PT804070E - Isolamento de componentes de interesse a partir do leite. - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "ISOLAMENTO DE COMPONENTES DE INTERESSE A PARTIR DO LEITE"
Fundamentos do Invento
Devido à longa história da sua inclusão na dieta humana e à relativa facilidade com a qual eles podem ser isolados, componentes do leite que ocorrem naturalmente têm sido estudados há muitos anos. (Swisgood, H.E., Developments in Dairy Chemistry -I: Chemistry of Milk Protein, (Applied Science Publishers, NY, 1982)). Recentemente, alguns investigadores tiraram partido do leite como uma fonte conveniente de proteínas não produzidas normalmente no leite ao dirigirem a síntese de proteínas particulares de interesse para o tecido mamário de mamíferos transgénicos. Por exemplo, certos investigadores incorporaram um gene de combinação composto pela sequência reguladora a partir do gene β-lactoglubulina e a sequência codificadora para o gene do factor IX anti-hemofílico humano para a linhagem germinal do carneiro. (Clark, A.J. et al., (May 1989) Biotechnology 7: 487-492). As ovelhas transgénicas que produzem leite subsequentemente segregaram factor IX para o seu leite. De um modo semelhante, uma linhagem germinal de cabra foi submetida a engenharia genética a fim de incluir um gene de reunião contendo as sequências reguladoras a partir do gene para proteína acídica de leite coalhado murino ligado a sequencia codificadora para activador do plasminogénio do tipo tecidular de acção prolongada humano. (Ebert, K.M. et al., (September 1991) Biotechnology 9: 835-838). Leite de cabras transgénicas produtoras de leite continha o activador do plasminogénio tecidular modificado.
A produção de proteínas de interesse, tais como agentes terapêuticos, no leite de gado transgénico oferece a possibilidade de produção em larga escla dessas proteínas com uma redução concomitante dos custos que estão tipicamente associados à produção convencional de proteínas recombinantes complexas em sistemas de cultura de células de mamíferos. Embora a expressão transgénica de proteínas no leite apresente vantagens em relação a métodos mais tradicionais de expressão de proteína recombinante, ela também coloca vários desafios. Estes incluem a preservação da actividade da proteína recombinante no leite e a purificação da proteína até ao grau de pureza requerido para produção comercial praticável. Métodos tradicionais para isolamento de uma proteína de interesse a partir do leite frequentemente incluíam como um dos seus passos inciais o fraccionamento dos componentes major do leite quer por sedimentação (Swaisgood, H.E., Developments in Dairy Chemistry-I: Chemistry of Milk Protein, (Applied Science Publishers, NY, 1982), quer por precipitação (Kothe et al., U.S. Patent No. 4644056); Groves, M.L. et al., (1985) Biochem. et. Biophvs. Acta.. 844: 105-112; McKenzie, H.A., Milk Proteins: Chemistry and Molecular Biology, Academic Press, NY, 1971), 88) ou coagulação enzimática usando renina ou quimotripsina (Swaisgood, H.E., Developments in Daily Chemistiy-I: Chemistry of Milk Protein, (Applied Science Publishers, NY, 1982). Problemas associados a estes métodos incluem baixos rendimentos devido à perda da proteína de interesse devido a retenção no produto precipitado do componente do leite a ser removido e a perda de actividade biológica da proteína de interesse devido ao baixo pH frequentemente requerido para precipitação de ácido. Ver Denman, J. et al (Sept. 1991) Biotechnology 9: 839-843. Além disso, porque métodos tradicionais para o isolamento de proteínas de interesse a partir do leite ο envolviam a sedimentação, precipitação, ou coagulação dos componentes major do leite, as amostras de leite não foram rapidamente processáveis por filtração.
Pode também ser feita referência a um artigo com o título "Production of pharmaceutical proteins in milk" por Wilmut, I., et al, Experientia, 47, 905-912, (1991), e a EP-A-451823. O primeiro indica que proteínas podem ser produzidas no leite de animais transgénicos, mas é completamente silencioso no que se refere ao modo pelo qual essas proteínas podem ser purificadas com sucesso a partir do leite de animais transgénicos, enquanto que a última menciona a purificação de uma proteína, mas usa precipitação ácida da preparação. A técnica anterior não indica nem sugere que a adição de certos agentes estabilizádores/solubilizadores vá permtir purificação de uma proteína de interesse a partir do leite de animais transgénicos sem perda significativa dessa proteína.
Sumário do Invento
Numa apresentação, o presente invento proporciona um método de estabilização da solubilidade de uma porção da proteína de leite completo numa amostra de leite contendo uma proteína de interesse e facultativamente isolando a proteína de interesse a partir da amostra de leite caracterizado pelo facto de compreender: ajustamento facultativo do pH da amostra do leite contendo a proteína de interesse até um nível seleccionado de modo a que a proteína de interesse retenha a sua actividade biológica e se permita que a solubilidade de uma porção da proteína do leite completo estabilize; contacto da amostra de leite contendo a proteína de interesse com um agente de estabilização catiónico mono- ou polivalente em condições que -4- -4-
d Λ estabilizem a solubilidade de uma porção da proteína do leite completo que pode incluir caseina, e facultativamente da proteína de interesse de modo a que a proteína de interesse possa ser isolada a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa da proteína de interesse; e isolamento facultativo da proteína de interesse a partir da amostra de leite estabilizado numa forma que seja biologicamente activa.
Numa outra apresentação, o presente invento proporciona um estojo para estabilização de uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo uma proteína de interesse caracterizado pelo facto de compreender: um agente catiónico mono- ou polivalente; e instruções para utilização do agente de estabilização catiónico tendo como finalidade a estabilização da solubilidade de uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo uma proteína de interesse até um grau que permita isolamento da proteína de interesse a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa da proteína de interesse devido a remoção anterior da porção da proteína do leite completo; e, facultativamente, um recipiente contendo um agente para ajustamento do pH da amostra de leite contendo a proteína de interesse até um nível seleccionado de modo a que a proteína de interesse retenha a sua actividade biológica e que a solubilidade da porção da proteína do leite completo seja estabilizada.
