CN114062682A - Notch3作为检测靶标的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了NOTCH3作为检测靶标在制备早期诊断动脉粥样硬化的试剂盒中的应用，该NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中。本发明中的NOTCH3作为早期离体诊断动脉粥样硬化和离体诊断动脉血管平滑肌病变的生物标志物，可实现可视化的检测，检测准确率高，且检测迅速。

Description

NOTCH3作为检测靶标的应用
技术领域
本发明属于医学生物学技术领域，具体涉及NOTCH3作为检测靶标的应用。
背景技术
动脉粥样硬化是危害血管健康的重要疾病，由脂质代谢障碍引发，促进动脉血管平滑肌分裂、形态状态，并募集免疫细胞，最终堆积于血管中膜层内测，形成坏死斑块。动脉粥样硬化斑块的破裂，导致血栓的形成，是引发心绞痛、心梗、脑梗的直接病理原因，对生命健康的危害极大。
血管内膜增生是由血管平滑肌细胞分裂增殖导致，在高脂等血液环境的刺激下，血管平滑肌细胞开始分裂并聚集于血管内皮细胞与平滑肌细胞的分界面，导致血管壁增厚，血管变窄等临床表型。血管内膜增生是多数动脉粥样硬化斑块形成的前提调节，分裂增殖的血管平滑肌细胞转分化形成类巨噬细胞，吞噬脂类物质、并逐渐转变成泡沫细胞、最终堆积成动脉粥样硬化斑块的坏死内核。然而，血管内膜增生发生频率远高于动脉粥样硬化，并且只有部分内膜增生的血管最终发展成了动脉粥样硬化斑块，由内膜增生发展到动脉粥样硬化的调节机制尚不清晰。
目前对于外科手术中切除下来的动脉血管样本是否存在动脉粥样硬化缺乏可靠的评价标准，多数情况下依赖于医生的经验、根据离体动脉组织样本的外形变化进行大致判断。具体来说，就是基于医生经验，根据切除下来的离体动脉组织样本的表面形态，如黑色不光滑，则判断为动脉瘤；如表面有淡黄色突起(需是刚分离的、未经冷冻的组织才可以看到)，可以判断为动脉粥样硬化斑块。但是，这种评价方法存在以下缺陷：1.冻存后再融化的样本形态学发生改变，极难再观察到；2.对医生经验的依赖度大，对于青年或者发病较轻的样本，很难判断；3.准确度无法保证。此外目前也没有可靠的分子诊断的手段，因此也就难对于动脉粥样硬化的发展进行精准有效的预判和预警。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供NOTCH3作为检测靶标的应用。
本发明采用技术方案之一为：
NOTCH3作为早期离体诊断动脉粥样硬化的检测靶标的应用，其特征在于：所述NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中，其与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
本发明采用技术方案之二为：
NOTCH3作为离体诊断动脉血管平滑肌病变的检测靶标的应用，其特征在于：所述NOTCH3的量与所述动脉血管平滑肌病变负相关。
本发明采用技术方案之三为：
连接有荧光染料的NOTCH3抗体在制备早期离体诊断动脉粥样硬化的试剂盒中的应用，其特征在于：所述NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中，并与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
本发明采用技术方案之四为：
连接有荧光染料的NOTCH3抗体在制备离体诊断动脉血管平滑肌病变的试剂盒中的应用，其特征在于：所述NOTCH3与所述动脉血管平滑肌病变的病变负相关。
本发明的技术方案之五为：
一种早期离体诊断动脉粥样硬化的试剂盒，包括能够可视化检测NOTCH3的量的试剂，其中，NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中。
在本发明的一个优选实施方案中，所述NOTCH3的量与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
进一步优选的，包括连接有荧光染料的抗NOTCH3抗体
本发明的技术方案之六为：
一种离体诊断动脉血管平滑肌病变的试剂盒，包括能够可视化检测NOTCH3的量的试剂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述NOTCH3的量与所述动脉血管平滑肌细胞病变负相关。
进一步优选的，：包括连接有荧光染料的抗NOTCH3抗体
本发明的有益效果是：本发明中的NOTCH3作为早期离体诊断动脉粥样硬化和离体诊断动脉血管平滑肌病变的生物标志物，为检测离体动脉组织样本内的斑块存在与否提供了可靠的分子标记物，通过技术手段弥补了现有技术中的缺陷，可实现可视化的检测，检测准确率高，检测迅速，同时降低对经验的依赖度。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验结果图。
图2为本发明实施例2的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)主动脉夹层等外科手术中获得的含有动脉中膜层的血管样本：外科手术中切除下来的含有中膜层的动脉血管样本，置于冰面上，以最大程度保持血管的原始活性，随即转移至病理实验室进行详细检测，全程冷链运输。
(2)OCT包埋后迅速冷冻：冷链保存的血管样本，经4％的多聚甲醛固定5min，根据测试的紧急程度，可延长固定时间至15min或省去该操作；经固定或者新鲜的血管样本，置于OCT试剂(Sakura 4583)内，并迅速转移至-80℃冰箱内，冷却固定30min。
