ES2818184T3 - Anticuerpo anti-Notch 4 humano - Google Patents

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ES2818184T3 ES16780097T ES16780097T ES2818184T3 ES 2818184 T3 ES2818184 T3 ES 2818184T3 ES 16780097 T ES16780097 T ES 16780097T ES 16780097 T ES16780097 T ES 16780097T ES 2818184 T3 ES2818184 T3 ES 2818184T3
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Yusuke Adachi
Junji Matsui
Yu Kato
Yoichi Ozawa
Takanori Abe
Ken Ito
Yuya Nakazawa
Sho Tachino
Katsuhisa Suzuki
Kishan Agarwala
Kana Hoshino
Masahiko Katayama
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Abstract

Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras y se selecciona entre cualquiera de los siguientes (i) - (vii): (i) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, (ii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, (iii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47, (iv) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49, (v) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51, (vi) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, y (vii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-Notch 4 humano
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a Notch4 humano.
Antecedentes de la técnica
Notch es una molécula que contribuye en la determinación del destino de las células de varios tejidos y se indica que participa, por ejemplo, en la diferenciación, proliferación y supervivencia durante cada uno de los estadios del estadio inicial de desarrollo, estadio embriónico y después del nacimiento. Se describen cuatro tipos de receptores, que incluyen Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4, así como cinco tipos de ligandos, que incluyen Jaggedl, Jagged2, DLL1, DLL3 y DLL4, como la familia Notch. Cuando un receptor Notch expresado en una célula adyacente se une a un ligando de Notch, el dominio NRR presente en el dominio extracelular inferior del receptor es escindido por parte de TACE y, debido al cambio estructural del dominio intracelular provocado de este modo, el dominio intracelular es escindido por la secretasa y. El dominio intracelular de Notch (NIC) formado como resultado migra hacia el núcleo, forma un heterodímero con el factor de transcripción CSL y se inducen y expresan moléculas diana tales como la familia aHes o la familia Hey. Estas moléculas de estadios posteriores inducen y expresan a su vez varios genes y, como resultado, la señal de Notch contribuye, por ejemplo, al mantenimiento de células madre o células progenitoras, la diferenciación, la detención del ciclo celular y la determinación del destino de las células (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 1).
También existe constancia de que Notch participa en la formación de tumores. En primer lugar, se ha descrito que la mutación de Notch1 debida a la traslocación cromosómica t(7;9) se relaciona con el inicio de la leucemia linfoblástica aguda de pre-linfocitos (T-ALL). Además, se ha descrito que el sitio de inserción en el genoma del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), que es un modelo de inicio de tumor espontáneo, es Int3 (dominio intracelular de Notch4) y se ha descrito que se induce cáncer de células epiteliales, tal como cáncer de mama o cáncer de glándulas salivales, en un ratón transgénico en el que se ha expresado Int3 de forma forzada (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 2). También se ha descrito que Notch4 se relaciona con la oncogénesis, evolución o metástasis del cáncer de mama (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 3), melanoma (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 4), cáncer de estómago (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 5), leucemia linfocítica aguda de linfocitos B (B-ALL) (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 6), leucemia linfocítica crónica (CLL) (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 7), glioma (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 8), carcinoma hepatocelular (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 9), cáncer pulmonar (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 10), cáncer renal (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 11), sarcoma de Kaposi (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 12) y similares en seres humanos.
La señal de Notch también contribuye a la neovascularización intratumoral. Notch1 y Notch4 se expresan como receptores Notch en células endoteliales vasculares y la expresión de DLL4 y Jagged1 se confirma como ligandos. Las células endoteliales activadas (tip cells) presentes en el extremo de los nuevos vasos sanguíneos expresan en gran medida DDL4 con estimulación de VEGF y los vasos sanguíneos se extienden enviando una señal al receptor Notch de la célula del tallo adyacente. Por otro lado, Jagged1 compite con DLL4 por el receptor Notch e inhibe la unión de DLL4 con el receptor Notch. Debido a que la señal de Jagged1 es débil en comparación con la de DLL4, la señal de Notch se suprime mediante la unión con Jagged1. La intensidad de la señal de Notch se ajusta mediante los patrones de expresión que difieren espacialmente de estos dos ligandos para controlar la neovascularización (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 13).
Se ha descrito la producción de un anticuerpo inhibidor de DLL4, donde cuando la señal procedente de DLL4 es inhibida con un anticuerpo inhibidor de DLL4, se potencia la angiogénesis inmadura sin torrente sanguíneo dentro de un tumor y se induce la inhibición de la proliferación tumoral. Esto es un fenómeno completamente diferente al caso en el que un inhibidor de VEGF inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares para suprimir la angiogénesis, y la señal de Notch está ganando atención como diana novedosa para inhibidores de la neovascularización (Referencia de la bibliografía distinta de patentes 14).
El documento US 2011/0033481 describe que la vía de Notch, especialmente Notch 4, representa una vía central en la carcinogénesis. Se describen composiciones de células madre de tumores sólidos, métodos para distinguir poblaciones funcionalmente diferentes de células tumorales, métodos para utilizar estas poblaciones de células tumorales para estudiar los efectos de agentes terapéuticos sobre el crecimiento tumoral, y métodos para identificar y evaluar terapias novedosas contra el cáncer dirigidas a las células madre de tumores sólidos.
Lista de citas
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 1] Radtke et al. (2004), Nature Immunology 5,247-53.
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 2] Jhappan et al. (1992), Genes Dev. 6,345-55
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 3] Nagamatsu et al. (2014), Anticancer Res. 34, 69-80 [Referencia de la bibliografía distinta de patentes 4] Hardy et al. (2010), Cáncer Res. 70, 10340-50
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 5] Qian et al. (2015), Mol Cell Biochem. 401, 165-74 [Referencia de la bibliografía distinta de patentes 6] Nwabo Kamdje et al. (2011), Blood 118, 380-9
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 7] Nwabo Kamdje et al. (2012), Blood Cancer Journal 2, e73 [Referencia de la bibliografía distinta de patentes 8] Dell'Albani et al. (2012), Neuro-Oncology 16, 204-16 [Referencia de la bibliografía distinta de patentes 9] Ahn et al. (2013), Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 12, 286-94 [Referencia de la bibliografía distinta de patentes 10] Justilien et al. (2012), PLoS ONE 7, e35040
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 11] Boo et al. (2009), J Pediatr Surg. 44, 2031-6
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 12] Curry et al. (2005), Oncogene 24, 6333-44
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 13] Benedito et al. (2009), Cell 137, 1124-35
[Referencia de la bibliografía distinta de patentes 14] Ridgway et al. (2006), Nature 444, 1083-7
Compendio de la invención
Problemas que ha de resolver la invención
El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un anticuerpo anti-Notch4 humano o un fragmento de unión a Notch4 de este que pueda tener actividad neutralizante frente a Notch4 humano, así como también una composición farmacéutica que comprende el mismo como principio activo.
Medios para resolver los problemas
Como resultado de una investigación exhaustiva dirigida a resolver los pruebas anteriores, los inventores de la presente han sido capaces de obtener un anticuerpo anti-Notch4 humano de ratón que tiene una elevada actividad neutralizante y afinidad de unión frente a Notch4 humano. Además, al determinar la secuencia de la región determinante de la complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo anti-Notch4 humano de ratón, los inventores de la presente han hecho posible la producción de un anticuerpo humanizado que comprende la región variable de las cadenas ligera y pesada así como la secuencia de CDR de dicho anticuerpo anti-Notch 4 humano de ratón para completar la presente invención.
Dicho de otro modo, la presente divulgación se refiere a lo siguiente.
(1) Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este que comprende:
(a) una CDR1 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 15 o 16;
(b) una CDR2 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 17 o 18;
(c) una CDR3 de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 19;
(d) una CDR1 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 20;
(e) una CDR2 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 21; y
(f) una CDR3 de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 22.
(2) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras y se selecciona entre cualquiera de los siguientes (i) -(vii):
(i) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45,
(ii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45,
(iii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
47,
(iv) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
49,
(v) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
51,
(vi) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45, y
(vii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
47.
(3) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(4) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(5) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(6) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49.
(7) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51.
(8) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(9) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (2), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(10) El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (1) - (9), donde la región constante de dicha cadena pesada y la región constante de dicha cadena ligera comprenden una secuencia derivada de un anticuerpo humano.
(11) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (10), donde la región constante de la cadena pesada comprende la región constante de IgG humana.
(12) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (11), donde dicha región constante de IgG humana es la región constante de IgG2 humana.
(13) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (12), donde dicha región constante de IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o G237A.
(14) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (10), donde el residuo de lisina en el extremo carboxi de la región constante de dicha cadena pesada se elimina de forma artificial.
(15) El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (10), donde la región constante de dicha cadena ligera comprende la región constante de IgK humana.
(16) Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch de este de acuerdo con cualquiera de (1) -(15).
(17) La composición farmacéutica de acuerdo con (16) que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
(18) La composición farmacéutica de acuerdo con (17) que se utiliza para el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico.
(19) La composición farmacéutica de acuerdo con (17) que se utiliza para el tratamiento de cáncer de tiroides. (20) La composición farmacéutica de acuerdo con (17) que se utiliza para el tratamiento de cáncer de próstata. (21) La composición farmacéutica de acuerdo con (17) que se utiliza para el tratamiento de carcinoma hepatocelular. La presente invención se refiere a las siguientes invenciones.
(1') Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras y se selecciona entre cualquiera de los siguientes (i) -(vii):
(i) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45,
(ii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45,
(iii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
47,
(iv) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
49,
(v) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
51,
(vi) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
45, y
(vii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.
(2') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(3') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(4') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(5') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49.
(6') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51.
(7') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(8') El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (1'), donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(9') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (1') -(8'), donde la región constante de dicha cadena pesada y la región constante de dicha cadena ligera comprenden la región constante de un anticuerpo humano.
