PT81012B

PT81012B - Processo para a recuperacao de hormonas de crescimento purificadas a partir de microrganismos tratados por engenharia genetica

Info

Publication number: PT81012B
Application number: PT81012A
Authority: PT
Original assignee: Bio Technology General Corp
Priority date: 1984-08-27
Filing date: 1985-08-23
Publication date: 1987-09-18
Also published as: CA1267615A; IL76191A; DE3587391T2; HU201806B; PT81012A; IE852092L; EP0173215B1; AU4626885A; EP0173215A3; JPS6193128A; EP0173215A2; NZ213153A; HUT38398A; DK174889B1; KR930009336B1; DK377985A; HK147695A; DK377985D0; ES8606496A1; KR870002258A

Description

Descrição do objecto do invento que

BIO-TECHNOLOGY GENERAL CQRP., norte-americana, industrial com sede em 375 Park Avenue, Suite 3303, Nova Iorque, Nova Iorque 10152, Estados Unidos da América, pretende obter en Portugal, para; "PROCESSO PARA A RECUPERAÇÃO DE HORMONAS DE CRESCIMENTO PURIFICADAS A PARTIR DE MICRORGANISMOS TRATADOS POR:ENGENHARIA GENÉTICA»

Um marco da investigação de engenharia genética foi 0 desenvolvimento de processos para a produção, em microrganismos de proteínas, apenas produzidas naturalmente em organismos superiores. Esta meta foi atingida rela tivamente a certas hormonas de crescimento eucarióticas ou seus análogos. Estirpes de bactérias geneticamente modifica das, por exemplo, Escherichia coli, capazes de produzirem várias hormonas de crescimento após desenvolvimento e indução foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, MD. Essas hormonas são de grande valor potencial em aplicações agrícolas, por exemplo, para aumentar a produção de leite e carne em animais de criação, bem assim como em aplicações médicas, por exemplo, para tratar seres humanos que sofrem de nanismo.

A produção duma hormona de crescimento por um microrganismo envolve as seguintes operações; 1) num microrganismo apropriado, tal como Escherichia coli, insere-se ADN estranho codificado com as instruções genéticas para a produção da hormona pretendida; 2) cultiva-se 0 micror ganismo sob condições apropriadas e este produz e armazena

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a hormona em grandes quantidades; e 3) recupera-se a hormona do microrganismo e purifica-se.

A recuperação e a purificação da hormona

geralmente envolvem a disrupção das células, a separação da hormona de crescimento de outros componentes celulares e a ulterior purificação da hormona recuperada. Constituintes celulares indesejados podem ser digeridos com enzimas, solu bilizados com agentes tensioaetivos e separados das hormonas por centrifugação. Finalmente, a hormona de crescimento pode ser purificada num grau variável por uma série de técnicas que foram desenvolvidas para a purificação de proteinas em geral. Essas técnicas incluem uma ou mais das seguin tes operações: diálise, centrifugação zonal, cromatografla por exclusão molecular, precipitação isoeléctrica, "salting -in” e “salting-out”, fraccionamento por dissolventes, méto dos de electroforese, cromatografla com permuta de iões e cromatografla por afinidade. Estes métodos variam entre si tanto pelo que diz respeito à praticabilidade económica como ao grau de purificação que se pode atingir.

0 pedido pendente, de Patente co-transferi

da, dos Estados Unidos com o Número de Série 514 188, depositado em 15 de Julho de 1983, descreve um processo de recu peração e de purificação para a hormona de crescimento bovi na. Aquele processo envolve a recuperação da hormona através de rotura mecânica uma suspensão de células misturadas e incubando o precipitado com lisózima e depois com desoxir ribonuclease. A hormona é em seguida purificada tratando por ultrassons a hormona solubilizada, clarificando a solução por centrifugação e submetendo a solução que contém a hormona a cromatografla em gel, cromatografla com permuta de ioes, diálise e liofilização.

0 processo anterior requer relativamente

grandes quantidades de lisózima e requer lavagens repetidas e demoradas a fim de originar hormona purificada e, mesmo assim, apenas com um rendimento relativamente pequeno (cer- 2 -

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ca de 10 - 15 $ com base no peso da hormona existente nas células no fim da fermentação). 0 processo anterior sofre ainda de outro inconveniente devido ao facto de se basear na digestão com desoxirribonuclease, A desoxirribonuclease é uma enzima cara que tem sido usada para digerir ADN celular durante 0 processo de recuperação da hormona. Verificou -se que as preparações de desoxirribonuclease são contamina das com proteases que degradam 0 produto pretendido duraite a recuperação. 0 uso de desoxirribonuclease como no processo anterior pode assim fazer reduzir 0 rendimento de hormona recuperada a não ser que se tomem medidas de precaução a dicionais para inibir qualquer protease presente. Mesmo assim, pode acontecer que não seja possível realizar a compl£ ta inibição da protease. Além de reduzir 0 rendimento em produto, o uso de desoxirribonuclease também origina um pro duto com uma estabilidade inferior à desejável por causa da contaminação com protease.

