IT202000015754A1

IT202000015754A1 - Antibodies to coronavirus

Info

Publication number: IT202000015754A1
Application number: IT102020000015754A
Authority: IT
Inventors: Emanuele Andreano; Anna Kabanova; Dario Cardamone; Santi Concetta De; Ida Paciello; Noemi Manganaro; Elisa Pantano; Piero Pileri; Claudia Sala; Rino Rappuoli
Original assignee: Fond Toscana Life Sciences
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-12-30

Description

ANTICORPI CONTRO CORONAVIRUS

DESCRIZIONE

Campo tecnico dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce ad anticorpi monoclonali o ad una loro porzione legante l'antigene aventi una potente attivit? neutralizzante contro il Coronavirus, in particolare contro SARS-CoV-2. L'invenzione riguarda anche l'uso di tali anticorpi monoclonali o di loro parti leganti l'antigene nella terapia, nella profilassi, e nella diagnosi di Coronavirus, in particolare di malattie dipendenti da SARS-CoV-2.

Stato dell?arte

Gli anticorpi monoclonali umani (mAb) rappresentano una tecnologia industrialmente matura con oltre 50 prodotti gi? approvati nell?ambito del cancro, dell'infiammazione e dell'autoimmunit?. L'affermato profilo di sicurezza e la vasta esperienza nel loro sviluppo rendono gli mAb candidati ideali per un rapido sviluppo, specialmente in contesti di epidemia e pandemia. Finora gli mAb sono stati usati raramente nell?ambito delle malattie infettive, principalmente perch? le grandi quantit? necessarie per la terapia li hanno resi non convenienti. Tuttavia, negli ultimi anni, l'incredibile progresso tecnologico nell'isolare e sottoporre a screening le cellule B di memoria ha consentito l'identificazione di mAb neutralizzanti molto potenti e un ulteriore miglioramento della loro potenza di diversi ordini di grandezza attraverso procedure ingegneristiche consolidate. Questa possibilit? ha comportato una riduzione della quantit? di anticorpi necessari per la terapia, rendendo cos? possibile il trasporto per via non-endovenosa di potenti mAb neutralizzanti.

Nel caso di SARS-CoV-2, per il quale non esistono ad oggi interventi terapeutici o profilattici efficaci, gli mAb hanno la possibilit? di diventare uno dei primi farmaci in grado di poter essere utilizzati per una terapia immediata di qualsiasi paziente positivo al virus e anche per fornire una protezione immediata dalle infezioni nelle popolazioni ad alto rischio. Prove preliminari mostrano che il plasma di soggetti infetti migliora l'esito dei pazienti con malattia grave, quindi ? altamente possibile che una terapia e/o profilassi basate su mAb e/o siano altamente efficaci. Inoltre, le strategie di vaccinazione che inducono anticorpi neutralizzanti hanno gi? dimostrato di proteggere primati nonumani dall'infezione. Questi risultati sottolineano ulteriormente l'importanza degli mAb come misura per colpire l'infezione da SARS-CoV-2 e per contenere la sua circolazione.

Tra le molte opzioni terapeutiche disponibili, i mAb offrono una serie di vantaggi. Innanzitutto, sono quelli che possono essere sviluppati nel pi? breve periodo di tempo. In effetti, la vasta esperienza clinica con la sicurezza di oltre 50 mAb commerciali approvati per il trattamento di tumori, infiammazioni e autoimmunit? infonde un'elevata fiducia nella loro sicurezza, supportando la possibilit? di avere un percorso regolatorio accelerato. Inoltre, la lunga esperienza industriale nello sviluppo e nella produzione di mAb riduce i rischi solitamente associati allo sviluppo tecnico di prodotti sperimentali. Infine, l'incredibile progresso tecnico nel settore consente di abbreviare le tempistiche convenzionali e passare dalla scoperta agli studi di proof-of-concept in 5-6 mesi. Diversi candidati sono attualmente in fase di sviluppo nel campo dell'HIV, dell'influenza pandemica, dell'RSV e di molte altre malattie infettive. Forse la dimostrazione pi? sorprendente della potenza dei mAbs per le infezioni emergenti ? venuta dall'esperienza di Ebola. In questo caso, i potenti mAbs sviluppati rapidamente sono stati tra i primi farmaci ad essere testati nell'epidemia di Ebola e hanno mostrato una notevole efficacia nella prevenzione della mortalit?. Data la straordinaria efficacia di questo intervento, i potenti mAb sono diventati il primo e, finora, l'unico farmaco raccomandato dall'Organizzazione mondiale della sanit? (OMS) per l'Ebola. Dato il ruolo cardine della glicoproteina spike transmembrana di SARS-CoV-2 (proteina S) per la patogenesi virale, questa ? considerata l'obiettivo principale per indurre potenti anticorpi neutralizzanti e il focus per lo sviluppo di strumenti terapeutici e profilattici contro questo virus. Infatti, l'ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti ? mediato dall'interazione tra la proteina S e l'enzima 2 di conversione dell'angiotensina umano (ACE2). La proteina S ? una proteina di fusione virale di classe I trimerica che esiste come conformazione pre-fusione metastabile e come conformazione post-fusione stabile. Ogni monomero di proteina S ? composto da due regioni distinte, le subunit? S1 e S2. Il riarrangiamento strutturale si verifica quando il dominio legante il recettore (RBD) presente nella subunit? S1 si lega alla membrana della cellula ospite. Questa interazione destabilizza lo stato pre-fusione della proteina S innescando la transizione nella conformazione post-fusione che a sua volta porta all'ingresso della particella virale nella cellula ospite. Le analisi a singola cellula dell'RNA-seq volti alla valutazione dei livelli di espressione di ACE2 in diversi organi umani hanno dimostrato che SARS-CoV-2, attraverso il legame con le proteine S, pu? invadere le cellule umane in diversi importanti sistemi fisiologici tra cui il sistema respiratorio, cardiovascolare, digestivo e urinario, aumentando la possibilit? di diffusione e infezione. Pertanto, ? importante produrre mAb neutralizzanti o una loro porzione legante l'antigene che siano efficaci per bloccare il processo di ingresso del virus. Di conseguenza, rimane urgente la necessit? di potenti terapie anticorpali ad ampio spettro per uso nella terapia, profilassi e diagnosi di malattie dipendenti da Coronavirus, in particolare SARS-CoV-2.

Sommario dell'invenzione

Per identificare potenti mAb umani contro SARS-CoV-2, gli inventori hanno isolato migliaia di cellule B con memoria specifica per proteine S derivate da diversi donatori convalescenti da COVID-19. Gli inventori hanno sottoposto a screening gli mAb prodotti naturalmente contro le subunit? S1 e/o S2 e il trimero della proteina S stabilizzato nella sua conformazione pre-fusione. La strategia di screening, descritta in dettaglio negli esempi, ha consentito l'identificazione di mAb umani che hanno una potente attivit? neutralizzante contro Coronavirus, in particolare contro SARS-CoV-2.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che si lega specificamente a una regione di proteina Spike (S) del Corona Virus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave umana (SARS). In una forma di realizzazione, detta regione ? i) nel dominio S1 della proteina S di SARS-CoV-2; o (ii) nel dominio S2 della proteina S di SARS-CoV-2; oppure (iii) nel trimero di proteina S di SARS-CoV-2 nella sua conformazione prefusione o (iv) nel trimero di proteina S SARS-CoV-2 nella sua conformazione post-fusione o in una loro combinazione.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene che si lega specificamente alla proteina S del Corona Virus (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave umana (SARS), in cui detto anticorpo o detta sua porzione legante l'antigene fornisce oltre il 25% di inibizione del legame tra il recettore ACE2 umano e la proteina virale Spike misurata mediante test di neutralizzazione del legame (NOB).

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che si lega specificamente alla proteina S del Corona Virus (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave umana (SARS), in cui detto anticorpo o detta sua porzione legante l'antigene ha un'attivit? neutralizzante. In particolare, tale anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) inferiore a 100 ng/ml quando testato in un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2, ad esempio contro il 2019-nCoV ceppo 2019-nCov/Italy-INMI1, alla dose virale 100TCID50.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente il dominio variabile della catena leggera (VL) e il dominio variabile della catena pesante (VH) di un anticorpo monoclonale selezionato dal gruppo composto da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente i CDR di un anticorpo monoclonale selezionato dal gruppo costituito da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente i domini VL e VH che sono almeno 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% identici nella sequenza degli amminoacidi ai domini VL e VH, rispettivamente, di un anticorpo monoclonale selezionato dal gruppo costituito da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce anticorpi monoclonali umani o loro porzioni leganti l'antigene che competono per la proteina S di SARS-CoV-2 con uno qualsiasi degli anticorpi qui descritti. In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene secondo qualsiasi forma di realizzazione qui descritta, per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico di un'infezione virale o condizioni o disturbi risultanti da tale infezione. In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene secondo qualsiasi forma di realizzazione qui descritta, per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da SARS-CoV-2 o condizioni o disturbi risultanti da tale infezione, in particolare la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19).

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un metodo per prevenire o trattare l'infezione da SARS-CoV-2 o le condizioni o i disturbi derivanti da tale infezione, in particolare la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19), comprendente la somministrazione di un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l?antigene secondo qualsiasi forma di realizzazione qui descritta, a un soggetto che ne abbia bisogno.

L'invenzione fornisce inoltre un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene secondo qualsiasi forma di realizzazione qui descritta per l'uso nella diagnosi, profilassi e/o trattamento di un soggetto che abbia, o corra il rischio di sviluppare, un'infezione da virus, in particolare un'infezione da coronavirus, pi? in particolare infezione da SARS-CoV-2. Inoltre, l'invenzione riguarda l'uso delle molecole di legame umane e/o delle molecole di acido nucleico dell'invenzione nella diagnosi/rilevazione di tali infezioni virali.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce una composizione farmaceutica comprendente almeno uno o pi? anticorpi monoclonali umani o loro porzioni leganti l'antigene secondo qualsiasi una delle forme di realizzazione qui descritte e un veicolante farmaceuticamente accettabile e il suo uso nella prevenzione e/o trattamento dell'infezione da SARS-CoV-2 o condizioni o disturbi risultanti da tale infezione, in particolare la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19).

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce una linea cellulare isolata che produce l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce una molecola isolata di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica che codifica l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un vettore comprendente la molecola di acido nucleico codificante l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene delle sue forme di realizzazione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, in cui il vettore comprende facoltativamente una sequenza di controllo dell'espressione legata operativamente alla molecola di acido nucleico.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un animale transgenico non-umano o una pianta transgenica comprendenti l'acido nucleico secondo una qualsiasi delle precedenti forme di realizzazione, in cui l'animale transgenico non-umano o la pianta transgenica esprime detto acido nucleico. In alcune forme di realizzazione, detto animale transgenico non-umano ? un mammifero.

In alcuni aspetti, l'invenzione prevede l'uso dell'anticorpo monoclonale umano o di una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte nella diagnosi dell'infezione da SARS-CoV-2.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un metodo in vitro per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione comprendente i seguenti passaggi:

i) mettere in contatto l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte;

ii) Rilevare il legame di detto anticorpo o di una sua porzione legante l'antigene con la proteina S di SARS-CoV-2.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un metodo in vitro per la diagnosi dell'infezione da SARS-CoV-2 in un soggetto comprendente i seguenti passaggi:

i) mettere in contatto l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte con un campione biologico di detto soggetto;

L'invenzione contempla combinazioni di uno qualsiasi dei precedenti aspetti e forme di realizzazione dell'invenzione.

Breve descrizione dei disegni

Fig. 1. Legame con le proteine S e titolazione di neutralizzazione del plasma dei donatori convalescenti da SARS-CoV-2. (A) I campioni di plasma sono stati diluiti due volte a partire da 1:80 per testare la loro capacit? di legare il trimero di proteine S nel suo stato pre-fusione mediante ELISA. I risultati sono stati considerati positivi quando il valore OD405 era almeno due volte superiore al bianco. (B) I campioni di plasma sono stati diluiti due volte a partire da 1:10 per testare la loro capacit? di neutralizzare SARS-CoV-2 in vitro. I risultati sono stati considerati positivi quando non ? stato osservato alcun effetto citopatico (-) sulle cellule Vero E6. (C) Il grafico mostra sull'asse Y il Log10 del titolo di legame della proteina S e sull'asse X il Log10 del titolo di neutralizzazione del legame (NOB) del plasma raccolto da pazienti convalescenti da COVID-19. (D) Il grafico mostra sull'asse Y il Log10 del titolo di legame alle proteine S e sull'asse X il Log10 del titolo di neutralizzazione del plasma raccolto da pazienti convalescenti da COVID-19.

Fig. 2. Strategia di gating per la selezione di singole cellule MBC specifiche per le proteine S. A partire dal riquadro in alto a sinistra sul pannello di destra, la strategia di gating mostra: Live / Dead; Morfologia; Singoletti; Cellule CD19 B; CD19 CD27 IgD-; CD19 CD27 IgD-IgM; CD19 CD27 IgD-IgM-S-protein B cellule.

Fig. 3. Identificazione di mAb specifici per la S-proteina di SARS-CoV-2 isolati da donatori convalescenti. (A) Il grafico mostra i supernatanti testati per il legame con le subunit? S1 S2 della proteina S di SARS-CoV-2. La soglia di positivit? ? stata impostata come due volte il valore del bianco (linea tratteggiata). I punti pi? scuri rappresentano mAb che si legano a S1 S2 mentre i punti giallo chiaro rappresentano mAb che non si legano. Il numero totale (N) di surnatanti di cellule B ordinate a singola cellula sottoposti a screening per il legame viene inoltre mostrato per ciascun donatore. (B) Il grafico mostra i supernatanti testati per il legame con la proteina S di SARS-CoV-2 stabilizzata nella sua conformazione pre-fusione. La soglia di positivit? ? stata impostata come due volte il valore del bianco (linea tratteggiata). I punti rossi rappresentano mAb che si legano alla proteina S, mentre i punti rosa rappresentano mAb che non si legano. Il numero totale (N) di surnatanti di cellule B ordinate a singola cellula sottoposti a screening per il legame viene inoltre mostrato per ciascun donatore.

Fig. 4. Neutralizzazione del legame delle proteine S ai recettori delle cellule Vero E6 mediante mAb specifici per le proteine S. (A) Rappresentazione schematica del test di neutralizzazione del legame (NOB) utilizzato per lo screening di mAb specifici per proteine S per la loro capacit? di abrogare l'interazione tra SARS-CoV-2 e i recettori delle cellule Vero E6. (B) Il grafico mostra i supernatanti testati mediante dosaggio NOB. La soglia di positivit? ? stata impostata come il 50% della neutralizzazione del legame (linea tratteggiata). I punti blu scuro rappresentano mAb in grado di neutralizzare l'associazione tra SARS-CoV-2 e recettori sulle cellule Vero E6, mentre i punti blu chiaro rappresentano mAb non neutralizzanti. Il numero totale (N) di supernatanti specifici della proteina S sottoposti a screening mediante test NOB ? mostrato per ciascun donatore.

Fig. 5. Saggio di neutralizzazione di SARS-CoV-2 per mAb specifici per proteine S. (A) Rappresentazione schematica del test di neutralizzazione del virus utilizzato in questo studio per valutare le attivit? funzionali di mAb specifici per proteine S. (B) Immagini rappresentative del microscopio che mostrano l'effetto citopatico di SARS-CoV-2 o l'efficacia protettiva dei supernatanti selezionati sulle cellule Vero E6.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

Salvo ove diversamente definito nel presente documento, i termini scientifici e tecnici usati in relazione alla presente invenzione devono avere i significati come comunemente compresi dall?esperto della tecnica. Inoltre, se non diversamente richiesto dal contesto, i termini singolari includeranno le pluralit? e i termini plurali includeranno il singolare. Generalmente, la nomenclatura usata in connessione con, e le tecniche di, coltura cellulare e tissutale, biologia molecolare, immunologia, microbiologia, genetica e chimica delle proteine e degli acidi nucleici e ibridazione qui descritte sono quelle ben note e comunemente usate nell'arte. I metodi e le tecniche della presente invenzione sono generalmente eseguiti secondo metodi convenzionali ben noti nella tecnica e come descritti in vari riferimenti generali e pi? specifici che sono citati e discussi nel corso della presente descrizione, salvo diversa indicazione. Vedi, ad esempio, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, seconda edizione, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) e Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), qui incorporato come riferimento.