(10') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (9'), donde la región constante de la cadena pesada comprende la región constante de IgG humana.
(11') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (10'), donde dicha región constante de IgG humana es la región constante de IgG2 humana.
(12') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (11’), donde dicha región constante de IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o G237A.
(13') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (9') a (12’), donde el residuo de lisina en el extremo carboxi de la región constante de dicha cadena pesada se elimina de forma artificial.
(14') El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (9') a (13'), donde la región constante de dicha cadena ligera comprende la región constante de IgK humana.
(15') Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (1') -(14').
(16') La composición farmacéutica de acuerdo con (15') que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
(17') La composición farmacéutica de acuerdo con (16') para su uso en el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico.
(18') La composición farmacéutica de acuerdo con (16') para su uso en el tratamiento de cáncer de tiroides.
(19') La composición farmacéutica de acuerdo con (16') para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata.
(20') La composición farmacéutica de acuerdo con (16') para su uso en el tratamiento de carcinoma hepatocelular.
En otras realizaciones, la presente invención se refiere además a las siguientes invenciones.
(1") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(2") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(3") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(4") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49.
(5") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51.
(6") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
(7") Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras, y la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
(8") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (1") -(7"), donde la región constante de dicha cadena pesada y la región constante de dicha cadena ligera comprenden la región constante de un anticuerpo humano.
(9") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (8"), donde la región constante de la cadena pesada comprende la región constante de IgG humana.
(10") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (9"), donde dicha región constante de IgG humana es la región constante de IgG2 humana.
(11") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con (10"), donde dicha región constante de IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o G237A.
(12") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (8") a (11"), donde el residuo de lisina en el extremo carboxi de la región constante de dicha cadena pesada se elimina de forma artificial.
(13") El anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (8") a (12"), donde la región constante de dicha cadena ligera comprende la región constante de IgK humana.
(14") Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de (1") -(13").
(15") La composición farmacéutica de acuerdo con (14") que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
(16") La composición farmacéutica de acuerdo con (15") para su uso en el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico.
(17") La composición farmacéutica de acuerdo con (15") para su uso en el tratamiento de cáncer de tiroides.
(18") La composición farmacéutica de acuerdo con (15") para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata.
(19") La composición farmacéutica de acuerdo con (15") para su uso en el tratamiento de carcinoma hepatocelular.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la correlación entre la concentración de Anticuerpo B y el valor de luminiscencia relativa (%).
La Figura 2 muestra el efecto antitumoral y el efecto supresor de la perfusión sanguínea del Anticuerpo B en un modelo de xenoinjerto Calu6. La Figura 2A muestra el cambio en el volumen tumoral relativo (RTV) para cada grupo con la administración en la vena de la cola de IgG con una dosis de 10 mg/kg para el Control o de Anticuerpo B con una dosis de 1,3 o 10 mg/kg en un modelo de xenoinjerto Calu6 (N = 8, media ± error estándar). La Figura 2B muestra el resultado de la determinación del área de fluorescencia de Hoechst para tumores muestreados al final de la prueba de administración (Día 8) (N = 8 media ± error estándar) (*P < 0.05 frente al grupo de administración de IgG de Control (prueba de Dunnett)).
La Figura 3 muestra el efecto antitumoral debido al uso combinado de Anticuerpo B y cisplatino en un modelo de trasplante subcutáneo de ratón Calu6. El cambio en el volumen tumoral relativo (RTV) del grupo de control (no tratado), el grupo de administración de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana), el grupo de administración de cisplatino (administración en la vena de la cola una vez) y el grupo de combinación de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana) cisplatino (administración en la vena de la cola una vez) (N = 4, media ± error estándar) (*: P < 0.05 frente al grupo de control (prueba t de Student, Día 8, Día 24), #: P < 0.05 grupo de administración de 10 mg/kg de cisplatino frente al grupo de combinación de Anticuerpo B cisplatino (prueba t de Student, Día 36)).
La Figura 4 muestra el efecto antitumoral debido al uso combinado de Anticuerpo B y mesilato de lenvatinib en un modelo de xenoinjerto de la línea celular de cáncer de tiroides humana FTC238. El cambio en el volumen tumoral relativo (RTV) (N = 5, media ± error estándar) del grupo de control (no tratado), el grupo de administración de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana), el grupo de administración de mesilato de lenvatinib (administración oral una vez al día) y el grupo de combinación de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana) mesilato de lenvatinib (administración oral una vez al día) (*: P < 0.05 frente al grupo de control (prueba t de Student, Día 13), #: P < 0.05 grupo de administración de un solo agente frente al grupo de combinación de Anticuerpo B mesilato de lenvatinib (prueba t de Student, Día 13)).
La Figura 5 muestra el efecto antitumoral debido al uso combinado de Anticuerpo B y paclitaxel en un modelo de xenoinjerto de la línea celular de cáncer de próstata humana DU145. El cambio en el volumen tumoral (TV) del grupo de control (no tratado), el grupo de administración de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana), el grupo de administración de paclitaxel (administración en la vena de la cola una vez al día durante 5 días) y el grupo de combinación de Anticuerpo B (administración en la vena de la cola dos veces a la semana) paclitaxel (administración en la vena de la cola una vez al día durante 5 días) (N = 4, media ± error estándar) (*: P < 0.05 frente al grupo de control (prueba t de Student, Día 57)), #: P < 0.05 grupo de administración de un solo agente frente al grupo de combinación de Anticuerpo B paclitaxel (prueba t de Student, Día 57).
La Figura 6 muestra el efecto antitumoral debido al uso combinado de Anticuerpo B y mesilato de lenvatinib en un modelo de xenoinjerto de carcinoma hepatocelular derivado de un paciente humano. El cambio en el volumen del tumor (TV) del grupo de control (HCl 3 mM), el grupo de mesilato de lenvatinib (10 mg/kg), el grupo de tosilato de sorafenib (30 mg/kg) y el grupo de mesilato de lenvatinib (10 mg/kg) más Anticuerpo B (0.5 mg/ratón) (N= 10, media ± error estándar) (*: P < 0.05 frente al grupo de control, prueba t no apareada, Día 13).
La Figura 7 muestra la correlación entre la concentración de Anticuerpo B y el valor de luminiscencia relativa (%). La gráfica muestra el valor promedio de los resultados de tres pruebas independientes y la barra de error muestra la desviación estándar de estos.
La Figura 8 muestra el sensograma superpuesto de la interacción entre los dominios NRR de Notch humano y el Anticuerpo B. (A) Notch1 humano-NRR-SEAP-His, (B) Notch2 humano-NRR-SEAP-His, (C) Notch3 humano-NRR-SEAP-His y (D) Notch4 humano-NRR-SEAP-His.
Descripción de las realizaciones
En la presente, un anticuerpo se puede referir a una molécula de inmunoglobulina que se puede unir específicamente a una diana tal como un azúcar, un polinucleótido, un lípido, un polipéptido y una proteína mediante al menos un sitio de reconocimiento de antígenos situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Un anticuerpo se puede referir a un anticuerpo monoclonal o policlonal completo.
El anticuerpo puede ser de cualquier clase tal como IgG, IgA o IgM (o una subclase de estos), etc. y no se limita a ninguna clase particular. Una inmunoglobulina se clasifica en diferentes clases dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo (que se denomina en ocasiones cadena H). Existen cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, algunas de las cuales se pueden clasificar adicionalmente en subclases (isotipos) tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de la cadena pesada correspondientes a las diferentes clases de inmunoglobulina se denominan a, 5, £, y y p, respectivamente. Además, los tipos de cadena ligera (que se denomina en ocasiones cadena L) del anticuerpo incluyen las cadenas A y k.
En un aspecto, el anticuerpo anti-Notch4 humano de la presente invención puede ser un anticuerpo de tipo IgG, por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG1 o un anticuerpo de tipo IgG2, etc. Además, en algunos casos, el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este puede adoptar la forma de un monómero, un dímero o un multímero.
El fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente no está particularmente limitado, siempre que sea un fragmento estructural y funcional de dicho anticuerpo y conserve la capacidad de unión a un antígeno al que se pueda unir dicho anticuerpo. Los ejemplos del fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen, sin carácter limitante, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, de cadena única (ScFv), variantes de estos, una proteína de fusión que comprenda una porción de anticuerpo, otras estructuras modificadas de una molécula de inmunoglobulina que comprendan el sitio de reconocimiento del antígeno, y similares.
El fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo se puede obtener, por ejemplo, mediante la digestión proteolítica de un anticuerpo completo, o puede ser producido directamente por una célula hospedadora recombinante (por ejemplo, un eucariota tal como una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de mamífero, o un procariota tal como E. coli). Por ejemplo, un fragmento F(ab')2 se puede formar recolectando fragmentos Fab' -SH directamente de E. coli y sometiéndolos a una unión química. También se puede formar F(ab')2 utilizando una cremallera de leucina GCN4 que propicia el acoplamiento de una molécula F(ab')2. Además, se puede utilizar un sintetizador automático a la hora de producir scFv con una tecnología de síntesis química. Se puede introducir un plásmido adecuado que comprenda un polinucleótido que codifique scFv en una célula hospedadora adecuada (por ejemplo, un eucariota tal como una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de mamífero, o un procariota tal como E. Coli) cuando se produce ScFv con una tecnología de recombinación genética. El polinucleótido que codifica el scFv de interés se puede producir mediante una manipulación muy conocida tal como la ligación de polinucleótidos. El scFv producido como resultado se puede aislar utilizando una tecnología de purificación de proteínas estándar muy conocida en la técnica.