Desenvolveu-se um processo para recuperar uma hormona de crescimento eucariótica purificada ou 0 seu análogo, que é mais fácil de realizar, melhor controlado e menos dispendioso do que os processos anteriores. 0 processo de acordo com 0 presente invento tem como resultado a recuperação do produto pretendido com um maior rendimento e sob uma forma mais estável do que se podia obter previamente. 0 processo requer apenas 2,5 - 5 da quanti

dade de lisózima usada no processo anterior, facilitando a£ sim a purificação e reduzindo 0 custo da recuperação. Além disso, 0 processo não necessita 0 uso de desoxirribonuclease. Além de reduzir ainda mais 0 custo da recuperação, a £ liminação da necessidade da desoxirribonuclease mais do que durante 0 rendimento do produto e proporciona o produto sob uma forma significativamente mais estável. Além disso, redu zindo 0 número de lavagens necessárias, este método proporciona um processo mais conveniente e com uma melhor eficiên cia do tempo para recuperar hormonas de crescimento purifi- 3 -

cadas ou seus análogos, demorando apenas 10 / a 20 / do tem po do processo. Utilizando a ultrafiltração, o processo pro porciona quer uma significativa redução dos custos e uma pu reza maior do produto.

0 presente invento refere-se a um processo para recuperar uma hormona de crescimento de animais, purificada ou um seu análogo a partir de uma célula hacteriana em que a hormona de crescimento do animal ou o seu análogo foi produzida por meio da expressão duma sequência de ADN que codifica a hormona ou o seu análogo. 0 processo envolve os seguintes passos:

a. a disrupçao da parede celular da célula bacteriana ou dos seus fragmentos para se obter um lisato;

h, a separação de um precipitado contendo partículas e material insolúvel do lisato;

c. a preparação de uma suspensão do precipitado se-pa rado numa solução tampão apropriada;

d. o tratamento da suspensão para efectuar o contacto entre líquidos e sólidos;

e. a separação de material parcial ou completamente precipitado da suspensão submetida a contacto líquido-sólidos;

f. a solubilização do precipitado separado numa quan tidade suficiente de água e ajustamento do pH para um pH al calino apropriado para se obter uma solução;

g. a separação da hormona solubilizada ou do seu análogo de outros componentes celulares por ultrafiltração sob condiçoes apropriadas para produzir um ultrafiltrado que contém a hormona ou o seu análogo e um produto de reten ção; e

h. o tratamento da hormona soluhilizada ou o seu aná logo de maneira a purificar e concentrar ulteriormente a hormona ou o seu análogo e recuperar assim a hormona purifi cada ou o seu análogo.

No passo d), pode-se empregar lisózima pa- 4 56.527

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ra tratar a suspensão do precipitado separado do lisaão antes de se efectuar o contacto líquido-sólidos e a subsequen te separação do precipitado. Os dois últimos passos assim como a ultrafiltração podem ser repetidos. No passo h), p£ de-se empregar cromatografia com permuta de ião para purifi car e concentrar ainda a hormona ou o seu análogo. Adicionalmente, a maior parte dos passos do processo podem-se realizar de maneira contínua e podem ser automatizados.

As células de bactérias que produzem hormonas apropriadas para utilizar no presente invento incluem as estirpes de Escherischia coli com Nos. ATCC 39806,3978¾ 39386, 39384, 39804 e 39792. As hormonas de crescimento que podem ser recuperadas e purificadas usando 0 presente invento incluem hormonas de crescimento bovina, porcina, de frango e hormona e os seus análogos.

Desenvolveu-se um novo método para recuperar uma hormona eucariótica purificada, por exemplo, hormona de crescimento humana ou de animal ou um seu análogo de uma célula bacteriana em que a hormona de crescimento ou 0 seu análogo foi produzido por meio de expressão duma sequên cia de ADN que codifica a hormona ou 0 seu análogo.

