TW201702273A - 用於治療的藥劑、用途及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及單株抗分揀蛋白抗體，已經發現它們在校正缺陷水平的顆粒蛋白先質(progranulin)(PGRN)中是有用的。具體而言，該等抗體可以用於額顳癡呆(FTD)和肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之治療。

Description

用於治療的藥劑、用途及方法
本發明涉及單株抗分揀蛋白(sortilin)抗體，已經發現它們在校正缺陷水平的顆粒蛋白先質(PGRN)中是有用的。具體而言，該等抗體可以用於治療額顳癡呆(FTD)和肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；然而，預期該等單株抗體還可以有用於治療神經退行性障礙(如阿茲海默症(AD))。
【對序列表的引用】
本申請包括一個或多個序列表(依照37 C.F.R.1.821等等)，其係以電腦可讀介質形式揭露的(檔案名：0993_ST25.txt，創建於2016年6月22日，並且大小為141kB)，將該文件藉由引用以其全部內容結合在此。
分揀蛋白係已經被報導介導前神經營養因子的促凋亡效應並且介導神經營養因子受體的運輸和分揀之受體(尼科紮爾(Nykjr)等人，2012，神經科學趨勢(Trends Neurosci.)2012；35(4)：261-70；格萊拉普(Glerup)等人，實驗藥理學手冊(Handb Exp Pharmacol),2014；220：165-89；卡洛(Carlo)等人，分子醫學雜誌(柏林)(J Mol Med(Berl)).2014年9月；92(9)：905-11)。已經鑒定了多種分揀蛋白配位基，包括藉由X射線結晶學將其高親和力結合位點定位到分揀蛋白分子的β螺旋槳通道內的神經降壓素(奎斯特加德 (Quistgaard)等人，自然結構與分子生物學(Nat Struct Mol Biol.)2009年1月；16(1)：96-8；奎斯特加德等人，蛋白質科學(Protein Sci.)2014年9月；23(9)：1291-300)。最近，顯示分揀蛋白作為生長因子顆粒蛋白先質(PGRN)的高親和力受體起作用(胡(Hu)等人，神經元(Neuron.)2010年11月18日；68(4)：654-67)。
PGRN((前上皮因子，顆粒體蛋白-上皮因子先質，PC細胞衍生的生長因子，acrogranin))係具有抗炎和神經營養樣作用的分泌型糖基化蛋白(關於最新綜述，參見阮(Nguyen)，內分泌與代謝趨勢(Trends Endocrinol Metab.)2013年12月；24(12)：597-606)。PGRN被蛋白水解地切割為顆粒體蛋白，但是關於PGRN和顆粒體蛋白的生理作用以及其受體的身份還有許多需要瞭解。PGRN已經被牽涉於若干細胞功能中，包括細胞週期調節和細胞運動(何，Z.(He,Z.)&貝特曼，A.(Bateman,A.)，分子醫學雜誌(J.MoI.Med.)57：600-612(2003)；慕那美，G.(Monami,G.)等人，癌症研究(Cancer Res.)(5(5：7103-7110(2006))、創面修復、炎症(朱，J.(Zhu,J.)等人，細胞(Cell)777：867-878(2002))、生長因子(如血管內皮生長因子(VEGF))的誘導(唐康辛辛，W.(Tangkeangsi π sin,W.)&塞萊羅，G(Serrero,G)，致癌作用(Carcinogenesis)25.1587-1592(2004))以及腫瘤發生(何，Z.&貝特曼，A.，分子醫學雜誌81：600-612(2003)；慕那美，G.等人，癌症研究(5(5：7103-7110(2006)；塞萊羅，G，生物化學和生物物理研究通訊(Biochem Biophys.Res.Commun.)505-409-413(2003)；陸，R(Lu,R)&塞萊羅，G，美國國家科學院院刊(Proc.Natl Acad Sci U.SA)98 142-147(2001)；廖，LM.(Liau,L M.)等人，癌症研究60：1353-1360(2000))。已經 報導PGRN結合TNF受體(唐W(Tang W)等人，科學(Science)2011，332(6028)：478-84)，但是這種觀察已經受到了別人的質疑(陳(Chen)等人，神經科學雜誌(J Neurosci.)2013，33(21)：9202-9213)。
PGRN與分揀蛋白的結合已經被映射到神經降壓素位點並且被報導按與神經降壓素類似的方式僅由PGRN C末端結構域介導(鄭(Zheng)等人，PLoS One.2011；6(6)：E21023；李(Lee)等人，人分子遺傳學(Hum Mol Genet.)2013)，並且與其一致，已經顯示神經降壓素阻斷分揀蛋白與PGRN以及其他配位基的相互作用。結合後，分揀蛋白介導PGRN的溶酶體清除並且由此調節細胞外PGRN水平(胡(Hu)等人，2010)。因此，已經顯示分揀蛋白的敲減(knockdown)或過表現調節細胞培養物中的細胞外PGRN水平(卡拉斯基羅(Caurasquillo)等人，美國人遺傳學雜誌(Am J Hum Genet.)2010年12月10日；87(6)：890-7)，並且在小鼠中，報導分揀蛋白缺陷增加PGRN水平並且恢復PGRN +/-小鼠中的血漿和腦PGRN水平(胡(Hu)等人，2010)。有趣的是，分揀蛋白附近的單核苷酸多態性(SNP)與降低的血漿PGRN水平和增加的分揀蛋白mRNA水平相關(卡拉斯基羅(Carrasquillo)等人，美國人遺傳學雜誌(Am J Hum Genet.)2010年12月10日；87(6)：890-7)。該等觀察表明分揀蛋白係關鍵的細胞外PGRN調節劑。
PGRN已經與額顳癡呆(FTD，由行為和語義改變表徵的進行性癡呆)以及額顳葉退化(FTLD)和含有TAR DNA結合蛋白-43(TDP-43)的神經元包涵物或τ包涵物聯繫(貝克(Baker)等人，2006，自然(Nature).2006年8月24日；442(7105)：916-9；克魯特斯(Cruts)等人，自然442：920-924(2006)；美國人遺傳學雜誌(Am J Hum Genet.)2010年12月10日；87(6)：890-7； M等人，遺傳學趨勢(Trends in Genetics)24：186-194(2008))。大部分的散發性和家族性FTD病例顯示出與ALS類似的TDP-43病理學(約50%)，並且FTD-TDP43和ALS被一些人認為構成疾病譜(伊藤D(Ito D)，神經病學(Neurology).2011年10月25日；77(17)：1636-43；博克瑟AL(Boxer AL)等人，阿茲海默症與癡呆症(Alzheimers Dement.)2013年3月；9(2)：176-88；拉德麥克斯(Rademakers)等人，神經病學自然評論(Nat Rev Neurol.)2012年8月；8(8)：423-434)，這係由於共同的病理和遺傳因素以及症狀學中的一些重疊。沒有可供FTD用的疾病修飾治療選擇。具有TDP-43病理學的一小群額顳癡呆患者在顆粒體蛋白基因(GRN)中具有功能缺失突變，從而導致PGRN單倍型不足。迄今為止，顆粒體蛋白基因中的69個不同突變(全部都導致PGRN水平和/或功能減少)已經與FTD相關聯並且據信升高血漿和腦中的細胞外PGRN將阻礙疾病過程。
PGRN突變還已經與阿茲海默症(AD)聯繫(沈(Sheng)等人，2014，基因(Gene).2014年6月1日；542(2)：141-5；布勞維斯(Brouwers)等人，2008，神經病學(Neurology).2008年8月26日；71(9)：656-64)，表明PGRN缺陷可能在AD發病機制中發揮重要作用。此外，已經在小鼠AD模型中觀察到PGRN的神經保護作用(米娜迷(Minami)等人，2014，自然醫學(Nat Med.)2014年10月；20(10)：1157-64)，從而為以下觀點提供支援，即增強的PGRN在AD和可能地其他神經退行性疾病中可能是有益的。
本申請描述了抗人分揀蛋白抗體的產生和鑒定，該等抗體可以調節細胞模型和小鼠中的PGRN。那些抗體出人意料地結合到分揀蛋白上的遠離先前報導的顆粒蛋白先質結合位點(所謂的神經降壓素-位點)的區 域，並且仍能夠抑制分揀蛋白-PGRN相互作用並且能夠增加細胞外PGRN。
諸位發明人已經定義了六個分揀蛋白結合區並且出人意料地鑒定出最有效的抗體結合一個區域(“D區”)。因為PGRN具有神經保護和抗炎作用，諸位發明人的發現指示靶向分揀蛋白的此類抗體在一系列神經退行性障礙(包括FTD/FTLD)的治療中可能具有有益效果。一個亞組的該等患者在編碼PGRN的基因中攜帶突變，從而導致單倍型不足。因此，分揀蛋白抗體對於罹患其他TDP-43蛋白質病以及PGRN水平可以影響TDP43-功能和病理學的疾病(包括ALS和AD)的患者而言可能具有類似的治療益處。
本發明的諸位發明人已經產生了單株抗體，該等抗體能夠抑制PGRN與分揀蛋白的結合並且出人意料地結合到被命名為如在SEQ ID NO：170中所定義的“D-區”的新穎分揀蛋白區。由諸位發明人鑒定的若干抗體具有與D-區抗體類似的特性，並且實驗證據指示它們也結合在D-區內，並且那些抗體在此被稱為D+抗體。因此，在一個方面，本發明涉及此類抗體，涉及包含此類抗體的組成物和/或套組(kit)，並且涉及其方法和用途。
本發明還涉及一種預防或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的方法，該方法包括給予有效劑量的結合到分揀蛋白的D-區的抗體或其抗原結合片段。特別地，該等疾病包括FTD、ALS和TDP43蛋白質病(如AD)。
圖1提供了基於分揀蛋白區結合的人抗體的區域分配的產生，對PGRN-結合和PGRN-水平以及抗體之間的交叉阻斷的影響的概述。
對分揀蛋白結合抗體進行選擇並且基於與改組構建體的結合將其分配給區域A-E，其中序列對應於該蛋白的所選區域內的四齒魨屬(tetraodon)分揀蛋白序列(實例1，圖2)。
選擇了20個抑制分揀蛋白-PGRN結合(如藉由HTRF分析測量的)的抗體(參見實例10，圖5和圖6)。該等抗體中的15個係D-區抗體，同時3個係D+抗體(圖6)。隨後的交叉阻斷分析顯示18個D-區和D+抗體(D+抗體具有與D-區抗體不同的結合改組構建體的模式，然而D+抗體不能被確定無疑地分配到如上概述的結合區A-E，但是具有與D-區抗體類似的功能特徵(細胞測定等))全部都彼此交叉阻斷，支援它們與同一分揀蛋白區相互作用(實例9，圖7)。當在HTRF分揀蛋白-PGRN結合測定中測試其他區域類別的分揀蛋白抗體時，41個抗體中僅有兩個展現出抑制效果。這兩個抗體之一與D和D+交叉阻斷，但是具有非典型改組構建體結合模式(D樣，除了它結合hB01-05區之外)，而另一抗體並不與抑制PGRN-分揀蛋白結合的其他抗體交叉阻斷，從而支持以下結論，即它結合到另一分揀蛋白區。
該等觀察顯示，結合到分揀蛋白中的由D-區定義的區域的抗體具有抑制分揀蛋白-PGRN結合的潛力。
19個交叉阻斷抗體(其中18個係D-區和D+抗體)在細胞測定中增加細胞外PGRN(實例13，圖10和圖11)。在體內對該等抗體中的三個進行了測試，並且發現其增加血漿PGRN(圖13，實例15)。
圖1中的框說明了抗體選擇中的步驟。A-E係指基於如描述於實例1和SEQ ID NO：171-180中的改組構建體，對應的分揀蛋白結合抗體所分配的區域。“其他”係指不能被分配到一個區域並且可以結合在A-區與B-區之間的介面處的抗體。Tet係指還結合四齒魨屬-分揀蛋白的抗體。
除所示的人抗體之外，還產生並且類似地表徵了一組小鼠抗人分揀蛋白抗體。該等抗體中的兩個被分配到D區並且顯示與人D-區和D+抗體交叉阻斷，以抑制分揀蛋白-PGRN結合並且增加細胞外PGRN(參見圖4)。
圖2示出了基於與分揀蛋白改組構建體的結合的抗體區域分配。
圖A示出了用於抗體區域分配的如實例1中所述的改組構建體的線性說明。基於人分揀蛋白序列(SEQ ID NO：169)(以灰色描繪的區段)產生分揀蛋白改組構建體，在該序列中胺基酸殘基被交換為來自四齒魨屬分揀蛋白序列(以黑色描繪)(SEQ ID NO：173)的相應胺基酸(實例1-3)。
圖B示出了在A中線性地說明的改組構建體的預測結構。深色殘基指示在改組構建體中變為相應的四齒魨屬序列的殘基。
圖C說明了分別被分配到D-區和E區類別的抗體的結合模式。“+”指示與給定的改組構建體結合，並且“-”指示缺少結合。基於與不同改組構建體的結合模式，為抗體分配區域。所得抗體區域類別由A-E指示。對於說明的D和E區抗體，兩者均結合如由“+”指示的人序列(全部為灰色)並且均不結合如由“-”指示的四齒魨屬序列(全部為黑色)，而 E區抗體結合hB45678改組構建體，然而D區抗體並不結合，從而產生如圖A中說明的結合定位。對於D區抗體，觀察到與以下改組區域結合：hsort、hB06-10、B12390。該等抗體不與hB01-05、B45678、tet結合。對於D+抗體，觀察到與以下改組區域結合：hsort、B12390。該等抗體不與hB01-05、hB06-10、B45678、tet結合。F結合模式與D結合模式類似，除了沒有觀察到D+抗體與hB06-10結合之外。
該等抗體並不與完全四齒魨屬的分揀蛋白結合，兩個除外。這兩個能夠結合四齒魨屬序列的抗體被表示為“tet”。“其他”係指不能被分配到一個區域的抗體。
圖3示出了人D-區和D+抗體的結合親和力。使用Octet 384RED，藉由生物膜層干涉技術如實例8中描述的確定與分揀蛋白改組構建體的結合親和力(EC50，ng/ml)。沒有陰影指示0.1-10ng/ml的EC50，淺灰色陰影指示EC50>10ng/ml並且灰色陰影指示沒有結合(NB)。基於結合模式的區域分配在圖2中說明。改組構建體在圖2中說明並且序列以SEQ ID NO：171-180給出。mAb=單株抗體。
圖4示出了如使用Octet 384RED藉由生物膜層干涉技術如實例8中描述的獲得的小鼠抗人抗體與分揀蛋白改組構建體的結合親和力(EC50，ng/ml)。沒有陰影指示結合並且灰色陰影指示沒有結合(NB)。在圖2中說明基於結合模式的區域分配。
圖5示出了分揀蛋白抗體對分揀蛋白PGRN結合的影響。D區分揀蛋白人單株(humAb)抗體45(實心圓)阻止PGRN與分揀蛋白結合，與不干擾結合的對照分揀蛋白E區抗體(實心三角形)和IgG對照 IgG1-b12(空心三角形)相反。藉由使用均相時間分辨螢光(HTRF)測量結合到分揀蛋白的PGRN的位移來確定抗體的結合(實例10)。用涵蓋50pM至1μM的十個濃度在3倍稀釋曲線中進行抗體的劑量應答評估。藉由在XLfit 4(IDBS，英國)中使用S形濃度應答(可變斜率)進行非線性回歸來計算半最大抑制濃度(IC50)值。
圖6如圖5中所示的，藉由均相時間分辨螢光(HTRF)分析確定的抗體對分揀蛋白-PGRN結合的影響的概述。總計對62個抗體進行了測試-發現15個D-區抗體和3個D+抗體抑制分揀蛋白-PGRN結合並且確定了IC50值。對於兩個另外的抗體(E和其他區域)，觀察到抑制效應。剩餘的所有抗體在測試中都是陰性的。
該等觀察顯示由其D-區或D+分配表徵的分揀蛋白抗體直接抑制分揀蛋白與PGRN的結合並且能夠抑制分揀蛋白-PGRN結合。
圖7示出了抗體之間的交叉阻斷。人抗體和小鼠抗體都在單次實驗中進行了測試，在該單次實驗中每個抗體都結合到人野生型(WT)分揀蛋白(圖7)。隨後，針對與預成型的分揀蛋白：抗體複合物的結合對所有其他抗體進行測試(實例9)。所選的15個D-區和3個D+人抗體(基於其在HTRF PGRN-分揀蛋白測定中的作用)(圖5和圖6)和兩個小鼠D區抗體全部抑制彼此與人WT分揀蛋白的結合。
該等抗體不與被指定為其他區域類別的抗體(如針對識別A-區、E-區和四齒魨屬的抗體所說明的，其在表中分別被編號為AbA1-x、AbE1-x和Abtet)交叉阻斷，除了一個交叉阻斷A區抗體(一個具有未知區域分配(“其他”)並且對D+抗體548部分阻斷的抗體)之外。該等數據 支持在HTRF測定中能夠抑制分揀蛋白-PGRN結合的D-區和D+抗體全部與分揀蛋白中的同一區域相互作用。
藉由分析對抗體-分揀蛋白結合的干擾來確定來自相同或不同區域(基於如圖2中說明的與改組構建體結合的區域)的分揀蛋白抗體之間的交叉阻斷。使用Octet 384RED藉由生物膜層干涉技術測量抗體與分揀蛋白-ECD-His的結合(實例9)。左欄指示一級(固定)抗體並且頂行指示二級抗體(針對固定抗體進行測試的抗體)。一級和二級抗體與分揀蛋白-ECD-His的結合都將產生高於0.1的應答值並且指示兩種抗體都結合到該蛋白的不同區域。小於0.1的應答值顯示缺少二級抗體的結合和被固定(一級)抗體有效的交叉阻斷，這表明兩種抗體結合到分揀蛋白的同一區域。沒有陰影指示沒有結合阻斷，陰影指示這兩種抗體阻斷彼此的結合。
圖8示出了D-區和D+分揀蛋白抗體對選擇性小分子配位基AF38469與分揀蛋白的結合的影響。已經顯示AF38469結合位點與神經降壓素的結合位點類似並且藉由X射線結晶學對其進行了表徵(施羅德(Schrder)等人，生物有機化學與藥物化學快報(Bioorg Med Chem Lett.)2014年1月1日；24(1)：177-80)。已經報導PGRN結合到同一位點(李(Lee)等人，人分子遺傳學(Hum Mol Genet.)2013)，分別結合到D-區和D+的抗體45和68不抑制AF38469與分揀蛋白的結合。這個數據表明該等抗體具有與AF38469結合位點不同的分揀蛋白結合位點。因此，抗體45和68藉由與迄今推測的分揀蛋白中的PGRN結合位點不同的結合位點抑制PGRN-分揀蛋白結合。
藉由使用閃爍親近測定法(SPA)測量結合到分揀蛋白的3H- 神經降壓素的位移來確定對AF38469的親和力。在將蛋白溶液添加至包含AF38469的測定板孔中之前，將分揀蛋白(圓)與或不與1μM分揀蛋白特異性抗體IgG1-6003-045(D-區，實心三角形)、IgG1-6003-068(D+，正方形)或與人IgG1同種型對照(三角形)預培養。分揀蛋白對AF38469的結合親和力呈現為平均IC50±SEM。用涵蓋2.5nM至50μM的十個濃度在3倍稀釋曲線中進行化合物的劑量應答評估。藉由在XLfit 4(IDBS，英國)中使用S形濃度應答(可變斜率)進行非線性回歸來計算半最大抑制濃度(IC50)。(實例11)。
圖9抗體45和68對PGRN的細胞結合和內吞的影響(實例12)。抗體45和68抑制過表現分揀蛋白的細胞對PGRN的結合和/或內吞。神經降壓素(NT，10uM)的添加類似地減少PGRN的結合或內吞，如在如預期的減少的螢光中所反映的，而同種型對照抗體B12並不影響PGRN螢光水平。
在添加重組PGRN持續4hr之前30min，將有待測試的抗體(100nM)添加至S18細胞中。然後將細胞固定，針對PGRN進行染色並且藉由Cellomics進行分析。將PGRN螢光測量為平均螢光/細胞。數據呈現為平均值±SD。藉由單因素方差分析，隨後是鄧奈特分析(Dunnett’s analysis)對數據進行分析，將所有組群與PGRN進行比較。*p<0.05；**p<0.01
圖10在來自過表現分揀蛋白的HEK細胞(S18)的培養物的培養基中藉由ELISA估計的細胞外PGRN水平。分揀蛋白D-區(45，811)和D+(68)抗體增加PGRN水平並且觀察到分揀蛋白配位基神經降壓素的 類似效果，而對照抗體B12沒有影響。該等觀察指示D-區和D+分揀蛋白抗體能夠抑制分揀蛋白介導的PGRN清除，由此增加細胞外PGRN。在100nM下對所有抗體進行測試。在10uM下對神經降壓素進行測試。PGRN水平已經用對照進行歸一化。數據呈現為平均值±SD。藉由單因素方差分析，隨後是鄧奈特分析對數據進行分析，將所有組群與CTRL進行比較*p<0.05；**p<0.01。(實例13)。
圖11示出了如在實例13中描述的藉由ELISA測量的抗體對過表現人分揀蛋白的HEK細胞中的細胞外PGRN的影響。全部所選D-區抗體和三個所選D+抗體增加細胞外PGRN。與上述相同的分析PGRN水平。將PGRN水平用未處理的對照進行歸一化並且以%給出。無陰影框係D區抗體(其中兩個抗體在小鼠抗人分揀蛋白中是升高的(1F2F4 & 5E1F6))，並且其餘係人抗體。灰色陰影框中的3個抗體係D+抗體。Ab=單株抗體。
圖12(上下圖)示出了分揀蛋白抗體對神經元分化的iPSC細胞中的細胞外PGRN的影響(實例14)。分揀蛋白D-區抗體45和D+抗體68增加PGRN水平，而對照抗體B12和抗HEL沒有影響。
將神經元分化的iPSC細胞鋪在96孔板中。一週後，將抗體添加至細胞中。在48hr或96hr時收集來自細胞的培養基並且藉由人PGRN ELISA(恩佐生命科學公司(Enzo Life sciences))進行分析並且按照製造商的說明書對樣品進行分析。分揀蛋白人抗體45和68在兩個時間點均增加培養基中的PGRN水平。對照同種型抗體B12和抗Hel(陰性對照)並不改變細胞外PGRN。數據呈現為平均值±SD。藉由單因素方差分析，隨後係鄧奈特分析對數據進行分析*p<0.05；**p<0.01(實例14)
圖13(圖A-C)示出了用分揀蛋白人抗體處理的表現人分揀蛋白的敲入(KI)小鼠中的血漿PGRN水平(實例15)。分揀蛋白抗體45增加血漿PGRN水平，而對照抗體沒有影響。
A時程研究：在抗體45(D區)注射後觀察到增加的血漿PGRN水平。以10mg/kg的劑量為小鼠皮下注射45(n=5)或對照(n=3)抗體。在不同時間點將各組處死。在用對照抗體(抗Hel)處理的小鼠中血漿PGRN沒有變化，而在用45處理的小鼠中PGRN水平逐漸增加。效果似乎在24與48hr之間達到峰值並且在第4-7天逐漸降低。
B亞慢性研究：將小鼠用10mg/kg的45和對照抗體(抗Hel)一週處理兩次。每週從頰血收集樣品。與用對照抗體處理的動物(n=20)相比，血漿PGRN在第1週升高並且貫穿整個研究保持大致相同的水平。
C劑量應答研究：注射不同劑量(4個劑量：0.1、0.4、2和10mg/kg)的分揀蛋白(45)和對照抗體(抗Hel)並且在第2天將小鼠處死。在用45(10和2mg/kg)處理的小鼠中血漿PGRN係升高的。更低的劑量(0.4和0.1mg/kg)對血漿PGRN沒有影響。數據呈現為平均值±SD。藉由雙因素方差分析，隨後是龐費洛尼分析(Bonferroni’s analysis)對數據進行分析*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(實例15)。
圖14提供了基於加到預測的分揀蛋白結構上的分揀蛋白改組構建體的分揀蛋白區域說明。該等區域構成分揀蛋白的區段，在該等區段中所選胺基酸殘基從人序列向四齒魨屬序列的改變抑制對那一區域類別的抗體的結合。箭頭指示報導的神經降壓素和PGRN的高親和力結合位點 (奎斯特加德(Quistgaard)，自然結構與分子生物學(Nat Struct Mol Biol.)2009年1月；16(1)：96-8；李(Lee)等人，人分子遺傳學(Hum Mol Genet.)2013)。
圖15a(小圖A-F)和15b(小圖A-C)示出了涵蓋抗體45、68和811的構象表位的代表肽。示出的所有肽都顯示出受保護免於交換大於0.5D，肽115-125除外。肽115-125係不受抗體45、68或811的存在影響，並且由此不是構象結合表位的一部分的肽的實例(實例16)。
圖16a(小圖A-F)和16b(小圖A-C)示出了涵蓋抗體30的構象表位的代表肽。示出的所有肽都顯示出受保護免於交換大於0.5D，肽563-572、肽646-656和肽704-714除外。這三種肽係不受抗體30的存在影響，並且由此不是構象結合的一部分的肽的實例(實例16)。
圖17示出了微透析程序的說明。
圖18a示出了時程：在微透析實驗之前24h抗體45或PBS(50mg/kg，10ml/kg，皮下(s.c.))的全身性給予隨時間(24h)對自由活動的hSORT1小鼠的海馬迴中的PRGN水平的影響。(實例17)
圖18b示出了合併的24h透析的結果：自由活動的hSORT1小鼠的海馬迴中的基礎PRGN，在用mab#45和PBS處理的小鼠中分別為3.3±0.3ng/ml和1.1±0.1ng/m1，如藉由推拉式微透析所評估的(實例17)。
圖18c呈現了一個表，示出了將動物用mab#45(n=10)或PBS(n=8)處理之後1d，在24h期間每2h測量的自由活動的hSORT1小鼠的海馬迴中的PRGN水平(平均值±SEM)(實例17)。
如在此使用的，術語“分揀蛋白(Sortilin)”與“分揀蛋白(Sortilin protein)”係同義的(在例如UniProt中鑒定為Q99523，1和2)。分揀蛋白的胺基酸編號相對於SEQ ID NO：169如下所示的給出，Met係胺基酸1：
如在此使用的，術語“D區”旨在係指分揀蛋白上的由如下所示的SEQ ID NO：170中的胺基酸組成的區域(對應於SEQ ID NO：169的殘基523-610)：HYYTILDSGG IIVAIEHSSR PINVIKFSTD EGQCWQTYTF TRDPIYFTGL ASEPGARSMN ISIWGFTESF LTSQWVSYTI DFKDILER
對於D區抗體，觀察到與以下改組區域結合：hsort、hB06-10、B12390。該等抗體不與hB01-05、B45678、tet結合。對於D+抗體， 觀察到與以下改組區域結合：hsort、B12390。該等抗體不與hB01-05、hB06-10、B45678、tet結合。對於命名為“D+”的抗體，觀察到與“D”區抗體類似的結合模式，除了沒有觀察到D+抗體與hB06-10結合之外。儘管與改組構建體的結合模式不同，D+抗體與D-區抗體共用功能特徵(細胞測定等)。
某些D和D+結合抗體尤其結合如在SEQ ID NO：185、186或187中定義的區域。因此，本發明在某些實施方式中涉及結合到SEQ ID 170的，並且在區域SEQ ID NO：185、186或187內的D區序列的抗體或其抗原結合片段。藉由結合，該等抗體或抗原結合片段影響PGRN水平並且因此可以用於治療與PGRN相關的疾病，如FTD、ALS和AD。
藉由進一步分析本發明的D和D+的抗體的結合，鑒定到一些抗體與鄰區(A區)的部分結合。這個區域對應於SEQ ID NO：169的胺基酸78-254，如在SEQ ID NO：180中和以下所示的：
這個區域已經被給予術語“A區”。
因此，在某些實施方式中，本發明涉及以下抗體或其抗原結合片段，其結合如上所定義的並且在SEQ ID No 170、185、186或187中的D區，並且對在SEQ ID NO 180中鑒定的A區進一步具有親和力。在A區內，某些抗體或其抗原結合片段對在SEQ ID NO 181、182、183或184中鑒定的A區胺基酸具有親和力。
PGRN(前上皮因子，顆粒體蛋白-上皮因子先質，PC細胞衍生的生長因子，acrogranin)編碼68.5kDa的分泌型糖蛋白，該糖蛋白具有較小的顆粒體蛋白基序(範圍從6-25kDa)的7.5倍重複，該重複可以從先質PGRN中蛋白水解地切割下來(何，Z.(He,Z.)&貝特曼，A.(Bateman,A.)，分子醫學雜誌(J.MoI.Med.)81：600-6X2(2003))。在非神經元細胞中，PGRN已經與多個事件相關聯，如細胞週期調節和細胞運動(何，Z.(He,Z.)&貝特曼，A.(Bateman,A.)，分子醫學雜誌(J.MoI.Med.)57：600-612(2003)；慕那美，G.(Monami,G.)等人，癌症研究(Cancer Res.)(5(5：7103-7110(2006))、創面修復、炎症(朱，J.(Zhu,J.)等人，細胞(Cell)777：867-878(2002))、生長因子(如血管內皮生長因子(VEGF))的誘導(唐康辛辛，W.(Tangkeangsi π sin,W.)&塞萊羅，G(Serrero,G)，致癌作用(Carcinogenesis)25.1587-1592(2004))以及腫瘤發生(何，Z.&貝特曼，A.，分子醫學雜誌81：600-612(2003)；慕那美，G.等人，癌症研究(5(5：7103-7110(2006)；塞萊羅，G，生物化學和生物物理研究通訊(Biochem Biophys.Res.Commun.)505-409-413(2003)；陸，R(Lu,R)&塞萊羅，G，美國國家科學院院刊(Proc.Natl Acad Sci U.SA)98142-147(2001)；廖，L M.(Liau,L M.)等人，癌症研究60：1353-1360(2000))。
PGRN突變導致單倍型不足(貝克，M.(Baker,M.)等人，自然(Nature)442：916-919(2006)；克魯特斯，M.(Cruts,M.)等人，自然442：920-924(2006))並且已知存在於將近50%的家族性FTD病例中，使得PGRN突變成為FTD的主要遺傳促成因素(克魯特斯，M.&范 布洛克霍芬，C(Van Broeckhoven,C)，遺傳學趨勢(Trends Genet.)24：186-194(2008)； 樂貝，I.(Le Ber,I.)等人，腦(Brain)129：3051-3065(2006))。PGRN突變的功能缺失雜合性狀意味著在健康個體中，PGRN表現在保護健康個體免於患上FTD中發揮劑量依賴性的關鍵作用。
