障害及び食欲調節の病態生理に関係している（Wats
on, S.及びS. Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book,
Academic Press, San Diego CA, pp. 194-198）。ＰＰは膵臓の内分泌細胞にお
いて生成され、膵臓分泌、胆嚢収縮及び腸管運動を抑制する。ＰＹＹは膵臓及び
大腸の内分泌細胞において生成される。ＰＹＹはＰＰと類似の能力を有し、さら
に腸内血管の血流を再配分する。ＰＰ及びＰＹＹはいずれも食物摂取に応じて循
環内に放出される。これらの構造的に関連したペプチドは、個別のＧＰＣＲサブ
タイプとの相互作用を通して、その変化した生物学的機能を達成する。いくつか
の受容体サブタイプが、ＮＰＹ、ＰＹＹ、ＰＰ及びそのペプチドの誘導体を結合
する能力により明らかにされている。現在までに少なくとも５つの個別の受容体
サブタイプが特徴付けられている（Weinberg, D.H.等(1996) J. Biol. Chem. 27
1: 16435-16438）。

【０００７】コレシストキニン（ＣＣＫ）は腸管全体に渡って存在する生理活性ペプチドで
あり、膀胱及び子宮のような平滑筋組織、外分泌性膵臓のような分泌腺及び脳に
おいても見いだされる。ＣＣＫの主な生理学的能力は胆嚢収縮、膵臓酵素分泌及
び胃腸管における分泌／吸収の調節である。ＣＣＫ受容体は、膵臓、胃、腸及び
胆嚢を含む末梢組織において、また脳においては限られた量だけ見受けられるＧ
ＰＣＲである。ＣＣＫ受容体は膵臓腺房分泌及び胆嚢収縮を媒介する（De Weert
h, A.等(1993) Am. J. Physiol. 265:G1116-G1121）。ＣＣＫ−Ａ受容体は精神分裂病、パーキンソン病、薬物刺激及び摂食障害の病原に関係している（Watson
及びArkinstall, 前出, pp. 89-95）。

【０００８】新規のヒトＧタンパク質結合受容体及びそれをコードするポリヌクレオチドの
発見は、内分泌障害、神経障害及び心血管障害の診断、予防及び治療において有
用な新規の組成物を提供することができ、当分野における必要性を満足するもの
である。

【０００９】発明の概要本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されるアミノ酸配列或いはそのフラグメン
トを有する実質的に精製されたポリペプチド、ヒトＧタンパク質結合受容体（Ｇ
ＲｅｃＨ）を特徴とする。

【００１０】さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメン
トを含むポリペプチドをコードする単離され、実質的に精製されたポリヌクレオ
チド配列及びそのポリヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。また本発明は
ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、或い
はそのポリヌクレオチド配列のフラグメントに厳密性条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチド配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、或いはそのポリヌクレオチド配
列のフラグメント又は変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提供す
る。

【００１１】また本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：２或いはその変異配列を含む単離され、精製
された配列を提供する。さらに本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：２のポリヌクレオチ
ド配列に厳密性条件したでハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する
。また本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異体の相補
配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１２】さらに本発明は少なくとも任意の請求されたポリヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む発現ベクタを提供する。さらに別の態様では、ポリヌクレオチド配列
を含む発現ベクタは宿主細胞に含まれる。

【００１３】また本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを
含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）そのポリペプチドの発現
に適した条件下で少なくともＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド配列のフ
ラグメントを含む発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、その宿主細胞培
養株からポリペプチドを生成する過程とを有する方法を提供する。

【００１４】また本発明は適当な医薬品担体と共にＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列を
有する実質的に精製されたＧＲｅｃＨを含む医薬品組成物を提供する。

【００１５】また本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアンタゴニス
トを提供する。一態様では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列を含
むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。

【００１６】さらに本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドの精製されたアゴニスト
を提供する。

【００１７】また本発明は、精製されたＧＲｅｃＨを含む医薬品組成物の有効量を治療を要
する被検者に投与する過程を含む内分泌障害を治療或いは予防するための方法を
提供する。

【００１８】また本発明は、精製されたＧＲｅｃＨを含む医薬品組成物の有効量を治療を要
する被検者に投与する過程を含む神経障害を治療或いは予防するための方法を提
供する。

【００１９】また本発明は、精製されたＧＲｅｃＨを含む医薬品組成物の有効量を治療を要
する被検者に投与する過程を含む心血管障害を治療或いは予防するための方法を
提供する。

【００２０】また本発明は生物学的サンプルにおいて、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレ
オチドを検出するための方法であって、ａ）生物学的サンプルの核酸物質にＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１をコードすポリヌクレオチドの相補配列をハイブリダイズさせ
、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）そのハイブ
リダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、その複合体の存在が生物学的
サンプルにおけるＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなす
ことを特徴とする方法を提供する。一態様では、生物学的サンプルの核酸物質は
、ハイブリダイズする前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。

【００２１】発明を実施するための形態本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。

【００２２】本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。

【００２３】異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。

【００２４】定義ここで用いるＧＲｅｃＨは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意
の供給源からの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適には
ヒトを含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＧＲｅｃＨのアミノ酸配列で
ある。

【００２５】ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＧＲｅｃＨに結合される際に、ＧＲｅｃ
Ｈの量を増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニス
トはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＧＲｅｃＨに結合してその作用を調節す
る任意の他の分子を含む場合がある。

【００２６】ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」はＧＲｅｃＨをコードする遺伝
子の代替形である。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から
生じ、変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化
する場合もしない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル
形を持つ場合もあれば、全く持たない場合もある。アレルを引き起こす通常の突
然変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これ
らの種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配
列において１回或いは２回以上生じる場合がある。

【００２７】ここで用いるＧＲｅｃＨをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機
能的に等価なＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレ
オチドの欠失、挿入或いは置換を含む。本定義には、ＧＲｅｃＨをコードするポ
リヌクレオチドのある特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出す
ることができる場合もできない場合もある多形性及びＧＲｅｃＨをコードするポ
リヌクレオチド配列に対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレル
への不適当な或いは予想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードさ
れたタンパク質は「変化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＧＲ
ｅｃＨをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意
のアミノ酸置換は、ＧＲｅｃＨの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷
、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うこ
とができる。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸
を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を
有する帯電していない極性頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン
、イソロイシン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミ
ン、セリン及びスレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含む。

【００２８】ここで用いる「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド
或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成分子の
ことである。ＧＲｅｃＨのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であり、
ＧＲｅｃＨの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好ましい。
「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして表
されるが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全な
自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。

【００２９】ここで用いる「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般
に当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行され
る（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratgry M anual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

【００３０】ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＧＲｅｃＨに結合される際にＧＲｅｃＨ
の生物学的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニスト
はタンパク質、核酸、炭水化物或いはＧＲｅｃＨに結合し、その作用を減少させ
る任意の他の分子を含む場合がある。

【００３１】ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆ
ａ、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ＧＲｅｃＨポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さ
なペプチドを含む無傷のポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことがで
きる。動物を免疫するために用いられるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、
ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望により担体タンパク
質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される通常用いられる担体
は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペットヘモシア
ニンを含む。その後結合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット或
いはウサギ）を免疫する。

【００３２】ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すな
わちエピトープ）のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿
主動物を免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或
いは三次元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの
領域或いは構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するため
に、無傷の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と
競合する場合がある。

【００３３】ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補
的なヌクレオチド配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、
「センス」鎖に相補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペ
プチド核酸を含み、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができ
る。一度細胞内に導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然
配列と結合し、二重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「
負（マイナス）」はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プ
ラス）」はセンス鎖を示す場合に用いられることがある。

【００３４】ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは
生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然
、組換え或いは合成ＧＲｅｃＨ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物
或いは細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力の
ことである。