Conhecem-se as células geneticamente modificadas para uso no presente processo» Uma estirpe de Escherischia coli geneticamente modificada para produzir um análogo de hormonas de crescimento bovina (bGH), por exemplo foi depositada com a * American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)” e foi-lhe conferido 0 No. ATCC 39806, 0 análogo de bGH tem a sequência de amino-ácidos Met-Asp-Gln adicionada à extremidade N da forma de fenilalanina de bGH natural. Outra linha de células E. Coli geneticamente modificadas depositadas na ATCC e a que foi conferido o No. ATCC 39785 produz um análogo de bGH que tem um resíduo de metionina adicionada à extremidade N da forma de fenilanina da bGH natural. Ainda outra estirpe de E.Coli depositada na ATCC e a que foi conferido 0 No. ATCC 39386 produz um

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análogo da hormona de crescimento humana (hGH) que tem a sequência de aminoácidos de hGH natural que começa com

de células de E, Coli a que atribuiu o No. ATCC 39384 produz um análogo de hGH que tem a sequência de hGH naturam precedido por metionina na extremidade N. De maneira semelhante, as linhas de células E. Coli a que foram atribuídos os Nos 39804 e 39792 produzem um análogo da hormona de crescimento proporciona (hGH) e um análogo da hormona de crescimento de frangos (cGH) respectivamente, tendo cada um um residuo de metionina adicionado à extremidade N da forma da fenilanina da respectiva hormona natural. Cada um dos acima análogos mencionados da hormona pode ser produzido por crescimento e indução das células apropriadas em condições convenientes e pode ser recuperado sob a forma purificada pelo processo do presente invento.

Este processo é mais fácil de realizar, me~

lhor controlado e menos dispendioso do que os processos anteriores e tem como resultado a recuperação do produto pretendido com um maior rendimento a sob uma forma mais estável. Estes produtos podem ser recuperados por este processo com rendimentos maiores do que 25 fo ou mesmo 30 em peso com base no peso de hormona ou de análogo presente nas bactérias no fim da fermentação. Utiliza-se lisózima com menores quantidades da enzima do que as necessárias nos pro cessos anteriores. Além de o processo não requerer o uso de qualquer desoxirribonuclease, pode também efectuar-se de maneira contínua e pode ser convenientemente automatizado.

De acordo com este processo, depois do desenvolvimento, indução e colheita das células de bactérias apropriadas, as células de bactérias decantadas, os seus fragmentos ou o bolo de células são suspensos numa solução tamponizada apropriada a um pH neutro, por exemplo, um pH de cerca de 7,4. Um meio de suspensão apropriado para esta finalidade é a solução aquosa 50 mSI de Tris (pH 7»4): 50 mSI

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cie NaCl, 50 mM de Tris (pH 7,4) : 50 Λ de EDTA, tampão 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,4) ^J 50 ml de NaCl ou tampão de 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,4) : 50 mM de EDTA. Como variante, a suspensão de células de pasta de fermentação, depois de ser ajustada a um valor de pH, pode ser usada directamente.

A parede celular das células ou os seus fragmentos é em seguida rompida para produzir um lisato. Nu ma forma de realização preferida, as células são mecanicamente rompidas a temperaturas inferiores a cerca de 35°C, por exemplo, entre cerca de -10°C e cerca de + 8°C. Para es ta finalidade, é apropriado um moinho de esferas ou um homogeneizador comercial, por exemplo, um dispositivo Dynomill KD-5 (Willy A. Bachofen, Basileia). A disrupção realiza-se preferivelmente fazendo passar continuamente a sus pensão através do dispositivo disruptor a um caudal de passagem apropriado, por exemplo, a cerca de 80 litros/hora.

Do lisato, que também contém proteínas solúveis em água, ADN e ARN ou seus fragmentos, separa-se então um precipitado contendo também material insolúvel e em partículas que compreende a hormona ou o seu análogo e outras proteínas insolúveis em água, assim como membrana de célula e fragmentos e agregados de parede de célula. Para efectuar esta separação, o lisato é preferivelmente diluído com uma quantidade apropriada, por exemplo, um volume aproximadamente igual de água desionizada e, em seguida, centr£ fugada numa centrífuga de funcionamento contínuo de cesto sólido (por exemplo, Cepa 101) com caudais suficientes para se efectuar a separação pretendida, por exemplo, cerca de 60 - 80 litros/hora. Em seguida, prepara-se uma suspensão do precipitado separado numa quantidade adequada duma solução tampão apropriada tendo um valor de pH neutro, per exemplo, um pH de cerca de 7,4. Preferivelmente, a solução contem 50 mM de Tris ou de fosfato de sódio (pH 7,4) : 50mM de EDTA. Uma quantidade apropriada de solução de tampão para

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a suspensão é igual a cerca de 0,5 - 2,5 litros por kg de células bacterianas iniciais, preferivelmente, cerca de

1,3 litros por kg de células.