I seguenti termini, se non diversamente indicato, devono intendersi con i seguenti significati:

Il termine "polipeptide" comprende proteine native o artificiali, frammenti di proteine e analoghi polipeptidici di una sequenza proteica. Un polipeptide pu? essere monomerico o polimerico. Il termine "proteina isolata", "polipeptide isolato" o "anticorpo isolato" ? una proteina, un polipeptide o un anticorpo che in virt? della sua origine o fonte di derivazione (1) non ? associato a componenti naturalmente associati che lo accompagnano nel suo stato nativo , (2) ? privo di altre proteine della stessa specie, (3) ? espresso da una cellula di una specie diversa o (4) non ? presente in natura. Pertanto, un polipeptide sintetizzato o sintetizzato chimicamente in un sistema cellulare diverso dalla cellula da cui proviene naturalmente sar? "isolato" dai suoi componenti naturalmente associati. Una proteina pu? anche essere resa sostanzialmente priva di componenti naturalmente associati mediante isolamento, usando tecniche di purificazione delle proteine ben note nella tecnica. Esempi di anticorpi isolati includono un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che ? stato purificato per affinit? usando la proteina S di SARS-CoV-2 o una sua porzione, un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che ? stato sintetizzato da un ibridoma o altra linea cellulare in vitro, e un anticorpo umano anti-proteina S di SARS-CoV-2 derivato da un animale transgenico. Una proteina o un polipeptide ? "sostanzialmente puro", "sostanzialmente omogeneo" o "sostanzialmente purificato" quando almeno circa il 60-75% di un campione presenta un singolo polipeptide. Il polipeptide o la proteina possono essere monomerici o multimerici. Un polipeptide o una proteina sostanzialmente puri comprenderanno tipicamente circa il 50%, 60%, 70%, 80% o 90% W/W di un campione proteico, pi? solitamente circa il 95% e preferibilmente saranno oltre il 99% puri. La purezza o l'omogeneit? delle proteine possono essere indicate mediante un numero di mezzi ben noti nella tecnica, come l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di un campione proteico, seguita dalla visualizzazione di una singola banda di polipeptidi dopo la colorazione del gel con un colorante ben noto nella tecnica. Per alcuni scopi, una risoluzione pi? elevata pu? essere fornita usando HPLC o altri mezzi ben noti nella tecnica per la purificazione. Il termine "frammento di polipeptide" come qui utilizzato si riferisce a un polipeptide che ha una delezione ammino-terminale e/o carbossi-terminale, ma in cui la sequenza amminoacidica rimanente ? identica alle posizioni corrispondenti nella sequenza naturale. In alcune forme di realizzazione, i frammenti sono lunghi almeno 5, 6, 8 o 10 amminoacidi. In altre forme di realizzazione, i frammenti sono lunghi almeno 14, almeno 20, almeno 50 o almeno 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoacidi. Il termine "analogo polipeptidico" come qui utilizzato si riferisce a un polipeptide che comprende un segmento che ha un'identit? sostanziale a una porzione di una sequenza di aminoacidi e che ha almeno una delle seguenti propriet?: (1) legame specifico con la proteina S di SARS-CoV- 2 in condizioni di legame adeguate, (2) capacit? di inibire la proteina S di SARS-CoV-2. Tipicamente, analoghi polipeptidici comprendono una sostituzione conservativa di aminoacidi (o inserimento o eliminazione) rispetto alla sequenza nativa. Gli analoghi in genere sono lunghi almeno 20 o 25 aminoacidi, preferibilmente lunghi o pi? lunghi di almeno 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoacidi, e spesso possono essere lunghi quanto un polipeptide a lunghezza intera. Alcune forme di realizzazione dell'invenzione includono frammenti di polipeptide o anticorpi analoghi polipeptidici con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 sostituzioni dalla sequenza di aminoacidi nella linea germinale. In alcune forme di realizzazione, le sostituzioni di amminoacidi ad un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 o una sua porzione legante l'antigene sono quelle che: (1) riducono la suscettibilit? alla proteolisi, (2) riducono la suscettibilit? all'ossidazione, (3) alterano affinit? di legame per formare complessi proteici e (4) conferiscono o modificano altre propriet? fisico-chimiche o funzionali di tali analoghi, ma mantengono comunque un legame specifico con la proteina S di SARS-CoV-2. Gli analoghi possono includere varie muteine di una sequenza diversa dalla sequenza peptidica normalmente ricorrente. Ad esempio, sostituzioni di amminoacidi singoli o multipli, preferibilmente sostituzioni di amminoacidi conservative, possono essere effettuate nella sequenza normalmente ricorrente, preferibilmente nella porzione del polipeptide al di fuori del dominio o dei domini che formano contatti intermolecolari. Una sostituzione conservativa di aminoacidi non dovrebbe cambiare sostanzialmente le caratteristiche strutturali della sequenza madre; ad esempio, un amminoacido sostitutivo non dovrebbe alterare il foglietto [beta] anti-parallelo che costituisce il dominio di legame delle immunoglobuline che ? presente nella sequenza di origine, o interrompere altri tipi di struttura secondaria che caratterizzano la sequenza di origine. In generale, glicina e prolina non verrebbero utilizzate in un foglietto [beta] anti-parallelo. Esempi di strutture secondarie e terziarie polipeptidiche riconosciute nell'arte sono descritte in Proteins, Structures e Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to protein structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et ai, Nature 354: 105 (1991), qui incorporate per riferimento.

Il termine "SARS-CoV-2" si riferisce al coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2), il tipo di coronavirus che causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), in cui un "anticorpo" viene qui indicato con rispetto all'invenzione, si intende normalmente che pu? anche essere usata una sua porzione legante l'antigene. Una porzione legante l'antigene compete con l'anticorpo intatto per il legame specifico. Vedi in generale, Immunologia fondamentale, cap.7 (Paul, W., ed., Secondo ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporato per riferimento nella sua interezza a tutti gli effetti). Porzioni leganti l'antigene possono essere prodotte mediante tecniche di DNA ricombinante o mediante scissione enzimatica o chimica di anticorpi intatti. In alcune forme di realizzazione, le porzioni leganti l'antigene includono Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb e frammenti di regione determinante la complementarit? (CDR), anticorpi a catena singola (scFv), anticorpi chimerici, diabodies, nanobodies e tutti i polipeptidi che contengono almeno una porzione di un anticorpo sufficiente a conferire al polipeptide un legame specifico all'antigene.

Da N-terminale a C-terminale, sia i domini variabili a catena leggera che quelli a catena pesante comprendono le regioni FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. L'assegnazione di amminoacidi a ciascun dominio nel presente documento ? conforme alle definizioni della convenzione IMGT descritte in Lefranc et al. (2003), Developmental & Comparative Immunology 27.1 (2003): 55-77. Come qui impiegato, un anticorpo cui si fa riferimento mediante numero ? lo stesso di un anticorpo monoclonale ottenuto dalle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) isolate dal donatore dello stesso numero. Ad esempio, l'anticorpo monoclonale MAD0004J08 ? lo stesso anticorpo di uno ottenuto da PBMC isolato dal soggetto identificato dal codice 004, o da un suo subclone.

Come qui usato, un frammento Fd significa un frammento di anticorpo che ? costituito dai domini VH e CH 1; un frammento Fv ? costituito dai domini VL e VH di un singolo braccio di un anticorpo; e un frammento di dAb (Ward et al, Nature 341: 544-546 (1989)) ? costituito da un dominio VH. In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo ? un anticorpo a catena singola (scFv) in cui i domini VL e VH sono accoppiati per formare una molecola monovalente tramite un linker sintetico che consente loro di essere realizzati come una singola catena proteica. (Bird et al, Science 242: 423-426 (1988) e Huston et al, Proc. Natl Acad. ScL USA 85: 5879-5883 (1988)). In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi sono dianticorpi (diabodies), cio? sono anticorpi bivalenti in cui i domini VH e VL sono espressi su una singola catena polipeptidica, ma utilizzando un linker che ? troppo corto per consentire l'associazione tra i due domini sulla stessa catena, quindi costringendo i domini ad accoppiarsi con domini complementari di un'altra catena e creando due siti di legame dell'antigene.

(Vedi ad esempio Holliger P. et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 6444-6448 (1993), e Poljak R. J. et al, Structure 2: 1121-1123 (1994)). In tali forme di realizzazione, i CDR possono essere incorporati come parte di una catena polipeptidica pi? grande, possono essere legati covalentemente a un'altra catena polipeptidica o possono essere incorporati noncovalentemente. In forme di realizzazione aventi uno o pi? siti di legame, i siti di legame possono essere identici tra loro o possono essere diversi.

Come qui usato, il termine "anticorpo umano" indica qualsiasi anticorpo in cui le sequenze di dominio variabile e costante sono sequenze umane o uno qualsiasi dei CDR delle sequenze di dominio variabile sono sequenze umane. Il termine comprende anticorpi con sequenze derivate da geni umani, ma che sono stati modificati, ad es. per ridurre l'eventuale immunogenicit?, aumentare l'affinit?, eliminare le cisteine che potrebbero causare un ripiegamento indesiderato, ecc. Il termine comprende tali anticorpi prodotti in maniera ricombinante in cellule non-umane, che potrebbero impartire una glicosilazione non tipica delle cellule umane. Il termine "anticorpo chimerico" come qui usato indica un anticorpo che comprende regioni di due o pi? anticorpi diversi.

Il termine "epitopo" comprende qualsiasi determinante proteico in grado di legarsi in modo specifico a un'immunoglobulina o al recettore delle cellule T o interagire in altro modo con una molecola. Gli epitopi o i determinanti antigenici sono generalmente costituiti da raggruppamenti superficiali chimicamente attivi di molecole come amminoacidi o catene laterali di carboidrati o zuccheri e generalmente presentano caratteristiche strutturali tridimensionali specifiche, nonch? specifiche caratteristiche di carica. Un epitopo pu? essere "lineare" o "conformazionale". In un epitopo lineare, tutti i punti di interazione tra la proteina e la molecola interagente (come un anticorpo) sono presenti linearmente lungo la sequenza primaria di amminoacidi della proteina. In un epitopo conformazionale, i punti di interazione si verificano attraverso i residui di aminoacidi sulla proteina che sono separati l'uno dall'altro.

Un "anticorpo neutralizzante", un anticorpo con "attivit? neutralizzante", come usato nel presente documento, indica un anticorpo che neutralizza un effetto biologico che il suo bersaglio (ad esempio un agente patogeno o una particella infettiva) pu? avere. Un "anticorpo neutralizzante", un anticorpo con "attivit? neutralizzante", come qui utilizzato ? ad esempio un anticorpo o una sua porzione legante l'antigene che mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) di almeno meno di 100 ng/ml, preferibilmente inferiore a 50 ng/ml, pi? preferibilmente inferiore a 25 ng/ml quando testato in un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2, eseguito ad esempio come descritto qui negli esempi.

Si dice che un anticorpo si lega specificamente a un antigene quando la costante di dissociazione ? ad esempio ? 1 mM, preferibilmente <100 nM e molto preferibilmente <10 nM. La costante di dissociazione pu? essere misurata mediante uno qualsiasi dei metodi disponibili nello stato dell'arte, ad esempio mediante saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA), saggi radioimmunologici (RIA), citometria a flusso, risonanza plasmonica di superficie, come BIACORE (TM). Ad esempio, l'espressione "si lega specificamente a una regione di proteina Spike (S) del coronavirus 2 da sindrome respiratoria grave acuta (SARS-CoV-2)" come qui significa che l'anticorpo o una sua porzione legante l?antigene provoca oltre il 50% di inibizione dell'interazione tra il recettore ACE2 umano e la proteina Spike virale misurata dal test NOB come descritto negli esempi.

Il termine "polinucleotide" come indicato nel presente documento indica una forma polimerica di nucleotidi di almeno 10 basi di lunghezza, sia ribonucleotidi o desossiribonucleotidi o una forma modificata di entrambi i tipi di nucleotidi. Il termine include forme a filamento singolo e doppio. Il termine "polinucleotide isolato" come qui utilizzato indica un polinucleotide di origine genomica, cDNA o sintetica o una loro combinazione, che in virt? della sua origine il "polinucleotide isolato" (1) non ? associato a tutto o a una parte di un polinucleotide con cui il "polinucleotide isolato" si trova in natura, (2) ? operativamente legato a un polinucleotide a cui non ? legato in natura, o (3) non si presenta in natura come parte di una sequenza pi? ampia.

Il termine "nucleotidi presenti in natura" come qui utilizzato include desossiribonucleotidi e ribonucleotidi. Il termine "nucleotidi modificati" come qui utilizzato comprende nucleotidi con gruppi di zuccheri modificati o sostituiti e simili. Il termine "legami oligonucleotidici" a cui si fa riferimento nel presente documento comprende legami oligonucleotidici quali fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e simili. Vedi ad esempio, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res.14: 9081 (1986); Stec et al, J. Am. Chem. Soc.106: 6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res.16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Brevetto U.S. n.5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), le cui informazioni sono incorporate per riferimento. Un oligonucleotide pu? includere un marcatore per il rilevamento, se lo si desidera. Le sequenze "operativamente legate" includono sia sequenze di controllo dell'espressione contigue al gene di interesse sia sequenze di controllo dell'espressione che agiscono in trans o a distanza per controllare il gene di interesse. Il termine "sequenza di controllo dell'espressione" come qui usato indica sequenze di polinucleotidi che sono necessarie per influenzare l'espressione e il processamento delle sequenze di codifica a cui sono legate. Le sequenze di controllo dell?espressione comprendono appropriate sequenze di trascrizione, terminazione, promotore e potenziatore; segnali di elaborazione dell'RNA efficienti come segnali di splicing e poliadenilazione; sequenze che stabilizzano l'mRNA citoplasmatico; sequenze che migliorano l'efficienza della traduzione (ad es.

sequenza di consenso di Kozak); sequenze che migliorano la stabilit? proteica; e quando desiderato, sequenze che aumentano la secrezione di proteine. La natura di tali sequenze di controllo varia a seconda dell'organismo ospite; nei procarioti, tali sequenze di controllo generalmente includono promotore, sito di legame ribosomiale e sequenza di terminazione della trascrizione; negli eucarioti, in genere, tali sequenze di controllo includono promotori e sequenza di terminazione della trascrizione. Il termine "sequenze di controllo" intende includere, come minimo, tutti i componenti la cui presenza ? essenziale per l'espressione e il processamento, e pu? anche includere componenti aggiuntivi la cui presenza ? vantaggiosa, ad esempio sequenze leader e sequenze di partner di fusione. Il termine "vettore", come qui usato, significa una molecola di acido nucleico in grado di trasportare un altro acido nucleico a cui ? stato legato. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un plasmide, cio? un pezzo circolare di DNA a doppio filamento in cui possono essere legati ulteriori segmenti di DNA. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore virale, in cui segmenti di DNA aggiuntivi possono essere legati nel genoma virale. In alcune forme di realizzazione, i vettori sono in grado di replicarsi autonomamente in una cellula ospite in cui sono introdotti (ad esempio vettori batterici che hanno un'origine batterica di replicazione e vettori di mammiferi episomici). In altre forme di realizzazione, i vettori (ad esempio vettori di mammiferi non-episomici) possono essere integrati nel genoma di una cellula ospite al momento dell'introduzione nella cellula ospite, e quindi vengono replicati insieme al genoma ospite. Inoltre, alcuni vettori sono in grado di dirigere l'espressione di geni a cui sono operativamente legati. Tali vettori sono qui indicati come "vettori di espressione ricombinante" (o semplicemente "vettori di espressione").

Il termine "cellula ospite ricombinante" (o semplicemente "cellula ospite"), come qui utilizzato, indica una cellula in cui ? stato introdotto un vettore di espressione ricombinante. Dovrebbe essere chiaro che "cellula ospite ricombinante" e "cellula ospite" significano non solo la cellula soggetto in particolare ma anche la progenie di tale cellula. Poich? alcune variazioni possono presentarsi nelle generazioni successive a causa di mutazioni o influenze ambientali, tale progenie pu?, in effetti, non essere identica alla cellula madre, ma ? ancora inclusa nell'ambito del termine "cellula ospite" come qui utilizzato.

Il termine "identit? della sequenza percentuale" nel contesto delle sequenze nucleotidiche o aminoacidiche indica i residui in due sequenze che sono uguali quando allineati per la massima corrispondenza. La lunghezza del confronto di identit? di sequenza pu? essere su un tratto di almeno circa nove nucleotidi, di solito almeno circa 18 nucleotidi, pi? solitamente almeno circa 24 nucleotidi, tipicamente almeno circa 28 nucleotidi, pi? tipicamente almeno circa 32 nucleotidi, e preferibilmente almeno circa 36, 48 o pi? nucleotidi. Esistono numerosi algoritmi noti nell'arte che possono essere utilizzati per misurare l'identit? della sequenza nucleotidica. Ad esempio, le sequenze di polinucleotidi possono essere confrontate usando FASTA, Gap o Bestfit, che sono programmi disponibili, forniscono allineamenti e identit? della sequenza percentuale delle regioni della migliore sovrapposizione tra le sequenze di query e di ricerca (Pearson, Methods Enzymol.183: 63-98 (1990); Pearson, Methods MoI. Biol.132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol.266: 227-258 (1996); Pearson, J. MoI. Biol 276: 71-84 (1998); incorporato nel presente documento per riferimento). Il termine "somiglianza sostanziale" o "somiglianza sostanziale della sequenza", quando si riferisce a un acido nucleico o ad un suo frammento, o amminoacidico significa che se allineato in modo ottimale con opportuni inserimenti o eliminazioni di nucleotidi con un altro acido nucleico (o il suo filamento complementare), c'? identit? di sequenza di nucleotidi in almeno circa l'85%, preferibilmente almeno circa il 90%, e pi? preferibilmente almeno circa il 95%, 96%, 97%, 98% o 99% delle basi nucleotidiche, come misurato da qualsiasi noto algoritmo di identit? di sequenza, come FASTA, BLAST o Gap, come discusso sopra. Come applicato ai polipeptidi, il termine "identit? sostanziale" significa che due sequenze di peptidi, quando allineate in modo ottimale, come ad esempio dai programmi GAP o BESTFIT che utilizzano pesi di gap predefiniti forniti con i programmi, condividono almeno il 70%, il 75% o l'80% di identit? di sequenza, preferibilmente almeno 90% o 95% di identit? di sequenza e pi? preferibilmente almeno 97%, 98% o 99% di identit? di sequenza. In alcune forme di realizzazione, le posizioni dei residui che non sono identiche differiscono per sostituzioni conservative di aminoacidi. Una "sostituzione conservativa di amminoacidi" ? quella in cui un residuo di amminoacido ? sostituito da un altro residuo di amminoacido avente un gruppo R della catena laterale con propriet? chimiche simili (ad esempio carica o idrofobicit?). In generale, una sostituzione conservativa dell'amminoacido non cambier? sostanzialmente le propriet? funzionali di una proteina. Nei casi in cui due o pi? sequenze di amminoacidi differiscono l'una dall'altra per sostituzioni conservative, l'identit? della sequenza percentuale pu? essere regolata verso l'alto per correggere la natura conservativa della sostituzione. I mezzi per effettuare questa regolazione sono ben noti agli esperti del ramo. Vedi, ad esempio, Pearson, Methods MoI. Biol.243: 307-31 (1994). Esempi di gruppi di aminoacidi che hanno catene laterali con propriet? chimiche simili includono 1) catene laterali alifatiche: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) catene laterali alifaticheidrossiliche: serina e treonina; 3) catene laterali contenenti ammide: asparagina e glutammina; 4) catene laterali aromatiche: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) catene laterali di base: lisina, arginina e istidina; 6) catene laterali acide: acido aspartico e acido glutammico; e 7) catene laterali contenenti zolfo: cisteina e metionina. I gruppi conservativi di sostituzione degli aminoacidi sono: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutammato-aspartato e asparagina-glutammina. In alternativa, una sostituzione conservativa ? qualsiasi cambiamento avente un valore positivo nella matrice di probabilit? logaritmica PAM250 descritta in Gonnet et al, Science 256: 1443-45 (1992), qui incorporata come riferimento. Una sostituzione "moderatamente conservativa" ? qualsiasi modifica che abbia un valore non negativo nella matrice di probabilit? logaritmica PAM250. L'identit? della sequenza per i polipeptidi viene in genere misurata utilizzando un software di analisi della sequenza. Il software di analisi delle proteine abbina le sequenze usando misure di somiglianza assegnate a varie sostituzioni, eliminazioni e altre modifiche, comprese le sostituzioni conservative di aminoacidi. Ad esempio, GCG contiene programmi come "Gap" e "Bestfit" che possono essere utilizzati con parametri predefiniti come specificato dai programmi per determinare l'omologia della sequenza o l'identit? della sequenza tra polipeptidi strettamente correlati, come polipeptidi omologhi di diverse specie di organismi o tra una proteina wild-type e una sua muteina.

Come qui usato, i termini "etichetta" o "etichettati" si riferiscono all'incorporazione di un'altra molecola nell'anticorpo. In una forma di realizzazione, l?etichetta ? un marcatore rilevabile, ad esempio, incorporazione di un amminoacido radiomarcato o attaccamento a un polipeptide di parti biotiniliche che pu? essere rilevato da avidina marcata (ad esempio, streptavidina contenente un marcatore fluorescente o attivit? enzimatica che pu? essere rilevata da metodi ottici o colorimetrici). In un'altra forma di realizzazione, l'etichetta o il marcatore pu? essere terapeutico, ad esempio un farmaco coniugato o tossina. Vari metodi per etichettare polipeptidi e glicoproteine sono noti nella tecnica e possono essere usati.