【００３５】ここで用いる「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度
条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−
Ｔ」の場合、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性
は、核酸のあるものだけが結合する「部分的相補性」であるか、或いは一本鎖分
子間に全相補性が存在する場合には完全相補性である。核酸鎖間の相補性の度合
いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。こ
れは核酸鎖間の結合に及びＰＮＡ分子の設計及び使用に依存する増幅反応におい
て特に重要である。

【００３６】ここで用いる「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」は、所与のポリヌ
クレオチド配列を含む任意の組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態
或いは水溶液状態を含む。ＧＲｅｃＨ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）をコードするポ
リヌクレオチド配列或いはそのフラグメント（例えばＳＥＱＩＤＮＯ：２及び
そのフラグメント）を含む組成物はハイブリダイゼーションプローブとして用い
ることもできる。プローブは凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化
剤と関連させることもできる。ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩
（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデン
ハート液、粉乳、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させることもできる。

【００３７】ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するた
めに再配列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer
, Norwalk, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント
構築用コンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GC
G, Madison WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されているもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コ
ンセンサス配列を生成している。

【００３８】ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析
によるＳＥＱＩＤＮＯ：２に類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにおい
てＧＲｅｃＨをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す
。

【００３９】ここで用いる「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにお
いて変化し、１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如する
ことである。

【００４０】ここで用いる用語「誘導体」は、ＧＲｅｃＨをコードする核酸配列或いはＧＲ
ｅｃＨ又はコードされたＧＲｅｃＨの相補配列の化学修飾体のことである。その
ような修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換するこ
とである。核酸誘導体は、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリ
ペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチ
レングリコール化（pegylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは
免疫学的機能を保持する任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドで
ある。

【００４１】ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同
性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が
標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実
用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列
の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブ
リダイゼーション検定法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブ
リダイゼーション等）を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或
いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的
配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な
結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密性条件は、
２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを
必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（
例えば約３０％同一性より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合
もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配
列にハイブリダイズしないであろう。

【００４２】ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、大きさが１０Ｋから１０ＭのＤＮＡ配列を含み
、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含む直鎖
状の小染色体である（Harrington等(1997) Nat Genet.15:345-355）。

【００４３】ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合
領域内においてアミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持し
ている抗体分子のことである。

【００４４】ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して
相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。

【００４５】ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基
との間、並びに相補的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つ
の核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタ
ッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は
、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（
例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固
形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又
は細胞或いはその核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化さ
れる別の核酸配列との間に形成することもできる。

【００４６】ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いは
それ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或い
はヌクレオチド配列における変化のことである。

【００４７】ここで用いる「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィ
ルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持
体上で合成される個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるア
レイのことである。

【００４８】ここで用いる用語「調節」は、ＧＲｅｃＨの生物学的活性の変更ことである。
例えば調節により、ＧＲｅｃＨのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機
能的或いは免疫学的特性が増減するようになる。

【００４９】ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌ
クレオチド並びにそのフラグメント、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合がある
ゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアン
チセンス鎖を表す。「フラグメント」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸
配列であり、長さが少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌ
クレオチド、さらに少なくとも１０，０００ヌクレオチドであるフラグメントを
含むことが最も好ましい。

【００５０】ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６
０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、
より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハ
イブリダイゼーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、
オリゴヌクレオチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アン
プリマ」、「プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である
。

【００５１】ここで用いる「ペプチド核酸」、すなわちＰＮＡは、リジンにおいて終端する
アミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオ
チドからなるオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（an
ti-gene agent）ことである。末端リジンはその組成物に可溶性を付与する。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の寿命を延長し、その中で相補一本
鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延長を停止する（Nielsen PE 等(19
93) Anticancer Drug Des 8:53-63）。

【００５２】ここで用いる用語「部分」は、タンパク質に関して（「所与のタンパク質の一
部」をなすような）そのタンパク質のフラグメントを示す。そのフラグメントは
長さ５アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものにまで及
ぶ場合がある。こうして「ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列の少なくとも一
部を含む」タンパク質は、完全長ＧＲｅｃＨ−１及びそのフラグメントを含む。

【００５３】ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＧＲｅｃＨをコー
ドする核酸或いはそのフラグメント又はＧＲｅｃＨ自体を含むと予想される生物
学的サンプルは、溶液中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（
tissue print）等に結合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官
或いは細胞から単離された膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含
む。

【００５４】ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或
いはペプチドとアゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことであ
る。その相互作用は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すな
わち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトー
プ「Ａ」に対して特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけ
るエピトープＡ（或いは遊離し、標識されないＡ）及びその抗体を含むタンパク
質の存在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。

【００５５】ここで用いる「厳密性条件」或いは「厳密性」は、核酸、塩類及び温度により
定義されるようなハイブリダイゼーションのための条件である。これらの条件は
当分野において周知であり、その条件を変更して、同一或いは関連するポリヌク
レオチド配列を同定或いは検出することができる。低い或いは高い厳密性のいず
れかを含む多くの等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さ及
び性質、標的（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、環境（溶液中或いは固形
基質上に固定）、塩類或いは他の成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン
並びに又ポリエチレングリコール）及び反応の温度（プローブの融解温度より約
５℃低い温度から溶融温度より約２０〜２５℃低い温度までの範囲にある）のよ
うな要因に依存する。１つ或いはそれ以上の要因を変更して、上記条件とは異な
るが、等価である低或いは高厳密性のいずれかの条件を発生させることもできる
。

【００５６】ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単
離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それら
は自然に関連する他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には
９０％含まないものである。

【００５７】ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸
が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。

【００５８】ここで定義する「（形質）転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化
させるプロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自
然或いは人工的条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を
原核或いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある
。その方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウ
イルス感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む
場合がある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞
を含んでおり、その細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド
或いはその宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその
細胞は、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細
胞も含む。

【００５９】ここで用いるＧＲｅｃＨの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸によ
り変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合が
あり、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換
える場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあ
るが、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存
的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入
、又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなく
アミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に
周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTAR softwareを用いて見出すことが
できる。

【００６０】発明本発明は新規のヒトＧタンパク質結合受容体（これ以降「ＧＲｅｃＨ」と呼ぶ
）、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド及び神経障害、内分泌障害及び心
血管障害の診断、予防或いは治療におけるこれらの組成物の使用法の発見に基づ
いている。

【００６１】本発明のＧＲｅｃＨをコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対する
コンピュータ検索を用いて心筋ｃＤＮＡライブラリＣＡＲＤＮＯＴ０１に由来す
るインサイト社クローン２８２４１４において最初に同定された。コンセンサス
配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：２は重複並びにまた伸長した核酸配列、インサイト社
クローン２８２４１４（ＣＡＲＤＮＯＴ０１）及び３０６０２０（ＨＥＡＲＮ
ＯＴ０１）に由来した。