Numa outra apresentação, o presente invento porporciona uma composição, que é um meio de cultura de células ou uma preparação de géneros alimentícios, caracterizada pelo facto de compreender uma proteína de interesse isolada pelo método presente. f(| -5-
Tendo indicado o âmbito do presente invento, ele será agora ainda descrito em termos mais gerais. O presente invento relaciona-se com um método para o isolamento de um componente de interesse, tal como uma proteína, a partir do leite. O invento baseia-se, pelo menos em parte, no reconhecimento de que baixos rendimentos de componentes biologicamente activos de interesse obtidos a partir de amostras de leite usando métodos tradicionais eram devidos essencialmente a retenção do componente de interesse no produto precipitado do passo de fraccionamento inicial. O método do presente invento evita a inactivação e retenção do componente de interesse ao proporcionar um agente de estabilização que estabiliza a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. Em vez de ser sedimentado ou precipitado a partir da amostra de leite estabilizado e de transportar com ele o componente de interesse, pelo menos uma porção da proteína do leite total permanece solúvel de modo a que possa subsequentemente ser eliminado durante a purificação do componente de interesse. Além disso, porque o método do presente invento não requere os pHs baixos dos métodos anteriores, é evitada a inactivação de componentes de interesse sensíveis ao pH. O presente invento relaciona-se com métodos para o isolamento de um componente de interesse na sua forma biologicamente activa a partir de uma amostra de leite contendo o componente de interesse. Mais particularmente, o presente invento relaciona-se com um método para o isolamento de um composto de interesse a partir de uma amostra de leite fazendo contactar a amostra de leite contendo o componente de interesse com um agente de estabilização em condições que estabilizem a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. Após estabilização, o componente de interesse pode ser isolado -6-
%aSSBSZ&SSS> sem perda significativa e o componente de interesse pode ser isolado a partir da amostra de leite estabilizado na sua forma biologicamente activa. O presente invento relaciona-se ainda com um método de isolamento de um componente de interesse a partir de uma amostra de leite fazendo contactar uma amostra de leite contendo um componente de interesse com um agente de estabilização formando uma amostra de leite processável por filtração. O componente de interesse é então isolado a partir da amostra de leite processável por filtração. O presente invento relaciona-se ainda com componentes de interesse isolados usando os métodos acima descritos e métodos para estabilização da solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo numa amostra de leite contendo um componente de interesse. Os componentes isolados de interesse podem ser usados como aditivos para os meios de cultura de células, preparações de géneros alimentícios, e composições medicinais. O invento relaciona-se ainda com estojos contendo reagentes usados nos métodos acima descritos juntamente com instruções para utilização do estojo para estabilização da solubilidade de pelo menos uma porção da proteína de leite completo de uma amostra de leite contendo um componente de interesse.
Descrição Resumida dos Desenhos A Figura 1 é uma fotografia representando o grau de solubilização de uma porção de proteína do leite completo em amostras de leite em doze diferentes concentrações de arginina. A Figura 2 representa a concentração relativa de proteína versus a actividade do activador do plasminogénio do tipo tedidular de acção prolongada -7- (LA-tPA) do produto flutuante a partir do passo de solubilização da arginina representado na Figura 1 para doze concentrações de arginina. A Figura 3 é uma fotografia representando o grau de solubilização de uma porção da proteína do leite completo em amostras de leite de doze concentrações diferentes de imidazole. A Figura 4 representa a concentração relativa de proteína versus a actividade LA-tPA do produto flutuante a partir do passo de solubilização de imidazole indicado na Figura 3 para doze concentrações de imidazole. A Figura 5 é uma fotografia representando o grau de solubilização de uma porção da proteína de leite completo em amostras de leite em dez concentrações diferentes de Bis-Tris. A Figura 6 representa a concentração relativa de proteína versus a actividade LA-tPA do produto flutuante a partir do passo de solubilização Bis-TRis indicado na Figura 5 para as dez concentrações de Bis-Tris.
As Figuras 7A-7E são cinco fotografias representando o grau de solubilização de uma porção da proteína de leite completo em amostras de leite para várias concentrações de arginina numa gama de pHs. A Figura 8 representa a concentração relativa de proteína versus a actividade LA-tPA do produto flutuante a partir de uma solubilização mediada por arginina de uma porção da proteína do leite completo em que a arginina foi adicionada à amostra de leite antes do ajustamento do pH da amostra de leite. - 8-
Descrição Detalhada do Invento O presente invento relaciona-se com métodos para o isolamento de um componente de interesse a partir de uma amostra de leite contendo o componente de interesse sem perda significativa do componente de interesse. O método inclui fazer contactar uma amostra de leite contendo um componente de interesse com um agente de estabilização em condições que estabilizem a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo de modo a que o componente de interesse possa ser isolado a partir da amostra de leite estabilizado. O componente de interesse é então isolado a partir da amostra de leite estabilizado numa forma que seja biologicamente activa. A expressão "componente de interesse" pretende incluir materiais presentes na amostra de leite capazes de serem isolados a partir do leite usando o método acima descrito sem afectar de um modo significativo a função pretendida do componente de interesse de um modo prejudicial. O componente de interesse pode ser um material que ocorra naturalmente numa amostra de leite ou pode ser um material que não esteja normalmente presente numa amostra de leite mas que seja dirigido para o tecido mamário de um mamífero transgénico e que seja por último introduzido no leite desse mamífero. O componente de interesse pode apresentar-se numa forma livre ou pode ser retido ou encapsiulado num outro material presente na amostra de leite, por exemplo um globulo de gordura do leite e/ou a membrana encerrando o glóbulo de gordura do leite (ver, por exemplo, Di Tollio et al. (1992) Biotechnology 10: 74-77). Exemplos de componentes de interesse incluem proteínas, tais como caseína, lactoferrina, β-lactoglobulina, imunoglobulinas, lípidos, tais como glicerideos de ácido oleico, ácido palmítico, e ácido miristico, polissacarídeos, tais como lactose e oligossacarídeos mais complexos, ou qualquer um dos componentes acima reeferidos em combinação
com vitaminas, tais como vitaminas A e as do complexo B, e minerais, tais como fósforo, potássio, ferro, magnésio, cobre e cálcio. Por exemplo, componentes de interesse podem ser produzidos no leite através de vias de secreção normais. Vias de secreção normais para proteínas podem incluir síntese da proteína no retículo endoplasmico rugoso, passagem da proteína para o lúme do retículo endoplasmico seguido por transporte para o aparelho de Golgi. Finalmente, as proteínas (ou proteínas glicosiladas) são embaladas em vesículas que são cortadas para o citoplasma e subsequentemente se reúnem com a membrana plasmática. Outra via de secreção envolve fazer borbulhar para fora do leite glóbulos de gordura a partir da membrana que contem o componente de interesse, tal como acontece no caso do regulador da conductancia transmembranar na fibrose quística.