Anticorpi anti-SARS-CoV-2 umani e loro caratterizzazione

In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che si lega specificamente a una regione di proteina Spike (S) del Corona Virus 2 (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta umana grave (SARS) e inibisce almeno parzialmente il legame della proteina S a un recettore.

In una forma di realizzazione detta regione ? i) nel dominio S1 della proteina S di SARS-CoV-2; o (ii) nel dominio S2 della proteina S di SARS-CoV-2; o (iii) nel trimero di proteine S di SARS-CoV-2 nella sua conformazione pre-fusione o nella sua conformazione post-fusione o in una combinazione di i) con ii) o in una combinazione di i) con iii) o in un combinazione di ii) con iii) o una combinazione di i) con iv) o una combinazione di ii) con iv).

In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene che si lega specificatamente alla proteina S del Corona Virus (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave (SARS), in cui detto anticorpo o sua porzione legante l'antigene provoca pari o superiore al 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% di inibizione dell'interazione tra il recettore ACE2 umano e la proteina virale Spike misurata dal dosaggio NOB, eseguito ad esempio come descritto negli esempi.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua parte legante l'antigene che si lega specificamente alla proteina S del Corona Virus (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave (SARS), in cui detto anticorpo o sua porzione legante l'antigene ha un'attivit? neutralizzante. In particolare, tale anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) inferiore a 100 ng/ml, preferibilmente inferiore a 50, 25, 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 , 2 o 1 ng/ml, quando testati in un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2, ad esempio contro il ceppo 2019-nCoV 2019-nCov/Italy-INMI1, alla dose virale 100TCID50.

Gli acidi nucleici che codificano per la versione integrale o per le porzioni che comprendono un dominio variabile, di catene pesanti e leggere, e le corrispondenti sequenze di amminoacidi dedotte possono essere trovati nell'elenco delle sequenze qui incluso nella descrizione.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente: (a) una sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena pesante che comprende la sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena pesante di un anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05; (b) una sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena leggera che comprende la sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena leggera di un anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05; (c) un dominio variabile di catena pesante di (a) e un dominio variabile di catena leggera di (b); oppure (d) sequenze di amminoacidi del dominio variabile di catena pesante e di catena leggera comprendenti rispettivamente le sequenze di amminoacidi del dominio variabile di catena pesante e di catena leggera, dallo stesso anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 umana, comprendente: (a) una sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena pesante che comprende le sequenze amminoacidiche di CDRl, CDR2 e CDR3 della catena pesante di un anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05; (b) una sequenza di amminoacidi del dominio variabile di catena leggera che comprende le sequenze di amminoacidi CDRl, CDR2 e CDR3 della catena leggera di un anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05: (c) un dominio variabile della catena pesante di (a) e un dominio variabile della catena leggera di (b); o (d) il dominio variabile della catena pesante e il dominio variabile della catena leggera di (c), comprendente sequenze di amminoacidi CDR della catena pesante e della catena leggera dello stesso anticorpo selezionato tra: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2, in cui l'anticorpo comprende sequenze di amminoacidi FR, FR2, FR3 e FR4 da un anticorpo scelto tra: MAD0004J08 , MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2, in cui detto anticorpo comprende una catena pesante di un anticorpo selezionato dal gruppo costituito da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05. In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2, in cui detto anticorpo comprende una catena leggera di un anticorpo selezionato dal gruppo costituito da MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05. In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2, in cui detto anticorpo comprende una catena pesante e una catena leggera dello stesso anticorpo che ? selezionato dal gruppo costituito da MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente domini VL e VH che sono almeno 85%, 90%, 95%, 97%, 98 % o 99% identici nella sequenza di aminoacidi ai domini VL e VH, rispettivamente, di un anticorpo monoclonale selezionato dal gruppo costituito da MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che lega specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 comprendente la catena leggera e la catena pesante che sono almeno 85%, 90%, 95%, 97 %, 98% o 99% identici nella sequenza di aminoacidi alla catena leggera e alla catena pesante, rispettivamente, di un anticorpo monoclonale selezionato dal gruppo costituito da MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

Un tipo di sostituzione amminoacidica che pu? essere fatta ? di cambiare una o pi? cisteine nell'anticorpo, che pu? essere chimicamente reattivo, con un altro residuo, come, senza limitazione, alanina o serina. In una forma di realizzazione, vi ? una sostituzione di una cisteina non canonica. La sostituzione pu? essere effettuata in una regione CDR o regione di framework di un dominio variabile o nel dominio costante di un anticorpo. In alcune forme di realizzazione, la cisteina ? canonica. Un altro tipo di sostituzione amminoacidica che pu? essere fatta ? di cambiare qualsiasi potenziale sito proteolitico nell'anticorpo. Tali siti possono verificarsi in una regione CDR o regione di framework di un dominio variabile o nel dominio costante di un anticorpo. La sostituzione di residui di cisteina e la rimozione di siti proteolitici pu? ridurre il rischio di eterogeneit? nel prodotto anticorpale e quindi aumentarne l'omogeneit?. Un altro tipo di sostituzione degli aminoacidi ? l'eliminazione delle coppie asparagina-glicina, che formano potenziali siti di deamidazione, mediante alterazione di uno o entrambi i residui. In alcune forme di realizzazione, la lisina C-terminale della catena pesante dell'anticorpo anti proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione viene scissa. In varie forme di realizzazione dell'invenzione, le catene pesanti e leggere degli anticorpi anti proteina S di SARS-CoV-2 possono facoltativamente includere una sequenza di segnale.

La classe e la sottoclasse di anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere determinate con qualsiasi metodo noto nell'arte. In generale, la classe e la sottoclasse di un anticorpo possono essere determinate usando anticorpi specifici per una particolare classe e sottoclasse di anticorpi. Tali anticorpi sono disponibili in commercio. La classe e la sottoclasse possono essere determinate mediante ELISA, Western blot (immunoblot) e altre tecniche. In alternativa, la classe e la sottoclasse possono essere determinate sequenziando in tutto o in parte i domini costanti delle catene pesanti e/o leggere degli anticorpi, confrontando le loro sequenze di aminoacidi con le sequenze di aminoacidi note di varie classi e sottoclassi di immunoglobuline, e determinare la classe e la sottoclasse degli anticorpi.

In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo umano anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? una molecola di IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. In una forma di realizzazione, l'anticorpo umano anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? una IgG ed ? una sottoclasse IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. In ancora un'altra forma di realizzazione, la sottoclasse di anticorpi umani ? IgGl.

Affinit? di Legame di Anticorpi anti proteina S di SARS-CoV-2 alla proteina S di SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione dell'invenzione, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 si legano alla proteina S di SARS-CoV-2 con elevata affinit?. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 si legano con elevata affinit? con il dominio S1 della proteina S di SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 si legano al dominio S2 della proteina S di SARS-CoV-2. In un'altra forma di realizzazione, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 si lega alla proteina S di SARS-CoV. L'affinit? di legame e il tasso di dissociazione di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 con la proteina S di SARS-CoV-2 possono essere determinati con metodi noti nell'arte. L'affinit? di legame pu? essere misurata mediante ELISA, RIA, citometria a flusso, risonanza plasmonica di superficie, come BIACORE (TM). Il tasso di dissociazione pu? essere misurato mediante risonanza plasmonica di superficie. Preferibilmente, l'affinit? di legame e il tasso di dissociazione sono misurati mediante risonanza plasmonica di superficie. Pi? preferibilmente, l'affinit? di legame e il tasso di dissociazione sono misurati usando BIACORE (TM). Si pu? determinare se un anticorpo ha sostanzialmente lo stesso KD di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 usando metodi noti nell'arte. L'esempio V esemplifica un metodo per determinare le costanti di affinit? degli anticorpi monoclonali anti proteina S di SARS-CoV-2.

Identificazione di epitopi di proteina S di SARS-CoV-2 riconosciuti da anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2.

L'invenzione fornisce un anticorpo monoclonale anti proteina S di SARS-CoV-2 umano che si lega alla proteina S di SARS-CoV-2 e compete o compete in modo incrociata con e/o lega lo stesso epitopo di un anticorpo selezionato tra MAD0004J08, MAD0100I14 , MAD0102F05. Se due anticorpi competono reciprocamente per il legame con la proteina S di SARS-CoV-2, si dice che competano in modo incrociato.

Si pu? determinare se un anticorpo si lega allo stesso epitopo o se compete in modo incrociato per il legame con un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 usando i metodi noti nell'arte. In una forma di realizzazione, si consente all'anticorpo anti proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione di legarsi alla proteina S di SARS-CoV-2 in condizioni di saturazione e quindi si misura la capacit? dell'anticorpo test di legarsi alla proteina S di SARS-CoV-2. Se l'anticorpo test ? in grado di legarsi alla proteina S di SARS-CoV-2 contemporaneamente all'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2, l'anticorpo test si lega a un epitopo diverso rispetto all'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2. Tuttavia, se l'anticorpo del test non ? in grado di legarsi contemporaneamente alla proteina S di SARS-CoV-2, l'anticorpo test si lega allo stesso epitopo, un epitopo sovrapposto o un epitopo che si trova nelle immediate vicinanze dell'epitopo legato dall'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 umano o il legame dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 umano pu? indurre un cambiamento conformazionale nella proteina S di SARS-CoV-2 che previene o riduce il legame dell'anticorpo in esame. Questo esperimento pu? essere eseguito usando ELISA, RIA, BIACORE (TM), citometria a flusso o altri metodi noti nell'arte.

Per verificare se un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 compete con un altro anticorpo antiproteina S di SARS-CoV-2, si pu? usare il metodo di competizione sopra descritto in due direzioni, cio? determinare se l'anticorpo di riferimento blocca l'anticorpo test e viceversa. In una forma di realizzazione, l'esperimento viene eseguito usando ELISA. I metodi per determinare la KD sono discussi pi? avanti.

In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che inibisce, blocca o riduce il legame della proteina S di SARS-CoV-2 a un recettore, in particolare all'enzima 2 di conversione dell'angiotensina (ACE2 ). In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che inibisce, blocca o diminuisce l'entrata virale mediata dalla proteina S di SARS-CoV-2 nelle cellule. In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che inibisce, blocca o riduce la fusione delle membrane virali e cellulari. In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che riduce la carica virale. In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che inibisce, blocca o diminuisce la gravit? per qualsiasi periodo di tempo di sintomi o condizioni risultanti dall'infezione da SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che inibisce, blocca o diminuisce la gravit? per un giorno, una settimana, un mese, 6 mesi, un anno o per il resto della vita di soggetti di sintomi o condizioni risultanti dall'infezione SARS-CoV-2 del 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100%. In alcune forme di realizzazione, l'invenzione fornisce un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 che pu? eseguire qualsiasi combinazione delle forme di realizzazione precedenti.

In alcune forme di realizzazione, la regione costante mAb degli anticorpi viene modificata per l'estensione dell'emivita e il rischio ridotto di potenziamento anticorpo-dipendente (ADE) della malattia. Ad esempio, per migliorare l'attivit? terapeutica dei mAb possono essere applicati due diversi e alternativi gruppi di mutazioni nei loro domini costanti (M252Y/S254T/T256E secondo Dall'Acqua et al., 2006; M428L/N434S come riportato da Zalevsky et al., 2010).

In alcune forme di realizzazione, al fine di ridurre il rischio di potenziamento anticorpo-dipendente (ADE) di malattia, verranno introdotte mutazioni che eliminano il legame con i recettori Fc nella parte Fc della molecola IgG1 come precedentemente descritto (L234A / L235A come in Hezareh et al., 2001; Beltramello et al., 2010; P329G LALA come in Schlothauer et al., 2016). Tutte queste modifiche possono essere eseguite mediante mutagenesi sito-diretta, ad esempio utilizzando il kit di Site-Directed mutagenesi Agilent Quick-Change II, secondo le raccomandazioni del produttore. In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo comprende le regioni variabili di un anticorpo selezionato tra MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 e uno scheletro di regione costante di IgG1 mutante, che contiene uno o pi? dei seguenti gruppi di mutazioni: L234A/L235A (come in Hezareh et al. , 2001; Beltramello et al., 2010), P329G (come in Schlothauer et al., 2016); M428L/N434S (come in Zalevsky et al., 2010). Preferibilmente l'anticorpo comprende le regioni variabili di un anticorpo selezionato tra MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 e uno scheletro di regione costante di IgG1 mutante, che contiene tutti e tre i gruppi di tali mutazioni.

Acidi nucleici, vettori, cellule ospiti e metodi ricombinanti per la produzione di anticorpi Acidi nucleici

La presente invenzione comprende anche molecole di acido nucleico che codificano anticorpi antiproteina S di SARS-CoV-2 o sue porzioni leganti l'antigene. In alcune forme di realizzazione, diverse molecole di acido nucleico codificano una catena pesante e una catena leggera di immunoglobulina anti-proteina S di SARS-CoV-2. In altre forme di realizzazione, la stessa molecola di acido nucleico codifica una catena pesante e una catena leggera di un'immunoglobulina anti-proteina S di SARS-CoV-2. In una forma di realizzazione, l'acido nucleico codifica un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2, o una sua porzione legante l'antigene, dell'invenzione. In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica che codifica una sequenza di aminoacidi VL comprendente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sostituzioni di amminoacidi conservative e/o 1, 2 o 3 sostituzioni non conservative rispetto alla linea germinale. Le sostituzioni possono trovarsi nelle regioni CDR, nelle regioni di framework o nel dominio costante. In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica una sequenza di aminoacidi VL comprendente una o pi? varianti rispetto alla sequenza germinale che sono identiche alle variazioni trovate nel VL di uno degli anticorpi selezionati tra MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica almeno tre sostituzioni di aminoacidi rispetto alla sequenza germinale trovata nel VL di uno degli anticorpi selezionati tra MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05.

In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza di aminoacidi VL di MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 o una sua variante o porzione. In alcune forme di realizzazione, l'acido nucleico codifica una sequenza di amminoacidi comprendente i CDR a catena leggera di uno di detti anticorpi sopra elencati. In alcune forme di realizzazione, detta porzione ? una porzione contigua comprendente CDR1-CDR3. In alcune forme di realizzazione, l'acido nucleico codifica la sequenza aminoacidica delle CDR a catena leggera di detto anticorpo. In alcune forme di realizzazione, detta porzione codifica una regione contigua da CDR1-CDR3 della catena leggera di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2.

In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica una sequenza di aminoacidi VL che ? almeno il 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% identici a una sequenza amminoacidica VL di una regione VL di uno qualsiasi degli anticorpi MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05. Le molecole di acido nucleico dell'invenzione includono acidi nucleici che si ibridano in condizioni altamente stringenti, come quelle sopra descritte, a una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di una regione VL.

In un'altra forma di realizzazione, l'acido nucleico codifica una catena leggera a lunghezza intera di un anticorpo selezionato MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 o una catena leggera comprendente una mutazione, come quella qui descritta.

In ancora un'altra forma di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica il dominio variabile della catena pesante (VH) che comprende una sequenza genica umana della famiglia VH1, VH3 o VH4 o una sequenza derivata da essa. In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica una o pi? mutazioni di aminoacidi rispetto alla sequenza germinale che sono identiche alle mutazioni di aminoacidi presenti nel VH di uno degli anticorpi monoclonali MAD0004J08, MAD0100I14 e MAD0102F05.

In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica che codifica almeno una porzione della sequenza aminoacidica VH di un anticorpo monoclonale selezionato tra anticorpi monoclonali MAD0004J08, MAD0100I14 e MAD0102F05, tutte e tre le regioni CDR, una porzione contigua tra cui CDR1-CDR3, o l'intera regione VH, con o senza una sequenza di segnale. In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di uno di MAD0004J08, MAD0100I14 e MAD0102F05, o detta sequenza priva della sequenza del segnale. In alcune forme di realizzazione preferite, la molecola di acido nucleico comprende almeno una porzione della sequenza nucleotidica di MAD0004J08, MAD0100I14 o MAD0102F05, o detta sequenza priva della sequenza del segnale. In alcune forme di realizzazione, detta porzione codifica la regione VH (con o senza una sequenza di segnale), una regione CDR3, tutte e tre le regioni CDR, o una regione contigua tra cui CDR1-CDR3.

In alcune forme di realizzazione, la molecola di acido nucleico codifica una sequenza amminoacidica VH che ? identica almeno del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% alle sequenze amminoacidiche di VH di uno qualsiasi di MAD0004J08, MAD0100I14 o MAD0102F05.

Le molecole di acido nucleico dell'invenzione includono acidi nucleici che si ibridano in condizioni altamente stringenti, come quelle sopra descritte, a una sequenza nucleotidica che codifica la sequenza amminoacidica di MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 o che codifica una loro regione VH.

In un'altra forma di realizzazione, l'acido nucleico codifica una catena pesante di lunghezza intera di un anticorpo selezionato tra MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 o una catena pesante avente la sequenza amminoacidica di MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 con o senza una sequenza di segnale o una catena pesante comprendente una mutazione, come una delle varianti discusse nel presente documento. Inoltre, l'acido nucleico pu? comprendere la sequenza nucleotidica di MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05, con o senza una sequenza di segnale, o una molecola di acido nucleico codificante una catena pesante comprendente una mutazione, come una delle varianti discusse nel presente documento.