La región variable de un anticuerpo se puede referir a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo y/o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, y la región constante de un anticuerpo se puede referir a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo y/o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo. La región variable de las cadenas ligera y pesada está constituida cada una por cuatro regiones de entramado (FR) unidas mediante tres CDR conocidas también como regiones hipervariables. La CDR en cada cadena se mantiene próxima mediante una FR y, junto con la CDR en la otra cadena, contribuye a la formación del sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Las tecnologías para determinar CDR incluyen, sin carácter limitante, por ejemplo, (1) una estrategia basada en la variabilidad de las secuencias entre diferentes especies (tal como Kabat et al., Sequences o f Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD) ; y (2) una estrategia basada en la investigación de la estructura cristalina de complejos de antígeno-anticuerpo (Al-lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol.
273:927-948). Estas y otras estrategias se pueden utilizar combinadas.
La expresión «se une específicamente a» es una expresión muy conocida en el campo de los expertos en la técnica y los métodos para determinar la unión específica de un anticuerpo, etc. a un antígeno o un epítopo también son muy conocidos. Por ejemplo, se sobreentiende que un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al epítopo de Notch4 se puede unir a dicho epítopo de Notch4 con una actividad de unión y afinidad más elevadas, de forma más rápida y/o durante una duración más prolongada que a otro epítopo o sitios que no sean epítopos. Sin embargo, no se excluye que un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a una primera diana se una específicamente a una segunda diana.
Un anticuerpo monoclonal se puede referir a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente uniformes. Dicho de otro modo, los anticuerpos individuales contenidos en esta población son idénticos excepto por una ligera cantidad de mutantes que existen de forma natural, los cuales pueden estar presentes. Los anticuerpos monoclonales se dirigen a un único sitio del antígeno y son muy específicos. Además, al contrario de un anticuerpo policlonal habitual que tiene como diana diferentes antígenos o diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal tiene como diana un único epítopo del antígeno. El modificador «monoclonal» indica la propiedad de un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente uniforme y no se debe interpretar como que se limite al hecho de requerir que la producción del anticuerpo sea mediante un método particular.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo de mamífero no humano (tal como de ratón, rata, conejo, vaca, caballo y cabra) o un fragmento de unión al antígeno de estos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que se ha introducido, por ejemplo, la región variable de un anticuerpo no humano (tal como de ratón o rata) en la región constante de un anticuerpo humano y se puede referir, por ejemplo, a un anticuerpo en el que la región variable deriva de un anticuerpo no humano y la región constante deriva de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo en el que se ha introducido, por ejemplo, la región hipervariable (que también se denomina región determinante de la complementariedad (CDR)) de un anticuerpo no humano en un anticuerpo humano y se puede referir, por ejemplo, a un anticuerpo en el que la CDR deriva de un anticuerpo no humano y otras regiones del anticuerpo derivan de un anticuerpo humano. Cabe destacar que, en la presente invención, la frontera entre un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado no tiene por qué estar necesariamente bien definida y un anticuerpo se puede encontrar en un estado tal que se pueda denominar tanto anticuerpo quimérico como anticuerpo humanizado.
Obviamente, el anticuerpo quimérico o humanizado ilustrado anteriormente que ha sido modificado adecuadamente (tal como mediante la modificación del anticuerpo o la sustitución, adición o deleción parcial de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo) a la vez que se mantiene la función de dicho anticuerpo (o con el fin de añadir o mejorar la función de dicho anticuerpo) también se engloba en el anticuerpo de la presente divulgación. Más específicamente, en el alcance de la presente divulgación también se engloba un anticuerpo modificado mediante la tecnología POTELLIGENT™ con el fin de incrementar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (actividad (ADCC)) del anticuerpo unido a la diana, un anticuerpo modificado mediante la tecnología COMPLEGENT™ con el fin de incrementar las citotoxicidad dependiente del complemento (actividad (CDC)) del anticuerpo o un anticuerpo modificado mediante el uso combinado de estas tecnologías. Además, en el alcance de la presente divulgación también se engloba un anticuerpo en el que se ha eliminado la lisina (Lys) situada en el extremo carboxi (C terminal) de la cadena pesada mediante un método artificial tal como una modificación genética con el fin de reducir la falta de uniformidad de los anticuerpos producidos mediante células productoras de anticuerpos. Además, en el alcance de la presente divulgación también se engloba un anticuerpo biespecífico que posee un sitio de unión del anticuerpo que tiene la secuencia de CDR del anticuerpo de la presente invención junto con un sitio de unión al antígeno que se une a un antígeno diferente (Kontermann (2012), mAbs 4, 182-97).
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede modificar según se desee. La modificación del anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este puede ser una modificación que cambie (a) la estructura tridimensional de la secuencia de aminoácidos en la región modificada tal como la conformación de lámina o hélice; (b) la carga o estado de hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana; o (c) el efecto de la modificación en el volumen de la cadena lateral, o una modificación en la que estos cambios no se observen claramente.
La modificación del anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede conseguir, por ejemplo, mediante sustitución, deleción y adición, etc. de los residuos aminoacídicos que lo constituyen.
En la presente, un aminoácido se emplea en su significado más amplio e incluye, no solo los aminoácidos naturales tales como serina (Ser), asparagina (Asn), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), alanina (Ala), tirosina (Tyr), glicina (Gly), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), glutamina (Gln), treonina (Thr), cisteína (Cys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp) y prolina (Pro), sino también aminoácidos no naturales tales como derivados y variantes de aminoácidos. Los expertos en la técnica reconocerán naturalmente, teniendo en cuenta esta definición amplia, que los ejemplos de aminoácidos de la presente incluyen aminoácidos L; aminoácidos D; aminoácidos modificados químicamente tales como derivados y variantes de aminoácidos; aminoácidos que no son materiales que configuran proteínas in vivo tales como norleucina, p-alanina y ornitina; y compuestos que se sintetizan químicamente los cuales tienen propiedades de aminoácidos muy conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de un aminoácido no natural incluyen a-metilaminoácidos (tales como ametilalanina), aminoácidos D (tales como ácido aspártico D y ácido glutámico D), aminoácidos similares a la histidina (tales como 2-aminohistidina, p-hidroxihistidina, homohistidina, a-fluorometilhistidina y a-metilhistidina), aminoácidos que tienen metileno en exceso en la cadena lateral («homo»aminoácidos) y aminoácidos donde el aminoácido con un grupo funcional de tipo carboxilato en la cadena lateral está sustituido con un grupo de tipo sulfonato (tal como el ácido cisteico).
Los residuos aminoacídicos de origen natural se pueden clasificar, por ejemplo, en los siguientes grupos basándose en las propiedades de las cadenas laterales comunes:
(1) Hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu e Ile;
(2) Hidrófilos neutros: Cys, Ser y Thr;
(3) Ácidos: Asp y Glu;
(4) Básico: Asn, Gln, His, Lys y Arg;
(5) Residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: Gly y Pro; y
(6) Aromáticos: Trp, Tyr y Phe.
Una sustitución no conservativa de la secuencia de aminoácidos que configura un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este se puede llevar a cabo intercambiando un aminoácido que pertenezca a uno de estos grupos por un aminoácido que pertenezca a otro grupo. Una sustitución más conservativa se puede llevar a cabo intercambiando un aminoácido que pertenezca a uno de estos grupos por otro aminoácido que pertenezca al mismo grupo. De forma similar, se puede llevar a cabo de forma adecuada una deleción o sustitución de la secuencia de aminoácidos.
Una modificación del aminoácido que configura un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este puede ser, por ejemplo, una modificación posterior a la traducción tal como una glicosilación por parte de un azúcar, una acetilación o una fosforilación. El anticuerpo se puede glicosilar en una posición conservada en su región constante. La glicosilación de un anticuerpo se lleva a cabo habitualmente mediante una unión a través de N o una unión a través de O. Una unión a través de N se refiere a la unión de un resto de azúcar a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptícidas asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína(donde X es cualquier aminoácido distinto de prolina) son secuencias de reconocimiento para añadir enzimáticamente un resto de azúcar a la cadena lateral de la asparagina. Existe un sitio de glicosilación potencial presente cuando una de estas secuencias tripeptídicas está presente en un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este. Una glicosilación con unión a través de O puede ser la unión de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido ( tal como serina o treonina) y, en algunos casos, puede ser la unión a 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. Las condiciones de glicosilación (por ejemplo, cuando la glicosilación se lleva a cabo con un medio biológico, el tipo de célula hospedadora o medio celular, pH y similares) pueden ser seleccionadas adecuadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el objetivo.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede modificar adicionalmente basándose en el sentido común técnico con el que estarán familiarizados los expertos en la técnica mediante otros métodos de modificación solos o combinados.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede producir mediante un método con el que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo se puede producir con un hibridoma que produzca el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este, o integrando el gen que codifica el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este en un vector de expresión e introduciendo dicho vector de expresión, por ejemplo, en células de E. Coli, células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO) y similares.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este pueden ser los que se aíslan o purifican de acuerdo con métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. En la presente, «aislado» o «purificado» se refiere a que se ha aislado o purificado artificialmente a partir del estado natural. Cuando una molécula o una composición es de origen natural, está «aislada» o «purificada» cuando se ha modificado o retirado de su entorno original o ambos. Los ejemplos de un método de aislamiento o purificación incluyen, sin carácter limitante, electroforesis, medios de biología molecular, inmunológicos o cromatográficos, específicamente, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba o cromatografía de HPLC de fase inversa, o enfoque isoeléctrico.
