CN101883786A - 人源化的notch融合蛋白组合物及治疗方法 - Google Patents

人源化的notch融合蛋白组合物及治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种融合蛋白，包括一信号肽、一人Notch受体蛋白的胞外域和与其结合的抗体Fc部分。本发明还提供一种治疗患有肿瘤的患者的方法、一种抑制患者血管生成的方法、一种治疗患有卵巢癌患者的方法以及一种治疗患有代谢紊乱的患者的方法，包括给患者施予有效治疗所述患者的有效量的上述融合蛋白。本发明还提供上述融合蛋白在制备用于治疗患有肿瘤的患者的药物组合物中的用途、在制备用于抑制患者血管生成的药物组合物中的用途、在制备用于治疗患有卵巢癌的患者的药物组合物中的用途以及在制备用于治疗患有代谢紊乱的患者的药物组合物中的用途。

Description

人源化的NOTCH融合蛋白组合物及治疗方法
本申请要求于2007年8月23日提交的申请号为60/966,052的美国临时申请的权益，该临时申请的内容在此被以引用的方式并入到本申请中。
在此公开的本发明由美国政府支持，支持的基金号R01HL62454来自美国国立卫生研究院，和基金号DAMRDCW81XWH-04-1-054和DAMD17-03-1-0218来自国防部。因此，美国政府在本发明中享有一定权利。
在本申请中，各种出版物被引用的方式为以在括号中的阿拉伯数字或在括号中的作者和出版日期来表示。这些出版物的完整的出处列出在本说明书的结尾部分。这些出版物的公开的内容在此被以引用的方式并入到本申请中，以更全面地描述与本发明相关的现有技术。
发明背景
血管发育
在哺乳动物胚胎发生期间，血管系统的形成是早期的基本的过程。在胚胎中，血管发育由来源于轴旁中胚层和侧板中胚层的多潜能成血管细胞开始。所述成血管细胞具有潜能分化成造血祖细胞或内皮前体细胞，也被称为成血管细胞。
血管发育开始的程序为血管发生，因此成血管细胞分化成内皮细胞并一起迁移形成初级血管丛。该初级血管网包括大小相同的并完全由内皮细胞组成的血管。然后所述血管丛通过血管生成被重建。
血管生成包括新生血管的萌芽，这些血管迁移到无血管部位，以及辅助细胞、周细胞和平滑肌细胞的募集(Gale and Yancopoulos，1999)。所述分化并形成有收缩性血管壁的平滑肌细胞起源于多种祖细胞包括神经脊细胞、间质细胞和甚至是内皮细胞(Owens，1995)。在成人中，卵泡发育、伤口愈合和病理过程例如肿瘤血管生成和心脏病都涉及血管生成。
Notch家族和Notch配体
对果蝇属、线虫、斑马鱼和哺乳动物的研究结果表明所述Notch通路是进化上保守的信号传导机制，其功能是调控多数的细胞命运决定。Notch信号传导是起源于所有三种胚层的细胞所必需的适当的模式。根据细胞环境，Notch信号传导可能都抑制和诱导分化、诱导增殖和促使细胞存活(Artavanis-Tsakonas et al.，1995；Lewis，1998；Weinmaster，1997)。在果蝇属，单一的Notch细胞被两种配体(Serrate和Delta)激活。在哺乳动物，这些家族被扩大到四个Notch基因(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)以及五种配体(2种Serrate样(Jagged1-2)和3种Delta(Dl1，3，4))(Bettenhausen et al.，1995；Dunwoodie et al.，1997；Gallahan and Callahan，1997；Lardelli et al.，1994；Lindsell et al.，1995；Shawber et al.，1996a；Shutter et al.，2000a；Uyttendaele et al.，1996；Weinmaster et al.，1992；Weinmaster et al.，1991)。在胚胎发生期间，Notch受体和配体以动态空间和时间模式表达。然而，是否所有配体激活所有受体仍然未知。
Notch信号传导和功能
Notch信号传导通过根据环境背景提供抑制的、诱导的或增殖的信号影响多种不同类型的细胞命运决定(在Artavanis-Tsakonas et al.，1995中综述；Greenwald，1998；Robey，1997；Vervoort et al.，1997)。这种多种功能表明Notch以时间-空间的方式调控多种信号传导通路。
与Notch调控细胞命运决定一致，所述受体和配体都是具有信号跨膜区的细胞表面蛋白(图1)。所述Notch蛋白的调节的胞外域主要包括串联排列的结合配体所需的EGF-样重复序列(EGF-like repeats)(Artavanis-Tsakonas et al.，1995；Weinmaster，1998)。C-末端到所述EGF-样重复序列是一另外的指定为LIN12/Notch重复序列(LNR)的三个富含半胱氨酸重复序列(Greenwald，1994)。所述LNR的下游区位于被弗林蛋白酶样转化酶(furin-like convertase)识别的蛋白水解切割序列(RXRR)。对于Notch1，在该位点切割得到一分子量为180千道尔顿的细胞外肽和一分子量为120千道尔顿的细胞内肽，所述分子量为180千道尔顿的细胞外肽和分子量为120千道尔顿的细胞内肽可在所述细胞表面结合产生一异二聚体的受体(Blaumueller et al.，1997；Kopan et al.，1996；Logeat et al.，1998)。
Notch的胞内域(NotchICD，图1)挽救Notch表型功能缺失说明Notch信号的组成型形式(Fortini and Artavanis-Tsakonas，1993；Lyman and Young，1993；Rebay et al.，1993；Struhl et al.，1993)。
Notch的胞浆域包含三种可识别区域：RAM区域、锚蛋白重复序列区域和C-末端PEST区域(图1)。经配体激活，Notch经历两种其它的导致胞浆域释放的蛋白水解切割(Weinmaster，1998)。该Notch肽易位到细胞核并与转录抑制因子也称为CS1(CBF，Su(H)，Lag-2)相互作用，并将其转化为转录激活因子。虽然转录活性也需要存在有所述锚蛋白重复序列，但是所述CS1/Notch的相互作用取决于Notch的RAM区域的存在(Hsieh et al.，1996；Hsieh et al.，1997；Roehl et al.，1996；Tamura et al.，1995；Wettstein et al.，1997)。体内和体外研究都表明HES和Hey基因是Notch/CS1依赖性信号传导的直接靶点(Bailey and Posakony，1995；Eastman et al.，1997；Henderson et al.，2001；Jarriault et al.，1995；Nakagawa et al.，2000；Wettstein et al.，1997)。所述HES和Hey基因是在N-盒(N-boxes)结合DNA的bHLH转录抑制因子(Nakagawa et al.，2000；Sasai et al.，1992；Tietze et al.，1992)。Notch也可由不依赖CS1的通路(CS1-independentpathway)传导信号。实际上对于Notch信号传导的一些形式，所述锚蛋白重复序列区域的表达是必要且充分的(Lieber et al.，1993；Matsuno et al.，1997；Shawber et al.，1996b)。
最终，所述PEST区域被包含在通过SEL-10/泛肽依赖通路进行的蛋白质转换中(Greenwald，1994；Oberg et al.，2001；Rogers et al.，1986；Wu et al.，1998；Wu et al.，2001)。与所述受体相似，所述Notch配体的胞外域也主要包括串联排列的EGF样重复序列(图1)。这些重复序列的上游区是一不同的EGF样重复序列也称为DSL(Delta，S_errate，Lag-2)，其是配体结合并激活所述受体所必需的(Artavanis-Tsakonas et al.，1995)。
Notch信号传导和血管发育
虽然已经鉴别了多数诱导血管发生和血管生成的基因，但是关于细胞命运决定在血管发育过程中是如何区分的仍然未知。多种观察结果显示Notch信号传导通路可能在细胞命运决定和血管系统模式(patterning)中起作用。
Notch1、Notch4、Jagged1和Dll4都在发育中的血管系统中表达，而Notch3在附属的平滑肌细胞中表达(Krebs et al.，2000；Shutter et al.，2000b；Uyttendaele et al.，1996；Villa et al.，2001；Xue et al.，1999)。缺失Jagged1的小鼠会胚胎致死和具有严重的血管缺陷(Xue et al.，1999)。无合的(nullizygous)Notch1的小鼠会胚胎致死和死于严重的神经缺陷，但是也具有血管生成缺陷(Krebs et al.，2000；Swiatek et al.，1994)。缺失Notch4的小鼠可出生并看来像是正常的，但同时缺失Notch1和Notch4的胚胎死于E9.5严重出血和血管模式缺陷，这些表明Notch1和Notch4可能在血管发育过程中是功能性丰余的(Krebs et al.，2000)。Notch4的激活型在内皮组织中外源性表达也导致与双Notch1/Notch4无合的小鼠的那些缺陷类似的血管缺陷，表明适当水平的Notch信号对胚胎血管系统的正常发育至关重要(Uyttendaele et al.，2001)。
综合来自突变型小鼠的关于Notch/Notch信号传导组份的数据表明几种依赖于Notch的过程包括血管重构、动静脉区分(arterial venous specification)、血管平滑肌细胞募集和心脏/心脏流出管发育。
最近的实验显示在动脉/静脉内皮细胞区分中涉及Notch信号传导。对E13.5胚胎进行原位分析发现Notch1、Notch3、Notch4、D14、Jagged1和Jagged2的表达仅限于动脉，而在静脉中没有表达(Villa et al.，2001)。与表达数据一致，在斑马鱼中Notch信号传导的破坏与动脉标记物ephrinB2的缺失有关；而且Notch的激活型的异位表达导致在背主动脉内缺失静脉细胞标记物EphB4(Lawson et al.，2001)。这些数据表明Notch信号传导有助于在血管生成期间区分动脉细胞和静脉细胞。
综合来自突变型小鼠的关于Notch/Notch信号传导组份的数据表明几种依赖于Notch的过程包括血管重构、动静脉区分(arterial venous specification)、血管平滑肌细胞募集和心脏/心脏流出管发育。
Notch信号传导也显示在成人血管系统中起作用。在人体，Notch3胞外域的错义突变与退行性血管疾病CADASIL的发生发展有关(Caronti et al.，1998；Desmond et al.，1998；Joutel etal.，2000；Joutel et al.，1996)。在一伤口愈合模型中，观察到在再生的内皮伤口边缘Jagged1的表达上调，这表明Notch信号传导可能在成年血管生成过程期间起作用(Lindner et al.，2001)。综合这些数据，证实Notch信号传导在血管发育的许多关键步骤包括血管发生、血管模式化/血管生成和动脉/静脉区分中起作用。然而，Notch信号传导通路影响这些不同步骤的分子机制仍有待解释。
意义
Shimizu等(J.Biol.Chem.274(46)：32961-32969(1999))描述了在结合研究中采用了Notch1ECD/Fc、Notch2ECD/Fc和Notch3ECD/Fc。然而Shimizu等没有提及所述蛋白质用于抑制血管生成的用途。
于2002年4月30日公布的专利号为6,379,925、发明人为Kitajewski等的美国专利公开了Notch4。然而，它没有描述如本申请所述的基于Notch的融合蛋白。
Notch蛋白在包括血管系统、造血系统和神经系统的发育决定中起关键作用。因此，理解它们的功能是理解在发育期间和在成年组织中如何控制细胞命运决定和定型的关键。迄今为止，一些关于Notch或Notch配体基因破坏的报道公开了血管表型并强调所述通路是引导血管发育的机构的一个主要部分。异常的Notch活性与包括癌症和血管疾病(CADASIL)的人体病变有关。仅仅在最近才开始对肿瘤血管生成中的Notch进行分析；然而，我们发现的Notch的潜在的下游靶点显示在与血管生成有关的病变过程中起作用。例如，VEGFR-3与肿瘤血管生成和肿瘤淋巴管生成都有关。一些其他潜在的Notch靶点的功能或表达也与肿瘤血管生成有关；所述靶点包括ephrinB2、Id3、血管生成素1和PDGF-B。对Notch基因功能中的这些靶点的作用的透彻理解显然将方便将来对人体病变中Notch的分析。
发明概述
本发明提供一融合蛋白，所述融合蛋白包括一信号肽、一人Notch受体蛋白胞外域和一与其结合的抗体的Fc段。
本发明提供一种治疗患有肿瘤的患者的方法，所述方法包括施予患者有效量的能有效治疗所述患者的上述融合蛋白，从而治疗所述患有肿瘤的患者。
本发明提供一种抑制患者血管生成的方法，该方法包括施予患者有效量的能有效抑制患者血管生成的上述融合蛋白，从而抑制患者的血管生成。
本发明提供一种治疗患有卵巢癌的患者的方法，该方法包括施予患者有效量的能有效治疗所述患者的上述融合蛋白，从而治疗患有卵巢癌的患者。
本发明提供一种治疗患有代谢紊乱的患者的方法，该方法包括施予患者有效量的能有效治疗所述患者的上述融合蛋白，从而治疗患有代谢紊乱的患者。
本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗患有肿瘤的患者的药物组合物中的用途。
本发明提供上述融合蛋白在制备用于抑制患者的血管生成的药物组合物中的用途。
本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗患有卵巢癌的患者的药物组合物中的用途。
本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗患有代谢紊乱的患者的药物组合物中的用途。
本发明提供一种抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的方法，该方法包括施予所述患者有效量的能有效抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的上述融合蛋白。
本发明提供一种抑制患者的肿瘤转移的方法，该方法包括施予患者有效量的能有效抑制患者肿瘤转移的上述融合蛋白。
本发明提供一种抑制患者的继发性瘤的生长的方法，该方法包括施予患者有效量的能有效抑制患者的继发性瘤生长的上述融合蛋白。
本发明提供一种抑制患者的肿瘤导致的血管共择的形成的方法，该方法包括施予患者有效量的有效抑制患者的肿瘤导致的血管共择的形成的上述融合蛋白。
本发明提供一种治疗患者癌症的方法，该方法包括施予患者上述融合蛋白以及一血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-A、P1GF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D的抑制剂，所述融合蛋白和所述抑制剂的给药量均为能有效治疗患者癌症的量。
本发明提供一种治疗患者癌症的方法，该方法包括施予患者上述融合蛋白以及一VEGF受体拮抗剂、一VEGFR-1拮抗剂、一VEGFR-2拮抗剂或一VEGFR-3拮抗剂，被施予的各个药物的给药量均为有效治疗患者癌症的量。
本发明提供一种治疗患者癌症的方法，该方法包括施予患者上述融合蛋白以及一血小板衍生的生长因子(PDGF)、PDGF-A或PDGF-B的抑制剂，被施予的各个药物的给药量均为有效治疗患者癌症的量。
本发明提供一种治疗患者癌症的方法，该方法包括施予患者上述融合蛋白和一PDGF受体拮抗剂，被施予的各个药物的给药量均为有效治疗患者癌症的量。
本发明提供一种治疗患者癌症的方法，该方法包括施予患者上述融合蛋白和一HER2/neu抑制剂，被施予的各个药物的给药量均为有效治疗患者癌症的量。
本发明提供一种治疗血管增殖性视网膜病的方法，该方法包括施予患者上述有效量的能有效治疗上述血管增殖性视网膜病的融合蛋白。
附图简要说明
图1
该图显示了Notch和包括Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、Delta样1、Delta样3、Delta样4的Notch配体的结构示意图。
图2
该图显示了基于Notch的融合蛋白(NotchECD/Fc)的设计示意图。包含上述EGF重复序列的Notch1、Notch2、Notch3或Notch4的胞外域被融合到一抗体的Fc部分。
图3
该图显示了一测试基于Notch的融合蛋白活性的共同培养实验。Notch和Notch敏感转录报告子在“Notch敏感”细胞HeLa中表达。Notch配体、Jagged-1、Delta样1或Delta样4在“配体传递”细胞293中表达。该表达是通过转染单独的细胞群来介导的，细胞是共同培养的并且随后用于测试Notch依赖报告子的活性。
图4
该图显示了基于Notch的融合蛋白对通过Notch和Notch配体之间的相互作用激活Notch信号传导的抑制活性。通过共同培养Notch1型和Notch3型的Notch配体表达细胞来检测Notch信号传导的诱导作用，并且通过共转染基于Notch的融合蛋白表达载体到Notch1表达细胞来抑制这些诱导作用。因此，根据抑制Notch和Notch配体之间的相互作用，基于Notch的融合蛋白可被用作为Notch抑制剂。
图5
该图显示了基于Notch的融合蛋白(Notch1ECD/Fc)在293中的表达。A组：在细胞溶解产物(lys)中表达或在培养基中分泌。B组：在NECD/Fcs的293溶解产物中表达，如图示。
图6
该图显示在腺病毒编码的VEGF-165感染的HUVEC中的Notch信号传导的激活。可以通过利用CBF1启动子活性检测Notch信号传导的激活。CBF1启动子的转录活性通过Notch-IC结合到CBF1而激活。我们在HUVEC中检测CBF1启动子活性，所述HUVEC被腺病毒编码的VEGF-165在不同的MOI时感染。与在MOI依赖方式中的Ad-LacZ感染的细胞相比较，可在Ad-VEGF-感染的HUVEC中明显地检测到CBF1启动子的诱导作用。该数据显示的VEGF过表达可以激活HUVEC中的Notch信号传导。
图7
该图显示基于Notch的融合蛋白对VEGF诱导的Notch信号传导的激活作用的影响。基于Ad-Notch的融合蛋白与Ad-VEGF混合感染，明显降低由Ad-VEGF单独感染诱导的激活CBF1启动子活性的作用。在A组中对于每个腺病毒在40MOI时感染的情况下，在检测报告子基因转染后在24小时抑制为60％，在48小时抑制为90％。Notch抑制的抑制活性依赖于基于Ad-Notch的融合蛋白的MOI。
图8
该图显示了我们通过在HUVEC中过表达VEGF-165评价基于Notch融合蛋白对诱导出芽的作用的实验。当Ad-VEGF感染的HUVEC在型胶原凝胶(type collagen gel)上培养8天，在胶原凝胶中诱导出芽。由过表达VEGF诱导的出芽明显地被共同感染的腺病毒编码的基于Notch的融合蛋白所抑制。基于Ad-Notch的融合蛋白本身对形态(morphology)影响更小。
图9
该图显示了在显微镜下对每区域芽体计数的结果。依赖于使用的MOI，在HUVEC中的Ad-VEGF感染增加了芽体的数量。与Ad-VEGF相比较，即使使用半数MOI的基于Notch的融合蛋白，Ad-VEGF诱导的出芽也可被明显地抑制。这些数据显示VEGF通过激活Notch信号传导诱导HUVEC出芽以及基于Notch的融合蛋白可抑制VEGF诱导的出芽。
图10
该图显示大鼠Notch1蛋白胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和一连接子序列(SEQ IDNO：2)。
图11
该图显示了大鼠Notch2蛋白胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和一连接子序列(SEQID NO：2)。
图12
该图显示了小鼠Notch3蛋白胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图13
该图显示了小鼠Notch4蛋白胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)和一连接子序列(SEQIDNO：2)。
图14A和14B
这些图显示了大鼠Notch1基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：6)。
图15A和15B
这些图显示了大鼠Notch2基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：7)。
图16A和16B
这些图显示了大鼠Notch3基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：8)。
图17A和17B
这些图显示了小鼠Notch4基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：9)和核酸序列(SEQ IDNO：10)以及连接子序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图18A和18B
这些图显示了人Notch1基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：11)。
图19A和19B
这些图显示了人Notch2基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：12)。
图20A和20B
这些图显示了人Notch3基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：13)。
图21A和21B
这些图显示了人Notch4基因的胞外域的核酸序列(SEQ ID NO：14)。
图22A至22I
这些图显示了VEGF激活Notch信号传导来诱导HUVEC出芽。用Ad-VEGF在40MOI(图22A、22H、22I)或在20MOI时(图22C、22G)转导HUVEC。分别在60MOI(图22G)、80MOI(图22A)和100MOI(图22H、22I)时用Ad-LacZ共转导HUVEC来制备相同总额腺病毒。图22A显示Notch的RT-PCR分析和Notch配体表达。数字表示PCR循环次数。图22B显示转导的VEGF对CS1报告子活性的影响作用。图22C显示SU5416对Ad-VEGF反式激活的CS1报告子的活性的作用。图22D显示Notch引诱物(decoy)(N1ECDFc)的构造。图22E显示从用Ad-N1ECDFc转导的HUVEC中分泌N1ECDFc。图22F显示在共同培养实验中N1ECDFc抑制配体诱导的CS1报告子活性的作用(□：(-)；■：0.33ng pHyTC-N1ECDFc；■：0.67ngpHyTC-N1ECDFc)。图22G-I显示N1ECDFc抑制Ad-VEGF转导HUVEC的作用。在不存在或存在以指示剂量(indicated dosage)共转导Ad-N1ECDFc时，Notch信号传导被Ad-VEGF转导入HUVEC内所激活。图22G显示N1ECDFc对由Ad-VEGF反式激活的CS1报告子活性的作用。图22H显示在40MOI时Ad-N1ECDFc共转导抑制Ad-VEGF转导的HUVEC的出芽。图22I显示对N1ECDFc对Ad-VEGF转导的HUVEC的出芽的作用的定量化(□：芽体；■：细胞数量)。
图23A至23J
这些图显示了Notch信号传导上调Flt1表达以诱导HUVEC出芽。HUVEC在40MOI时被Ad-LacZ或Ad-N1IC转导。图23A-23C显示受体酪氨酸激酶的抑制剂对Notch诱导的HUVEC出芽的作用。图23A为用1μM的PD166866和ZD1893以及0.5μM的SU5416处理的Ad-N1IC转导的HUVEC的出芽的照片。图23B显示抑制剂在1μM时的作用的定量化(□：芽体；■：细胞数量)。图23C显示剂量依赖的SU5416的作用(□：芽体；■：细胞数量)。图23D-E显示诱导Flt-1在Ad-N1IC转导的HUVEC中表达。图23D显示Flt-1mRNA表达的RT-PCR分析。图23E显示Flt-1蛋白表达的W.B.分析。图23F-G显示P1GF刺激的促进的Notch诱导的HUVEC出芽。Ad-N1IC转导的HUVEC在不存在或存在50ng/ml P1GF时在具有SFM的胶原凝胶上培养，而不是在通用培养基上培养。图23F显示了P1GF诱导的Ad-N1IC转导的HUVEC出芽(箭号的头部：具有单个丝状伪足的芽体；箭号：具有多个丝状伪足的芽体)。图23G显示P1GF对Ad-N1IC转导的HUVEC的出芽的作用的定量化(□：多重的；■：总体的)。图23H-I显示Flt-1siRNA转染对Flt1表达的影响作用。Ad-N1IC转导的HUVEC被200pmol的对照(CT)或Flt-1siRNA转染。图23H显示Flt-1mRNA的表达减少。图23I显示Flt-1蛋白的表达减少。图23J显示Flt-1siRNA转染对Notch诱导的HUVEC出芽的影响作用。Ad-N1IC转导的HUVEC被100或200pmol的siRNA转染，然后在胶原凝胶培养2天。
图24A至24E
这些图显示了VEGF通过Notch信号传导通过上调MMP-9和MT1-MMP调节明胶酶的活性。图24A-B显示在HUVEC中VEGF刺激的MMP-9和MMP-2活性的明胶酶谱法分析。图24A显示N1ECDFc对MMP-9活性的作用。转导的HUVEC在纤维蛋白凝胶上培养必需的天数(亦即2天、4天、6天、8天)。虽然MMP-9的诱导作用在纤维蛋白凝胶上比在胶原蛋白凝胶上更强(数据未图示)，但是采用纤维蛋白凝胶也得到相似的结果。图24B显示N1ECDFc对MMP-2活性的作用。以所必需的剂量用Ad-N1ECDFc转导HUVEC，并且在HUVEC在胶原蛋白凝胶上培养4天后收集条件培养基。图24C-D显示由于Notch信号传导引起的MMP-9和MT1-MMP上调。在40MOI用Ad-LacZ或Ad-N1IC转导HUVEC。数字表示PCR循环次数。图24C显示Notch信号传导对MMP-9和MMP-2的表达的作用的RT-PCR分析。图24D显示Notch信号传导诱导MT1-MMP表达转录本和蛋白质。图24E显示MMP-9和MT1-MMP在Ad-VEGF-HUVEC中表达并伴随Ad-N1ECDFc的共转导的RT-PCR分析。在40MOI并在不存在或存在Ad-N1ECDFc的共转导下用Ad-VEGF转导HUVEC。在80MOI共转导Ad-LacZ来制备相同总量的腺病毒。
图25A至25D
这些图显示Notch信号传导在VEGF依赖的体内血管生成中的作用。图25A-25D显示在小鼠DAS实验中N1ECDFc对VEGF诱导的血管生成的抑制。已示出具有代表性的照片。图25A显示由于293/VEGF转染子引起的皮下诱导的血管生成和293/VEGF也表达Notch引诱物(decoy)(基于Notch的融合蛋白)N1ECDFc的比较。图25B显示在对照组293/VEGF诱导的血管化作用和293表达的Notch引诱物(基于Notch的融合蛋白)N1ECDFc的比较。图25C显示Ad-LacZ感染的MDA-MB-231细胞的皮下诱导的血管生成和Ad-N1ECDFc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231细胞的皮下诱导的血管生成。图25D显示由Ad-LacZ感染的MDA-MB-231细胞诱导的血管化作用程度的定量和Ad-N1ECDFc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231细胞诱导的血管化作用程度的定量。
图26A和26B
这些图显示Ad-VEGF165转导的HUVEC的增殖。在指示的剂量用Ad-VEGF165转导HUVEC。Ad-LacZ也被在MOI为40pfu/细胞时共感染以制备相同总量的腺病毒。HUVEC在补充了1％FBS的SFM中悬浮，然后在具有0.4ml培养基的24孔多孔板上以1×104细胞/孔进行铺板。4天后，采用CCK-8试剂盒检测细胞数目，结果显示为检测的细胞数目与对照组细胞数目的比值，所述对照组细胞也被Ad-GFP在MOI为40pfu/细胞转导。图26A显示转导的VEGF在增殖上的作用。图26B显示SU5416的抑制作用。用SU5416以指示剂量处理Ad-VEGF转导的HUVEC。
图27A和27B
这些图显示诱导HUVEC在I型胶原蛋白凝胶上出芽。用Ad-VEGF165或AD-N1IC在指示剂量转导HUVEC。Ad-LacZ也被在MOI为40pfu/细胞时共同感染以制备相同总量的腺病毒。转导的HUVEC在伴随有完全培养基的胶原凝胶上培养。在7天在显微镜下计数芽的数量。
图28A和28B
这些图显示Notch信号传导的改变在细胞增殖上的影响。所述细胞被所述指示的腺病毒转导。Ad-GFP也被在MOI为60pfu/细胞时共感染以制备相同总量的腺病毒。在4天后，采用CCK-8试剂盒检测细胞数目，结果显示为检测的细胞数目与对照组细胞数目的比值，所述对照组细胞也被Ad-GFP在MOI为60pfu/细胞转导。图28A显示转导的N1IC和Notch融合蛋白对HUVEC增殖的影响。在完全培养基中悬浮转导的HUVEC，然后在具有0.4ml指示培养基的24孔多孔板上以1×104细胞/孔进行铺板(□：Ad-N1IC；■：Ad-N1ECDFc)。图28B显示Notch融合蛋白对KP1/VEGF转染子增殖的影响。转导的KP1/VEGF转染子在RPMI1640培养基中悬浮，然后以2×104细胞/孔在具有0.5ml培养基的24孔多孔板上铺板。
图29
该图显示诱导PIGF在Ad-N1IC转导的HUVEC中表达的RT-PCR分析。HUVEC被Ad-LacZ或Ad-N1IC在MOI为40pfu/细胞时感染。从在胶原凝胶与完全培养基上培养5天的转导的HUVEC中分离得到总RNA。
图30A至30C