Una molecola di acido nucleico che codifica la catena pesante o leggera di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 o loro porzioni pu? essere isolata da qualsiasi fonte che produce tale anticorpo. In varie forme di realizzazione, le molecole di acido nucleico sono isolate da una cellula B isolata da un animale immunizzato con la proteina S di SARS-CoV-2 o da una cellula immortalizzata derivata da tale cellula B che esprime o codifica un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2. I metodi per isolare l'mRNA che codifica un anticorpo sono ben noti nella tecnica. Vedi, ad esempio, Sambrook et al. L'mRNA pu? essere usato per produrre cDNA per l'uso nella reazione a catena della polimerasi (PCR) o nella clonazione di cDNA di geni anticorpali. In una forma di realizzazione, la molecola di acido nucleico ? isolata da un ibridoma che ha come partner di fusione una cellula che produce immunoglobuline umane derivante da un animale transgenico non-umano. In una forma di realizzazione ancora pi? preferita, la cellula che produce immunoglobuline umane ? isolata da un animale XENOMOUSE. In un'altra forma di realizzazione, la cellula che produce immunoglobuline umana proviene da un animale transgenico non-umano, non-murino, come descritto sopra. In un'altra forma di realizzazione, l'acido nucleico ? isolato da un animale non-umano, non-transgenico. Le molecole di acido nucleico isolate da un animale non-umano, non-transgenico possono essere usate, ad esempio, per anticorpi umanizzati. In alcune forme di realizzazione, un acido nucleico che codifica una catena pesante di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione pu? comprendere una sequenza nucleotidica che codifica un dominio VH dell'invenzione unita in-frame a una sequenza nucleotidica codificante un dominio costante di catena pesante da qualsiasi fonte. Analogamente, una molecola di acido nucleico codificante per una catena leggera di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione pu? comprendere una sequenza nucleotidica codificante un dominio VL dell'invenzione unito in-frame a una sequenza nucleotidica codificante una catena leggera di dominio costante da qualsiasi fonte. In un ulteriore aspetto dell'invenzione, le molecole di acido nucleico che codificano il dominio variabile delle catene pesanti (VH) e/o leggere (VL) vengono "convertite" in geni anticorpali a lunghezza intera. In una forma di realizzazione, le molecole di acido nucleico che codificano i domini VH o VL vengono convertite in geni anticorpali a lunghezza intera mediante l'inserimento in un vettore di espressione che codifica gi? i domini costanti di catene pesanti (CH) o di catene leggere (CL), in modo tale che il segmento VH ? operativamente legato al segmento/i CH all'interno del vettore e/o il segmento VL ? operativamente legato al segmento CL all'interno del vettore. In un'altra forma di realizzazione, le molecole di acido nucleico che codificano i domini VH e/o VL vengono convertite in geni anticorpali a lunghezza intera collegando, ad esempio, legando, una molecola di acido nucleico che codifica un dominio VH e/o VL a una molecola di acido nucleico che codifica un CH e/o dominio CL utilizzando tecniche biologiche molecolari standard. Sono note nell'arte sequenze nucleotidiche di geni umani del dominio costante di immunoglobuline di catena pesante e leggera. Vedi, ad esempio, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ.91-3242, 1991. Le molecole di acido nucleico che codificano per l'intera lunghezza delle catene pesanti e/o leggere possono quindi essere espresse da una cellula in cui esse sono state introdotte e l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 isolato.

Le molecole di acido nucleico possono essere usate per esprimere in modo ricombinante grandi quantit? di anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2. Le molecole di acido nucleico possono anche essere usate per produrre anticorpi chimerici, anticorpi bispecifici, anticorpi a catena singola, immunoadesine, diabodies, anticorpi mutati e derivati di anticorpi, come descritto pi? avanti. Se le molecole di acido nucleico derivano da un animale non umano, non transgenico, le molecole di acido nucleico possono essere utilizzate per l'umanizzazione dell'anticorpo, anche come descritto di seguito. In un'altra forma di realizzazione, una molecola di acido nucleico dell'invenzione viene utilizzata come una sonda o un primer per PCR per una sequenza anticorpale specifica. Ad esempio, l'acido nucleico pu? essere utilizzato come sonda nei metodi diagnostici o come primer per PCR per amplificare regioni di DNA che potrebbero essere utilizzate, tra l'altro, per isolare molecole di acido nucleico aggiuntive che codificano domini variabili di anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, le molecole di acido nucleico sono oligonucleotidi. In alcune forme di realizzazione, gli oligonucleotidi derivano da domini altamente variabili delle catene pesanti e leggere dell'anticorpo di interesse. In alcune forme di realizzazione, gli oligonucleotidi codificano in tutto o in parte una o pi? delle CDR di anticorpi MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05 o loro varianti come qui descritto.

Vettori

L'invenzione fornisce vettori comprendenti molecole di acido nucleico che codificano la catena pesante di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione o di una sua porzione legante l'antigene. L'invenzione fornisce anche vettori comprendenti molecole di acido nucleico che codificano la catena leggera di tali anticorpi o una loro porzione legante l'antigene. L'invenzione fornisce inoltre vettori comprendenti molecole di acido nucleico che codificano per proteine di fusione, anticorpi modificati, frammenti di anticorpi e loro sonde. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 o le porzioni leganti l?antigene dell'invenzione sono espressi inserendo DNA che codificano catene leggere e pesanti parziali o a lunghezza intera, ottenute come descritto sopra, in vettori di espressione tali che i geni sono operativamente legati alle necessarie sequenze di controllo dell'espressione come sequenze di controllo trascrizionale e traslazionale. I vettori di espressione includono plasmidi, retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati (AAV), virus vegetali come virus del mosaico del cavolfiore, virus del mosaico del tabacco, cosmidi, YACs, episomi derivati dall'EBV e simili. Il gene dell'anticorpo viene legato in un vettore in modo tale che le sequenze di controllo trascrizionale e traslazionale all'interno del vettore servano alla funzione prevista di regolazione della trascrizione e della traduzione del gene dell'anticorpo. Il vettore di espressione e le sequenze di controllo dell'espressione sono scelti per essere compatibili con la cellula host di espressione utilizzata. Il gene della catena leggera dell'anticorpo e il gene della catena pesante dell'anticorpo possono essere inseriti in vettori separati. In una forma di realizzazione, entrambi i geni sono inseriti nello stesso vettore di espressione. I geni dell'anticorpo vengono inseriti nel vettore di espressione con metodi standard (ad es. ligazione di siti di restrizione complementari sul frammento e vettore del gene dell'anticorpo, o ligazione di blunt-end se non sono presenti siti di restrizione). Un vettore conveniente ? quello che codifica una sequenza immunoglobulinica umana CH o CL funzionalmente completa, con opportuni siti di restrizione progettati in modo tale che qualsiasi sequenza VH o VL possa essere facilmente inserita ed espressa, come descritto sopra. In tali vettori, lo splicing di solito si verifica tra il sito del donatore di splice nella regione J inserita e il sito dell'accettore di splice che precede il dominio C umano, e anche nelle regioni di splice che si verificano all'interno degli esoni CH umani. La poliadenilazione e la terminazione della trascrizione si verificano nei siti cromosomici nativi a valle delle regioni codificanti. Il vettore di espressione ricombinante pu? anche codificare un peptide di segnale che facilita la secrezione della catena di anticorpi da una cellula ospite. Il gene della catena di anticorpi pu? essere clonato nel vettore in modo tale che il peptide di segnale sia legato in-frame all'ammino-terminale della catena immunoglobulinica. Il peptide di segnale pu? essere un peptide di segnale di immunoglobulina o un peptide di segnale eterologo (cio? un peptide di segnale proveniente da una proteina non immunoglobulinica). Oltre ai geni della catena di anticorpi, i vettori di espressione ricombinante dell'invenzione recano sequenze regolatorie che controllano l'espressione dei geni della catena di anticorpi in una cellula ospite. Gli esperti del settore comprenderanno che la progettazione del vettore di espressione, inclusa la selezione di sequenze regolatorie, pu? dipendere da fattori quali la scelta della cellula ospite da trasformare, il livello di espressione della proteina desiderato, ecc. Le sequenze regolatorie preferite per l'espressione in cellule ospiti di mammiferi includono elementi virali che determinano alti livelli di espressione proteica nelle cellule di mammiferi, come promotori e/o potenziatori derivati da LTR retrovirali, citomegalovirus (CMV) (come il promotore/potenziatore del CMV), Simian Virus 40 (SV40) (come il promotore/potenziatore SV40), adenovirus (ad es. il promotore tardivo maggiore dell'adenovirus (AdMLP)), polioma e potenti promotori di mammiferi quali immunoglobuline native e promotori di actina. Per un'ulteriore descrizione degli elementi regolatori virali e loro sequenze, si veda ad esempio il brevetto U.S. n.5.168.062, il brevetto U.S. n.

4.510.245 e il brevetto U.S. n. 4.968.615. Sono noti nell'arte metodi per esprimere anticorpi nelle piante, inclusa una descrizione di promotori e vettori, nonch? la trasformazione di piante. Si veda, ad esempio, il brevetto degli Stati Uniti 6.517.529, qui incorporato come riferimento. I metodi per esprimere polipeptidi in cellule batteriche o fungine, ad esempio cellule di lievito, sono anche ben noti nella tecnica. Oltre ai geni della catena anticorpale e alle sequenze regolatorie, i vettori di espressione ricombinante dell'invenzione possono presentare sequenze aggiuntive, come sequenze che regolano la replicazione del vettore nelle cellule ospiti (ad esempio, origini della replicazione) e geni di marcatori selezionabili. Il gene di marcatore selezionabile facilita la selezione delle cellule ospiti in cui ? stato introdotto il vettore (vedere ad esempio i brevetti statunitensi n. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, qui incorporati per riferimento). Ad esempio, in genere il gene di marcatore selezionabile conferisce resistenza ai farmaci, come G418, igromicina o metotrexato, ad una cellula ospite in cui sia stato introdotto il vettore. I geni di marcatori selezionabili preferiti includono il gene diidrofolato reduttasi (DHFR) (per l'uso nelle cellule ospiti dhfr con selezione/amplificazione del metotrexato), il gene neo (per la selezione G418) e il gene della glutammato sintetasi.

Cellule ospiti non-ibridoma e metodi di produzione ricombinante di proteine

Le molecole di acido nucleico che codificano per gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 e i vettori comprendenti queste molecole di acido nucleico possono essere utilizzate per la trasfezione o la trasformazione di una cellula ospite adatta di mammifero, pianta, batterio o lievito. La trasfezione o trasformazione pu? essere effettuata con qualsiasi metodo noto per l'introduzione di polinucleotidi in una cellula ospite. I metodi per l'introduzione di polinucleotidi eterologhi nelle cellule di mammiferi sono ben noti nella tecnica e includono trasfezione mediata da destrano, precipitazione con fosfato di calcio, trasfezione mediata da polibrene, fusione di protoplasti, elettroporazione, incapsulamento dei polinucleotidi nei liposomi e microiniezione diretta del DNA nei nuclei. Inoltre, le molecole di acido nucleico possono essere introdotte nelle cellule di mammiferi mediante vettori virali. I metodi per la trasformazione delle cellule sono ben noti nella tecnica (vedere, ad esempio, i brevetti statunitensi n.4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455, qui incorporati per riferimento). I metodi per trasformare le cellule vegetali sono ben noti nella tecnica, tra cui, ad esempio, trasformazione mediata da Agrobacterium, trasformazione biolistica, iniezione diretta, elettroporazione e trasformazione virale. I metodi per trasformare cellule batteriche e di lievito sono anche ben noti nella tecnica. Le linee cellulari di mammiferi disponibili come host per l'espressione sono ben note nell'arte e includono molte linee cellulari immortalizzate disponibili dalla American Type Culture Collection (ATCC). Questi includono, tra l'altro, cellule ovariche di criceto cinese (CHO), cellule N50, cellule SP2, cellule HEK-293T, cellule NIH-3T3, cellule HeLa, cellule renali di criceto (BHK), cellule renali di scimmia verde africana (COS), cellule di carcinoma epatocellulare umano (ad es. Hep G2), cellule A549 e svariate altre linee cellulari. Le linee cellulari di particolare preferenza vengono selezionate determinando quali linee cellulari hanno livelli di espressione elevati. Altre linee cellulari che possono essere utilizzate sono linee cellulari di insetti, come cellule Sf9 o Sf21. Quando i vettori di espressione ricombinante che codificano i geni degli anticorpi sono introdotti nelle cellule ospite di mammiferi, gli anticorpi vengono prodotti coltivando le cellule ospite per un periodo di tempo sufficiente a consentire l'espressione dell'anticorpo nelle cellule ospite o, pi? preferibilmente, la secrezione dell'anticorpo nel terreno di coltura in cui vengono coltivate le cellule ospite. Gli anticorpi possono essere recuperati dal terreno di coltura usando metodi standard di purificazione delle proteine. Le cellule ospite delle piante includono, ad esempio, Nicotiana, Arabidopsis, lenticchia d'acqua, mais, grano, patate, ecc. Le cellule ospite batteriche includono specie E.coli e Streptomyces. Le cellule ospite del lievito includono Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Inoltre, l'espressione di anticorpi dell'invenzione da linee cellulari di produzione pu? essere potenziata usando una serie di tecniche note. Ad esempio, il sistema di espressione genica della glutamina sintetasi (il sistema GS) ? un approccio comune per migliorare l'espressione in determinate condizioni. Il sistema GS ? discusso in tutto o in parte in relazione ai brevetti europei N.0 216846, 0256 055, 0323997 e 0338 841. ? probabile che gli anticorpi espressi da diverse linee cellulari o in animali transgenici presentino una glicosilazione diversa l'uno dall'altro. Tuttavia, tutti gli anticorpi codificati dalle molecole di acido nucleico forniti nel presente documento o comprendenti le sequenze di amminoacidi fornite nel presente documento fanno parte della presente invenzione, indipendentemente dalla glicosilazione degli anticorpi.

Animali e piante transgenici

Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione possono anche essere prodotti transgenicamente attraverso la generazione di un mammifero o di una pianta che ? transgenica per le sequenze di interesse di catene pesanti e leggere di immunoglobulina e la produzione dell'anticorpo in una forma recuperabile da questi. In connessione con la produzione transgenica nei mammiferi, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere prodotti e recuperati nel latte di capre, mucche o altri mammiferi. Si vedano, ad esempio, i brevetti statunitensi n. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957, qui incorporati come riferimento. In alcune forme di realizzazione, gli animali transgenici non-umani che comprendono loci di immunoglobuline umane sono immunizzati con la proteina S di SARS-CoV-2 o una sua porzione immunogena, come descritto sopra. I metodi per produrre anticorpi nelle piante sono descritti, ad esempio, nei brevetti statunitensi 6.046.037 e 5.959.177, qui incorporati come riferimento.

In alcune forme di realizzazione, animali o piante transgenici non-umani sono prodotti introducendo una o pi? molecole di acido nucleico che codificano un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione nell'animale o nella pianta mediante tecniche transgeniche standard. Si veda il brevetto Hogan e Stati Uniti 6.417.429, supra. Le cellule transgeniche utilizzate per produrre l'animale transgenico possono essere cellule staminali embrionali o cellule somatiche o un uovo fecondato. Gli organismi non umani transgenici possono essere eterozigoti chimerici, non chimerici, e omozigoti nonchimerici. Si veda, ad esempio, Hofian et al. Manipulation the Mouse Embryo: A Laboratory Manual seconda ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999), tutti qui incorporati per riferimento. In alcune forme di realizzazione, gli animali non umani transgenici presentano un'interruzione mirata e una sostituzione con un costrutto bersaglio che codifica una catena pesante e/o una catena leggera di interesse. In una forma di realizzazione, gli animali transgenici comprendono ed esprimono molecole di acido nucleico che codificano catene pesanti e leggere che si legano specificamente alla proteina S di SARS-CoV-2 e preferibilmente al (i) dominio S1 della proteina S di SARS-CoV-2; (ii) dominio S2 della proteina S di SARS-CoV-2; o (iii) entrambi (i) e (ii). In una forma di realizzazione, gli animali transgenici comprendono ed esprimono molecole di acido nucleico che codificano catene pesanti e leggere che si legano specificamente alla proteina S umana di SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, gli animali transgenici comprendono molecole di acido nucleico che codificano un anticorpo modificato come un anticorpo a catena singola, un anticorpo chimerico o un anticorpo umanizzato. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere prodotti in qualsiasi animale transgenico. In una forma di realizzazione, gli animali non umani sono topi, ratti, pecore, maiali, capre, bovini o cavalli. L'animale transgenico non umano esprime detti polipeptidi codificati in sangue, latte, urina, saliva, lacrime, muco e altri fluidi corporei.

Cambio di classe

Un altro aspetto dell'invenzione fornisce un metodo per convertire la classe o sottoclasse di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 in un'altra classe o sottoclasse. In alcune forme di realizzazione, una molecola di acido nucleico che codifica un VL o VH che non include sequenze che codificano CL o CH viene isolata usando metodi ben noti nella tecnica. La molecola di acido nucleico ? quindi operativamente legata a una sequenza nucleotidica che codifica un CL o CH da una classe o sottoclasse di immunoglobuline desiderate. Ci? pu? essere ottenuto utilizzando un vettore o una molecola di acido nucleico che comprende una catena CL o CH, come descritto sopra. Ad esempio, la classe di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 originariamente IgM pu? essere convertita in una IgG. Inoltre, la conversione di classe pu? essere utilizzata per convertire una sottoclasse di IgG in un'altra, ad esempio da IgGl a IgG2. Un altro metodo per produrre un anticorpo dell'invenzione comprendente un desiderato isotipo include le fasi di isolamento di un acido nucleico codificante una catena pesante di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 e un acido nucleico codificante una catena leggera di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2, isolamento della sequenza che codifica la regione VH, ligazione della sequenza VH a una sequenza che codifica un dominio costante della catena pesante dell'isotipo desiderato, espressione del gene della catena leggera e il costrutto della catena pesante in una cellula, e raccolta dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 con l'isotipo desiderato.

Anticorpi modificati

In un'altra forma di realizzazione, pu? essere realizzato un anticorpo di fusione o immunoadesivo che comprende tutto o una porzione di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione legato ad un altro polipeptide. In una forma di realizzazione, solo i domini variabili dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 sono legati al polipeptide. In ancora un'altra forma di realizzazione, il dominio VH di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? legato a un primo polipeptide, mentre il dominio VL di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? legato a un secondo polipeptide che si associa al primo polipeptide in in modo tale che i domini VH e VL possano interagire tra loro per formare un sito legante l'antigene. In ancora un'altra forma di realizzazione, il dominio VH ? separato dal dominio VL da un linker in modo tale che i domini VH e VL possano interagire tra loro (vedi sotto in anticorpi a catena singola). L'anticorpo VH-linker-VL viene quindi legato al polipeptide di interesse. L'anticorpo di fusione ? utile per dirigere un polipeptide verso una cellula o un tessuto che esprima la proteina S di SARS-CoV-2. Il polipeptide pu? essere un agente terapeutico, come una tossina, una chemochina o un'altra proteina regolatrice, oppure pu? essere un agente diagnostico, come un enzima che possa essere facilmente visualizzato, come la perossidasi di rafano. Inoltre, ? possibile creare anticorpi di fusione in cui due (o pi?) anticorpi a catena singola sono legati tra loro. Ci? ? utile se si desidera creare un anticorpo bivalente o polivalente su una singola catena polipeptidica o se si desidera creare un anticorpo bispecifico o nanobody. Per creare un anticorpo a catena singola, (scFv) i frammenti di DNA codificanti VH e VL sono operativamente legati a un altro frammento che codifica un linker flessibile, ad esempio codificante la sequenza aminoacidica (GIy4 -Ser)3, in modo tale che le sequenze VH e VL possano essere espresse come una proteina contigua a catena singola, con i domini VL e VH uniti dal linker flessibile. Si veda, ad esempio, Bird et al, Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). L'anticorpo a catena singola pu? essere monovalente, se vengono utilizzati solo un singolo VH e VL, bivalente, se vengono utilizzati due VH e VL, oppure polivalente, se vengono utilizzati pi? di due VH e VL. Possono essere generati anticorpi bispecifici o polivalenti che si legano specificamente alla proteina S di SARS-CoV-2 e ad un'altra molecola. Anticorpi bispecifici o frammenti leganti l'antigene possono essere prodotti con una variet? di metodi tra cui la fusione di ibridomi o il collegamento di frammenti di Fab. Vedi, ad esempio, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Inoltre, gli anticorpi bispecifici possono essere formati come "diabodies" o "Janusin". In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo bispecifico si lega a due diversi epitopi della proteina S di SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo bispecifico ha una prima catena pesante e una prima catena leggera dall'anticorpo monoclonale MAD0004J08, MAD0100I14 o MAD0102F05 e una catena pesante e catena leggera di anticorpi aggiuntivi. In alcune forme di realizzazione, anche la catena leggera aggiuntiva e la catena pesante provengono da uno degli anticorpi monoclonali sopra identificati, ma sono diverse dalle prime catene pesanti e leggere. In alcune forme di realizzazione, gli anticorpi modificati descritti sopra sono preparati usando uno o pi? domini variabili o regioni CDR da un anticorpo monoclonale anti-proteina S di SARS-CoV-2 umano fornito nel presente documento.