El método empleado para medir la propiedad de unión (tal como afinidad de unión y reactividad cruzada) de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este respecto a un antígeno puede ser un método muy conocido en el campo por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la afinidad de unión se puede medir con, sin carácter limitante, un biosensor Biacore™, biosensor KinExA, ensayo de proximidad por centelleo, ELISA, inmunoensayo ORIGEN (de IGEN), citometría de flujo, desactivación de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, presentación de levaduras y/o inmunotinción. La actividad neutralizante de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este frente a la unión de Notch4 con su ligando se puede medir con, sin carácter limitante, un biosensor Biacore™, ELISA, y/o citometría de flujo. La actividad neutralizante de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este frente a la transducción de señales que es inducida dentro del cuerpo humano debido a la unión de Notch4 con su ligando, o frente a la respuesta de expresión molecular o el cambio de funcionalidad de la célula se puede medir con, sin carácter limitante, por ejemplo, los siguientes métodos: (i) un ensayo marcador que detecta la variación en la expresión de una molécula en una etapa posterior respecto a la señal de Notch, (ii) inmunotransferencia de Western que detecta la escisión de Notch4 por parte de la enzima que convierte TNF-a (TACE) o y selectasa, (iii) tinción de células inmunitarias que detecta el importe nuclear del dominio intracelular de Notch (NIC) y (iv) evaluación de la funcionalidad celular que emplea una célula normal tal como una célula endotelial vascular o una célula cancerosa que expresa Notch4.
En un aspecto, la presente invención puede ser una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este en una forma de preparado acuosa o seca puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, excipiente y/o un estabilizante. Los ejemplos de un portador aceptable, excipiente o un estabilizante incluyen solución salina; un tampón tal como ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos; un antioxidante, incluido el ácido ascórbico; un polipéptido de peso molecular bajo; una proteína (tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina); un polímero hidrófilo tal como polivinilpirrolidona; un aminoácido; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; un agente quelante tal como EDTA; alditoles tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman una sal tales como sodio; o un surfactante no iónico tal como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede encapsular, por ejemplo, en una microcápsula, en un sistema de suministro farmacológico coloidal (tal como un liposoma, una microesfera de albúmina, una microemulsión, una nanopartícula o una nanocápsula) o en una macroemulsión. Cuando se desea una administración de liberación sostenida del anticuerpo en un preparado que tenga una propiedad de liberación adecuada para cualquier enfermedad que requiera la administración del anticuerpo, se puede diseñar una microencapsulación del anticuerpo. Los ejemplos de una matriz de liberación sostenida incluyen un poliéster, un hidrogel (tal como poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vinílico)), ácidos polilácticos, un copolímero de ácido L-glutámico y Y-L-glutamato de etilo, uno de etileno-acetato de vinilo no degradable, un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico degradable tal como LUPRON DEPOT™ (una microesfera inyectable compuesta de un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Un preparado empleado para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se puede conseguir fácilmente mediante una filtración a través de una membrana de filtración estéril.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este tiene el potencial de ser útil para el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular. Dicho de otro modo, otro aspecto de la presente divulgación puede ser un método para tratar cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular que comprende un paso de administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este. Además, otro aspecto de la presente invención puede ser el uso del anticuerpo anti-Notch4 de la presente divulgación o un fragmento de unión al antígeno de este para la elaboración de un fármaco terapéutico para el cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este utilizado para el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular es preferentemente un anticuerpo que reconoce el dominio extracelular de Notch4. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a cualquier sitio de las posiciones 24 - 1447 en la secuencia de aminoácidos de Notch4 humano que se muestra en SEQ ID NO. 1. En la secuencia de aminoácidos de Notch4 humano que se muestra en SEQ ID NO. 1, las posiciones 1 - 23 son la secuencia señal y las posiciones 1448 - 2003 son el dominio de transmembrana y el dominio intracelular.
El anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede utilizar en un método terapéutico solo o combinado con otros agentes o composiciones. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede administrar a la vez o en momentos diferentes con otro agente anticancerígeno. Una terapia combinada de este tipo comprende la administración combinada (dos o más agentes se contienen en el mismo preparado o un preparado por separado) y la administración por separado (por ejemplo, a la vez o de forma continuada). Cuando dos o más agentes se administran por separado, la administración del anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este se puede realizar antes o después del método terapéutico que la acompaña. El agente anticancerígeno que se puede utilizar combinado con el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este puede ser, por ejemplo, un agente anticancerígeno que sea eficaz para tratar el cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular. Los ejemplos de un agente anticancerígeno de este tipo pueden incluir, sin carácter limitante, cisplatino, lenvatinib y paclitaxel. Los ejemplos de la composición farmacéutica para una terapia combinada de este tipo pueden incluir, sin carácter limitante, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este y cisplatino, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este y lenvatinib, y una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este y paclitaxel.
El sujeto para la administración de la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este no está limitado y la presente divulgación se puede emplear para un mamífero (tal como un ser humano, un cerdo, una vaca, un mono, un mandril, un perro, un gato, una rata y un ratón). Sin embargo, los seres humanos se pueden excluir del sujeto cuando no se prefiera este caso.
El método de administración de la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 de la presente invención o un fragmento de unión al antígeno de este a un sujeto (tal como la vía de administración, dosis, frecuencia de administración al día y programa de administración) no está limitado y puede ser determinado convenientemente por los expertos en la técnica (tales como un médico) de acuerdo con el estado de salud del sujeto, el grado de la enfermedad, el tipo de agente utilizado en la combinación y similares.
Los expertos en la técnica reconocen que, siempre que no sea contradictorio desde un punto de vista técnico, uno cualquiera o más de todos y cada uno de los aspectos descritos en la presente se pueden combinar adecuadamente para llevar a cabo la presente invención. Además, los expertos en la técnica reconocen que, siempre que no sea contradictorio desde un punto de vista técnico, se prefiere que todos y cada uno de los aspectos preferidos o convenientes descritos en la presente se combinen adecuadamente para llevar a cabo la presente invención.
Las referencias de la bibliografía citadas en la presente se proporcionan únicamente con el fin de divulgar la tecnología relacionada precedente a la fecha de presentación de la presente solicitud y no se deben interpretar como una admisión de que los inventores de la presente no poseen el derecho de prioridad respecto a dichas divulgaciones por motivos de invención previa o cualquier otro motivo. Toda descripción de estas referencias de la bibliografía se basa en la información disponible para los solicitantes de la presente y no configura el reconocimiento de que estas descripciones sean correctas.
Los términos utilizados en la presente se emplean para describir realizaciones particulares y no se pretende que limiten la invención.
El término «comprende», tal como se utiliza en la presente, a menos que el contenido indique claramente que se debe interpretar de otra manera, se refiere a la presencia de los artículos descritos (tales como componentes, pasos, elementos o números) y no excluye la presencia de otros artículos (tales como componentes, pasos, elementos o números). La expresión «constituido por» engloba los aspectos descritos con las expresiones «constituido por» y/o «constituido esencialmente por».
La expresión «actividad neutralizante», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la actividad para inhibir la unión de Notch4 con su ligando y/o la actividad para inhibir la transducción de señales que es inducida dentro del cuerpo humano por la unión de Notch4 con su ligando, o la respuesta de expresión molecular o cambio de funcionalidad de la célula.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos utilizados en la presente (incluidos los términos técnicos y científicos) tienen los mismos significados que los que reconocen por lo general los expertos en la materia de la tecnología a la que pertenece la presente invención. Los términos utilizados en la presente, a menos que se defina explícitamente lo contrario, se deben interpretar como que tienen los significados que son coherentes con los significados de la presente y de los campos técnicos relacionados, y no se deben interpretar como que tienen significados idealizados o excesivamente formales.
Términos tales como primero y segundo se emplean para expresar varios elementos y se reconoce que estos elementos no deben estar limitados por estos términos en sí. Estos términos se emplean únicamente con el fin de discriminar un elemento de otro y es posible, por ejemplo, describir un primer elemento como un segundo elemento y, de forma similar, describir un segundo elemento como un primer elemento sin alejarse del alcance de la presente invención.
Los valores numéricos empleados en la presente para indicar el intervalo de valores numéricos o el contenido de un componente y similares, a menos que se indique explícitamente, se deben interpretar como que están modificados por el término «aproximadamente». Por ejemplo, a menos que se indique explícitamente, se reconoce que «4 °C» significa «aproximadamente 4 °C» y los expertos en la técnica pueden reconocer de forma razonable naturalmente el grado de esto de acuerdo con el sentido común técnico y el contexto de la presente memoria descriptiva.
A menos que se indique claramente que significa otra cosa en el contexto, cuando se utilice en la memoria descriptiva y las reivindicaciones de la presente, se debe reconocer que cada aspecto representado en forma singular también puede ser una forma plural siempre que no se contradiga técnicamente, y viceversa.
A continuación, la presente invención se describirá más detalladamente haciendo referencia a los Ejemplos. Sin embargo, la presente invención puede estar representada por varios aspectos y no se debe interpretar que esté limitada a los Ejemplos que se describen en la presente.
Ejemplos
Ejemplo 1: Producción de un anticuerpo monoclonal anti-Notch4 humano
Producción de un anticuerpo monoclonal anti-Notch4 humano de ratón
Con el fin de producir un anticuerpo monoclonal frente a Notch4 humano (N.° de acceso a Genbank NP_004548.3) (SEQ ID NO. 1), se inmunizaron ratones Balb/c con tres repeticiones de EGF y la región reguladora negativa (NRR) de Notch4 humano (posiciones 1046 - 1445 de SEQ ID NO. 1) fusionada con fosfatasa alcalina secretora (SEAP) y una marca de histidina (se denomina en lo sucesivo en la presente «Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His»).
La proteína Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His se preparó mediante los siguientes pasos: En primer lugar, se construyó un vector de expresión pcDNA3.1-Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His. Las tres repeticiones de EGF y NRR de Notch4 humano se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en el sitio Sfil/Notl de pcDNA3 .1 (Invitrogen/LifeTechnologies) que tenía una secuencia de ADN que codificaba una secuencia señal de IgK, SEAP, y una marca de histidina. A continuación, el vector de expresión pcDNA3.1-Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His se transfectó en células HEK293 EBNA (Invitrogen/LifeTechnologies) con TransIT-LT1 (TAKARA) . Después de 6 días de incubación (5% de CO2, 37 °C), se recolectó el sobrenadante del cultivo. La proteína Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His se purificó con una columna Protino (MACHEREY-NAGEL).