这些图显示抑制Flk-1siRNA转染的Ad-N1IC-或Ad-VEGF转导的HUVEC的出芽。图30A显示Flk-1mRNA和蛋白质在200pmol Flk-1siRNA转染的Ad-VEGF-HUVEC中表达的减少。在MOI为40pfu/细胞，Ad-VEGF-HUVEC被200pmol对照组(CT)或Flk-1siRNA转染。在转染后48小时分离总RNA。在转染后48小时从SFM中的血清饥饿细胞收集总细胞溶胞产物。图30B和30C显示Flk-1siRNA转染对VEFG或Notch诱导的HUVEC出芽的影响作用。Ad-N1IC-或Ad-VEGF-HUVEC按照指示在MOI为40pfu/细胞被200pmol siRNA转染并在胶原蛋白上培养5天。图30B显示Flk-1siRNA转染对HUVEC出芽的影响(□：Ad-VEGF；■：Ad-N1IC)。图30C显示Flk-1siRNA转染的抑制作用的定量。
图31A和31B
这些图显示对间质金属蛋白酶抑制剂GM6001处理的Ad-N1IC-转导的HUVEC出芽的抑制。在MOI为40pfu/细胞，在不存在或存在50μm GM6001时Ad-LacZ或Ad-N1IC-HUVEC在胶原凝胶上培养5天。图31A显示GM6001对Notch诱导的HUVEC出芽的影响。图31B显示GM6001抑制作用的定量。
图32A至32D
这些图显示Notch1引诱物抑制由Notch配体刺激的Notch信号传导的激活。图32A显示Notch1引诱物(N1ECDFc)的示意图和检测在条件培养基中分泌的Notch1引诱物的Western印迹。在指示的m.o.i，HUVECs被编码Notch1引诱物(Ad-N1ECDFc)的腺病毒转导。图32B显示在共培养信号传导实验中Notch1引诱物抑制配体诱导的CS1报告子活性。在表达Notch1的与表达Notch配体的293细胞共培养的HeLa细胞中检测Notch信号传导的激活。数据显示为平均值±SD。图32C显示Noth4异位表达诱导在纤维蛋白凝胶中培养的HUVECs的形态发生。用腺病毒编码的Notch4(Ad-Notch4)在30m.o.i和Ad-GFP在10m.o.i转导HUVECs以标记感染的细胞。两天后，HUVECs与稳定的HUVEC转染子在纤维蛋白凝胶上共培养，采用荧光显微镜检查法记录形态学变化。Notch4诱导细胞扩展(左上部分，白色箭头)并用200nM化合物E处理阻止Notch4诱导的扩展(右上部分)。Notch引诱物表达阻止Notch4诱导的细胞伸展。腺病毒转导的HUVECs在纤维蛋白凝胶上与表达Fc(左下部分)或Notch1引诱物(右下部分)的稳定的HUVEC转染子共培养，在两天后进行拍照。带＝200μm。图32D显示Notch信号抑制对Notch4诱导的伸展的作用的定量。在用化合物E处理和转导N1ECDFc后芽殖的减少具有显著的统计学意义(两者都为p＜0.0001；数据显示为±SD)。
图33A至33D
这些图显示FGF4诱导Notch配体在小鼠乳腺癌Mm5MT细胞中表达。稳定的Mm5MT转染子由逆转录病毒基因转移产生。图33A显示与模拟的转染子(Mm5MT-X)相比较，在表达FGF4的Mm5MT转染子(Mm5MT-FGF4)中诱导Jaggedl和Dll1的Notch配体表达的定量的RT-PCR分析。图33B显示采用western印迹检测，与在Mm5MT-X中比较，Jagged1蛋白质在Mm5MT-FGF4中增加。图33C显示在具有PD166866的Mm5MT-FGF4细胞中Notch配体表达的减少，PD166866为FGF受体激酶抑制剂。图33D显示在Mm5MT转染子中Jagged1染色的免疫组织化学分析。带＝50μm。
图34A至34C
这些图显示Notch1引诱物抑制小鼠Mm5MT-FGF4肿瘤的血管生成和皮下肿瘤生长。图34A显示在小鼠中Mm5MT-FGF4-X和Mm5MT-FGF4-Fc的肿瘤体积与Mm5MT-FGF4-N1ECDFC转染子显著不同(21天，P＝0.037和P＝0.008，Mm5MT-FGF4-X和Mm5MT-FGF4-Fc分别与Mm5MT-FGF4-N1ECDFc相比较；数据显示为平均值±SD)。图34B显示在Mm5MT-FGF4转染子的肿瘤中CD31染色的新生血管的免疫组织化学分析。上面的组，带＝100μm，下面的组，带＝50μm。图34C显示定量分析表明，与Fc或模拟-转染的肿瘤相比较，Mm5MT-FGF4-N1ECDFc转染子中的CD31(+)新生血管减少(Mm5MT-FGF4-X和Mm5MT-FGF4-Fc与Mm5MT-FGF4-N1ECDFc相比较，均为P＜0.001；数据显示为平均值±SD)。在接种并用抗CD31抗体染色异种移植物后22天采集。
图35A至35D
这些图显示在人NGP异种移植物中Notch1引诱物表达破坏血管生成和降低肿瘤生存能力。我们已报道在小鼠中这些人神经母细胞瘤异种移植物具有成熟的分级的能相对地耐受VEGF阻断的血管系统(16)。为了检测是否Notch受体激活促进NGP血管生成，我们用Notch1引诱物结构转染NGP细胞，这不会影响它们在培养中生长的能力(数据未图示)。然而，存在有在体内肿瘤生存能力显著降低(图35A)TUNEL＝红色荧光，红细胞＝绿色荧光，带＝100μm)，和(图35B)显著增加的肿瘤细胞凋亡(P＝0.0002，在NGP-NIECDFc的TUNEL阳性细胞与在NGP-LacZ肿瘤的相比较)，和(图35C)增加的肿瘤内出血(p＜0.0001，实质红细胞信号的定量)。而且，与NGP-LacZ对照组相比较，在NGP-NIECDFc异种移植物中的肿瘤血管网络系统似乎已被完全破坏，伴随有(图35D)ECs和VMCs免疫染色(分别采用抗-CD31和αSMA抗体)证明这些血管细胞层缺乏连续性(带＝50μm)。单个血管细胞似乎相互独立。综合起来，这些结果表明Notch1引诱物表达破坏ECs和VMCs的能力以形成稳定的血管，导致肿瘤组织的血管破裂、出血和局部缺血。
图36
该图显示SKOV3肿瘤细胞按程序表达的Notch1引诱物阻止卵巢癌异种移植物的生长。
图37
该图显示由Foxo和Notch调节的成肌细胞分化。C2C12细胞用抗肌球蛋白抗体(绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色。参见组说明的正文。每个实验重复≥六次。
图38A至38C
这些图显示C2C12分化的定量分析。图38A显示在C2C12细胞中表达的肌球蛋白的Western印迹分析。图38B显示肌球蛋白阳性细胞的形态测定分析。分化实验的结果通过采用评分肌球蛋白免疫荧光染色的细胞的数目作为所有DAPI-阳性细胞的百分比来分析。图38C显示DBD-Foxo1ADA报告子基因实验。我们通过采用标准的Foxo1-反应的Igfbpl启动子(左边的组)和Hes1启动子(右边的组)在与Foxo1-ADA或DBD-Foxo1ADA共转染的细胞中进行报告子基因实验。Western印迹(插图)表明两个蛋白质的表达水平是相似的。星号表示方差分析(ANOVA)的P＜0.01。
图39A至39E
这些图显示Foxo1与Cs1共免疫沉淀。a，在与LacZ-(以″-″表示)或Jagged1-表达的HEK293细胞(以″+″表示)共培养的C2C12细胞中内源性Foxo1和Cs1共免疫沉淀。b-c，在与FLAG-Cs1和HA-Foxo1共转染的C2C12细胞中进行共免疫沉淀实验。d-e，在与FLAG-Cs1和截短的突变体Myc-或HA-标记的Δ256Foxo1共转染的C2C12细胞中进行共免疫沉淀实验。
图40A至40D
这些图显示了Foxo1直接结合Cs1。a，GST pull-down assays的带有Cs1的GST-Foxo1融合蛋白从HEK293细胞中免疫共沉淀。b-c，GST-Foxo1在无细胞系统中结合GST-FLAG-Cs1并标测Cs1相互作用域。从细菌和共培养中提纯GST-Foxo1和GST-FLAG/Cs1的全长序列和截短的片段。此后，采用抗FLAG抗体分离Cs1，并通过与抗Foxo1或抗FLAG抗体免疫印迹来分析所述免疫沉淀。d，Hes1启动子ChIP穿过所述Cs1在C2C12细胞的结合位点以便检测内源性Foxo1、Cs1和Notch1(Endog)或接着的在成肌细胞分化期间Foxo1-ADA(Foxo1-ADA)转导。在免疫沉淀前输入代表从染色质提取的DNA。图示了对应每个时间点的Hes1(半定量RT-PCR)和Myosin(Western印迹)表达。0天被定义为当细胞为无血清时诱导成肌细胞融合。缩写：IP：免疫沉淀；IB：免疫印迹；TCL：总的细胞溶胞产物。
图41A和41B
这些图显示Foxo1调节Notch诱导的Hes1、Hes5和Hey1表达。a，通过按指示在Foxo1-ADA或Notch1-IC转导然后Gfp、Foxo1或Cs1siRNA转染的C2C12细胞中通过半定量RT-PCR技术表达Hes1、Hes5和Hey1。b，在Foxo1-ADA、Notch1-IC、Foxo1siRNA、GFP siRNA或对照质粒转导的HEK293细胞中进行Hes1报告子基因实验。我们检测荧光素酶活性并通过β-半乳糖苷酶活性使其符合标准。所述数据代表相对于对照空载体的任意单位。
图42A至42F
这些图显示Foxo1对于Notch结合Hes1启动子并激活Hes1靶基因是必需的。a，在不存在(泳道1-2)和存在(泳道3-4)Cs1 siRNA时，在与LacZ-(由″-″号表示)或Jagged1-表达的HEK293细胞(由″+″号表示)共培养的C2C12细胞中进行内源性的Foxo1和Notch1的ChIP实验。b，在不存在(泳道1-2)和存在(泳道3-4)Foxo1siRNA时，在共培养系统中进行内源性Notch1的ChIP实验。c，Hes1启动子实验，然后在不存在或存在Foxo1或Gfp siRNA时，进行共培养。d，在不存在(泳道1-2)或存在(泳道3-4)Foxo1siRNA时，在共培养系统中进行Ncor和Smrt和Mamll结合Hes1的ChIP实验。e，由半定量RT-PCR技术使MyoD、Myf5和β-肌动蛋白在C2C12细胞中表达。f，Foxo1和Notch调节Hes1启动子的模型。
图43A至43D
这些图显示在骨骼肌中Foxo1的消融。a，Westem印迹分析Foxo1和Foxo4在各种肌肉类型中的表达水平。b，比目鱼肌以及来自Myog-Foxo1小鼠和对照组(lox/lox)同窝仔的跖肌的异染性的和免疫组织化学的分析。c，Myog-Foxo1(实带(sold bars))小鼠和对照小鼠(空白带)的基因表达分析；TropC：肌钙蛋白-C；TropT：肌钙蛋白-T；Mlc：肌球蛋白轻链；Myog：肌细胞生成素；Mck：肌肉型肌酸激酶。三个独立的测量方法的数据表示为±SEM(对每一种基因型n＝6)。星号表示方差分析的P＜0.05。d，八周大的Myog-Foxo1小鼠和lox/lox同窝仔的踏车运动试验(对于每种基因型n＝6)。星号表示方差分析的P＜0.05。
图44
该图显示在C2C12细胞中腺病毒转导的效率。我们用HA-Foxo1-ADA或HA-Notch1-IC腺病毒转导细胞，并用抗-HA抗体(红色)和DAPI(蓝色)进行免疫组织化学。
图45
该图显示抑制转染的Foxo1表达。我们测试Foxo1siRNA的抑制内源性Foxo1(左边组)和转染的Foxo1(右边组)表达和随后的腺病毒转导的能力。
图46
该图显示Foxo1siRNA的特异性。Western印迹分析Foxo1、Foxo3和Foxo4在Foxo1 siRNA转染的C2C12细胞中的表达。
图47
该图显示Foxo1-ADA和Notch1-IC不影响细胞增殖。我们用LacZ、Foxo1-ADA或Notch1-IC腺病毒转导C2C12细胞，用抗-Ki67抗体和DAPI进行免疫组织化学，并通过计数至少1,000个细胞来定量Ki67标记指数作为Ki67阳性细胞的百分比。
图48
该图显示siRNA耐受的Foxo1-ADA。Foxo1siRNA转染的细胞中的Foxo1-ADA和siRNA-耐受的Foxo1-ADA的Western印迹。
图49
该图显示Foxo1-Cs1共免疫沉淀的特异性。我们采用Cs1进行共免疫沉淀实验，然后采用Foxo3或Foxo4表达载体进行共转染。
图50
该图显示Hes1启动子实验。我们采用包含Cs1结合位点的四个串联重复序列的合成的Hes1报告子基因与Foxo1和Notch1-IC在C2C12细胞中进行启动子实验。
图51
该图显示由siRNA抑制Cs1表达。我们通过Western印迹检测Cs1水平，然后用Cs1siRNA在不同浓度转染C2C12细胞。
图52
该图显示人Notch1引诱物的11个组分的示意图。
图53
该图显示Notch 1信号序列分析，以便确定Notch1信号肽末端。图示了采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0Server程序分析预测的结果。结果预示多数的裂解位点位于丙氨酸18(A19)和A19之间，以及少数的裂解位点位于A19和精氨酸20(R20)之间。这两个裂解位点在人Notch1(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列1-20：MPPLLAPLLCLALLPALA/A/R中以″/″表示。人Notch1的核苷酸序列编码的氨基酸1-23为atgccgccgc tcctggcgcc cctgctctgcctggcgctgc tgcccgcgct cgccgcacga ggcccgcga(SEQ ID NO：16)。
图54
该图显示人Hc的信号序列分析用于确定人Hc信号肽末端。MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R(SEQ ID NO：17)。图示了采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0 Server程序分析预测的结果。这些结果预示多数的裂解位点位于丙氨酸21(A21)和精氨酸22(R22)之间。该裂解位点在上述的人Hc(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列1-22中以″/″表示。编码人Hc氨基酸的核苷酸序列为atgtggggct ggaagtgcct cctcttctgg gctgtgctggtcacagccac tctctgcact gccagg(SEQ ID NO：18)。
图55
该图显示在人Notch1的EGF重复序列36后终止的所有构成物的人Notch1/Fc融合序列。
图56
该图显示在人Notch1的EGF重复序列13后终止的所有构成物的人Notch1/Fc融合序列。
图57
该图显示在人Notch1的EGF重复序列23后终止的所有构成物的人Notch1/Fc融合序列。
图58
该图显示在人Notch1的EGF重复序列24后终止的所有构成物的人Notch1/Fc融合序列。
图59A和59B
该图显示人Notch1的全长氨基酸(aa)序列，包括氨基酸残基1(M＝蛋氨酸)至氨基酸残基2555(K＝赖氨酸)(SEQ ID NO：52)。在该序列的氨基酸1-1433中存在有所述信号肽和第一36EGF样重复域。氨基酸1-1433或这些氨基酸中的子集被用于设计在以下的部分描述的人Notch1引诱物蛋白。在这些包括EGF重复序列1-36的氨基酸的下面划线。
图60
该图显示用于在Notch1引诱物蛋白上产生Fc标记的人Fc氨基酸序列(SEQ ID NO：53)。所述人Fc的237个氨基酸在所有Notch1引诱物结构基因的C末端也就是Notch1EGF样重复序列的下游融合。所述人Fc的区域允许Notch引诱物的检测和提纯并可使分泌的人Notch1-人Fc融合蛋白稳定。
图61
该图显示h-Notch1(1-36)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。h-Notch1 (1-36) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-1433的人Notch1的编码EGF样重复序列1-36的氨基酸，然后是(3)包含人HC标记的氨基酸1434-1670。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1670个氨基酸。
图62
该图显示h-Notch1(1-13)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)。h-Notch1 (1-13) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-531的人Notch1的编码EGF样重复序列1-13的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸532-768。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含768个氨基酸。
图63
该图显示h-Notch1(1-24)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。h-Notch1 (1-24) 引透物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-948的人Notch1的编码EGF样重复序列1-24的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸949-1185。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1185个氨基酸。
图64
该图显示h-spNNotch1(9-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)。h-spNNotch1(9-23)引 透物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-594的人Notch1的编码EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸595-831。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含829个氨基酸。
图65
该图显示h-spHCNotch1(9-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。h-spHCNotch1(9-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-593的人Notch1的编码EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包含人HC标记的氨基酸594-830。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含829个氨基酸。
图66
该图显示h-spNNotch1(9-36)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)。缩写spN表示所述人Notch1信号肽用于该组成中。h-spNNotch1(9-36)引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-1118的人Notch1的编码EGF样重复序列9-36的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸1119-1355。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1355个氨基酸。
图67
该图显示h-spHCNotch1(9-36)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch1 (9-36) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-1117的人Notch1的编码EGF样重复序列9-36的氨基酸，然后是(3)包含人HC标记的氨基酸1118-1354。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1354个氨基酸。
图68
该图显示h-spNNotch1(13-24)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)。缩写spN表示所述人Notch1信号肽用于该组成中。h-spNNotch1(13-24)引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-478的人Notch1的编码EGF样重复序列13-24的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸479-715。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含715个氨基酸。
图69
该图显示h-spHCNotch1(13-24)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-spHCNotch1(13-24)引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-477的人Notch1的编码EGF样重复序列13-24的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸478-714。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含714个氨基酸。
图70
该图显示h-spNNotch1(25-36)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：63)。缩写spN表示所述人Notch1信号肽用于该组成中。h-sp N Notch1 (25-36) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)包括氨基酸24-508的人Notch1的编码EGF样重复序列25-36的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸509-745。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含745个氨基酸。
图71
该图显示h-spHCNotch1(25-36)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch1 (25-36) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-507的人Notch1的编码EGF样重复序列25-36的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸508-744。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含744个氨基酸。
图72A和72B
该图显示编码如图61所示的h-Notch1(1-36)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：65)。
图73
该图显示编码如图62所示的h-Notch1(1-13)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：66)。
图74A和74B
该图显示编码如图63所示的h-Notch1(1-24)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ IDNO：67)。
图75
该图显示编码如图64所示的h-spNNotch1(9-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：68)。
图76
该图显示编码如图65所示的h-spHCNotch1(9-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ IDNO：69)。
图77A和77B
该图显示编码如图66所示的h-spNNotch1(9-36)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：70)。
图78A和78B
该图显示编码如图67所示的h-spHCNotch1(9-36)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：71)。
图79
该图显示编码如图68所示的h-spNNotch1(13-24)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：72)。
图80
该图显示编码如图69所示的h-spHCNotch1(13-24)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：73)。
图81
该图显示编码如图70所示的h-spNNotch1(25-36)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：74)。
图82
该图显示编码如图71所示的h-spHCNotch1(25-36)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：75)。
图83
该图显示人Notch4的全长氨基酸(aa)序列，包括氨基酸残基1(M＝蛋氨酸)至氨基酸残基2003(K＝赖氨酸)(SEQ ID NO：76)。在该序列的氨基酸1-1174中存在有所述信号肽和第一29EGF样重复域。氨基酸1-1174或这些氨基酸中的子集被用于设计在以下的部分描述的人Notch4引诱物蛋白。在这些包括EGF重复序列1-29的氨基酸的下面划线。
图84
该图显示用于在Notch4引诱物蛋白上产生Fc标记的人Fc氨基酸序列(SEQ ID NO：77)。这里所示的人Fc的237个氨基酸在所有Notch4引诱物结构基因的C末端也就是Notch4EGF样重复序列的下游融合。所述人Fc的区域允许Notch引诱物的检测和提纯并可使分泌的人Notch4-人Fc融合蛋白稳定。
图85
该图显示h-Notch4(1-29)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：78)。h-Notch4(1-29)引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-1173的人Notch4的编码EGF样重复序列1-29的氨基酸，然后是(3)包含人HC标记的氨基酸1174-1410。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1410个氨基酸。
图86
该图显示h-Notch4(1-13)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：79)。h-Notch4 (1-13) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-554的人Notch4的编码EGF样重复序列1-13的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸555-791。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含791个氨基酸。
图87
该图显示h-Notch4(1-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：80)。h-Notch4 (1-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-933的人Notch4的编码EGF样重复序列1-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸934-1170。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1170个氨基酸。
图88
该图显示h-spNNotch4(9-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：81)。缩写spN表示所述人Notch4信号肽用于该组成中。h-sp N Notch4 (9-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-602的人Notch4的编码EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸603-839。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含839个氨基酸。
图89
该图显示h-spHCNotch4(9-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch4 (9-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-597的人Notch4的编码EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸598-834。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含834个氨基酸。
图90
该图显示h-spNNotch4(9-29)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：83)。缩写spN表示所述人Notch4信号肽用于该组成中。h-sp N Notch4 (9-29) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-843的人Notch4的编码EGF样重复序列9-29的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸844-1080。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1080个氨基酸。
图91