(3)切片后免疫荧光染色：冷冻固定后的血管样本转移至-20℃的冷冻切片机内，将血管样本从径向切出8μm厚度的环状结构，粘附于粘性载玻片上。随即使用一步法对于血管内NOTCH3的表达量进行定性检测，一步法如下：使用4％的多聚甲醛固定液对载有血管样本的片子固定5min，随后使用PBS(pH＝7.4)洗涤1-3次，接着于PBTG缓冲液(0.2％TritonX-100，0.5％v牛血清白蛋白和2％，以PBS溶解)静置60min；然后使用连接有荧光染料AlexaFluor 488的抗NOTCH3抗体对室温样本孵育1-3h，再次使用同样PBS洗脱1-3次，最后使用含有DAPI的封片剂对样本进行封片处理，进行观察。
本实施例的具体结果如图1所示，可对动脉血管平滑肌是否病变，且该病变是否会发展成动脉粥样硬化进行定性判断，其中动脉中膜层中靠近动脉外膜层的部分通常较稳定，可作为对照比较是否存在NOTCH3。具体结果为：当动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜未出现对应NOTCH3的荧光时，则判定动脉血管平滑肌并未发生病变，并未发展成动脉粥样硬化；而当动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜出现对应NOTCH3的荧光时，则判定动脉血管平滑肌发生病变，其该病变已发展成动脉粥样硬化。
实施例2
(1)主动脉夹层等外科手术中获得的含有动脉中膜层的血管样本：外科手术中切除下来的含有中膜层的动脉血管样本，置于冰面上，以最大程度保持血管的原始活性，随即转移至病理实验室进行详细检测，全程冷链运输。
(2)OCT包埋后迅速冷冻：冷链保存的血管样本，经4％的多聚甲醛固定5min，根据测试的紧急程度，可延长固定时间至15min或省去该操作；经固定或者新鲜的血管样本，置于OCT试剂(Sakura 4583)内，并迅速转移至-80℃冰箱内，冷却固定30min。
(3)切片后免疫荧光染色：冷冻固定后的血管样本转移至-20℃的冷冻切片机内，将血管样本从径向切出8μm厚度的环状结构，粘附于粘性载玻片上。随即使用二步法对于血管内NOTCH3的表达量进行定性检测，二步法如下：使用4％的多聚甲醛固定液对载有血管本的片子固定5min，随后使用PBS(pH＝7.4)洗脱1-3次，接着于PBTG缓冲液(0.2％TritonX-100，0.5％v牛血清白蛋白和2％，以PBS溶解)静置60min；然后使用抗NOTCH3的一抗室温孵育1-3h，再次使用同样的PBS洗脱2-3次；再使用连接有荧光染料Alexa Fluor 546的二抗识别并结合一抗，孵育1-3h后，使用同样的PBS洗脱1-3次，最后使用含有DAPI的封片剂对样本进行封片处理，进行观察。
本实施例的具体结果如图2所示，可对动脉血管平滑肌是否病变，且该病变是否会发展成动脉粥样硬化进行定性判断，其中动脉中膜层中靠近动脉外膜层的部分通常较稳定，可作为对照比较是否存在NOTCH3。具体结果为：当动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜未出现对应NOTCH3的荧光时，则判定动脉血管平滑肌并未发生病变，并未发展成动脉粥样硬化；而当动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜出现对应NOTCH3的荧光时，则判定动脉血管平滑肌发生病变，其该病变已发展成动脉粥样硬化。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.NOTCH3作为早期离体诊断动脉粥样硬化的检测靶标的应用，其特征在于：所述NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中，其与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
2.NOTCH3作为离体诊断动脉血管平滑肌病变的检测靶标的应用，其特征在于：所述NOTCH3的量与所述动脉血管平滑肌病变负相关。
3.连接有荧光染料的NOTCH3抗体在制备早期离体诊断动脉粥样硬化的试剂盒中的应用，其特征在于：所述NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中，并与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
4.连接有荧光染料的NOTCH3抗体在制备离体诊断动脉血管平滑肌病变的试剂盒中的应用，其特征在于：所述NOTCH3与所述动脉血管平滑肌病变的病变负相关。
5.一种早期离体诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其特征在于：包括能够可视化检测NOTCH3的量的试剂，其中，NOTCH3位于动脉中膜层与动脉内膜层之间的增生内膜中。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述NOTCH3的量与所述增生内膜中的血管平滑肌细胞的病变负相关。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：包括连接有荧光染料的抗NOTCH3抗体。
8.一种离体诊断动脉血管平滑肌病变的试剂盒，其特征在于：包括能够可视化检测NOTCH3的量的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述NOTCH3的量与所述动脉血管平滑肌细胞病变负相关。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：包括连接有荧光染料的抗NOTCH3抗体。
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