在本發明的背景下，術語“抗體”(Ab)係指免疫球蛋白分子或根據本發明的一些實施方式，免疫球蛋白分子的具有結合到分子(“抗原”)的表位上的能力的片段。天然存在的抗體典型地包含四聚體，該四聚體通常由至少兩條重(H)鏈和至少兩條輕(L)鏈構成。每條重鏈由重鏈可變域(在此縮寫為VH)和重鏈恒定域構成，重鏈恒定域通常由3個結構域(CH1、CH2和CH3)構成。重鏈可以具有任何同種型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型)、IgA(IgA1和IgA2亞型)、IgM以及IgE。每條輕鏈由輕鏈可變域(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定域(CL)構成。輕鏈包括κ鏈和λ鏈。重鏈和輕鏈可變域典型地負責抗原識別，而重鏈和輕鏈恒定域可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q))的結合。VH和VL域還可以被進一步細分成稱作“互補性決定區”的超變區，它們中間穿插著更保守的稱為“構架區”(FR)的區域。每個VH和VL由三個CDR域和四個FR域構成，按以下順序從胺基末端排到羧基末端：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鏈和輕鏈可變域含有與抗原相互作用的結合域。特別相關的是已經“被分離”以便存在於與它可以在自然界中存在的不同於物理環境中的或者已經被修飾以便在胺基酸序列上不同於天然存在的抗體的抗體及其抗原結合片段。
術語“表位”意指能夠特異性結合抗體的抗原決定簇。表位 通常由如胺基酸或糖側鏈分子的表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構象表位和線性表位的區別在於，在變性溶劑的存在下常常喪失與前者而非後者的結合。表位可以包含直接牽涉在結合中的胺基酸殘基以及其他沒有直接牽涉在結合中的胺基酸殘基，如被特異性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，胺基酸殘基在特異性抗原結合肽的影響範圍之內)。
如在此使用的，術語“抗體的抗原結合片段”意指能夠與表位結合的抗體的片段、部分、區域或結構域(無論它是如何產生的(例如，經由切割、重組、合成等))，並且因此術語“抗原結合”旨在意指與“表位結合”係相同的，這樣使得例如，“抗體的抗原結合片段”旨在係與“抗體的表位結合片段”是相同的。抗原結合片段可以含有這樣的抗體的1、2、3、4、5或所有6個CDR域，並且儘管能夠結合到這樣的表位，仍可以展現出對不同於這樣的抗體的表位的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。然而，較佳的是，抗原結合片段含有這樣的抗體的所有6個CDR域。抗體的抗原結合片段可以是單條多肽鏈(例如，scFv)的一部分或包含單條多肽鏈，或者可以是兩條或更多條多肽鏈(各自具有胺基末端和羧基末端)(例如，雙抗體、Fab片段、Fab2片段等)的一部分或包含兩條或更多條多肽鏈。可以例如藉由完整抗體的蛋白酶切割來獲得展現出抗原結合能力的抗體片段。更較佳的是，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨基因或編碼這樣的基因序列的多核苷酸(例如，其編碼cDNA)天然地編碼，但是可以將這兩個結構域使用重組方法藉由柔性接頭連接，該柔性接頭使得這兩個結構域能夠成為單條蛋白鏈，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區締合 以形成單價抗原結合分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，伯德(Bird)等人，(1988)科學(Science)242：423-426；和休斯頓(Huston)等人，(1988)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))85：5879-5883)。可替代地，藉由採用太短(例如，小於約9個殘基)的柔性接頭以使得單條多肽鏈的VL域和VH域締合在一起，可以形成雙特異性抗體、雙抗體或類似分子(其中兩條這樣的多肽鏈締合在一起以形成二價抗原結合分子)(關於雙抗體的描述，參見例如PNAS USA 90(14),6444-8(1993))。本發明所包括的抗原結合片段的實例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CHl域組成的單價片段，或如描述於WO 2007059782中的單價抗體；(ii)F(ab')2片段，包含兩個由二硫鍵在鉸鏈結構域連接的Fab片段的二價片段；(iii)基本上由VH域和CHl域組成的Fd片段；(iv)基本上由VL域和VH域組成的Fv片段；(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，自然(Nature)341，544-546(1989))，其基本上由VH域組成並且也稱為結構域抗體(奧爾特(Holt)等人，生物技術趨勢(Trends Biotechnol.)2003年11月；2i(ll)：484-90)；(vi)駱駝或奈米抗體(雷維特斯(Revets)等人，生物療法的專家意見(Expert Opin Biol Ther.)2005年1月；5_(l)：l ll-24)以及(vii)分離的互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由分離基因編碼，但是可以使用重組方法藉由合成接頭將它們連接，該合成接頭使得它們能夠成為單條蛋白鏈，在該單條蛋白鏈中VL域和VH域配對以形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)；參見例如，伯德(Bird)等人，科學(Science)242，423-426(1988)和休斯頓(Huston)等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988))。在此進一步討論在本發明的背景下的該等和其他有用抗體片段。還應理解 的是，除非另外指明，否則術語抗體還包括抗體樣多肽，如藉由任何已知技術(如酶促切割、肽合成和重組技術)提供的嵌合抗體和人源化抗體以及保留與抗原結合能力的抗體片段(抗原結合片段)。這樣產生的抗體可以具有任何同種型。如在此使用的，“同種型”係指由重鏈恒定域基因編碼的免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。使用熟習該項技術者已知的常規技術獲得這類抗體片段；可以按與完整抗體相同的方式針對實用性容易地對能夠與希望的表位結合的適合片段進行篩選。
術語“雙特異性抗體”係指含有各自靶向獨立靶標的兩個獨立抗原結合片段的抗體。該等靶標可以是存在於不同蛋白質上的表位或存在於相同靶標上的不同表位。可以使用親本單特異性二價抗體分子的HC的恒定域中的補償胺基酸變化製備雙特異性抗體分子。所得異源二聚體抗體含有一個由兩個不同親本單特異性抗體貢獻的Fab。Fc域中的胺基酸變化導致具有隨時間穩定的雙特異性的異源二聚體抗體的穩定性增加。(裡奇韋(Ridgway)等人，蛋白質工程(Protein Engineering)9，617-621(1996)；古納塞克蘭(Gunasekaran)等人，JBC 285，19637-1(2010)；莫耳(Moore)等人，MAbs 3：6 546-557(2011)；施特羅普(Strop)等人，JMB 420，204-219(2012)；梅茨(Metz)等人，蛋白質工程25：10 571-580(2012)；拉布賴恩(Labrijn)等人，PNAS 110：113，5145-5150(2013)；斯普雷特馮克魯德恩斯坦(Spreter Von Kreudenstein)等人，MAbs 5：5 646-654(2013))。雙特異性抗體還可以包括使用ScFv融合物產生的分子。然後將兩個單特異性scfv獨立地連接至能夠形成穩定異源二聚體的Fc域，以產生單個雙特異性分子(馬布裡(Mabry)等人，PEDS 23：3 115-127(2010))。雙特異性分子具有雙重結合能力。
“抗分揀蛋白抗體”或“分揀蛋白抗體”(取決於書寫它的背景，在此可互換地使用)係特異性地結合到分揀蛋白，並且尤其是結合到分揀蛋白D區SEQ ID NO：170的抗體、其抗原結合片段。結合到分揀蛋白D區的抗分揀蛋白抗體通常將以或低於22nM(如在22nM與1nM之間、在10nM與1nM之間或在5nM與1nM之間)的親和力(IC50)結合到D-區(例如SEQ ID No：185、186或187)內的3、4、5、6或7個連續胺基酸的構象表位或線性表位。根據一些實施方式，抗分揀蛋白抗體還可以結合到A區(SEQ ID NO：180、181、182、183或184)，儘管強調的是據信它們的主要生物功能係藉由結合到D區實現的。
鑒定的結合位點係相當獨特的，如藉由例如選擇性小分子配位基AF38469與分揀蛋白的結合所顯示的。已經顯示AF38469結合位點與神經降壓素的結合位點類似並且藉由X射線結晶學對其進行了表徵(施羅德(Schrder)等人，生物有機化學與藥物化學快報(Bioorg Med Chem Lett.)2014年1月1日；24(1)：177-80)。已經報導PGRN結合到同一位點(李(Lee)等人，人分子遺傳學(Hum Mol Genet.)2013)。分別結合到D-區和D+的抗體45和68不抑制AF38469與分揀蛋白的結合。這個數據表明該等抗體具有與AF38469和神經降壓素結合位點不同的分揀蛋白結合位點。因此，在某些實施方式中，本發明涉及能夠特異性結合到分揀蛋白並且抑制PGRN與分揀蛋白的結合的抗體或其抗原結合片段，但是該結合不抑制或基本上不抑制神經降壓素或AF38469與分揀蛋白的結合。這可以使用閃爍親近測定法(SPA)，使用例如結合到分揀蛋白的位移來示出(實例11)。解釋這個發現的一方式可以是抗體或其抗原結合片段結合到分揀蛋白的表面區 域，而小分子樣神經降壓素結合在結合口袋內。
如在此使用的，術語“人抗體”(其可以縮寫為“humAb”或“HuMab”)旨在包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變域和恒定域的抗體。本發明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，在體外藉由隨機或位點特異性誘變或在基因重排期間或在體內藉由體細胞突變引入的突變)。
如在此使用的術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”係指單分子組成物的抗體分子製劑。常規的單株抗體組成物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。在某些實施方式中，單株抗體可以由多於一種Fab域構成，由此增加對多於一種靶標的特異性。術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”並不旨在受限於任何具體產生方法(例如，重組的、轉基因的、融合瘤等)。
本發明的抗體及其分揀蛋白抗原結合片段較佳的是人的，例如對於小鼠抗體(表示為1F2、5E1)而言，是“人源化的”，特別是如果用於治療目的的話。術語“人源化的”係指通常使用重組技術製備的具有衍生自來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構的分子。抗原結合位點可以包含融合至人恒定域的完全非人抗體可變域或僅包含接枝到人可變域的適當人構架區的此類可變域的互補決定區(CDR)。此類人源化分子的構架殘基可以是野生型的(例如，全人的)或者它們可以被修飾成包含一種或多種未在其序列已經充當人源化的基礎的人抗體中發現的胺基酸取代。人源化減小或消除該分子的恒定域充當人個體中的免疫原的可能性，但是仍存在對外源 可變域做出免疫應答的可能性(洛布格利奧，A.F.(LoBuglio,A.F.)等人(1989)“人體內的小鼠/人嵌合單株抗體：動力學與免疫應答(Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))86：4220-4224)。另一種方法不僅集中於提供人衍生的恒定域，還集中於修飾可變域以便將它們改造地盡可能接近人形式。已知的是，重鏈和輕鏈兩者的可變域都含有三個互補決定區(CDR)，它們響應於所討論的抗原而改變並且決定結合能力，其側翼為四個構架區(FR)，該等構架區在給定物種中是相對保守的並且推定為CDR提供支架。當相對於特定抗原製備非人抗體時，可以藉由在有待修飾的人抗體中存在的FR上接枝衍生自非人抗體的CDR來“改造”或“人源化”可變域。已經由薩托，K.(Sato,K.)等人(1993)癌症研究(Cancer Res)53：851-856；萊克曼妮，L.(Riechmann,L.)等人(1988)“改造治療用的人抗體(Reshaping Human Antibodies for Therapy)”，自然(Nature)332：323-327；費爾霍恩，M.(Verhoeyen,M.)等人(1988)“改造人抗體：接枝抗溶菌酶活性(Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity)”，科學(Science)239：1534-1536；凱特伯勒，C.A.(Kettleborough,C.A.)等人(1991)“藉由CDR-接枝人源化小鼠單株抗體：構架殘基在環構象中的重要性(Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting；The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation)”，蛋白質工程(Protein Engineering)4：773-3783；馬艾達，H.(Maeda,H.)等人(1991)“具有HIV中和活性的經改造的人抗體的構建(Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity)”，人抗體融合瘤(Human Antibodies Hybridoma)2：124-134；戈爾曼，S.D.(Gorman,S.D.)等人(1991)“改造治療用CD4抗體(Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：4181-4185；坦皮斯特，P.R.(Tempest,P.R.)等人(1991)“改造人單株抗體以抑制體內人呼吸道合胞病毒感染(Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo)”，生物/技術(Bio/Technology)9：266-271；科，M.S.(Co,M.S.)等人(1991)“抗病毒治療用的人源化抗體(Humanized Antibodies For Antiviral Therapy)”，美國國家科學院院刊88：2869-2873；卡特，P.(Carter,P.)等人(1992)“人癌症治療用的抗p185her2抗體的人源化(Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy)”，美國國家科學院院刊89：4285-4289；以及科，M.S.等人(1992)“對CD33抗原具有特異性的嵌合和人源化抗體(Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD3-3 Antigen)”，(J.Immunol.)148：1149-1154報導了這種方法在各種抗體中的應用。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，它們相對於原始抗體係改變的，它們還被稱為一個或多個“衍生自”來自原始抗體的一個或多個CDR的CDR。人源化抗原的能力係眾所周知的(參見例如，美國專利號5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
術語“抗體“XX””旨在表示以下抗體或其抗原結合片段(例如抗體“5E1”)，其包含如由其對應SEQ ID NO定義的輕鏈、輕鏈可 變域或輕鏈可變域CDR1-3和如由其對應SEQ ID NO定義的重鏈、重鏈可變域或重鏈可變域CDR1-3或者由其組成。在某些實施方式中，抗體或其抗原結合片段藉由如由其SEQ ID NO定義的其整個重鏈可變域和如由其SEQ ID NO定義的其輕鏈可變域定義。
除非在此另外指明，否則抗體的Fc區或恒定域中的胺基酸殘基編號係根據EU編號系統(也稱為EU索引)，如描述在卡巴特(Kabat)等人，免疫學關注的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共衛生服務，美國國立衛生研究院(Public Health Service,National Institutes of Health)，貝塞斯達，馬里蘭州，1991中。
如在此使用的，抗體或其抗原結合片段被說成“特異性地”結合另一分子的區域(即，表位)，如果它相對於替代表位與該表位更加頻繁地、更加快速地、以更長的持續時間和/或以更大的親和力或親合力反應或締合的話。在一個實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合片段相對於另一分子至少強10倍地與其靶標(分揀蛋白)結合；較佳的是強至少50倍並且更較佳的是強至少100倍。較佳的是，抗體或其抗原結合片段在生理條件下(例如，在體內)結合。因此，所謂“特異性地結合到分揀蛋白”，我們包括該抗體或其抗原結合片段以這樣的特異性和/或在這樣的條件下結合到分揀蛋白上的能力。適合於確定這樣的結合的方法係熟習該項技術者已知的，並且示例性方法描述在所附實例中。如在此使用的，在抗體與預定抗原結合的背景下，術語“結合”典型地是指以對應於約10-7M或更小(如約10-8M或更小、如約10-9M或更小)的KD的親和力結合，當用抗原作為配位基並且抗體作為分析物在BIAcore® 3000或T200儀器中藉由例如 表面電漿共振(SPR)技術確定時，並且以對應於以下KD的親和力結合到預定抗原，該KD比該抗體對與除預定抗原或緊密相關抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)結合的親和力低至少十倍，如低至少100倍、例如低至少1,000倍、如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍。親和力低的量依賴於抗體的KD，這樣使得當抗體的KD非常低(即，該抗體具高度特異性)時，低於對非特異性抗原的親和力的對抗原的親和力的量可以是至少10,000倍。具體而言，本發明涉及抗分揀蛋白抗體，當使用Octet384RED藉由例如生物膜層干涉技術確定時(實例8)，其展現出對應於或低於22nM(如在22nM與1nM之間、在10nM與1nM之間或在5nM與1nM之間)的結合親和力。
在本發明的某些實施方式中，本發明涉及能夠與humAb抗體45或humAb抗體68競爭與分揀蛋白結合的抗體或其抗原結合片段。在另一個實施方式中，本發明涉及能夠與抗體45競爭與如在SEQ ID NO：170中定義的分揀蛋白的D區結合的抗體或其抗原結合片段。這種競爭性結合抑制可以使用本領域熟知的測定和方法確定，例如使用固定有人分揀蛋白的BIAcore®晶片並且與參考抗體(如抗體“45”或“68”)，與和不與有待測試的抗體多肽培養。可替代地，可以使用成對映射方法，其中參考抗體(如抗體“45”或“68”)被固定到BIAcore®晶片的表面，人分揀蛋白抗原被結合到固定的抗體，並且然後測試第二抗體同時結合人分揀蛋白的能力(參見‘BIAcore®測定手冊(BIAcore® Assay Handbook)’，GE醫療集團生命科學部(GE Healthcare Life Sciences)，29-0194-00 AA 05/2012；將其揭露藉由引用結合在此)。
如在此使用的，術語“kd”(sec -1或1/s)係指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值又稱為koff值。
如在此使用的，術語“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)係指特定抗體-抗原相互作用的締合速率常數。
如在此使用的，術語“KD”(M)係指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數並且藉由kd除以ka獲得。
如在此使用的，術語“KA”(M-1或1/M)係指特定抗體-抗原相互作用的締合平衡常數並且藉由ka除以kd獲得。
在一個實施方式中，本發明涉及展現出以下特性中的一種或多種的抗體或其抗原結合片段：(i)在0.5-10nM(如1-5nM或1-2nM)之間的對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力。
術語“減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力”包括使用實例10中所揭露的時間分辨螢光測定(HTFR)，具有以小於50nM但較佳的是在10nM與0.2nM之間的IC50抑制與PGRN結合的能力的抗體。
術語“減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力”包括將培養基中的PGRN濃度增加至少25%(如在25%與500%之間、 在25%與400%之間或在25%與200%之間)的能力，如藉由ELISA測定如實例13中所揭露的測量的。
“減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力”包括將PGRN的細胞內濃度減少至少10%但較佳的是在20%與100%之間的能力，如藉由基於細胞組學的測定如實例12中所揭露的測量的。
“增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力”包括將血漿中的PGRN濃度增加至少25%但較佳的是在50%與500%之間的能力，如藉由ELISA測定如實例15中所揭露的測量的。
設想的是，增加腦中的PGRN的能力還可以藉由例如微透析進行測定。因此，“增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力”包括將腦中的PGRN濃度增加至少25%但較佳的是在50%與500%之間的能力，如藉由微透析所測量的。
在一些抗體中，僅需CDR的一部分(即結合所需的CDR殘基亞群，稱為SDR)在人源化抗體中保持結合。可以藉由分子建模和/或憑經驗或者如在岡薩雷斯，N.R.(Gonzales,N.R.)等人，(2004)“使用多個人種系範本對鼠類抗體進行SDR接枝以最小化其免疫原性(SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity)”，分子免疫學(Mol.Immunol.)41：863-872中所述的，基於先前研究(例如CDR H2中的殘基H60-H65通常是不需要的)從位於喬西亞(Chothia)超變環外的卡巴特CDR區域(參見，卡巴特(Kabat)等人，(1992)免疫學關注的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，公開號91-3242； 喬西亞，C.(Chothia,C.)等人，(1987)“免疫球蛋白的超變區的典型結構(Canonical Stuctures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196：901-917)中鑒定不接觸相關表位並且不在SDR中的CDR殘基。在此類人源化抗體中，在一個或多個供體CDR殘基不存在或整個供體CDR被省略的位置處，佔據該位置的胺基酸可以是在受體抗體序列中佔據相應位置(藉由卡巴特編號)的胺基酸。在包含在內的CDR中受體對供體胺基酸的這樣的取代的數目反映了競爭考慮的平衡。這樣的取代在降低人源化抗體中的小鼠胺基酸的數目方面並且因此在降低潛在的免疫原性方面是潛在有利的。然而，取代還可以引起親和力變化，並且較佳的是避免親和力的顯著減少。還可以憑經驗選擇CDR內的取代位置和待取代的胺基酸。
CDR殘基的單個胺基酸改變可以導致失去功能性結合的事實(魯迪科夫，S.(Rudikoff,S.)等人(1982)“單個胺基酸取代改變抗原結合特異性(Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-binding Specificity)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6)：1979-1983)提供了用於系統性鑒定可替代的功能性CDR序列的手段。在用於獲得此類變體CDR的較佳的方法中，將編碼CDR的多核苷酸誘變(例如經由隨機誘變或藉由位點定向方法(例如，用編碼突變座位的引物進行聚合酶鏈式介導的擴增))以產生具有取代的胺基酸殘基的CDR。藉由比較原始(功能性)CDR序列中的相關殘基的身份與取代的(非功能性)變體CDR序列的身份，可以鑒定出該取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM系統提供了藉由分析序列數據庫創建的胺基酸取代矩陣，用於可信比對(埃 迪，S.R.(Eddy,S.R.)(2004)“BLOSUM62比對得分矩陣來自哪裡？(Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？)”，自然生物技術(Nature Biotech.)22(8)：1035-1036；赫尼科夫，J.G.(Henikoff,J.G.)(1992)“來自蛋白質嵌段的胺基酸取代矩陣(Amino acid substitution matrices from protein blocks)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))89：10915-10919；卡林，S.(Karlin,S.)等人，(1990)“藉由使用通用評分方案評估分子序列特徵的統計顯著性的方法(Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes)”，美國國家科學院院刊87：2264-2268；阿爾丘爾，S.F.(Altschul,S.F.)(1991)“來自資訊理論視角的胺基酸取代矩陣(Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective)”，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)219，555-565)。目前，最先進的BLOSUM數據庫係BLOSUM62數據庫(BLOSUM62.iij)。表1呈現了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，並且因此更加可能地，該取代將不會影響功能)。如果包含所得CDR的抗原結合片段不能結合到分揀蛋白，例如，則BLOSUM62.iij取代得分被認為是不充分保守的，並且選擇且產生新的具有更高取代得分的候選取代。因此，例如，如果原始殘基係穀胺酸(E)並且非功能性取代殘基係組胺酸(H)，則BLOSUM62.iij取代得分將為0，並且更保守的變化(如到天冬胺酸、天冬醯胺、穀氨醯胺或賴胺酸)係較佳的。
本發明因此考慮了隨機誘變用於鑒定改進的CDR的用途。在本發明的背景下，保守取代可以由反映在以下三個表中的一個或多個中的胺基酸類別內的取代定義：
保守取代的胺基酸殘基類別：
替代性保守胺基酸殘基取代類別：
胺基酸殘基的替代性物理和功能分類：
更保守的取代分組包括：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、賴胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸以及天冬醯胺-穀氨醯胺。
還可以使用描述於例如克賴頓(Creighton)(1984)蛋白質：結構與分子特性(Proteins：Structure and Molecular Properties)(第2版1993)，W.H.弗裡曼公司(W.H.Freeman and Company)中的原理制定另外的胺基酸組群。