该图显示h-spHCNotch4(9-29)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch4 (9-29) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-838的人Notch4的编码EGF样重复序列9-29的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸839-1075。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含1075个氨基酸。
图92
该图显示h-spNNotch4(13-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：85)。缩写spN表示所述人Notch4信号肽用于该组成中。h-sp N Notch4 (13-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-444的人Notch4的编码EGF样重复序列13-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸445-681。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含681个氨基酸。
图93
该图显示h-spHCNotch4(13-23)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch4 (13-23) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-439的人Notch4的编码EGF样重复序列13-23的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸440-676。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含676个氨基酸。
图94
该图显示h-spNNotch4(21-29)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：87)。缩写spN表示所述人Notch4信号肽用于该组成中。h-sp N Notch4 (21-29) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)包括氨基酸28-392的人Notch4的编码EGF样重复序列21-29的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸393-629。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含629个氨基酸。
图95
该图显示h-spHCNotch4(21-29)引诱物蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。缩写spHC表示所述人HC信号肽用于该组成中。h-sp HC Notch4 (21-29) 引诱物蛋白包括下列三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)包括氨基酸23-387的人Notch4的编码EGF样重复序列21-29的氨基酸，然后是(3)包含人Fc标记的氨基酸388-624。在所述预示的信号肽序列下面划线，所述人Fc标记以下划线和斜体字体表示。该组成包含624个氨基酸。
图96A和96B
该图显示人Notch4的核酸序列(SEQ ID NO：89)。
图97
该图显示人Notch4信号肽序列(SEQ ID NO：90)。具有下划线的序列编码信号肽。
图98
该图显示人HC信号肽(nt 1-66)的核酸序列(SEQ ID NO：91)。
图99
该图显示人FC标记的核酸序列(SEQ ID NO：92)。
图100
该图显示编码h-Notch4(1-29)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：93)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列1-29)[nt 1-3522]。
图101
该图显示编码h-Notch4(1-13)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：94)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列1-13)[nt 1-1662]。
图102
该图显示编码h-Notch4(1-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：95)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列1-23)[nt 1-2799]。
图103
该图显示编码h-spNNotch4(9-29)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：96)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列9-29)[nt 1-81，1075-3522]。
图104
该图显示编码h-spHCNotch4(9-29)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：97)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列9-29)[nt 1075-3522]和HC信号肽[nt 1-66]。
图105
该图显示编码h-spNNotch4(9-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：98)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列9-23)[nt 1-81，1075-2799]。
图106
该图显示编码h-spHCNotch4(9-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：99)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列9-23)[nt 1075-2799]和HC信号肽[nt 1-66]。
图107
该图显示编码h-spNNotch4(13-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ IDNO：100)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列13-23)[nt 1-81，1549-2799]。
图108
该图显示编码h-spHCNotch4(13-23)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：101)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列13-23)[nt 1549-2799]和HC信号肽[nt 1-66]。
图109
该图显示编码h-spNNotch4(21-29)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：102)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列21-29)[nt 1-81，2428-3522]。
图110
该图显示编码h-spHCNotch4(21-29)引诱物蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：103)。人Notch4引诱物(EGF样重复序列21-29)[nt 2428-3522]和HC信号肽[nt 1-66]。
图111
该图显示人Notch4引诱物的11个组分的示意图。
图112
该图显示Notch4的信号序列分析用于确定Notch4信号肽末端。
图113
该图显示在人Notch4的EGF重复序列29后终止的所有构成物的人Notch4/Fc融合序列。
图114
该图显示在人Notch4的EGF重复序列13后终止的所有构成物的人Notch4/Fc融合序列。
图115
该图显示在人Notch4的EGF重复序列23后终止的所有构成物的人Notch4/Fc融合序列。
图116
该图显示Notch4的缺乏降低循环的葡萄糖和胰岛素水平。现在我们分析Notch4(N4)突变型小鼠的血液葡萄糖和胰岛素水平。由N4+/-交配出生的多胎同窝仔在断奶期(P21)给予正常饮食或包括45％卡路里的脂肪的高脂肪饮食。在生长至5个月时，随机从喂养的小鼠或禁食6小时后的小鼠上抽血，检测葡萄糖和胰岛素水平。在雌性小鼠，N4等位基因的减少与不依赖于饮食的循环葡萄糖水平的显著降低相关。相反地，仅在进食正常膳食的雄性小鼠，N4的缺乏与葡萄糖水平降低相关。所有雌性小鼠的胰岛素水平未受影响(数据未图示)。这可能是由于雌性小鼠遗传上保护对抗胰岛素耐药性，因而代谢异常情况相当少。在正常饮食情况下，雄性小鼠的胰岛素水平没有差别。然而，N4abalation与高脂肪饮食喂养的雄性小鼠的随机喂养的胰岛素水平显著降低相关。在禁食6小时后的敲除N4的雄性小鼠上观察到相似的倾向。因此N4的缺失均与正常饮食喂养的雄性和雌性小鼠的血液葡萄糖水平的显著降低相关。在雌性小鼠，在高脂肪饮食喂养的N4突变型雌性小鼠观察到这种葡萄糖水平的降低而不是胰岛素水平的降低。相反，N4敲除雄性小鼠的葡萄糖水平没有变化，而胰岛素水平降低。这些结果与Notch4缺乏保护对抗由于胰岛素信号的破坏导致遗传的和环境型的高血糖症。
图117
该图显示在高脂肪饮食喂养的小鼠，Notch4表达缺失抑制体重增长。
图118
该图显示大鼠Notch1引诱物存在鼠血清中。检测哺乳动物血流中大鼠Notch1引诱物组分的稳定性。Western印迹分析表明全长蛋白质可在小鼠中表达，并且以可检测水平存在，也没有降解的迹象。
图119
该图显示人Notch1引诱物(n-Notch(1-36)引诱物)和大鼠Notch1引诱物阻止小鼠乳房肿瘤生长。这里提供的生长曲线表明大鼠Notch1引诱物或人Notch1引诱物减少裸鼠的肿瘤异种移植物的生长。
图120
该图显示大鼠Notch1引诱物抑制SKNEP1转移到肺组织。SKNEP1尤文氏瘤细胞被安排表达控制Fc蛋白或大鼠Notch1引诱物s1(分类2)或大鼠Notch1引诱物s4(分类4)。这些SKNEP1细胞系被原位移植入裸鼠的肾。在肿瘤生长6周后，对转移到肺进行组织学评价。SKNEP1细胞表达的大鼠Notch1引诱物表明较少的肺组织对转移呈阳性。我们推断在裸鼠中大鼠Notch1引诱物的表达降低了SKNEP1细胞转移到肺的能力。
图121
该图显示Notch1和Notch4与VEGFR-3和LYVE-1在小鼠皮肤的淋巴系统中共表达。分析小鼠P4背部皮肤脉管系统中的Notch1和Notch4的表达。在这个时间点，真皮淋巴管正积极地重新构建成靠近表面的毛细淋巴管和在较低真皮层的集合管。5μm的皮肤的横截面切片被与抵抗Notch1或Notch4(红色)和PECAM、VEGFR-3或LYVE-1(绿色)的抗体共染色。Notch1和Notch4与血液和淋巴管内皮细胞标记物PECAM共享表达的重叠模式(上面的组)。Notch1和Notch4均与VEGFR-3(中间的组)和LYVE-1在真皮脉管系统中共表达(下面的组)。这些表达模式表明Notch1和Notch4被表达并可能在新生儿真皮的淋巴管中起作用。
图122
该图显示在Notch4纯合子基因敲除小鼠中真皮毛细淋巴管的改变。我们测试P4小鼠的真皮淋巴管。野生型和Notch4 nullizygous的切片被与抵抗PECAM和LYVE-1(绿色)的抗体免疫染色。对PECAM染色分析发现在突变型和野生型皮肤之间有相似之处(上面的组)。相反地，在Notch4突变型的真皮中的LYVE-1阳性的导管(vessels)的形态学与野生型的不同(中间的组)。Notch4突变型LYVE-1导管通常是扩张的，而LYVE-1染色的是不连续的(下面的组)。这些结果表明Notch4信号传导可能与淋巴管丛的重构有关。
图123
该图显示Notch4的缺失与LYVE1在鼠真皮淋巴管表达的降低有关。交配Notch4杂合子(N4+/-)小鼠，移去交配产生的小鼠的背部皮肤并在出生后14天的植入。为了内皮细胞标记物PECAM(数据未图示)或淋巴管内皮细胞标记物LYVE1(A)，皮肤的横截面切片被免疫染色。每一个切片的五个区域用显微镜检查，且PECAM和LYVE1染色采用成像软件定量(B，C)。与野生型(WT)真皮相比较，在N4-/-真皮中PECAM表达降低了将近25％(B)。相对于WT小鼠，LYVE-1染色的受影响的程度比PECAM大，在N4-/-真皮中LYVE1染色的降低将近50％(C)。相对于WT，在N4-/-真皮中LYVE1染色的强度也有降低(A)。
图124
该图显示Notch1和Notch4在人乳腺癌淋巴管中表达。我们采用与抵抗VEGFR-3或LYVE-I(绿色)和人乳腺癌的Notch1或Notch4(红色)的抗体进行双重免疫组织化学研究。Notch1和Notch4在人微乳头状乳腺癌的肿瘤外(extratumoral)血液和淋巴管内皮中表达。为确定在肿瘤淋巴管内的Notch1信号传导是否被激活，我们采用与抵抗podoplanin(绿色)和N1Va1(红色；细胞信号)的抗体、特异鉴别激活的Notch1肽的抗体进行双重染色。在大部分淋巴管内皮细胞核(白色箭头)而不是所有的淋巴管内皮细胞核(黄色箭头)观察到激活的Notch1肽的表达(下面的组)。这些结果证明Notch1被激活在病理的淋巴管内传导信号。
发明详述
术语
如本申请中所使用的，除了另有明文规定外，下面将对以下的每一个术语的定义进行解释说明。
“给药”，通过采用本领域一般技术人员所熟知的任意方法作用实现或完成。这些方法包括，例如，局部注射(intralesional)、肌肉注射、皮下注射、静脉注射、腹腔注射、脂质体介导的给药方式、粘膜给药、肠道给药、局部给药、鼻腔给药、口服、肛门给药、经眼部给药或经耳部给药。
“固定”意指通过任何方式连接。在一实施例中，固定表示通过一共价键连接。在另一实施例中，固定表示以非共价键连接。
“氨基酸”“氨基酸残基”和“残基”在这里可互相替换使用，指的是掺入蛋白质、多肽或肽的氨基酸。例如，该氨基酸可以为一天然存在的氨基酸或与天然存在的氨基酸起作用的方式相似的天然氨基酸类似物。
“抗体”包括但不限于(a)一包括两个重链和两个轻链的可识别抗原的免疫球蛋白分子；(b)一多克隆或单克隆免疫球蛋白分子；和(c)其一价或二价片段。免疫球蛋白分子可来源于任何通常已知的种类，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG、IgE和IgM。IgG亚型已为本领域技术人员所熟知，其包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体可以为天然存在的或人工合成的。而且抗体包括嵌合抗体、完全合成的抗体、单链抗体及其片段。抗体可以是人的或非人的。非人的抗体可以通过重组方法人源化(humanized)以降低其对人的免疫原性。抗体片段包括但不限于Fab和Fc片段。在一实施例中，所述“抗体的Fc部分”为一通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而获得的易结晶化片段，该免疫球蛋白包括通过二硫键连接的并被认为是该免疫球蛋白的效应区域的两个重链的C末端的一半。在另一个实施例，“一抗体的Fc部分”表示所有的或实质上所有的一重链的C末端的一半。
“人源化的”，涉及抗体，表示一抗体，其中一些、大部分或所有在所述CDR区域外的氨基酸可用来源于人免疫球蛋白分子的相应的氨基酸置换。允许少量增加、缺失、插入、置换或修饰氨基酸，条件是它们不能消除该抗体结合给定的抗原的能力。适当的人免疫球蛋白分子包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。已有各种公布出版物描述了如何制备人源化的抗体，例如，专利号分别为4,816,567、5,225,539、5,585,089和5,693,761的美国专利和国际公布号为WO 90/07861的PCT国际申请。
本申请中所使用的术语“组合物”，与药用组合物一样，是为了包含一包括有效成分和组成载体的非有效成分的产品，以及任何直接或间接通过联合、络合或聚集所述成分中的任意两种或两种以上、或通过分离所述成分中的一种或一种以上、或通过所述成分中的一种或一种以上的其它类型的反应或相互作用来起效果的产品。
本申请中所使用的“有效量”是指能治疗患有肿瘤、疾病或机能紊乱的患者的量。因此，所述有效量将根据治疗的患者以及治疗的条件而改变。本领域普通技术人员可通过常规滴定实验来确定该有效量。化合物的有效量将根据患者和特定的给药途径而改变。根据化合物，所述量可通过例如通过连续泵或在定期间隔被连续递送(例如一次或多次间隔)。在没有由本领域技术人员做过多的实验的情况下，仍可以确定特定化合物的多次用量的需要的时间间隔。在一实施例中，所述有效量是1μg/kg-10mg/kg。在另一实施例中，所述有效量是10μg/kg-1mg/kg。在另一实施例中，所述有效量是100μg/kg。
本申请中所使用的与Notch受体有关的“胞外域”是指Notch的所有或一部分，其(i)存在细胞外(即不是以跨膜部分或细胞内部分的形式存在)和(ii)结合完整的Notch受体蛋白结合的胞外配体。Notch的胞外域可任选地包括一信号肽。“胞外域”、“ECD”和“外功能区”是同义词。
“半衰期增加部分”是指一部分当其被可操作连接到一第二部分时，提高所述第二部分的体内半衰期。半衰期增加部分包括例如抗体的Fc部分、糖基化标记(即糖基化多肽)、聚乙二醇(PEG)、连接了PEG的多肽和脂质修饰的多肽。
“抑制”紊乱或不需要的生物过程的发作是指减少所述紊乱或所述不需要的生物过程的发作的可能性，或完全阻止所述紊乱或所述不需要的生物过程的发作。在一优选实施例中，抑制紊乱或不需要的生物过程的发作是指完全阻止它的发作。
“Notch”、“Notch蛋白”和“Notch受体蛋白”是同义词。另外，术语“基于Notch的融合蛋白”和“Notch引诱物”是同义词。以下的Notch氨基酸序列为已知的，并在此以引用的方式合并入本申请：Notch1(Genbank登记号S18188(大鼠))；Notch2(Genbank登记号NP_077334(大鼠))；Notch3(Genbank登记号Q61982(小鼠))；和Notch3(Genbank登记号T09059(小鼠))。下列Notch核酸序列为已知的并在此以引用的方式合并入本申请：Notch1(Genbank登记号XM_342392(大鼠)和NM_017617(人))、Notch2(Genbank登记号NM_024358(大鼠)，M99437(人和AF308601(人))、Notch3(Genbank登记号NM_008716(小鼠)和XM_009303(人))、和Notch4(Genbank登记号NM_010929(小鼠)和NM_004557(人))。
本申请所使用的术语“核酸”、“多聚核苷酸”和“核酸序列”是可互相替换的，它们中的每一个是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可以是其天然存在的或合成的类似物。“核酸”是指任何核酸，包括但不限于DNA、RNA和其杂种。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域所熟知的，并在PCR系统、试剂和消耗品中进行举例说明(Perkin Elmer Catalogue1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，New Jersey，USA)。核酸包括但不限于反义分子和催化核酸分子例如核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。根据对一个或多个的共同具有天然存在结构的一些或所有性质的氨基酸残基(包含少于所有的特定残基的缺失类似物(deletion analogs)；替代类似物，其中一个或多个残基被一个或多个残基替代；和其它类似物，其中一个或多个残基被加到所述肽的末端或中间部分)的鉴定，核酸也包括编码与天然存在形式不同的肽的类似物、片段或衍生物的核酸。
“可操作连接”是指，涉及连接到一第二部分的一第一部分，以允许第一部分起作用(例如结合性能)的方式连接，正如它不是这样连接的那样。
这里所使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以相互替换，它们中的每一个是指氨基酸残基的聚合物。氨基酸残基可以是其天然存在的或化学合成的类似物。多肽、肽和蛋白质也可以包括修饰物例如糖基化、脂质连接、硫酸盐化、羟基化和ADP-核糖基化修饰物。
本申请所使用的“可药用载体”是指与该制剂中的其他成分相容的载体，并对其接受者没有毒性，并包括任何标准的可药用载体。所述载体包括例如0.01-0.1M和优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。因此，所述可药用载体可以是水溶液或非水溶液、悬浮剂和乳剂。非水溶液的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射有机酯例如油酸乙酯。水溶液载体包括水、醇/水溶液、乳剂和悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道给药的载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏和不挥发性油。静脉注射的载体包括液体(fluid)和营养素补充剂(nutrient replenishers，)、电解质补充剂例如那些基于林格氏葡萄糖的补充剂等。也可以存在防腐剂和其他添加剂例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。
“患者”是指任何有机体包括但不限于哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、白鼬、兔和灵长类动物。在一优选实施例中，所述患者为人类。
“治疗”是指减缓、阻止或反转疾病或紊乱的发展。本申请所使用的“治疗”也是指改善与疾病或紊乱相关的症状。疾病包括但不限于肿瘤血管生成、动脉粥样硬化、伤口愈合、黄斑变性、早产导致的视网膜病变、先兆子痫、糖尿病性视网膜病、局部缺血、中风、心血管疾病、银屑病、淋巴水肿、肿瘤发生和肿瘤淋巴管生成。
在伤口愈合过程、女性月经周期和子宫内膜重塑期间以及在胚胎发育和器官生长期间出现血管生成。在病理环境下，血管生成在不同的疾病像类风湿性关节炎、银屑病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病和肿瘤生长中起重要作用。
在体内有大量的证据包括临床观察证明许多疾病都涉及到异常血管生成，这些疾病包括类风湿性关节炎、炎症、癌症、银屑病、退行性眼部疾病及其它的疾病。
需要采用Notch融合蛋白的其他疾病是代谢性疾病例如但不限于糖尿病、肥胖症、糖尿病前期、动脉粥样硬化、局部缺血、中风、心血管疾病、胰岛素表达调节和胰岛素功能的调节。
Notch融合蛋白的使用也适用于代谢综合征，所述代谢综合征是指增加患者心血管疾病和糖尿病的风险的医疗疾病的组合。其他已知的涉及所述综合征的名称是综合征X、胰岛素耐受性综合征、雷文氏综合征。所述综合征的一些特征包括：空腹高血糖、高血压、向心性肥胖(又名内脏肥胖)、减少的高密度脂蛋白(LDL)、高甘油三酯、高尿酸水平。上述空腹高血糖包括II型糖尿病或空腹葡萄糖降低和葡萄糖耐量降低或胰岛素耐受量降低。除了代谢综合征外，Notch引诱物可适用于糖尿病前期。
单位、前缀和符号可表示在它们的SI接受的结构中。除非其它指示，核酸序列以5′到3′的方向从左向右书写，氨基酸序列以氨基末端到羧基末端的方向从左向右书写。在这里氨基酸可以由它们通常已知的三个字母符号表示或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母符号表示。核苷酸同样可以由它们通常被接受的单个字母代码表示。
本申请使用下列缩写：ECD：胞外域；IC：胞内域；NECD/Fc：基于Notch的融合蛋白；N1：Notch1；N2：Notch2；N3：Notch3；N4：Notch4；Dll：Delta样；EC：内皮细胞；FGF：成纤维细胞生长因子；FGFR：成纤维细胞生长因子受体；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；m.o.i.：多重感染；VMC：血管周细胞；VEGF：血管内皮细胞生长因子；VEGFR：血管内皮细胞生长因子受体；sp：信号肽；PDGF：血小板衍生的生长因子；PDGFR：血小板衍生的生长因子受体；P1GF：胎盘生长因子。
发明实施方式
本发明提供一包括一信号肽、一人Notch受体蛋白的胞外域和一结合到其的抗体的Fc部分的融合蛋白。
在所述融合蛋白的第一实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch1受体蛋白。在一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-36。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-13。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-24。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-23。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-36。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列13-24。在另一实施例中，Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列25-36。
在所述融合蛋白的第二实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。
在所述融合蛋白的第三实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。
在所述融合蛋白的第四实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。在一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-29。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-13。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-23。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-23。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-29。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列13-23。在另一实施例中，Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列21-29。
在所述融合蛋白的一实施例中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
在所述融合蛋白的一实施例中，所述信号肽是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的信号肽或一抗体的Hc(HC；重链)部分。
在一实施例中，所述融合蛋白包括连续的氨基酸，其序列如SEQ ID NO：54所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：55所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：56所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：57所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：58所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：59所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：60所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：61所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：62所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ IDNO：63所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：64所示。
在一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：65所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：66所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：67所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：68所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：69所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：70所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：71所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：72所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：73所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：74所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ IDNO：75所示。