Se mezclaron veinte microgramos de dicha proteína Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His con la misma cantidad de adyuvante GERBU (GERBU Biotechnik GmbH) y se inyectaron por vía subcutánea en la almohadilla de la pata de ratones Balb/c. Se administraron tres inyecciones adicionales en los Días 3, 7 y 10. Se sacrificaron los ratones al día siguiente y se recolectaron los nodos linfáticos periféricos. La mitad de cada uno de los nódulos linfáticos periféricos se trasplantó en ratones SCID. Se prepararon células de nódulos linfáticos a partir de la mitad restante de cada nódulo linfático y se fusionaron con células de mieloma P3U1 con una proporción de 5:1 en presencia de GenomeONE-CF (Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.). Dichas células fusionadas se cultivaron en una placa de plástico de 96 pocillos. Después de 7 días de incubación (5% de CO2, 37 °C), se recolectó el sobrenadante del cultivo.
Se administraron diez microgramos de la proteína Notch4 humano 3EGF-NRR-SEAP-His por vía intravenosa a dichos ratones SCID con trasplante de nódulos linfáticos en el día del trasplante y 6 días después del trasplante. Tres días después de la inmunización final, se recolectaron células de los nodos linfáticos periféricos, se fusionaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron.
Mediante los pasos anteriores, se obtuvieron anticuerpos monoclonales de ratón de 8 clones. Entre ellos, se seleccionó el anticuerpo principal más preferido (6-3-A6) basándose en la actividad inhibitoria de la señal específica de Notch4 y la actividad de unión a Notch4 de ratón y Notch4 humano.
Análisis de la secuencia del anticuerpo monoclonal anti-Notch4 humano de ratón (6-3-A6)
La secuencia de ADN que codifica las cadenas pesada y ligera del clon 6-3-A6 se amplificó mediante 5'-RACE (amplificación rápida 5’ de los extremos de ADNc). Se preparó ARN completo a partir de dicho hibridoma con TRIZOL (Invitrogen/LifeTechnologies) y se trató utilizando DNasa (QIAGEN, conjunto de DNasa exento de RNasa). Se preparó ADNc bicatenario a partir de dicho ARN completo utilizando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA). El adaptador 5' obtenido mediante la hibridación de ad29S (ACATCACTCCGT (SEQ ID NO. 2)) y ad29AS (ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT (SEQ ID NO. 3)) se añadió a dicho ADNc. El ADNc obtenido se amplificó con el cebador directo 5' (cebador 5’-PCR4, AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO. 4)) y el cebador inverso 3' (GCCAGTGGATAGACTGATGG (SEQ ID NO. 5) se utilizó para amplificar la cadena pesada de IgG1 de ratón y GATGGATACAGTTGGTGCAGC (SEQ ID NO. 6) se utilizó para amplificar la cadena ligera de IgK de ratón). Dicho ADNc amplificado se insertó en el vector pCR2.1 (Invitrogen/LifeTechnologies). La secuencia del gen se analizó con ABI3130XL. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del gen identificada con este análisis se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 1. Secuencia de aminoácidos del anticuer o anti-Notch4 humano de ratón 6-3-A6
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Tabla 2. Secuencia de ácidos nucleicos del anticuer o anti-Notch4 humano de ratón 6-3-A6
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Preparación de un anticuerpo anti-Notch4 humano quimérico y un anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado
Utilizando PCR de extensión con solapamiento, la secuencia génica de la región variable de la cadena pesada de 6-3-A6 se unió a la secuencia génica de la región constante de IgG2 humana con las mutaciones V234A y G237A como cadena pesada, y la secuencia génica de la región variable de la cadena ligera de 6-3-A6 se unió a la secuencia génica de la región constante de IgK humana como cadena ligera para preparar una secuencia de ADN que codificara un anticuerpo quimérico. Tal como se utiliza en la presente, «V234A» representa una mutación en la que la valina en la posición 234 se sustituye por alanina y «G237A» representa una mutación en la que la glicina en la posición 237 se sustituye por alanina. La secuencia obtenida como resultado se insertó en los vectores de expresión (pEE6. 4 para la cadena pesada y pEE12.4 para la cadena ligera, Lonza). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos del anticuerpo quimérico se muestran en las siguientes tablas.
Tabla 3. Secuencia de aminoácidos del anticuer o anti-Notch4 humano uimérico
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Tabla 4. Secuencia de ácidos nucleicos del anticuer o anti-Notch4 humano uimérico
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El anticuerpo se humanizó tasplantando la CDR del anticuerpo de ratón 6-3-A6 en la región variable de un anticuerpo humano. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo de ratón 6-3-A6 se numeró de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat utilizando el software Abysis (con licencia de UCL) y, basándose en esta numeración, dicha CDR se determinó de acuerdo con la definición de Kabat o el método de definición de AbM para identificar la CDR. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la CDR de 6-3-A6 se muestran en las siguientes tablas.
Tabla 5. Secuencia de aminoácidos de la CDR de 6-3-A6
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Tabla 6. Secuencia de ácidos nucleicos de la CDR de 6-3-A6
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Basándose en la elevada homología respecto a la región de entramado (FR) de 6-3-A6, se seleccionó la FR de un anticuerpo humano, IGKV1-27*1 o IGKV3-15*1 y JK1 para la cadena ligera, e IGHV3-64*01 y JH4 para la cadena pesada como las FR del anticuerpo humanizado. A continuación, se empleó un modelo de predicción de la estructura 3D de 6-3-A6 de ratón para predecir el aminoácido en la FR que interactúa con el aminoácido de la CDR, y se trasplantó conjuntamente con la CDR. La región constante de IgG2 humana con las mutaciones V234A y G237A y con o sin un residuo de lisina C- terminal, así como IgK humana se emplearon cada una como la región constante de las cadenas pesada y ligera. HK1, HK2 y HK3 se designaron como la cadena pesada del anticuerpo humanizado en la que se trasplantó la CDR determinada mediante el método de definición de Kabat, HA1 y HA2 se designaron como la cadena pesada del anticuerpo humanizado en la que se trasplantó la CDR determinada mediante el método de definición de AbM, L1, L2 y L5 se designaron como la cadena ligera del anticuerpo humanizado que emplea IGKV1-27*1 y JK1, y L3, L4 y L6 se designaron como la cadena ligera del anticuerpo humanizado que emplea IGKV3-15*1 y JK1. Las siguientes tablas muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable del anticuerpo humanizado, la región constante de IgG2 humana con las mutaciones V234A y G237A y con o sin un residuo de lisina C-terminal, así como IgK humana.
Tabla 7.
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Tabla 8.
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Tabla 9.
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Tabla 10.
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Tabla 11.
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Tabla 12.
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Tabla 13.
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Tabla 14.
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Tabla 15.
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Tabla 16.
Figure imgf000025_0002
Tabla 17.
Figure imgf000026_0001
Tabla 18.
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0002
Tabla 19.
Figure imgf000027_0001
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Tabla 20.
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Las secuencias génicas de la región variable de estos anticuerpos humanizados se sintetizaron utilizando GenScript USA Inc., y se insertaron en la región constante de IgG2 humana con o sin una lisina C-terminal o pcDNA3.3 (Invitrogen) que comprendía la secuencia de ADN que codifica la región constante de IgK humana. Dichos vectores de expresión se transfectaron en células FreeStyle 293-F (Invitrogen) utilizando el sistema de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) con el fin de producir los anticuerpos. El sobrenadante se recolectó y se purificó utilizando Proteína A (GE Healthcare) .
Las secuencias génicas de longitud completa (región variable región constante) de los anticuerpos humanizados se optimizaron de forma similar, se sintetizaron completamente con GenScript USA Inc., y la cadena pesada se insertó en pEE6.4 y la cadena ligera se insertó en pEE12.4 (Lonza). Estos vectores de expresión se emplearon como antes con el fin de producir los anticuerpos. Las secuencias de nucleótidos optimizadas de los anticuerpos humanizados se muestran en las siguientes tablas.
Tabla 21.
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Tabla 22.
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Tabla 23.
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Tabla 24.
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Tabla 25.
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Tabla 26.
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Tabla 27.
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En los siguientes Ejemplos, se llevaron a cabo experimentos con anticuerpos que comprenden las secuencias de aminoácidos de la CDR del anticuerpo 6-3-A6 determinada en el Ejemplo 1.
Por conveniencia, se hará referencia a los anticuerpos específicos empleados en el siguiente Ejemplo como «Anticuerpo A», «Anticuerpo B», «Anticuerpo C», «Anticuerpo D», «Anticuerpo E», «Anticuerpo F» y «Anticuerpo G».
En el Anticuerpo A, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK2 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L3 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo B, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK3 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L3 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo C, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK2 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L4 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo D, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK3 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L5 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo E, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK2 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L6 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo F, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HA2 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L3 descrita en el Ejemplo 1.
En el Anticuerpo G, la región variable de la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesada de HK3 descrita en el Ejemplo 1 y la región variable de la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de L4 descrita en el Ejemplo 1.
Cabe destacar que en los Anticuerpos A - G, la lisina (Lys) que está situada en el extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo humano común se ha eliminado.
Ejemplo 2: Actividad neutralizante del anticuerpo anti-Notch4 humano
La actividad neutralizante del anticuerpo anti-Notch4 humano (Anticuerpo B) se evaluó con el ensayo marcador de luciferasa Notch4-GAL4. Este experimento es un sistema experimental que evalúa la transducción de señales específica para Notch4 evaluando la actividad de luciferasa cuando la línea celular b.end3 en la que se ha introducido un gen modificado que tiene una parte del dominio intracelular de Notch4 sustituido por el dominio de unión de ADN de GAL4 así como un vector de expresión del gen fusionado entre UAS de GAL4 y 2CP de la luciferasa (que se denomina en lo sucesivo en la presente «célula marcadora») se estimula con DLL4, que es un ligando de Notch.