噬菌體展示技術可替代地被用於增加(或降低)CDR親和力。被稱為親和力成熟的這種技術採用誘變或“CDR步移”並且重選擇使 用靶抗原或其抗原性抗原結合片段來鑒定具有如下CDR的抗體，該等CDR當與初始抗體或親本抗體相比時以更高(或更低)親和力結合到抗原(參見例如，格拉澤(Glaser)等人(1992)免疫學雜誌(J.Immunology)149：3903)。誘變整個密碼子而不是單個核苷酸產生胺基酸突變的半隨機譜。可構建由一組變體殖株所組成的庫，每一殖株都在單個CDR中相差單個胺基酸改變，並且該等殖株包含代表了每個CDR殘基的每個可能胺基酸取代的變體。可藉由使固定化突變體與標記的抗原相接觸來篩選對抗原的結合親和力增加(或減少)的突變體。可以使用本領域已知的任何篩選方法來鑒定對抗原具有增加或減少的親和力的突變抗體(例如，ELISA)(參見吳(Wu)等人，1998，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))95：6037；耶爾頓(Yelton)等人，1995，免疫學雜誌(J.Immunology)155：1994)。可能可以使用隨機化輕鏈的CDR步移(參見，希爾(Schier)等人，1996，分子生物學雜誌(J.Mol.Bio.)263：551)。
用於完成此類親和力成熟的方法描述於以下中，例如：克勞斯，J.C.(Krause,J.C.)等人(2011)“使抗體結合部位構造變形的插入突變增強人抗體的功能(An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody)”，MBio.2(1)pii：e00345-10.doi：10.1128/mBio.00345-10；庫安，C.T.(Kuan,C.T.)等人(2010)“靶向惡性膠質瘤和黑色素瘤的親和力成熟的抗糖蛋白NMB重組免疫毒素(Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas)”，國際癌症雜誌(Int.J.Cancer)10.1002/ijc.25645；海克爾，B.J.(Hackel,B.J.)等人(2010)“穩定性和CDR 組成偏移富集粘合劑功能性景觀(Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes)”，分子生物學(J.Mol.Biol.)401(1)：84-96；蒙哥馬利，D.L.(Montgomery,D.L.)等人(2009)“針對HIV-1 gp41的人單株抗體的親和力成熟與表徵(Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41)”，MAbs 1(5)：462-474；古斯特齊納，E.(Gustchina,E.)等人(2009)“藉由源自於合成的原初人抗體文庫的單株Fab的CDR-H2環的定向多樣化以及針對Gp41的內部三聚物的捲曲螺旋進行的親和力成熟產生一組具有改進的HIV-1中和效價以及幅度的Fab(Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth)”，病毒學(Virology)393(1)：112-119；芬利，W.J.(Finlay,W.J.)等人(2009)“用於抗RAGE治療的人源化大鼠抗體的親和力成熟：綜合誘變揭示在互補決定區內部和外部兩者的高水平的突變可塑性(Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy：Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions)”，分子生物學(J.Mol.Biol.)388(3)：541-558；波斯特朗，J.(Bostrom,J.)等人(2009)“改進抗體結合親和力以及特異性用於治療性開發(Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development)”，分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)525：353-376；史泰德，S.(Steidl,S.)等人(2008)“藉由定向CDR多樣化進行人GM-CSF抗體 的體外親和力成熟(In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification)”，分子免疫學(Mol.Immunol.)46(1)：135-144；以及巴爾代雷斯，R.(Barderas,R.)等人(2008)“藉由電腦建模輔助的抗體親和力成熟(Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling)”，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))105(26)：9029-9034。
因此，所包含的抗體或其抗原結合片段的CDR變體的序列可以藉由取代而不同於親本抗體的CDR的序列；例如取代的4個胺基酸殘基、3個胺基酸殘基、2個胺基酸殘基或胺基酸殘基中的1個。根據本發明的實施方式，此外設想的是，CDR區中的胺基酸可以用保守取代進行取代，如在以下3個表中所定義的。
術語“轉基因非人動物”係指具有包含一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉基因或轉染色體(整合或未整合進動物的天然基因組DNA)的基因組並且能夠表現全人抗體的非人動物。例如，轉基因小鼠可以具有人輕鏈轉基因和人重鏈轉基因或人重鏈轉染色體，這樣使得當用分揀蛋白抗原和/或表現分揀蛋白的細胞免疫時，該小鼠產生人抗分揀蛋白抗體。人重鏈轉基因可以被整合進小鼠的染色體DNA中，轉基因小鼠就是這樣，例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCo12小鼠，或者人重鏈轉基因可以被維持在染色體外，如描述於WO 02/43478中的轉染色體KM小鼠就是這樣。這樣的轉基因和轉染色體小鼠(在此統稱為“轉基因小鼠”)藉由經歷V-D-J重組和同種型轉換能夠產生多種針對給定抗原的人單株抗體同種型(如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
轉基因非人動物還可以藉由引入編碼這樣的特異性抗體的基因(例如藉由將該等基因可操作地連接至在該動物的乳中表現的基因)而用於產生針對特定抗原的抗體。
如在此使用的術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指改善、減緩、減弱或逆轉疾病或障礙的進展或嚴重性，或者改善、減緩、減弱或逆轉這種疾病或障礙的一種或多種症狀或副作用。出於本發明的目的，“治療(treatment)”或“治療(treating)”另外意指用於獲得有益的或希望的臨床結果的方法，其中“有益的或希望的臨床結果”包括但不限於症狀的緩解、障礙或疾病程度的減小、穩定化的(即沒有惡化的)疾病或障礙狀態、疾病或障礙狀態進展的延緩或減緩、疾病或障礙狀態的改善或減輕以及疾病或障礙的緩解，不論是部分地或全部地、可檢出的或不可檢出的。
當應用於本發明的抗體或其抗原結合片段時，“有效量”係指以所需劑量並且持續所需時間段足以達到預期生物效應或希望的治療結果(包括但不限於臨床結果)的量。當應用於本發明的抗體或其抗原結合片段時，短語“治療有效量”旨在表示足以改善、減輕、穩定、逆轉、減緩、減弱或延緩障礙或疾病狀態的進展，或者該障礙或疾病的症狀的進展的抗體或其抗原結合片段的量。在實施方式中，本發明的方法提供了抗體或其抗原結合片段與其他化合物組合的給藥。在此類情況下，“有效量”係足以引起預期的生物效應的該組合的量。
本發明的抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段的治療有效量可以根據以下因素而變化，如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及 抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段在個體中引起希望的應答的能力。治療有效量還是抗體或抗體部分的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量。
抗體較佳的是人或人源化抗體。
抗體5E1：
因此，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：1的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：8的重鏈可變域和SEQ ID NO：7的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體1F2：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：16的重鏈可變域和SEQ ID NO：15的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體068：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：24的重鏈可變域和SEQ ID NO：23的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體1320：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：32的重鏈可變域和SEQ ID NO：31的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體93-05：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：36的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：37的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：38的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：40的重鏈可變域和SEQ ID NO：39的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體93-01：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：41的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：42的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：43的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：44的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：45的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：46的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：48的重鏈可變域和SEQ ID NO：47的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體924：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：49的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：50的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：51的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：52的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：53的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：54的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：56的重鏈可變域和SEQ ID NO：55的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體1276：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：57的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：58的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：59的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：60的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：61的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：62的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：64的重鏈可變域和SEQ ID NO：63的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體849：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：65的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：66的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：67的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：68的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：69的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：70的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：72的重鏈可變域和SEQ ID NO：71的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體531-02：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：73的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：74的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：75的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：76的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：77的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：78的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：80的重鏈可變域和SEQ ID NO：79的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體548-01：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：81的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：82的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：83的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：84的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：85的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：86的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：88的重鏈可變域和SEQ ID NO：87的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體548-02：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：89的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：90的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：91的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：92的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：93的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：94的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：96的重鏈可變域和SEQ ID NO：95的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體1289-02：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：97的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：98的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：99的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：100的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：101的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：102的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：104的重鏈可變域和SEQ ID NO：103的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體811-02：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：105的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：106的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：107的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：108的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：109的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：110的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：112的重鏈可變域和SEQ ID NO：111的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體566-01：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：113的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：114的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：115的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：116的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：117的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：118的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：120的重鏈可變域和SEQ ID NO：119的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體562：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：121的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：122的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：123的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：124的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：125的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：126的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：128的重鏈可變域和SEQ ID NO：127的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體193：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：129的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：130的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：131的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：132的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：133的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：134的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：136的重鏈可變域和SEQ ID NO：135的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體88：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：137的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：138的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：139的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：140的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：141的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：142的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：144的重鏈可變域和SEQ ID NO：143的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體045：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：145的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：146的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：147的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：148的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：149的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：150的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：152的重鏈可變域和SEQ ID NO：151的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體044：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：153的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：154的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：155的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：156的胺基酸序列的重鏈CDR1； (e)具有SEQ ID NO：157的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：158的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：160的重鏈可變域和SEQ ID NO：159的輕鏈可變域或者由其組成。
抗體002：
根據另一個實施方式，本發明涉及包含以下各項或由其組成的抗體或其抗原結合片段：(a)具有SEQ ID NO：161的胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：162的胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：163的胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：164的胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：165的胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：166的胺基酸序列的重鏈CDR3。
較佳的是，單株抗體可以包含SEQ ID NO：168的重鏈可變域和SEQ ID NO：167的輕鏈可變域或者由其組成。
根據一個實施方式，以上所提及的抗體可以進一步包括與所述CDR1、CDR2和/或CDR3(VH和/或VL)序列具有不超過4個胺基酸差異、或不超過3個胺基酸差異、或不超過2個胺基酸差異或不超過1個胺基酸差異的變體。
此外，抗體可以與藥學上可接受的載體一起處於組成物中。本發明的抗體可以在治療中使用。具體而言，本發明的抗體可以用於治療FTD或ALS或TDP43蛋白質病(如阿茲海默症(AD))。
藉由本發明所設想的治療可以是長期的並且患者可以接受至少2週(如至少持續1個月、6個月、1年或更久)治療。
本發明的抗體可以例如是藉由融合瘤方法產生的單株抗體，該方法首次由科勒(Kohler)等人，自然(Nature)256，495(1975)進行描述，或者可以是藉由重組DNA或其他方法產生的單株抗體。還可以使用在例如克拉克森(Clackson)等人，自然(Nature)352，624-628(1991)和馬克思(Marks)等人，分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)222，581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離單株抗體。單株抗體可以從任何適合的來源獲得。因此，例如，單株抗體可以從製備自鼠類脾臟B淋巴細胞的融合瘤獲得，該等淋巴細胞獲得自用感興趣的抗原或編碼感興趣的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，該等淋巴細胞處於在表面表現該抗原的細胞的形式。單株抗體還可以從來源於免疫的人的或來自非人哺乳動物(如大鼠、兔、狗、綿羊、山羊、靈長類動物等)的表現抗體的細胞的融合瘤獲得。