Material celular indesejável tal como frag mentos de parede de célula pode então ser digerido incubando a suspensão com uma enzima apropriada capaz de digerir os polissacáridos presentes na suspensão, por exemplo, lisózima (Sigma L-6876, St. Louis, MO), sob condições apropriadas e durante um período de tempo apropriado. A concen tração presentemente preferida de lisózima é de cerca de 50 - 100/ug por mililitro de solução, uma redução significa tiva em relação aos 2 mg/ml usados nos métodos anteriores. Um período de tempo apropriado para realizar a incubação da lisózima está compreendido entre cerca de uma e 20 horas,

A temperatura durante este período de incubação é preferivelmente mantida a cerca de 37°C. Pode então adicionar-se uma quantidade apropriada de um agente tensio-activo apropriado, por exemplo, Triton X-100 (Rohm & Haaa Oo., Filadélfia, PA) à suspensão até se atingir uma concentração final igual a cerca de 1 fi (em volume/volume) a fim de solubilizar material tal como lípidos celulares. Então, incuba-se a suspensão durante mais um período de tempo apropriado, por exemplo, cerca de 30 minutos.

O líquido e os sólidos contidos na suspensão são então tratados de maneira a efectuar-se 0 contacto íntimo líquido-sólidos, por exemplo, por tratamento por ultrassons sob condições adequadas, tal como por exemplo um dispositivo de tratamento com ultrassons de funcionamento continuo com a potência de 37 W* (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY) regulado a 65 fi» da potência máxima e com um caudal de cerca de 18 litros/hora até 25 litros/hora. Se para-se então 0 material precipitado da suspensão de líqiido-sólidos submetida a contacto, preferivelmente, centrifugando a suspensão de líquido-sólidos em contacto numa centrífuga de funcionamento contínuo de cesto sólido (por exem

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pio, Cepa 101) com um caudal de por exemplo, cerca dé 30 litros/hora. Noutra forma de realização, a separação deste passo e dos passos subsequentes pode efectuar-se por microfiltração com uma membrana aoropriada, por exemplo, uma mem brana lillipore Durapore de 0,45 mícron em vez de centrifugação. Depois da separação, o material precipitado separado da suspensão de líquido-sólidos submetida a contacto, por exemplo, por aeção de ultrassons, pode ser lavado apropria damente com 50 ml de Tris ou fosfato (pH 7,4) : 100 ml de NaCl e ressuspende-se numa quantidade adequada de um meio apropriado, por exemplo, uma solução aquosa tamponizada ou nao tamponizada. A suspensão assim preparada é então posta em contacto líquido-sólidos, por exemplo, mediante tratamento por ultrassons, sob condições apropriadas e o material precipitado resultante é parcial ou completamente separado da suspensão de líquido-sólidos feita contactar, por exempç mediante tratamento por ultrassons, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração como se referiu acima. 0 contácto líquido-sólidos de ressuspensão (por exemplo, mediante tratamento por ultrassons) e a separação realizam-ee preferivelmente durante pelo menos um certo tempo adicional, Numa forma de realização especialmente preferida, estes passos realizam-se quatro vezes procedendo da seguixte forma: primeiro, ressuspende-se o precipitado resultante em tampão de 20 ml de Tris (pH 7,4 ) ou 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,4) e faz-se contactar a suspensão de líquido-sólidos (por exemplo, por tratamento com ultrassons) como se mencionou acima. A suspensão é então centrifugada eomo se referiu acima e o precipitado recuperado é ressuspenso em tampão de Tris 50 mM (pH 7,4) : 100 mM NaCl ou 20 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,4) EDTA 10 ml: NaCl 100 ml. Esta suspensão é então feita contactar líquido-sólidos, por exemplo, mediante tratamento com ultrassons, centrifuga-se como se descreveu acima e ress.uspende-se o precipitado recuperado em água desionizada. A suspensão de

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água é submetida a contacto líquido-sólidos, por exemplo, por tratamento com ultrassons e eentrifuga-se de novo como se mencionou acima e suspende-se novamente o precipitado recuperado em água desionizada. Esta segunda suspensão em água é então submetida a contacto líquido-sólidos, por exemplo, por tratamento com ultrassons e centrifuga-se como referido acima para se obter um precipitado enriquecido na hormona pretendida ou no seu análogo.