【００６２】一実施例では、本発明は図１Ａ−図１Ｆに示されるようなＳＥＱＩＤＮＯ：
１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＧＲｅｃＨは長さが４３３アミノ
酸であり、図２Ａ−図２Ｃ及び図３Ａ−図３Ｃに示されるように、モルモットに
由来するＧＰＣＲＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ
：３）及びマウスに由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：４）と化学的及び構造的相同性を有する。詳細にはＧＲｅｃＨ
とモルモットＣＣＫ−Ａ受容体は３７％「アミノ酸配列類似性」を有し、１９％
アミノ酸配列同一性を有する。ＧＲｅｃＨとマウス神経ペプチドＹ受容体は３５
％類似性と１９％同一性とを有する。「アミノ酸配列類似性」はKarlin, S.等(1
985; Proc: Natl. Acad. Sci. USA 82:8597-8601)に定義されるように、その配列が化学的に類似の機能グループを有することを意味する。図４Ａ及び図４Ｂに
示されるように、ＧＲｅｃＨ及びモルモットＣＣＫ−Ａ受容体は類似の疎水性プ
ロットを有する。ＧＲｅｃＨは、ＧＰＣＲを特徴付ける７つの潜在的な膜貫通ド
メインを含む。これらの膜貫通（ＴＭ）ドメインのおよその位置は、Ｙ３６−Ｍ
６８（ＴＭ１）、Ｉ７３−Ｌ１０７（ＴＭ２）、Ｎ１１０−Ｌ１３８（ＴＭ３）
、Ｍ１５４−Ｓ１８３（ＴＭ４）、Ｙ２１０−Ｉ２４２（ＴＭ５）、Ｍ３１４−
Ｓ３４２（ＴＭ６）及びＬ３４８−Ｆ３６９（ＴＭ７）である。ＧＲｅｃＨは４
つの潜在的なＮ結合グリコシレーション部位を含み、そのうちの３つは残基Ｎ１
６、Ｎ１９２及びＮ３３３に位置し、膜の細胞外側に存在するものと予測される
。またＧＲｅｃＨは８つの潜在的なリン酸化部位を含み、そのうちの６つは残基
Ｓ１４４、Ｔ２５９、Ｔ２６４、Ｓ３８８、Ｓ４０４及びＴ４１５に位置し、膜
の細胞内側に存在するものと予測される。ノーザン分析は内分泌組織（副腎）、
平滑筋（子宮）、心筋（胎児及び成人心臓）及び神経組織（胎児及び乳児脳）を
含む種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示す。

【００６３】また本発明はＧＲｅｃＨ変異体を含む。好適なＧＲｅｃＨ変異体は、ＧＲｅｃ
Ｈアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）に少なくとも８０％、より好ましくは
９０％アミノ酸配列同一性を有し、ＧＲｅｃＨの活性の生物学的、免疫学的或い
は他の機能的特性を保持する変異体である。最も好ましいＧＲｅｃＨ変異体は、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有する変異体である
。

【００６４】また本発明はＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＧＲｅ
ｃＨのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＧＲｅｃＨを発現す
る組換え分子を生成することができる。ある特定の実施例では、本発明は図１Ａ
−図１Ｆに示されるようなＳＥＱＩＤＮＯ：２の核酸配列を有するポリヌクレ
オチドを含む。

【００６５】遺伝子コードの縮重の結果として、ＧＲｅｃＨをコードする多数のヌクレオチ
ド配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列
に最低限の相同性しか示さないものもあることは当業者には明らかであろう。こ
のように本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより
形成されるようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。
これらの組み合わせは、自然発生ＧＲｅｃＨのヌクレオチド配列に適用されるよ
うな標準的なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変
形例が明確に開示されているものと考慮されたい。

【００６６】ＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択さ
れた厳密性条件下で、自然発生ＧＲｅｃＨのヌクレオチド配列にハイブリダイズ
できることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＧＲｅｃＨをコ
ードするヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある
。コドンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペ
プチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加しても
よい。コードされたアミノ酸配列を変更することなくＧＲｅｃＨをコードするヌ
クレオチド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期
のような、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ
転写物を生成することを含む。

【００６７】また本発明は、合成化学的に完全に、ＧＲｅｃＨ及びその誘導体をコードする
ＤＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願
の出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入
手可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、
ＧＲｅｃＨをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入す
ることもできる。

【００６８】また本発明にはWahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol. Vol. 152:39
9-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol 152: 507-511)に教示され
るような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレオチド配列、詳細にはＳＥＱ
ＩＤＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる
ポリヌクレオチド配列が含まれる。

【００６９】当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。

【００７０】ＧＲｅｃＨをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつ
プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野におい
て既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合
がある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に
隣接する未知の配列を回収する（Sarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:318-
322）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増幅された配列は、同
じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用いて
第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメ
ラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。

【００７１】また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐に渡るプライマを用いて配列
を増幅或いは伸長することもできる（Triglia T等(1988) Nucleic Acids Res 16
:8186）。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Bioscien
ces Inc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用いて、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有
し、さらに約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。
その方法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域に適当なフラグメ
ントを生成する。その際そのフラグメントは、分子内連結により環状にされ、Ｐ
ＣＲテンプレートとして用いられる。

【００７２】用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配
列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lage
rstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19）である。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二
本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置することができる。

【００７３】未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD 等
(1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060)による方法である。さらにある方法はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを用いて、ゲノムＤ
ＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスにより
ライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソン接合部
を見つける際に有用である。

【００７４】完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際に、より長いｃＤＮＡを含むように大
きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初回抗原
刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むより大き
な配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリ
の使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況では特
に好ましい。ゲノムライブラリは５´及び３´非転写調節領域に配列を伸長する
ために有用でもある。

【００７５】市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM 、Perkin Elmer）を用いて電
気信号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示に
至るまでの全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定の
サンプルの限られた量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好
ましい。

【００７６】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド配列或い
はそのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＧＲｅｃＨ、そのフラグメント
或いはその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる
場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価
なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＧＲ
ｅｃＨをクローニングし、発現することもできる。

【００７７】非自然発生コドンを有するＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配列を生成す
ることが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核
或いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増
加したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所
望の特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。

【００７８】本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＧＲｅ
ｃＨをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺
伝子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドの
ランダムな断片化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチド配
列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新
しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の変更
、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともできる。

【００７９】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨをコードする自然、修飾或いは組換えポ
リヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されるこ
ともできる。例えば、ＧＲｅｃＨ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをス
クリーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＧＲｅｃ
Ｈタンパク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、Ｇ
ＲｅｃＨをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含
むように遺伝子操作されることもでき、それによりＧＲｅｃＨは切断され、概ね
異種部分から離れて精製されるようになる。

【００８０】別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＧＲｅｃＨをコードす
る配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（Caruthers MH 等 (1
980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Symp Se
r 225-232参照）。別法では、タンパク質自体が、ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えばペ
プチド合成は種々の固相技術（Roberge JY 等(1995) Science 269:202-204）を用いて実行することができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer
(Perkin Elmer)を用いることにより実現することができる。

【００８１】新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的
に精製されることができる（例えばCreighton (1983) Proteins, Structures an d Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。合成ペプチドの
組成物は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる（例えばEdma
n degradation procedure; Creighton、前出）。さらにＧＲｅｃＨのアミノ酸配
列或いはその任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパ
ク質或いはその任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異
配列ポリペプチドを生成することもできる。

【００８２】生物学的に有効なＧＲｅｃＨを発現するために、ＧＲｅｃＨをコードするヌク
レオチド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入され
たコード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入
されてもよい。

【００８３】当業者に周知の方法を用いて、ＧＲｅｃＨをコードする配列及び適当な転写或
いは翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方
法は、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにin vivoゲノム組換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manua l , Cold Spring Harbor Press, Plainview NY及びAusubel FM 等 (1989) Curren t Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NYに記載さ
れている。

【００８４】種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＧＲｅｃＨをコードする配列を含有し
、発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ
、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵
母発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系
（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系
（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴ
ＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ
或いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明
は用いられる宿主細胞により制限されない。

【００８５】「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン
ハンサ、プロモータ並びに５´及び３´非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及
び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成
的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用
いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc
ript ファージミド(Stratagene, LaJolla CA) のハイブリッドlacZプロモータ或
いはpSport 1 プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用いることができ
る。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に用い
られる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば熱シ
ョック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに由来
するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配
列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺乳動
物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＧＲｅｃＨ
をコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合には、
ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いることがで
きる。

【００８６】バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＧＲｅｃＨの使用に応じて選択
されてもよい。例えば大量のＧＲｅｃＨが抗体を誘導するために必要とされると
き、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いるこ
とができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＧＲｅｃＨをコー
ドする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対
する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生
成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript(Stratagene)のよう
な発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Che
m 264:5503-5509）等を含む。またｐＧＥＸベクタ（Promega, Madison WI）を用
いて、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を
有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融合タンパク質
は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそれに後続する
遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精製することが
できる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは
第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象のクローニングさ
れたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。