在一個實施方式中，本發明的抗體係人抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統而非小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠產生針對分揀蛋白的人單株抗體。這樣的轉基因和轉染色體小鼠包括在此分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠。
HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因微座位連同定向突變，該微座位編碼非重排人重鏈可變和恒定(μ和Y)以及輕鏈可變和恒定(κ)免疫球蛋白序列，該等定向突變使內源μ和K鏈座位失活(朗伯格，N.(Lonberg,N.)等人，自然(Nature)368，856-859(1994))。因此，小鼠展現出減少的小鼠IgM或K表現，並且響應於免疫，所引入的人重鏈和輕鏈 轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人IgG,κ單株抗體(朗伯格，N.(Lonberg,N.)等人(1994)，見上文；綜述於朗伯格，N.，實驗藥物學手冊(Handbook of Experimental Pharmacology)113，49-101(1994)；朗伯格，N.和胡薩爾，D.(Huszar,D.)，國際免疫學評論(Intern.Rev.Immunol.)第13卷65-93(1995)和哈丁，F.(Harding,F.)和朗伯格，N.，紐約科學院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci)764536-546(1995))。HuMAb小鼠的製備詳細描述於泰勒，L.(Taylor,L.)等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)20，6287-6295(1992)；陳，J.(Chen,J.)等人，國際免疫學(International Immunology)5，647-656(1993)；圖愛隆(Tuaillon)等人，免疫學雜誌(J.Immunol.)152，2912-2920(1994)；泰勒，L.等人，國際免疫學6,579-591(1994)；菲施維爾德，D.(Fishwild,D.)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)。還參見US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918以及WO 01/09187。
Hco7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在其內源輕鏈(κ)基因中具有JKD破壞(如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993))，在其內源重鏈基因中具有種CMD破壞(如描述於WO01/14424的實例1)以及KCo5人κ輕鏈轉基因(如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996))。此外，HCo7小鼠具有HCo7人重鏈轉基因(如描述於US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重鏈轉基因(如描述於WO 01/14424的實例2)， HCo17小鼠具有HCo17人重鏈轉基因(如描述於WO 01/09187的實例2)並且HCo20小鼠具有HCo20人重鏈轉基因。所得小鼠在對內源小鼠重鏈和κ輕鏈座位破壞純合的背景下表現人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉基因。
在KM小鼠品系中，內源小鼠κ輕鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993)，並且內源小鼠重鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於WO 01/09187的實例1。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中。這個小鼠品系還攜帶由染色體14片段hCF(SC20)構成的人重鏈轉染色體，如描述於WO 02/43478中。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以藉由將HCo12、HCo17和HCo20與KCo5[J/K](Balb)雜交來產生，如描述於WO 09/097006中。
在KM小鼠品系中，內源小鼠κ輕鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於陳(Chen)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.)12，811-820(1993)，並且內源小鼠重鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於WO 01/09187的實例1。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於菲施維爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中。這個小鼠品系還攜帶由染色體14抗原結合片段hCF(SC20)構成的人重鏈轉染色體，如描述於WO 02/43478中。
來自該等轉基因小鼠的脾細胞可以用於根據熟知的技術產生分泌人單株抗體的融合瘤。本發明的人單株抗體或多株抗體或者源於其他物種的本發明的抗體還可以藉由產生對於感興趣的免疫球蛋白重鏈和輕 鏈序列而言轉基因的另一非人哺乳動物或植物並且從其中產生可回收形式的抗體而轉基因地產生。與哺乳動物中的轉基因生產相結合，抗體可以從山羊、奶牛或其他哺乳動物的乳中產生和回收。參見例如US 5,827,690、US 5,756,687、US 5,750,172和US 5,741,957。
本發明的抗體可以具有任何同種型。同種型的選擇典型地將由希望的效應子功能(如ADCC誘導)來指導。示例性同種型係IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人輕鏈恒定域κ或λ中任一者。如果希望的話，可以藉由已知方法轉換本發明的抗分揀蛋白抗體的類別。例如，最初是IgM的本發明抗體可以類別轉換為本發明的IgG抗體。此外，類別轉換技術可以用來將一個IgG亞類轉化成另一亞類，例如從IgG1到IgG2。因此，本發明的抗體的效應子功能可以藉由同種型切換變為例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體，用於各種治療用途。在一個實施方式中，本發明的抗體係IgG1抗體，例如IgG1,κ。抗體被說成屬於特定同種型，如果其胺基酸序列相對於其他同種型與該同種型大部分同源的話。
在一個實施方式中，本發明的抗體係全長抗體，較佳的是IgG抗體，特別是IgG1,κ抗體。在另一個實施方式中，本發明的抗體係抗體抗原結合片段或單鏈抗體。
抗體及其抗原結合片段可以例如使用常規技術藉由抗原結合片段化來獲得，並且按與如在此針對完整抗體描述的相同方式針對實用性對抗原結合片段進行篩選。例如，F(ab')2抗原結合片段可以藉由用胃蛋白酶處理抗體而產生。可以處理所得F(ab')2抗原結合片段，以減少二硫鍵，從而產生Fab'抗原結合片段。Fab抗原結合片段可以藉由用木瓜蛋白酶處理 IgG抗體而獲得；Fab'抗原結合片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗體而獲得。F(ab)抗原結合片段還可以經由硫醚鍵或二硫鍵藉由結合以下描述的Fab’而產生。Fab'抗原結合片段係藉由切割F(ab')2的鉸鏈域的二硫鍵獲得的抗體抗原結合片段。Fab'-抗原結合片段可以藉由用還原劑(如二硫蘇糖醇)處理F(ab')2抗原結合片段而獲得。抗體抗原結合片段還可以藉由在重組細胞中表現編碼此類抗原結合片段的核酸而產生(參見例如埃文斯(Evans)等人，免疫學方法雜誌(J.Immunol.Meth.)184，123-38(1995))。例如，編碼F(ab')2抗原結合片段的一部分的嵌合基因可以包括編碼H鏈的CH1域和鉸鏈域的DNA序列，隨後是翻譯終止密碼子，以產生這樣一種截短的抗體抗原結合片段分子。
在一個實施方式中，抗分揀蛋白抗體係單價抗體，較佳的是如在WO 2007059782(將其藉由引用以其全部內容結合在此)中描述的具有鉸鏈區缺失的單價抗體。因此，在一個實施方式中，抗體係單價抗體，其中所述抗分揀蛋白抗體藉由以下方法構建，該方法包括：i)提供編碼所述單價抗體的輕鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼所選抗原特異性抗分揀蛋白抗體的VL區的核苷酸序列和編碼Ig的恒定CL區的核苷酸序列，其中編碼所選抗原特異性抗體的VL區的所述核苷酸序列和編碼Ig的CL區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起，並且其中，在IgG1亞型的情況下，編碼CL區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人IgG的存在下或當給予給動物或人時，該CL區不含有能夠與包含該CL區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價鍵的任何胺基酸；ii)提供編碼所述單價抗體的重鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼所選抗原特異性抗體的VH區的核 苷酸序列和編碼人Ig的恒定CH區的核苷酸序列，其中編碼CH區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人IgG的存在下或當給予給動物、人時，對應於鉸鏈區和(如由Ig亞型所要求的)CH區的其他區域(如CH3區)的區域不包含參與和包含人Ig的CH區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價或穩定的非共價重鏈間鍵的任何胺基酸殘基，其中編碼所選抗原特異性抗體的VH區的所述核苷酸序列和編碼所述Ig的CH區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起；iii)提供用於產生所述單價抗體的細胞表現系統；iv)藉由在(iii)的細胞表現系統的細胞中共表現(i)和(ii)的核酸構建體來產生所述單價抗體。
類似地，在一個實施方式中，抗分揀蛋白抗體係單價抗體，其包含：(i)如在此描述的本發明抗體的可變域或所述結構域的抗原結合部分，以及(ii)免疫球蛋白的CH域或其包含CH2和CH3域的結構域，其中該CH域或其結構域已經被修飾，這樣使得對應於鉸鏈域和(如果該免疫球蛋白不是IgG4亞型的話)CH域的其他結構域(如CH3域)的結構域不包含任何胺基酸殘基，該等任何胺基酸殘基能夠與相同CH域形成二硫鍵或在多株人IgG的存在下與相同CH域形成其他共價或穩定的非共價重鏈間鍵。
在一個另外的實施方式中，單價抗體的重鏈已經被修飾，這樣使得已經缺失整個鉸鏈區。
在另一個另外的實施方式中，單價抗體的序列已經被修飾，這樣使得它不包含用於N-連接的糖基化的任何受體位點。
本發明還包括“雙特異性抗體”，其中抗分揀蛋白結合區(例如，抗分揀蛋白單株抗體的分揀蛋白結合區)係靶向一種以上表位的二價或多價雙特異性支架的一部分(例如第二表位可以包含主動轉運受體的表位，這樣使得該雙特異性抗體將展現出跨生物屏障(如血腦屏障)的改進的胞轉作用)。因此，在另一個另外的實施方式中，抗分揀蛋白抗體的單價Fab可以連接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv，以產生雙特異性抗體。雙特異性抗體可以具有雙重功能，例如由抗分揀蛋白結合域賦予的治療功能和可以結合到受體分子以增強跨生物屏障(如血腦屏障)轉移的轉運功能。
本發明的抗體及其抗原結合片段還包括單鏈抗體。單鏈抗體係重鏈和輕鏈Fv域被連接的肽。在一個實施方式中，本發明提供了單鏈Fv(scFv)，其中本發明的抗分揀蛋白抗體的Fv中的重鏈和輕鏈由柔性肽接頭(典型地為約10、12、15或更多個胺基酸殘基)連接成單條肽鏈。產生此類抗體的方法描述於例如US 4,946,778；普拉克圖恩(Pluckthun)，在單株抗體藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，羅森伯格(Rosenburg)和莫耳(Moore)編輯，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，紐約，第269-315頁(1994)；伯德(Bird)等人，科學(Science)242，423-426(1988)；休斯頓(Huston)等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和麥卡弗蒂(McCafferty)等人，自然(Nature)348，552-554(1990)。單鏈抗體可以是單價的，如果僅使用單個VH和VL的話；可以是二價的，如果使用兩個VH和VL的話；或可以是多價的，如果使用兩個以上VH和VL的話。
可以藉由包含任何適合數目的經修飾的胺基酸和/或與此類 偶聯取代基締合來修飾在此描述的抗體及其抗原結合片段。在此背景下適合性通常由至少基本上保留與非衍生化親本抗分揀蛋白抗體相關的分揀蛋白選擇性和/或分揀蛋白特異性的能力決定。一個或多個經修飾的胺基酸的包含在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽儲存穩定性中可以是有利的。對一種或多種胺基酸進行修飾，例如，在重組產生的過程中與翻譯同時進行或在翻譯之後進行(例如，在哺乳動物細胞中表現過程中在N-X-S/T基序上的N-連接的糖基化作用)，或藉由合成手段進行修飾。經修飾的胺基酸的非限制性實例包括糖基化的胺基酸、硫酸化的胺基酸、異戊二烯化(例如，法尼基化(farnesylated)、香葉基-香葉基化(geranyl-geranylated))的胺基酸、乙醯化的胺基酸、醯化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、羧基化的胺基酸、磷酸化的胺基酸等。足夠指導熟習該項技術者進行胺基酸修飾的參考文獻在文獻中相當充分。示例性方案見於沃克(Walker)(1998)唯讀型光碟蛋白質指南(Protein Protocols On CD-Rom)，胡馬納出版社(Humana Press)，托托華(Totowa)，新澤西州。經修飾的胺基酸可以例如選自糖基化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、法尼基化的胺基酸、乙醯化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、偶聯到脂質部分的胺基酸或偶聯到有機衍化劑的胺基酸。
本發明的抗體及其抗原結合片段還可以藉由共價偶聯到聚合物而化學地修飾，以例如增加其循環半衰期。示例性聚合物以及將它們附接到肽的方法說明於例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的說明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在約1,000與約40,000之間，如在約2,000與約20,000 之間，例如約3,000-12,000g/mol的PEG)。
本發明的抗體及其抗原結合片段可以進一步用在診斷方法中或用作診斷成像配位基。
在一個實施方式中，提供了本發明的包含一個或多個放射性標記的胺基酸的抗體及其抗原結合片段。放射性標記的抗分揀蛋白抗體可以用於診斷和治療兩種目的(偶聯到放射性標記的分子係另一可能特徵)。此類標記的非限制性實例包括但不限於鉍(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co、60Co)、銅(64Cu)、鏑(165Dy)、鉺(169Er)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、金(198Au)、鈥(166Ho)、氫(3H)、銦(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、銥(192Ir)、鐵(59Fe)、氪(81mKr)、鑭(140La)、鑥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鉀(42K)、鐠(142Pr)、鉕(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、銣(81Rb、82Rb)、釕(82Ru、97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鈉(24Na)、鍶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、鍀(99Tc)、鉈(201Tl)、錫(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb、177Yb)、釔(90Y)以及鋅(65Zn)。用於製備放射性標記的胺基酸和相關肽衍生物的方法在本領域是已知的(參見例如，榮漢斯(Junghans)等人，在癌症化療和生物療法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版，查弗尼爾(Chafner)和)隆哥(Longo)編輯，利平科特瑞文公司(Lippincott Raven)(1996))以及US 4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471和US 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺T方法進行偶聯(林德葛籣，S.(Lindegren,S.)等人(1998)“使用N-琥珀醯亞胺基-3-(三甲 基錫烷基)苯甲酸酯作為中間體的抗體的高比活放射性碘化中的氯胺-T(Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate)”，核醫學與生物學(Nucl.Med.Biol.)25(7)：659-665；庫爾特，M.(Kurth,M.)等人(1993)“放射性碘化的苯乙胺衍生物至單株抗體的位點特異性偶聯在腫瘤中產生增加的放射性(Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor)”，藥物化學雜誌(J.Med.Chem.)36(9)：1255-1261；雷亞，D.W.(Rea,D.W.)等人(1990)“用於靶向腫瘤的位點特異性放射性碘化的抗體(Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors)”，癌症研究(Cancer Res.)50(3增刊)：857s-861s)。
本發明還提供了使用以下項可檢測地標記的抗分揀蛋白抗體及其抗原結合片段：螢光標記(如稀土螯合物(例如，銪螯合物))、螢光素型標記(例如，螢光素、螢光素異硫氰酸酯、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素、二氯三基胺螢光素)、羅丹明(rhodamine)型標記(例如，ALEXA FLUOR® 568(英傑公司(Invitrogen))、TAMRA®或丹磺醯氯)、VIVOTAG 680XL FLUOROCHROMETM(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))、藻紅蛋白；傘形酮、麗絲胺；花菁；藻紅蛋白、德克薩斯紅、BODIPY FL-SE®(英傑公司)或其類似物，所有該等都適用於光學檢測。可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素和水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶合至可檢測物質(包括但不限於各種酶，酶包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)或 者偶合至輔基複合體(如但不限於鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素)來完成。
可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素和水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶合至可檢測物質(包括但不限於各種酶，酶包括但不限於辣根(horseradish)過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)或者偶合至輔基複合體(如但不限於鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素)來完成。還可以採用順磁性標記，並且較佳的是使用正電子發射斷層掃描攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層掃描攝影術(SPECT)進行檢測。這樣的順磁性標記包括但不限於含有鋁(Al)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、銥(Ir)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(M)、釹(Nd)、鋨(Os)、氧(O)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、銠(Rh)、釕(Ru)、釤(Sm)、鈉(Na)、鍶(Sr)、鋱(Tb)、銩(Tm)、錫(Sh)、鈦(Ti)、鎢(W)和鋯(Zi)並且特別是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3和V+4的順磁離子的化合物，使用各種正電子發射斷層掃描攝影術的正電子發射金屬以及非放射性順磁金屬離子。
因此，在一個實施方式中，可以用螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記來標記本發明的抗分揀蛋白抗體或其分揀蛋白結合片段。可以使用經標記的抗體或片段檢測或測量所述分揀蛋白在受試者的腦中的存在或量。這種方法可以包括結合到所述分揀蛋白的抗分揀蛋白抗體或分揀蛋白結合片段的體內成像的檢測或測量並且可以包括結合到這樣的分揀蛋白的所述抗分揀蛋白抗體或分揀蛋白結合片段 的離體成像。
在另外的方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其抗原結合域的一條或多條多肽鏈的表現載體。此類表現載體可以用於重組產生本發明的抗體和抗原結合片段。
在本發明的背景下，表現載體可以是任何適合的DNA或RNA載體，包括染色體載體、非染色體載體和合成核酸載體(包含一組適合的表現控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、杆狀病毒、酵母質粒、衍生自質粒與噬菌體DNA的組合的載體以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施方式中，編碼抗分揀蛋白抗體的核酸被包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如描述於例如賽克斯(Sykes)和約翰斯頓(Johnston)，自然生物技術(Nat Biotech)12，355-59(1997))、緊湊型核酸載體(如描述於例如US 6,077,835和/或WO 00/70087)、質粒載體(如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、“侏儒(midge)”最小尺寸的核酸載體(如描述於例如斯查考斯基(Schakowski)等人，分子治療學(MoI Ther)3，793-800(2001))，或作為沈澱型核酸載體構建體，如CaPO4沈澱型構建體(如描述於例如WO 00/46147；本威尼斯提(Benvenisty)和雷瑟夫(Reshef)，PNAS USA 83，9551-55(1986)；威格爾(Wigler)等人，細胞(Cell)14，725(1978)以及柯拉科(Coraro)和皮爾森(Pearson)，體細胞遺傳學(Somatic Cell Genetics)2，603(1981))。此類核酸載體及其使用在本領域是熟知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一個實施方式中，載體適用於在細菌細胞中表現抗分揀蛋 白抗體或其抗原結合片段。此類載體的實例包括以下表現載體，如BlueScript(Stratagene公司)、pIN載體(范 黑克(Van Heeke)&舒斯特(Schuster)，生物化學雜誌(J Biol Chem)264，5503-5509(1989))、pET載體(Novagen公司，麥迪森，威斯康辛州)等。
表現載體還可以是或可替代地是適用於在酵母系統中進行表現的載體。可以採用任何適用於在酵母系統中進行表現的載體。適合的載體包括例如包含組成型或誘導型啟動子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的載體(綜述於：F.奧蘇貝爾(F.Ausubel)等人編輯分子生物學實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版和威利國際科學(Greene Publishing and Wiley InterScience)紐約(1987)；格朗(Grant)等人，酶學方法(Methods in Enzymol)153，516-544(1987)；瑪塔諾維奇，D.(Mattanovich,D.)等人分子生物學方法(Methods Mol.Biol.)824，329-358(2012)；塞利克，E.(Celik,E.)等人生物技術進展(Biotechnol.Adv.)30(5)，1108-1118(2012)；李，P.(Li,P.)等人應用生物化學與生物技術(Appl.Biochem.Biotechnol.)142(2)，105-124(2007)；波爾，E.(Böer,E.)等人應用微生物學與生物技術(Appl.Microbiol.Biotechnol.)77(3)，513-523(2007)；範德法特，J.M.(van der Vaart,J.M.)分子生物學方法178，359-366(2002)和霍利格，P.(Holliger,P.)分子生物學方法178，349-357(2002))。
在本發明的表現載體中，編碼抗分揀蛋白抗體的核酸可以包含任何適合的啟動子、增強子和其他有助於表現的元件或者與其締合。此類元件的實例包括強表現型啟動子(例如，人CMV IE啟動子/增強子連同RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的聚(A)終止序列、 用於在大腸桿菌中產生質粒的複製起點、作為選擇性標記的抗生素抗性基因和/或便利的殖株位點(例如，多聚接頭)。核酸還可以包含與組成型啟動子(如CMV IE)相對的誘導型啟動子(熟習該項技術者應認識到此類術語實際上是在某些條件下的基因表現程度的描述語)。
在甚至另外的方面，本發明涉及重組真核或原核宿主細胞(如轉染瘤)，其產生如在此定義的本發明的抗體或其抗原結合片段或如在此定義的本發明的雙特異性分子。宿主細胞的實例包括酵母、細菌和哺乳動物細胞(如CHO或HEK細胞)。例如，在一個實施方式中，本發明提供了包含穩定地整合進細胞基因組中的核酸的細胞，該基因組包含編碼本發明的抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段的表現的序列。在另一個實施方式中，本發明提供了包含非整合型核酸(如質粒、粘粒、噬菌粒或線性表現元件)的細胞，該核酸包含編碼本發明的抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段的表現的序列。