Anticorpi derivatizzati e marcati

Un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 o una sua porzione legante l?antigene dell'invenzione pu? essere derivatizzato o legato a un'altra molecola (ad esempio un altro peptide o proteina). In generale, gli anticorpi o loro porzioni sono derivatizzati in modo tale che il legame con la proteina S di SARS-CoV-2 non sia influenzato negativamente dalla derivatizzazione o dalla marcatura. Di conseguenza, le porzioni di anticorpi e gli anticorpi dell'invenzione sono intesi come comprendenti sia forme intatte che modificate degli anticorpi umani anti-proteina S di SARS-CoV-2 ivi descritti. Ad esempio, un anticorpo o una porzione di anticorpo dell'invenzione pu? essere funzionalmente legato (mediante accoppiamento chimico, fusione genetica, associazione non covalente o altro) a una o pi? altre entit? molecolari, come un altro anticorpo (ad esempio un anticorpo bispecifico o un diabody) , un agente di rilevamento, un agente citotossico, un agente farmaceutico e/o una proteina o un peptide che pu? mediare l'associazione dell'anticorpo o della porzione di anticorpo con un'altra molecola (come una regione del nucleo di streptavidina o un tag di poliistidina). Un tipo di anticorpo derivatizzato viene prodotto mediante crosslinking di due o pi? anticorpi (dello stesso tipo o di tipi diversi, ad esempio per creare anticorpi bispecifici). Agenti di crosslinking adatti includono quelli che sono eterobifunzionali, con due gruppi distintamente reattivi separati da un distanziatore appropriato (ad esempio, estere di m-maleimidobenzoil-N-idrossisuccinimide) o omobifunzionale {ad esempio disuccinimidil suberato). Tali linker sono disponibili presso Pierce Chemical Company, Rockford, II. [0179]. Un altro tipo di anticorpo derivatizzato ? un anticorpo marcato. Agenti di rivelazione utili con i quali un anticorpo o una porzione legante l'antigene dell'invenzione possono essere derivatizzati comprendono composti fluorescenti, tra cui fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, 5-dimetilammina-naptalensolfonil cloruro, fosfori di lantanide e simili. Un anticorpo pu? anche essere marcato con enzimi che sono utili per il rilevamento, come perossidasi di rafano, [beta]-galattosidasi, luciferasi, fosfatasi alcalina, glucosio ossidasi e simili. Quando un anticorpo viene marcato con un enzima rilevabile, viene rilevato aggiungendo reagenti aggiuntivi che l'enzima utilizza per produrre un prodotto di reazione che pu? essere individuato. Ad esempio, quando ? presente l'agente perossidasi di rafano, l'aggiunta di perossido di idrogeno e diaminobenzidina porta a un prodotto di reazione colorato, che ? rilevabile. Un anticorpo pu? anche essere etichettato con biotina, e rilevato attraverso la misurazione indiretta del legame avidina o streptavidina. Un anticorpo pu? anche essere marcato con un epitopo polipeptidico predeterminato riconosciuto da un reporter secondario (ad esempio sequenze di coppie di cerniera di leucina, siti di legame per anticorpi secondari, domini leganti metallo, tags di epitopo). In alcune forme di realizzazione, i marcatori sono attaccati mediante distanziatori di varie lunghezze per ridurre il potenziale ingombro sterico. Un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 pu? anche essere marcato con un amminoacido radiomarcato. Il radiomarcatore pu? essere utilizzato per scopi diagnostici e terapeutici. Ad esempio, il radiomarcatore pu? essere utilizzato per rilevare tumori che esprimono proteine S di SARS-CoV-2 mediante radiografia o altre tecniche diagnostiche. Inoltre, il radiomarcatore pu? essere usato terapeuticamente come tossina per cellule cancerose o tumori. In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 pu? essere marcato con uno ione paramagnetico, radioattivo o florigenico che ? rilevabile durante l'imaging. In alcune forme di realizzazione, lo ione paramagnetico ? cromo (III), manganese (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), nichel (II), rame (II), neodimio (III), samario ( III), itterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), olmio (III) o erbio (III). In altre forme di realizzazione, lo ione radioattivo ? iodio 123, tecnezio 99, indio 111, renio 188, renio 186, rame 67, iodio 131, ittrio 90, iodio 125, astato 211 e gallio 67. In altre forme di realizzazione, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? marcato con un agente di imaging a raggi X come lantanio (III), piombo d'oro (III) (II) e bismuto (III).

Composizioni e kit

L'invenzione riguarda composizioni comprendenti l'anticorpo umano anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione e uno o pi? eccipienti e/o veicolanti farmaceuticamente accettabili.

In alcune forme di realizzazione, la composizione pu? comprendere anticorpi o una loro porzione legante secondo una qualsiasi delle precedenti forme di realizzazione. In alcune forme di realizzazione, il soggetto del trattamento ? un essere umano. In altre forme di realizzazione, il soggetto ? un soggetto veterinario. In alcune forme di realizzazione, un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 antagonista che si lega al dominio S1 e uno che si lega al dominio S2 o porzioni leganti l'antigene di uno o entrambi, vengono entrambi somministrati a un soggetto, insieme o separatamente. In alcune forme di realizzazione gli anticorpi sono in una composizione comprendente un veicolante farmaceuticamente accettabile. In un'altra forma di realizzazione, uno o pi? degli anticorpi antagonisti della proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione sono somministrati in combinazione con uno o pi? anticorpi antagonistici aggiuntivi che legano epitopi diversi sulla proteina S, che legano la proteina S da diversi isolati di SARS-CoV-2 e/o che si legano a diversi stadi di SARS-CoV-2 (vale a dire, virus in stadio iniziale, medio o avanzato). Come qui utilizzato, un "veicolante farmaceuticamente accettabile" indica qualsiasi solvente, mezzo di dispersione, rivestimento, agenti antibatterici e antifungini, agenti ritardanti di assorbimento e isotonici e simili che sono fisiologicamente compatibili. Alcuni esempi di veicolanti farmaceuticamente accettabili sono acqua, soluzione salina, soluzione salina tamponata con fosfato, destrosio, glicerolo, etanolo e simili, nonch? loro combinazioni. In molti casi, sar? preferibile includere nella composizione agenti isotonici, ad esempio zuccheri, polialcoli come mannitolo, sorbitolo o cloruro di sodio. Ulteriori esempi di sostanze farmaceuticamente accettabili sono agenti umettanti o quantit? minori di sostanze ausiliarie quali agenti umettanti o emulsionanti, conservanti o tamponi, che aumentano la durata di conservazione o l'efficacia dell'anticorpo. Le composizioni della presente invenzione possono essere in una variet? di forme, ad esempio forme di dosaggio liquide, semi-solide e solide, come soluzioni liquide (ad esempio soluzioni iniettabili e infusibili), dispersioni o sospensioni, compresse, pillole, polveri, liposomi e supposte. La forma preferita dipende dalla modalit? di somministrazione prevista e dall'applicazione terapeutica. Le composizioni preferite tipiche sono sotto forma di soluzioni iniettabili o infusibili, come composizioni simili a quelle utilizzate per l'immunizzazione passiva nell'uomo. La modalit? di somministrazione preferita ? parenterale (ad es. endovenosa, sottocutanea, intraperitoneale, intramuscolare). In una forma di realizzazione, l'anticorpo viene somministrato per infusione o iniezione endovenosa. In ancora un'altra forma di realizzazione, l'anticorpo viene somministrato mediante iniezione intramuscolare o sottocutanea. Le composizioni terapeutiche sono tipicamente sterili e stabili nelle condizioni di fabbricazione e conservazione. La composizione pu? essere formulata come soluzione, microemulsione, dispersione, liposoma o altra struttura ordinata adatta ad un?alta concentrazione di farmaco. Le soluzioni iniettabili sterili possono essere preparate incorporando l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 nella quantit? richiesta in un solvente appropriato con uno o una combinazione di ingredienti sopra elencati, come richiesto, seguito da sterilizzazione filtrata. Generalmente, le dispersioni vengono preparate incorporando il composto attivo in un veicolante sterile che contiene un mezzo di dispersione di base e gli altri ingredienti richiesti tra quelli elencati sopra. Nel caso di polveri sterili per la preparazione di soluzioni iniettabili sterili, i metodi preferiti di preparazione sono l'essiccazione sotto vuoto e la liofilizzazione che producono una polvere del principio attivo pi? qualsiasi altro ingrediente desiderato a partire da una soluzione precedentemente sterilizzata mediante filtrazione. La fluidit? appropriata di una soluzione pu? essere mantenuta, ad esempio, mediante l'uso di un rivestimento quale lecitina, mediante il mantenimento della dimensione delle particelle richiesta in caso di dispersione e mediante l'uso di tensioattivi. L'assorbimento prolungato di composizioni iniettabili pu? essere ottenuto includendo nella composizione un agente che ritardi l'assorbimento, ad esempio sali di monostearato e gelatina. Gli anticorpi della presente invenzione possono essere somministrati mediante una variet? di metodi noti nell'arte, sebbene per molte applicazioni terapeutiche, la via/modalit? di somministrazione preferita sia l'infusione sottocutanea, intramuscolare o endovenosa. Come compreso dall?esperto della tecnica, la via e/o la modalit? di somministrazione varieranno in base ai risultati desiderati. Altre modalit? di somministrazione comprendono intraperitoneale, intrabronchiale, transmucosale, intraspinale, intrasnoviale, intraaortico, intranasale, oculare, otico, topico e vestibolare. In alcune forme di realizzazione, il composto attivo delle composizioni di anticorpi pu? essere preparato con un veicolante che protegger? l'anticorpo dal rilascio rapido, come una formulazione a rilascio controllato, inclusi impianti, cerotti transdermici e sistemi di rilascio microincapsulati. Si possono usare polimeri biodegradabili e biocompatibili, come etilene vinil acetato, polianidridi, acido poliglicolico, collagene, poliesteri e acido polilattico. Molti metodi per la preparazione di tali formulazioni sono brevettati o generalmente noti agli esperti del ramo. Si vedano, ad esempio, i sistemi di rilascio di farmaci a rilascio sostenuto e controllato (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). L'invenzione fornisce anche composizioni adatte per la somministrazione per inalazione, che comprendono gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 qui descritti. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere convenientemente rilasciati a un soggetto sotto forma di una presentazione spray aerosol da pacchi pressurizzati o da un nebulizzatore, con l'uso di un propellente adatto, ad esempio diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, anidride carbonica o altro gas adatto. Nel caso di un aerosol pressurizzato, l'unit? di dosaggio pu? essere determinata fornendo una valvola per erogare una quantit? misurata. Capsule e cartucce, ad esempio gelatina da utilizzare in un inalatore o in un insufflatore, possono essere formulate come contenenti una miscela in polvere del composto e una base in polvere adatta quale lattosio o amido. Dellamary et al. (2004) J Control Release.; 95 (3): 489-500 descrive formulazioni per il rilascio polmonare di anticorpi. L'invenzione fornisce anche composizioni, adatte per la somministrazione attraverso la mucosa orale, che comprendono l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 qui descritto. Il trasporto transmucosale orale si riferisce al trasporto di un veicolo di trasporto attraverso una membrana di mucosa nella cavit? orale, cavit? faringea o esofago e pu? essere contrapposto, ad esempio, al trasporto orale tradizionale, in cui l'assorbimento di un farmaco si verifica nell'intestino. Di conseguenza, le vie di somministrazione nelle quali gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 vengono assorbiti attraverso la mucosa buccale, sublinguale, gengivale, faringea e/o esofagea sono tutti inclusi in "trasporto transmucosale orale", come tale termine ? ivi impiegato. Per la somministrazione attraverso la mucosa transmucosale, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 pu? essere formulato, ad esempio, come gomme da masticare (vedere il brevetto U.S. n. 5.711.961) o cerotti buccali (vedere ad esempio il brevetto U.S. n. 5.298.256). L'invenzione fornisce anche composizioni adatte per la somministrazione attraverso la mucosa vaginale, che comprendono gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 qui descritti. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione possono essere formulati come supposta vaginale, schiuma, crema, compressa, capsula, unguento o gel. In alcune forme di realizzazione, le composizioni comprendenti gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 sono formulate con permeanti appropriati per la barriera transmucosale che deve essere permeata. Tali permeanti sono generalmente noti nella tecnica e includono, ad esempio, sali biliari per somministrazione trans mucosale e derivati dell'acido fusidico. In alcune forme di realizzazione, un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione pu? essere somministrato per via orale, ad esempio, con un diluente inerte o un veicolo commestibile disponibile. Il composto (e altri ingredienti, se desiderato) pu? anche essere racchiuso in una capsula di gelatina dura o morbida, compresso in compresse o incorporato direttamente nella dieta del soggetto. Per la somministrazione terapeutica orale, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere incorporati con eccipienti e utilizzati sotto forma di compresse ingeribili, compresse buccali, troches, capsule, elisir, sospensioni, sciroppi, wafer e simili. Per somministrare un composto dell'invenzione in modo diverso dalla somministrazione parenterale, pu? essere necessario ricoprire il composto o co-somministrare il composto con un materiale per impedirne l'inattivazione. Ulteriori composti attivi possono anche essere incorporati nelle composizioni. In alcune forme di realizzazione, un anticorpo inibitore anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione ? co-formulato con e/o cosomministrato con uno o pi? agenti terapeutici aggiuntivi, in particolare agenti anti-virali. Questi agenti terapeutici includono, senza limitazione, anticorpi che si legano ad altri bersagli, fotosensibilizzanti, androgeni, estrogeni, agenti antinfiammatori non steroidei, agenti antiipertensivi, analgesici, antidepressivi, antibiotici, agenti antitumorali, anestetici, antiemetici, anti-infettivi, contraccettivi, antidiabetici agenti, steroidi, agenti anti-allergici, agenti chemioterapici, agenti antiemicrania, agenti per smettere di fumare, agenti anti-virali, immunosoppressori, agente trombolitico, agenti ipolipemizzanti e agenti anti-obesit?. Agenti terapeutici includono anche analoghi peptidici che inibiscono l'attivit? della proteina S di SARS-CoV-2, anticorpi o altre molecole che impediscono l'ingresso della SARS-CoV-2 in una cellula, includendo ma non limitando alla prevenzione del legame delle proteine S a un recettore come il recettore ACE2 e agenti che inibiscono l'espressione della proteina S di SARS-CoV-2. In una forma di realizzazione, gli agenti aggiuntivi che inibiscono l'espressione della proteina S di SARS-CoV-2 comprendono un acido nucleico antisense in grado di ibridarsi con un mRNA della proteina S di SARS-CoV-2, come un RNA a forcella o siRNA, acidi nucleici locked (LNA) o ribozimi. Gli acidi nucleici sequenza-specifici in grado di inibire la funzione genica mediante l'interferenza dell'RNA sono ben noti nella tecnica. Tali terapie di combinazione possono richiedere dosaggi pi? bassi dell'anticorpo inibitore anti-proteina S di SARS-CoV-2 e degli agenti co-somministrati, evitando cos? possibili tossicit? o complicanze associate alle varie monoterapie. In alcune forme di realizzazione specifiche, l'/gli agente(i) terapeutico(i) co-formulat(i) con e/o co-somministrato(i) con un anticorpo inibitore anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione ? un agente antimicrobico. Agenti antimicrobici includono antibiotici (ad esempio antibatterici), agenti antivirali, agenti antifungini e agenti antiprotozoari. Esempi non limitativi di agenti antimicrobici sono sulfamidici, trimetoprim-sulfametossazolo, chinoloni, penicilline e cefalosporine. Le composizioni dell'invenzione possono includere una "quantit? terapeuticamente efficace" o una "quantit? profilatticamente efficace" di un anticorpo o porzione legante l'antigene dell'invenzione. Una "quantit? terapeuticamente efficace" si riferisce a una quantit? efficace, ai dosaggi e per i periodi di tempo necessari, per ottenere il risultato terapeutico desiderato. Una quantit? terapeuticamente efficace dell'anticorpo o della porzione di anticorpo pu? variare in base a fattori come lo stato della malattia, l'et?, il sesso e il peso dell'individuo e la capacit? dell'anticorpo o della porzione di anticorpo di ottenere una risposta desiderata nell'individuo. Una quantit? terapeuticamente efficace ? anche una quantit? in cui qualsiasi effetto tossico o dannoso dell'anticorpo o della sua porzione di anticorpo ? compensato dagli effetti terapeuticamente benefici. Una "quantit? profilatticamente efficace" si riferisce a una quantit? efficace, ai dosaggi e per i periodi di tempo necessari, per ottenere il risultato profilattico desiderato. Tipicamente, poich? una dose profilattica viene utilizzata in soggetti prima o in una fase precoce della malattia, la quantit? profilatticamente efficace pu? essere inferiore alla quantit? terapeuticamente efficace. I regimi di dosaggio possono essere regolati per fornire la risposta ottimale desiderata (ad es. una risposta terapeutica o profilattica). Ad esempio, pu? essere somministrato un singolo bolo, diverse dosi divise possono essere somministrate nel tempo o la dose pu? essere ridotta o aumentata in modo proporzionale come indicato dalle esigenze della situazione terapeutica.