Se disolvió DLL4 humano recombinante (R&D Systems, 1506-D4-050/CF) en PBS para preparar una solución de 10 pg/mL (en lo sucesivo en la presente solución de DLL4). En una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano (Greiner, 655083), se dispensaron 50 pL/pocillo (500 ng/pocillo) de la solución de DLL4 y 50 pL/pocillo de PBS para los pocillos no estimulados, y esto se dejó reposar durante toda la noche a 4 °C para permitir que DLL4 pasara a fase sólida en la placa blanca de 96 pocillos. Las células marcadoras se suspendieron en un medio de cultivo de D-MEM que comprendía un 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina para preparar una suspensión celular con una densidad de 1 x 10A5/mL. Cada pocillo con DLL4 en fase sólida se lavó tres veces con PBS y se sembraron 50 pL/pocillo (5000 células/pocillo) de la suspensión celular. Las diluciones del anticuerpo anti-Notch4 humano (concentraciones finales: 0, 0.00064, 0.0032, 0.016, 0.08, 0.4, 2 y 10 pg/mL) o IgG2 k humana (SIGMA, 15404, concentración final: 10 pg/mL) se añadieron cada una en una cantidad de 50 pL y esto se cultivó a 37 °C durante 22 horas. La actividad de luciferasa de las células marcadoras se evaluó con el sistema de ensayo Steady-Glo (Promega, E2510) como se indica a continuación.
Se añadieron cien microlitros de solución Steady-Glo a cada pocillo, después se cultivaron, agitaron y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la luminiscencia con un lector de placas Multilabel (Envision 2102-0020, Perkin Elmer). Se calculó la luminiscencia relativa (%) a partir del valor de luminiscencia medido utilizando la siguiente fórmula.
Luminiscencia relativa (%) = (Intensidad de luminiscencia de los pocillos de las muestras - Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos no estimulados) / (Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos de control - Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos no estimulados)
La correlación entre la concentración de Anticuerpo B y el valor de luminiscencia relativa (%) se muestra en la Figura 1. La gráfica de la Figura 1 muestra el valor promedio de los resultados de tres pruebas independientes y la barra de error muestra la desviación estándar de estos. El valor de IC50 fue de 0.011 pg/mL (95% de IC; 0.0036 - 0.034).
A continuación, se llevaron a cabo experimentos similares para una pluralidad de anticuerpos anti-Notch4 humanos, que incluyeron el Anticuerpo B (Anticuerpo A, Anticuerpo B, Anticuerpo C, Anticuerpo D, Anticuerpo E, Anticuerpo F y Anticuerpo G) y se midió la actividad neutralizante de los anticuerpos.
Se disolvió DLL4 humano recombinante (R&D Systems, 1506-D4-050/CF) en PBS para preparar una solución de 10 pg/mL (en lo sucesivo en la presente solución de DLL4). En una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano (Greiner, 655083), se dispensaron 50 pL/pocillo (500 ng/pocillo) de la solución de DLL4 y 50 pL/pocillo de PBS para los pocillos no estimulados, y esto se dejó reposar durante toda la noche a 4 °C para permitir que DLL4 pasara a fase sólida en la placa blanca de 96 pocillos. Las células marcadoras se suspendieron en un medio de cultivo de D-MEM que comprendía un 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina para preparar una suspensión celular con una densidad de 1 x 10A5/mL. Cada pocillo con DLL4 en fase sólida se lavó tres veces con PBS y se sembraron 50 pL/pocillo (5000 células/pocillo) de la suspensión celular. Cada dilución del anticuerpo anti-Notch4 humano (concentraciones finales: 0 y 10 pg/mL) o IgG2 k humana (SIGMA, 15404, concentración final: 10 pg/mL) se añadió en una cantidad de 50 pL y esto se cultivó a 37 °C durante 22 horas. La actividad de luciferasa de las células marcadoras se evaluó con el sistema de ensayo Dual luc-Glo (Promega, E2940) como se indica a continuación.
Se añadieron cien microlitros de solución del sustrato luciferasa Dual-Glo a cada pocillo, después se cultivaron, agitaron y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se midió la luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga con un lector de placas Multilabel (Envision 2102-0020, Perkin Elmer). A continuación, se añadieron 100 pL de solución de sustrato Dual-Glo Stop & Glo a cada pocillo, se agitaron y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se midió la luminiscencia de la luciferasa de Renilla con un lector de placas Multilabel (Envision 2102-0020, Perkin Elmer). Se calculó la luminiscencia relativa de cada pocillo (luciferasa de luciérnaga/luciferasa de Renilla) a partir del cociente de los valores de luminiscencia. Además, se calculó la luminiscencia relativa (%) de cada valor calculado utilizando la siguiente fórmula y se evaluó la actividad inhibitoria de la señal de Notch4 de cada anticuerpo.
Luminiscencia relativa (%) = (Luminiscencia relativa promedio de los pocillos de las muestras - Luminiscencia relativa promedio de los pocillos no estimulados) / (Luminiscencia relativa promedio de los pocillos de control -Luminiscencia relativa promedio de los pocillos no estimulados)
En la siguiente Tabla 28 se describe la actividad inhibitoria de la señal de Notch4 para cada anticuerpo (pruebas realizadas con una concentración de 10 pg/mL).
En la siguiente tabla, por ejemplo, la descripción «HK2L3 (Lys-)» significa que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado que se emplea en el experimento es la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado correspondiente a la cadena pesada de HK2 en el Ejemplo 1, la región variable de la cadena ligera es la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado correspondiente a la cadena ligera de L3 en el Ejemplo 1, y la lisina (Lys) situada en el extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo humano común se ha eliminado en este anticuerpo.
Tabla 28.
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Ejemplo 3: Análisis cinético de la unión del anticuerpo anti-Notch4 humanizado a una proteína de dominio Notch4-NRR recombinante
Se llevó a cabo un análisis cinético de la interacción de los dominios Notch4-NRR de ser humano, mono cinomólogo, ratón y rata con el Anticuerpo B con BIACORE. El Anticuerpo B se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A a partir del sobrenadante del cultivo de una línea celular CHO estable transfectada con el Anticuerpo B. Los dominios Notch4-NRR de ser humano, mono, ratón y rata se prepararon como proteínas de fusión con fosfatasa alcalina secretora (SEAP) y 10 x marca de histidina. Los genes para estas proteínas se transfectaron en células Expi293F en Opti-MEM (iNv ITROGEN) utilizando ExpiFectamine 293. Estas células se cultivaron en medio de expresión Expi293 (INVITROGEN) . Resumiendo, las células se diluyeron hasta obtener 7.5 x 107 células/25.5 mL y se transfectaron con el reactivo ExpiFectamine 293 el Día 0. Aproximadamente 16 horas después de la transfección, se añadieron 150 uL del Potenciador de la transfección 1 ExpiFectamine 293 y 1.5 mL del Potenciador de la transfección 2 ExpiFectamine 293 a cada recipiente. El sobrenadante se recolectó el Día 4. Estos antígenos se purificaron con una columna de superflujo Ni-NTA (QIAGEN) . La interacción se analizó como se indica a continuación. El Anticuerpo B purificado fue capturado por un anticuerpo Fc anti-IgG humana fijado sobre un chip sensor CM5 (GE healthcare). Las proteínas de fusión Notch4-NRR purificadas se inyectaron sobre el chip sensor con 8 concentraciones diferentes y se observó su interacción y disociación según las instrucciones del fabricante.
Tabla 29. Parámetros cinéticos calculados del Anticuer o B
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Se llevó a cabo un análisis cinético de anticuerpos humanizados inhibitorios anti-Notch4 adicionales tal como se indica a continuación. Se expresaron proteínas de fusión Fc Notch4 humano-dominio NRR con una línea celular CHO. El antígeno en el sobrenadante del cultivo fue capturado por el anticuerpo anti-Notch4 humano fijado sobre un chip sensor CM5 que reconoce diferentes epítopos de Notch4 humano. A continuación, el anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado se inyectó sobre el chip sensor con diferentes concentraciones. Se calcularon sus constantes de interacción y disasociación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la Tabla 30.
En la siguiente tabla, por ejemplo, la descripción «HK2L3 (Lys-)» significa que la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado que se emplea en el experimento es la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado correspondiente a la cadena pesada de HK2 en el Ejemplo 1, la región variable de la cadena ligera es la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-Notch4 humano humanizado correspondiente a la cadena ligera de L3 en el Ejemplo 1, y la lisina (Lys) situada en el extremo C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo humano común se ha eliminado en este anticuerpo. Los casos sin la descripción «(Lys-)» se refieren a que la Lys localizada en el extremo C- terminal de la cadena pesada del anticuerpo humano no se ha eliminado.
Tabla 30.
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En la Tabla 31 se muestran resultados experimentales de experimentos similares a los de la Tabla 30 anterior llevados a cabo con más anticuerpos adicionales.
Tabla 31.
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Ejemplo 4: Prueba farmacológica in vivo que emplea el anticuerpo anti-Notch4 humano (efecto antitumoral y efecto supresor de la perfusión sanguínea del Anticuerpo B en un modelo de xenoinjerto Calu6)
Se preparó una línea celular humana de cáncer pulmonar no microcítico Calu6 (número de ATCC HTB-56) cultivada en un medio de cultivo EMEM que comprendía un 10% de FBS, aminoácidos no esenciales MEM, piruvato de sodio y penicilina/estreptomicina para obtener una concentración de 1.6 x 108 células/mL con medio de cultivo EMEM, y se mezcló con Matrigel™ (N° de cat. CORNING 354234) con una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular de 8.0 x 107 células/mL. Se trasplantó por vía subcutánea una dosis de 0.1 mL en la región dorsal posterior derecha de ratones atímicos de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj, hembra, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.) Veintiocho días después del trasplante, se midieron los ejes mayor y menor del tumor con un calibre digital electrónico (calibre DIGIMATIC™, Mitsutoyo Corporation) y se calculó el volumen tumoral TV con la siguiente fórmula de cálculo.