在一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：78所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：79所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：80所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：81所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：82所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：83所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ IDNO：84所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ IDNO：85所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：86所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：87所示。在另一实施例中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，其序列如SEQ ID NO：88所示。
在一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：89所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：90所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：91所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：92所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：93所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：94所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：95所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：96所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：97所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：98所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ IDNO：99所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：100所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：101所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：102所示。在另一实施例中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，其序列如SEQ ID NO：103所示。
本发明提供一种用于治疗患有肿瘤的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的上述融合蛋白，从而治疗所述患有肿瘤的患者。
本发明提供一种用于抑制患者的血管生成的方法，包括给患者施予能有效抑制所述患者的血管生成的有效量的上述融合蛋白，从而抑制所述患者的血管生成。
本发明提供一种用于治疗患有卵巢癌的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的上述融合蛋白，从而治疗所述患有卵巢癌的患者。
本发明提供一种用于治疗患有代谢紊乱的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的上述融合蛋白，从而治疗所述患有代谢紊乱的患者。在一实施例中，所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、局部缺血、中风或心血管疾病。
本发明提供所述融合蛋白在制备用于治疗患有肿瘤的患者的药物组合物中的用途。
本发明提供所述融合蛋白在制备用于抑制患者的血管生成的药物组合物中的用途。
本发明提供所述融合蛋白在制备用于治疗患有卵巢癌的患者的药物组合物中的用途。
本发明提供所述融合蛋白在制备用于治疗患有代谢紊乱的患者的药物组合物中的用途。在一实施例中，所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、局部缺血、中风或心血管疾病。
本发明提供一种用于抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的有效量的上述融合蛋白。在一实施例中，所述病理的淋巴管生成是肿瘤淋巴管生成或可能依赖于肿瘤淋巴管生成的淋巴结转移。
本发明提供一种用于抑制患者的肿瘤转移的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的肿瘤转移的有效量的上述融合蛋白。在一实施例中，所述转移通过血管、淋巴管系统或淋巴结发生。肿瘤转移是肿瘤从一种器官播散到另一种邻近的器官。
本发明提供一种用于抑制患者中的继发性瘤的生长的方法，包括给患者施予能有效抑制患者中的继发性瘤的生长的有效量的上述融合蛋白。也可以是抑制与继发性瘤或转移性瘤相关的肿瘤血管生成。在一实施例中，所述继发性瘤的生长是通过抑制与继发性瘤相关的血管生成而被抑制。
本发明提供一种用于抑制患者的肿瘤共选择的血管的方法，包括给患者施予能有效抑制患者中的肿瘤共选择的血管的有效量的上述融合蛋白。血管共选择的过程是一肿瘤细胞由此与预成的血管相关和伴随着共选择的血管的协助的生长的过程。肿瘤在共选择的血管的生长可以是缺少、早于或结合肿瘤血管生成。
本发明提供一种用于治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予上述融合蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，所述融合蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂中的每一个的给药量为能有效治疗患者癌症的有效量。在一实施例中，所述VEGF抑制剂为VEGF-A抑制剂、P1GF抑制剂、VEGF-B抑制剂、VEGF-C抑制剂或VEGF-D抑制剂。VEGF抑制剂的例子包括但不限于贝伐单抗、PTK787、Bay43-9006、SU11248、AG013676、ZD6474、VEGF-trap和抗VEGFR2。对所述抑制剂的例子的更全面的描述已在Ferrara等，(2004)Nature ReviewsDrug Discovery，Vol.3：391-400和Ellis等.(2008)Nature Reviews Cancer Vol 8：579-591中公开，公开的内容在此以引用的方式合并入本申请中。
本发明提供一种用于治疗患者癌症的方法，包括给患者施予上述融合蛋白和VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3抑制剂，所述融合蛋白和VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3抑制剂中的每一个的给药量为能有效治疗患者癌症的有效量。在一实施例中，所述抑制剂的以VEGFR的一种或一种以上作为靶点。
本发明提供一种用于治疗患者癌症的方法，包括给患者施予上述融合蛋白和血小板衍生的生长因子(PDGF)抑制剂，所述融合蛋白和血小板衍生的生长因子抑制剂中的每一个的给药量为能有效治疗患者癌症的有效量。在一实施例中，所述血小板衍生的生长因子抑制剂是PDGF-A抑制剂或PDGF-B抑制剂。
本发明提供一种用于治疗患者癌症的方法，包括给患者施予上述融合蛋白和PDGF受体拮抗剂，所述融合蛋白和PDGF受体拮抗剂中的每一个的给药量为能有效治疗患者癌症的有效量。在一实施例中，所述PDGF受体拮抗剂是一PDGF受体-B拮抗剂。
本发明提供一种用于治疗患者癌症的方法，包括给患者施予上述融合蛋白和HER2/neu抑制剂，所述融合蛋白和HER2/neu抑制剂中的每一个的给药量为能有效治疗患者癌症的有效量。
本发明提供一种用于治疗患者的血管增殖性视网膜病的方法，包括给患者施予能有效治疗血管增殖性视网膜病的有效量的上述融合蛋白。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述血管增殖性视网膜病是糖尿病性视网膜病、黄斑变性(defernation)或早产儿视网膜病。
本发明也提供一种用于治疗患有肿瘤的患者的第一方法，包括给患者施予有效量的组合物，所述组合物包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch受体蛋白胞外域，以便由此治疗该患者。
本发明也提供一种用于抑制患者血管生成的第二方法，包括给患者施予有效量的组合物，所述组合物包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch受体蛋白胞外域，以便由此抑制该患者的血管生成。
在上述方法中的第一实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch1受体蛋白。在一实施例中，所述Notch1受体蛋白是人Notch1受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述方法中的第二实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。在一实施例中，所述Notch2受体蛋白是人Notch2受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述方法中的第三实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。在一实施例中，所述Notch3受体蛋白是人Notch3受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述方法中的第四实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。在一实施例中，所述Notch4受体蛋白是人Notch4受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述方法中的第五实施例中，所述患者是一哺乳动物。在一实施例中，所述哺乳动物是人类。
在上述方法中的第六实施例中，所述血管生成是肿瘤血管生成。
在所述第二种方法的另一实施例中，所述患者患有肿瘤。在另一实施例中，所述患者患有病理的血管增生。在一实施例中，所述病理的血管增生是良性血管瘤。在另一实施例中，所述患者患有淋巴管增生疾病。
本发明提供一种第一组合物，所述第一组合物包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch4受体蛋白的胞外域。在一实施例中，所述胞外域是共价连接到所述半衰期增加部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
本发明还提供一种第二组合物，所述第二组合物包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch4受体蛋白的胞外域和一可药用载体。
本发明还提供一制备物品(article ofmanufacture)，所述制备物品包括(i)包含有一包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch受体蛋白的胞外域的组合物的包装材料以及(ii)一表明所述组合物可以用于通过抑制患者血管生成而治疗患有肿瘤或其它可治疗的紊乱的患者的标签。
在上述制备物品的一第一实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch1受体蛋白。在一实施例中，所述Notch1受体蛋白是人Notch1受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述制备物品的一第二实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。在一实施例中，所述Notch2受体蛋白是人Notch2受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述制备物品的一第三实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。在一实施例中，所述Notch3受体蛋白是人Notch3受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述制备物品的一第四实施例中，所述Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。在一实施例中，所述Notch4受体蛋白是人Notch4受体蛋白。在另一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述抗体的Fc部分是一人抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述胞外域和所述半衰期增加部分是位于所述相同的多肽链内。
在上述制备物品的另一实施例中，所述组合物是与一可药用载体混合。在一最后实施例中，所述患者是人类。
本发明提供一种编码多肽的可复制载体，包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch4受体蛋白的胞外域。在一实施例中，所述半衰期增加部分是一抗体的Fc部分。在另一实施例中，所述载体包括但不限于质粒、粘粒、逆转录病毒、腺病毒、λ-噬菌体或YAC。
本发明还提供一种宿主载体，包括一种编码多肽的可复制载体，所述可复制载体包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch受体蛋白的胞外域和一合适的宿主细胞。在一实施例中，所述宿主细胞是真核细胞。在另一实施例中，所述真核细胞是CHO细胞。在另一实施例中，所述真核细胞是HeLa细胞。在另一实施例中，所述宿主细胞是细菌细胞。
最后，本发明提供一制备多肽的第三种方法，包括在允许制备所述多肽的条件下培养一宿主载体系统，所述宿主载体系统包括一编码包括可操作连接到一半衰期增加部分的Notch受体蛋白胞外域的多肽的可复制载体，以及一合适的宿主细胞，并收集由此制备的多肽。
本发明将在以下实验细节部分进行图解说明。该部分的说明是为了帮助理解本发明，但不是为了和将不被解释为以任何方式限制如在其后的权利要求书所阐述的本发明。
实验详述
第一系列实验
人Notch1融合蛋白(Notch引诱物)
采用编码信号肽的序列、包括EGF样重复序列区域的所有或一亚型的Notch1胞外域的一部分以及所述人Fc蛋白的一部分(氨基酸1-237)组装所述Notch1引诱物。在图59中提供所述人Notch1的完整的全长序列。
所采用的信号肽是天然的Notch1信号肽或人Hc信号肽，它们中的每一个被融合到Notch1的区域。所述信号肽允许分泌Notch引诱物蛋白。
所采用的Notch1胞外域被设计结合Notch配体，并包括所述人Notch1蛋白的36EGF样重复序列区域的所有或一亚型。
所述Fc标记融合到人Notch1的给定的EGF样重复序列的C末端，并用于允许提纯、检测和稳定Notch1引诱物蛋白。
所述人Notch1引诱物，十一个组分，的总体设计是为了编码：(1)一信号肽以允许在用于制备所述蛋白的真核细胞的胞外介质中分泌Notch1引诱物蛋白，(2)人Notch1EGF样重复序列的所有或一部分的胞外域的一部分，以允许联合Notch配体，以及(3)人Fc蛋白的一部分以允许检测。
以下人Notch1引诱物的十一个组分将在图52中描述和图示。
1)h-Notch1(1-36)引诱物       (图52的N1-1)
2)h-Notch1(1-13)引诱物       (图52的N1-2)
3)h-Notch1(1-24)引诱物       (图52的N1-3)
4)h-spNNotch1(9-23)引诱物    (图52的N1-4)
5)h-spHCNotch1(9-23)引诱物   (图52的N1-5)
6)h-spNNotch1(9-36)引诱物    (图52的N1-6)
7)h-spHCNotch1(9-36)引诱物   (图52的N1-7)
8)h-spNNotch1(13-24)引诱物   (图52的N1-8)
9)h-spHCNotch1(13-24)引诱物  (图52的N1-9)
10)h-spNNotch1(25-36)引诱物  (图52的N1-10)
11)h-spHCNotch1(25-36)引诱物 (图52的N1-11)
人Notch1序列
在图59中图示包括氨基酸残基1(M＝蛋氨酸)到氨基酸残基2555(K＝赖氨酸)的人Notch1的全长氨基酸(aa)序列。所述信号肽和第一36EGF样重复序列区域存在于所述序列的氨基酸1-1433内。氨基酸1-1433或这些氨基酸的子集被用于设计人Notch1引诱物蛋白，这在随后的部分进行描述。所述包括EGF重复序列1-36的氨基酸用下划线强调。
用于在Notch1引诱物蛋白上产生Fc标记的人Fc序列
如图60所示，所述人Fc的237氨基酸被融合在所有Notch1引诱物结构的C末端，也就是Notch1EGF样重复序列的下游区。所述人Fc的区域允许检测和提纯所述Notch引诱物并用于稳定所述分泌的人Notch1-人Fc融合蛋白。
在Notch1引诱物蛋白中使用的信号肽
两个不同的信号肽序列被掺合到所述人Notch1引诱物蛋白的设计中。所述第一个是预计包括人Notch1的氨基酸1-20的所述人Notch1信号肽。通过采用由丹麦技术大学提供的SignalIP 3.0 Server程序进行该测定实验。所述第二个是预计包括人IgG重链(HC)信号肽的氨基酸1-22的人Hc信号肽。
1、人Notch1信号肽(氨基酸1-20)
MPPLLAPLLCLALLPALA/A/R(SEQ ID NO：16)
在图53中图示所述预计的人Notch1信号肽的氨基酸序列。在图53中图示了采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0Server分析预计结果。这些结果预示分裂的主要位点位于丙氨酸18(A18)和丙氨酸19(A19)之间以及分裂的次要位点位于A19和精氨酸20(R20)之间。这两个分裂位点在上面提供的人Notch1的氨基酸序列1-20中以“/”表示。
2、在采用所述信号序列的Notch1引诱物中采用的人Notch1信号肽融合肽(氨基酸1-23)
为了证实所述Notch1信号肽被充分利用，在所述人Notch1引诱物中提供在所述预示的分裂的次要位点外的三个其它氨基酸。因此在掺入Notch1信号肽的所述人Notch1引诱物组分中采用的氨基酸序列包括如下所示的在预示的信号肽分裂位点和Notch1EGF样重复序列之间的甘氨酸-脯氨酸-精氨酸(GPR-粗体/下划线)。
MPPLLAPLLCLALLPALAARGPR(SEQ ID NO：130)
3、人HC信号肽(氨基酸1-22)
所述预示的人Hc信号肽的氨基酸序列是MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R(SEQ IDNO：18)。采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0Server分析的预示结构如上所示。这些结果预示分裂的主要位点位于丙氨酸21(A21)和精氨酸22(22)之间。该分裂位点在上面提供的人Hc的氨基酸序列1-22中以“/”表示。
h-Notch1 (1-36) 引诱物
h-Notch1(1-36)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列1-36的人Notch1引诱物(图52的N1-1)。
图示在图61中的h-Notch1(1-36)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-1433的人Notch1的EGF样重复序列1-36的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸1434-1670。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1670个氨基酸。
h-Notch1 (1-13) 引诱物
h-Notch1(1-13)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列1-13的人Notch1引诱物(图52的N1-2)。
图示在图62中的h-Notch1(1-13)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-531的人Notch1的EGF样重复序列1-13的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸532-768。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括768个氨基酸。
h-Notch1 (1-24) 引诱物
h-Notch1(1-24)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列1-24的人Notch1引诱物(图52的N1-3)。
图示在图63中的h-Notch1(1-24)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-948的人Notch1的EGF样重复序列1-24的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸949-1185。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1185个氨基酸。
h-sp N Notch1 (9-23) 引诱物
h-spNNotch1(9-23)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列9-23的人Notch1引诱物(图52的N1-4)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch1信号肽。
图示在图64中的h-spNNotch1(9-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-593的人Notch1的EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸594-830。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括830个氨基酸。
h-sp HC Notch1 (9-23) 引诱物
h-spHCNotch1(9-23)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列9-23的人Notch1引诱物(图52的N1-5)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
图示在图65中的h-spHCNotch1(9-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-592的人Notch1的EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸593-829。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括829个氨基酸。
h-sp N Notch1 (9-36) 引诱物
h-spNNotch1(9-36)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列9-36的人Notch1引诱物(图52的N1-6)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch1信号肽。
图示在图66中的h-spNNotch1(9-36)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-1118的人Notch1的EGF样重复序列9-36的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸1119-1355。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1355个氨基酸。
h-sp HC Notch1 (9-36) 引诱物
h-spHCNotch1(9-36)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列9-36的人Notch1引诱物(图52的N1-7)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
图示在图67中的h-spHCNotch1(9-36)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-1117的人Notch1的EGF样重复序列9-36的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸1118-1354。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1354个氨基酸。
h-sp N Notch1 (13-24) 引诱物
h-spNNotch1(13-24)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列13-24的人Notch1引诱物(图52的N1-8)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch1信号肽。
图示在图68中的h-spNNotch1(13-24)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-478的人Notch1的EGF样重复序列13-24的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸479-715。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括715个氨基酸。
h-sp HC Notch1 (13-24) 引诱物
h-spHCNotch1(13-24)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列13-24的人Notch1引诱物(图52的N1-9)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
图示在图69中的h-spHCNotch1(13-24)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-477的人Notch1的EGF样重复序列13-24的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸478-714。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括714个氨基酸。
h-sp N Notch1 (25-36) 引诱物
h-spNNotch1(25-36)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列25-36的人Notch1引诱物(图52的N1-10)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch1信号肽。
图示在图70中的h-spNNotch1(25-36)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch1的氨基酸1-23的人Notch1信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸24-508的人Notch1的EGF样重复序列25-36的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸509-745。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括745个氨基酸。
h-sp HC Notch1 (25-36) 引诱物
h-spHCNotch1(25-36)引诱物表示包括Notch1的EGF样重复序列25-36的人Notch1引诱物(图52的N1-11)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
图示在图71中的h-spHCNotch1(25-36)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-507的人Notch1的EGF样重复序列25-36的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸508-744。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括744个氨基酸。