【００８７】酵母、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いる
ことができる。再確認する場合には、Ausubel 等 (前出）及びGrant等(1987) Me
thods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。

【００８８】植物発現ベクタが用いられる場合には、ＧＲｅｃＨをコードする配列の発現は
、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ
及び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶか
らのω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6
:307-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモー
タ或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Brog
lie 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Re
sults Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入される
ことができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例え
ば、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technolog y (1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。

【００８９】また昆虫系もＧＲｅｃＨを発現するために用いることができる。例えばある系
では、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとし
て用いて、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＧＲｅｃＨをコードする配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須
領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＧＲｅｃ
Ｈをコードする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性
になり、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。その後組換
えウイルスを用いて、ＧＲｅｃＨを発現することができる、例えばヨトウガ細胞
或いはイクラサキンウワバ幼虫を感染させる（Engelhard EK 等 (1994), Proc N
at Acad Sci 91:3224-3227）。

【００９０】哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＧＲｅｃＨをコードす
る配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／
翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領
域内の挿入により、感染した宿主細胞においてＧＲｅｃＨを発現することができ
る生ウイルスを得ることができる（Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sc
i 81:3655-59）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写
エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させることができる。

【００９１】またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
めに、６−１０ＭのＨＡＣが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチ
オンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。

【００９２】また特異な開始シグナルを用いて、ＧＲｅｃＨをコードする配列のより効率的
な転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列
を含む。ＧＲｅｃＨをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発
現ベクタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要で
ある。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、
ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さら
に開始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれな
ければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種
々の起源からなることができる。発現の効率は、論文（Scharf D 等 (1994) Res
ults Probl Cell Differ 20: 125-162）に記載されるように、使用される特定の
細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある。

【００９３】さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の
ように発現したタンパク質を処理できるように選択することができる。そのよう
なポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプ
ロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並
びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために特異な細胞機構及び
特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ
２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection（ATTC; Bethesda,
MD）から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確
実にするように選択することができる。

【００９４】長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま
しい。例えば、ＧＲｅｃＨを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エ
レメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝
子を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタの導入に続いて
、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるように
する。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在に
より、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。
安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技
術を用いて増殖させることができる。

【００９５】任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ^-細胞或いはａｐｒｔ^-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与える（Murry、前出）。さらに選択可能遺伝子が記載されており、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan (1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのよう
なマーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定するの
みならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の量
を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995) Methods Mol Biol 55:
121-131）。

【００９６】マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認する必要がある。例えば、ＧＲｅｃＨをコードする配列がマ
ーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＧＲｅｃＨをコードする配列を含む組
換え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定することができる。別法では、
マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＧＲｅｃＨをコードする配列と直
列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列
型遺伝子の発現を示す。

【００９７】別法では、ＧＲｅｃＨをコードする核酸配列を含み、ＧＲｅｃＨを発現する宿
主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手
順は、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための
膜、溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブ
リダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含
む。

【００９８】ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＧＲｅｃＨをコード
するポリヌクレオチドのプローブ或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或
いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出することがで
きる。核酸増幅系アッセイは、ＧＲｅｃＨをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含
む形質転換体を検出するために、ＧＲｅｃＨをコードする配列に基づくオリゴヌ
クレオチド或いはオリゴマを使用することを伴う。

【００９９】ＧＲｅｃＨの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパ
ク質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを
用いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などであ
る。ＧＲｅｃＨにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗
体を用いる２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based immun
oassay）が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここで記
載した検定法及び他の検定法は、Hampton R 等(1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN)及びMaddox DE 等 (1983, J Exp'
Med 158:1211-1216)に記載される。

【０１００】幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド
に関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプ
ローブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末
端標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＧＲ
ｅｃＨをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のた
めにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野にお
いて知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポ
リメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販のキッ
ト（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Biochemi
cal Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。検出を容易にするのに適したリポータ分子或いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化
学発光剤或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を
含む。

【０１０１】ＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞
培養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養することがで
きる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまた
ベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＧＲｅｃＨをコードす
るポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介して
ＧＲｅｃＨの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは
当業者には理解されよう。他の組換え構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を
容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＧＲｅｃＨをコー
ドする配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定は
しないが、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモ
ジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製でき
るようにするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immune
x Corp., Seatile, WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＧ
ＲｅｃＨとの間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego,
CA）に対して特異な配列のような分割可能リンカー配列を含有することにより、精製が容易になる場合もある。１つのそのような発現ベクタが、ＧＲｅｃＨ及
びチオレドキシン或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基
をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、
ＩＭＩＡＣ（Porath, J. 等 (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトクグラフィ）において精製を容易にし
、一方エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのＧＲｅｃＨを精製する
ための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクタの議論はKroll,D.J.等(199
3;DNA Cell Biol. 12:441-453)に与えられる。

【０１０２】組換え生成物に加えて、ＧＲｅｃＨのフラグメントは、固相技術（Merrifield
J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成
される場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行
されることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer
(Perkin Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることにより
自動合成を実現してもよい。ＧＲｅｃＨの種々のフラグメントは化学的に個別に
合成されるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成すること
ができる。

【０１０３】治療ＧＲｅｃＨ、モルモットに由来するＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４）
及びマウスに由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４）の間には
化学的及び構造的相同性がある。さらにＧＲｅｃＨは内分泌組織、平滑筋、心筋
及び神経組織において発現される。それゆえＧＲｅｃＨは細胞内シグナル伝達活
性に関連し、内分泌障害、神経障害及び心血管障害において役割を果たすように
現れる。

【０１０４】それゆえ一実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を被検
者に投与して、内分泌障害を治療或いは予防することができる。そのような障害
は、限定はしないが、アジソン病、カルチノイド症候群、クッシング病、尿崩病
、糖尿病、高アルドステロン病、高血糖及び低血糖症、甲状腺腫、グレーブス病
、多発性内分泌腺新形成症候群（multiple endocrine neoplasia syndromes）、
クロム親和性細胞腫、多内分泌脱落症候群（polyendocrine deficiency syndrom
es）及び甲状腺炎を含む。

【０１０５】別の実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現するこ
とができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む内分泌障
害を治療或いは予防することができる。

【０１０６】さらに別の実施例では、ＧＲｅｃＨの活性を調節するアゴニストを被検者に投
与して、限定はしないが、上記障害を含む内分泌障害を治療或いは予防すること
ができる。

【０１０７】別の実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体が被検者を投
与して、神経障害を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限定
はしないが、静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極
性障害、緊張病、脳性腫瘍、痴呆、うつ病、ダウン症、遅発性ジスキネジア、ジ
ストニア、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経繊維腫症、パー
キンソン病、妄想性精神症、精神分裂病及びトゥーレット病並びにアンギナ、ア
ナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心血管性ショック、クッシング症候
群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛及びクロム親和性細胞腫を含む交換神
経系の障害を含む。

【０１０８】別の実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現するこ
とができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む神経障害
を治療或いは予防することができる。

【０１０９】さらに別の実施例では、ＧＲｅｃＨの活性を調節するアゴニストを被検者に投
与して、限定はしないが上記障害を含む神経障害を治療或いは予防することがで
きる。

【０１１０】別の実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を被検者に投
与して、心血管障害を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限
定はしないが、アンギナ、不整脈、アナフィラキシー性ショック、動脈硬化症、
心筋症、心血管性ショック、冠状動脈疾患、心内膜炎、高血圧、心筋梗塞、心筋
内虚血、心外膜炎、リウマチ性心臓疾患及び感染性ショックを含む。

【０１１１】別の実施例では、ＧＲｅｃＨ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現するこ
とができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む心血管
障害を治療することができる。