TV (mm3) = Eje mayor (mm) x Eje menor (mm) x Eje menor (mm) / 2
La aleatorización se llevó a cabo basándose en el volumen tumoral del primer día de administración de modo que el valor promedio de los volúmenes tumorales será aproximadamente igual entre los grupos. El Anticuerpo B se diluyó inmediatamente antes de su administración de modo que la solución de vehículo (histidina 25 mM, sacarosa 250 mM y Tween80 al 0.05% (pH5.3)) y la solución salina están en una proporción de 1:9 para obtener 0.1, 0.3 y 1.0 mg/mL de las muestras para evaluación (1, 3 y 10 mg/kg para el grupo de administración, respectivamente). Las muestras para evaluación se administraron mediante una inyección en la vena de la cola con una dosis de 0.2 mL/20 g de peso corporal del ratón dos veces a la semana (Día 1 y Día 4 cuando se cuenta el día de agrupación como Día 1). Para el grupo de control, se diluyeron 11.6 mg/mL de IgG de control (IgG humana ChromPure, molécula entera, Jackson ImmunoResearch Laboratories, N ° de cat. 009-000-003) con PBS para obtener 1.0 mg/mL, y se administraron mediante una inyección en la vena de la cola con una dosis de 0.2 mL/20 g de peso corporal del ratón (volumen de administración 10 mg/kg). El experimento se llevó a cabo con 8 ratones por grupo. Se calculó el volumen tumoral relativo RTV para cada uno de entre el grupo de IgG de control y el grupo de administración de Anticuerpo B con la siguiente fórmula y se muestra en la Figura 2A.
RTV = Volumen tumoral en el día de la medición / Volumen tumoral en el inicio de la administración
El Anticuerpo B mostró un efecto antitumoral significativo con todas las dosis en el modelo de xenoinjerto de Calu6.
Se evaluó la perfusión sanguínea en el tumor determinando la florescencia mediante la tinción del núcleo de células alrededor de los vasos sanguíneos debida a un tinte fluorescente (Hoechst) inyectado en la vena de la cola (Funahashi et al. (2014), Cáncer Sci., 105(10), 1334-42.). Después de medir el diámetro del tumor en el último día de la prueba, se diluyeron 10 mg/mL de Hoechst 33342 (N.° de cat. de Life technologies H3570) hasta 2 x con PBS, y se inyectaron 5.0 mg/mL de Hoechst 33342 diluido en la vena de la cola con una dosis de 0.1 mL/cabeza. Los ratones se sometieron a eutanasia mediante una dislocación cervical 5 minutos después de la inyección de Hoechst, y los tumores recolectados se embebieron en compuesto OCT (N° de cat. de Sakura Finetek Japan Co., Ltd. 4583) para producir bloques congelados.
Los vasos sanguíneos de los tumores de las secciones congeladas se sometieron a una tinción inmunofluorescente con un anticuerpo anti-CD31 (conjugado con FITC, N ° de cat. de BD Pharmingen 553372) y la fluorescencia de Hoechst de los puntos principales de los vasos sanguíneos de los tumores (5 por tumor) se fotografió con un microscopio de fluorescencia BIOREVO (KEYENCE, BZ-9000). Se determinó el área positiva de Hoechst con un software de análisis de imágenes (Lumina Vision ver 2.2.2, MITANI CORPORATION) y se calculó el promedio de cada sección tumoral, que se muestra en la Figura 2B.
El Anticuerpo B mostró un efecto supresor de la perfusión sanguínea significativo con todas las dosis en el modelo de xenoinjerto de Calu6.
Ejemplo 5: Uso combinado del Anticuerpo B y cisplatino en un modelo de xenoinjerto de Calu6
Se preparó una línea celular humana de cáncer pulmonar no microcítico Calu6 (número de ATCC HTB-56) cultivada en un medio de cultivo EMEM que comprendía un 10% de FBS y penicilina/estreptomicina para obtener una concentración de 1.2 x 108 células/mL con medio de cultivo EMEM, y se mezcló con Matrigel™ (N.° de cat. CORNING 354234) con una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular de 6.0 x 107 células/mL. Se trasplantó por vía subcutánea una dosis de 0.1 mL en la región dorsal posterior derecha de ratones atímicos de 7 semanas de edad (CAnN. Cg-Foxn1 nu/CrlCrlj, hembra, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.) Veintisiete días después del trasplante, se midieron los ejes mayor y menor del tumor con un calibre digital electrónico (calibre DIGIMATIC™, Mitsutoyo Corporation) y se calculó el volumen tumoral TV con la siguiente fórmula de cálculo.
Volumen tumoral TV (mm3) = Eje mayor (mm) x Eje menor (mm) x Eje menor (mm) / 2
La aleatorización se llevó a cabo basándose en el volumen tumoral del primer día de administración de modo que el valor promedio de los volúmenes tumorales será aproximadamente igual entre los grupos. Para el Anticuerpo B, se diluyó una solución de 10.34 mg/mL (vehículo: fosfato 25 mM, trealosa 200 mM y Tween80 al 0.05% (pH 5.5)) inmediatamente antes de la administración con PBS para preparar una solución de 2.5 mg/mL, y esta se administró mediante una inyección intravenosa con una dosis de 0.2 mL (500 gg)/cabeza, dos veces a la semana durante 5 semanas. El cisplatino se administró una vez el primer día de administración mediante una administración en la vena de la cola con una dosis de 10 mg/kg. El experimento se llevó a cabo con 4 ratones por grupo. El volumen tumoral relativo RTV se calculó para cada uno de entre el grupo de control (no tratado), el grupo de administración de Anticuerpo B, el grupo de administración de cisplatino y el grupo combinado de Anticuerpo B cisplatino con la siguiente fórmula y se muestra en la Figura 3.
RTV = Volumen tumoral en el día de la medición / Volumen tumoral en el inicio de la administración
El uso combinado de Anticuerpo B y cisplatino mostró un efecto antitumoral significativamente superior en comparación con el cisplatino solo en el modelo de xenoinjerto de Calu6.
Ejemplo 6: Uso combinado del Anticuerpo B y mesilato de lenvatinib en un modelo de xenoinjerto de FTC238
Se preparó una línea celular humana de cáncer de tiroides FTC238 (adquirida de Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.) cultivada en un medio de cultivo DMEM/HAM's F12 (1:1) que comprendía un 10% de FBS y penicilina/estreptomicina para obtener una concentración de 1.2 x 108 células/mL con medio de cultivo DMEM/HAM's F12 (1:1), y se mezcló con Matrigel™ (N° de cat. de CORNING 354234) con una proporción de 1:1 para preparar una suspensión celular de 6.0 x 107 células/mL. Se trasplantó por vía subcutánea una dosis de 0.1 mL en el flanco derecho de ratones atímicos de 7 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj, hembra, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.). Ocho días después del trasplante, se midieron los ejes mayor y menor del tumor con un calibre digital electrónico (calibre DIGIMATIC™, Mitsutoyo Corporation) y se calculó el volumen tumoral TV con la siguiente fórmula de cálculo.
Volumen tumoral TV (mm3) = Eje mayor (mm) x Eje menor (mm) x Eje menor (mm) / 2
La aleatorización se llevó a cabo basándose en el volumen tumoral del primer día de administración de modo que el valor promedio de los volúmenes tumorales será aproximadamente igual entre los grupos. Para el Anticuerpo B, se diluyeron 10.8 mg/mL de Anticuerpo B (vehículo: histidina 25 mM y sacarosa 250 mM (pH 5.3)) inmediatamente antes de la administración con la solución de vehículo para preparar 2.5 mg/mL de Anticuerpo B, y esto se administró mediante una inyección en la vena de la cola con una dosis de 0.2 mL (500 gg)/cabeza, dos veces a la semana durante 2 semanas. El mesilato de lenvatinib se administró por vía oral con una dosis de 10 mg/kg, una vez al día durante 12 días. El experimento se llevó a cabo con 5 ratones por grupo. El volumen tumoral relativo RTV se calculó para cada uno de entre el grupo de control (no tratado), el grupo de administración de Anticuerpo B, el grupo de administración de mesilato de lenvatinib y el grupo combinado de Anticuerpo B mesilato de lenvatinib con la siguiente fórmula y se muestra en la Figura 4.
RTV = Volumen tumoral en el día de la medición / Volumen tumoral en el inicio de la administración
El uso combinado de Anticuerpo B y mesilato de lenvatinib mostró un efecto antitumoral significativamente superior en comparación con el Anticuerpo B administrado solo o el mesilato de lenvatinib administrado solo en el modelo de xenoinjerto de FTC238.
Ejemplo 7: Uso combinado del anticuerpo de ratón 6-3-A6 y paclitaxel en un modelo de xenoinjerto de DU145
Se preparó una línea celular humana de cáncer de próstata DU145 (número de ATCC HTB-81) cultivada en un medio de cultivo RPMI1640 que comprendía un 10% de FBS, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol, y penicilina/estreptomicina para obtener una concentración de 6.0 x 107 células/mL con medio de cultivo RPMI1640. Se trasplantó por vía subcutánea una dosis de 0.1 mL en el flanco derecho de ratones atímicos de 6 semanas de edad (CAnN.Cg-Foxn1 nu/CrlCrlj, hembra, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.). Veinticuatro días después del trasplante, se midieron los ejes mayor y menor del tumor con un calibre digital electrónico (calibre DIGIMATIC™, Mitsutoyo Corporation) y se calculó el volumen tumoral TV con la siguiente fórmula de cálculo.