在另外的方面，本發明涉及用於產生本發明的抗分揀蛋白抗體之方法，所述方法包括以下步驟：a)培養如在上文描述的本發明的融合瘤或宿主細胞，並且b)從培養基中純化本發明的抗體。
在一個實施方式中，本發明涉及一種製劑，如此術語在此使用的，該製劑包含如在此定義的抗分揀蛋白抗體，並且基本上不含天然產生的不能結合到分揀蛋白或不實質性地改變該製劑的抗分揀蛋白功能性的抗體。因此，這樣一種製劑不包括天然產生的血清或這樣的血清的經純化的衍生物，該製劑包含抗分揀蛋白抗體和另一種抗體的混合物，所述另一種抗體不改變該製劑的抗分揀蛋白抗體的功能性，其中這樣的功能性係： (i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力；增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力和/或(vi)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)和/或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的治療的能力。
本發明具體涉及在其胺基酸序列中(在任何其CDR、可變域、構架殘基和/或恒定域中)相對於天然存在的抗分揀蛋白抗體的結構具有結構改變的這樣一種抗分揀蛋白抗體的製劑，其中所述結構改變使得抗分揀蛋白抗體單株抗體相對於由所述天然存在的抗分揀蛋白抗體展現出的功能性展現出顯著改變的功能性(即，在功能性方面，差異超過20%、差異超過40%、差異超過60%、差異超過80%、差異超過100%、差異超過150%、差異超過2倍、差異超過4倍、差異超過5倍或差異超過10倍)；其中這樣的功能性係：(i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(vi)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力； (vii)增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力和/或(vi)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和/或阿茲海默症(AD)的治療的能力。
尤其是其中這樣改變的功能性係結構改變的結果並且因此與它不可分。
術語“基本不含”天然產生的抗體係指在此類製劑中完全不存在此類天然產生的抗體，或在此類製劑中包含不實質上影響該等製劑的分揀蛋白結合特性的濃度的此類天然產生的抗體。抗體被說成是“分離的”，如果它具有非天然產生的對應物或已經從天然伴隨它的組分中分離或純化出來的話。
當它涉及此類製劑時，術語“天然產生的抗體”係指作為活的人或其他動物的免疫系統發揮功能的自然結果在活的人或其他動物體內誘出的抗體(包括天然產生的自身抗體)。
因此，本發明的製劑不排除並且的確明確地包括含有抗分揀蛋白抗體和有意添加的另外的抗體的此類製劑，該另外的抗體能夠結合到不為分揀蛋白所具有的表位。此類製劑具體包括製劑在治療額顳癡呆(FTD)和/或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)中展現出增強的功效的其實施方式。
本發明的抗體或其抗原結合片段可以在不同細胞系中產生，如人細胞系、非人哺乳動物細胞系和昆蟲細胞系，例如CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系和HuH-7人細胞系 (杜蒙特(Dumont)等人，2015，生物技術評論性綜述(Crit Rev Biotechnol.)9月18日：1-13.，將其內容藉由引用包括在此)。
在甚至另外的方面，本發明涉及醫藥組成物，其包含：(i)抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段，兩者均如在此定義的，或包含這樣一種抗分揀蛋白抗體或其抗原結合片段的製劑，如此術語在此定義的；以及(ii)藥學上可接受的載體。
醫藥組成物可以用藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑根據常規技術配製，該等常規技術係如以下揭露的那些：雷明頓：藥學科學與實踐(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第22版，熱納羅(Gennaro)編輯，馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓，賓夕法尼亞州，2013。
藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑應該適合於本發明的所選化合物和所選給藥方式。基於就表位結合而言對本發明的所選化合物或醫藥組成物的所希望的生物特性的顯著不利影響的缺少(例如，小於實質性影響(10%或更少相對抑制、5%或更少相對抑制等))來確定醫藥組成物的載體和其他組分的適合性。
本發明的醫藥組成物還可以包含稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、洗滌劑(例如，非離子型洗滌劑，如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例如，糖或無蛋白胺基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑和/或適於包含在醫藥組成物中的其他材料。將稀釋劑選擇為不影響組合的生物活性。此類稀釋劑的實例為蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液和 漢克氏溶液。此外，醫藥組成物或配製物還可以包含其他載體，或無毒的、非治療性的、非免疫原性的穩定劑等。組成物還可以包含大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質、多糖(像殼聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳膠功能化的交聯瓊脂糖、瓊脂糖、纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物以及脂質聚集體(例如，油滴或脂質體)。
本發明醫藥組成物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得對於特定患者、組成物和給藥方式而言有效實現所希望的治療應答的活性成分量。所選的劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括所採用的本發明具體組成物或其醯胺的活性，給藥路徑，給藥時間，所採用的具體化合物的排泄速率，治療持續時間，與所採用的具體組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、病情、一般健康狀況和既往病史以及醫學領域熟知的類似因素。
醫藥組成物可以藉由任何適合的途徑和方式給予，包括：用於預防性和/或治療性治療的胃腸外、局部、口服或鼻內手段。在一個實施方式中，胃腸外地給予本發明的醫藥組成物。如在此使用的短語“胃腸外給藥(parenteral administration)”和“胃腸外地給藥(administered parenterally)”意指除腸內和局部給藥之外的給藥方式，通常是藉由注射，並且包括表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、真皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、椎管內、顱內、胸腔內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注。另外的適合的在體內和在體外給予本發明化合物的途徑在本領域是熟知的並且可以由熟習該項技術者進行選擇。在一個實施方式中，藉由靜脈內或皮下注射或輸注 給予該醫藥組成物。
藥學上可接受的載體包括任何和所有適合的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑和吸收延遲劑以及可與本發明的化合物生理上相容的類似物。
可以在本發明醫藥組成物中採用的適合的水性和非水性載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇、右旋糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(如橄欖油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油)、羧甲基纖維素膠體溶液、黃蓍膠和可注射有機酯(如油酸乙酯)和/或各種緩衝劑。其他載體在製藥領域是熟知的。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域是已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明醫藥組成物中的使用。
可以例如藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，藉由維持所需的粒度(在分散體的情況下)和藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。
本發明的醫藥組成物還可以包含藥學上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本發明的醫藥組成物還可以在組成物中包含等滲劑，如糖、 多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化鈉。
本發明的醫藥組成物還可以含有一種或多種適用於所選給藥途徑的佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩衝劑，該等試劑可以增強醫藥組成物的保質期或有效性。本發明的化合物可以與載體一起製備，該等載體可以保護化合物免於被快速釋放，如控釋配製物，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統。此類載體可以包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物相容聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸)(單獨的或與蠟一起)或本領域熟知的其他材料。用於製備此類配製物的方法通常是熟習該項技術者已知的。參見例如，緩釋和控釋遞藥系統(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.羅賓遜(J.R.Robinson)編輯，馬歇爾德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，紐約，1978。
在一個實施方式中，可以將本發明的化合物配製成確保在體內恰當分佈。用於胃腸外給藥的藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域是已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明醫藥組成物中的使用。還可以將補充活性化合物摻入組成物中。
注射用醫藥組成物通常在生產和保存條件下典型地必須是無菌且穩定的。可以將組成物配製為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度的其他有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射 有機酯(如油酸乙酯)的水性或非水性溶劑或分散介質。可以例如藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，藉由維持所需的粒度(在分散體的情況下)和藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，較佳的是在組成物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中包括延遲抗體吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現。無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與一種例如像上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和例如來自上文列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，這從其之前的無菌過濾溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉劑。
無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與一種上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和來自上文列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，這從其之前的無菌過濾溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉劑。
調整在以上治療方法和在此描述的使用中的劑量方案，以提供最佳期望應答(例如，治療應答)。例如，可以給予單次推注，可以隨時間給予若干分次劑量或者可以由治療情況的緊迫性所指示的按比例減少或 增加劑量。為了便於給藥和劑量統一，胃腸外組成物可以被配製為劑量單位形式。如在此使用的劑量單位形式係指作為針對待治療受試者的單一劑量適合的物理上離散的單位；每個單位含有經計算產生與所需藥物載體相關的所希望的治療效果的活性化合物的預定量。針對本發明的劑量單位形式的描述受指示於並且直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和待達到的具體治療效果，以及(b)在複合這樣的活性化合物以在個體中獲得靈敏治療的領域中固有的限制。
抗分揀蛋白抗體的有效劑量和劑量方案取決於待治療的疾病或病症並且可以由熟習該項技術者確定。本發明抗體的治療有效量的示例性、非限制性範圍係約0.1-10mg/kg體重，如約0.1-5mg/kg體重，例如約0.1-2mg/kg體重，如約0.1-1mg/kg體重，例如約0.15、約0.2、約0.5、約1、約1.5或約2mg/kg體重。
具有本領域普通技術的醫師或獸醫可以容易地確定並且開出所需醫藥組成物的有效量。例如，醫師或獸醫可以按低於為了達到所希望的治療效果所需的水平開始給予醫藥組成物中採用的抗分揀蛋白抗體，並且逐步增加劑量直至達到所希望的效果。通常，本發明組成物的適合日劑量將是有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。這樣一個有效劑量通常將取決於上述因素。給藥可以例如是靜脈內的、肌內的、腹膜內的或皮下的，或者例如臨近靶標位點給予。如果希望的話，醫藥組成物的有效日劑量可以在一整天以適當的時間間隔分開為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個子劑量來給予，視情況以單位劑型給予。雖然本發明的化合物可以單獨給予，但是較佳的是作為如上描述的醫藥組成物給予該化合物。
本發明的標記抗體或其抗原結合片段可以用於診斷目的，以檢測、診斷或監測疾病或障礙。本發明提供了神經退行性或認知疾病或障礙的檢測或診斷，所述神經退行性或認知疾病或障礙包括但不限於FTD、ALS或TDP43蛋白質病(如阿茲海默症(AD))，該檢測或診斷包括：(a)使用一種或多種特異性結合到分揀蛋白上的抗體測定受試者的細胞或組織樣品中的焦穀胺酸化A β片段的存在；並且(b)將抗原的水平與對照水平(例如，正常組織樣品中的水平)進行比較，由此相比於抗原的對照水平該抗原的測定水平的增加指示疾病或障礙，或指示疾病或障礙的嚴重性。
使用本領域熟知的免疫組織化學方法，本發明的抗體或其抗原結合片段可以用於測定生物樣品中的分揀蛋白或分揀蛋白抗原結合片段。有用於檢測蛋白質的其他基於抗體的方法包括免疫測定(如酶聯免疫測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA))以及基於中型發現平臺(mesoscale discovery platform)的測定(MSD)。適合的抗體標記可以用在此類套組和方法中，並且本領域已知的標記包括酶標記，如鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素標記，如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)和鍀(99mTc)；和發光標記，如魯米諾和螢光素酶；以及螢光標誌，如螢光素和羅丹明。
可以在體內檢測標記的抗分揀蛋白抗體或其分揀蛋白結合片段的存在，用於診斷目的。在一個實施方式中，診斷包括：a)向受試者給予有效量的這樣的標記分子；b)在給藥後等待一定時間間隔，以允許標記的分子在A β沈積位點(如果有的話)聚集並且以允許未結合的標記分子被清除至背景水平；c)測定背景水平；並且d)檢測受試者中的標記分 子，這樣使得在背景水平之上的標記分子的檢測指示該受試者患有該疾病或障礙，或指示該疾病或障礙的嚴重性。根據這樣的實施方式，用成像部分標記分子，該成像部分適於使用熟習該項技術者已知的具體成像系統進行檢測。背景水平可以藉由本領域已知的多種方法測定，包括將檢測到的標記抗體的量與先前針對具體成像系統測定的標準值進行比較。可以用於本發明診斷方法的方法和系統包括但不限於電腦斷層掃描攝影術(CT)、全身掃描如正電子發射斷層掃描攝影術(PET)、磁共振成像(MRI)以及超音波檢查。
在另外的方面，本發明涉及用於在醫學中使用的抗體或其抗原結合片段。
在另外的方面，本發明涉及用於在治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病中使用的本發明的抗體或其抗原結合片段。
在另外的方面，本發明涉及本發明的抗體或其抗原結合片段在生產用於治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的藥物中的用途。
在另外的方面，本發明涉及預防或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的方法，該方法包括給予有效劑量的本發明的抗體或其抗原結合片段。
較佳的是在本發明的那些方面的用途和方法中，該疾病係：FTD；ALS；或TDP43蛋白質病，如AD。
較佳的是，在本發明的那些方面的用途和方法中，治療係長期的，並且較佳的是持續至少2週，如至少持續1個月、6個月、1年或更 久。
在另外的方面，本發明提供了包含本發明的抗體或其抗原結合片段的套組。
在明顯在先公開的文獻的說明書中的清單或討論並不一定要視為承認該文獻係先前技術的一部分或是公知常識。
【具體實例】
如應從文本和實例顯而易見的，本發明進一步涉及以下實施方式：
1.一種抗體或其抗原結合片段，能夠特異性地結合到分揀蛋白並且抑制PGRN與分揀蛋白的結合。
2.根據實施方式1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含完整抗體或由其組成。
3.根據實施方式1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段包含選自下組的抗原結合片段或由其組成，該組由以下各項組成：Fv片段(例如單鏈Fv或二硫化物鍵合的Fv)；Fab樣片段(例如Fab片段或F(ab’)2片段)；以及結構域抗體(例如單個VH可變域或VL可變域)。
4.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自由以下各項組成之群組：亞型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗體。
5.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性地結合到如在SEQ ID NO：170中定義的分揀蛋白的D區。
6.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段特異性地結合到如在SEQ ID NO：170中定義的分揀蛋白的D區的至少3個連續胺基酸，如4、5、6或7個連續胺基酸。
7.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現出以下特性中的一種或多種：(i)在0.5-10nM(如1-5nM或1-2nM)之間的對分揀蛋白的結合親和 力(KD)(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力。
8.根據實施方式7所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段減少PGRN與分揀蛋白的結合的能力包括將PGRN與分揀蛋白的結合減少10%或更多；例如，20%或更多；或30%或更多。
9.根據實施方式7或8所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其片段減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白的結合的能力包括以或低於22nM，如在22nM與1nM之間、或在10nM與1nM之間、或在5nM與1nM之間的IC50減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白的結合。
10.根據任何以上實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是人的或是人源化的。
11.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的CDR 1-3輕鏈中的一條或多條，或具有不超過4個胺基酸差異、或不超過3個胺基酸差異、或不超過2個胺基酸差異、或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
12.根據實施方式11所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的CDR 1-3輕 鏈。
13.根據實施方式11或12所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的胺基酸序列VL或由其組成。
14.根據實施方式11至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈，該輕鏈包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的VL的胺基酸序列或由其組成。
15.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的一條或多條CDR 1-3重鏈，或具有不超過4個胺基酸差異、或不超過3個胺基酸差異、或不超過2個胺基酸差異、或不超過1個胺基酸差異的胺基酸序列。
16.根據實施方式15所述之抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的CDR 1-3重鏈。
17.根據實施方式15或16所述之抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的VH的胺基酸序列或由其組成。
18.根據實施方式15至17項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，包含重鏈，該重鏈包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的胺基酸序列VL或由其組成。
19.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈可變域以及重鏈可變域，該輕鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的 每者列出的VL的胺基酸序列或由其組成，該重鏈可變域包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的VH的胺基酸序列或由其組成。
20.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，包含輕鏈以及重鏈，該輕鏈包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的VL的胺基酸序列或由其組成，該重鏈包含如針對表5中所定義的抗體中的每者列出的VH的胺基酸序列或由其組成。
21.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與在實施方式20中所定義的抗體或其抗原結合片段競爭與分揀蛋白的結合。
22.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含Fc區。
23.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段進一步包含用於增加體內半衰期的部分。
24.根據實施方式22所述之抗體或其抗原結合片段，其中用於增加體內半衰期的該部分選自由以下各項組成之群組：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基團、脂肪酸以及葡聚糖。
25.根據任何前述實施方式所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段進一步包含可檢測部分。
26.根據實施方式25所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分選自由以下各項組成之群組：螢光標記；化學發光標記；順磁性標記；放射性同位素標記；或酶標記。
27.根據實施方式25或26所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可檢 測部分包含放射性同位素或由其組成。
28.根據實施方式26或27所述之抗體或其抗原結合片段，其中該放射性同位素選自由以下各項組成之群組：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I以及201Tl。
29.根據實施方式25所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分包含順磁性同位素或由其組成。
30.根據實施方式29所述之抗體或其抗原結合片段，其中該順磁性同位素選自由以下各項組成之群組：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr以及56Fe。
31.根據實施方式25至30項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分可藉由成像技術如SPECT、PET、MRI、光學或超音波成像檢測到。
32.根據實施方式25至31項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可檢測部分經由連接部分間接地連接到該抗體或其抗原結合片段。
33.根據實施方式32所述之抗體或其抗原結合片段，其中該連接部分選自由以下各項組成之群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10，四乙酸(DOTA)的衍生物；去鐵胺(DFO)；二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物；S-2-(4-異氰硫基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物；以及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
34.一種分離的核酸分子，編碼如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段。
35.根據實施方式34所述之核酸分子，其中該分子係cDNA分子。
36.一種載體，包含如在實施方式34或35中所定義的核酸分子。
37.一種重組宿主細胞，包含如在實施方式34-36的任一項中所定義的核酸分子。
38.一種用於產生如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或抗原結合片段的方法，該方法包括在允許表現所編碼的抗體或其抗原結合片段的條件下培養如在實施方式37中所定義的宿主細胞。