方法
构建人Notch1引诱物
来源于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的总RNA用于产生所述人Notch1引诱物变异体。总RNA与M-MLV逆转录酶和任意的六聚体引物或一Notch1引诱物特异引物逆转录。然后合成的cDNA与Notch1引诱物特异的上游(有义)和下游(反义)引物扩增。
下游引物编码将结合Fc序列中的Bg1II位点以产生一人Notch1/Fc嵌合体框架的在5′末端的BamHI或Bg1II限制位点。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列36后产生融合蛋白的Notch1引诱物，一Bg1II位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch1，图4)。这适用于组分：h-Notch1(1-36)引诱物、h-spNNotch1(9-36)引诱物、h-spHCNotch1(9-36)引诱物、h-spNNotch1(25-36)引诱物、h-spHCNotch1(25-36)引诱物。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列13后产生融合蛋白的Notch1引诱物，一BamHI位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch1，图5)。这适用于组分h-Notch1(1-13)引诱物。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列23后产生融合蛋白的Notch1引诱物，一Bg1II位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch1，图6)。这适用于组分h-spNNotch1(9-23)引诱物、h-spHCNotch1(9-23)引诱物。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列24后产生融合蛋白的Notch1引诱物，一Bg1II位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch1，图7)。这适用于组分h-Notch1(1-24)引诱物、h-spNNotch1(13-24)引诱物、h-spHCNotch1(13-24)引诱物。
扩增的PCR产物被亚克隆到pBluescript SK II Fc以产生不同的人Notch1/Fc嵌合体。然后为了表达和提纯人Notch1引诱物蛋白，所述人Notch1/Fc引诱物序列被穿梭进哺乳动物表达载体(pAd-lox、pCCL、pcDNA3)。
人Notch4融合蛋白(Notch引诱物)
采用序列编码的信号肽、包括EGF样重复域的所有或一子集的Notch4胞外域的一部分和人Fc蛋白的一部分(氨基酸1-237)组装所述Notch4引诱物。图83中显示了人Notch4的完整的全长序列。
所采用的信号肽是天然的Notch4信号肽或人Hc信号肽，它们中的每一个均与Notch4的一区域融合。所述信号肽允许分泌所述Notch1引诱物蛋白。
所采用的Notch4胞外域被设计用于结合Notch配体，且Notch4胞外域包括所述人Notch4蛋白的29EGF样重复序列域的所有或一子集。
所述Fc标记融合到给定的人Notch4的EGF样重复序列的C-末端，并用于允许提纯、检测和稳定所述Notch4引诱物蛋白。
人Notch4引诱物，十一个组分，的总体设计是为了编码：(1)一信号肽一允许在用于制备所述蛋白的真核细胞胞外介质中分泌Notch4引诱物蛋白，(2)人Notch4EGF样重复序列的所有或一部分的胞外域的一部分，以允许联合Notch配体，以及(3)人Fc蛋白的一部分以允许检测。
以下人Notch4引诱物的十一个组分将在图111中描述和图示。
1)h-Notch4(1-29)引诱物 (图111的N4-1)
2)h-Notch4(1-13)引诱物 (图111的N4-2)
3)h-Notch4(1-23)引诱物 (图111的N4-3)
4)h-spNNotch4(9-23)引诱物    (图111的N4-4)
5)h-spHCNotch4(9-23)引诱物   (图111的N4-5)
6)h-spNNotch4(9-29)引诱物    (图111的N4-6)
7)h-spHCNotch4(9-29)引诱物   (图111的N4-7)
8)h-spNNotch4(13-23)引诱物   (图111的N4-8)
9)h-spHCNotch4(13-23)引诱物  (图111的N4-9)
10)h-spNNotch4(21-29)引诱物  (图111的N4-10)
11)h-spHCNotch4(21-29)引诱物 (图111的N4-11)
人Notch4序列
在图83中图示包括氨基酸残基1(M＝蛋氨酸)到氨基酸残基2003(K＝赖氨酸)的人Notch4的全长氨基酸(aa)序列。所述信号肽和第一29EGF样重复序列区域存在于所述序列的氨基酸1-1174内。氨基酸1-1174或这些氨基酸的子集被用于设计人Notch4引诱物蛋白，这在随后的部分进行描述。所述包括EGF重复序列1-29的氨基酸用下划线强调。
用于在Notch4引诱物蛋白上产生Fc标记的人Fc序列
如图84所示，所述人Fc的237氨基酸被融合在所有Notch4引诱物结构的C末端，也就是Notch4 EGF样重复序列的下游区。所述人Fc的区域允许检测和提纯所述Notch引诱物并用于稳定所述分泌的人Notch4-人Fc融合蛋白。
在Notch4引诱物蛋白中使用的信号肽
两个不同的信号肽序列被掺合到所述人Notch4引诱物蛋白的设计中。所述第一个是预计包括人Notch4的氨基酸1-24的所述人Notch4信号肽。通过采用由丹麦技术大学提供的SignalIP 3.0Server程序进行该测定实验。所述第二个是预计包括人HC的氨基酸1-22的人Hc信号 肽。
1、人Notch4信号肽(氨基酸1-24)
MQPPSLLLLLLLLLLLCVSVVRP/R(SEQ ID NO：104)
在图112中图示所述预计的人Notch4信号肽的氨基酸序列。在图112中图示了采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0Server分析预计结果。这些结果预示分裂的一位点位于脯氨酸23(A23)和精氨酸24(R24)之间。该分裂位点在上面提供的人Notch4的氨基酸序列1-24中以“/”表示。
2、在采用所述信号序列的Notch4引诱物中采用的人Notch4信号肽融合肽(氨基酸1-27)
为了证实所述Notch4信号肽被充分利用，在所述人Notch4引诱物中提供在所述预示的分裂的次要位点外的三个其它氨基酸。因此在掺入Notch4信号肽的所述人Notch4引诱物组分中采用的氨基酸序列包括在预示的信号肽分裂位点和Notch4EGF样重复序列之间的甘氨酸-脯氨酸-精氨酸(GLL-粗体/下划线)。
MQPPSLLLLLLLLLLLCVSVVRPRGLL(SEQ ID NO：131)
3、人HC信号肽(氨基酸1-22)
所述预示的人Hc信号肽的氨基酸序列是MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R(SEQ IDNO：17)。采用由丹麦技术大学在线提供的Signal IP 3.0Server分析的预示结构如上所示。这些结果预示分裂的主要位点位于丙氨酸21(A21)和精氨酸22(22)之间。该分裂位点在上面提供的人Hc的氨基酸序列1-22中以“/”表示。
h-Notch4 (1-29) 引诱物
h-Notch4(1-29)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列1-29的人Notch4引诱物(图111的N4-1)。
h-Notch4(1-29)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-1173的人Notch4的EGF样重复序列1-29的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸1174-1410。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1410个氨基酸。
h-Notch4 (1-13) 引诱物
h-Notch4(1-13)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列1-13的人Notch4引诱物(图111的N4-2)。
h-Notch4(1-13)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-554的人Notch4的EGF样重复序列1-13的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸555-791。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括791个氨基酸。
h-Notch4 (1-23) 引诱物
h-Notch4(1-23)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列1-23的人Notch4引诱物(图111的N4-3)。
h-Notch4(1-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-933的人Notch4的EGF样重复序列1-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸934-1170。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1170个氨基酸。
h-sp N Notch4 (9-23) 引诱物
h-spNNotch4(9-23)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列9-23的人Notch4引诱物(图111的N4-4)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch4信号肽。
h-spNNotch4(9-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-602的人Notch4的EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸603-839。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括839个氨基酸。
h-sp HC Notch4 (9-23) 引诱物
h-spHCNotch4(9-23)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列9-23的人Notch4引诱物(图111的N4-5)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
h-spHCNotch4(9-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-597的人Notch4的EGF样重复序列9-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸598-834。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括834个氨基酸。
h-sp N Notch4 (9-29) 引诱物
h-spNNotch4(9-29)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列9-29的人Notch4引诱物(图111的N4-6)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch4信号肽。
h-spNNotch4(9-29)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括入Notch4氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-843的人Notch4的EGF样重复序列9-29的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸844-1080。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1080个氨基酸。
h-sp HC Notch4 (9-29) 引诱物
h-spHCNotch4(9-29)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列9-29的人Notch4引诱物(图111的N4-7)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
h-spHCNotch4(9-29)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-838的人Notch4的EGF样重复序列9-29的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸839-1075。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括1075个氨基酸。
h-sp N Notch4 (13-23) 引诱物
h-spNNotch4(13-23)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列13-23的人Notch4引诱物(图111的N4-8)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch4信号肽。
h-spNNotch4(13-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-444的人Notch4的EGF样重复序列13-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸445-681。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括681个氨基酸。
h-sp HC Notch4 (13-23) 引诱物
h-spHCNotch4(13-23)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列13-23的人Notch4引诱物(图111的N4-9)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
h-spHCNotch4(13-23)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-439的人Notch4的EGF样重复序列13-23的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸440-676。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括676个氨基酸。
h-sp N Notch4 (21-29) 引诱物
h-spNNotch4(21-29)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列21-29的人Notch4引诱物(图111的N4-10)。缩写spN表示在该组分中采用人Notch4信号肽。
h-spNNotch4(21-29)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人Notch4的氨基酸1-27的人Notch4信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸28-392的人Notch4的EGF样重复序列21-29的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸393-629。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括629个氨基酸。
h-sp HC Notch4 (21-29) 引诱物
h-spHCNotch4(21-29)引诱物表示包括Notch4的EGF样重复序列21-29的人Notch4引诱物(图111的N4-11)。缩写spHC表示在该组分中采用人HC信号肽。
h-spHCNotch4(21-29)引诱物蛋白包括以下三个组分：(1)包括人HC的氨基酸1-22的人HC信号序列，然后是(2)编码包括氨基酸23-387的人Notch4的EGF样重复序列21-29的氨基酸，然后是(3)包括人Fc标记的氨基酸388-624。所述预示的信号肽序列用下划线强调，所述人Fc标记以下划线和斜体表示。该组分包括624个氨基酸。
方法
构建人Notch4引诱物
来源于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的总RNA用于产生所述人Notch4引诱物变异体。总RNA与M-MLV逆转录酶和任意的六聚体引物或一Notch4引诱物特异引物逆转录。然后合成的cDNA与Notch4引诱物特异的上游(有义)和下游(反义)引物扩增。
下游引物编码将结合Fc序列中的Bg1II位点以产生一人Notch4/Fc嵌合体框架的在5′末端的BamHI或Bg1II限制位点。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列29后产生融合蛋白的Notch4引诱物，一Bg1II位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch4，图113)。这适用于组分：h-Notch4(1-29)引诱物、h-spNNotch4(9-29)引诱物、h-spHCNotch4(9-29)引诱物、h-spNNotch4(21-29)引诱物、h-spHCNotch4(21-29)引诱物。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列13后产生融合蛋白的Notch4引诱物，一BamHI位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch4，图114)。这适用于组分h-Notch4(1-13)引诱物。
对于在核苷酸序列编码EGF样重复序列23后产生融合蛋白的Notch4引诱物，一Bg1II位点将被制备来产生所述融合位点，且所述融合蛋白序列已给出(Notch4，图115)。这适用于组分h-Notch4(1-23)引诱物、h-spNNotch4(9-23)引诱物、h-spHCNotch4(9-23)引诱物、h-spNNotch4(13-23)引诱物、h-spHCNotch4(13-23)引诱物。
扩增的PCR产物被亚克隆到pBluescript SK II Fc以产生不同的人Notch4/Fc嵌合体。然后为了表达和提纯人Notch4引诱物蛋白，所述人Notch4/Fc引诱物序列被穿梭进哺乳动物表达载体(pAd-lox、pCCL)。
第二系列实验
材料与方法
质粒构建
已有描述腺病毒构建编码LacZ、全长Notch4或Notch4/int3的激活型(Shawber等.，2003)。与6原癌基因融合到框架内的Notch1cDNA激活型被克隆到所述腺病毒表达载体pAd-lox内。VEGF165和N1ECDFc也都被克隆到所述pAd-lox内。已有描述制备和滴定腺病毒存库(Hardy等.，1997)。已有描述编码LacZ、Notch4/int3的激活型、Jl、Dll1和Dll4的所述逆转录病毒表达载体pHyTc(以出版物出版的Uyttendaele等.，2000、Shawber等.，2003、Das等.，2004)。编码Notch1的胞内域(bp 5479-7833，Genbank登记号#X57405)的质粒，和与一原癌基因/组氨酸标记融合到框架内的Dll4的胞外域(由Chiron提供的bp 1-1545，Genbank登记号#AF253468)，在pHyTC内制造。
通过在Clin.Exp.Immunol.(1992)87(1)：105-110中公开的方法采用包含在质粒pCMX-sFR1-IgG中的Fc序列制造NotchlECD、Notch2ECD、Notch3ECD和Notch4ECD，以制备基于Notch的融合蛋白即Notch1ECD/Fc、Notch2ECD/Fc、Notch3ECD/Fc和Notch4ECD/Fc。
腺病毒基因转移
在腺病毒感染前一天将第3代的HUVEC的7.5×105个细胞接种在I型胶原蛋白涂铺的6孔板上。在指示的m.o.i.用Ad-lacZ、Ad-VEGF165或Ad-N1ECDFc感染腺病毒，然后在37℃培养1小时，在1小时期间偶尔摇晃板。
荧光素酶报告子实验
为检测配体诱导的Notch信号传导，采用HeLa和293衍生的Bosc细胞进行共同培养实验。通过磷酸钙沉淀进行瞬时转染。一天前在10cm板上以1.5×106个细胞密度铺板的Hela细胞与333ng的pBOS Notch1、333ng pGA981-6和83ng pLNC lacZ以及666ng pCMV-Fc或pHyTC-N1ECDFc(一次采用333ng，2次采用666ng)转染。一天前在10cm板上以4×106个细胞密度铺板的Bosc细胞与680ng pHyTc-Jagged1、pHyTc-Dll1、pHyTc-Dll4或pHyTc-x(空载体)转染。在转染后一天，所述细胞分三份(HeLa∶Bosc，1∶2)在12孔板上共同培养24小时。采集细胞，采用增强型荧光素酶检测试剂盒(BD PharMingen)检测转染后2天的荧光素酶的活性，并采用半乳糖光加试剂盒(Galacto-Light Plus kit)(PE Biosystems)检测β-半乳糖苷酶。所有实验在贝特霍尔德双注射光度计(Berthold dual-injection luminometer)中进行。
为了检测VEGF诱导的Notch信号传导，采用与腺病毒感染的HUVEC。一天前在6孔板上以8.0×105个细胞密度铺板的HUVEC与作为对照的Ad-LacZ或Ad-VEGF在指示的m.o.i.以及存在或不存在Ad-N1ECD/Fc下感染。在感染后两天，感染的HUVEC被分成三份以1.5×105个细胞密度重新接种到24孔板并培养24小时，然后采用Effectene转染试剂(Qiagen)与12.5ng pRL-SV40(Promega)和137.5ng pGA981-6转染。转染1天或2天后采集细胞，采用双荧光素
Figure GPA00001102593700491
报告子检测系统(Promega)测定荧光素酶的活性。
芽殖实验
为了制备胶原蛋白凝胶，用冰预冷的猪I型胶原蛋白(Nitta gelatin，东京，日本)与10xRPMI1640培养基和中和缓冲液在8∶1∶1的比例混合。然后400μl等分的胶原蛋白凝胶被加到24孔板上，并在37℃形成凝胶至少1小时。在腺病毒感染后(上述)，采集HUVEC，并以1.3×105个细胞每孔铺在含有0.8ml EGM2培养基的24孔板的胶原蛋白凝胶上面。在铺板后48小时，HUVEC变得几乎融合。在接种后，在一周内每2天更换培养基。观察到出芽，并在8天后用安装有显微镜的奥林巴斯数码相机拍照。为了定量出芽的数量，每个孔随机选择5个区域，由两个研究者在不知情的情况下用显微镜计数出芽的数目。
结果与讨论
NOTCHECD/Fc融合蛋白用作为Notch拮抗剂
Notch拮抗剂-NotchECD/Fc融合蛋白
我们已制备了一些Notch拮抗剂(图2)。我们的策略是将在胞外域(ECD)中的Notch EGF重复序列的编码序列融合上述人或小鼠Fc域。该设计得到一分泌的蛋白，该蛋白不具有信号传导功能但保留了配体结合区域因此将结合并抑制配体功能。我们将这些蛋白称为″NotchECD/Fc″并制备了全部四个Notch1-4ECD/Fcs。所述Fc域有利于通过免疫印迹或免疫组织化学法进行亲和提纯和蛋白质检测。
测试Notch拮抗剂
具有在一细胞上表达的配体和在另一细胞中评分的Notch受体激活作用的一体外共同培养系统(图3)被用于检测所述Notch通路的转录激活。我们采用该共同培养实验来证明Notch1ECD/Fc具有阻止配体依赖的Notch信号传导的功能(图4)。该N1ECD/Fc表达载体以不同的比例与全长Notch1和所述CS1-荧光素酶报告子在HeLa细胞中共同培养，然后与配体表达293细胞共同培养。我们观察到由Notch配体激活的Notch1信号传导被N1ECD/Fc表达所减少。这些结果显示浓度依赖性；N1ECD/Fc与Notch1的比例2∶1在抑制信号传导比比例为1∶1时更有效。Notch1ECD/Fc可以阻止由Jagged1、Delta-样1或Delta-样4介导的信号传导。
Notch拮抗剂的表达和纯化
为了纯化蛋白质，我们采用逆转录病毒载体制备了CHO和HeLa细胞系表达的NotchECD/FCs。N1ECD/Fc蛋白被分泌(图5)；如从HeLa-NotchECD/Fc系收集得到的条件培养基中所示，用蛋白质-A(pA)琼脂糖酶纯化。所述pA纯化样品(Sup)和整个细胞溶胞产物(Lys)被与α-Fc抗体进行免疫印迹(图5，A组)，证明N1ECD/Fc是被分泌到所述培养基中。适用于NotchECD/Fc的腺病毒载体被用于感染HeLa细胞，且来自这些细胞的溶胞产物与α-Fc抗体进行免疫印迹，证明它们表达NotchECD/Fc(1、2、3、4)蛋白(图5，B组)。我们现在通过采用pA亲和色谱法从CHO细胞条件培养基提纯N1ECD/Fc。
采用Notch融合蛋白说明血管生成抑制
可通过利用CBF1启动子活性检测Notch信号传导的激活
可通过检测由Notch-IC结合到CBF1而激活的CBF1启动子的转录活性来测定Notch信号传导功能。我们在不同的MOI在与编码VEGF-165的腺病毒感染的HUVEC中检测CBF1启动子活性(图6)。在MOI依赖的方式时，与Ad-LacZ感染的细胞相比较，在Ad-VEGF感染的HUVEC中清楚地检测到CBF1启动子的诱导作用。所述表示VEGF过表达的数据可激活HUVEC中的Notch信号传导。因此VEGF诱导Notch信号传导活性。
我们想知道是否Notch融合蛋白能阻止VEGF诱导激活Notch信号传导。与Ad-VEGF共同感染的Ad-Notch融合蛋白明显地减少由Ad-VEGF单独感染诱导的激活CBF1启动子活性(图7)。对于在图7中的在40MOI感染的每一个腺病毒(A组)，在报告基因转染后24小时检测到60％抑制率和48小时检测到90％抑制率，Notch引诱物的抑制活性依赖于Ad-Notch融合蛋白的多重感染(MOI)。
Notch融合蛋白阻止由VEGF诱导的血管生成芽殖的开始
在该实验中，我们通过在HUVEC中过表达的VEGF-165评价Notch引诱物对诱导出芽(开始出芽)的作用。当Ad-VEGF感染的HUVEC在型胶原蛋白凝胶上培养8天，在胶原蛋白凝胶上诱导出芽。所述由过表达的VEGF诱导的出芽明显地被编码Notch融合蛋白的腺病毒同时感染而抑制(图8)。Ad-Notch融合蛋白本身在形态学上具有很少的作用。
在图9中，我们采用显微镜计数每个区域的出芽数量。依赖于使用的MOI，Ad-VEGF感染的HUVEC增加出芽的数量。Ad-VEGF诱导的出芽被明显地抑制。这些数据表明VEGF通过激活Notch信号传导来诱导的HUVEC出芽，且Notch融合蛋白可以抑制VEGF诱导的出芽。
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第三系列实验
VEGF通过激活Notch信号传导促使血管生成
VEGF和Notch信号通路都是血管发育所必需的。这里我们证明VEGF激活Notch信号传导以促使血管生成。VEGF增加引起Notch信号激活和诱导在培养的初级内皮细胞内丝状伪足的Delta4和Notch4的表达。采用VEGF受体抑制剂的研究表明Notch信号激活通过诱导VEGFR-1(Flt-1)表达依次增强VEGF的功能。VEGF功能的其它部分，包括诱导MMP-9和MT1-MMP，由Notch介导。在采用体内实验塑造VEGF诱导的皮肤新生血管形成，我们发现一分泌的Notch抑制剂(基于Notch的融合蛋白)阻止VEGF诱导的新生血管形成和诱导VEGFR-1表达。因此，Notch信号传导对于由VEGF调节的血管生成是必需的，可能在开始的水平是必需的。
VEGF是血管生成发育的关键调节剂，所述血管生成发育包括多个过程例如ECM的降解、出芽(丝状伪足形成)、增殖、存活和内皮细胞的迁移。虽然多数步骤可能与VEGF信号传导的下游分子共同操作，但是仍未知这些步骤是如何协调调节导致更复杂的形态发生事件，例如血管芽殖。Notch信号传导是一进化保守的信号传导机制，其作用是调节细胞命运决定(1)。在通过结合一配体例如Jagged和Delta样，所述Notch胞浆区(NotchIC)由早老素/γ-分泌酶释放，易位到所述胞核，与转录抑制物CS1(CBF1/Su(H)/lag2)相互作用，并将其转换成转录激活因子(1)。Notch信号传导在血管发育中的作用已通过研究具有靶突变的小鼠来证明(2)。由于Notch在内皮组织的激活也中断了血管重塑，适合的Notch信号传导对血管发育是必需的(3)。虽然已有提出Notch与VEGF信号传导的相关性(4-6)，但是仍然未清楚Notch信号传导在VEGF调节的血管生成中是怎样起作用的以及是否Notch信号传导参与成年血管系统的生理的和病理的血管生成。