【０１１２】さらに別の実施例では、ＧＲｅｃＨの活性を調節するアゴニストを被検者に投
与して、限定はしないが上記障害を含む心血管障害を治療することができる。

【０１１３】他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。

【０１１４】ＧＲｅｃＨのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成される
ことができる。詳細には、精製されたＧＲｅｃＨを用いて抗体を生成するか、或
いは医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＧＲｅｃＨと特異に結合する
ものを同定することができる。

【０１１５】ＧＲｅｃＨに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる
。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメ
ラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフ
ラグメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に
治療上の使用に適している。

【０１１６】抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＧＲｅｃＨ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴ
ペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバ
ントは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのよう
なミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペ
プチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールの
ような表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（
カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。

【０１１７】ＧＲｅｃＨに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ
ド、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し
、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それ
らは自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子か
らなる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＧＲｅｃＨアミノ酸の短い伸
展部はキーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して生成される抗
体のような別のタンパク質の伸展部と融合されることもできる。

【０１１８】ＧＲｅｃＨに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分
子の生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は
、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozb
or 等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci
80:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。

【０１１９】さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ＧＲｅｃＨ特異性一本鎖抗体を生成して
もよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体
が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成さ
れることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-3）。

【０１２０】また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。

【０１２１】またＧＲｅｃＨに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させる
こともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子
のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ
（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成するこ
とができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを、所
望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同
定できるように作製してもよい（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）。

【０１２２】種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＧＲｅｃＨとその特異的抗体との間の複合形成体を
測定することを含む。２つの非干渉性ＧＲｅｃＨエピトープに反応するモノクロ
ーナル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結
合タンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox 前出)。

【０１２３】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド或いはそ
の任意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様で
は、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡの
転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、Ｇ
ＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることが
できる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＧＲｅｃＨ活性を調
節するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は
当分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより
大きなフラグメントを、ＧＲｅｃＨをコードする配列のコード化或いは調節領域
に沿った種々の位置から設計することができる。

【０１２４】レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＧＲｅｃＨをコードする遺伝子のポリヌクレ
オチドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる。これらの
技術は、Sambrook 等(前出)及びAusubel 等 (前出)の両方に記載される。

【０１２５】ＧＲｅｃＨをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＧＲｅｃＨをコードす
る高レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと
形質転換することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳でき
ないセンス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮ
Ａ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼ
により無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発
現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレ
メントがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。

【０１２６】上記のように遺伝子発現の修飾は、ＧＲｅｃＨをコードする遺伝子の制御、５
´或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に
対する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計
することにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置
−１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重
らせん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の
抑制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放される
ようになるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の
進歩は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Imm unologic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY)に記載されている。また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを
防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができる。

【０１２７】リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＧＲｅｃＨをコードする配列のヌクレオチド
鎖切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハ
ンマヘッドモチーフリボザイムを含む。

【０１２８】任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。

【０１２９】本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＧＲｅｃＨをコードするＤＮＡ配列のin vitro 及びin vivo転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベク
タ内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ作製物は、相補ＲＮ
Ａを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入すること
ができる。

【０１３０】ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。

【０１３１】細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達（Goldman, C.K. 等(1
997）Nature Biotechnology 15:462-66、参照して本明細書の一部としている)は
、当分野で周知の方法を用いて実現することができる。

【０１３２】上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検者に適用
されることができる。

【０１３３】本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＧＲｅｃＨ、ＧＲｅｃＨに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニ
スト或いはＧＲｅｃＨのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或
いは限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の
滅菌の生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のよ
うな少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これ
らの組成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者
に投与してもよい。

【０１３４】本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。

【０１３５】活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。

【０１３６】経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。

【０１３７】経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。

【０１３８】糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。

【０１３９】経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。

【０１４０】非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。

【０１４１】局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。

【０１４２】本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。

【０１４３】医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク
ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。

【０１４４】医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＧＲｅｃＨの投与の場合、そのようなラ
ベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。

【０１４５】本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。

【０１４６】任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。

【０１４７】製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＧＲｅｃＨ或いはそ
のフラグメント、ＧＲｅｃＨの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＧＲ
ｅｃＨのインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効
度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥ
Ｄ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％
が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が
治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指
数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られる
データは、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのよう
な化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中
濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感
度及び投与経路によりこの範囲内で変化する。

【０１４８】厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。

【０１４９】通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。

【０１５０】診断別の実施例では、ＧＲｅｃＨを特異に結合する抗体を、ＧＲｅｃＨの発現によ
り特徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＧＲｅｃＨ、アゴニスト
、アンタゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検
定法において用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上
記した方法と同様の方法で調製することができる。ＧＲｅｃＨに対する診断検定
法は、抗体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＧ
ＲｅｃＨを検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いること
ができ、リポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することによ
り標識されることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用い
ることができ、そのいくつかが上記される。

【０１５１】ＧＲｅｃＨを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプ
ロトコルが当分野において知られており、ＧＲｅｃＨ発現の変更されたレベル或
いは異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＧＲｅｃＨ発現のための正
常或いは標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出され
た体液或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＧＲｅｃＨに対する抗体
と結合することにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定
量することができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現した
ＧＲｅｃＨの量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される
。標準値と被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する
。

【０１５２】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドを診断の
ために用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド
配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチド
を用いて、ＧＲｅｃＨの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子
発現を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＧＲｅｃＨの存否
及び過剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＧＲｅｃＨレベルの調
節をモニタすることができる。

【０１５３】一態様では、ＧＲｅｃＨ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイ
ブリダイゼーションにより、ＧＲｅｃＨをコードする核酸配列を同定することが
できる。非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチ
ド、或いは特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプ
ローブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高
、中間或いは低）が、そのプローブがＧＲｅｃＨをコードする自然発生配列、ア
レルのみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。

【０１５４】またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＧＲｅｃＨをコード
する配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ま
しい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエ
レメント及び自然発生ＧＲｅｃＨのイントロンを含むゲノム配列に由来する。

【０１５５】ＧＲｅｃＨをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプロー
ブを生成するための手段は、ＧＲｅｃＨ或いはＧＲｅｃＨ誘導体をコードする核
酸配列を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含
む。そのようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリ
メラーゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプ
ローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブ
は、種々のリポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射性核種、又はア
ビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファ
ターゼのような酵素標識により標識されることができる。

【０１５６】ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチド配列はＧＲｅｃＨの発現に関連する
状態或いは疾患の診断のために用いることができる。そのような状態或いは疾患
の例は、アジソン病、カルチノイド症候群、クッシング病、尿崩病、糖尿病、高
アルドステロン病、高血糖及び低血糖症、甲状腺腫、グレーブス病、多発性内分
泌腺新形成症候群（multiple endocrine neoplasia syndromes）、クロム親和性
細胞腫、多内分泌脱落症候群（polyendocrine deficiency syndromes）及び甲状
腺炎のような内分泌障害、静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索
硬化症、双極性障害、緊張病、脳性腫瘍、痴呆、うつ病、ダウン症、遅発性ジス
キネジア、ジストニア、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経繊
維腫症、パーキンソン病、妄想性精神症、精神分裂病及びトゥーレット病並びに
アンギナ、アナフィラキシー性ショック、不整脈、喘息、心血管性ショック、ク
ッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、偏頭痛及びクロム親和性細胞腫
を含む交換神経系の障害のような神経障害並びにアンギナ、不整脈、アナフィラ
キシー性ショック、動脈硬化症、心筋症、心血管性ショック、冠状動脈疾患、心
内膜炎、高血圧、心筋梗塞、心筋内虚血、心外膜炎、リウマチ性心臓疾患及び感
染性ショックのような心血管障害を含む。ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオ
チド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜系技
術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＧＲｅｃＨ発現を検出す
るために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティック、ｐｉｎ
、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができる。そのよ
うな定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。