39.一種包含如以上申請專利範圍項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述製劑基本上不含天然產生的抗體，該等抗體不能結合到分揀蛋白或不實質上改變該製劑的抗分揀蛋白功能性，所述功能性選自由以下各項組成之群組：(i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力；和/或(vi)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)和/或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的治療的能力。
40.一種包含如以上申請專利範圍項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述單株抗體在其胺基酸序列中相對於天然存在的抗分揀蛋白抗體的結構具有結構改變，其中所述結構改變使得所述單株抗體相對於由所述天然存在的抗分揀蛋白抗體展現出的功能性展現出改變的功能性，其中所述功能性係： (i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力；和/或(vi)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)和/或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的治療的能力。
41.一種醫藥組成物，包含如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，或如實施方式39-40項中任一項所述之製劑，以及藥學上可接受的載體。
42.如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，或如實施方式39-40項中任一項所述之製劑，用於在醫學中使用。
43.如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，或如實施方式39-40項中任一項所述之製劑，用於在預防和/或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病中使用。
44.如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，或如實施方式39-40項中任一項所述之製劑在生產用於預防和/或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的藥物中的用途。
45.根據實施方式43所述供使用的抗體或其抗原結合片段，或根據實施方式44所述的用途，其中該疾病選自由以下各項組成之群組：FTD；ALS；TDP43蛋白質病，如AD。
46.一種預防或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病之方法，該方法包括給予有效劑量的如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其片段、如實施方式39-40項中任一項所述之製劑、或如實施方式41所述的醫藥組成物。
47.根據實施方式43所述供使用的抗體或其抗原結合片段，或根據實施方式44所述之用途，或根據實施方式46所述的方法，其中該疾病選自由以下各項組成之群組：FTD；ALS；或TDP43蛋白質病，如AD。
48.根據實施方式46或47所述的供使用的抗體或其抗原結合片段；或用途；或方法，其中該治療係長期的。
49.根據實施方式48所述的供使用的抗體或其抗原結合片段；或用途；或方法，其中該長期治療持續至少2週，如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
50.如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，如實施方式39-40項中任一項所述之製劑，或如實施方式41所述的醫藥組成物，其能夠特異性地結合到分揀蛋白並且抑制PGRN與分揀蛋白的結合，但是不抑制或基本上不抑制神經降壓素或AF38469與分揀蛋白的結合。
51.一種套組，包含如在實施方式1-33的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段、如在實施方式39-40的任一項中所定義的製劑、或如在實施方式41中所定義的醫藥組成物。
現在將參照附圖描述採用本發明的某些方面的較佳的、非限制性實例。
【實例】
實例1-3描述了分揀蛋白構建體的產生
實例1揭露了改組構建體。實例2揭露了分揀蛋白構建體的表現。實例3揭露了分揀蛋白構建體的純化。
實例4-7描述了分揀蛋白抗體的產生
實例4揭露了免疫和融合瘤。實例5揭露了序列分析。實例6揭露了抗體的純化。實例7揭露了小鼠抗體的產生。
實例8-17描述了分揀蛋白抗體的表徵
實例8揭露了與分揀蛋白的結合。實例9揭露了分揀蛋白抗體的交叉阻斷能力。實例10揭露了octet red PGRN結合。實例11揭露了HTRF PGRN-分揀蛋白結合。實例12揭露了NTS結合。實例13揭露了細胞PGRN結合和內吞。實例14揭露了細胞外PGRN水平。實例15揭露了iPSC PGRN水平。實例16揭露了物種反應性的FACS分析。實例17揭露了血漿PGRN測定。
實例1
用於在融合瘤篩選過程中使用和用作抗體組的多樣化兩者，設計、構建並且產生了所謂的‘改組構建體’，從而製備一組含有來源於人分揀蛋白和具有顯著降低的序列同源性的遠親物種(四齒魨屬)兩者的胺基酸序列的嵌合分揀蛋白分子。基本原理係該等嵌合構建體的整體分揀蛋白結構和功能性將被保留，但是抗體與某些嵌合構建體的結合損失將指示在結合中涉及特定交換區域。將可溶性胞外區(ECD，aa 1-755)構建體用BAP標籤(生物素受體肽)(使得能夠藉由共表現生物素連接酶而進行蛋白質的“體外”生物素醯化)或His標籤(使得能夠容易地純化)進行 標記。製備編碼以下蛋白質的表現載體：SORT-ECDBAP、SORT-ECDBAP-hB01-05、SORT-ECDBAP-hB06-10、SORT-ECDBAP-hB12390、SORT-ECDBAP-hB45678、SORT-ECDBAP-tetra、SORT、SORT-tetra。
分揀蛋白序列可以發現於SEQ ID NO：169-180中並且圖2示出了基於與分揀蛋白改組構建體的結合的抗體區域分配的示意性展示。
實例2
在抗體表現的情況下，在HEK-293F細胞中共表現適當的重鏈和輕鏈載體，如在實例4、5和6中描述的。
實例3：His標記的分揀蛋白的純化
在HEK-293F細胞中表現SORTECDHis。蛋白質中的His-標籤使得能夠藉由固定化金屬親和層析進行純化。在這種方法中，將NiNTA超流柱體(NiNTA Superflow Cartridge)(凱傑公司(Qiagen))用50mM NAH2PO4、300mM NaCl和10mM咪唑(pH 8.0)平衡。柱裝載有His標記的蛋白，其中停留時間為1分鐘。將柱用50mM NAH2PO4、300mM NaCl和20mM咪唑(pH 8.0)洗滌。將蛋白質用50mM NAH2PO4、300mM NaCl和250mM咪唑(pH 8.0)洗脫。隨後，將蛋白質使用截留為10.000 mwco的Slide-A-Lyzer(賽默科技公司(Thermo Scientific))用PBS透析。透析後，將蛋白質使用0.2微米SFCA過濾器(賽默科技公司)無菌過濾。
藉由用人野生型(WT)分揀蛋白表現載體轉染HEK293細胞來產生S18-HEK細胞系。在選擇劑的存在下傳代後得到穩定轉染的細胞。藉由稀釋複製選擇單獨的殖株。使用QPCR針對分揀蛋白mRNA表現對殖株進行表徵。然後使用抗分揀蛋白多株抗體(多株山羊分揀蛋白生物 素醯化的Ab，目錄號：BAF2934_(R&D系統公司(R&D Systems)))藉由FACS(Guava，密理博公司(Millipore))分析最高的表現殖株，以確定分揀蛋白的表面表現水平。
實例4
A-轉基因小鼠的免疫程序
抗體HuMab分揀蛋白來源於HuMAb小鼠品系HCo12、HCo17、Hco20、HCo12-BALB/c、HCo17-BALB/c和HCo20-BALB/c(人單株抗體；梅達瑞克斯公司(Medarex Inc.)，聖約瑟，加利福尼亞州，美國)的免疫。該等小鼠被雙敲除了小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈和小鼠κ輕鏈，這基本上使完全鼠類的抗體表現失活。藉由插入人Ig重鏈和人Ig κ輕鏈座位使得不同小鼠品系成為轉基因的並且區別在於人VH(重鏈的可變域)和VL(輕鏈的可變域)基因的數目。藉由用KCo5-BALB/c(κ輕鏈轉基因的)小鼠雜交繁育得到HCo12-BALB/c小鼠。
將48只小鼠用20μg SORTECDHis(SEQ ID NO：179)腹膜內地(IP)並且用相同蛋白皮下地(SC，在尾根處)交替免疫，間隔為14天。進行最多八次免疫，4次IP和4次SC。
在一個方案中，用完全弗氏佐劑(CFA；Difco實驗室(Difco Laboratories)，底特律，密西根州，美國)中的SORTECDHis進行第一次免疫，之後的免疫在不完全弗氏佐劑(IFA)中進行。第二方案在所有免疫步驟中使用SAS作為佐劑。當發現血清滴度足夠(針對至少兩個連續的、雙週的、篩選事件，在抗原特異性篩選測定中，發現1/50或更低的血清稀釋度呈陽性)時，在融合之前四天和三天，將小鼠另外用100μL PBS中的 10μg SORTECDHis蛋白靜脈內地(IV)強化兩次。
B-HuMab融合瘤-產生
將具有如上定義的足夠抗原特異性滴度發生的HuMAb小鼠處死並且收集腹主動脈與腔靜脈兩側的脾臟和淋巴結。基本上根據製造商的說明書，使用CEEF 50電融合系統(細胞脈衝科學(Cyto Pulse Sciences)，葛籣伯尼，馬里蘭州，美國)藉由電融合進行脾細胞和淋巴結細胞與小鼠骨髓瘤細胞系的融合。將融合的細胞接種在融合培養基中，該培養基含有10%Fetal Clone I牛血清(普達生物公司(Perbio))、1mM丙酮酸鈉(康伯司公司(Cambrex))、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素(康伯司公司)、50μM 2-巰基乙醇(英傑公司)、600ng/mL白介素6(IL-6)(施特拉特曼公司(Strathmann))、1 x HAT(西格瑪公司(Sigma))和0.5mg/mL卡那黴素(英傑公司)，在HyQ mADCF-Mab(普達生物公司)中。十天之後，收穫上清液並且將細胞培養基更換為收穫培養基，該收穫培養基含有10%Fetal Clone I牛血清、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素、600ng/mL IL-6和1 x proHT(康伯司公司)，在HyQ mADCF-Mab中。藉由初級篩選測定和偶合到SORTECDBAP(SEQ ID NO 171)、SORTECDBAPhB06-10(SEQ ID NO 176)、SORTECDBAPhB12390(SEQ ID NO 177)上的鏈黴親和素珠對融合瘤培養物上清液進行篩選，以檢測產生人(或嵌合)抗分揀蛋白抗體的融合瘤。將來自最佳初級孔的雜種瘤細胞接種於半固體培養基中，該培養基由40%殖株培養基(CloneMedia)(基因有限公司(Genetix)，漢普郡，英國)和60%HyQ 2x完全培養基(Hyclone公司，沃爾瑟姆，美國)製成。對於每個初級孔，接種Generix黑色6孔板的孔。使用ClonePix系統(基因有限公司)從 每個孔中挑取25個亞殖株。將亞殖株挑取在收穫培養基中。七天之後，針對分揀蛋白特異性人IgG結合再次對亞殖株上清液進行篩選並且使用Octet 384red(Fortebio公司，門洛派克，美國)測量人IgG濃度。從每個初級孔選擇最佳亞殖株並且在僅含有600ng/mL IL-6、0.5U/mL青黴素、0.5U/mL鏈黴素和1 x proHT的擴增培養基中進行擴增。將亞殖株從一個96孔板孔擴增到一個24孔板孔，到四個24孔板孔，到六個6孔板孔。藉由這種方法得到的殖株被指定為初級殖株(PC)。
對本發明的抗分揀蛋白HuMab抗體進行鑒定並且使其經受序列分析。
實例5：分揀蛋白特異性HuMab可變域的序列分析與表現載體中的複製
從0.2至5 x 106個融合瘤細胞製備總RNA並且根據製造商的說明書，使用SMART RACE cDNA擴增套組(克羅泰克公司(Clontech))從100ng總RNA製備5’-RACE-互補DNA(cDNA)。藉由PCR擴增VH和VL編碼區並且框內地直接在p33G1f和p33 κ表現載體(含有人IgG1./κ恒定域編碼序列)中藉由連接獨立複製進行複製(阿斯拉尼迪斯，C.(Aslanidis,C.)和P.J.德容(P.J.de Jong)，核酸研究(Nucleic Acids Res)1990；18(20)：6069-74)。對於每個抗體，對16個VL殖株和16個VH殖株進行測序。選擇具有正確開放閱讀框(ORF)的殖株進行進一步研究和表現。使用293fectin在FreestyleTM 293-F細胞中暫態共表現重鏈和輕鏈的所有組合的載體。
所得序列示於在此的序列表(SEQ ID NO：1-168)中。根據 公開的指南定義CDR序列(卡巴特(Kabat)等人(1992)免疫學關注的蛋白質序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL IN-TEREST)，美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)公開號91-3242)；(喬西亞，C.(Chothia,C.)等人(1987)“免疫球蛋白的超變區的典型結構(Ca-nonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins)”，分子生物學(J.Mol.Biol.)196：901-917)。
實例6：抗體的純化
將培養物上清液經0.2μm死端過濾器進行過濾，裝載在5mL蛋白A柱(rProtein A FF，阿莫仙生物科學公司(Amersham Bioscience))上並且用0.1M檸檬酸-NaOH(pH 3)洗脫。將洗脫物立即用2M Tris-HCl(pH 9)中和並且用12.6mM NaH2PO4、140mM NaCl，pH 7.4(貝朗公司(B.Braun))，O/N透析。透析之後，將樣品經0.2μm死端過濾器進行無菌過濾。藉由SDS-PAGE確定純度並且藉由比濁法和280nm處的吸光度測量濃度。將純化的抗體等分並且儲存在-80℃下。一旦解凍，便將純化的抗體等分部分保持在4℃下。進行質譜法，以鑒定由融合瘤表現的抗體重鏈和輕鏈的分子量。
實例7：小鼠抗體(1F2和5E1)的產生
免疫原
使用來自英傑公司的freestyle系統將編碼嵌合免疫原hSortilin-FC(來自SEQ ID NO：169的人分揀蛋白AA(78-756))和來自SEQ ID NO：169的人IgG1-FC AA(104-330)的合成基因複製進pcDNA3.1中並且用於表現。使用如上針對人抗體描述的抗體純化標準程序藉由蛋白-A親和層 析從細胞培養上清液中純化抗原。
融合瘤產生
將hSortilin-FC用作免疫原並且免疫5只BALB/c小鼠。選擇具有令人滿意的免疫應答的小鼠進行細胞融合和融合瘤產生。使用hSortilin-ECD作為包被抗原藉由ELISA篩選融合瘤上清液。產生了來源於九個親本殖株的總共十八個融合瘤細胞系。
表現
使融合瘤首先在完全生長培養基(具有10%FBS+抗生素的DMEM)中生長，並且隨後變為CDhybridoma培養基(英傑公司)用於表現實驗。
純化
根據供應商(GE醫療公司(GE healthcare))推薦的標準程序藉由蛋白-G交聯瓊脂糖從融合瘤細胞培養上清液中純化小鼠單株抗體。
實例8：分揀蛋白特異性HuMab和小鼠抗體對分揀蛋白的重組胞外區的親和力
使用Octet 384RED(Fortebio公司，門洛派克，美國)確定抗分揀蛋白HuMab抗體對分揀蛋白的結合動力學。藉由稀釋於樣品稀釋劑(Fortebio公司，品號18-5028)中製備2μg/ml的HuMab溶液。將Prot A傳感蛋白(Fortebio公司，品號18-0004)用動力學緩衝液(PBS中的1：10樣品稀釋液)預濕至少600秒。隨後，將傳感蛋白用HuMab溶液固定600秒。藉由在動力學緩衝液中浸漬120秒獲得基線應答。在1000秒培養期間進行SORTECD構建體的締合。這之後在動力學緩衝液中解離100秒。解離之後， 使傳感蛋白再生(10mM甘胺酸pH 1.0)並且中和(動力學緩衝液)3次，每次持續5秒。使用四個濃度的SORTECD構建體(10、5、2.5和1.25μg/ml)分析所有HuMab。將76.8kDA的分子量用於SORTECDHis。將數據使用全球全擬合(global full fit)用ForteBio分析6.4軟體進行擬合。結果示於圖3和圖4中。
實例9：抗分揀蛋白HuMab的抗體交叉阻斷
使用Octet 384RED(Fortebio公司，門洛派克，美國)進行抗體交叉阻斷研究。藉由稀釋於樣品稀釋劑(Fortebio公司，品號18-5028)中製備2μg/ml的HuMab抗體溶液。將胺反應性傳感蛋白(Fortebio公司，品號18-0008)用於HuMab的固定。在偶合至胺反應性傳感蛋白之前，將HuMab稀釋在MES pH 6.0緩衝液(18-5027)中。如下在30℃和1000rpm下進行偶合：將胺反應性傳感蛋白在PBS中預濕並且隨後用EDC/NHS(Fortebio公司，品號18-1033/18-1034)活化溶液(根據製造商的說明書)活化300秒。在600秒期間用HuMab固定活化的傳感蛋白。由於剩餘的胺與乙醇胺(Fortebio公司，目錄號18-1039)的反應性，將固定的傳感蛋白淬滅。淬滅之後，將傳感蛋白置於PBS中直到使用。在30℃和1000rpm下藉由建立基線應答開始交叉阻斷分析。藉由在樣品稀釋液中浸漬120秒獲得基線應答。在300秒期間進行SORTECDHis的締合，隨後直接進行HuMab的締合持續300秒。HuMab的締合之後，使傳感蛋白再生(10mM甘胺酸pH 1.0)並且中和(樣品稀釋液)3次，每次持續5秒。使用ForteBio分析6.4軟體處理數據。
基於它們在不同分揀蛋白改組構建體上的結合譜將抗體分 組(圖2，圖3和圖4)。為了證實來自區D(和區F)的所有抗體都結合到人野生型分揀蛋白ECD的同一區域，使用Octet384 red在交叉阻斷研究中表徵它們阻斷彼此與野生型人分揀蛋白ECD的結合的能力。例如，當測試來自同一區域的抗體時，一級抗體將阻斷二級抗體的結合，反之亦然。然而，當測試來自從不同區域的抗體時，將不會存在交叉阻斷，因為僅有一個區域被該一級抗體阻斷並且其餘的區域可供二級抗體結合使用。圖7顯示所有D-區和D+抗體都交叉阻斷彼此，這證實了將抗體基於改組構建體分類到區D和D+。另外，該等數據還證實嵌合分揀蛋白構建體保留與天然人野生型分揀蛋白ECD的相似性。
實例10：在抗分揀蛋白抗體的存在下分揀蛋白-PGRN配位基結合的表徵。
藉由使用均相時間分辨螢光(HTRF，CisBio公司)測定測量結合到分揀蛋白的PGRN的位移來確定抗體的IC50值，參見圖5和圖6。
在葛萊娜(Greiner)384孔、白色、低體積微量滴定板(784075，葛萊娜公司)中，在總體積為20μl的測定緩衝液(50mM磷酸鹽(pH 7.0)、0.1%BSA)中進行實驗。
在添加稀釋於偶聯緩衝液(50mM磷酸鹽(pH 7.0)、0.8mM KF，0.1%BSA)中的7nM抗6HIS-d2和0.7nM抗PGRN-Eu穴合物(Cisbio公司)之前，將抗體在室溫下與50nM HIS標記的分揀蛋白ECD和4nM PGRN(SULU20110924)預培養15min。將20μM神經降壓素用作陽性對照並且將緩衝液中的DMSO用作陰性對照。
在將板在EnVision讀取器(珀金埃爾默公司)中讀取之前， 將測定板在室溫下培養60min並且在4℃下培養過夜。
將未標記的神經降壓素和DMSO空白分別用作測定建立的陽性對照和陰性對照。用在1μM與50pM之間的十個濃度在3倍稀釋曲線中進行抗體的劑量應答評估。
藉由在XLfit 4(IDBS，英國)中使用S形濃度應答(可變斜率)進行非線性回歸來計算半最大抑制濃度(IC50)。(圖5和圖6)。
實例11：在抗分揀蛋白抗體的存在下分揀蛋白-神經降壓素結合的表徵
使用閃爍親近測定法(SPA)藉由測量結合到分揀蛋白的3H-神經降壓素的位移確定分揀蛋白特異性化合物AF38469(施羅德(Schrder)等人，生物有機化學與藥物化學快報(Bioorg Med Chem Lett.)2014年1月1日；24(1)：177-80，2014)的IC50。
在384孔白色不透明Optiplate(6007299，珀金埃爾默公司)中，在總體積為40μl的測定緩衝液(50mM HEPES(pH 7.4)、100mM NaCl、2mM CaCl2、0.1%BSA、0.1%Tween-20)中進行實驗。
在將蛋白溶液添加至含有濃度系列50μM至2.5nM的AF38469的孔中之前，將150nM HIS標記的分揀蛋白在室溫下與或不與1μM分揀蛋白特異性抗體(IgG1-6003-045或IgG1-6003-068)或與人IgG1同種型對照預培養15min。在添加5nM 3H-神經降壓素和Ni-螯合物成像珠(RPNQ0266，珀金埃爾默公司)之前，將混合物在搖床上在室溫下培養15min。將測定在相同條件下再培養60min。
6h之後，將板在ViewLux(360s曝光時間)上讀取。將未 標記的神經降壓素和DMSO空白分別用作陽性對照和陰性對照。
用在50μM與2.5nM之間的十個濃度在3倍稀釋曲線中進行AF38469的劑量應答評估。藉由在XLfit 4(IDBS，英國)中使用S形濃度應答(可變斜率)進行非線性回歸來計算半最大抑制濃度(IC50)。結果可以見於圖8中。
實例12：在抗分揀蛋白抗體的存在下分揀蛋白-PGRN配位基在細胞表面上的結合的表徵。
在這個測定中使用分揀蛋白暫態轉染的細胞和穩定細胞系S18-HEK細胞(過表現人分揀蛋白的HEK細胞)兩者。將細胞胰酶消化並且以每孔42,000個細胞的密度在96孔板中鋪板。在暫態轉染的細胞的情況下，在轉染後將細胞在96孔板中鋪板24hr。第二天，完全換掉培養基並且將稀釋於培養基中的測試化合物添加至細胞中持續30min，隨後添加PGRN持續4hr。在研究結束時(4.5hr後)，將細胞固定並且針對PGRN進行染色。藉由Cellomics陣列掃描(賽默飛世爾公司(Thermo Fischer))分析所有染色板並且將PGRN/細胞/孔的平均染色強度用於分析。
在HEK 293細胞中瞬間轉染PGRN表現質粒之後，從培養基中收穫在測定中使用的PGRN。使用PGRN ELISA套組(R&D)測量PGRN水平。
添加至細胞中的PGRN被容易地結合並且內吞，這使得分揀蛋白轉染的孔中的螢光信號增加。神經降壓素的添加阻止分揀蛋白與PGRN結合，並且PGRN螢光強度類似於對照水平，指示PGRN在神經降壓素的存在下未被結合和內吞。
兩種分揀蛋白HumAb(45和68)以類似於神經降壓素的效力阻斷PGRN的吸收。同種型對照抗體B12對PGRN內吞或結合沒有任何影響。結果可以見於圖9中。
實例13：抗體對細胞外PGRN水平的影響
發現HEK293細胞和S18-HEK細胞在沒有任何刺激的情況下將PGRN連續地分泌進培養基中。
將抗體和對照劑添加至S18-HEK細胞中，以評估對PGRN的影響。向S18-HEK細胞中添加神經降壓素(已知肽分揀蛋白配位基)或人抗體45、68和811使得細胞培養基中的PGRN增加。兩種分揀蛋白人抗體(45和68)具有與神經降壓素類似的影響，將PGRN水平分別提高到202%和201%。與對照B12相比，抗體811將培養基中的PGRN增加到146%，將同種型對照抗體在我們所有的研究中用作陰性對照並且對PGRN水平沒有顯示出任何影響。該等觀察指示測試的分揀蛋白抗體抑制分揀蛋白介導的PGRN內化，由此增加細胞外PGRN。
在第1天，將S18-HEK細胞接種在96孔板中。24hr之後，將培養基完全換為單獨的培養基(對照)或補充有測試化合物的培養基。除非另外指明，否則在10uM下測試所有化合物並且在100nM下測試抗體。在第3天收集培養基並且使用PGRN ELISA(R&D)進行分析。藉由Cell TitcrGlo(普洛麥格公司(Pro Mega))評估細胞活力，以評價化合物的細胞毒效應。藉由ELISA分析培養基中的PGRN水平並且將值用對照孔進行歸一化。結果可以見於圖10中。
實例14：iPSC中的細胞外PGRN的ELISA測定
如在其他地方描述的(拉斯馬森(Rasmussen)等人，乾細胞報告(Stem Cell Reports).2014年9月9日；3(3)：404-13)，藉由人成纖維細胞(正常的人真皮成纖維細胞，18歲男性；龍沙公司(Lonza))的非整合重程式設計產生誘導多能乾細胞(iPSC)。將NHDF K1_shp53系用於該等研究。首先在mTESR培養基中產生iPSC並且隨後在Pluripro(細胞指導系統公司(Cell Guidance System))中以單層進行培養。藉由將細胞在聚-L-鳥胺酸/層粘連蛋白包衣的培養皿中重新鋪板並且在具有500ng/mL頭髮生素和10μM SB431542的N3培養基(補充有0.5%N2、具有RA的1%B27、0,5mM GlutaMAX、0,5 & NEA、50μM 2-巰基乙醇和2.5mg/mL胰島素的50%DMEM/F12+50%Neurobasal培養基)中培養它們而在第0天啟動神經元分化。每天更換培養基。頭髮生素/SB431542誘導11天之後，將細胞用分散酶分散並且在N3培養基中的聚-L-鳥胺酸/層粘連蛋白中重新鋪板。從此今後，每2-3天更換N3培養基並且大約每10-14天使用accutase分散細胞。
將神經元分化的iPSC細胞鋪在96孔板中。一週後，將抗體添加至細胞中。在48hr或96hr時收集來自細胞的培養基並且藉由人PGRN ELISA(恩佐生命科學公司)進行分析並且按照製造商的說明書對樣品進行分析。
測試的分揀蛋白人抗體(45和68)在第48hr和96hr時以不同的水平增加PGRN水平。B12和抗Hel係對照同種型抗體(陰性對照)。數據呈現為平均值±SD。藉由單因素方差分析，隨後是鄧奈特分析對數據進行分析*p<0.05；**p<0.01。結果可以見於圖12中。
實例15
為了分析抗體對血漿中PGRN水平的影響，藉由皮下注射向人源化分揀蛋白KI小鼠給予單次或多次分揀蛋白抗體或同種型對照注射(10mg/kg)。在給藥後不同時間點將動物麻醉並且處死，並且藉由ELISA確定血漿PGRN水平。
A.時程研究：將小鼠用抗體(分揀蛋白humab或對照ab)處理並且在不同時間點將其處死。用對照抗體(抗Hel)處理的小鼠沒有顯示出血漿PGRN變化，而在用分揀蛋白humab 45處理的小鼠中，PGRN水平係增加的，它似乎在24與48hr之間達到峰值並且然後從第4天左右逐漸降低。PGRN水平在第7天仍是升高的。
B.亞慢性研究：基於來自時程研究的數據，向分揀蛋白KI小鼠每週皮下地給予兩次10mg/kg的分揀蛋白人抗體45或同種型對照抗體，以便維持穩定的抗體水平持續亞慢性研究(4週)。在研究開始時並且每週收集血液樣品，以密切注意血漿PGRN變化。在兩組動物中研究開始時的血漿PGRN水平係相似的。從第1週在用分揀蛋白抗體45處理的小鼠中看到較高水平的血漿PGRN並且在整個研究中仍然是升高的。用對照ab處理的小鼠沒有顯示出任何血漿PGRN增加並且保持在基線水平(第0週)。
C.劑量應答研究：注射不同劑量(4個劑量：10、2、0.4和0.1mg/kg)的分揀蛋白(45)和對照抗體(抗Hel)並且在第2天將小鼠處死。在用分揀蛋白humab處理的小鼠中在10mg/kg和2mg/kg情況下血漿PGRN係升高的，並且更低的劑量對血漿PGRN沒有影響，這清楚地顯示了分揀蛋白抗體對血漿PGRN水平的劑量依賴性效應。用對照抗體處理的小鼠沒有顯示出任何PGRN水平變化。
將小鼠用0,4ml阿佛丁腹膜內地麻醉，並且收集心臟血並且轉移到500ul kEDTA小瓶中。將樣品保持在冰上，直到在4℃以3600G離心15min。將血漿移液到micronic小瓶中並且冷凍於-20℃下。按照製造商的說明書使用PGRN ELISA套組(Adipogen公司)測量樣品中的PGRN。結果可以見於圖13中。
實例16：藉由氫/氘交換隨後藉由質譜法對靶向顆粒蛋白先質-分揀蛋白相互作用的抗體進行表位作圖
在氫/氘交換，隨後是質譜法(HDX-MS)中，測量蛋白質中的骨架醯胺氫的交換速率。由此，有可能探測到整個蛋白質骨架的構象動力學，除了在脯胺酸殘基處之外。交換反應的速率由骨架醯胺的氫鍵合狀態並且在較小程度上由其溶劑可及性決定。可以觀察到作為氘摻入變化的例如由配位基的存在引起的這兩個參數的微妙變化。
為了對氘摻入變化進行亞定位，將蛋白質用酸穩定蛋白酶(例如胃蛋白酶)處理，這產生典型地為十至十五個胺基酸的局部區域。在配位基的存在下顯示出擾動的區域直接牽涉在結合介面中或者別構性地受結合事件的影響。