HUVEC(人脐静脉内皮细胞)生长是依赖于VEGF(图26A和26B)和分化相关的生物反应例如出芽，并能在早期阶段被评价(7)。首先，根据报道(5)，我们检测是否腺病毒转导的VEGF诱导Notch和Notch配体都在与包含bFGF的完全培养基中培养的HUVEC中表达(图22A)。RT-PCR分析表明，与腺病毒转导的LacZ HUVEC(Ad-LacZ-HUVEC)相比较，D14和Notch4mRNA在腺病毒转导的VEGF HUVEC(Ad-VEGF-HUVEC)中都是上调的(图22A)。转导的VEGF没有表现出诱导Jagged1和Notch1表达。转导的VEGF也通过检测CS1-荧光素酶报告子活性以剂量依赖的方式激活Notch信号传导(图22B)，所述转导的VEGF被Notch信号传导反激活(transactivated)(8)。与增殖相比较，Notch信号传导由高剂量的Ad-VEGF激活(图26A)。由于VEGFR激酶抑制剂SU5416降低VEGF诱导的CS1-荧光素酶报告子活性(图22C)，VEGF通过激活受体激酶来诱导Notch信号传导。由于缺失跨膜域和胞浆域的Notch突变体作为抵抗Notch信号传导的显性负性抑制剂(9)，我们制备了基于Notch的融合蛋白或引诱物(N1ECDFc)来抑制Notch信号传导(图22D)。Ad-N1ECDFc转导的HUVEC(Ad-N1ECDFc-HUVEC)的条件培养基的Western印迹分析表明N1ECDFc被适当地表达和分泌(图22E)。通过采用共同培养实验，在该实验中表达激活在表达Notch1的HeLa细胞中的Notch信号传导的Notch配体的Bosc细胞与对照Bosc相比较，我们检测到N1ECDFc表达质粒转染抑制Notch信号传导(图22F)。然后，我们检测是否在HUVEC中N1ECDFc通过转导的VEGF抑制Notch信号传导的激活(图22G)。在HUVEC中Ad-N1ECDFc和Ad-VEGF共转导明显降低由VEGF诱导的CS 1荧光素酶活性。Gerhardt等报道在早产儿视网膜中VEGF通过引导伪状丝足在血管发芽的顶端延伸控制血管生成(10)。在血管发芽期间，在静止的内皮细胞中间形成制备伪状丝足突出物的特异的内皮细胞可能是早期发育的一个活动。这里我们将制备伪状丝足突出物的单一的内皮细胞定义为出芽。该初级内皮细胞的出芽是通过在它们三倍大的纤维蛋白凝胶或胶原蛋白凝胶上培养而被诱导的(11)。在Ad-VEGF-HUVEC在具有完全培养基的胶原蛋白凝胶上培养的情况时，培养5天，转导的HUVEC在胶原蛋白凝胶上产生伪状丝足延伸(图22H)以及出芽的数量的增加具有剂量依赖性(图27A)。腺病毒编码的激活型Notch4(Ad-Notch4/int3)激活的Notch信号传导诱导HUVEC出芽(12)以及腺病毒编码的激活型Notch1(Ad-N1IC)激活的Notch信号传导也诱导HUVEC出芽(图23A&27B)。由于VEGF和Notch信号传导都诱导HUVEC出芽，我们检测是否N1ECDFc抑制VEGF诱导的HUVEC出芽(图22H-I)。Ad-VEGF-HUVEC出芽明显被Ad-N1ECDFc共转导抑制。Ad-LacZ或Ad-N1ECDFc转导的HUVEC都不形成出芽(图22H)。N1ECDFc抑制VEGF诱导的HUVEC出芽，但不影响细胞的数量(图22I)。转导的N1ECDFc不明显改变HUVEC的增殖，而Ad-N1IC转导的HUVEC对HUVEC增殖是以剂量依赖的形式抑制(图28A)，与Notch信号传导抵抗内皮细胞增殖的抑制效能是一致的(13)。
为了检测是否Notch信号传导是VEGF的下游，由于三个生长因子存在于完全培养基中，我们评价受体酪氨酸激酶的三个不同的抑制剂，包括在N1IC诱导的HUVEC芽体上的VEGFR(图23A-C)。在浓度为1μM时，每一个化合物显示了选择抑制每一个激酶(数据未显示)。PD166866或ZD1893都不影响Ad-N1IC-HUVEC的出芽，而SU5416明显抑制Ad-N1IC-HUVEC的出芽(图23A-B)。SU5416在更低浓度时选择性抑制Ad-N1IC-HUVEC的出芽，并且不减少生存能力(图23C)。由于Taylor等报道Notch下调Flk1/KDR/VEGFR2表达(14)，因此Notch不大可能与Flk1共同作用促使发芽。因为SU5416都抑制Flt1和Flk1激酶活性(15)，因此，我们检测是否Notch信号传导的激活会影响Flt1/VEGFR1在HUVEC中表达。RT-PCR分析表明在Ad-N1IC-HUVEC中Flt1mRNA的表达上调，而内皮细胞制造者CD31mRNA的表达不与在Ad-LacZ-HUVEC中的CD31mRNA作比较(图23D)。Western印迹分析也表明Flt1蛋白在Ad-N1IC-HUVEC中的表达也上调(图23E)。因此，我们检测是否Flt1的选择性配体P1GF促进HUVEC发芽，其中Flt1通过Notch信号传导的激活被上调(图23F-G)。与P1GF缺失的情况相比较，P1GF使Ad-N1IC-HUVEC芽体的数量增加150％(图23F)。而且P1GF使包括多倍丝状伪足的HUVEC芽体增加250％(图23G)。而采用适于Flt1的小干扰RNA(siRNA)降低Flt1的表达抑制Ad-N1IC-HUVEC的出芽(图23J)，转染Flt1选择性降低Flt1mRNA的表达(图23H)和Flt1蛋白的表达(图23I)。尽管带有Flk1siRNA的Flk1表达的降低也抑制Ad-N1IC-HUVEC出芽(图30B)，Flk1siRNA的抑制效能小于Flt1siRNA的抑制效能(图23J)。Flk1 siRNA对Ad-VEGF-HUVEC出芽的作用比对Ad-N1IC-HUVEC出芽的作用更有效(图30B-C)。用Flt1siRNA转染都以相似的程度抑制Ad-N1IC-和Ad-VEGF-HUVEC的出芽(数据未显示)。
一些研究表明VEGF在内皮细胞中调节的明胶酶的活性，且明胶酶的活性的重要性像MMP-2和MMP-9已被建立以诱导血管芽殖(16)。我们检测是否VEGF通过HUVEC中的Notch信号传导调节明胶酶活性。
在明胶酶谱法实验中，与Ad-LacZ-HUVEC的条件培养基相比较，Ad-VEGF-HUVEC条件培养基表明都诱导和激活MMP9，所述MMP9在6天开始被检测出(图24A)，以及激活MMP2，所述MMP2在4天被检测出(图24B)。用Ad-VEGF共同转导Ad-N1ECDFc显示都抑制诱导和激活MMP9(图24A)以及激活MMP2(图24B)。RT-PCR分析表明MMP9mRNA在Ad-N1IC-HUVEC中表达上调，但MMP2mRNA在Ad-N1IC-HUVEC中表达下降(图24C)。由于在明胶酶谱法实验中MMP2活性的诱导未检测到，因此这个结果是可能的结果。而在Ad-N1IC-HUVEC中，能在所述细胞表面激活MMP2的MT1-MMP(17)的表达，都在转录本和蛋白质水平被上调(图24D)。由于VEGF能都调节明胶酶和MT1-MMP的表达(16)，RT-PCR分析表明与Ad-LacZ-HUVEC相比较，在Ad-VEGF-HUVEC中MMP9和MT1-MMP均被上调，且该诱导作用被Ad-N1ECDFc的共转导所抑制(图24E)。Ad-N1ECDFc单独感染不影响MMP9或MT1-MMP在Ad-LacZ感染的HUVEC中表达(数据未显示)。通过合成的MMP抑制剂已确定MMPs对血管芽殖是必需的(16)。GM6001是抑制包括MMP2、MMP9和MT1-MMP的MMPs的广谱抑制剂(18)。GM6001明显降低胶原蛋白凝胶(图31A-B)和纤维蛋白凝胶(数据未显示)的Ad-N1IC-HUVEC出芽。
在小鼠背空气囊(DAS)实验中(19)，稳定转染过表达VEGF121的293细胞(293/VEGF)显著诱导体内血管生成(图25A，左边的组)。与293/VEGF单独相比较，该VEGF诱导的血管生成被N1ECDFc共表达明显抑制(图25A)。检测血管密度以及图25B中显示的血管生成指数，表明293/VEGF诱导血管生成被293/N1ECDFc共表达抑制(图25B)。
而且，在小鼠背空气囊(DAS)实验中(19)，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231在体内可能是通过分泌VEGF来显著诱导血管生成(图25C，左边的组)。与腺病毒表达LacZ相比较，该VEGF诱导的血管生成明显地被腺病毒介导表达的N1ECDFc抑制(图25C)。检测血管密度以及图25D中显示的血管生成指数，表明MDA-MB-231诱导血管生成被N1ECDFc表达抑制。
Flk1是胚胎中血管生成的主要的正性信号转导蛋白，通过其强的酪氨酸激酶活性起作用，而Flt1被认为是血管生成的负性信号转导蛋白。然而，Flt-1的正性作用在成年小鼠上被证实，因为在缺失胞质Flt-1激酶域的小鼠中LLC过表达P1GF2的体内生长被严重地损坏(20)。由于P1GF/Flt-1信号传导改变Flk-1的磷酸化位点和加强的局部缺血心肌的血管生成，Notch可能通过诱导Flt-1信号传导而作用于改变VEGF信号传导，且适当的Flt-1信号传导可诱导伪状丝足延伸或加强的血管芽殖(21)。有趣的是，Notch信号传导也上调P1GF表达(图29)。然而，如前所报道的，持续的激活Notch信号传导抑制包含多细胞内腔的血管发芽的形成(22)。在出芽/伪状丝足形成后Notch信号传导将被关闭，但可能需要瞬时激活的Notch通路。在胰腺β细胞癌变的转基因小鼠模型(Rip1Tag2小鼠)中肿瘤血管生成是VEGF依赖的，VEGF表达的水平没有增加，但是发生储存在基质中的胞外VEGF向VEGF受体运动。MMP-9是造成该运动的原因，而肿瘤发育在Rip1Tag23MMP-9-双缺失-转基因小鼠中被抑制(23)。Notch上调MMP-9表达并可能局部提高在血管发芽的位点的VEGF水平。而Notch也上调MT1-MMP表达，胞外MMP-2也可能定向于Notch激活的内皮细胞的细胞膜。Notch可能通过调节明胶酶活性和VEGF浓度决定血管发芽的位点。由于内皮细胞的MMP-9在肺部特异性转移中是由Flt-1调节(20)，Flt-1可能参与直接诱导MMP-9。
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第四系列实验
来源于Notch1外功能区的新的结构抑制Notch信号传导、内皮形态发生和肿瘤血管生成
Notch信号传导是血管发育所必需的，但也在肿瘤血管生成中起作用。血管内皮生长因子(VEGF)的抑制是有效的抗血管生成治疗，且VEGF可诱导Notch和Notch配体Delta-样4(Dll4)都在内皮细胞(EC)中表达。尽管Dll4抑制可限制肿瘤生长和损坏新血管系统，但是抑制Notch受体功能对肿瘤血管生成的影响已被确定。在该研究中，我们制备了所述Notch1受体的可溶性融合蛋白(N1ECDFc或Notch1引诱物)来阻止该通路，并评价它在体外和体内对血管生成的作用。Notch1引诱物表达减少由三个不同Notch配体与Notch1结合而激活的信号传导，并且还抑制EC过表达的Notch4的形态发生。我们采用两种模型检测Notch1引诱物表达对肿瘤血管生成作用，这两种模型为：小鼠乳房肿瘤Mm5MT细胞过表达成纤维细胞生长因子4(Mm5MT-FGF4)和NGP人成神经瘤细胞。外源性表达的FGF4诱导Notch配体Jagged1和Delta-样1(Dll1)在Mm5MT-FGF4细胞中表达，以及Jagged1在Mm5MT-FGF4异种移植物中表达。尽管Notch1引诱物过表达显著地损坏新血管生成，Notch1引诱物过表达在体外不影响Mm5MT-FGF4细胞的致肿瘤性，但限制Mm5MT-FGF4异种移植物在小鼠中生长。相似地，Notch1引诱物表达在体外不影响NGP细胞但在NGP异种移植物中损坏血管和降低肿瘤存活能力。这些结果明显表明Notch受体信号传导是肿瘤新血管生成所必需的，并提供一肿瘤治疗的新靶点。
血管生成由包括VEGFs、成纤维细胞生长因子(FGFs)和肝细胞生长因子(HGF)的多条信号通路精细调节。在这些信号通路中，VEGF决定性地影响大多数血管生成的所有步骤，包括内皮细胞增殖、存活和管的形成(1)。与该蛋白初产物作用一致，VEGF抑制剂减少临床前模型中的血管生成，并已经临床验证在癌症治疗时有效(2)。尽管这确定了效能，不同的肿瘤类型对VEGF抑制显示了广泛的变化的易感性(2)。对这个变化性的根本的原因仍不清楚。一种可能性是替代的信号拯救了肿瘤血管系统，可以灌流(perfusion)而不管VEGF抑制。因此对该通路的鉴定具有明显的治疗重要性。
所述高度保守的Notch基因家族编码跨膜受体(Notch1，Notch 2，Notch 3，Notch 4)和配体(Jagged1，Jagged 2；Delta-样或Dll1，Dll3，Dll4)，以及跨膜蛋白。经配体结合，所述Notch胞浆区(NotchIC)被早老素/γ-分泌酶释放(3)。在胚胎中Notch信号传导缺陷产生严重的血管缺陷，伴随有Dll4单倍剂量不足导致的致死现象。因此Notch信号传导在肿瘤血管生成中潜在的作用最近已经引起的许多研究人员的研究兴趣。对Dll4受体构成物的小鼠基因转移证明在肿瘤内皮细胞(EC)中表达(5)，并且提高的Dll4表达已被检测到存在人肿瘤中(6，7)。两个最近的报道通过证实Dll4在实验的肿瘤中阻断抑制生长和灌流来证实了这个作用是关键的(8，9)。有趣的是，在这些研究中，Dll4抑制无系统的肿瘤血管系统而不是简单地抑制血管增殖，表明Dll4对功能的血管装配是必需的。
最近的数据表明Notch受体也在肿瘤血管系统中起作用。例如，在头和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中HGF最近显示上调肿瘤细胞中Jagged1的表达，但不作用于内皮细胞。在小鼠中，上调的Jagged1的表达激活邻近的EC中的Notch信号传导，激活肿瘤血管生成和生长(10)。因此这些数据显示至少有两种不同的机制激活肿瘤EC中的Notch信号传导。
在这些研究中，我们采用新的基于Notch1(N1ECDFc或Notch1引诱物)胞外域的可溶性构成物来评价Notch受体激活在血管生成中的作用。在体外，Notch1引诱物都抑制配体诱导的Notch信号传导激活和EC腺病毒过表达的Notch4的形态发生。在体内，Notch1引诱物表达延迟了鼠Mm5MT异种移植物的生长，在鼠Mm5MT异种移植物中Jagged1表达由FGF4转导上调，Notch1引诱物表达在NGP成神经细胞瘤中损坏血管系统和肿瘤存活能力。这些数据支持在肿瘤新血管生成过程中Notch受体起作用是必需的，并表明了抑制这条通路可提供一有效的新的抗肿瘤方法。
材料和方法
试剂和表达载体
化合物E购自Calbiochem(圣地亚哥，加利福尼亚州)，以及PD166866购自Eisai(东京，日本)。Notch1引诱物(N1ECDFc)编码与人IgG Fc融合到框架内的大鼠的Notch1外功能区(bp241-4229，Genbank登记号#X57405)。已有描述逆转录病毒的pHyTC-Jagged1、-Dll1、-Dll4和pBos-Notch1(11)。Notch1引诱物和Fc被处理到逆转录病毒载体pHyTCX，以及小鼠FGF4被处理到pQNCX。腺病毒构成物编码的LacZ和小鼠Notch4以及pAdlox-GFP已被描述(12)(13)。
HUVECs、腺病毒和逆转录病毒感染
按所述的方法分离HUVECs(14)以及获得小鼠乳房癌Mm5MT(ATCC，Manassas，VA)。我们采用指示的多重感染(m.o.i.)的腺病毒和来自于用于感染的GP2-293细胞(BD Biosciences，Bedford，MA)的逆转录病毒上清液。采用300μg/ml潮霉素B(Invitrogen，Carlsbad，CA)选择HUVECs，以及在1mg/ml G418(Gibco-Invitrogen，Grand Island，NY)中选择Mm5MT-FGF4，伴随着在300μg/ml潮霉素B中的双转染子。
Western印迹
Ad-N1ECDFc转导的HUVEC在内皮组织无血清培养基(GIBCO-Invitrogen)中培养48小时，然后Mm5MT-FGF4转染子在DMEM中培养。采用抗人Fc(Pierce，Rockford，IL)进行Western印迹。
定量RT-PCT
Mm5MT转染子与载体或1μM PD166866(FGF受体激酶)培养7天，分离总RNA(RNeasymini-kit，Qiagen，Valencia，CA)，并合成第一链cDNA(SuperscriptTM第一链合成系统，Invitrogen)。对β-actin、FGF4、Jagged1、Dll1和Dll4定量RT-PCR(SYBER Green PCR MasterMix，7300Real Time PCR；Applied Biosystems，Foster City，CA)三次，并对β-actin的值标准化。与对照相比较，这些数值显示了成倍的诱导作用(引物序列根据需要提供)。
共同培养信号传导实验
按所述进行Notch1引诱物抑制配体诱导的信号传导(11)。用333ng pBOS-Notch1、333ngpGA981-6和83ng pLNC-LacZ以及666ng pCMV-Fc或pHyTC-N1ECDFc(333ng×1，666ng×2)转染HeLa细胞。293细胞用680ng pHyTc-Jagged1、pHyTc-Dll1、pHyTc-Dll4或pHyTc-X(空载体)转染。转染后48小时采集细胞，检测荧光素酶活性(增强型荧光素酶检测试剂盒，BDPharMingen，San Diego，CA)，并测定β-半乳糖苷酶活性(半乳糖光加试剂盒，AppliedBiosystems)。实验进行三次。
内皮细胞共培养形态发生实验
按所述评价HUVEC形态发生(11)，通过添加带有Notch1引诱物-或Fc-HUVEC转染子的共同培养的Ad-Notch4转导HUVEC进行修饰。10m.o.i.的Ad-GFP在HUVECs与30m.o.i.的Ad-LacZ或Ad-Notch4共同转导，48小时后接种到纤维蛋白凝胶上(24孔板，1.5×104个细胞/孔)。稳定的HUVEC-模拟物(HUVEC-X)、HUVEC-Fc或HUVEC-N1ECDFc以1.35×105个细胞/孔密度接种，然后在3小时后添加载体或200nM化合物E。7天后，用与总GFP-阳性细胞/区域相比较的方法，将HUVEC形态发生计算作为GFP-阳性细胞数目。
Mm5MT肿瘤模型
对6-8周大的雌性C3H小鼠(Taconic，Hudson，NY)进行皮下植入106Mm5MT转染子(每个N＝10)。用测径器测量肿瘤直径，并计算体积(长度(mm)×宽度(mm)2×1/2)。在22天采集肿瘤并进行分析。实验进行三次。
免疫组织化学
5μm的新鲜冷冻Mm5MT组织切片被免疫染色(15)(参见抗体表单的补充数据)。采用Eclipse E800显微镜和ImagePro加v.4.01(Silver Spring，MD)进行CD31定量。检测20个不同的区域/载波片，并将密度比例按(特异染色面积)/(每个区域的总面积)计算。数据显示为每个Mm5MT转染子与Mm5MT模拟转染子的平均密度比例的平均值的比例。
NGP肿瘤模型
NGP肿瘤模型已被详细报道(16)。如上所述用LacZ或N1ECDFc转染NGP细胞，以及106NGP-LacZ或NGP-N1ECDFc细胞植入4-6周大的NCR裸鼠肾内(Taconic，Germantown，NY；NGP-LacZ n＝11，NGP-N1ECDFc n＝13)。在6周，采集肿瘤用作分析。5μM石蜡包埋的切片被免疫染色以观察CD-31/PECAM和α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)。为检测细胞凋亡(TUNEL实验)我们在原位试剂盒(situ Kit)(Chemicon)中采用Apoptag红。通过对每个组织的20-23个随机选择的区域，不包括正常肾脏区域，进行拍照从而定量信号。每个框架被拍摄成红色(TUNEL signal)和绿色通道。为了除去红细胞自体荧光，采用Adobe Photoshop删去绿色通道信号。随意选择统一的红色通道阈值，并在NGP-N1ECDFc和3NGP-LacZ肿瘤中检测总信号区域。红细胞的定量采用相同的方法进行。
统计分析
采用Tukey-Kramer实验(CD31定量)和Kruskal-Wallis分析(其它所有的)评价定量研究的显著性。
结果
Notch1引诱物在表达Notch1的细胞中抑制配体诱导的Notch信号传导
如由腺病毒Notch1引诱物(Ad-N1ECDFc)感染的HUVEC限制的培养基的印迹检测所示，Notch1引诱物是基于融合到人IgG Fc的Notch1的外功能区，并被分泌(图32A)。我们采用共同培养信号传导实验评价Notch1引诱物活性(11)。当表达Notch配体(Jagged1、Dll1、Dll4)的293细胞与表达Notch1的HeLa细胞培养时，293细胞激活Notch信号传导，由CS1荧光素酶报告子活性检测(图32B)。在共同培养实验中，Notch1引诱物在HeLa细胞(图32B)或293细胞(数据未显示)中表达阻断Notch1信号传导，表明Notch1引诱物阻止Jagged1、Dll1或Dll4激活。
Notch1引诱物阻断由Notch4诱导的HUVEC形态发生
Notch4表达诱导在纤维蛋白凝胶上培养的HUVECs的细胞延伸(extensions)(图32C)，由VEGF和FGF2诱导的形态变化相似(17，18)。在EC中纤维蛋白可以诱导Jagged1(19)。我们采用化合物E(CE)、一分泌酶抑制剂(GSI)或Notch1引诱物来验证这个所述延伸反映内源性Notch配体激活Notch4的在HUVECs中转导的假设。与载体相比较，用200nM CE处理明显地抑制在Notch4-HUVECs中的延伸(图32C的上面的组，32D)。在出芽上的减少是显著的(图32D，对于化合物E处理和N1ECDFc转导都是p＜0.0001，数据表示为平均值±SD)。相对于Notch4+Fc对照组，在HUVECs中共同表达的Notch4+Notch1引诱物同样地阻止内皮细胞延伸(图32C，下面的组；32D)。共同地，这些数据表明Notch受体激活对在该实验中诱导HUVEC延伸是必需且充分的，且Notch1引诱物功能与GSI相似，还确认其活性是作为Notch受体抑制剂。
在小鼠乳房肿瘤Mm5MT细胞中FGF4诱导表达Notch配体Jagged1和Dll1
在克隆原实验和异种移植物实验中在Mm5MT细胞中过表达FGF4促使致肿瘤性(数据未显示)。由于HGF/MAPK信号传导诱导Jagged1在HNSCC中表达(10)，我们想知道是否FGF4刺激Notch配体在Mm5MT细胞中表达。我们采用定量PCR检测到在Mm5MT-FGF4转染子中Jagged1和Dll1上调(Dll4表达无变化)(图33A)。FGFR激酶抑制剂PD166866抑制Jagged1和Dll1在Mm5MT-FGF4转染子中的诱导作用(图33C)，表明FGF4-诱导的Jagged1和Dll1表达需要FGFR信号传导。免疫印迹确定了在Mm5MT-FGF4细胞中Jagged1蛋白的上调(图33B)，并且免疫染色证明在Mm5MT-FGF4肿瘤中Jagged1的显著增加(图33D)。此外，在Mm5MT-FGF4肿瘤内皮组织中检测到Notch4(未显示)。
Notch1引诱物表达抑制在小鼠中的Mm5MT-FGF4肿瘤的血管生成和生长
我们假设Mm5MT-FGF4肿瘤表达的Jagged1由信号传导通过内皮细胞Notch受体促进血管生成。因此我们评价Notch1引诱物表达对Mm5MT-FGF4异种移植物在小鼠中生长的影响。克隆原性实验发现Mm5MT-FGF4稳定地过表达Fc或Notch1引诱物的致肿瘤性未发生改变(数据未显示)。然而，与Mm5MT-FGF4模拟的和Fc转染子相比较，Mm5MT-FGF4-N1ECDFc异种移植物生长被显著地延迟，这表明Notch抑制作用已损坏了致肿瘤性的一个关键要素(图34A)。对内皮细胞标记物CD31/PECAM免疫染色证明在Mm5MT-FGF4-N1ECDFc肿瘤中血管生成被显著地抑制(图34B)。与在血管装配中需要Notch一致，EC显示为分离的单个细胞或小群，伴随有检测到的少数有组织的血管。抗CD31染色的定量分析显示在Notch1引诱物表达的肿瘤中微血管密度降低58％(对于Mm5MT-FGF4-X和Mm5MT-FGF4-Fc与Mm5MT-FGF4-N1ECDFc相比较都是p＜0.001，数据表示为平均值±SD；图32C)。
Notch1引诱物表达中断在人NGP成神经细胞瘤异种移植物中的血管生成
在小鼠中的NGP异种移植物形成成熟的分级的血管系统，其相对地耐受VEGF阻断(16)。为检测是否Notch受体激活作用促成NGP血管生成，我们按上述方法用N1ECDFc转染NGP细胞(未显示)。然而，异种移植物存活能力被显著地破坏(图35A)，伴随有肿瘤细胞凋亡显著增加(在NGP-NIECDFc中的TUNEL-阳性细胞与NGP-LacZ肿瘤相比较，P＝0.0002，图35B)。在NGP-NIECDFc肿瘤中肿瘤内出血显著增加，表明血管被生理断裂((P＜0.0001，图36C)。对血管基底膜组分胶原蛋白IV的免疫染色表明，尽管保留的胶原套表现得平滑完整，但是血管系统总体减少，并伴随有分支减少(未显示)。然而，对EC和血管周细胞(VMC)(分别采用抗-CD31和抗-αSMA抗体)免疫染色表明这些正常连续的细胞层出现混乱。单个血管细胞表现为不规则，并不规律地彼此脱离，伴随有失去血管连续性(图35D)。综上所述，这些结果表明Notch1引诱物表达中断了在肿瘤血管系统中内皮细胞和VMC的相互作用，导致肿瘤组织的不稳定、出血和有缺陷的灌流。
讨论
近来的报道证实了Notch配体Dll4在血管生成中起关键作用，并证明了Dll4阻断可通过破坏血管系统而有效抑制肿瘤生长(8，9)。在该研究中，我们证明了采用一来源于Notch1外功能区的新的构成物阻断Notch受体功能也有效地降低肿瘤灌流，即使它对血管系统的作用是不同的。Notch1引诱物抑制由配体Jagged1、Dll1和Dll4结合Notch1诱导的信号传导。与Notch受体在新生血管生成中激活作用一致，Notch4过表达诱导内皮细胞延伸，这可以通过Notch1引诱物或GSI阻断Notch信号传导来阻止。尽管Notch1引诱物不抑制肿瘤细胞在体内生长，但Notch1引诱物表达抑制Mm5MT-FGF4异种移植物生长和血管生成，其中Jagged1表达上调。同样地，Notch1引诱物表达对NGP肿瘤细胞体内增殖不起作用，但破坏肿瘤血管和体内存活能力。
在没有外源的表达Notch配体的情况下，Notch4在HUVECs中过表达足以诱导内皮细胞在纤维蛋白凝胶上延伸。由于已知纤维蛋白诱导Jagged1在EC中表达，因此可能在该试验中起促进HUVEC表达Jagged1，我们推测这引起激活Notch4。在HeLa共同培养信号传导实验中，Notch1引诱物通过配体-Notch1受体相互作用抑制信号传导。我们不能同样评价Notch4活性，因为Notch4加工不足并存在HeLa细胞中(未显示)。然而在腺病毒Notch4转导后在HUVECs发现加工的Notch4(未显示)，表明Notch1引诱物可阻断配体诱导的Notch4激活。
近来证明的Notch信号传导在肿瘤发生中的多种作用增加了该通路作为癌症治疗潜在的靶点的吸引力。虽然Notch激活可能直接作用在人肿瘤的恶性转化(20，21)，但是它也是血管生成所必需的(8，9)。有趣的是，Notch配体诱导可被生长因子信号调节。例如，Jagged1在肿瘤细胞中被HGF诱导(10)，以及Dll4在EC中被VEGF诱导(22)。这里我们证明FGF4可同样地刺激Jagged1和Dll1在鼠Mm5MT细胞表达。Notch1引诱物降低Mm5MT-FGF4肿瘤体内生长和血管生成但不影响体外致肿瘤性。因此，这些结果表明在该系统中Notch受体激活在Mm5MT血管系统而不是在肿瘤细胞中，对瘤生长是必需的。
尽管Mm5MT-FGF4和NGP异种移植物在Notch1引诱物表达后都显示肿瘤血管系统的显著的混乱，但是在这些模型中观察到的血管表型的不同表明Notch功能的肿瘤特异模式可使血管装配规则化。Mm5MT-FGF4肿瘤快速增殖，并密集发育，游走的内皮细胞网络相对地缺乏募集的VMC。这些不成熟的血管床表达Dll4(数据未显示)且被Notch1引诱物表达广泛除去，剩下小群或单个EC隔离在肿瘤软细胞组织中。与该初始不能形成血管网络一致，引诱物表达的肿瘤残余物没有坏死，并显著小于对照组。相反，NGP肿瘤发育出成熟血管丛，伴随有通过VMC的接近一致程度的内皮组织。NGP血管表达Notch1和相对小的Dll4(未显示)。Notch1引诱物在NGP肿瘤中表达导致瘤内出血和坏死，伴随有血管连续性的丧失，这表明在肿瘤生长到一定程度后灌流的血管变得不稳定。
总的来说，这些数据支持在其中Notch信号传导控制肿瘤血管生成的多个方面的模型。虽然Notch激活对新血管生成是广泛必需的，但是单个Notch蛋白可能有差别地调节血管重塑。我们的结果证实Notch配体-受体相互作用在肿瘤血管系统中的重要性，并表明扰乱的Notch受体功能可提供一种新的破坏肿瘤血管生成的有效的方法。
第四系列实验引用的参考文献
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第五系列实验
Notch作为卵巢癌的治疗靶点
在美国，上皮组织卵巢癌是妇科癌症死亡的主要原因。由于我们不能在早期诊断出该疾病，并由于缺乏直接抑制该肿瘤的新治疗方法而导致病人患该疾病。血管内皮生长因子(VEGF)由恶性上皮卵巢癌细胞产生，血管内皮生长因子反过来促进肿瘤血管生成从而滋养肿瘤[1]。近来的临床试验证明在一些情况下将VEGF作为介入治疗的靶点可改善结果[2]。因此，抗血管生成的治疗方法作为治疗卵巢癌的方法已被验证是有效的，但仍需要进行更多的工作来建立在这些成果上。我们已鉴定Notch信号通路在生理和病理的血管生成中是作为新的血管生成通路[3，4]。Notch是细胞表面受体(图1-Notch1)其促进细胞命运决定、细胞存活和增殖。我们的实验室已发展出一Notch抑制剂，又称为Notch引诱物(在图1中示意结构)，其是一融合蛋白，包括融合到Fc标记的Notch1胞外域(N1ECDFc)的融合蛋白，其能抑制配体依赖的Notch信号传导(数据未显示)。我们已证明Notch引诱物可在维尔姆斯瘤(Wilms Tumor)小鼠模型中阻断VEGF诱导的血管生成和肿瘤血管生成(数据未显示)。我们产生过表达Notch引诱物的人卵巢癌细胞SKOV3，SKOV3-N1ECDFc。我们发现在SKOV3细胞中表达的Notch引诱物当异种移植入小鼠时显著地抑制肿瘤的生长(图36)。因此，Notch引诱物抑制卵巢癌生长。我们假设该抑制作用是以肿瘤血管生成作为靶点。而且，我们调查人卵巢癌样本，并发现一些Notch配体和Notch受体在与卵巢癌相关联的肿瘤血管中高度表达，因此支持该假设，即支持可以人卵巢癌血管中的Notch作为靶点并最终抑制肿瘤的生长。
该研究将对Notch信号传导促进卵巢癌中肿瘤血管生成的假设进行验证。此外，我们假设采用一“Notch引诱物”抑制Notch可抑制肿瘤生长。我们将测定是否Notch引诱物作用是抑制肿瘤血管或肿瘤细胞生长或都具有两种作用。总体的目标是建立Notch引诱物作为治疗卵巢癌的治疗方法。
具体目的：