【０１５７】特定の態様では、ＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特
に上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。
ＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハ
イブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織
サンプルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプ
ルは洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或い
は抽出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著
しく変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズされており、サンプル内のＧＲｅｃＨをコードするヌク
レオチド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような
検定法を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に
特定の治療措置の有効度を評価することができる。

【０１５８】ＧＲｅｃＨの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対す
る正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被
検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適
した条件下でＧＲｅｃＨをコードする配列或いはそのフラグメントと結合するこ
とにより与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得
られた値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験
から得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから
得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較さ
れる。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。

【０１５９】一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。

【０１６０】癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。

【０１６１】ＧＲｅｃＨをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさら
なる診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化
学的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよ
い。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向（５´−
＞３´）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３´＜−５´）を有するヌクレ
オチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件
下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴ
マ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮ
Ａ配列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いることができる
。

【０１６２】またＧＲｅｃＨの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオ
チドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果
が書き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods,
159:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプルを定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加
速することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペ
クトル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。

【０１６３】さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイの標的として用いることもでき
る。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転
写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突然変異及び多形性を同定するこ
とができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、疾患の遺伝的基礎を理解し、か
つ疾患を診断する際に有用であり、また治療薬剤の活性を発生及びモニタする際
に有用であろう（Heller.R.等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-55）。

【０１６４】一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願
ＷＯ９５／１１９９５（Chee等）、Lockhart, D.J.等（1996; Nat. Biotech. 14
:1675-1680）及びSchena, M等（1996; Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619
）に記載される方法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。

【０１６５】マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され
るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ
がからなることが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは長さが約６−６０ヌクレ
オチドであることが好ましく、１５−３０ヌクレオチドであることがより好まし
く、約２０−２５ヌクレオチドであることが最も好ましい。ある種のマイクロア
レイの場合、長さが７−１０ヌクレオチドしかないオリゴヌクレオチドを用いる
ことが好ましいこともある。マイクロアレイは、既知の５´或いは３´配列に及
ぶオリゴヌクレオチド、完全長配列に及ぶ連続的なオリゴヌクレオチド、或いは
その配列の長さに沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを
含む場合がある。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは対象の遺伝子
に特異なオリゴヌクレオチドであり、その中では少なくともその配列のフラグメ
ントが既知であるか、或いは特定の細胞タイプ、発生的或いは疾患状態に共通の
１つ或いはそれ以上の未同定のｃＤＮＡに特異である。

【０１６６】あるマイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成するた
めに、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５´或いはより好ましくは３´末端
で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズムは
、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内にＧＣ含
有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉することがある予測される副構造体
のない所定の長さのオリゴマを同定する。ある状況では、マイクロアレイにおい
てオリゴヌクレオチドの対を用いることが適切である。その「対」は、好ましく
は中央に位置する１つのヌクレオチドを除いて同一であろう。その対の第２の（
１つだけ一致しない）ヌクレオチドは、制御体として機能する。オリゴヌクレオ
チド対の数は２−１００万の範囲にある。そのオリゴマは、光照射化学処理（li
ght-directed chemical process）を用いて支持体上の指定された領域で合成される。支持体は紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ、スライド
ガラス或いは任意の他の適切な固定支持体である。

【０１６７】別の態様では、オリゴヌクレオチドは、参照してその全体を本明細書の一部と
しているＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載される
ような、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体
の表面上で合成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット）
ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡ
フラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することができる。アレ
イは手動で或いは市販の開発された（スロットブロット或いはドットブロット装
置）機器及び装置（ロボット式機器を含む）を用いて生成され、８ドット、２４
ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドット、又
は市販の機器を有効に使用するのに適した任意の他の数量のグリッドを含む。

【０１６８】マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生物学的サンプルから
のＲＮＡ或いはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブに加工される。ｍＲＮ
Ａが単離され、ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を形成するためのテ
ンプレートとして作製及び使用される。ａＲＮＡは、蛍光性ヌクレオチドの存在
下で増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイでインキュベートされ、プ
ローブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする
ようにする。インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相
補的一致或いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される。ハイブリダ
イズされなかったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光のレベル及びパ
ターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイクロアレイ上の
各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確定する。生物
学的サンプルは任意の体液（例えば血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、培養され
た細胞、バイオプシ或いは他の組織標本から得ることができる。同時に、個々の
配列の全てに対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否或いは量
を測定することができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異、変異配
列或いは多形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができる。

【０１６９】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨをコードする核酸配列を用いて、自然発
生ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを
生成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、
又はPrice CM (1993; Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ (1991; Trends Genet
7:149-154)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工
染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一
染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造にマッピンクされてもよい。

【０１７０】蛍光in situハイブリダイゼーション（Verma 等(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NYに記載されるＦＩ
ＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関をな
す。遺伝子マップデータの例は種々の科学雑誌或いはOnline Mendelian Inherit
ance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＧＲｅｃＨをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対する素因と
の間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを可
能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と保菌者、すなわち感染
した個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる。

【０１７１】染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２３まで
(Gatti等(1998) Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局在され
ていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のための関
連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列を用い
て、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等により染
色体位置内の差を検出することができる。

【０１７２】本発明の別の実施例では、ＧＲｅｃＨ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメ
ント又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のもの
において化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持
体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい
。ＧＲｅｃＨと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もあ
る。

【０１７３】薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０
３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する
化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＧＲｅｃＨ
に適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或いは
ある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物はＧＲｅｃＨ或い
はそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＧＲｅｃＨが当分
野で周知の方法により検出される。また精製されたＧＲｅｃＨは、上記の薬物ス
クリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーティングされるこ
ともできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体
支持体上に固定化することもできる。

【０１７４】別の実施例では、ＧＲｅｃＨを特異に結合することができる中和性抗体がＧＲ
ｅｃＨを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセ
イを使用する。このようにして、抗体を用いて、ＧＲｅｃＨと１つ或いはそれ以
上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。

【０１７５】さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＧＲｅｃＨをコードするヌクレオチド配
列を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。

【０１７６】以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。

【０１７７】

【実施例】１ＣＡＲＤＮＯＴ０１ｃＤＮＡライブラリ作製ＣＡＲＤＮＯＴ０１ライブラリは自為銃創により死亡した６５歳白人男性の正
常な心筋から単離されたＲＮＡを用いて作製された。その組織はKeystone Skin
Bank, International Institute for the Advancement of Medicine (Exton, PA
)から入手した。その組織は瞬間冷凍され、乳鉢及び乳棒で粉砕され、直ちにグアニジニウムイソチオシアネートを含む緩衝液中に溶解された。その後溶解生成
物は、数回のフェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿が行われた。ポリ
（Ａ⁺）ＲＮＡがビオチン標識されたオリゴｄ（Ｔ）プライマ及び常磁性粒子（P
romega Corp.）に結合されたストレプトアビジンを用いて単離され、Stratagene
社に送られた。Stratagene社では、オリゴｄ（Ｔ）プライム法を用いてｃＤＮＡ
ライブラリが作製された。合成オリゴヌクレオチドが、Uni-ZAP^TMベクタ系（Str
atagene）への挿入を可能にするｃＤＮＡ分子に結合された。ｃＤＡＮライブラリの品質がｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングされ、その後pBluescript
phagemid (Stratagene)が切除され、その後宿主細胞（SOLR. Stratagene）に転換された。