抗體的表位作圖
在不存在和存在mAb45、mAb68、mAb811和命名為mAb30的抗體(其不結合到D區)的情況下測量分揀蛋白的胞外區(SEQ ID NO：188)的氘摻入。為了保證在穩態條件下進行測量，在啟動交換反應之前，使複合物在25℃下平衡15min。藉由將蛋白樣品1：9(v/v)地稀釋到氘化的緩衝液(99%D2O、20mM tris、150mM NaCl，pDread=7.6)中啟動交換反應。 在不同時間點(15s、1min、10min、1h和8h)之後，藉由用冰冷的淬滅緩衝液(2M甘胺酸、0.8M三-(2-羧乙基)膦(TCEP)，pH=2.3)1：1(v/v)地稀釋將交換反應淬滅，由此使pH降至2.46。立即將淬滅的樣品置於-80℃冷凍箱中並且儲存直到分析。藉由將分揀蛋白樣品1：9(v/v)地稀釋到氘化的變性緩衝液(6M鹽酸胍、99%D20、20mM tris、150mM NaCl，pDread=7.6)中，隨後在25℃下培養16h來製備完全氘化的對照樣品，之後如上所述的將它們淬滅並處理。
將淬滅的樣品解凍並且注入配備有家庭裝胃蛋白酶柱(60μL的內體積，獲得自賽默科技公司(Thermo Scientific Inc.)的胃蛋白酶珠)的冷卻(0℃)反相UPLC-HDX系統(沃特斯公司(Waters Inc.)，美國)中。這裡，使氘化的蛋白樣品在20℃下經受線上胃蛋白酶消化，並且藉由反相UPLC分離所得胃酶解肽。在最終的質量測定之前，將肽藉由電灑離子化電離到質譜儀(Synapt G2質譜儀，沃特斯公司，英國)中，在該質譜儀中肽藉由離子遷移被進一步分離。
使用數據獨立(MSe)和數據依賴採集的組合藉由串聯質譜法在完全還原且非氘化的樣品上進行肽的鑒定。
數據分析
肽的鑒定
將採集的質譜針對GFP進行鎖定質量校正並且在PLGS 3.0中進行分析，其將先質和片段離子匹配到本地蛋白質數據庫中。手動地謹慎評估所有肽鑒定。
氘摻入的確定：將採集的質譜針對GFP進行鎖定質量校正 並且使用軟體DynamX 3.0(沃特斯公司，美國)來確定在不存在或存在抗體的情況下分揀蛋白的所有肽的氘摻入。
肽被認為係結合表位的一部分，如果在抗體的存在下觀察到保護免於交換大於0.5D的話。
實例17：用於評估清醒的自由活動動物的腦中顆粒蛋白先質水平的微透析
使用推拉式微透析方法評估來自清醒且自由活動的小鼠的腦ISF顆粒蛋白先質(PRGN)。將小鼠在受控的溫度(22±1.5℃)和濕度條件(55%-65%)下單獨飼養並且保持12：12小時光/暗循環(在06：00h時開燈)。食物和水可隨意獲得。在人分揀蛋白敲入(hSORT1)小鼠(22週齡)的海馬迴中進行本研究。為了使得能夠在海馬迴中進行微透析，將小鼠用異氟烷麻醉並且將腦內引導套管(CMA)立體定向地植入腦中，從而根據大鼠腦立體定位圖譜集(the atlas of Paxinos and Franklin 2001)將微透析探針定位在海馬迴中(探針尖的座標：前囟後面3.1mm並且前囟側面2.8mm，並且相對於硬腦膜1.3mm)。將丙烯酸粘固劑用於固定引導套管。植入套管之後，在透析之前允許小鼠從手術中恢復7天。在前5天(包括手術當天)，動物具有痛感並且接受抗生素處理(力莫敵(Rimadyl)和Noromox Prolongatum)。在微透析實驗開始之前24h，還將泵連接到出口管，以便防止藉由拉動流體穿過管時灌注液從探針中丟失。作為灌注緩衝液，在使用當天將25%牛白蛋白餾分V(西格瑪公司)用人工CSF(aCSF；以mM計：147 NaCl、2.7 KCl、1.2 CaCl2、0.85 MgCl2)稀釋至0.2%並且通過0.1-μm膜過濾。在不連接探針的情況下確定泵的實際流速。在取樣前後對樣品管進行稱重持續給定時間段並且計算流速。然後將泵設置為具有1μL/min的恒流。貫穿實驗期使用120-min取樣方案並且收集12個樣品(收集12h)(圖17，關於程序)。在實驗結束時，從動物取血，灌注動物並且收集腦。將透析液、血漿和腦儲存在-80℃下，直到藉由ELISA測定PRGN。
在24h期間每2h的PRGN水平測量值描繪於圖17中。在每個時間段，除了開始收集透析液之後24h，當與來自用PBS處理的動物的PRGN水平相比時，在用mab #45處理的動物中PRGN水平係顯著增加的(圖18a)。從將探針插入海馬迴之後4h直到16h，PRGN水平隨時間是穩定的。在第一透析液中，PRGN係升高的，可能是由於將探針插入了海馬迴。據推測在探針插入後18h/20h，PRGN水平正在降低，可能是由於探針膜的堵塞，因為它發生在兩組中(並且先前已經在其他推拉式研究觀察到)。
將針對每個動物並且然後是合併的所有動物的在抗體或載體處理之後24h的12個透析樣品的平均值±SEM視為基線(圖18b)。藉由非配對t檢驗分析用mab #45和PBS處理的動物之間的差異。當與來自用PBS處理的動物的PRGN基礎水平相比時，在用mab#45處理的動物中PRGN基礎水平係顯著增加的(p<0.001，F10.0，DFn，9 Dfd 7；3.3±0.3ng/ml，n=10對比1.1±0.1ng/ml，n=8)(圖18b)。
<110> H‧朗德貝克公司(H.Lundbeck A/S)
<120> 分揀蛋白D區抗體
<130> 0993
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<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工
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<213> 人工
<220>
<223> 566-01 CDR3重鏈
<400> 118
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 566-01 VL
<400> 119
<210> 120
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 566-01 VH
<400> 120
<210> 121
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR1輕鏈
<400> 121
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR2輕鏈
<400> 122
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR3輕鏈
<400> 123
<210> 124
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR1重鏈
<400> 124
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR2重鏈
<400> 125
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 CDR3重鏈
<400> 126
<210> 127
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 VL
<400> 127
<210> 128
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 562 VH
<400> 128
<210> 129
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR1輕鏈
<400> 129
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR2輕鏈
<400> 130
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR3輕鏈
<400> 131
<210> 132
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR1重鏈
<400> 132
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR2重鏈
<400> 133
<210> 134
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 CDR3重鏈
<400> 134
<210> 135
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 VL
<400> 135
<210> 136
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 193 VH
<400> 136
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR1輕鏈
<400> 137
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR2輕鏈
<400> 138
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR3輕鏈
<400> 139
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR1重鏈
<400> 140
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR2重鏈
<400> 141
<210> 142
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 CDR3重鏈
<400> 142
<210> 143
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 VL
<400> 143
<210> 144
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 88 VH
<400> 144
<210> 145
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR1輕鏈
<400> 145
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR2輕鏈
<400> 146
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR3輕鏈
<400> 147
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR1重鏈
<400> 148
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR2重鏈
<400> 149
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 CDR3重鏈
<400> 150
<210> 151
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 VL
<400> 151
<210> 152
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 045 VH
<400> 152
<210> 153
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR1輕鏈
<400> 153
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR2輕鏈
<400> 154
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR3輕鏈
<400> 155
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR1重鏈
<400> 156
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR2重鏈
<400> 157
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 CDR3重鏈
<400> 158
<210> 159
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 VL
<400> 159
<210> 160
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 044 VH
<400> 160
<210> 161
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR1輕鏈
<400> 161
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR2輕鏈
<400> 162
<210> 163
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR3輕鏈
<400> 163
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR1重鏈
<400> 164
<210> 165
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR2重鏈
<400> 165
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 CDR3重鏈
<400> 166
<210> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 VL
<400> 167
<210> 168
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 002 VH
<400> 168
<210> 169
<211> 831
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 全人分揀蛋白序列同种型1
<400> 169
<210> 170
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 如由本发明鉴定的“D區”
<400> 170
<210> 171
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白hSORTECDBAP
<400> 171
<210> 172
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hBACK
<400> 172
<210> 173
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_tetra
<400> 173
<210> 174
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hB01-05
<400> 174
<210> 175
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hRIM
<400> 175
<210> 176
<211> 699
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hB06-10
<400> 176
<210> 177
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hB12390
<400> 177
<210> 178
<211> 700
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECDBAP_hB45678
<400> 178
<210> 179
<211> 763
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 分揀蛋白SORTECD_HIS
<400> 179
<210> 180
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A區
<400> 180
<210> 181
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A區胺基酸109-114
<400> 181
<210> 182
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A區胺基酸126-153
<400> 182
<210> 183
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A區胺基酸126-144
<400> 183
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> A區胺基酸154-159
<400> 184
<210> 185
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D區胺基酸570-572
<400> 185
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D區胺基酸588-597
<400> 186
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> D區胺基酸593-597
<400> 187
<210> 188
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 用于HDX實驗的序列
<400> 188

Claims (109)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，能夠特異性地結合到分揀蛋白並且抑制或減少PGRN與分揀蛋白的結合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自由以下各項組成之群組：Fv片段(例如單鏈Fv或二硫化物鍵合的Fv)；Fab樣片段(例如Fab片段、Fab’片段或F(ab)2片段)；以及結構域抗體(例如單個VH可變域或VL可變域)。
  3. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含完整抗體或由其組成。
  4. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自由以下各項組成之群組：亞型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗體。
  5. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段結合到如在SEQ ID NO：170中定義的分揀蛋白的D區。
  6. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段結合到如在SEQ ID NO：185、186或187的任一項中定義的分揀蛋白的D區。
  7. 如申請專利範圍第5或6項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段另外結合到如在SEQ ID NO：180中定義的分揀蛋白的A區。
  8. 如申請專利範圍第5或6項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段另外結合到如在SEQ ID No 181、182、183或184 的任一項中定義的分揀蛋白的A區。
  9. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段結合到如在SEQ ID NO：170中定義的分揀蛋白的D區內的至少3個連續胺基酸，如4、5、6或7個連續胺基酸。
  10. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段展現出以下特性中的一種或多種：a.在0.5-10nM，如1-5nM或1-2nM之間的對分揀蛋白的結合親和力(KD)；b.減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；c.減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；d.減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；e.增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力，和/或f.增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力。
  11. 根據任何前述申請專利範圍第1-9項所述之抗體或其抗原結合片段，其中使用時間分辨螢光測定(HTFR)，該抗體或其抗原結合片段減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白的結合的能力的IC50小於50nM，但是較佳的是在10nM與0.2nM之間。
  12. 根據任何前述申請專利範圍第1-9項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白的結合的能力包括以或低於22nM，如在22nM與1nM之間、或在10nM與1nM之間、或在5nM與1nM之間的IC50減少和/或抑制PGRN與分 揀蛋白的結合。
  13. 如任何前述申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係人抗體、人源化抗體、重組抗體或嵌合抗體。
  14. 如任何以上申請專利範圍所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：1的輕鏈可變域L-CDR1；b.包含SEQ ID NO：2的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：3的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：4的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：5的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：6的重鏈可變域H-CDR 3。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：8。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：7。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第15和16項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  18. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：9的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：10的輕鏈可變域L-CDR 2； c.包含SEQ ID NO：11的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：12的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：13的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：14的重鏈可變域H-CDR 3。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：16。
  20. 如申請專利範圍第18項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：15。
  21. 如申請專利範圍第18項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第19和20項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  22. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：17的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：18的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：19的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：20的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：21的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：22的重鏈可變域H-CDR 3。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：24。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體 或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：23。
  25. 如申請專利範圍第22項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第23和24項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  26. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：25的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：26的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：27的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：28的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：29的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：30的重鏈可變域H-CDR 3。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：32。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：31。
  29. 如申請專利範圍第26項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第27和28項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  30. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：33的輕鏈可變域L-CDR 1； b.包含SEQ ID NO：34的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：35的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：36的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：37的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：38的重鏈可變域H-CDR 3。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：40。
  32. 如申請專利範圍第30項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：39。