具体目的1：测定是否Notch引诱物表达阻断SKOV3或OVCAR3细胞的肿瘤异种移植物生长并说明是否Notch引诱物是以肿瘤血管生成作为靶点。
具体目的2：修改Notch引诱物设计以产生具有提高的效能/稳定性的形式。
具体目的3：采用纯化的Notch引诱物阻断小鼠中的卵巢癌肿瘤异种移植物，也与标准化学治疗药物联合用药。
研究策略
具体目的1：测定是否Notch引诱物阻断SKOV3或OVCAR3细胞的肿瘤异种移植物生长并说明是否Notch引诱物是以肿瘤血管生成作为靶点。
我们的初步结果表明SKOV3肿瘤细胞安排表达的Notch引诱物阻断卵巢癌异种移植物的生长(图36)。这个研究结果将在另一个卵巢癌细胞系OVCAR3得到重复。Notch引诱物可抑制肿瘤细胞的生长、肿瘤血管的生长或同时抑制两者。为测定是否Notch引诱物以肿瘤细胞作为靶点，我们将测定是否卵巢癌系表达的Notch引诱物在软琼脂实验中生长的更少。为测定是否该引诱物是以肿瘤血管生成为靶点，我们将对该抑制作用的证据异种移植物进行评价。为控制异种移植物检测肿瘤血管生成将包括微血管密度鉴定、肿瘤内皮细胞的增殖指数以及通过凝集素灌注对肿瘤血管系统成像。对在Notch引诱物表达的异种移植物中抑制肿瘤血管生成的测量将包括评价细胞凋亡的内皮细胞、减少肿瘤微血管系统和减少腹水积聚。
具体目的2：修改Notch引诱物设计以产生具有提高的效能/稳定性的形式。
尽管目前的Notch1引诱物是作为Notch阻断剂起效用的，但是由于它是一相对大的蛋白质，可能难于被提纯。我们计划研究发展Notch1引诱物的变异体，该变异体包括胞外域的更小部分。这些变异体将被筛选作为在基于细胞培养的实验中的Notch信号传导抑制剂。抑制的变异体也将根据它们从制备细胞分泌的有效性、分泌后它们的稳定性、它们的溶解性和易于纯化的性能通过Fc亲和标记进行筛选。纯化的变异体将被注射入小鼠来评价潜在的毒性。
具体目的3：采用纯化的Notch引诱物阻断小鼠中的卵巢癌肿瘤异种移植物，也与标准化学治疗药物联合用药。
来自具体目的2的纯化的引诱物将被采用作为单独药剂或于化学治疗联合用药，来评价它们抑制卵巢癌异种移植物(SKOV3/OVCAR3)的有效性。采用纯化的Notch引诱物作为单独药剂，我们将尝试重复对在具体目的1的实验中观察到的肿瘤异种移植物的生长的阻断，并测定最佳的抑制浓度。为达到该目的，我们将测定阻断SKOV3/OVCAR3异种移植物在小鼠中的生长所需的最佳剂量、给药方案和治疗持续时间。然后，我们将采用Notch引诱物与紫杉醇联合用药。采用最佳剂量的Notch引诱物与或不与紫杉醇联合来测定在阻断异种移植物生长的有效性。
影响：该研究的目的是直接推进卵巢癌的治疗。临床研究最近已确定用VEGF阻断药剂成功治疗卵巢癌。少数几个新的治疗药剂已被研发用来补充化学疗法的治疗。尽管其成功治疗卵巢癌，但是以VEGF作为靶点来阻断肿瘤生长可能仅在一定程度上限制肿瘤生长。它也可能导致生长出耐受VEGF阻断的新的肿瘤血管。我们计划以与卵巢癌有关的另一个肿瘤血管生成通路作为靶点，即Notch信号通路。该研究将通过研发新的治疗实体Notch引诱物而促进治疗。我们的初步研究已确定在小鼠模型中Notch引诱物可阻断卵巢癌生长。因此，Notch引诱物作为治疗实体的发展的影响是非常显著的。
创新：我们的Notch引诱物的最近发展提出了一新的和先前未检验的范例来治疗卵巢癌。仍然没有其它公布的研究表示该通路与治疗卵巢癌有关，然而我们的初步证据解释这个作为探索的一个关键区域。此外，尽管最近的VEGF阻断作为新的治疗方法成功治疗卵巢癌，我们认为该方法可能需要通过抑制其它血管生成通路来补充，例如抑制Notch。
第五系列实验引用的文献
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第六系列实验
Foxo/Notch通路控制肌原性分化和纤维类型区分
Foxo转录因子控制新陈代谢作用和细胞分化。与Foxo依赖的新陈代谢通路和靶基因不同，这些蛋白调节分化的机制仍未被研究。Notch信号传导激活模拟Foxo获得功能(gain-of-function)对细胞分化的影响。采用肌肉分化作为模式系统，我们证明通过促进从Notch效应子Cs1上清除辅抑制子，Foxo在生理上和功能上与Notch相互作用，导致激活Notch靶基因。由构成活化的Foxo引起的成肌细胞分化抑制部分地由抑制Notch信号传导来复苏，而Foxo1功能缺失阻止Notch抑制肌发生并增加MyoD表达。因此，条件的切除骨骼肌中的Foxo1导致增加在损害包含肌细胞生成素(慢抽搐)的纤维的情况下形成包含MyoD(快速颤搐(fast-twitch))的肌纤维以及改变纤维类型分布。Notch/Foxo1合作可通过Notch集合周围的信号和通过Foxo1集合代谢信号，来调节祖细胞维持和分化。
再生医学的主要问题是要了解高度特异性的细胞类型怎样从未分化的干细胞或祖细胞产生(1)。与该问题有密切关系的是由微环境的和内分泌的/营养的信号产生的生物化学信号是怎样转录整合来激活细胞分化过程。
插头(Fox)蛋白的O亚科为促进细胞存活和代谢调节激素、营养素和应激反应。调整Foxo转录的能力对控制这些细胞的功能是必需的，并且是很大程度依赖于转录后修饰，包括磷酸化和乙酰化(2)。除了它们在终末分化细胞中的作用外，Foxo蛋白也与成肌细胞(3)、前脂肪细胞(4)和内皮细胞分化(5)有关。而且，Foxo4通过与Myocardin(6)相互作用调节血管平滑肌细胞分化。Foxo3敲除的小鼠表现出卵巢功能早衰，与该基因在卵泡成熟中的作用一致(7)。Foxo蛋白控制细胞分化的机制仍不清楚，并且近来的条件切除研究与在所述三个Foxo亚型中的功能重叠在造血谱系中的重要程度一致(8，9)。
Notch通路在胚胎发生期间的神经、血管、肌肉和内分泌的分化中起重要作用(10)。经配体诱导裂解，Notch受体细胞内域易位到细胞核，在细胞核与DNA结合蛋白Cs1相互作用，将其转录性质从抑制剂改变为转录激活剂(11)。Cs1靶点包括Hairy和促分裂因子(Hes，Hey)基因。Hes1控制消化道内胚层(12)、前脂肪细胞(13)和神经发生的分化(14)。激活的Notch信号传导或获得的Notch1受体功能，通过抑制MyoD转录来抑制C2C12和10T/2成肌细胞的分化(15-21)。
值得注意的是在每个细胞分化环境中Foxo1获得功能(3-5)表型模拟Notch1激活(13，17，22，23)。而且，Foxo1切除(24)在小鼠中表型模拟Notch1切除(25)。尽管这些有趣的相似性，但Foxo和Notch通过两个表面上不同的机制传导信号，所述两个机制为磷脂酰肌醇-3-激酶通路(Foxo)和Hes/Hey通路(Notch)。在该研究中，我们证明Foxo通过促进从Cs1清除辅抑制子而在生理上和功能上与Notch相互作用，从而控制肌形成过程。
生肌前体由中胚层干细胞产生(26)并通过多级过程最后的表达MRF家族(MyoD、肌细胞生成素、MRF4和Myf5)的生肌转录因子被转化成肌管(27)。生肌转录因子与E蛋白形成异二聚体并促进肌肉特异性的基因表达，与肌细胞特异的MEF2增强子密切协调起作用(28)。
成年肌肉是异形组织，主要由其肌纤维内容限定(29)。不同的肌球蛋白重链(MyHC)亚型的特点是具有不同的肌纤维。I型纤维主要表达慢抽搐MyHC，而II型纤维表达快速颤搐MyHC(29)。所述纤维类型区分的过程被控制成多个步骤。首先，在生肌前体细胞中似乎出现不均一性，且鸟类胚胎交叉移植实验表明早期前体主要促成慢肌纤维，晚期前体促成快纤维(29)。出生后，纤维类型区分也受细胞自发因素影响，包括神经支配和内分泌/营养信号(28)。该Foxo共激活剂Pgc1α在促进慢抽搐纤维形成中起关键作用(30)，且近来的数据也暗示在该过程中涉及Foxo脱乙酰基酶Sirtl(31)。在小鼠中采用诱发突变，我们证明Foxo1在抑制C2C12细胞中MyoD依赖的肌形成中的作用，是通过在Foxo1缺乏的骨骼肌中的包含MyoD的肌纤维的增加而被反映，与在生肌细胞谱系区分的关键功能一致。
结果
Foxo1和Notch信号传导在C2C12分化中相互作用
为了理解是否Notch和Foxo相互作用来控制肌肉发育，我们采用一细胞分化模型。在生长因子取消后，C2C12细胞经历生肌转变和肌管融合，所述生长因子取消是一与Foxo1核转运相关的过程(3)。因此，转导腺病毒编码的构成的活化的Foxo1突变体(Foxo1-ADA)(4)阻断血清取消的作用来诱导C2C12分化，如抑制生肌细胞融合所反映的一样(图37a-c)。相反地，由siRNA引起的Foxo1抑制不影响这些过程(图37d)。同样地，构成的活化的Notch(Notch1-IC)在阻断生肌细胞分化中表型模拟Foxo1-ADA(图37e)。实际上所有细胞变得与腺病毒转导(图44)。Foxo1 siRNA以剂量依赖的方式有效地抑制表达内源性Foxo1和转染的FLAG-Foxo1(图45)，并且不影响对照蛋白或其他Foxo亚型(图46)。Foxo1-ADA和Notch1-IC都不影响C2C12分化(图47)。
我们想知道是否我们能通过抑制内源性Notch信号传导优先取得Foxo1-ADA的作用。为实现这个目的，我们采用以缺失跨膜锚和胞内域的截短的Notch1受体，其通过作为结合Notch配体的引诱物受体来起作用(32，33)(Y.F.和J.K.，未公布的观察报告)。所述引诱物不影响C2C12的响应生长因子取消而进行的分化的能力(图37f)，但部分地复苏Foxo1-ADA抑制生肌细胞分化(图37g)。作为一种替代的探针阻断Notch信号传导，所述早老素抑制剂(PSI)化合物E(34)也复苏Foxo1-ADA抑制的生肌细胞分化(图37h)。
为检测Foxo1对Notch信号传导的影响，我们共转染Foxo1siRNA和Notch-IC。Foxo1siRNA复苏抑制生肌细胞分化和由Notch-IC引起的肌球蛋白表达(图37i)，而对照siRNA没有作用(数据未显示)。为了排除Foxo1siRNA对生肌细胞分化的非特异的作用，我们制备一siRNA耐受的Foxo1-ADA(图48)。Foxo1siRNA逆转Foxo1-ADA的作用(图37j)，但不能复苏由siRNA耐受的Foxo1-ADA引起的抑制C2C12分化(图37k)。我们提出对图38a中的这些数据进行定量分析，该分析表明Foxo1和Notch-IC减少肌球蛋白水平＞80％，而Notch引诱物和Foxo1siRNA将它们恢复到所有分化细胞的-70％我们通过进行肌球蛋白阳性细胞的形态测定分析得到相似的数据(图38b)。这些数据表明Foxo1是Notch对生肌细胞分化起作用所必需的。
然后我们检测是否Foxo1通过它的转录功能对分化起作用。为达到这个目的，我们在ADA突变体的长链结构中通过由N208A和H212R(DBD-Foxo1ADA)制备一DNA结合缺陷突变体(6，35)。我们通过检测Igfbp1启动子的活性来证实该突变体不能结合DNA，所述Igfbp1启动子为一典型的Foxo1靶点。Foxo1-ADA使Igfbp1启动子的活性提高10倍，而DBD-Foxo1ADA不能这样做(图38c，左边的组)。令人惊讶的是，该突变体与有能力结合DNA的Foxo1-ADA在抑制分化上一样有效(图37l)。这些数据表明Foxo1控制分化不依赖于它的以序列特异的方式结合DNA的能力。
Foxo1结合Cs1并被募集到所述Hes1启动子上
Notch1-IC结合并共同激活Cs1以促使Hes和Hey表达(11)。根据与DBD-Foxo1ADA突变体的结果，我们检测是否Foxo1通过采用表达Notch1受体的C2C12细胞和表达Notch配体Jagged1(以“+”号表示)的HEK293细胞共同培养或LacZ作为阴性对照(以“-”号表示)以Notch依赖的方式与Cs1相互作用。我们提供一些细胞系的证据证明Foxo1和Cs1在培养的细胞中相互作用。我们在内源性的Cs1免疫沉淀物中检测到内源性的Foxo1，并且所述共免疫沉淀作用被通过激活Notch信号传导而显著增强(图39a)。为了证实该相互作用的特异性，我们在C2C12细胞中表达HA标记的Foxo1和FLAG标记的Cs1。在与抗HA(Foxo1)抗血清免疫沉淀后，我们在免疫印迹中检测到FLAG-Cs1(图39b)。相反地，在与抗FLAG(Cs1)抗血清免疫沉淀后，我们在免疫印迹中检测到HA-Foxo1(图39c)。由于我们在Cs1免疫沉淀中没有检测到其他Foxo亚型，因此与Cs1共免疫沉淀的能力对Foxo1是特异的(图42)。一截短的Foxo1突变体(Δ256，编码氨基酸1-256)(36)保留与Cs1相互作用的能力。我们在Myc-Δ256免疫沉淀物中检测到FLAG-Cs1(图39d)，以及在FLAG-Cs1免疫沉淀物中检测到HA-Δ256(图39e)，这表明Cs1与Foxo1N末端域相互作用。
为了测定是否这是一直接的蛋白-蛋白相互作用并描绘该相互作用域，我们首先用亲和纯化的在细菌中制备的GST-Foxo1和在HEK293细胞表达的FLAG-Cs1进行pull-down实验。我们检测到Cs1与Foxo1的全长和N末端相关(氨基酸1-300)，但与Foxo1的C末端(氨基酸290-655)或GST不相关(图40a)。我们然后采用具有从细菌培养物纯化的GST-Foxo1和GST-Flag/Cs1的无细胞系统描绘与Foxo1相互作用的Cs1域。此外，我们恢复了Cs1免疫沉淀物中的Foxo1的全长(1-655)和N末端(1-300)，但不恢复其C末端(290-655)。相反地，Foxo1的N末端域Cs1的N末端相互作用(图40b)。
我们采用Cs1缺乏的突变体来描绘Cs1的Foxo1结合域。这些研究表明Foxo1结合一包括氨基酸172-279的域(图40c)，该域包含在所述Cs1NTD域中(37)(图40c，曲线图)。有趣的是，该域是DNA和辅抑制物结合所必需的，但不促成Notch结合(38，39)。
Cs1结合到所述Hes1启动子中的共有序列(40)，因此提供一有用的Foxo/Cs1相互作用的读出实验(readout assay)。如果后者是调节C2C12分化所必需的，则将会得到三种预测：(a)将在染色质免疫沉淀实验(ChIP)中跨越Hes1启动子中的Cs1单元检测到Foxo1，(b)该作用应该是分化依赖的以及(c)由Foxo1-ADA引起的分化抑制将伴随构成的结合到Hes1启动子中的Cs1单元上。图40d证明所述预测已被实现。第一，我们在分化的C2C12细胞中采用跨越所述Hes1的Cs1结合位点的引物进行ChIPs。我们在来自未分化的细胞的免疫沉淀物中检测到内源性Foxo1、Notch1和Cs1(图40d Endog道，0天)。由于所述PCR扩增的序列不包含插头结合位点，我们推断Foxo1通过Cs1结合到该DNA片段。而且，由于细胞变成分化的时候，Foxo1和Notch1的结合都减少(1天和2天)。当我们用构成的核的Foxo1-ADA转导细胞，所述分化被抑制，且所述突变体Foxo1被持久地结合到所述Hes1启动子上，Cs1和Notch1也一样(图40d，Foxo1-ADA泳道)。
然后我们分析Hes1表达。预测Hes1水平将与被Foxo1和Notch1占用的Hes1启动子相关。实际上，当Foxo1和Notch1结合到Cs1减少时，Hes1mRNA表达下降，而肌球蛋白水平上升(图40d)。为排除Foxo1对Cs1转录的直接作用，我们用Cs1启动子进行报告子基因实验。虽然在Cs1启动子中存在有插头结合位点的10个重复序列，但是Foxo1不能激活Cs1报告子基因的表达(41)(数据未显示)。而且，Cs1表达在表达Foxo1-ADA的C1C12细胞中不受影响(未显示)。这些数据表明Foxo1通过蛋白/蛋白与Cs1相互作用来调节Notch依赖的分化。
Foxo1对于Notch通过Cs1诱导Hes和Hey基因是必需的
我们检测Foxo1-ADA促进内源性Hes1、Hes5和Hey1在C2C12细胞中表达的能力。Foxo1-ADA和Notch1-IC都上调该三种基因的表达，而Foxo1siRNA抑制由Notch1-IC诱导的Hes1、Hes5和Hey1表达(图41a)。Foxo1siRNA不影响Hes1、Hes5和Hey1在缺失生长因子的细胞中的表达(图41a)。
我们的下一系列实验主要是针对Hes1，作为典型的Notch靶基因。我们通过报告子实验采用所述Hes1启动子来检测Foxo1调节Hes1转录的能力，以及检测Hes1表达。Foxo1-ADA和Notch1-IC分别诱导Hes1启动子活性提高1.8倍和2.5倍。Foxo1-ADA与Notch1-IC共转染引起提高2.5倍(图41b)。共转染Foxo1 siRNA以剂量依赖的方式抑制Notch诱导的Hes1活性，而对照的siRNA没有影响(图41b)。我们采用包含结合基序的Hes1的四个串联重复序列的合成的Hes1报告子也得到相似的结果(图50)。而且，与Foxo1ADA相比较，DBD-Foxo1ADA可以更大程度地诱导Hes1报告子基因活性，这证实直接DNA结合对Foxo1激活Hes1不是必需的(图38c，右边的组)。
Notch1-IC不能诱导Hes1在表达Foxo1siRNA的细胞中表达，表明Foxo1对Cs1/Notch相互作用是必需的。因此，我们在一共同培养系统中研究Foxo1和Notch1与Hes1启动子的结合。我们共同培养表达Notch1的C2C12细胞核表达Notch配体Jagged1的HEK293细胞，以诱导激活内源性Notch信号传导。在ChIP实验中(图42a、b，泳道1-2)，存在表达Jagged1的细胞的共同培养增加了内源性Foxo1(图42a，泳道1-2)和Notch1结合到Hes1启动子(42)。这些数据与经共同培养Foxo1与Cs1共免疫沉淀增加的观察结果一致(图39a)。为检测是否Foxo1结合到Hes1启动子是Cs1依赖的，我们用siRNA抑制Cs1表达(图51)。转染Cs1siRNA都抑制Foxo1和Notch1与Hes1启动子的结合(图42a，泳道3-4)，表明它们是Cs1依赖的。而且，Foxo1-ADA在存在Cs1siRNA时不能诱导Hes1表达(图41a，泳道5)。ChIP实验的结果被Hes1启动子实验证实。Jagged1或Notch1的单独表达不影响Hes1活性，但共同培养将Hes1报告子基因的活性提高3.7倍(图42c)。在ChIP实验中Foxo1siRNA取消Notch与Hes1启动子结合(图42b，泳道3-4)，并诱导Hes1启动子活性(图42c)。这些结果表明Foxo1对Notch1与Hes1启动子结合时必需的，并提供Foxo1表达的抑制恢复表达Notch1-IC的成肌细胞的分化的机制。Foxo1siRNA在一共同培养系统中抑制Notch诱导Hes1的能力，排除了由于通过截短的细胞内的Notch1突变体引起的非生理学激活Notch信号传导从而在与Notch1-IC的分化实验中观察到的作用的可能性(15)。
Foxo1促使辅抑制子清除以及Maml1与Cs1结合
为了说明Hes1表达的Foxo1依赖的激活的分子机制，我们研究了辅抑制子/共活化物在Hes1启动子的交换。Notch的激活清除了辅抑制子Ncor和Smrt(43)，并恢复对Hes1启动子的共活化物Maml1(42)。Foxo1siRNA阻止Notch诱导的辅抑制子交换(图42d)。这些数据与Foxo1结合到Cs1的域172-279的观察结果一致(图40c)，所述Cs1的域172-279已被证实包含有Ncor/Smrt结合位点(38，39)。
为了证明在转录合成物观察到的变化导致Hes1活性发生变化，我们研究在肌形成中涉及的Hes1靶基因的表达。Hes1已被认为是通过抑制bHLH转录因子MyoD而不是影响Myf5来抑制成肌细胞分化(16，17)。表达分析显示Notch1-IC或Foxo1-ADA抑制MyoD，而Myf5不受影响。Notch引诱物或Foxo1siRNA部分地恢复MyoD表达(图42e)。
在Foxo1的骨骼肌中的改变的纤维类型组合物
根据所述细胞的数据，我们采用条件基因失活进行探针探查Foxo1在体内肌肉分化中的功能。该实验的预测结果促进包含MyoD而不是Myf5的成肌细胞的分化。因为MyoD是快纤维中主要的生肌因子，而肌细胞生成素是慢纤维中主要的因子(44)，可能在损害慢纤维的情况下，除去Foxo/Notch对MyoD表达的抑制将导致促进形成快纤维。
在小鼠中存在有三种Foxo亚型：Foxo1、3和4(8，9)。后者在除了比目鱼肌的多数肌肉类型(45)中是主要的，而Foxo1是最丰富的(图43a)。碰巧的是，比目鱼肌也生理上富含有慢抽搐纤维，因此允许我们准备验证我们的假设。我们通过杂交适于floxed Foxo1等位基因与肌细胞生成素-cre转基因的小鼠杂合子来灭活Foxo1在骨骼肌中的表达。mRNA分析表明所述敲除是按计划发生(数据未显示)。组织学分析显示在Myog-Foxo1小鼠的比目鱼肌中的I型(慢抽搐)纤维减少，而富含II型纤维的肌肉未受影响(图43b)。与组织学检查所见一致，在Myog-Foxo1小鼠中I型纤维标记物的表达减少，而II型纤维标记物增加(图43c)。然后我们分析生肌的转录因子MyoD、Myf5和肌细胞生成素的表达。MyoD是快纤维中的主要的因子，而肌细胞生成素是慢纤维中的主要的因子(44)。与组织病理一致，我们发现MyoD表达上升了2倍和肌细胞生成素下降了80％，而Myf5表达没有变化(图43c)。而且，调节I型纤维决定(30)的Foxo1共活化物Pgclα的表达为发生变化，表明Myog-Foxo1表型小鼠不能通过降低的Foxo1依赖的Pgclα转录来解释说明(图43c)(46)。作为功能相关的观察到的纤维类型转变，我们检测在跑台上的跑步能力。的确，正如从I型(耐久性)纤维的减少所预测所述，Myog-Foxo1小鼠显示了降低的跑步能力(图43d)。
最后，为测定是否这些变化反映了在纤维类型区分中的发育的变化，相对于适当的或细胞非自主的因子，我们检测MyoD在Foxo1(24)和Notch1敲除(25)的E9.5的胚胎中的表达。与对照相比较，在Foxo1-/-胚胎中，MyoD水平上升3.1±1.1倍，和在Notch1-/-胚胎中上升7.3±2.9倍(突变体与野生型比较，P＜0.05，n＝4)。观察到的体内MyoD表达的增加，与在成肌细胞分化的关键信号连接中的Foxo1和Notch之间的生理和功能相互作用一致。因此。我们提出在Myog-Foxo1小鼠中的纤维类型转变是胚胎发育期间的包含MyoD的生肌细胞的加速分化的结果。
讨论
该研究提供生物化学的、细胞的和遗传的证据，即Foxo和Notch通路协作调节肌肉分化。该数据显示Foxo1作用的新模型，其是促进辅抑制子通过直接结合到Cs1NTD区域在Hes1启动子交换(图42f)。我们提出Foxo1与该区域结合稳定Notch/Cs1复合物，并促使辅抑制子清除和Maml1募集，与结构研究的提出的NTD的作用一致(37)。该结果也提供了两种主要生物化学通路即磷酸肌醇-3-激酶/Akt通路和Notch/Hes通路，以协同的方式会聚来控制体内细胞分化。
提出的Foxo1的作用是不依赖于其转录功能，并包含直接与Cs1相互作用。虽然我们的研究主要关注作为Notch1信号传导的典型效应子的Hes-1，但是我们的数据将不被解释为表示Hes-1是Notch/Foxo相互作用的唯一的调节剂。例如，我们已观察到在前脂肪细胞、PC-12和HUVECs的分化中一相似的Foxo/Notch上位，表明在多种细胞环境中Foxo与Notch相互作用(数据未显示)。我们提出Notch/Foxo协作通过Notch整合环境信号以及通过Foxo1整合代谢信号，来调节祖细胞维持和分化。所述两种等级的机制允许在各种组织中定型祖代细胞以避免当Foxo1被激活即缺失生长因子时响应发育信号(Notch)的分化。然后这些细胞将在成年组织中保持休眠状态，在成年组织中它们可以在响应导致Foxo1抑制的Notch配体和激素的/营养的信号组合时最终分化。这种解释与在Foxo1缺失的肌肉中观察到的纤维类型转变一致，相对于生肌过程中的诱导物，一观察似乎将Foxo1定位作为在生肌谱系中的命运决定者。是否其它Foxo和Notch亚型也相互作用以及它们怎样促成该过程仍有待观察。
解释Foxo1是基因表达的共调节剂的证明为该转录因子的多变的功能提供一种可能的解释。我们的研究中的一个有趣的问题是从一种功能到另一种功能的转变是怎样实现的，并且Foxo1的复杂的翻译后修饰是怎样响应生长因子、激素和营养素影响该过程。该结果广泛涉及包含Foxo1信号传导的疾病过程的病理生理学。我们的观察的一个潜在的暗示是开发抑制Notch信号传导的药剂用来治疗特征是过度的Foxo作用的代谢紊乱的用途的能力。
材料与方法
动物的生成和分析
已有描述肌细胞生成素-cre(49)和Foxo1flox小鼠(9)。采用PCR与引物5′-GCTTAGAGCAGA GAT GTT CTC ACA TT-3′、5′-CCA GAG TCT TTG TAT CAG GCA AAT AA-3′和5′-CAAGTC CAT TAA TTC AGC ACA TTG A-3′检测野生型、空的和Foxo1flox等位基因。在踏车运动试验前，训练小鼠2天(Columbus Instruments)。该试验在头30分钟以15m/min进行，然后每间隔10分钟增加1m/min直到疲惫。骨骼肌样本被快速冻结到OCT基质中，得到7μm系列片段。采用变色反应的ATPase(50)或用抗骨骼的慢肌球蛋白免疫染色(Sigma)来区分肌纤维类型。为了胚胎研究，我们安排杂合子Foxo1(24)或Notch1(25)小鼠同步交配，并在E9.5采集胚胎。从全部胚胎分离mRNA，并按如下所述进行RT-PCR。
病毒表达研究
按所述分化C2C12细胞(3，4)。已有描述Foxo1-ADA、Notch1-IC、Jagged1、Cs1和Notch引诱物腺病毒和哺乳动物表达载体(36，51)。我们采用pQCXIH载体制备表达Foxo1-ADA和Notch1-IC的逆转录病毒。为制备Notch引诱物(pAdlox Notch1ECD-Fc)，Notch1胞外域(bp 241-4229，GenBank登记号#X57405)被与人IgG Fc标记融合到结构中，然后克隆到pAdlox。细胞与pVSV-G载体短暂共转染并指定pQCXIH载体进入GP2-293细胞中产生逆转录病毒的上清液(BD Bioscience)。为制备DNA结合缺乏的Foxo1，我们采用QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)分别用丙氨酸和精氨酸替换N208和H212。然后该突变体被克隆到Foxo1-ADA突变体主链中。
荧光素酶实验和共同培养实验
我们用Hes1-荧光素酶转染HEK293细胞(从转录起始位点起的-194到160)(Hes1/pGL2碱基)。合成的Hes1-荧光素酶(包含一4×Cs1结合位点、4×Cs1/pGL2碱基)或Cs1-荧光素酶(-1536到22，Cs1/pGL2碱基)报告子基因连同pCMV5，pCMV5-Foxo1-ADA，pQNC-Notch1-IC，pHyTc Notch引诱物或Foxo1siRNA一起。我们采用质粒pRSV-β-半乳糖苷酶作为转染率的对照(51)。对于共同培养实验，我们通过转染在C2C12细胞中表达Notch1和在HEK293细胞中表达Jagged1或LacZ。然后我们收集HEK293细胞并将它们接种到C2C12细胞。培养1小时后，我们采用所述共同培养的细胞进行实验。
Western印迹和免疫沉淀
我们根据标准技术采用抗肌凝蛋白抗体(MF-20)、抗-HA(12CA5，Boehringer Mannheim)、抗FLAG(M2，Sigma)、抗Foxo1(H128和N20，Santa Cruz)、抗Notch1(C-20，Santa-Cruz)，抗-Cs1(Chemicon和Santa-Cruz)、抗-NcoR(Santa-Cruz)、抗-SMRT(Santa-Cruz)或抗-MAML1(Chemicon)抗体进行这些实验。对于Foxo/Cs1共免疫沉淀，我们采用纯化的细胞核部分(52)。由于Cs1迁移到SDS-PAGE的IgG重链附近，我们采用dimethylpyrimilidate(Pierce提供的DMP)来交联抗体到珠蛋白A并避免IgG污染洗脱的蛋白复合物(52)。
染色质免疫沉淀实验
我们按上述方法在C2C12细胞中进行ChIP实验(4)并按Fryer所报道的方法在共同培养的细胞中进行ChIP实验(42)。用来扩增Hes1启动子的Cs1结合位点的多对引物是：5′-GCAAAGCCCAGAGGAAAGAGTTAG-3′和5′-AGGAGAGAGGTAGACAGGGGATTC-3′。
siRNA转染和siRNA耐受的Foxo1
Foxo1特异性的siRNA序列是5′-ACGGAGGATTGAACCAGTATA-3′。Cs1特异性的siRNA序列是5′-TAGGGAAGCTATGCGAAATTA-3′。采用lipofectamine-plus试剂(Invitrogen)转染siRNA。我们通过替换序列5′-ACGGCGGTCTGAACCAGTATA-3′中的三个残基(以下划线强调)来制备siRNA耐受的Foxo1。根据需要提供用于即时RT-PCR研究的引物序列。
重组蛋白质和相互作用实验
我们通过克隆入PGEX6P-1制备包括氨基酸1-527、1-279、1-172和279-527片段的GST-FLAG-Cs1。已有描述GST-Foxo1构成物(53)。在细菌培养和IPTG诱导后，我们纯化GST融合蛋白并共同培养它们。此后，我们通过与抗FLAG抗体免疫沉淀分离GST-FLAG/Cs1，多次洗涤免疫沉淀物，并与抗Foxo1抗血清进行免疫印迹。
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第七系列实验
糖尿病病人通常发展肥胖症和血管病变。促使糖尿病合并症的分子机制仍有待阐明。在过去的两年里，本人一直评价Notch4敲除小鼠以评价出生后缺陷。这些分析显示Notch4突变型小鼠发展出糖尿病的标志：1)皮下脂肪的引人注目的增加被看作为是肥胖症的早期发作，以及2)在视网膜血管系统中减少的周细胞表示为糖尿病视网膜病变。我们已发现Notch和一种胰岛素信号传导的转录调节剂Foxo1共同协作调节脂肪形成和血管生成。缺乏Notch1、Notch1/Notch4或Foxo1的小鼠伴随有血管生成缺陷在子宫内死亡。这些数据让我们假设失调的Notch信号传导促成糖尿病肥胖症和血管病变。提出的目的是检验该假设并解释Notch和胰岛素信号传导相互作用在脂肪形成和血管生成中的作用。小鼠模型将通过基因操作被用于改变Notch、Foxo1和胰岛素受体活性。将在Notch4和胰岛素受体敲除小鼠和来自这些小鼠的胚胎成纤维细胞中评价脂肪形成和代谢功能障碍。胚胎的和视网膜血管生成将在单一缺乏Notch1、Notch4和/或Foxo1的小鼠中评价。最后在缺氧-驱使的视网膜血管生成小鼠模型中评价Notch和Foxo1信号传导在增殖性视网膜病中的作用。本人的职业目标是成为一名在糖尿病研究领域中的独立的科学研究者。