Verificou-se que componentes do leite que ocorrem naturalmente eram úteis como suplementos para o crescimento sem soro de certos tipos de células em cultura. Ver Steimer, K.S. et al. (Nov. 1981) J. Cell Physiol. 109(21:223-234 (células epiteliais e fíbroblastos); Steimer, K.S. and Klagsbrun, M. (Feb. 1981) J. Cell Biol. 88(2): 294-300 (fíbroblastos normais e transformados). Os componentes do leite podem também ser usados em géneros alimentícios. Por exemplo, a incorporação de componentes do leite no pão pode aumentar o valor nutricional do produto final, por exemplo Rudel, H.W. et al. (U.S. Patent No. 5178894). De um modo alternativo, componentes do leite podem ser adicionados a produtos lácteos, tais como sobremesas lacteas congeladas, para proporcionar consistência e textura às composições e diminuir a sensibilidade do produto a flutuações da temperatura. Huang, V.T. et al. (U.S. Patent No. 5175013). Componentes do leite podem também ser usados para fabricar queijos. Yee, Jen-Jung et al. (U.S. Patent No. 5165945). A expressão "componente de interesse" pretende também incluir qualquer composto que não esteja normalmente presente numa amostra de leite obtida a partir de um mamífero não transgénico mas que seja em vez disso segregado numa amostra de leite obtida a partir de um mamífero transgénico. Exemplos desses componentes de interesse incluem agentes terapêuticos. Um agente terapêutico é um agente tendo um efeito terapêutico num mamífero quando administrado numa dose apropriada em condições apropriadas. O efeito terapêutico desejado irá depender da doença ou da condição a ser tratada. A dose ou condições apropriadas acima mencionadas serão determinados numa base individual e irá depender de factores tais como o tamanho do ser individual a ser tratado, da gravidade dos sintomas a serem tratados, e da via seleccionada para administração do agente terapêutico. Exemplos de agentes terapêuticos incluem insulina, activador do plasminogénio do tipo tecidular de acção prolongada (LA-tPA), anti-trombina III, a-l-anti-tripsina, CD4 solúvel, interleukin-2, imunoglobulinas, regulador da conductancia transmembranar da fibrose quística, e factores de coagulação VIII e IX. A expressão "mamífero transgénico" pretende incluir um mamífero cujas células, por exemplo da linhagem germinal ou somáticas, tenham sido manipuladas geneticamente tendo nelas sido introduzidos segmentos de DNA estranhos. Exemplos de mamíferos transgénicos incluem vacas, carneiros, cabras, porcos, coelhos, ratos e ratinhos transgénicos. De um modo típico, para se obter produção em larga escala do componente de interesse com um custo reduzido, deverá ser seleccionado um mamífero de acordo com a quantidade de leite que produza. De preferência, grandes animais transgénicos de quinta tais como vacas, carneiros, e cabras são escolhidos devido à sua capacidade para produzir grandes volumes de leite. - 11 - A expressão "biologicamente activo" pretende incluir uma actividade para o componente de interesse que lhe permite realizar a função pretendida. O componente de interesse não tem que ser tão activo como a sua contrapartida que ocorre naturalmente mas tipicamente tem uma actividade próxima ou semelhante à da sua contrapartida que ocorre naturalmente. A expressão "amostra de leite" pretende incluir amostras contendo leite derivado de um mamífero que contenha um componente de interesse. A amostra de leite pode ser uma amostra derivada directamente do mamífero ou uma amostra que seja processada de um modo que não afecte de um modo prejudicial a actividade do componente de interesse ou a capacidade do agente de estbilização para realizar a função pretendida. A amostra de leite pode ainda ser concentrada ou diluída usando reagentes que não afectem de um modo prejudicial a actividade do componente de interesse ou a capacidade do agente de estabilização para realizar a sua função pretendida. A quantidade de leite presente na amostra de leite é uma quantidade suficiente para verificar a presença do componente de interesse. A expressão "agente de estabilização" pretende incluir compostos que tomem solúvel e/ou mantenham a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo e/ou o componente de interesse. A expressão "manter a solubilidade de" pretende incluir a manutenção da silubilidade até um grau que evite que a porção da proteína do leite completo se precipite a partir da amostra de leite durante passos de processamento posteriores, por exemplo ajustamento do pH, e interferindo com o processamento posterior da amostra de leite ou o isolamento do componente de interesse. Esta manutenção da solubilidade não significa manutenção da solubilidade num valor constante e pode ser a manutenção da solubilidade ao longo de uma gama apropriada. Exemplos desses agentes são agentes catiónicos mono- e polivalentes tais como amino ácidos e - 12-
tampões carregados positivamente. Tampões carregados positivamente úteis incluem arginina, imidazole, e Bis-Tris. O pH do agente de estabilização é tipicamente seleccionado de modo a que o agente seja carregado positivamente. A expressão "estabilizar a solubilidade" pretende incluir solubiliza-ção e/ou manutenção da solubilização de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. Algumas das proteínas major do leite, tais como caseína, estão naturalmente presentes numa forma parcialmente insolúvel ou insolúvel no leite. A diminuição do pH do leite pode resultar na precipitação de pelo menos uma porção destas proteínas do leite. Contudo, o isolamento de um componente de interesse pode requerer que o pH da amostra do leite seja ajustado de modo a que o componente de interesse se tome ou permaneça solúvel. O ajustamento do pH da amostra do leite pode também tender a encorajar a precipitação de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. O agente de solubilização solubiliza e/ou mantém a solubilidade dessas proteínas antes, durante, e após um ajustamento do pH. De um modo alternativo, o isolamento de outros componentes de interesse pode não requerer o ajustamento do pH para se tomarem solúveis ou para manter solubilidade mas é ainda requerido que o agente de solubilização se solubilize e/ou mantenha a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo permitindo o posterior processamento da amostra de