? particolarmente vantaggioso formulare composizioni parenterali in forma di unit? di dosaggio per facilit? di somministrazione e uniformit? di dosaggio. La forma di unit? di dosaggio qui utilizzata si riferisce ad unit? fisicamente discrete adatte come dosaggi unitari per i soggetti di mammiferi da trattare; ogni unit? contenendo una quantit? predeterminata di composto attivo calcolata per produrre l'effetto terapeutico desiderato in associazione con il veicolante farmaceutico richiesto. Le specifiche per le forme unitarie di dosaggio dell'invenzione sono dettate e direttamente dipendenti da (a) le caratteristiche uniche dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 o una sua porzione e il particolare effetto terapeutico o profilattico da ottenere, e (b) i limiti inerenti all'arte di mescolare un tale anticorpo per il trattamento della sensibilit? negli individui. Un intervallo esemplificativo e non limitativo per una quantit? terapeuticamente o profilatticamente efficace di un anticorpo o di una porzione di anticorpo dell'invenzione ? compreso tra 0,025 e 50 mg/kg, pi? preferibilmente tra 0,1 e 50 mg/kg, pi? preferibilmente tra 0,1-25, 0,1 e 10 o da 0,1 a 3 mg/kg. In alcune forme di realizzazione, una formulazione contiene 5 mg/nil di anticorpo in un tampone di citrato di sodio 20mM, pH 5,5, NaCl 140mM e polisorbato 80 mg/ml 80. Va notato che i valori di dosaggio possono variare con il tipo e la gravit? della condizione da alleviare. Resta inoltre inteso che per qualsiasi soggetto specifico, i regimi di dosaggio specifici devono essere adeguati nel tempo in base alle esigenze individuali e al giudizio professionale della persona che amministra o supervisiona la somministrazione delle composizioni e che gli intervalli di dosaggio stabiliti nel presente documento sono solo esemplificative non intendono limitare la portata o la pratica della composizione rivendicata. Un altro aspetto della presente invenzione fornisce kit comprendenti un anti-proteina S di SARS-CoV-2, o porzione legante l'antigene, dell'invenzione o una composizione comprendente un tale anticorpo o frammento legante l'antigene. Un kit pu? includere, oltre all'anticorpo o alla composizione, agenti diagnostici o terapeutici. Un kit pu? anche includere istruzioni per l'uso in un metodo diagnostico o terapeutico, nonch? materiale di imballaggio come, ma non limitato a, ghiaccio, ghiaccio secco, polistirolo, schiuma, plastica, cellofan, pellicola termoretraibile, pellicola a bolle, cartone e amido di arachidi. In una forma di realizzazione, il kit include l'anticorpo o una composizione che lo comprende e un agente diagnostico che pu? essere usato in un metodo descritto di seguito. In ancora un'altra forma di realizzazione, il kit include l'anticorpo o una composizione che lo comprende e uno o pi? agenti terapeutici che possono essere utilizzati in un metodo descritto di seguito.

In una forma di realizzazione, gli anticorpi o loro porzione legante o una composizione comprendente tali anticorpi secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte sono per l'uso nella prevenzione o trattamento di pazienti infetti da Coronavirus, in particolare infetti da SARS-CoV-2. L'uso di tali anticorpi e composizioni di mAb specifici per SARS-CoV-2 include, ma non ? limitato a immunizzazione passiva in persone a rischio di contrarre l'infezione (ad esempio personale professionalmente esposto, persone che vivono in aree endemiche) e terapia di casi acuti, ricoverati in ospedale o no. L'invenzione riguarda anche composizioni per inibire l'infezione virale, e in particolare l'infezione da Coronavirus, pi? in particolare l'infezione da SARS-CoV-2 in un mammifero comprendente una quantit? di un anticorpo dell'invenzione in combinazione con una quantit? di un agente antivirale, in cui il quantit? dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 e dell'agente antivirale sono insieme efficaci nell'inibire la replicazione virale, l'infezione virale di nuove cellule o le cariche virali.

Metodi di utilizzo diagnostici

Gli anticorpi secondo l'invenzione possono servire anche come strumenti diagnostici per la rilevazione rapida dell'infezione da SARS-CoV-2. In un altro aspetto, l'invenzione fornisce metodi diagnostici. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per rilevare la proteina S di SARS-CoV-2 in un campione biologico in vitro o in vivo. In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per diagnosticare la presenza o la posizione dei virus SARS-CoV-2 in un soggetto che ne abbia bisogno. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere utilizzati in un saggio immunologico convenzionale, tra cui, a titolo esemplificativo, un ELISA, un RIA, citometria a flusso, immunoistochimica tissutale, Western blot (immunoblot) o immunoprecipitazione. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione possono essere usati per rilevare la proteina S di SARS-CoV-2 da umani. L'invenzione fornisce un metodo per rilevare la proteina S di SARS-CoV-2 in un campione biologico comprendente il contatto del campione biologico con un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione e il rilevamento dell'anticorpo legato. In una forma di realizzazione, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? marcato direttamente con un marcatore rilevabile. In un'altra forma di realizzazione, l'anticorpo antiproteina S di SARS-CoV-2 (il primo anticorpo) ? senza marcatore e viene marcato un secondo anticorpo o altra molecola che pu? legare l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2. Come ? noto a un esperto del ramo, viene scelto un secondo anticorpo in grado di legare in modo specifico la specie e la classe particolari del primo anticorpo. Ad esempio, se l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? una IgG umana, l'anticorpo secondario potrebbe essere una IgG anti-umana. Altre molecole che possono legarsi agli anticorpi includono, senza limitazione, la proteina A e la proteina G, entrambe disponibili in commercio, ad esempio da Pierce Chemical Co. Esempio di campioni biologici da utilizzare nei metodi diagnostici qui descritti sono urina, feci, sangue, saliva, biopsie, liquido cerebrospinale, lavaggio rinofaringeo e orofaringeo, espettorato, aspirato endotracheale, lavaggio broncoalveolare o altri campioni biologici ottenibili da un soggetto umano.

Marcatori adatti per l'anticorpo o l'anticorpo secondario sono stati descritti sopra e includono vari enzimi, gruppi prostetici, materiali fluorescenti, materiali luminescenti e materiali radioattivi. Esempi di enzimi adatti includono perossidasi di rafano, fosfatasi alcalina, [beta]-galattosidasi o acetilcolinesterasi; esempi di complessi di gruppi prostetici adatti includono streptavidina/biotina e avidina/biotina; esempi di materiali fluorescenti adatti includono umbelliferone, fluoresceina, fluoresceina isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilammina fluoresceina, dansil cloruro o ficoeritrina; un esempio di materiale luminescente include il luminol. In altre forme di realizzazione, la proteina S di SARS-CoV-2 pu? essere analizzata in un campione biologico mediante un test immunologico di competizione che utilizza gli standard della proteina S di SARS-CoV-2 marcati con una sostanza rilevabile e un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 S senza marcatura. In questo test, il campione biologico, gli standard marcati di proteina S di SARS-CoV-2 e l'anticorpo antiproteina S di SARS-CoV-2 vengono combinati e viene determinata la quantit? di standard marcato di proteina S di SARS-CoV-2 legato all'anticorpo senza marcatura. La quantit? di proteina S di SARS-CoV-2 nel campione biologico ? inversamente proporzionale alla quantit? di standard di proteina S di SARS-CoV-2 marcata legata all'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2. Si possono usare i test immunologici sopra descritti per una serie di scopi. Ad esempio, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per rilevare la proteina S di SARS-CoV-2 in cellule in coltura o come test diagnostico in campioni di un soggetto. I metodi diagnostici secondo qualsiasi forma di realizzazione qui descritta possono essere seguiti da un'ulteriore passaggio di somministrazione nel soggetto positivo di un farmaco anti-SARS-CoV-2, ad esempio secondo uno qualsiasi dei metodi terapeutici qui descritti.

Metodi terapeutici d'uso

In un'altra forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un metodo per neutralizzare SARS-CoV-2 somministrando un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 a un paziente che ne abbia bisogno. Qualsiasi tipo di anticorpo qui descritto pu? essere usato terapeuticamente. In varie forme di realizzazione, l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 ? un anticorpo umano. In alcune forme di realizzazione, l'anticorpo, o sua porzione legante l'antigene, si lega al dominio S1 della proteina S SARS-CoV-2. In alcune forme di realizzazione, il paziente ? un paziente umano. In alternativa, il paziente pu? essere un mammifero infetto da SARS-CoV-2. In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce metodi per trattare, aiutare nel trattamento, prevenire o aiutare nella prevenzione dell'infezione da SARS-CoV-2 e condizioni o disturbi risultanti da tale infezione, in un soggetto somministrando al soggetto una quantit? terapeuticamente efficace o profilatticamente efficace di un anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 dell'invenzione. Anticorpi e loro frammenti leganti l'antigene che sono antagonisti della proteina S di SARS-CoV-2 possono essere usati come terapeutici per l'infezione da SARS-CoV-2. L'anticorpo pu? essere somministrato localmente o sistemicamente. Le composizioni terapeutiche comprendenti anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere somministrate al soggetto, ad esempio, per via orale, nasale, vaginale, vestibolare, rettale, attraverso l'occhio o attraverso la via polmonare, in una variet? di prodotti farmaceutici forme di dosaggio accettabili, che saranno familiari agli esperti del ramo. Ad esempio, gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono essere somministrati per via nasale usando un dispositivo insufflatore nasale. Gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 possono anche essere somministrati all'occhio in una formulazione in gel. Ad esempio, prima della somministrazione, una formulazione contenente gli anticorpi anti-proteina S di SARS-CoV-2 pu? essere convenientemente contenuta in un contenitore per dose unitaria a due compartimenti, un compartimento contenente un preparato liofilizzato di anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 e l'altro compartimento contenente una soluzione salina normale. Il dosaggio dell'anticorpo sar? generalmente compreso nell'intervallo 0,1-100 mg/kg, pi? preferibilmente 0,5-50 mg/kg, pi? preferibilmente 1-20 mg/kg, e ancora pi? preferibilmente 1-10 mg/kg. La concentrazione sierica dell'anticorpo pu? essere misurata con qualsiasi metodo noto nell'arte.

In un'altra forma di realizzazione, gli anticorpi della presente invenzione vengono somministrati al soggetto in combinazione con altri agenti terapeutici. In una forma di realizzazione, gli agenti terapeutici aggiuntivi possono trattare da soli i sintomi dell'infezione da SARS-CoV-2 e possono opzionalmente sinergizzare con gli effetti degli anticorpi. L'agente aggiuntivo che viene somministrato pu? essere selezionato da un esperto nella tecnica per il trattamento dell'infezione. La co-somministrazione dell'anticorpo con un agente terapeutico aggiuntivo (terapia di combinazione) comprende la somministrazione di una composizione comprendente l'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 e l'agente terapeutico aggiuntivo, nonch? la somministrazione di due o pi? composizioni separate, una comprendente l?anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 e le altre che comprendono gli agenti terapeutici aggiuntivi. Inoltre, sebbene la co-somministrazione o la terapia di combinazione generalmente significhino che l'anticorpo e gli agenti terapeutici aggiuntivi vengono somministrati contemporaneamente, essa comprende anche casi in cui l'anticorpo e altri agenti terapeutici vengono somministrati in momenti diversi. Ad esempio, l'anticorpo pu? essere somministrato una volta ogni tre giorni, mentre l'agente terapeutico aggiuntivo viene somministrato una volta al giorno. In alternativa, l'anticorpo pu? essere somministrato prima o dopo il trattamento con l'agente terapeutico aggiuntivo, ad esempio dopo che un paziente ha fallito la terapia con l'agente aggiuntivo. Allo stesso modo, la somministrazione dell'anticorpo anti-proteina S di SARS-CoV-2 pu? essere somministrata prima o dopo un'altra terapia.

L'anticorpo e uno o pi? agenti terapeutici aggiuntivi (la terapia di combinazione) possono essere somministrati una volta, due o almeno per periodo di tempo fino a quando la condizione non viene trattata, palliata o curata. Preferibilmente, la terapia di combinazione viene somministrata pi? volte. La terapia di combinazione pu? essere somministrata da tre volte al giorno a una volta ogni sei mesi. La somministrazione pu? essere basata su un programma come tre volte al giorno, due volte al giorno, una volta al giorno, una volta ogni due giorni, una volta ogni tre giorni, una volta alla settimana, una volta ogni due settimane, una volta al mese, una volta ogni due mesi, una volta ogni tre mesi e una volta ogni sei mesi, o pu? essere somministrata continuamente tramite una minipompa. La terapia di combinazione pu? essere somministrata per via orale, mucosa, buccale, intranasale, inalabile, endovenosa, sottocutanea, intramuscolare o parenterale. In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un metodo per trattare, prevenire o alleviare i sintomi di una malattia mediata da SARS-CoV-2 in un soggetto che ne abbia bisogno, comprendente la fase di somministrazione a detto soggetto di un anticorpo o di una porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle precedenti forme di realizzazione, comprendente inoltre almeno un agente terapeutico aggiuntivo selezionato dal gruppo costituito da: (a) uno o pi? anticorpi del gruppo costituito da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05:

e

(b) uno o pi? anticorpi che legano specificamente la proteina S di SARS-CoV-2 di una pluralit? di ceppi SARS-CoV-2; e/o

(c) uno o pi? anticorpi neutralizzanti che non legano la proteina S di SARS-CoV-2; e/o

(d) uno o pi? agenti che legano il recettore della proteina S di SARS-CoV-2; e/o

(e) uno o pi? agenti antivirali.

In alcuni aspetti, l'invenzione fornisce un kit per il trattamento, la prevenzione o l'alleviamento dei sintomi di una patologia mediata da SARS-CoV-2 in un soggetto che ne abbia bisogno, comprendente a) uno o pi? anticorpi del gruppo costituito da: MAD0004J08, MAD0100I14, MAD0102F05; e

(e) uno o pi? agenti antivirali.

L'anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene descritto nel presente documento pu? anche essere usato vantaggiosamente come reagente diagnostico in un metodo in vitro per rilevare in un campione biologico precedentemente ottenuto da un paziente (come ad esempio un siero, un plasma, un campione di sangue o qualsiasi altro materiale biologico adatto, ottenuto dal paziente, preferibilmente un essere umano) anticorpi anti-Coronavirus, in particolare anticorpi SARS-Cov-2. Questi anticorpi possono essere trovati nel campione biologico ottenuto dal paziente ad esempio a seguito di una precedente esposizione al virus o perch? un anticorpo monoclonale dell'invenzione era stato precedentemente somministrato al paziente per scopi terapeutici o profilattici o di ricerca. Pertanto, un kit diagnostico comprendente l'anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene dell'invenzione ivi descritto, come reagente specifico, rientra anch'esso nell'ambito dell'invenzione, detto kit essendo in particolare progettato per il rilevamento e/o la quantificazione, in un campione biologico precedentemente ottenuto da un paziente, di anticorpi anti-coronavirus.

L'anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene qui descritti possono anche essere usati vantaggiosamente per la progettazione di un vaccino contro il coronavirus. Come divulgato in Rappuoli, Rino et al. ?Reverse vaccinology 2.0: Human immunology instructs vaccine antigen design.? The Journal of experimental medicine vol. 213,4 (2016): 469-81.

doi:10.1084/jem.20151960?, mAb umano pu? essere utilizzato per identificare antigeni/epitopi protettivi. La caratterizzazione strutturale del complesso Ab-antigene pu? essere utilizzata per istruire la progettazione dell'antigene. Pertanto, rientra nell?ambito dell?invenzione anche un metodo o l'uso dell'anticorpo monoclonale umano o della sua porzione legante l'antigene descritto nel presente documento per la progettazione di un vaccino contro un coronavirus, in particolare contro il virus SARS-Cov-2.

L'anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene descritto nel presente documento pu? essere utilizzato per la preparazione di mimotopi, come ad esempio anticorpi antiidiotipo, peptidi, proteine S troncate o forme artificiali o altri, dotati della capacit? di evocare gli anticorpi ivi descritti. Tra questi, gli anticorpi anti-idiotipo sono preferiti. Gli anticorpi anti-idiotipo sono anticorpi specificamente diretti contro l'idiotipo degli anticorpi neutralizzanti utilizzati per la loro fabbricazione, e quindi sono in grado di imitare gli epitopi chiave che riconoscono. La produzione di anticorpi anti-idiotipo ? condotta mediante metodologie di per s? note che non necessitano di ulteriori spiegazioni dettagliate nella presente. Pertanto, anche i mimotopi, preferibilmente anticorpi anti-idiotipo, diretti contro un anticorpo dell'invenzione rientrano nell'ambito dell'invenzione. L'anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene nel presente documento pu? essere usato per la fabbricazione di anticorpi anti-idiotipo secondo metodi di per s? noti. Gli anticorpi anti-idiotipo sono anticorpi specificamente diretti verso l'idiotipo degli anticorpi neutralizzanti ad ampio raggio usati per prepararli e come tali sono in grado di imitare gli epitopi chiave che riconoscono. Pertanto, anche gli anticorpi anti-idiotipo diretti contro un anticorpo monoclonale dell'invenzione sono inclusi nell'ambito dell'invenzione.

La seguente sezione sperimentale ? fornita a solo scopo illustrativo e non limitativo e non intende limitare l'ambito dell'invenzione come definito nelle rivendicazioni allegate. Le rivendicazioni sono parte integrante della descrizione.

ESEMPI

1. Materiali e metodi

Iscrizione di donatori convalescenti da SARS-COV-2 e raccolta di campioni umani Questo lavoro deriva da una collaborazione con l'Istituto Nazionale per le Malattie Infettive, IRCCS - Lazzaro Spallanzani Roma (IT) e Azienda Ospedaliera Universitaria Senese, Siena (IT) che ha fornito campioni dai donatori convalescenti da SARS-CoV-2 che hanno dato il loro consenso scritto. Lo studio ? stato approvato dai comitati etici locali (Parere 18_2020 a Roma e Parere 17065 a Siena) e condotto secondo le buone pratiche cliniche in conformit? con la dichiarazione di Helsinki (Consiglio europeo 2001, Codice dei regolamenti federali degli Stati Uniti, ICH 1997). Questo studio ? stato non in cieco e non randomizzato.

Isolamento di cellule mononucleate di sangue periferico umano (PBMC) da donatori convalescenti da SARS-CoV-2

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dal sangue intero trattato con eparina mediante centrifugazione con gradiente di densit? (Lympholyte-H; Cedarlane). Dopo la separazione, i PBMC sono stati: i) congelati in azoto liquido alla concentrazione di 10x 10<6 >PBMC/flaconcino usando DMSO al 10% in siero bovino fetale inattivato a caldo (FBS) o ii) risospeso in RPMI 1640 (EuroClone) integrato con FBS al 10% (EuroClone), 2 mmol/L L-glutammina, 2 mmol/L penicillina e 50 ?g/mL di streptomicina (EuroClone). Le cellule sono state coltivate per 18 ore a 37?C con il 5% di CO2. I campioni di sangue sono stati sottoposti a screening per SARS-CoV-2 RNA e per anticorpi contro HIV, HBV e HCV.

Espressione e purificazione di SARS-CoV-2 S-kok

Il vettore di espressione codificante per ectodominio S pre-fusione (Wrapp, Daniel et al. " Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation." Science (New York, NY) vol.