【０１７８】２ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンがin vivo切除プロセスにより得られ、ファージミドＤＮＡがその細胞から遊離され、精製され、それを用いて新
しい宿主細胞（SOLR. Stratagene）を再感染し、その中で二本鎖ＤＮＡが生成さ
れた。プラスミドＤＮＡは細胞から単離され、REAL Prep 96 Plasmid Kit (Cata
log # 26173, QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて精製された。推奨プロト
コルを用いたが、以下の点を変更した。１）２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び
０．４％のグリセロールを有する１ｍｌの滅菌のTerrific Broth（Catalog #227
11, Gibco/BRL）において細菌が培養された。２）接種後、その培養株は１９時間培養され、培養終了時にその細胞は０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解された。３
）イソプロパノール沈殿後、そのプラスミドＤＮＡペレットは０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁された。プロトコルの最後のステップを終了した後、サンプルは４℃
で保管するために９６穴ブロックに移された。

【０１７９】ｃＤＮＡは、４つのPeltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Wa
tertown MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems(Perkin Elme
r)と共にHamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV)を用いて、Sanger F等(
1975; J Mol Biol 94:441f)の方法により配列決定され、読み枠が確定された。

【０１８０】３ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列は、GenBank、Swi
ssProt, BLOCKS及びPima IIのようなデータベースへの問合せ配列として用いられた。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、Ｂ
ＬＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域の検索が行われた。ＢＬＡＳＴはBasi
c Local Alignment Search Tool（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300,
Altschul等(1990)J. Mol. Biol. 215:403-410）を表している。

【０１８１】ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、
配列類似性を確定する。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは
厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植
物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用である。ここで他のアルゴリズ
ム、例えば参照して本明細書の一部としているSmith T.等(1992, Protein Engin
eering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムを、主要配列パターン及び副次的な構造間隙の問題を取り扱う際に用いることができる。本出願において開示される
配列は少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１２％未満であ
る（この場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。

【０１８２】ＢＬＡＳＴアプローチはKarlin.S.及びS.F.Atschul (1993; Proc.Nat. Acad.S
ci. 90:5873-7)に詳述され、参照して本明細書において用いられており、問合せ
配列とデータベース配列との間の一致を検索し、見い出されたあらゆる一致の統
計的有意性を評価し、ユーザにより選択された有意な閾値を満足する一致のみを
報告する。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０^-25、ペプチドの場合１０^-14に設定された。

【０１８３】インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び哺
乳動物（ｍａｍ）配列の場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して検索され、
その後同じクローンから推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質データベース、哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ）及び真核生物（ｅｕ
ｋｐ）に対して相同性を検索された。特定の一致に関連するデータベースが、Ｇ
Ｉｘｘｘ±ｐとして報告された（ただしｘｘｘはｐｒｉ、ｒｏｄ等であり、存在
する場合にはｐ＝ペプチドである）。

【０１８４】４ノーザン分析ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、前出）。

【０１８５】ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993及び1990前出）を用いる類似のコンピュータ技
術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ^TM database （インサイト社）のようなヌク
レオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多く
の膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索
の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れと
して分類されるかを判定することができる。検索の基準は、（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は
通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、
それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１８６】ノーザン分析の結果は、ＧＲｅｃＨをコードする転写物が発生するライブラリ
のリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特
定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量
をｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０１８７】５ＧＲｅｃＨをコードするポリヌクレオチドの伸長インサイト社クローン２８２４１４の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配
列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つの
プライマを合成してアンチセンス方向の伸長を開始し、他のプライマを合成して
センス方向の配列を伸長した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未
知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の
伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２−３０の
ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で
標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ
２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。

【０１８８】選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。

【０１８９】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始して、ＰＣＲはPeltier
Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、ステップ１１分間９４℃（初期変性）ステップ２１分間６５℃ ステップ３６分間６８℃ ステップ４１５秒間９４℃ ステップ５１分間６５℃ ステップ６７分間６８℃ ステップ７さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返しステップ８１５秒間９４℃ ステップ９１分間６５℃ ステップ１０７分１５秒間６８℃ ステップ１１１２サイクル間ステップ８−１０の繰返しステップ１２８分間７２℃ ステップ１３４℃（保持）のパラメータで実行された。

【０１９０】反応混合物の５−１０μｌアリコートが低濃度（約０．６−０．８％）アガロ
ースミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸展に成功し
たかを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、
QIA Quick^TM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクローニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除さ
れた。

【０１９１】エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（Sambrook J 等、前出）。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani (LB)-agar (Sambrook J 等
、前出）上に蒔かれた。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選
び取られ、適当な市販の滅菌９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に置
かれた１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各
５μｌの一晩おいた培養株が有菌の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希
釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイに移された。

【０１９２】ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、ステップ１６０秒間９４℃ ステップ２２０秒間９４℃ ステップ３３０秒間５５℃ ステップ４９０秒間７２℃ ステップ５さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返しステップ６１８０秒間７２℃ ステップ７４℃（保持）の条件で実行された。

【０１９３】ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。

【０１９４】同様にして、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、
５´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用い
て５´調節配列を得る。

【０１９５】６個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用ＳＥＱＩＤＮＯ：２に由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２
０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きな
ヌクレオチドフラグメントにも概ね同じ手順が用いられる。オリゴヌクレオチド
は、OLIGO 4.06 (National Biosciences)のような最新のソフトウエアを用いて設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０μＣｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸 (Amersham)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)
とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Se
phadex G-25 super fine resin column (Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれの毎分１０⁷ カウント含むアリコートは、エンドヌクレアーゼ(Ase I, Bgl II, Eco RI, Pst
I, Xba 1.或いは Pvu II、DuPont NEN)の１つで消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼーション分析において用いられる。

【０１９６】各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに上で分画され、ナイロン
膜(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写される。ハイブリダ
イゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異的シグナルを除去するため
に、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸
ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XO
MAT AR^TM film (Kodak, Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molec
ular Dynamics, Synnyvale CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼー
ションパターンが視覚的に比較される。

【０１９７】７マイクロアレイマイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを生成するために、上記ヌクレオチド
配列が、そのヌクレオチド配列の３´末端で開始するコンピュータアルゴリズム
を用いて検査される。そのアルゴリズムは、その遺伝子に固有で、ハイブリダイ
ゼーションに適した範囲内のＧＣ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉
すると考えられる予測された副構造体がない所定の長さのオリゴマを同定する。
そのアルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチドからなる２０の特異な配列のオリ
ゴヌクレオチド（２０量体）を同定する。各配列の中央の１つのヌクレオチドが
変化している、一致したオリゴヌクレオチドの組みが形成される。このプロセス
はマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰り返され、２０個の２０量体からなる
二組が、光照射化学処理（Chee, M.等、PCT/WO95/11995、参照して本明細書の一
部としている）を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。

【０１９８】別法では、化学的結合手順及びインクジェット吐出装置を用いることにより支
持体の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler等、PCT出願WO95/25116、参照してその全体を本明細書の一部としている）。別の方法では、ドット（或い
はスロット）ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表
面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することが
できる。アレイは手動で或いは市販の機器及び装置を用いて生成され、８ドット
、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドッ
トのグリッドを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかった
プローブを除去するためにマイクロアレイは洗浄され、スキャナを用いて蛍光の
レベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイク
ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量を判
定する。

【０１９９】８相補ポリヌクレオチドＧＲｅｃＨをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部用いて、自
然発生ＧＲｅｃＨの発現を減少或いは抑制する。約１５−約３０塩基対を含むオ
リゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より小さな或いはより大きなｃＤ
ＮＡフラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。適当なオリゴヌクレオチドは
Oligo4.06ソフトウエア及びＧＲｅｃＨ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のコード配列を用いて設計される。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは最も固有
の５´配列から設計され、コード配列へのプロモータ結合を防ぐために用いられ
る。翻訳を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは、ＧＲｅｃＨをコードす
る転写物へのリボソーム結合を防ぐように設計される。