leite sem interferência a partir das proteínas do leite precipitado. A concentração do agente de estabilização é seleccionada de modo a preservar as propriedades funcionais do componente de interesse e estabilizar a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. Por exemplo, se o componente de interesse for um enzima, a concentração do tampão deverá ser tão baixa quanto possível visto que intensidade iónica elevada pode diminuir a actividade do enzima. A concentração requerida do agente de estabilização no isolamento de um componente de interesse particular a partir do - 13- leite irá assim variar de acordo com as propriedades do próprio agente de estabilização e com o componente de interesse a ser isolado. Por exemplo, uma concentração de arginina de cerca de 0,3M é mais eficaz na preservação das propriedades funcionais de LA-tPA e na estabilização da solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo do que 0,3M de imidazole.
As condições nas quais o agente de estabilização é levado a contacto com a amostra de leite para formar uma amostra de leite estabilizado são seleccionadas de modo a que as propriedades funcionais do componente de ineteresse sejam preservadas e que a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo seja estabilizada. Um especialista nesta técnica será capaz de manipular, com apenas experimentação de rotina, condições tais como pH da amostra de leite, as concentrações dos agentes usados para o isolamento, e outros factores que podem afectar as propriedades funcionais do componente de interesse e a estabilidade da solubilização de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. O pH da amostra de leite contendo o componente de interesse deverá geralmente ser ajustado até um nível seleccionado de modo a que o componente de interesse retenha a sua solubilidade e propriedades funcionais e que a solubilidade da porção da proteína do leite completo seja estabilizada. O nível para o qual o pH é ajustado pode ser ditado por vários factores. Incluído entre estes factores encontra-se a variação do pH em que o componente de interesse se apresenta na sua forma natural e/ou biologicamente activa. Por exemplo, certos componentes de interesse, tais como enzimas, podem apenas ser activos numa variação estreita dos pHs e a exposição a pHs fora desta variação pode dar origem a perda irreversível de actividade. Assim, para se obter a fornia funcional do componente de interesse ou pelo menos o componente de interesse na sua forma natural, o pH deverá ser ajustado para níveis apenas nos limites permissíveis. Uma gama de pH variando entre cerca de 5,0 e cerca de 9,0 é um exemplo de uma gama típica na qual muitos componentes de interesse que têm actividade biológica irão reter essa actividade. A expressão "cerca de 5,0" é definido mais abaixo. A expressão "cerca de 9,0" pretende incluir pHs próximos de 9,0 que afectam o componente de interesse de um modo igual ou semelhante ao valor pH 9,0, por exemplo de preferência 8,5 e mais elevado, com maior preferência 8,8 e mais elevado.
Outro factor a considerar no ajustamento do pH é o nível ao qual a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo é estabilizada. O pH da amostra de leite contendo a proteína de interesse deverá geralmente não ser feito descer até ao nível ou abaixo do nível ao qual os componentes do leite irão precipitar-se a partir do leite. Por exemplo, as caseínas precipitam a um pH de cerca de 4,6 a 20° C. O pH deverá também ser mantido a um nível que evite que o componente de ineteresse se tome insolúvel. Por exemplo, o pH da amostra de leite contendo activador do plasminogénio do tipo tecidular de acção prolongada (LA-tPA) é geralmente feito descer apenas até cerca de 5,0 de modo a que LA-tPA permaneça solúvel. A expressão "cerca de 5,0" pretende incluir pHs próximos de 5,0 que afectam o componente de interesse de um modo igual ou semelhante ao que acontece com 5,0 por exemplo de preferência 4,6 a 5,4, com maior preferências 4,8 a 5,2. A expressão "perda significativa" pretende incluir perdas do componente de interesse que não permitiriam que o método acima descrito de isolamento do componente de interesse constituísse uma abordagem comercialmente realizável para a produção do componente de interesse. Os métodos deste invento têm de preferência uma perda do componente de interesse que é inferior a 50%, com maior preferência inferior a cerca de 20% e com a maior preferência inferior a cerca de 10%. Os métodos convencionais para o - 15-
processamento de leite originaram perdas significativas no rendimento do componente de interesse porque o componente de interesse foi fixado no sedimento, precipitado, ou coágulo. Por exemplo, Clark, A.J. et al, (May 1989) Biotechnology 7:487-492 referiram uma recuperação de factor anti-hemofilico IX de cerca de 2,0 a 2,5% usando precipitação ácida para remover caseínas do leite a partir de uma amostra de leite obtida a partir de ovelhas transgénicas. Isto traduz-se numa perda de 98%. Denman, J et al., (Sept. 1991) Biotechnology 9:839-843 referiram uma recuperação de LA-tPA de cerca de 25%, e assim uma perda de cerca de 75%, usando precipitação ácida para remover caseinas do leite a partir de uma amostra de leite obtida a partir de uma cabra produtora de leite transgénica. Denman et al. também referiram que outros passos de fracciona-mento iniciais tais como tratamento com renina e precipitação com ácido não proporcionaram aumentos significativos nos rendimentos de LA-tPA. Denman, J. et al. (Sept. 1991) Biotechnology 9: 839-843. A expressão "pelo menos uma porção da proteína do leite completo" pretende incluir pelo menos uma porção de pelo menos uma proteína que está normalmente presente em leite numa forma parcialmente insolúvel ou insolúvel. A porção da proteína do leite completo cuja solubilidade é estabilizada deverá apresentar-se numa quantidade tal que a sua remoção constitua mais do que um passo insignificante no isolamento de um componente de interesse. As solubilidades de porções de diferentes proteínas do leite podem ser estabilizadas ou a solubilidade de porções completas de uma ou mais proteínas do leite pode ser estabilizada. Nos exemplos mais abaixo, arginina e imidazole estabilizaram a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo nos exemplos descritos mais abaixo, estabilizaram a solubilidade de pelo menos a familia caseina de proteínas, isto é a porção completa ou substancialmente a porção completa de pelo menos um tipo de proteína do leite. - 16-