评价Notch在新陈代谢中的作用
我们发现Notch和一种胰岛素信号传导转录调节剂Foxo1与CS1形成转录复合物来调节细胞命运决定。Foxo1的一个等位基因缺失挽救在胰岛素受体单一缺乏小鼠中的高血糖症和超高胰岛素血症。同样地，与野生型同窝出生仔相比较，小鼠缺失Notch4与低血糖水平有关。Foxo1和Notch4共用成年鼠胰脏β-细胞中的重叠表达模式，而Notch1在α-细胞和β-细胞中都表达。在这个目标中，我们将进一步表现Notch突变型小鼠的新陈代谢特征。我们也将检测是否在Notch和Notch/Foxo1突变型小鼠的胰脏中存在缺陷。
评价Notch4在脂肪形成中的功能
我们已发现Notch4敲除小鼠具有更大的脂肪组织库。在皮肤中，Notch4在脂细胞和血管中都表达。Notch4也通过细胞自主的或细胞非自主的机制调节脂肪形成。在细胞自主模式中，Notch在脂肪细胞中起作用调节在间质血管部分的定型的前脂肪细胞的分化。另外，Notch可调节脂肪组织中的血管生成，然后对脂肪形成起作用。我们确定Notch和Foxo1协作抑制激素诱导的培养的成纤维细胞的脂肪形成。在胰岛素受体突变型小鼠中，通过抑制Foxo1干扰脂肪形成和部分地拯救分化。然而，仍未知是否Notch功能畸形能影响胰岛素依赖的脂肪细胞在体内分化和起的作用。为开始解释该问题，我们将进一步表现Notch突变型小鼠中的脂肪表型的特征，并主要关注皮下的和内脏的脂肪库。然后我们将检测是否Notch4缺乏挽救Insr突变型小鼠中的皮下脂肪表型。最后，我们将评价Notch在来自Notch4和Insr缺失小鼠的胚胎成纤维细胞的脂肪细胞分化中的作用。我们的目标是检测Notch和胰岛素信号传导相互作用在脂肪细胞分化中的作用。
糖尿病和肥胖症
肥胖症是胰岛素耐受、高血糖症和2型糖尿病发展的主要的危险因素{Eckel，2005#769}。它也与心血管功能障碍有关。脂肪组织在能量过多时贮存甘油三酯以及在能量缺乏时释放游离脂肪酸和甘油中起重要的代谢作用。此外，脂肪细胞通过产生大量生物活性物质(称为脂肪因子)调节代谢体内平衡。脂肪因子包括激素细胞因子类、生长因子和其它生物活性化合物。主题包括瘦素、肿瘤坏死因子α、血管紧张素II、细胞白介素-6、细胞白介素-1、脂连素、抵抗素和前列腺素类。这些分泌的因子在调节代谢和血管生理中起主要作用，并且这样已被认为是在胰岛素耐受和心血管疾病之间起连接作用。
肥胖症的发展看起来是由胰岛素信号传导调节的并依赖于血管生成。在脂肪细胞，胰岛素信号传导诱导血管内皮生长因子(VEGF){Mick，2002#767}。VEGF是一有效的血管生成诱导物，能促进内皮细胞增殖、迁移和分化，以及血管壁泄漏(vessel wall leakiness){Yancopoulos，2000#65}。在小鼠肥胖症模型中，VEGF拮抗剂不仅破坏血管生成，还阻止脂肪形成{Rupnick，2002#766；Fukumura，2003#768}。因此在脂肪组织中，存在有相互的旁分泌调节脂肪细胞分化和血管生成。
Notch在脂肪形成中的作用
Notch在脂肪细胞分化中的作用才刚开始被阐述。采用体外实验，Notch信号传导已被显示都促进和抑制激素诱导的成纤维细胞的脂肪形成。在基质细胞系，Notch干扰成骨细胞分化然后导致脂肪细胞分化增加{Sciaudone，2003#772}。相反地，配体调节的Notch信号传导或组成性激活突变基因Notch1的异位表达抑制3T3-L1成纤维细胞的脂肪形成{Garces，1997#177；Ross，2004#773}。同样地，Notch靶基因HES1的过表达抑制成纤维细胞的脂肪细胞分化{Ross，2004#773}。siRNA破坏的HES1表达也阻止成纤维细胞脂肪细胞分化。因此，Notch的抑制和激活干扰脂肪形成表明脂肪形成对Notch信号传导是剂量敏感的。
Notch介导的成纤维细胞脂肪形成的抑制与脂肪细胞特异性基因C/EBPα和PPARγ的缺失有关。在其中Notch信号传导被激活的成纤维细胞的脂肪细胞分化由C/EBPα或PPARγ□的表达挽救，表面Notch通过抑制这两种基因表达来抑制脂肪形成。与成纤维细胞数据一致，类维生素A诱导的脂肪形成轻微上调Notch1敲除胚胎样的抗体{Nichols，2004#770}。最后，发现Notch1表达在从与胰岛素敏感患者相关的胰岛素耐受患者分离得到的脂肪组织中降低，表明Notch在糖尿病相关的脂肪细胞分化中起作用{Yang，2003#777}。
糖尿病的血管并发症
糖尿病患者显示了多种血管并发症，包括动脉高血压、中风、局部缺血、视网膜病变、动脉粥样硬化和心脏病发作。然而，很少有人知道关于促成糖尿病血管并发症的分子机制。失明是所述并发症中的一种，具有血管起源，但人们对其知之甚少。在20年的诊断中，四分之一的糖尿病患者发展了会导致失明的增殖性视网膜病。糖尿病视网膜病开始时是血管渗透性增加，基膜变厚和在视网膜微血管系统中的周细胞缺失，然后是新生血管形成的增殖期{Cukiernik，2004#749}。在糖尿病增殖性视网膜病的发育中涉及到血管生长因子(VEGF)。VEGF信号传导可促进内皮细胞增殖、迁移、分化和血管壁泄漏{Yancopoulos，2000#65}。在I型和II型糖尿病小鼠模型中，在眼睛中发现低氧感应转录因子、HIF-1α和VEGF增加{Kondo，2004#744}，表明缺氧是糖尿病视网膜病变发展的开始事件。由于VEGF是HIF-1α的直接的转录靶点，VEGF的诱导作用可能由HIF-1α介导{Yancopoulos，2000#65}。支持VEGF在糖尿病视网膜病变中的作用，VEGF在灵长类眼睛中的异位表达导致增殖性视网膜病和黄斑水肿的快速发展{Lebherz，2005#748}。在一糖尿病大鼠模型中，皮下注射VEGF受体信号传导抑制剂SU5416抑制VEGF诱导的视网膜微血管通透性和血管收缩{Cukiernik，2004#749}。最后，玻璃体内注射所有三个VEGFRs的抑制剂PTK/ZK，减少缺氧小鼠模型中的视网膜新血管形成{Maier，2005#750}。因此，VEGF信号传导失调在增殖性视网膜病的发展中起关键作用，也可能促成其它糖尿病血管并发症。
评价Notch在新陈代谢中的作用
我们发现Notch和一种胰岛素信号传导转录调节剂Foxo1与CS1形成转录复合物来调节细胞命运决定。Foxo1的一个等位基因缺失挽救在胰岛素信号传导缺乏小鼠中的高血糖症和超高胰岛素血症(Nakae 2002ng)。与野生型同窝出生仔相比较，小鼠缺失Notch4与血糖水平显著降低有关。和Foxo1一样，Notch4可能抑制在调节新陈代谢中的胰岛素信号传导。循环的葡萄糖和胰岛素水平由产生葡萄糖的组织例如肝脏和产生胰岛素的胰脏胰岛β-细胞。在Foxo1转基因的β-细胞中的Foxo1信号传导上调导致□-细胞衰竭和发展糖尿病(Nakea 2002ng)。Foxo1和Notch4共用成年鼠胰脏β-细胞中的重叠表达模式，而Notch1在α-细胞和β-细胞中都表达。因此Notch4和/或Notch1可能在胰岛内分泌细胞中起作用。在这个目标中，我们将进一步表现Notch突变型小鼠的新陈代谢和胰脏的特征。Notch突变型小鼠将与L2Ttr-Insr-/-小鼠杂交(图21)，并用于检测是否N4和/或N1缺失抑制在该Insr缺乏背景中观察到的糖尿病的和胰脏的缺陷。
评价Notch在脂肪形成中的作用
我们已发现N4敲除小鼠具有真皮脂肪细胞过度生长。所述N4突变型小鼠的脂肪组织表型可能来自于脂肪细胞中的细胞自主缺陷或来自于非细胞自主的血管生成缺陷。与N4无合的(nullizygous)小鼠相比较，Insr缺乏的小鼠显示了脂肪组织发育障碍{Cinti，1998#774；Kitamura，2004#745}(Okamoto JCI 2004)。显性失活的Foxo1的异位表达恢复了Insr胚胎成纤维细胞的脂肪形成{Nakae，2003#765}。我们发现Notch和Foxo1协作抑制激素诱导的成纤维细胞的脂肪形成。由于Foxo1与胰岛素信号传导在上位性中起作用(图3)，Notch也可能在脂肪形成中对胰岛素信号传导起相反作用。与脂肪细胞对Notch4的自主功能一致，Notch4在皮下脂肪细胞中表达。因此，我们将评价Notch对来自于Notch和Notch；Insr缺乏的小鼠的胚胎成纤维细胞的脂肪形成的作用。我们将进一步表现皮下脂肪缺陷的特征并评价Notch突变型小鼠中的内脏脂肪库。最后，我们将检测是否Notch4缺乏挽救Insr突变型小鼠中的真皮脂肪组织缺陷。
在肥胖症小鼠模型中，VEGF拮抗剂阻止血管生成和脂肪形成{Rupnick，2002#766；Fukumura，2003#768}，表明存在有相互的调节脂肪形成和血管生成。由于N4无合的(nullizygous)小鼠也显示视网膜血管生成的缺陷，观察到的皮下脂肪组织的增加可能源于内皮细胞功能障碍。因此，我们也将检测是否在Notch突变型小鼠的脂肪组织血管系统中存在差别。
第八系列实验
存在鼠血清中的大鼠Notch1引诱物
检测大鼠Notch1引诱物在哺乳动物血液中形成的稳定性。如图118所示，Notch引诱物在鼠循环系统中稳定。
对裸鼠注射对照的腺病毒或腺病毒表达的大鼠Notch1引诱物(rN1引诱物)。注射后2周，采集血清，且4微升的血清用Western印迹分析评价。该分析表明全长大鼠Notch1引诱物蛋白质(参见图118中箭头)可在小鼠中表达并以可检测水平存在且没有降解的迹象。
第九系列实验
人Notch1引诱物(h-Notch (1-36)引诱物)和大鼠Notch1引诱物阻止小鼠乳房肿瘤生长
比较人Ntoch1引诱物和大鼠Notch1引诱物的抵抗乳房肿瘤细胞系Mm5MT-FGF4的生长的活性。如图119所示，hNotch1引诱物和rNaotch1引诱物降低Mm5Mt-FGF4的生长率。
我们采用在裸鼠中生长的Mm5MT-FGF4细胞制备肿瘤模型，在该实验中，2×105个Mm5MT-FGF4细胞被植入裸鼠中，四天后编码Fc对照的腺病毒、大鼠Notch1引诱物或人Notch1引诱物被注射入眼静脉中。Notch引诱物由腺病毒感染的小鼠肝脏产生并分泌到血液中(图118中的实例)。图119中的生长曲线表明大鼠Notch1引诱物或人Notch1引诱物降低裸鼠中肿瘤异种移植物的生长。
大鼠Notch1引诱物抑制SKNEP1转移到肺组织
Notch1引诱物可阻止小鼠模型中的转移。我们检测大鼠Notch1引诱物抑制Ewing肉瘤细胞系SKNEP的肿瘤生长和转移的活性。在该肿瘤模型中，SKNEP肿瘤细胞被常位移植到肾脏，在这里肿瘤生长然后迁移到肺。大鼠Notch1引诱物在SKNEP肿瘤细胞中的表达减少了肿瘤生长和迁移到肺，如图120所示。
SKNEP1尤文氏(Ewings)肉瘤细胞被安排表达对照Fc蛋白或大鼠Notch1引诱物s1(种类2(sort2))或大鼠Notch1引诱物s4(种类4)。这些SKNEP1细胞系被常位移植到裸鼠的肾脏。肿瘤生长6周，对迁移到肺进行组织学评价。表达大鼠Notch1引诱物的SKNEP1细胞显示较少的肺对迁移呈阳性。我们推断大鼠Notch1引诱物在裸鼠中的表达降低了SKNEP1细胞迁移到肺的能力。
第十系列实验
Notch1和Notch4与VEGFR-3和LYVE-1在小鼠皮肤的淋巴管中共表达
Notch1和Notch4在小鼠皮肤的淋巴管中表达
我们分析Notch1和Notch4在小鼠P4背部皮肤脉管系统中的表达。在这个时间点，真皮淋巴管正活跃地重新塑造成靠近表面的淋巴毛细管和在较低真皮层的集合管。5μm皮肤的横切片用抗Notch1或Notch4(红色)以及PECAM、VEGFR-3或LYVE-1(绿色)的抗体共染色。Notch1和Notch4与血液和淋巴管内皮细胞标记物PECAM共用重叠的表达模式(较上面的组，图121)。Notch1和Notch4与VEGFR-3(中间的组，图121)和LYVE-1在真皮脉管系统共表达(较下面的组，图121)。该表达模式证明Notch1和Notch4被表达并且可能在新生儿的真皮淋巴管中起作用。
真皮淋巴毛细管在Notch4突变型小鼠中被改变
我们检测P4小鼠的真皮淋巴管。野生型和Notch4无合的(nullizygous)切片用抗PECAM和LYVE-1(绿色)的抗体免疫染色。PECAM染色分析显示在突变型与野生型皮肤之间具有相似性(较上面的组，图122)。相反地，在Notch4突变型的真皮中的LYVE-1阳性导管(vessels)比野生型的LYVE-1阳性导管具有不同的形态(中间的组，图122)。Notch4突变型LYVE-1导管通常扩大且LYVE-1导管染色为不连续的(较低的组，图122)。这些结果显示Notch4信号传导可能参与重塑淋巴管丛。
缺失Notch4导致LYVE-1阳性导管减少
交配Notch4杂合的(N4+/-)小鼠，除去得到的小鼠的背部皮肤并在出生后14天植入背部皮肤。结果在图123中阐明。为了内皮细胞标记物PECAM(数据未显示)或淋巴管内皮细胞标记物LYVE1(A)对皮肤的横切片进行免疫染色。通过显微镜记录每个横切片的五个区域并采用成像软件定量PECAM和LYVE1染色(B，C)。与野生型(WT)真皮相比较，在N4+/-真皮中的PECAM表达下降将近25％(B)。相对于WT小鼠，在N4+/-中LYVE-1染色比PECAM更受影响，LYVE1染色下降将近50％(C)。相对于WT(A)，在N4+/-淋巴管中的LYVE1染色的密度也有减少(A)。
小鼠的Notch4功能缺失破坏真皮淋巴管的发育表明在淋巴管生成中的作用。
Notch1和Notch4存人乳腺癌中表达
我们采用抗VEGFR-3或LYVE-1(绿色)和人乳腺癌的Notch1或Notch4(红色)进行双重免疫组织化学。结果在图124中阐明。Notch1和Notch4在人微乳头状乳腺癌的肿瘤外的(extratumoral)血液和淋巴管内皮中表达。为检测是否Notch1信号传导在肿瘤淋巴管内皮中激活，我们用抗podoplanin(绿色)和N1Va1(红色；细胞信号传导)的抗体以及一特异检测激活的Notch1肽的抗体双重染色。在大部分(白色箭头)但不是所有(黄色箭头)的淋巴管内皮细胞核(较下面的组)中观察到的激活的Notch1肽的表达。这些结果证明Notch1在病理的淋巴管中活跃地传导信号。这些数据也证明Notch1和Notch4可能在肿瘤淋巴管生成中起作用。
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Claims (101)

1.一种融合蛋白，包括一信号肽、一人Notch受体蛋白的胞外域和与其结合的抗体的Fc部分。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述Notch受体蛋白是Notch1受体蛋白。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
7.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
8.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
9.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
10.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述抗体的Fc部分是人抗体的Fc部分。
11.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽是Notch1、Notch2、Notch3、Notch4或IgG重链的信号肽。
12.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-36。
13.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-13。
14.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-24。
15.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-23。
16.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-36。
17.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列13-24。
18.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述Notch1受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列25-36。
19.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-29。
20.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-13。
21.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列1-23。
22.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-23。
23.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列9-29。
24.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列13-23。
25.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述Notch4受体蛋白的胞外域包括EGF样重复序列21-29。
26.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：54所示。
27.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：55所示。
28.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：56所示。
29.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：57所示。
30.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：58所示。
31.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：59所示。
30.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：58所示。
31.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：59所示。
32.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：60所示。
33.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：61所示。
34.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：62所示。
35.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：63所示。
36.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：64所示。
37.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：65所示。
38.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：66所示。
39.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：67所示。
40.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：68所示。
41.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：69所示。
42.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：70所示。
43.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：71所示。
44.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：72所示。
45.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：73所示。
46.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：74所示。
47.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：75所示。
48.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ IDNO：78所示。
49.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：79所示。
50.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：80所示。
51.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：81所示。
52.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：82所示。
53.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：83所示。
54.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：84所示。
55.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：85所示。
56.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：86所示。
57.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：87所示。
58.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连续氨基酸，所述连续氨基酸的序列如SEQ ID NO：88所示。
59.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：89所示。
60.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：90所示。
61.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：91所示。
62.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：92所示。
63.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：93所示。
64.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：94所示。
65.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：95所示。
66.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：96所示。
67.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：97所示。
68.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：98所示。
69.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：99所示。
70.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：100所示。
71.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：101所示。
72.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：102所示。
73.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白由连续核苷酸编码，所述连续核苷酸的序列如SEQ ID NO：103所示。
74.一种治疗患有肿瘤的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的如权利要求1-73所述的融合蛋白，从而治疗所述患有肿瘤的患者。
75.一种抑制患者的血管生成的方法，包括给患者施予能有效抑制所述患者的血管生成的有效量的如权利要求1-73所述的融合蛋白，从而抑制所述患者的血管生成。
76.一种治疗患有卵巢癌的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的如权利要求1-73所述的融合蛋白，从而治疗所述患有卵巢癌的患者。
77.一种治疗患有代谢紊乱的患者的方法，包括给患者施予能有效治疗所述患者的有效量的如权利要求1-73所述的融合蛋白，从而治疗所述患有代谢紊乱的患者。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、局部缺血、中风或心血管疾病。
79.根据权利要求1-73所述的融合蛋白在制备用于治疗患有肿瘤的患者的药物组合物中的用途。
80.根据权利要求1-73所述的融合蛋白在制备用于抑制患者的血管生成的药物组合物中的用途。
81.根据权利要求1-73所述的融合蛋白在制备用于治疗患有卵巢癌的患者的药物组合物中的用途。
82.根据权利要求1-73所述的融合蛋白在制备用于治疗患有代谢紊乱的患者的药物组合物中的用途。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病、肥胖症、动脉粥样硬化、局部缺血、中风或心血管疾病。
84.一种抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的生理的淋巴管生成或病理的淋巴管生成的有效量的如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述病理的淋巴管生成是肿瘤淋巴管生成或淋巴结迁移。
86.一种抑制患者的肿瘤迁移的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的肿瘤迁移的有效量的如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白。
87.根据权利要求86所述的方法，其中，所述迁移通过血管、淋巴管系统或淋巴结发生。
88.一种抑制患者的继发性肿瘤生长的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的继发性肿瘤生长的有效量的如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白。
89.根据权利要求88所述的方法，其中，通过抑制与所述继发性肿瘤相关的血管生成而抑制所述继发性肿瘤。
90.一种抑制患者的肿瘤共同选择血管的方法，包括给患者施予能有效抑制患者的肿瘤共同选择血管的有效量的如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白。
91.一种治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白以及血管内皮生长因子(VEGF)的抑制剂，所述融合蛋白和血管内皮生长因子的抑制剂的给药量均为有效治疗患者的癌症的有效量。
92.根据权利要求91所述的方法，其中，所述VEGF抑制剂是VEGF-A、PGIF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D的抑制剂。
93.一种治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白以及VEGF受体抑制剂，所述融合蛋白和VEGF受体抑制剂的给药量均为有效治疗患者的癌症的有效量。
94.根据权利要求93所述的方法，其中，所述VEGF受体抑制剂是VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂或VEGFR-3抑制剂。
95.一种治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白以及血小板来源的生长因子(PDGF)，所述融合蛋白和血小板来源的生长因子的给药量均为有效治疗患者的癌症的有效量。
96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述血小板来源的生长因子是PDGF-A抑制剂或PDGF-B抑制剂。
97.一种治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白以及PDGF受体拮抗剂，所述融合蛋白和PDGF受体拮抗剂的给药量均为有效治疗患者的癌症的有效量。
98.根据权利要求97所述的方法，其中，所述PDGF受体拮抗剂是PDGF受体-B拮抗剂。
99.一种治疗患者的癌症的方法，包括给患者施予如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白以及HER2/neu抑制剂，所述融合蛋白和HER2/neu抑制剂的给药量均为有效治疗患者的癌症的有效量。
100.一种治疗血管增殖性视网膜病的方法，包括给患者施予治疗所述血管增殖性视网膜病的有效量的如权利要求1-73任一项所述的融合蛋白。
101.根据权利要求100所述的方法，其中，所述血管增殖性视网膜病是糖尿病视网膜病、黄斑变性或早产儿视网膜病。
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