【０２００】９ＧＲｅｃＨの発現ＧＲｅｃＨの発現は、ｃＤＮＡを適当なベクタにサブクローニングし、ベクタ
を宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合には、クローニング
ベクタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＧＲｅｃＨを発現する。クローニング部位の
上流では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それ
にアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配
列が続く。直後のこれらの８残基は、転写のために有用なバクテリオファージプ
ロモータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。

【０２０１】単離され、標準的な方法を用いてＩＰＴＧと形質転換された細菌株の誘発は、
β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び完全長タ
ンパク質からなる融合タンパク質を生成する。

【０２０２】１０ＧＲｅｃＨ活性の実証ＧＲｅｃＨ活性を試験するための手順は、Ｓｆ９昆虫細胞のバキュロウイルス
発現系を利用する。Ｓｆ９細胞は、受容体とＧタンパク質サブユニットとの相互
作用を促進する同時翻訳プロセッシングイベントと翻訳後プロセッシングイベン
トとの両方を可能にする（Taussing, R等(1994)Methods Enzymol. 238:95-108）
。ＧＲｅｃＨを含む組換えバキュロウイルスとＳｆ９細胞の感染により、ＧＲｅ
ｃＨが細胞膜において適切に発現かつ位置付けられる細胞が生じる。その受容体
と特異に結合するアゴニスト及びアンタゴニストは、当分野で周知の技術を用い
て同定かつ測定することができる。

【０２０３】１１ＧＲｅｃＨ特異的抗体の生成ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、前出)、或いは他の精製技術を用いて実質的に
精製されるＧＲｅｃＨを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて
抗体を生成する。ＳＥＱＩＤＮＯ：２或いはＳＥＱＩＤＮＯ：４から推定さ
れるアミノ酸配列は、DNAStar software (DNASTAR Inc)を用いて分析され、免疫
原性の高い領域を確定し、対応するオリゴポリペプチドを合成かつ使用して、当
業者に知られた手段により抗体を産生させる。Ｃ−末端付近、或いは親水性領域
内のエピトープのような適当なエピトープの選択は、Ausubel等（前出）などに記載される。

【０２０４】典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前出）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ
ュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血
清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ
抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと
反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２０５】１２特異的抗体を用いる自然発生ＧＲｅｃＨの精製自然発生或いは組換えＧＲｅｃＨは、ＧＲｅｃＨに対して特異な抗体を用いる
免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、
ＧＲｅｃＨ抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後
、製造者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。

【０２０６】ＧＲｅｃＨを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＧＲｅｃ
Ｈを選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの
）で洗浄される。カラムは、抗体／ＧＲｅｃＨ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２
−３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロ
ープ）で溶出され、ＧＲｅｃＨが回収される。

【０２０７】１３ＧＲｅｃＨと相互作用する分子の同定ＧＲｅｃＨ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬
(Bolton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多穴プレートの
ウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＧＲｅｃＨでインキュベー
トされ、洗浄され、標識されたＧＲｅｃＨ複合体を有する任意のウエルが検定さ
れる。種々のＧＲｅｃＨ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＧＲ
ｅｃＨと候補分子との関係を示す値を計算する。

【０２０８】上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入ることを意図
するものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｂ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｃ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｄ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｅ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図１Ｆ】ＧＲｅｃＨのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を示す図である。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TM softwar
e (Hitachi Software Engineering CO. Ltd. San Bruno, CA)を用いて生成された。

【図２Ａ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列同一性アライメントを示す図である。同一の機能グループ
を有する整列したアミノ酸は線で囲まれる。そのアライメントはDNASTAR^TM soft
ware (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを
用いて生成された。

【図２Ｂ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列同一性アライメントを示す図である。同一の機能グループ
を有する整列したアミノ酸は線で囲まれる。そのアライメントはDNASTAR^TM soft
ware (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを
用いて生成された。

【図２Ｃ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列同一性アライメントを示す図である。同一の機能グループ
を有する整列したアミノ酸は線で囲まれる。そのアライメントはDNASTAR^TM soft
ware (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを
用いて生成された。

【図３Ａ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列類似性アライメントを示す図である。化学的に類似の機能
グループを有する整列したアミノ酸が線で囲まれる。そのアライメントはDNASTA
R^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプロ
グラムを用いて生成された。

【図３Ｂ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列類似性アライメントを示す図である。化学的に類似の機能
グループを有する整列したアミノ酸が線で囲まれる。そのアライメントはDNASTA
R^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプロ
グラムを用いて生成された。

【図３Ｃ】ＧＲｅｃＨ（２８２４１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、モルモットに由来する
ＣＣＫ−Ａ受容体（ＧＩ５４４７２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３）及びマウスに
由来する神経ペプチドＹ受容体（ＧＩ１３７８００４、ＳＥＱＩＤＮＯ：４
）の間のアミノ酸配列類似性アライメントを示す図である。化学的に類似の機能
グループを有する整列したアミノ酸が線で囲まれる。そのアライメントはDNASTA
R^TM software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプロ
グラムを用いて生成された。

【図４Ａ】ＧＲｅｃＨ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対する疎水性プロットを示す図である。
正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す（MacDNASIS PRO
software）。

【図４Ｂ】モルモットＣＣＫ−Ａ受容体（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）に対する疎水性プロッ
トを示す図である。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表
す（MacDNASIS PRO software）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ゲグラー、カール・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州94025・メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者シャー、パルビアメリカ合衆国カリフォルニア州94087・サニーベイル・＃５・クイーンシャルロットドライブ 1608 (72)発明者コーレイ、ニール・シーアメリカ合衆国カリフォルニア州94040・マウンテンビュー・＃30・デールアベニュー 1240 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 BA63 CA04 CA09 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 HA03 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ02 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QR84 QS25 QS34 QS39 QX01 QX07 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA17 BA01 BA22 DC50 ZA012 ZA362 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメ
ントを含む実質的に精製されたヒトＧタンパク質結合受容体。
【請求項２】ＳＥＱＩＤＮＯ：１と少なくとも９０％アミノ酸配列同
一性を有し、ヒトＧタンパク質結合受容体の少なくとも１つの機能上の特徴を保
持する実質的に精製されたヒトＧタンパク質結合受容体の変異体。
【請求項３】請求項１のヒトＧタンパク質結合受容体をコードする単離
され、精製されたポリヌクレオチド配列或いは前記ポリヌクレオチド配列のフラ
グメント又は変異配列。
【請求項４】請求項３のポリヌクレオチド配列を含む組成物。
【請求項５】請求項３のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするポ
リヌクレオチド配列。
【請求項６】請求項３のポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメント
又は変異配列に相補的なポリヌクレオチド配列。
【請求項７】ＳＥＱＩＤＮＯ：２或いはそのフラグメント又は変異配
列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項８】請求項７のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオ
チド配列。
【請求項９】少なくとも請求項３のポリヌクレオチド配列のフラグメン
トを含む発現ベクタ。
【請求項１０】請求項９のベクタを含む宿主細胞。
【請求項１１】ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列或いはそのフラグ
メントを含むポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１０の宿主細胞を培養す
る過程と、ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
を特徴とする方法。
【請求項１２】適当な医薬品担体と共にＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ
酸配列を有する実質的に精製されたヒトＧタンパク質結合受容体を含む医薬品組
成物。
【請求項１３】請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗
体。
【請求項１４】請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
【請求項１５】請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１６】請求項１２の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む内分泌障害を治療するための方法。
【請求項１７】請求項１２の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む神経障害を治療するための方法。
【請求項１８】請求項１２の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む心血管障害を治療するための方法。
【請求項１９】生物学的サンプルにおいてヒトＧタンパク質結合受容体
をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、ａ）生物学的サンプルの核酸材料に請求項６のポリヌクレオチドをハイブリダ
イズさせ、これによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記複合体
の存在が前記生物学的サンプルにおけるヒトＧタンパク質結合受容体をコードす
るポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
【請求項２０】前記核酸材料がハイブリダイゼーション前にポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。