0 precipitado separado é então solubilizado, por exemplo, 4 - 40°C, numa quantidade suficiente de água, preferivelmente, cerca de vinte e cinco (25) volumes e ajusta-se o pH até um valor alcalino adequado,por exemplo, cerca de 9,0 a 12,0 de maneira a obter-se uma solução contendo a hormona ou análogo. Para facilitar a disso lução pode-se usar agitação de elevado corte 7""por ^exem~ pio, um misturador Polytron (Kinematica27· Pode-se ajustar convenientemente o pH da suspensão inicial adicionando NaOH à suspensão, por exemplo, NaOH 1 - 10 N, até que o pH seja igual a cerca de 9,0 - 12,0, Preferivelmente, adiciona-se o NaOH simultaneamente à solução com vigorosa agitação. Incuba-se então a solução e agita-se durante cerca de 1 hora, depois do que o pH pode ser reduzido para cerca de 10,5.

Adiciona-se então uma quantidade apropriada de solução aquosa de borato de sódio apropriadamente concentrada, por exemplo, cerca de 1 M com um pH apropriado, por exemplo, 11,5 - 12,0) à solução de maneira a conseguir-se uma concentração final de borato preferivelmente de cerca de 10 mM. Titula-se então a solução de proteína até pH 0,5 ou por diluição com 2-20 volumes de tampão de borato de sódio 10 mM (pH 10,2) ou por titulação com HCl concentrado ou com HCl 1 normal. A solução é então incubada durante 1-12 horas com agitação. A solução assim obtida pode ser clarificada, caso necessário, tratando a solução com ultrassons sob cnndições apropriadas, por

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exemplo, com um Heat System Sonicator Model 370 coni um cau dal cnntínuo de cerca de 10 litros/hora; centrifugando a solução tratada com ultrassons sob condições apropriadas, por esemplo, com uma centrífuga de funcionamento contínuo de cesto sólido (por exemplo Cepa 101) com um caudal de cerca de 30 litros / hora; separando o líquido sobrenadante e filtrando o líquido em filtro de vácuo, por exemplo, através de papel Whatman No. 2 num filtro de vácuo de Buchner de maneira a originar uma solução clarifica con tendo a hormona solubilizada ou o seu análogo. Como varian te, pode-se empregar exclusivamente a centrifugação.

A hormona solubilizada ou o seu análogo é então separada doutros componentes celulares tais como proteínas, lipidos e outras partículas e os agregados são dissociados por ultrafiltração sob condições apropriadas. Preferivelmente, o produto de retenção obtido ó de novo submetido a ultrafiltração pelo menos uma vez. Durante este procedimento, o volume do produto de retenção deve ser reduzido em cerca de 95%, por exemplo, de cerca de 10 litros para cerca de 0,5 litro e o filtrado ser recolhido. Para utilizar no procedimento de ultrafiltração é apropriada a Casset te Pellicoí^ ou a espiral PUF - 100 (Millipore Corp., Bedford, MA) com corte a 100 K peso molecular. Preferivelmente, o produto de retenção é diluído mais uma vez com um tampão apropriado a um pH alcalino adequado, por exemplo, cerca de

9 - 12 e submetido a ulterior ultrafiltração. Numa forma de realização presentemente preferida, usa-se tampão de borato

10 mM (pH 10,5 - 12,0). A rediluição e reconcentração por ultrafiltração são preferivelmente repetidas pelo menos uma vez. Como variante, a ultrafiltração pode efectuar-se uma ou mais vezes a volume de produto de retenção substancialmente constante. Numa forma de realização especialmente pre ferida, repete-se a ultrafiltração até que a absorvência do produto de retenção a 280 nanómetros seja menor do que cer— 11 —

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ca de 0,1 unidade de densidade óptica, A hormona pode ser convenientemente obtida a partir do ultrafiltrado com um ní vel de pureza e de actividade biológica superior ao do previamente obtido por cromatografia em gel.

A hormona purificada ou o seu análogo obtido

no ultrafiltrado ó então tratada, por exemplo por cromatografia com permuta de ião, por exemplo, com uma resina de permuta de ião contendo amina tal como o grupo de dietilami noetilo de maneira a purificar e concentrar ulteriormente a hormona ou o seu análogo e recuperar a hormona purificada ou o respectivo análogo. A concentração da ultrafiltração utilizando uma membrana de 10 K.M.V. para remover a água é, opcionalmente anterior à cromatografia por permuta de ião. Durante a fase de cromatografia por permuta de ião, a ADN remanescente, a lisózima no caso de estar presente, e os multímeros são separados da hormona ou seu análogo. Nesta operação, o pH do ultrafiltrado é primeiramente ajustado a um valor de pH apropriado, por exemplo, pH 9,0, mediante ti tulação com ácido clorídrico e é introduzido numa coluna de permuta de ião apropriada por exemplo uma coluna em secções KS-370 contendo DEAE-Sepharose CD-6B (passagem rápida) (Pharmacia Pine Chemicals, Piscataway, NJ). 0 sistema ó então lavado com um tampão apropriado, por exemplo, tampão de borato 10 mM e a amostra é eluída com um eluente apropriado a uma velocidade adequada, por exemplo, tampão de borato 10 mM (pH 9,0) contendo NaCl 100 mM. As fracções contendo a hormona ou o respectivo análogo podem ser concentradas por ultrafiltração usando uma Cassette Pellicon^ ou uma espiral PUP-100 com um corte de 10 K peso molecular e podem então ser dialisadas contra uma solução contendo uma concentração apropriada de um sal adequado, por exemplo, hidróxido de