Deverá ser compreendido que o componente de interesse pode ser isolado a partir da amostra de leite estabilizado usando técnicas convencionais. A selecção de uma técnica de separação ou de isolamento depende de factores tais como o tipo de componente de interesse a ser isolado e a quantidade do componente de interesse presente na amostra de leite. Além disso, o isolamento ou separação do componente de interesse a partir da amostra de leite estabilizado pode ser realizado usando uma técnica simples ou uma série de técnicas em sucessão. Estas técnicas incluem técnicas de filtração e de cromatografía. Exemplos de filtração incluem unidade de filtro para filtração de extremidade fechada e filtração de fluxo cruzado. Exemplos de técnicas cromatográficas incluem técnicas cromatográficas de permuta iónica, hidrofóbicas, de afinidade, e de filtração por gel. De um modo semelhante, outro processamento por fraccionamento da amostra de leite antes ou após o isolamento do componente de interesse pode ser conduzido usando as técnicas de separação acima descritas. Por exemplo, fraccionamento de proteínas e outros componentes pode ser realizado por qualquer um de uma série de métodos cromatográficos dependendo das propriedades do componente a ser isolado. Proteínas são mais frequentemente fraccionadas por cromatografía de coluna, em que uma mistura de proteínas em solução é feita passar através de uma coluna contendo uma matriz porosa, e podem ser recolhidas separadamente, no seu estado funcional nativo, à medida que vão fluindo para fora do fundo da coluna. Dependendo do tipo de matriz usada, proteínas são separadas, por exemplo, de acordo com a sua carga (cromatografía de permuta iónica), a sua hidrofobicidade (cromatografía hidrofóbica), a sua capacidade para se ligarem a grupos químicos particulares (cromatografía de afinidade), e com o seu tamanho (cromatografía de filtração por gel). Para graus mais elevados de separação, pode ser utilizada cromatografía líquida de elevada performanece. Os especialistas nesta técnica serão capazes de variàr a ordem e número das técnicas de separação acima descritas com - 17-
experimentação de rotina para isolar o componente da amostra de leite em que estejam interessados até à pureza por eles requerida. O presente invento relaciona-se ainda com um método para isolamento de um componente de interesse a partir de uma amostra de leite fazendo contactar uma amostra de leite contendo um componente de ineteresse com um agente de estabilização formando uma amostra de leite processável por filtração. O componente de interesse pode então ser isolado a partir da amostra de leite processável por filtração. As expressões componente de interesse e agente de estabilização são tal como foram acima definidos. A expressão "processável por filtração" pretende incluir uma amostra de leite em que a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo é estabilizada até um grau tal que a amostra de leite estabilizado seja capaz de passar através de um filtro e se tome parte do filtrado. Os filtros são do tipo tipicamente usado para processar leite ou substancias semelhantes ao leite. O filtro contem geralmente poros de um tamanho que tipicamente não seriam usados para processamento de leite porque os poros ficariam bloqueados por componentes no leite. Exemplos de tipos de filtros que podem ser usados para processar as amostras de leite deste invento incluem filtros tendo tamanhos de poros variando entre cerca de 0,2pm e cerca de 5,0 μτη. O componente de interesse pode então ser isolado a partir do produto filtrado por qualquer um dos métodos para isolamento de proteínas e em qualquer ordem conhecida dos especialistas nesta técnica. Alguns destes métodos são acima descritos. O presente invento relaciona-se ainda com um método para a estabilização da solubilidade de pelo menos uma parte da proteína do leite completo numa amostra de leite contendo o componente de interesse. O método envolve fazer contactar uma amostra de leite com um agente de estabilização em -18- condições que estabilizem a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo. O componente de interesse pode ser isolado a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa do componente de interesse. As expressões "agente de estabilização", "em condições que estabilizem a solubilidade" e "pelo menos uma porção da proteína do leite completo" são tal como foram acima definidas. O presente invento relaciona-se também com estojos para estabilizar a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo uma proteína de interesse. Os estojos incluem um recipiente contendo um agente de estabilização e instruções para utilização do agente de estabilização tendo como finalidade a estabilização da solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo um componente de interesse até um grau que permita isolamento do componente de interesse a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa. Os estojos também podem incluir um recipiente contendo um agente para ajustamento do pH da amostra de leite até um nível seleccionado de modo a que a actividade biológica do componente de interesse seja preservada e que a solubilidade da porção da proteína do leite completo seja estabilizada. A expressão "agente para ajustamento do pH" pretende incluir compostos que são usados pelos especialistas nesta técnica para ajustar o pH de uma solução, tal como uma amostra de leite. Esses agentes incluem ácidos, tais como HC1 e ácido acético, e bases, tais como NaOH. Além disso, o pH pode também ser regulado por gases, tais como CO2. No caso em que o agente para ajustamento do pH da amostra de leite se apresenta sob a forma de um líquido, exemplos de recipientes que proporcionam meios convenientes para - 19- administração do agente de ajustamento do pH incluem frascos, garrafas, etc., que têm tampas que incorporam pipetas ou frascos conta gotas medicinais. O presente invento é ainda ilustrado pelos exemplos que se seguem os quais não devem de algum modo ser limitativos. O presente invento é ainda ilustrado pelos exemplos que se seguem.