  33. 如申請專利範圍第30項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第31和32項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  34. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：41的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：42的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：43的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：44的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：45的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：46的重鏈可變域H-CDR 3。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：48。
  36. 如申請專利範圍第34項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：47。
  37. 如申請專利範圍第34項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第35和36項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  38. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：49的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：50的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：51的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：52的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：53的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：54的重鏈可變域H-CDR 3。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：56。
  40. 如申請專利範圍第38項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：55。
  41. 如申請專利範圍第38項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第39和40項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  42. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： a.包含SEQ ID NO：57的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：58的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：59的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：60的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：61的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：62的重鏈可變域H-CDR 3。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：64。
  44. 如申請專利範圍第42項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：63。
  45. 如申請專利範圍第42項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第43和44項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  46. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：65的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：66的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：67的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：68的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：69的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：70的重鏈可變域H-CDR 3。
  47. 如申請專利範圍第46所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或 其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：72。
  48. 如申請專利範圍第46項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：71。
  49. 如申請專利範圍第46項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第47和48項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  50. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：73的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：74的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：75的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：76的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：77的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：78的重鏈可變域H-CDR 3。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：80。
  52. 如申請專利範圍第50項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：79。
  53. 如申請專利範圍第50項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第51和52項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  54. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：81的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：82的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：83的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：84的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：85的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：86的重鏈可變域H-CDR 3。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：88。
  56. 如申請專利範圍第54項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：87。
  57. 如申請專利範圍第54項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第55和56項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  58. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：89的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：90的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：91的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：92的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：93的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：94的重鏈可變域H-CDR 3。
  59. 如申請專利範圍第58項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：96。
  60. 如申請專利範圍第58項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：95。
  61. 如申請專利範圍第58項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第59和60項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  62. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：97的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：98的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：99的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：100的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：101的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：102的重鏈可變域H-CDR 3。
  63. 如申請專利範圍第62項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：104。
  64. 如申請專利範圍第62項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：103。
  65. 如申請專利範圍第62項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或 其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第63和64項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  66. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：105的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：106的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：107的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：108的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：109的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：110的重鏈可變域H-CDR 3。
  67. 如申請專利範圍第66項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：112。
  68. 如申請專利範圍第66項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：111。
  69. 如申請專利範圍第66項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第67和68項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  70. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：113的輕鏈可變域L-CDR 1； b.包含SEQ ID NO：114的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：115的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：116的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：117的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：118的重鏈可變域H-CDR 3。
  71. 如申請專利範圍第70項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：120。
  72. 如申請專利範圍第70項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：119。
  73. 如申請專利範圍第70項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第71和72項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  74. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：121的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：122的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：123的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：124的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：125的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：126的重鏈可變域H-CDR 3。
  75. 如申請專利範圍第74項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：128。
  76. 如申請專利範圍第74項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：127。
  77. 如申請專利範圍第74項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第75和76項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  78. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：129的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：130的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：131的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：132的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：133的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：134的重鏈可變域H-CDR 3。
  79. 如申請專利範圍第78項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：136。
  80. 如申請專利範圍第78項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：135。
  81. 如申請專利範圍第78項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第79和80項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  82. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：137的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：138的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：139的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：140的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：141的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：142的重鏈可變域H-CDR 3。
  83. 如申請專利範圍第82項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：144。
  84. 如申請專利範圍第82項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：143。
  85. 如申請專利範圍第82項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第83和84項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  86. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段， 其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：145的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：146的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：147的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：148的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：149的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：150的重鏈可變域H-CDR 3。
  87. 如申請專利範圍第86項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：152。
  88. 如申請專利範圍第86項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：151。
  89. 如申請專利範圍第86項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第87和88項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  90. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：153的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：154的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：155的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：156的重鏈可變域H-CDR 1； e.包含SEQ ID NO：157的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：158的重鏈可變域H-CDR 3。
  91. 如申請專利範圍第90項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：160。
  92. 如申請專利範圍第90項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：159。
  93. 如申請專利範圍第90項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第91和92項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  94. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：161的輕鏈可變域L-CDR 1；b.包含SEQ ID NO：162的輕鏈可變域L-CDR 2；c.包含SEQ ID NO：163的輕鏈可變域L-CDR 3；d.包含SEQ ID NO：164的重鏈可變域H-CDR 1；e.包含SEQ ID NO：165的重鏈可變域H-CDR 2；以及f.包含SEQ ID NO：166的重鏈可變域H-CDR 3。
  95. 如申請專利範圍第94項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQ ID NO：168。
  96. 如申請專利範圍第94項所述之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO：167。
  97. 如申請專利範圍第94項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含如在申請專利範圍第95和96項中所定義的重鏈可變域和輕鏈可變域兩者。
  98. 一種包含如以上申請專利範圍項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述製劑基本上不含天然產生的抗體，該等抗體不能結合到分揀蛋白或不實質上改變該製劑的抗分揀蛋白功能性，所述功能性選自由以下各項組成之群組：(i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力；(vi)增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力和/或(vii)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和/或阿茲海默症(AD)的治療的能力。
  99. 一種包含如以上申請專利範圍項中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段的製劑，其中所述單株抗體在其胺基酸序列中相對於天然存在的抗分揀蛋白抗體的結構具有結構改變，其中所述結構改變使得所述 單株抗體相對於由所述天然存在的抗分揀蛋白抗體展現出的功能性展現出改變的功能性，其中所述功能性係：(i)對分揀蛋白的結合親和力(KD)；(ii)減少和/或抑制PGRN與分揀蛋白結合的能力；(iii)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞清除PGRN的能力；(iv)減少和/或抑制表現分揀蛋白的細胞對PGRN的內吞的能力；(v)增加表現人分揀蛋白的敲入小鼠的血漿中的PGRN量和/或濃度的能力；(vi)增加腦中的PGRN量和/或濃度的能力，和/或(vii)當長期給予時，提供額顳癡呆(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和/或阿茲海默症(AD)的治療的能力。
  100. 一種醫藥組成物，包含如在申請專利範圍第1至97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑，以及藥學上可接受的載體。
  101. 一種用於在醫學中使用之如在申請專利範圍第1至97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑，或如申請專利範圍第100項所述之醫藥組成物。
  102. 一種用於在治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病中使用之如在申請專利範圍第1至97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑，或如申請專利範圍第100項所述之醫藥組成物。
  103. 一種如在申請專利範圍第1至97的任一項中所定義的抗體或其抗原結 合片段、或如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑、或如申請專利範圍第100項所述之醫藥組成物之用途，其係用於生產治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的藥物。
  104. 一種預防或治療與患者的腦中降低的PGRN水平相關的疾病的方法，該方法包括給予有效劑量的如在申請專利範圍第1-97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑、或如申請專利範圍第100項所述之醫藥組成物。
  105. 如申請專利範圍第102所述供使用的抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第103項所述之用途，或如申請專利範圍第104項所述之方法，其中該疾病係：FTD；ALS；或TDP43蛋白質病，如AD。
  106. 如申請專利範圍第102所述供使用的抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第103項所述之用途，或如申請專利範圍第104項所述之方法，其中該治療係長期的，並且較佳的是持續至少2週，如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
  107. 一種套組，包含如在申請專利範圍第1-97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第98-99項中任一項所述之製劑、或如申請專利範圍第100項所述之醫藥組成物。
  108. 如在申請專利範圍第1-97的任一項中所定義的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段已經在細胞系中產生或生產，該細胞系係如人細胞系、非人哺乳動物細胞系、昆蟲、酵母或細菌細胞系。
  109. 如申請專利範圍第108項所述之抗體或其抗原結合片段，在CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、 纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系以及HuH-7人細胞系中產生。
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