amónio ou bicarbonato de amónio 3 mM, usando de novo uma Cas íl)

sette Pellicon de corte a 10 K peso molecular. 0 material dializado pode então ser seco por liofilização ou por secagem por pulverização sob condições apropriadas. A secagem

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por pulverização é o processo mais económico e pode'ser con venientemente realizada num secador por pulverização pequeno (Niro Atomizer) usando uma temperatura de entrada de cer ca de 200° C, uma temperatura de saída de cerca de 50° C e um caudal de passagem de cerca de 2,5 litros/hora. As hormo nas de crescimento de animais ou os seus análogos assim pro, cessadas podem ser obtidas sob a forma dum fino pó branco.

As hormonas de crescimento de animais purifi cadas ou os seus análogos podem ser recuperadas por este má todo com rendimentos maiores do que ou iguais a cerca de 30$ com base no peso da hormona ou do seu análogo presente nas bactérias no fim da fermentação. A hormona ou o seu aná logo assim obtido aparece como uma mancha quando desenvolvi da em gel contendo 15$ de poliacrilamida-SDS com marcadores de baixo peso molecular (Pharmacia) como referência.

Os péptidos obtidos depois de ultrafiltração e cromatografia com permuta de ião de acordo com o presente invento eram mais puros e mais estáveis do que quando se utilizou cromatografia em gel em vez de ultrafiltração ou quando a concentração dos péptidos se realizou com ultrafil tração de 10 E peso molecular em vez de cromatografia com permuta de ião.

Pelo que diz respeito à actividade biológica das hormonas e seus análogos recuperados, os resultados dos ensaios de radio-imunidade indicam que os anticorpos para a hormona natural tinham afinidades aproximadamente iguais à hormona ou ao seu análogo produzidos pelo microrganismo apro priado e recuperados de acordo com o presente invento. Seme lhantemente, os ensaios de ligação rádio-receptores indicam uma actividade de ligação de membranas apropriadas em relação a hormonas ou respectivos análogos purificados pelo pro cesso de acordo com o presente invento equivalente à de amostras autênticas das hormonas naturais. Além disso, não se detectaram anticorpos para as hormonas ou seus análogos a seguir a injecções primárias ou de reforço dos péptidos

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em animais apropriados. Além disso, verificou-se que 0 análogo da hormona de crescimento bovina aumentava a lactação quando administrado a vacas em lactação.

Os exemplos que se seguem são apresentados com 0 fim de ajudar a compreender 0 presente invento mas não se destinam a limitar de qualquer maneira o seu âmbito, nem assim devem ser interpretados. Os exemplos não incluem descrições pormenorizadas dos processos convencionais que são bem conhecidos pelos peritos no assunto.

EXEMPLO 1

Desenvolvimento de £, coli e Produção dum Análogo de bGH

I· Culturas de Reserva

Em meio de caseína (veja-se Inóculo) desenvolveram-se culturas de reserva da estirpe de E« coli com o NS. ATCC 39806 que por crescimento e indução produz 0 aná logo de bGH, a Met-Asp-Gln-bGH, depois diluíu-se duas vezes com meio de congelação e armazena-se a -80° C. 0 meio de congelação contém, por 500 mililitros:

k₂hpo₄	6,3 gramas
ΚΗ₂ϊ0₄	1,8 gramas
Citrato de Na	0,45 grama
MgS0₄. 7 H₂0	0,09 grama
(nh₄)₂so₄	0,9 grama
Glicerol	44,0 gramas

II. Inóculo

Propagou-se 0 inóculo em 20 gramas /litro de hidrolizado de caseína, 10 gramas/litro de extracto de leve

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dura e 2 gramas/litro de NaCl, Em balão sacudidor ínoculou-se meio esterilizado com cultura de reserva e incubou-se durante 15 horas num agitador de sacudidelas a 30^o C a apro ximadamente 200 rotações por minuto. Caso necessárias, as operações subsequentes na propagação do inóculo realizaram-se em fermentadores arejados agitados. Inoculou-se meio es terilizado com 2 - 10$ de cultura de inóculo e incubou-se durante 15 horas a 30° C, pH 7 - 0,5, com agitação e arejamento, para se manter um nível de oxigénio dissolvido igual a cerca de 20$ de saturação de ar.