Exemplo 1: Estabilização da Solubilidade da Proteína do Leite a partir de Leite de Cabras Leiteiras Transgénicas Contendo Activador do Plasminogénio do Tipo Tecidular de Actuação Prolongada ÍLA-tPAl Usando Arginina como o Agente Estabilizador
Amostras de leite obtidas a partir de cabras leiteiras transgénicas produzindo leite produzidas de acordo com o método de Ebert, K.M. et al. (Sept. 1991) Biotechnology 9: 835-838 foram armazenadas congeladas a -20° C e foram descongeladas num banho de água a 37° C antes da análise. O componente de interesse produzido no leite das cabras leiteiras foi LA-tPA, uma variante de glicosilação do activador do plasminogénio do tipo tecidular humano que apresenta uma semí-vida de circulação mais longa que o tipo selvagem tPA. (Ver Denman, J. et al., citado supra, para uma caracterização de LA-tPA produzido no leite de cabras leiteiras transgénicas). O pH da amostra de leite foi então ajustado de 6,7 para 5,0 usando ácido acético 1,0M. A amostra de leite foi subsequentemente dividida em doze porções aliquotas de 500 ml que foram colocadas em tubos de polipropileno de 1,5 ml. Uma quantidade diferente de arginina-HCl 2,0M (pH 5,5) foi adicionada a cada tubo para se obter concentrações de arginina variando entre 0,0M e 1,0M (Quadro I). Solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi adicionada para levar o volume final até 1,0 ml. -20- ARGININA pH 5,5
Concentração Final de Arginina Leite Arginina 2.0M PBS Volume Final m m m 00) (ml) 1,00 500 500 _ 1,0 0,90 500 450 50 1,0 0,80 500 400 100 1,0 0,70 500 350 150 1,0 0,60 500 300 200 1,0 0,50 500 250 250 1,0 0,40 500 200 300 1,0 0,30 500 150 350 1,0 0,20 500 100 400 1,0 0,10 500 50 450 1,0 0,05 500 25 475 1,0 0,00 500 - 500 1,0
QUADROI
Os tubos foram centrifugados durante dez minutos a 1.000 rpm numa centrífuga de Brinkman 5315. Os tubos foram removidos e fotografados para ilustrar o grau de solubiíização examinando o tamanho da pílula de caseina para cada concentração de arginina (Figura 1). O produto flutuante foi removido para análise quantitativa. A Figura 1 representa o grau de solubiíização de uma porção da proteína do leite completo em amostras de leite para doze concentrações diferentes de arginina. Para concentrações de arginina inferiores a 0,4M, pílulas de proteína (provavelmente consistindo principalmente em caseina) eram claramente visíveis. Para concentrações de arginina superiores a cerca de 0,4M, verificou-se pouca ou nenhuma pílula de proteína. -21 -
A concentração de proteína do produto flutuante foi calculada por uma medição da absorvência a 280 nm. A absorvência a 280 nm foi medida diluindo cada um dos doze produtos flutuantes 1:50 com PBS e fazendo a leitura num espectrofotometro Beckman DU-6. Cada uma das 12 amostras tinha o seu proprio controlo blank diluído 1:50 com PBS em que PBS foi substituído por leite. A actividade LA-tPA foi medida num ensaio de actividade amidolitica indirecta usando o substrato plasmina Val-Leu-Lis-para-nitroanilida (S-2251, Helena Labs. Inc.) tal como é descrito por Lau, D, et al. ((Sept. 1987) Biotechnology 5: 953-958). Os resultados são indicados na Figura 2. A diluição necessária foi 1:500.000. A Figura 2 representa a concentração de proteína relativa versus actividade LA-TPA de produtos flutuantes em relação a doze concentrações de arginina (pH 5,5). Os resultados na Figura 2 demonstram que à medida que a quantidade de arginina aumentava, havia um aumento concomitante tanto na concentração de proteína total da amostra de leite como na actividade de LA-tPA. Estes resultados demonstram que arginina é capaz de estabilizar a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo, permitindo desse modo isolamento de quantidades aumentadas de LA-tPA.