367.6483 (2020): 1260-1263. Doi: 10.1126 / science.abb250) ? stato usato per trasfettare transientemente le cellule Expi293F (Thermo Fisher #A14527) usando Expifectamine (Thermo Fisher # A14525). La proteina ? stata purificata da surnatanti di cellule filtrate usando resina NiNTA (GE Healthcare n. 11-0004-58), eluita con imidazolo 250 mM (Sigma Aldrich n.56750), dializzata contro PBS e quindi conservata a 4 ?C prima dell'uso.

Sorting a singola cellula di cellule B di memoria per proteina S di SARS-CoV-2<+>.

Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) di donatori convalescenti da SARS-CoV-2 sono state colorate con Fixable Aqua Live/Dead (Invitrogen; Thermo Scientific) in 100 ?L di volume finale diluito 1:500 a temperatura ambiente (RT). Dopo 20 minuti di incubazione le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e i legami non specifici sono stati saturati con 50 ?L di siero di coniglio al 20% in PBS. Dopo 20 minuti di incubazione a 4 ?C le cellule sono state lavate con PBS e colorate con proteina S di SARS-CoV-2 marcata con Strep-Tactin?XT DY-488 (iba-lifesciences cat # 2-1562-050) per 30 minuti a 4 ?C. Dopo l'incubazione ? stata utilizzata la seguente miscela di colorazione CD19 V421 (BD cat #562440), IgM PerCP-Cy5.5 (BD cat# 561285), CD27 PE (BD cat# 340425), IgD-A700 (BD cat# 561302), CD3 PE-Cy7 (BioLegend cat# 300420), CD14 PE-Cy7 (BioLegend cat# 301814), CD56 PE-Cy7 (BioLegend cat# 318318) e le cellule sono state incubate a 4 ?C per altri 30 minuti. Gli MBC colorati sono stati selezionati in una sola cellula con un BD FACSAria III (BD Biosciences) in piastre da 384 pozzetti contenenti cellule di alimentazione 3T3-CD40L e sono stati incubati con IL-2 e IL-21 per 14 giorni, come descritto nello stato dell'arte.

Saggio ELISA con subunit? S1 e S2 della proteina S di SARS-CoV-2

La presenza di anticorpi anti-S1 e S2 nei supernatanti di coltura di cellule di memoria B monoclonali specifiche della proteina S ? stata valutata mediante un test ELISA implementato con l'uso di un kit commerciale (ELISA Starter Accessory Kit, Catalogue No. E10; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA). In breve, i plates per microtitolazione a fondo piatto da 384 pozzetti (Nunc MaxiSorp 384-well plates; Sigma-Aldrich) sono state rivestite con 25 ?l/pozzetto di antigene (miscela 1:1 di subunit? S1 e S2, 1 ?g/ml ciascuna; The Native Antigen Company, Oxford, United Kingdom) diluito in tampone di rivestimento (soluzione di carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6) e incubato per una notte a 4 ?C. Le piastre sono state quindi lavate tre volte con 100 ?l/pozzetto di tampone di lavaggio (50 mM Tris Buffered Saline (TBS) pH 8,0, 0,05% Tween-20) e saturata con 50 ?l/pozzetto di tampone di blocco contenente albumina di siero bovino (BSA) (50 mM TBS pH 8,0, 1% BSA, 0,05% Tween-20) per 1 ora (h) a 37 ?C. Dopo ulteriore lavaggio, i campioni diluiti 1:5 in tampone bloccante sono stati aggiunti al plate. Il buffer di blocco ? stato utilizzato come bianco. Dopo un'incubazione di 1 ora a 37 ?C, i plates sono stati lavati e incubati con 25 ul/pozzetto di anticorpo secondario (anticorpo policlonale di capra anti-frammento IgG-Fc umano coniugato con perossido di rafano (HRP), diluito 1:10.000 in tampone bloccante, N. di catalogo A80-104P; (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) per 1 ora a 37 ?C. Dopo tre lavaggi, 25 ?l/pozzetto di substrato TMB One Component HRP Microwell (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) sono stati aggiunti e incubati 10-15 minuti a temperatura ambiente al buio. Lo sviluppo del colore ? stato terminato con l'aggiunta di 25 ?l/pozzetto 0,2M H2SO4. L'assorbanza ? stata misurata a 450 nm in un lettore di microplates Varioskan Lux (Thermo Fisher Scientific). La soglia per la positivit? del campione ? stata impostata al doppio dellla OD del bianco.

Saggio ELISA con trimero di pre-fusione della proteina S di SARS-CoV-2

Il saggio ELISA ? stato utilizzato per rilevare mAb specifici per la proteina S di SARS-CoV-2 e per sottoporre a screening il plasma dai donatori convalescenti da SARS-CoV-2. Le piastre da 384 pozzetti (piastre da 384 pozzetti Nunc MaxiSorp; Sigma Aldrich) sono state rivestite con 3 ?g/mL di streptavidina diluita in PBS e incubata a RT durante la notte. Le piastre sono state quindi rivestite con proteina S di SARS-CoV-2 a 3 ?g/mL e incubate per 1 ora a temperatura ambiente. 50 ?L/pozzetto di tampone di saturazione (PBS/BSA 1%) sono stati usati per saturare il legame non specifico e le piastre sono state incubate a 37 ?C per 1 ora senza CO2. I supernatanti sono stati diluiti 1:5 in PBS/BSA 1%/Tween200,05% in 25 ?L/pozzetto di volume finale e incubati per 1 ora a 37 ?C senza CO2. Come anticorpo secondario sono stati usati 25 ?L/pozzetto di anti- IgG umana di capra coniugata con fosfatasi alcalina (Sigma-Aldrich) e IgA (Jackson Immuno Research). Inoltre, sono state analizzate in duplicato dodici diluizioni seriali doppie di plasma da pazienti con infezione da SARS-CoV-2. I campioni di plasma sono stati diluiti in PBS/BSA 1%/Tween20 0,05% (25 ?L/pozzetto di volume finale; diluizione iniziale 1:80) e incubati per 1 ora a 37 ?C senza CO2. Successivamente, 25 ?L/pozzetto di anti-IgG umana di capra coniugata con fosfatasi alcalina (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti per 1 ora a 37 ?C senza CO2. I pozzetti sono stati lavati tre volte tra ogni passaggio con PBS/BSA 1%/Tween200,05%. Il PNPP (p-nitrofenil fosfato) (Thermo Fisher) ? stato usato come substrato solubile per rilevare gli anticorpi monoclonali specifici della proteina S di SARS-CoV-2 e la reazione finale ? stata misurata utilizzando il lettore Varioskan Lux (Thermo Fisher Scientific) a una lunghezza d'onda di 405 nm. I campioni sono stati considerati positivi se la densit? ottica a 405 nm (OD405) era due volte il bianco.

Virus SARS-CoV-2 e infezione cellulare

Le cellule Vero E6 della linea di rene di scimmia verde africana (American Type Culture Collection [ATCC] #CRL-1586) sono state coltivate nel Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) -Glucosio alto (Euroclone, Pero, Italia) integrato con 2 mM di L-glutammina (Lonza, Milano, Italia), miscela di penicillina (100 U/mL) -streptomicina (100 ?g/mL) (Lonza, Milano, Italia) e siero bovino fetale al 10% (FBS) (Euroclone, Pero, Italia). Le cellule sono state mantenute a 37 ?C, in un ambiente umidificato al 5% di CO2 e passate ogni 3-4 giorni.

Il virus wild-type SARS-CoV-22019 (2019-nCoV ceppo 2019-nCov / Italy-INMI1) ? stato acquistato da European Virus Archive goes Global (EVAg, Istituto Spallanzani, Roma). Per la propagazione del virus, i monostrati di cellule Vero E6 sub-confluenti sono stati preparati in beute T175 (Sarstedt) contenenti terreno ad alto contenuto di glucosio D-MEM. Per la titolazione e per i test di neutralizzazione di SARS-CoV-2, Vero E6 sono stati seminate in piastre da 96 pozzetti (Sarstedt) ad una densit? di 1,5x104 cellule/pozzetto il giorno prima del test.

Saggio di neutralizzazione del legame (NOB)

Per studiare il legame della proteina Spike di COVID-19 con i recettori della superficie cellulare abbiamo sviluppato un saggio per valutare il legame specifico della proteina S ricombinante con le cellule bersaglio e la sua neutralizzazione.

A questo scopo la proteina Spike stabilizzata ? stata accoppiata a Streptavidin-PE (eBioscience #12-4317-87, Thermo Fisher) per 30 minuti a 4 ?C e quindi incubata con cellule VERO E6. Il legame ? stato valutato mediante citometria a flusso. Le cellule VERO E6 stabilizzate con la proteina Spike hanno un'alta affinit? (dati non mostrati).

Per valutare il contenuto di anticorpi neutralizzanti nei sieri o nei supernatanti della coltura di cellule B, due microlitri di SARS-CoV-2 Spike-Streptavidin-PE a 15-30 ?g/ml in PBS-1% FCS sono stati miscelati con due microlitri di varie diluizioni di sieri o supernatanti di colture di cellule B in piastre a 96 pozzetti con fondo a U. Dopo incubazione a 37 ?C per 1 ora, sono state aggiunte 25x103 cellule Vero E6 sospese in due microlitri di PBS 1% FCS e incubate per 1 ora aggiuntiva a 4 ?C. Proteine e anticorpi non legati sono stati rimossi e la fluorescenza di PE legata alle cellule ? stata analizzata con un citometro a flusso FACScantoII (Becton Dickinson). I dati sono stati analizzati utilizzando il pacchetto software di analisi dei dati FlowJo (TreeStar, USA). La neutralizzazione specifica ? stata calcolata come segue: NOB (%) = 1 - (Valore MFI campione - valore MFI in background)/(Valore MFI controllo negativo - valore MFI in background).

Propagazione e titolazione virali

Il virus SARS-CoV-2 ? stato propagato nelle cellule Vero E6 in coltura con DMEM ad alto glucosio integrato con FBS al 2%, 100 U/mL di penicillina, 100 ?g/mL di streptomicina. Le cellule sono state seminate a una densit? di 1x106 cellule/mL in beute T175 e incubate a 37 ?C, 5% CO2 per 18-20 ore. Il monostrato cellulare subconfluente ? stato quindi lavato due volte con soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Le cellule sono state inoculate con 3,5 ml di virus opportunamente diluiti in DMEM 2% FBS a una molteplicit? di infezione (MOI) di 0,001 e incubate per 1 ora a 37 ?C in un ambiente umidificato con 5% di CO2. Alla fine dell'incubazione, 50 ml di DMEM 2% FBS sono stati aggiunti alle beute. Le colture infette sono state incubate a 37 ?C, 5% di CO2 e monitorate quotidianamente fino a quando circa l'80-90% delle cellule ha mostrato un effetto citopatico (CPE). I supernatanti di coltura sono stati quindi raccolti, centrifugati a 4 ?C a 1.600 rpm per 8 minuti per consentire la rimozione di detriti cellulari, aliquotati e conservati a -80 ?C come stock virale raccolto. I titoli virali sono stati determinati in monostrati confluenti di cellule Vero E6 seminate in piastre da 96 pozzetti usando un dosaggio della dose infettiva di coltura tissutale del 50% (TCID50). Le cellule sono state infettate con diluizioni seriali 1:10 (da 10-1 a 10-11) del virus e incubate a 37 ?C, in atmosfera umidificata con il 5% di CO2. Le piastre sono state monitorate quotidianamente per la presenza di CPE indotto da SARS-CoV-2 per 4 giorni usando un microscopio ottico invertito. Il titolo del virus ? stato stimato secondo la formula di Spearman-Karber (14) e definito come il reciproco della massima diluizione virale che porta ad almeno il 50% di CPE nei pozzetti inoculati.

Saggio semi-quantitativo di neutralizzazione basato su SARS-CoV-2 vivo

Per valutare il titolo di neutralizzazione dei campioni di plasma anti-SARS-CoV-2 da donatori convalescenti da COVID-19, ? stato utilizzato un metodo di neutralizzazione semiquantitativo. I campioni di plasma sono stati inattivati a caldo per 30 minuti a 56 ?C e diluiti 2 volte in serie a partire da diluizione 1:10 a 1:2,560, quindi miscelati con un eguale volume di soluzione virale contenente 100 TCID50 di SARS-CoV-2 diluiti in D-MEM a glucosio alto 2% FBS. Dopo 1 ora di incubazione a 37 ?C, 5% CO2, 100 ?l della miscela plasma-virus ad ogni diluizione sono stati passati ad una piastra cellulare contenente un monostrato di cellule Vero E6 subconfluente. Le piastre sono state incubate per 3 giorni a 37 ?C in un ambiente umidificato con il 5% di CO2, quindi ? stato controllato lo sviluppo di CPE mediante un microscopio ottico invertito. Il reciproco della massima diluizione plasmatica che ha provocato un'inibizione di CPE superiore al 50% ? stato definito titolo di neutralizzazione.

Saggio qualitativo di neutralizzazione basato su SARS-CoV-2 vivo

L'attivit? di neutralizzazione dei supernatanti di coltura da cellule di memoria B monoclonali specifiche per la proteina S ? stata valutata mediante un test qualitativo di neutralizzazione basato su virus-vivo contro una diluizione di un punto dei campioni. I supernatanti sono stati miscelati in un rapporto 1:3 con una soluzione virale di SARS-CoV-2 contenente 25 TCID50 di virus (volume finale: 30 ?l). Dopo 1 ora di incubazione a 37 ?C, 5% CO2, 25 ?l di ciascuna miscela di surnatante virale sono stati aggiunti ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente un monostrato di cellule Vero E6 sub-confluente. Dopo un'incubazione di 2 ore a 37 ?C, la miscela siero-virus ? stata rimossa e 100 ml di DMEM 2% FBS sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate per 3 giorni a 37 ?C in un ambiente umidificato con il 5% di CO2, quindi esaminate per CPE mediante un microscopio ottico invertito. L'assenza o la presenza di CPE ? stata definita dal confronto di ciascun pozzetto con il controllo positivo (campione di plasma che mostra alta attivit? neutralizzante di SARS-CoV-2 in cellule Vero E6 infette) e controllo negativo (campione di siero umano negativo per SARS-CoV-2 in Saggi ELISA e di neutralizzazione).

Espressione ricombinante di mAb neutralizzanti

Gli mAb neutralizzanti SARS-CoV-2 selezionati vengono clonati ed espressi come descritto (Tiller et al, 2008; Giuliani et al., 2018). In breve, le sequenze di regioni variabili a catena pesante e leggera vengono recuperate da cellule B selezionate mediante single-cell lisate. Gli ampliconi recuperati vengono clonati in vettori Ig?1, Ig? e Ig? adatti per la trasformazione di DH5? di Escherichia coli. I plasmidi purificati vengono utilizzati per esprimere in modo transiente IgG a lunghezza intera nelle cellule Expi293. I supernatanti delle colture cellulari Expi293 sono raccolti e testati per valutare l'espressione di mAb mediante saggi ELISA e la potenza di mAb mediante saggi di neutralizzazione.

Sequenziamento di mAbs selezionati

Le sequenze di DNA che codificano per i mAb neutralizzanti identificati mediante il NOB e i saggi di neutralizzazione sopra descritti sono recuperate mediante trascrizione inversa e amplificazione Polymerase Chain Reaction (PCR) come indicato in Tiller et al., 2008. Gli ampliconi sono sottoposti al sequenziamento Sanger del filamento forward e reverse per ottenere la regione di codifica della parte variabile delle catene pesanti e leggere.

Sequenze di aminoacidi predette:

TABELLE

Tabella 1. Analisi del plasma dei donatori convalescenti da SARS-CoV-2. I titoli di legame alle proteine S del plasma per ciascun soggetto sono stati misurati mediante saggi ELISA. L'attivit? di neutralizzazione ? stata rilevata mediante NOB e mediante neutralizzazione dell'infezione da SARS-CoV-2 delle cellule Vero.

Tabella 2. Analisi dei MBC specifici per proteina S di donatori convalescenti da SARS-CoV-2.

La tabella riporta il numero di MBC specifici per le proteine S che sono stati ordinati e sottoposti a screening (per il legame mediante ELISA e per funzionalit? mediante NOB e neutralizzazione virale) per ogni soggetto arruolato in questo studio.

Caratteristiche biologiche degli anticorpi sequenziati specifici

Le caratteristiche biologiche dell'anticorpo qui identificato come MAD0004J08

SOMMARIO:

> MAD0004J08 mostra una concentrazione inibitoria del 100% (IC100) di 7,2 ng/mL quando testato per un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2 autentico (ceppo 2019-nCoV 2019-nCov / Italy-INMI1) alla dose virale 100TCID50.

> MAD0004J08 mostra un legame specifico con il dominio S1 della proteina Spike di SARS-CoV-2.

> MAD0004J08 mostra il 53% di inibizione dell'interazione tra il recettore ACE2 umano e la proteina Spike virale misurata mediante test NOB.

> La catena pesante MAD0004J08 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGHV1-69 e IGHJ4. La catena pesante MAD0004J08 mostra un tasso di mutazione inferiore al 4% rispetto ai geni germinali.

> La catena leggera MAD0004J08 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGKV3-11 e IGKJ4. La catena leggera MAD0004J08 mostra un tasso di mutazione inferiore al 2% rispetto ai geni germinali.

> La regione variabile della catena pesante di MAD0004J08 ? stata clonata con successo ed espressa in uno scheletro della regione costante della catena pesante di IgG1 mutante, che contiene i seguenti tre gruppi di mutazioni: L234A/L235A come in Hezareh et al., 2001; Beltramello et al., 2010; P329G come in Schlothauer et al., 2016; M428L/N434S come in Zalevsky et al., 2010. Le mutazioni L234A/L235A e P329G riducono il rischio di potenziamento della malattia dipendente dall'anticorpo (ADE), mentre le mutazioni M428L/N434S aumentano l'emivita dell'anticorpo. Questa versione mutante ? indicata come "il mutante" nel presente documento.

Le caratteristiche biologiche dell'anticorpo qui identificate come MAD0100I14

SOMMARIO:

> MAD0100I14 mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) di 23,7 ng/mL quando testato per un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2 autentico (ceppo 2019-nCoV 2019-nCov / Italy-INMI1) alla dose virale 100TCID50.

> MAD0100I14 mostra un legame specifico con il dominio S1 della proteina Spike di SARS-CoV-2.

> MAD0100I14 mostra un'inibizione del 98% dell'interazione tra il recettore ACE2 umano e la proteina virale di Spike misurata mediante dosaggio NOB.

> La catena pesante MAD0100I14 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGHV1-58 e IGHJ3. La catena pesante MAD0100I14 mostra un tasso di mutazione inferiore al 4% rispetto ai geni germinali.

> La catena leggera MAD0100I14 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGKV3-20 e IGKJ1. La catena leggera MAD0100I14 mostra un tasso di mutazione inferiore al 2% rispetto ai geni germinali.