III. Produção 0 meio de produção contém

Hidrolisato de caseína	20 gramas/litro
Extracto de levedura	10 gramas/litro
K₂HP°₄	2,5 gramas/litro
MgSO₄. 7 H₂0	1 grama/litro
NaCl	5 gramas/litro
Biotina	0,1 miligrama/litro
Tiamina	1 miligrama/litro
Solução de elementos vestigiais	3 miligramas/litro
0 meio também contém 100	miligramas/litro de

ampicilina. A ampicilina é opcional para a produção mas encontra-se sempre presente no meio usado para desenvolver 0 inóculo.

A biotina, a tiamina e a ampicilina sob a forma de soluções concentradas foram esterilizadas por filtração separadamente e adicionadas ao meio de produção este rilizado antes da inoculação. A solução esterilizada de gli

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cose foi adicionada inicialmente de maneira a proporcionar 10 gramas/litro. Na fase de indução adicionaram-se mais 10 gramas/litro de glicose.

A solução de elementos vestigiais contém

PeCl,

ZnCl₂. 4 H₂0 CoClg, 6 H₂0 Na₂MoO^. 2 H₂0 CaClg. 2 H₂0 CuOlg

H01

16 gramas/litro 2 gramas/litro 2 gramas/litro 2 gramas/litro 1 grama/litro 1 grama/litro 0,5 grama/litro

100 mililitroa/litro

Inocula-se 0 meio com 0,5 - 10$ de cultura de inóculo e incuba-se a 30^o C. As taxas de agitação-arejamento são estabelecidas de maneira a manter um nível de oxi génio dissolvido superior a 20$ de saturação de ar. Mantém-se 0 pH a um valor igual a 7,0 a 7,5 - 0,2 com NH^. Uma vez que a concentração das células tenha atingido 3,5 gramas/litro (densidade óptica = 10 ), inicia-se a indução subindo a temperatura para 42° C. Manteve-se então a temperatura a 42° C durante 1-5 horas, depois do que as células podem ser colhidas da suspensão de células.

EXEMPLO 2

Colheita de Células

Arrefeceram-se até à temperatura ambiente quinhentos litros de suspensão de células (contendo 6,15 gramas de DCW/litro e 490 mg de bGH/litro) obtida como se descreveu no Exemplo 1 e transferiram-se para um tanque de

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armazenagem. Centrifugou-se a suspensão de células a 14.000 rotações por minuto (16.000 x g) numa centrífuga de cesto tubular CEPA 101 com um débito de alimentação igual a 250 litros/hora, A centrífuga CEPA 101 tinha um comprimento dos tubos igual a 73,7 cm, um raio da abertura de saída de 3,25 cm e um raio da parede do cesto de 7,35 cm» Estava equipada com alhetas de aceleração e tinha arrefecimento com uma camisa exterior.

0 líquido sobrenadante límpido tinha um peso volúmico igual a 1,0 g/ml, não continha bGH detectável e foi rejeitado. 0 bolo, pesando 11,4 kg (75% âe humidade), contém a bGH agregada e foi guardado. 0 bolo tinha tipicamente cerca de 2 cm de espessura com um peso volúmico igual a 1,1 g/ml. Um procedimento que se pode usar como variante consiste em permitir que as células assentem durante a noite e em sifonar o líquido sobrenadante límpido.

Métodos de ensaio: Varrimento em gel quantificado com suspensão de células, líquido sobrenadante e bolo.

Rendimento da operação 100%

Rendixnento global: 100 %

Volume de saída ; 2,3 % do volume inicial de

suspensão de células

Ensaio calculado: 21,5 gramas de bGH/kg de bolo

Factor de enriquecimento: 44 (concentração de bGH na saída / concentração de bGH na entrada).

Os rendimentos foram determinados medindo as unidades de densidade óptica que são definidas como a absorvância da solução a 280 nm (célula de 1 cm) multiplicada jíelo volume da solução expresso enml. Por exemplo se o valor

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da densidade óptica for 9,1 e o volume da solução for 32.600 mililitros, o valor das unidades de densidade óptica é igual a 297.000. Se a leitura da absorvência for feita a pH 9, o valor da densidade óptica pode ser transformado em gramas de bGH multiplicando pelo facto de conversão igual a 0,00157, obtehdot*se^l4,3 gramas de bGH/litro.