Exemplo 2: Estabilização da Solubilidade da Proteína do Leite a partir do Leite de Cabras Leiteiras Transgénicas Contendo LA-tPA Usando
Imidazole como o Agente de Estabilização O processo descrito no Exemplo 1 foi seguido exceptuando o facto de arginina ser substituída por imidazole 2,0M (pH 7,0). O Quadro II indica a gama de concentrações de imidazole testadas. A Figura 3 é uma fotografia que ilustra o grau de solubilização da amostra de leite com a gama de concentrações de imidazole. Para concentrações de imidazole mais baixas do que cerca de 0,7M, pílulas de proteína (provavelmente consistindo principalmente em caseina) foram claramente visíveis. Para concentrações de imidazole superiores a cerca de 0,7M, -22- observou-se pouca ou nenhuma pílula de proteína. A Figura 4 representa a concentração relativa de proteína do produto flutuante versus a actividade de LA-tPA em relação a doze concentrações de imidazole. Tal como no caso da arginina, imidazole foi capaz de estabilizar a solubilidade de pelo menos uma porção da proteína do leite completo, desse modo permitindo rendimentos aumentados de LA-tPA. A Figura 4 indica que houve um aumento concomitante na concentração de proteína total da amostra de leite e na actividade de LA-tPA à medida que a concentração de imidazole na amostra de leite aumentava. IMIDAZOLE pH 7,0
Concentração Final de Imidazole Leite Imidazole 2.0M PBS Volume Final m m m m (ml) 1,00 500 500 _ 1,0 0,90 500 450 50 1,0 0,80 500 400 100 1,0 0,70 500 350 150 1,0 0,60 500 300 200 1,0 0,50 500 250 250 1,0 0,40 500 200 300 1,0 0,30 500 150 350 1,0 0,20 500 100 400 1,0 0,10 500 50 450 1,0 0,05 500 25 475 1,0 0,00 500 - 500 1,0
QUADRO II
Exemplo 3: Estabilização da Solubilidade de Proteína do Leite a partir de Leite de Cabras Leiteiras Transgénicas Contendo LA-tPA Usando Bis-Tris como o Agente de Estabilização -23 - O processo descrito no Exemplo 1 foi seguido exceptuando o facto de arginina ser substituída por 1,7 M de Bis-Tris (pH 6,0) e a gama de concentrações de Bis-Tris testadas foi mais estreita do que a gama de concentrações de arginina testadas. O Quadro III indica a gama de concentrações de Bis-Tris usadas na experimentação. BIS-TRIS pH 6,0
Concentração Final de Bis-Tris Leite Bis-Tris 1.7M PBS Volume Final (M) OU) (Ml) m (ml) 0,85 500 500 - 1,0 0,80 500 471 29 1,0 0,70 500 412 88 1,0 0,60 500 353 147 1,0 0,50 500 294 206 1,0 0,40 500 235 265 1,0 0,30 500 176 324 1,0 0,20 500 118 382 1,0 0,10 500 59 441 1,0 0,00 500 - 500 1,0
QUADRO III A Figura 5 é uma fotografia que ilustra o grau de solubilização da amostra de leite em relação à gama de Concentrações de Bis-Tris testadas indicando o tamanho da pílula de proteína. Para concentrações de Bis-Tris tão baixas como 0,2M, houve pouca ou nenhuma pílula de proteína visível. A Figura 6 indica a concentração relativa de proteína do produto flutuante versus a actividade de LA-tPA em relação às dez concentrações de Bis-Tris. A Figura 6 indica que houve um aumento concomitante na concentração de proteína total da amostra de leite e da actividade de LA-tPA à medida que a concentração de Bis- -24-
Tris na amostra de leite aumentava com uma diminuição na actividade de LA-tPA com concentrações de Bis-Tris de cerca de 0,65 M ou superiores.
Exemplo 4: Estabilização da Solubilidade de Proteína do Leite a partir de Leite de Cabras Leiteiras Transgénicas Contendo LA-tPA Usando Argi-nina O pH inicial da amostra de leite era de 6,7, A partir deste ponto o pH da amostra foi ajustado para o desejado pH, por exemplo 4,3. 6,0, 7,0 e 8,0. O pH da amostra de leite não foi ajustado no caso em que o pH do agente de estabilização a ser testado era de 6,7. A arginina 2,0M foi ajustada de um modo semelhante ao pH da amostra à qual foi adicionada para evitar flutuações no pH da amostra final. As amostras de leite com pH ajustado foram então divididas em porções alíquotas de 500 ml que foram colocadas em tubos de polipropileno de 1,5 ml. Várias quantidades de arginina 2,0M foram adicionadas às amostras de leite para se obterem amostras de leite contendo arginina em várias concentrações e com vários pHs. O PBS foi adicionado para levar o volume final até 1,0 ml.
Os tubos foram centrifugados durante 10 minutos a 1.000 rpm numa centrífuga Brinkman 5315. Os tubos foram então removidos e fotografados para ilustrar o grau de solubilização examinando o tamanho da pílula de proteína para cada concentração de arginina a pHs de 4,3, 6,0, 6,7, 7,0 e 8,0. As fotografias são representadas na Figura 7. Tal como é indicado na Figura 7, a arginina a pH 6,0 actuou como o melhor estabilizador da solubilidade da proteína do leite em relação a uma gama de concentrações de arginina de cerca de 0,5M a cerca de 1,0M. Arginina com pH 7,0 com concentrações variando entre cerca de 0,6M e 1,0M foi também um bom estabilizador da solubilidade da proteína do leite. Arginina com pH 4,3 demonstrou fraca estabilização da proteína do leite em -25- relação a uma gama de concentrações variando entre cerca de 0,1M e cerca de 1,0M.
Exemplo 5: Isolamento de LA-tAP a partir do Leite de Cabras Leiteiras Trans-génicas Primeiro Adicionando Arginina e em Seguida Ajustando o pH da Amostra do Leite O processo descrito no Exemplo 1 foi seguido exceptuando o facto de se adicionar arginina 2,0M (pH 5,5) antes do ajustamento do pH. A gama de concentrações de arginina testadas na experimentação foi igual à testada no Exemplo 1 e é indicada no Quadro I. A Figura 8 indica a concentração relativa de proteína do produto flutuante versus a actividade de LA-tPA em relação às doze concentrações de arginina. Um aumento tanto na concentração da proteína do leite completo como na actividade de LA-tPA acompanhou o aumento na concentração de arginina. A actividade de LA-tPA, contudo, atingiu um pico para uma concentração de arginina de cerca de 1,0M a um nível (cerca de l,20e + 6 IU/ml) em comparação com o pico de actividade de LA-tPA (cerca de l,50e + 6 IU/ml) no Exemplo 1 para a mesma concentração de arginina.