Volumen tumoral TV (mm3) = Eje mayor (mm) x Eje menor (mm) x Eje menor (mm) / 2
La aleatorización se llevó a cabo basándose en el volumen tumoral del primer día de administración de modo que el valor promedio de los volúmenes tumorales será aproximadamente igual entre los grupos. Para 6-3-A6, se diluyeron 5.11 mg/mL de 6-3-A6 (vehículo: PBS) inmediatamente antes de la administración con PBS para preparar 2.5 mg/mL de 6-3-A6, y esto se administró mediante una inyección en la vena de la cola con una dosis de 0.2 mL (500 pg)/cabeza, dos veces a la semana durante 4 semanas. El paclitaxel se administró mediante una administración en la vena de la cola con una dosis de 20 mg/kg, una vez al día durante 5 días. El experimento se llevó a cabo con 4 ratones por grupo. El volumen tumoral TV de cada uno de entre el grupo de control (no tratado), el grupo de administración de 6-3-A6, el grupo de administración de paclitaxel y el grupo combinado de 6-3-A6 paclitaxel se muestra en la Figura 5.
El uso combinado de 6-3-A6 y paclitaxel mostró un efecto antitumoral significativamente superior en comparación con 6-3-A6 solo o paclitaxel solo en el modelo de xenoinjerto de DU145.
Ejemplo 8: Combinación de Anticuerpo B con mesilato de lenvatinib en un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente con carcinoma hepatocelular
Para examinar el efecto antitumoral del Anticuerpo B sobre un carcinoma hepatocelular (HCC), se utilizó LI0050, un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente HuPrime® (Crown Bioscience Inc.). LI0050 es un ratón modelo al cual se le han inoculado tejidos tumorales primarios procedentes de un paciente hembra con HCC, que se ha descrito que es resistente a sorafenib (panfleto de Patente Internacional WO2015/031604).
Se recolectaron fragmentos tumorales procedentes de ratones en stock LI0050 y se inoculó un fragmento de 2-4 mm de diámetro por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones atímicos BALB/c para desarrollar el tumor. El tamaño del tumor se midió en dos dimensiones utilizando un calibre y el volumen tumoral TV se calculó con la siguiente fórmula de cálculo.
Volumen tumoral TV (mm3) = Eje mayor (mm) x Eje menor (mm) x Eje menor (mm) / 2
El tratamiento se inició cuando el tamaño del tumor promedio alcanzó aproximadamente 192 mm3. La aleatorización se llevó a cabo basándose en el volumen tumoral del primer día de administración de modo que el valor promedio de los volúmenes tumorales será aproximadamente igual entre los grupos. Cada grupo estaba constituido por 10 ratones. El día de la aleatorización se consideró como el Día 0. Desde el Día 0 hasta el Día 13, los ratones de cada grupo se trataron una vez al día con cada uno de los siguientes (i) control (HCl 3 mM), (ii) mesilato de lenvatinib (10 mg/kg), (iii) tosilato de sorafenib (30 mg/kg) o (iv) mesilato de lenvatinib (10 mg/kg) más Anticuerpo B (0.5 mg/ratón).
Para realizar una comparación entre dos grupos, se ha utilizado una prueba t de muestras independientes.
La combinación de Anticuerpo B y mesilato de lenvatinib mostró un efecto antitumoral significativamente superior en comparación con el grupo de control.
Ejemplo 9: Comparación de la actividad inhibitoria de la señal entre un anticuerpo policlonal anti-Notch4 humano y el Anticuerpo B
A continuación, se compararon las actividades inhibitorias de la señal de un anticuerpo anti-Notch4 humano policlonal (Santa Cruz, SC8643, en lo sucesivo en la presente N-17) y el Anticuerpo B con un sistema de ensayo marcador de luciferasa Notch4-GAL4.
Se empleó Slide-A-Lyzer (Thermo scientific, 66333) para realizar una diálisis a 4 °C durante 8 horas en PBS con el fin de eliminar la azida sódica contenida en N-17. Después de concentrar la solución de N-17 dializada con Amicon Ultra (Millipore, UFC503096), la concentración se midió con un microespectrofotómetro (Nano Drop, Thermo).
Se disolvió DLL4 humano recombinante (R&D Systems, 1506-D4-050/CF) en PBS para preparar una solución de 10 pg/mL (en lo sucesivo en la presente solución de DLL4). En una placa blanca de 96 pocillos de fondo plano (Greiner, 655083), se dispensaron 50 pL/pocillo (500 ng/pocillo) de la solución de DLL4 y 50 pL/pocillo de PBS para los pocillos no estimulados, y esto se dejó reposar durante toda la noche a 4 °C para permitir que DLL4 pasara a fase sólida en la placa blanca de 96 pocillos. Las células marcadoras se suspendieron en un medio de cultivo de D-MEM que comprendía un 10% de suero bovino fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina para preparar una suspensión celular con una densidad de 1 x 10A5/mL. Cada pocillo con DLL4 en fase sólida se lavó tres veces con PBS y se sembraron 50 pL/pocillo (5000 células/pocillo) de la suspensión celular. Después de la diálisis/concentración, las diluciones de N-17 o diluciones de Anticuerpo B con el medio de cultivo (concentraciones finales: 0, 0.01,0.1, 1 y 10 pg/mL) se añadieron cada una en una cantidad de 50 pL y esto se cultivó a 37 °C durante 22 horas. La actividad de luciferasa de las células marcadoras se evaluó con el sistema de ensayo Steady-Glo (Promega, E2510) como se indica a continuación.
Se añadieron cien microlitros de solución Steady-Glo a cada pocillo, después se cultivaron, agitaron y a continuación se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la luminiscencia con un lector de placas Multilabel (Envision 2102-0020, Perkin Elmer). Se calculó la luminiscencia relativa a partir del valor de luminiscencia medido utilizando la siguiente fórmula.
Luminiscencia relativa (%) = (Intensidad de luminiscencia del pocillo de la muestra - Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos no estimulados) / (Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos de control - Intensidad de luminiscencia promedio de los pocillos no estimulados)
La correlación entre la concentración de Anticuerpo B y el valor de luminiscencia relativa (%) se muestra en la Figura 7. La gráfica de la Figura 7 muestra el valor promedio de los resultados de tres pruebas independientes y la barra de error muestra la desviación estándar de estos. Se confirmó la actividad inhibitoria de la señal para el Anticuerpo B, pero para N-17 no se observó actividad inhibitoria de la señal de Notch4 por parte de N-17 en el intervalo de concentraciones investigado.
Ejemplo 10: Análisis cinético de la unión entre el Anticuerpo B y el dominio NRR de Notch humano soluble recombinante
Se llevó a cabo un análisis cinético utilizando BIAcore T100 para la interacción entre el dominio NRR de isotipos de Notch humano (Notch1, Notch2, Notch3 y Notch4) y el Anticuerpo B. El Anticuerpo B se purificó a partir del sobrenadante de cultivo de una línea celular CHO de expresión estable del Anticuerpo B con el uso secuencial de cromatografía de afinidad con proteína A, cromatografía de intercambio aniónico Capto Q y cromatografía de intercambio catiónico UNOsphere S. Se crearon proteínas de fusión del dominio NRR de Notch1 humano (N.° de acceso de Genbank 017617; posiciones de la secuencia 1307-1733), dominio NRR de Notch2 humano (NT de acceso de Genbank 024408; posiciones de la secuencia 1239-1650), dominio NRR de Notch3 humano (NT de acceso de Genbank 000435; posiciones de la secuencia 1246-1641) y dominio NRR de Notch4 humano (NT de acceso de Genbank NP_004548.3; posiciones de la secuencia 1046-1445) con fosfatasa alcalina secretora (SEAP), una marca de hemaglutinina (HA) y una marca de histidina (x 10), y estas se purificaron con una columna de flujo rápido HisTrap™ (GE Healthcare). La interacción entre el Anticuerpo B y el dominio NRR de cada uno de los isotipos de Notch humano se midió con el siguiente método. El Anticuerpo B purificado fue capturado por un anticuerpo Fc anti-IgG humana fijado sobre un chip sensor CM5 (GE Healthcare). El dominio NRR purificado de cada uno de los isotipos de Notch humano se inyectó sobre el chip sensor con 6 concentraciones diferentes, y se observó la interacción y disociación con el anticuerpo mediante operación manual.
El sensograma de interacción superpuesto y los parámetros cinéticos calculados se muestran cada uno de ellos en la Figura 8 y la Tabla 32.
Tabla 32.
Figure imgf000042_0001

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este, donde dicho anticuerpo o un fragmento de unión a Notch4 de este comprende cadenas pesadas y ligeras y se selecciona entre cualquiera de los siguientes (i) - (vii): (i) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, (ii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, (iii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47, (iv) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49, (v) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51, (vi) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45, y (vii) un anticuerpo en el que la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
2. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
3. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
4. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
5. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 49.
6. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 33 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 51.
7. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 39 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 45.
8. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 1, donde la región variable de dicha cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35 y la región variable de dicha cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 47.
9. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la región constante de dicha cadena pesada y la región constante de dicha cadena ligera comprenden la región constante de un anticuerpo humano.
10. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 9, donde la región constante de dicha cadena pesada comprende la región constante de IgG humana.
11. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicha región constante de IgG humana es la región constante de IgG2 humana.
12. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicha región constante de IgG2 humana tiene una mutación V234A y/o G237A.
13. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el residuo de lisina en el extremo carboxi de la región constante de dicha cadena pesada se elimina de forma artificial.
14. El anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la región constante de dicha cadena ligera comprende la región constante de IgK humana.
15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Notch4 o un fragmento de unión a Notch4 de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento de cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de tiroides, cáncer de próstata o carcinoma hepatocelular.
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