> La regione variabile della catena pesante MAD0100I14 ? stata clonata con successo ed espressa in uno scheletro della regione costante della catena pesante di IgG1 mutante, che contiene i seguenti tre gruppi di mutazioni: L234A/L235A come in Hezareh et al., 2001; Beltramello et al., 2010; P329G come in Schlothauer et al., 2016; M428L/N434S come in Zalevsky et al., 2010. Le mutazioni L234A/L235A e P329G riducono il rischio di potenziamento della malattia dipendente dall'anticorpo (ADE), mentre le mutazioni M428L/N434S aumentano l'emivita dell'anticorpo. Questa versione mutante ? indicata come "il mutante" nel presente documento.

Caratteristiche biologiche dell'anticorpo qui identificato come MAD0102F05

SOMMARIO:

> MAD0102F05 mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) di 8,1 ng/mL quando testato per un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2 autentico (ceppo 2019-nCoV 2019-nCov / Italy-INMI1) alla dose virale 100TCID50.

> MAD0102F05 mostra un legame specifico con il dominio S1 della proteina Spike di SARS-CoV-2.

> MAD0102F05 mostra l'inibizione dell'89% dell'interazione tra il recettore ACE2 umano e la proteina virale Spike misurata mediante dosaggio NOB.

> La catena pesante MAD0102F05 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGHV3-53 e IGHJ6. La catena pesante MAD0102F05 mostra un tasso di mutazione inferiore al 3% rispetto ai geni germinali.

> La catena leggera MAD0102F05 ? composta dal riarrangiamento dei geni immunoglobulinici IGKV1-17 e IGKJ1. La catena leggera MAD0102F05 mostra un tasso di mutazione inferiore al 5% rispetto ai geni germinali.

> La regione variabile della catena pesante MAD0102F05 ? stata clonata con successo ed espressa in uno scheletro della regione costante della catena pesante di IgG1 mutante, che contiene i seguenti tre gruppi di mutazioni: L234A/L235A come in Hezareh et al., 2001; Beltramello et al., 2010; P329G come in Schlothauer et al., 2016; M428L/N434S come in Zalevsky et al., 2010. Le mutazioni L234A/L235A e P329G riducono il rischio di potenziamento della malattia dipendente dall'anticorpo (ADE), mentre le mutazioni M428L/N434S aumentano l'emivita dell'anticorpo. Questa versione mutante ? indicata come "il mutante" nel presente documento.

Elenco delle sequenze nella descrizione

Sequenza dell'anticorpo qui identificato come MAD0004J08

SEQUENZE AMMINOACIDICHE DI MAD0004J08:

>SEQ ID NO:1 CDR 1 of variable domain of Heavy chain of MAD0004J08

GGTFSSYT

>SEQ ID NO:2 CDR 2 of variable domain of Heavy chain of MAD0004J08

IIPILDRV

>SEQ ID NO:3 CDR 3 of variable domain of Heavy chain of MAD0004J08 CARRAIDSDTYVEQSHFDYW

>SEQ ID NO:4 CDR 1 of variable domain of Light chain of MAD0004J08

QSVSSY

>SEQ ID NO:5 CDR 2 of variable domain of Light chain of MAD0004J08 this sequence is not included in the sequence listing because is less than 4 amino acid

DAS (Asp-Ala-Ser)

>SEQ ID NO:6 CDR 3 of variable domain of Light chain of MAD0004J08

CQQPLTF

>SEQ ID NO:7 variable domain of Heavy chain of MAD0004J08 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILDRVMY AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAIDSDTYVEQSHFDYWGQGTL VTVSSAS

>SEQ ID NO:8 variable domain of Light chain of MAD0004J08 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPSLLIYDASNRATGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQPLTFGGGTKVEIKRT

>SEQ ID NO:9 Heavy chain of MAD0004J08 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPG QGLEWMGRIIPILDRVMYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRAIDS DTYVEQSHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

>SEQ ID NO:10 Light chain of MAD0004J08

GWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP SLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQPLTFGGGTKVEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI MAD0004J08:

> SEQ ID NO:11 MAD0004J08_heavy_chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:12 MAD0004J08_heavy chain_Variable domain CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGG TCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATACTATCAGCTGGGTGCGACAG GCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGATAGAGTAA TGTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCAC AGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCG AGACGGGCCATTGATTCCGACACCTATGTTGAACAATCCCACTTTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCC

> SEQ ID NO:13 MAD0004J08_heavy chain_Constant domain ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAAT GA

> SEQ ID NO:14 MAD0004J08_heavy chain_Complete ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCCA GGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTC TCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATACTATCAGCTGGGTGCGACAGG CCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGATAGAGTAAT GTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCAC AGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCG AGACGGGCCATTGATTCCGACACCTATGTTGAACAATCCCACTTTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTTGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTG CACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA

> SEQ ID NO:15 MAD0004J08 light chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:16 MAD0004J08_light_chain Variable Domain GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACTCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCA CCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAA ACCTGGCCAGGCTCCCAGCCTCCTCATCTATGATGCCTCCAACAGGGCCACTGGCATCC CAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT AGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGA CCAAGGTGGAGATCAAACGAACT

> SEQ ID NO:17 MAD0004J08_light_chain ConstantRegion GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

> SEQ ID NO:18 MAD0004J08_light_kappa_complete_seq ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCGA AATTGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACTCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACC TGGCCAGGCTCCCAGCCTCCTCATCTATGATGCCTCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAG CCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGA GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC GCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA GGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

Sequenza dell?anticorpo qui identificato come MAD0100I14

SEQUENZE AMMINOACIDICHE DI MAD0100I14:

>SEQ ID NO:19 CDR 1 of variable domain of Heavy chain of MAD0100I14

GFTFTSSA

>SEQ ID NO:20 CDR 2 of variable domain of Heavy chain of MAD0100I14

IVVGSGNT

>SEQ ID NO:21 CDR 3 of variable domain of Heavy chain of MAD0100I14 CAAPYCSSTTCHDGFDIW

>SEQ ID NO:22 CDR 1 of variable domain of Light chain of MAD0100I14

QSVSSSY

>SEQ ID NO:23 CDR 2 of variable domain of Light chain of MAD0100I14 questa sequenza non ? inclusa nella lista delle sequenze perch? contiene meno di 4 amminoacidi

GAS (Gly-Ala-Ser)

>SEQ ID NO:24 CDR 3 of variable domain of Light chain of MAD0100I14 CQQYGRSPWTF

>SEQ ID NO:25 variable domain of Heavy chain of MAD0100I14 VQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTSSAMQWVRQARGQRLEWIGWIVVGSGNTDY VQKFQGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAPYCSSTTCHDGFDIWGQGTMVT VSSAS

>SEQ ID NO:26 variable domain of Light chain of MAD0100I14 EIVMTQSPGTLSLAPGERATLSCRASQSVSSSYLGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGRSPWTFGQGTKVEIKRT

>SEQ ID NO:27 Heavy chain of MAD0100I14 MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTSSAMQWVRQAR GQRLEWIGWIVVGSGNTDYVQKFQGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAPYC SSTTCHDGFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

>SEQ ID NO:28 Light chain of MAD0100I14 GWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPGTLSLAPGERATLSCRASQSVSSSYLGWYQQKPGQ APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGRSPWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI MAD0100I14:

> SEQ ID NO:29 MAD0100I14_heavy_chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:30 MAD0100I14_heavy chain_Variable domain CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCAGTGAAGG TCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCACCTTTACTAGCTCTGCTATGCAGTGGGTGCGACAG GCTCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGATGGATCGTCGTTGGCAGTGGTAACACAG ACTACGTGCAGAAGTTCCAAGGAAGAGTCACCATTACCAGGGACATGTCCACAAGCAC AGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCG GCACCATATTGTAGTAGTACCACCTGCCATGATGGCTTTGATATTTGGGGCCAAGGGAC AATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCC

> SEQ ID NO:31 MAD0100I14_heavy chain_Constant domain ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAAT GA

> SEQ ID NO:32 MAD0100I14_heavy chain_Complete ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCCA GGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCAGTGAAGGTC TCCTGCAAGGCTTCTGGATTCACCTTTACTAGCTCTGCTATGCAGTGGGTGCGACAGGC TCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGATGGATCGTCGTTGGCAGTGGTAACACAGAC TACGTGCAGAAGTTCCAAGGAAGAGTCACCATTACCAGGGACATGTCCACAAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGC ACCATATTGTAGTAGTACCACCTGCCATGATGGCTTTGATATTTGGGGCCAAGGGACA ATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCTGTGACGGTCTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCT TCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAG CCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCT CTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA

> SEQ ID NO:33 MAD0100I14 light chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:34 MAD0100I14_light_chain Variable Domain GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGGCTCCAGGGGAAAGAGCCA CCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGGCTGGTACCAGCA GAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGC ATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCA GACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGGTCACCGTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACT

> SEQ ID NO:35 MAD0100I14_light_chain ConstantRegion GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

> SEQ ID NO:36 MAD0100I14_light_kappa_complete_seq ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCGA AATTGTGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGGCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGGCTGGTACCAGCAGA AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCAT CCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGA CTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGGTCACCGTGGAC GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCT GAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGC CTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCT GCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGA GTGTTAG

Sequenza dell?anticorpo qui identificato come MAD0102F05

SEQUENZE AMMINOACIDICHE DI MAD0102F05:

>SEQ ID NO:37 CDR 1 of variable domain of Heavy chain of MAD0102F05

GFTVSINY

>SEQ ID NO:38 CDR 2 of variable domain of Heavy chain of MAD0102F05

IYSGGST

>SEQ ID NO:39 CDR 3 of variable domain of Heavy chain of MAD0102F05 CAAPLLWADSYYMDVW

>SEQ ID NO:40 CDR 1 of variable domain of Light chain of MAD0102F05

QDIRNN

>SEQ ID NO:41 CDR 2 of variable domain of Light chain of MAD0102F05 questa sequenza non ? compresa nella lista delle sequenze perch? contiene meno di 4 amminoacidi

AAS (Ala-Ala-Ser)

>SEQ ID NO:42 CDR 3 of variable domain of Light chain of MAD0102F05 CLQHNSYLWTF

>SEQ ID NO:43 variable domain of Heavy chain of MAD0102F05 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSINYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAPLLWADSYYMDVWGKGTTVTVS SAS

>SEQ ID NO:44 variable domain of Light chain of MAD0102F05 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNNLGWFQQKPGKAPKRLIYAASTLQRGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYLWTFGQGTKVEIKRT

>SEQ ID NO:45 Heavy chain of MAD0102F05

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSINYMSWVRQAP GKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAPLLW ADSYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

>SEQ ID NO:46 Light chain of MAD0102F05 MGWSCIILFLVATATGVHSAIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNNLGWFQQKPGK APKRLIYAASTLQRGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYLWTFGQGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* SEQUENZE NUCLEOTIDICHE DI MAD0102F05:

> SEQ ID NO:47 MAD0102F05_heavy_chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:48 MAD0102F05_heavy chain_Variable domain GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAC TCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTATCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAG GCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGCACATACT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT GTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGGCC CCCTTACTATGGGCCGACTCCTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCA CCGTCTCCTCAGCCTCC

> SEQ ID NO:49 MAD0102F05_heavy chain_Constant domain ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACGGTCTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGA CCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGA GCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAAT GA

> SEQ ID NO:50 MAD0102F05_heavy chain_Complete ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCGA GGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTATCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGCGGTGGTAGCACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGGCCCC CTTACTATGGGCCGACTCCTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACC GTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCT GTGACGGTCTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTG TCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGA CCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACA AAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT CCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC CCCGGGTAAATGA

> SEQ ID NO:51 MAD0102F05 light chain LeaderSequence ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCC

> SEQ ID NO:52 MAD0102F05_light_chain Variable Domain GCCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAC CATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATAATTTAGGCTGGTTTCAGCAGAAA CCAGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTACAACGTGGAGTCC CATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCT GCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCTTTGGACAT TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACT

> SEQ ID NO:53 MAD0102F05_light_chain ConstantRegion GTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACA GCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACG AGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

> SEQ ID NO:54 MAD0102F05_light_kappa_complete_seq ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCCGC CATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATAATTTAGGCTGGTTTCAGCAGAAACC AGGGAAAGCCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTACAACGTGGAGTCCCA TCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGC AGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCATAATAGTTACCTTTGGACATTC GGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAAT AACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA GCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCG AAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG TTAG

Sequenze della proteina S

Sono note nell'arte sequenze della glicoproteina di superficie del coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave. Le sequenze di domini S1 ("Spike_rec_bind") e S2 ("glicoproteina S2 Coronavirus") si trovano nel GenBank con l'ID QHD43416.1.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Un anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che si lega specificamente a una regione della proteina Spike (S) del Corona Virus 2 umano (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave (SARS).

2. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo la rivendicazione 1, in cui detta regione ? i) nel dominio S1 della proteina S diSARS-CoV-2; o (ii) nel dominio S2 della proteina S di SARS-CoV-2; o (iii) nel trimero di proteine S di SARS-CoV-2 nella sua conformazione pre-fusione; o (iv) nel trimero di proteine S di SARS-CoV-2 nella sua conformazione post-fusione o in una sua combinazione.

3. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detto anticorpo o una sua porzione legante l'antigene fornisce un'inibizione uguale o superiore al 25% del legame tra il recettore ACE2 umano e la proteina virale Spike (S) come misurata mediante saggio NOB.

4. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto anticorpo o una sua porzione legante l'antigene mostra una concentrazione inibente al 100% (IC100) inferiore a 100 ng/ml quando testato in un test di neutralizzazione in vitro contro il virus SARS-CoV-2.

5. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, comprendente un dominio variabile della catena pesante (VH) e un dominio variabile della catena leggera (VL), in cui detti VH e VL comprendono le seguenti regioni che determinano la complementarit? (CDR):

-CDR1 di VH con ID SED NO: 1,

-CDR2 di VH con ID SED NO: 2,

-CDR3 di VH con ID SED NO: 3,

-CDR1 di VL con ID SED NO: 4,

-CDR2 di VL avente la sequenza DAS (Asp-Ala-Ser) e

-CDR3 di VL con SED ID NO: 6;

o

-CDR1 di VH con SED ID NO: 19,

-CDR2 di VH con SED ID NO: 20,

-CDR3 di VH con SED ID NO: 21,

-CDR1 di VL con SED ID NO: 22,

-CDR2 di VL avente la sequenza GAS (Gly-Ala-Ser) e

-CDR3 di VL con SED ID NO: 24;

o

-CDR1 di VH con SED ID NO: 37,

-CDR2 di VH con SED ID NO: 38,

-CDR3 di VH con SED ID NO: 39,

-CDR1 di VL con SED ID NO: 40,

-CDR2 di VL avente la sequenza AAS (Ala-Ala-Ser) e

-CDR3 di VL con SED ID NO: 42.

6. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, comprendente un dominio variabile della catena pesante (VH) e un dominio variabile della catena leggera (VL),

in cui detto VH ha SED ID NO: 7 e detto VL ha SED ID NO: 8; o

in cui detto VH ha SED ID NO: 25 e detto VL ha SED ID NO: 26; o

in cui detto VH ha SED ID NO: 43 e detto VL ha SED ID NO: 44.

7. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto VL e detto VH sono identici per almeno l'85% nella sequenza di aminoacidi, preferibilmente almeno per il 95%, pi? preferibilmente pe almeno il 99% a

VH con SED ID NO: 7 e detto VL con SED ID NO: 8; o

VH con SED ID NO: 25 e detto VL con SED ID NO: 26; o

VH con SED ID NO: 43 e detto VL con SED ID NO: 44.

8. Anticorpo monoclonale umano o una sua porzione legante l'antigene che competono per il legame con la proteina Spike (S) del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave con qualsiasi anticorpo o porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.

9. Anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico di un'infezione da virus o condizioni o disturbi risultanti da tale infezione, in particolare per l'uso nella prevenzione e/o trattamento di un'infezione da coronavirus.

10. Anticorpo monoclonale umano o una porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da SARS-CoV-2 o condizioni o disturbi risultanti da tale infezione, in particolare la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19).

11. Composizione farmaceutica comprendente uno o pi? anticorpi monoclonali umani o loro porzioni leganti l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 e un veicolante farmaceuticamente accettabile.

12. Composizione secondo la rivendicazione 11, per l'uso in un trattamento profilattico o terapeutico di un'infezione da virus o condizioni o disturbi derivanti da tale infezione, in particolare per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento di un'infezione da coronavirus, pi? in particolare per l?uso in un trattamento profilattico o terapeutico di un'infezione da virus o condizioni o disturbi derivanti da tale infezione, in particolare per l'uso nella prevenzione e/o nel trattamento di un'infezione da SARS-CoV-2.

13. Una linea cellulare isolata che produce l?anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10.

14. Una molecola isolata di acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica che codifica l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10.

15. Un vettore comprendente la molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 14, in cui il vettore comprende facoltativamente una sequenza di controllo di espressione operativamente legata alla molecola di acido nucleico.

16. Una cellula ospite comprendente il vettore secondo la rivendicazione 15 o la molecola di acido nucleico secondo la rivendicazione 15.

17. Animale transgenico non umano o pianta transgenica comprendente l'acido nucleico secondo la rivendicazione 14, in cui l'animale transgenico non umano o pianta transgenica esprime detto acido nucleico.

18. Uso dell'anticorpo monoclonale umano o di una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 nella diagnosi dell'infezione da SARS-CoV-2.

19. Un metodo in vitro per rivelare la presenza di SARS-CoV-2 in un campione comprendente i seguenti passaggi:

i) mettere in contatto l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 con detto campione;

20. Un metodo in vitro per la diagnosi dell'infezione da SARS-CoV-2 in un soggetto che comprende i seguenti passaggi:

i) mettere in contatto l'anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 con un campione biologico di detto soggetto;

21. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 19 o 20, in cui detto metodo ? un test immunologico selezionato tra ELISA, RIA, citometria a flusso, immunoistochimica tissutale, Western blot (immunoblot), immunoprecipitazione o qualsiasi altro test equivalente.

22. Un metodo in vitro secondo le rivendicazioni da 19 a 21, in cui detto anticorpo o una sua porzione legante l'antigene ? marcato direttamente con un marcatore rilevabile o in cui detto anticorpo o una sua porzione legante l'antigene (il primo anticorpo) ? legato a un secondo anticorpo marcato o ad un'altra molecola marcata.

23. Un kit diagnostico comprendente come reagente specifico un anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, detto kit essendo destinato in particolare all'uso in un metodo per rilevare o quantificare, in un campione da un paziente, anticorpi anticoronavirus e/o proteina S del coronavirus, in particolare anticorpi anti-Sars-Cov-2 e/o proteina S di Sars-Cov-2.

24. Uso di un anticorpo o di una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 per la progettazione di un vaccino contro un coronavirus, in particolare contro Sars-Cov-2.

25. Un mimotopo specificamente diretto contro l'idiotipo di un anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.

26. Un anticorpo anti-idiotipo che ? specificamente diretto contro l'idiotipo di un anticorpo o una sua porzione legante l'antigene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.