Exemplo 6: Isolamento de Anti-Trombina III a partir do Leite de um Ratinho Transgénico Usando Arginina como o Agente de Estabilização
Amostras de leite obtidas a partir de um ratinho transgénico produzindo leite foram armazenadas congeladas a -80° C e descongeladas à temperatura ambiente antes da análise. O componente de interesse produzido no leite do ratinho foi anti-trombina III humana. O pH da amostra de leite não foi ajustado porque o volume foi demasiadamente pequeno. A amostra de leite foi subsequentemente dividida em -26- duas porções aliquotas de 500 μΐ que foram colocadas em tubos de polipropileno de 1,5 ml. Uma porção aliquota de 500 ml de arginina 2,0M, pH 5,0, foi adicionada a um tubo e 100 μΐ de ácido epsilon-amino caproico 1,0M (EACA) foram adicionados ao outro tubo com 400 μΐ de PBS para equalizar os volumes a 1,0 ml em cada tubo. Os conteúdos do tubo foram filtrados usando uma unidade de filtro 0,45 pm (Millipore, Bedford, MA). Os resultados revelaram que a amostra contendo arginina foi fácil de filtrar e a recuperação foi de 83% da anti-trombina III de partida. O material com o EACA foi extremamente difícil de filtrar e a recuperação de anti-trombina III foi de 50%.
Exemplo 7: Isolamento de LA-tPA a partir do Leite de Cabras Leiteiras
Transgénicas Usando Arginina como o Agente de Solubilização O leite foi descongelado à temperatura ambiente, foi ajustado para pH 5,0 usando ácido acético 1,0M, diluído com um volume igual de arginina 1,0M e submetido a filtração de extremidade fechada através de um filtro nominal 0,22 pm (Sartorius, Bohemia, N.Y.) seguindo-se um filtro absoluto 0,20 pm (Millipore, Bedford, MA). LA-tPA foi purificada a partir do filtrado ligando inicialmente o enzima a uma coluna de TSK-butilo. A coluna foi equilibrada e lavada em fosfato de sódio 20mM (pH 6,0), arginina-HCl lOOmM, 0,01% de Tween 80 e eluida por passos usando fosfato de sódio 20mM, arginina-HCl lOOmM e 70% de etileno glicol. A recolha dos produtos de eluição reunidos foi realizada monitorizando por absorvência a 280 nm a 1,0 AUFS. A recolha foi iniciada na primeira deflecção acima da linha de base. O passo inicial proporciona um meio de concentração e de purificação substancial do enzima. A recuperação de LA-tPA a partir deste processo foi de 95% da actividade de partida em comparação com recuperações de 25 a 50% observadas sem a adição de arginina. -27-
Equivalentes
Os especialistas nesta técnica irão reconhecer, ou ser capazes de avaliar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das apresentações específicas do invento aqui descrito. Pretende-se que esses equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações que se seguem.
Lisboa, 10 de Agosto de 2000
JORGE CRUZ
Agente Oficial da Propriedade Industrial p:ua victor cordon, 14 1200 LISBOA
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um um método de estabilização da solubilidade de uma porção da proteína de leite completo numa amostra de leite contendo uma proteína de interesse e facultativamente isolando a proteína de interesse a partir da amostra de leite, caracterizado pelo facto de compreender: ajustamento facultativo do pH da amostra do leite contendo a proteína de interesse até um nível seleccionado de modo a que a proteína de interesse retenha a sua actividade biológica e se permita que a solubilidade de uma porção da proteína do leite completo estabilize; contacto da amostra de leite contendo a proteína de interesse com um agente de estabilização catiónico mono- ou polivalente em condições que estabilizem a solubilidade de uma porção da proteína do leite completo que pode incluir caseina, e facultativamente da proteína de interesse de modo a que a proteína de interesse possa ser isolada a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa da proteína de interesse; e isolamento facultativo da proteína de interesse a partir da amostra de leite estabilizado numa forma que seja biologicamente activa.
- 2. Um método tal como foi reivindicado na reivindicação 1, em que a amostra de leite é obtida a partir de um mamífero transgénico, de preferência seleccionado de entre um cavalo, vaca, carneiro, cabra, porco, coelho, rato e ratinho.
- 3. Um método tal como é reivindicado na reivindicação 1 ou na reivindicação 2, em que a proteína de interesse é uma proteína do leite ocorrendo naturalmente ou uma proteína segregada no leite de um mamífero transgénico, que pode ser um agente terapêutico, tal como regulador da conductancia -2- transmembranar da fibrose quistica, activador do plasminogénio do tipo tecidular de actuação prolongada (caso esse em que o pH é de preferência ajustado para cerca de 5,0) ou antitrombina III, ou imunoglobulina.
- 4. Um método tal como é reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que o pH da amostra do leite contendo o agente de estabilização catiónico varia entre 5,0 e 9,0.
- 5. Um método tal como é reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o agente de estabilização catiónico é seleccionado de entre arginina, imidazole e Bis-Tris, sendo preferida a arginina.
- 6. Um método tal como é reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a proteína de interesse é isolada por filtração ou por cromatografia a seguir à filtração.
- 7. Um método tal como é reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o ajustamento e o contacto são realizados simultâneamente ou o contacto é realizado antes do ajustamento.
- 8. Um método tal como é reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que há uma perda inferior a 50%, de preferência uma perda inferior a 20%, com maior preferência uma perda inferior a 10%, da proteína de interesse.
- 9. Um estojo para estabilização de uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo uma proteína de interesse caracterizado pelo facto de compreender: um agente catiónico mono- ou polivalente; e 1 -3- instruções para utilização do agente de estabilização catiónico tendo como finalidade a estabilização da solubilidade de uma porção da proteína do leite completo de uma amostra de leite contendo uma proteína de interesse até um grau que permita isolamento da proteína de interesse a partir da amostra de leite estabilizado sem perda significativa da proteína de interesse devido a remoção anterior da porção da proteína do leite completo; e, facultativamente, um recipiente contendo um agente para ajustamento do pH da amostra de leite contendo a proteína de interesse até um nível seleccionado de modo a que a proteína de interesse retenha a sua actividade biológica e que a solubilidade da porção da proteína do leite completo seja estabilizada. Lisboa, 10 de Agosto de 2000 V íJORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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