EXEMPLO 3

Rotura das Células

Suspenderam-se as células húmidas (11,4

kg) resultantes da operação de colheita de células (Exemplo 2) em 4 litros de tampão 50 mM de Tris : 50 mM de NaCl a pH igual a 7,4 por cada quilograma de células húmidas (total de 45,6 litros). Um misturador Bolytron de elevado corte (Kinematica) ajuda a dispersar o bolo. As células suspensas foram alimentadas a um moinho disruptor de esferas dynomill KD-5 (Willy A, Bachofen, Basileia) a 80 litros/hora. 0 moinho de esferas foi mantido a -10°C até +· 8°C por arrefecimento. As células rompidas foram então diluídas com um volume de água desionizada antes de centrifugação na centrífuga de cesto tubular CE3?A 101, 0 débito de alimentação da centrífuga era 30 - 60 litros/hora. Todas as condiçoes de centrifugação, excepto o débito de alimentação, eram idênticas às da colheita de células, 0 líquido sobrenadante contendo cerca de 10 / de bGH de entrada foi rejeitado. 0 bolo pesando 5,28 kg (75 / de humidade) contém a bGH agregada e foi guardada.

Tampao de Rotura (50 mM de Tris : 50 mM de NaCl, pH 7,4)

Ajustou-se a pH 7,4 com HCl concentrado, uma mistura de

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Ref; 385.154

6,06 gramas de Tris e 2,97 gramas de NaCl ein 750 mililitros de água, diluiu-se até 1 litro com água desionizada e, caso necessário, reajustou-se a pH 7,4.

Métodos de Ensaio; Rendimento quantificado em gel sobre células, sobrenadante e bolo.

Rendimento da operação ; 90

Rendimento global · 90

Volume de saída : 1,05 do volume inicial da suspensão de células.

Ensaio Calculado : 37,1 g de bGH/kg de bolo

Factor de enriquecimento ; 1,7

EXEMPLO 4

Tratamento com Lisózima

Suspendeu-se o bolo húmido (5,28 kg) da operação de rotura (Exemplo 2) em 1,2 litros de tampão 50 mM de Tris ; 50 mM de EDTA a pH 7,4 por cada quilograma de células húmidas originais colhidas (total de 13,7 litros), Um misturador Polytron de elevado corte ajuda a dispersar o bolo. Adicionou-se lisózima (Sigma Grau III) (0,05 grama/litro da lama e misturou-se a lama a 37°C durante uma hora. Adicionou-se Triton ®X-1QO (Rohm & Haas Co. Filadél fia, PA) (100 mililitros de uma solução a 10 / em colume/ volume tamponizada a pH 7,4 por litro, originando uma concentração final de 1 / de Triton X-100) e incubou-se a mistura durante 30 minutos adicionais. Submeteu-se a lama à acção de ultrassons num Sonicator Heat Systems 370 watt à potência de 65 $ equipado com uma célula de passagem, 0 débito de passagem através do aparelho de ultrassons foi de

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18 litros / hora. A lama tratada com ultrassons foi centri< fugada na centrífuga CEPA 101 com um débito de 30 litros / hora. Todas as condições de centrifugação, excepto 0 caudal de alimentação, eram idênticas às empregadas na colheita de células. 0 líquido sobrenadante contendo cerca de 3 $ de bGH foi regietado 0 bolo, pesando 3,07 kg (75 % de humidade) contém a bGH agregada e foi guardado.

Tampão de Lisózima (50 mM de Tris : 50 mM de EDTA, pH

7,4 ):

Ajustou-se a pH 7,4 com HC1 concentrado ou NaOH a 50 /· uma mistura de 6,06 gramas de Tris e 14,6 gramas de EDTA em 750 mililitros de água disionizada, diluíu-se com água, desionizada até prefazer 1 litro e, se necessário reajustou-se a pH 7,4.

ffiétádos de ensaio: Varrimentos quantificados em gel em

sobrenadantes e bolos.

Rendimento da operação: 97 $

Rendimento global: 87,3 %

Volume de saída: 0,61 % de volume inicial de suspensão

de células

Ensaio calculado : 61,9 granas de bGH/kg de bolo.

Factor de enriquecimento : 1,7

EXEMPLO 5

Primeira Lavagem

Suspendeu-se 0 bolo húmido (3,07 kg) da operação de tratamento com lisózima (Exemplo 4) em 0,6 li- 20 -

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Ref: 385.154

tro de tampão 20 ml de Tris a pH 7,4 por cada quilograma de células húmidas original colhidas (total de 6,8 litros). Um misturador Polytron de elevado corte ajuda a dispersar 0 bolo. Submeteu-se a lama à aeção de ultrassons com um caudal igual a 18 litros/hora através do modelo de Heat Systems de 370 watt a 65 / de potência. A lama tratada com ultrassons foi centrifugada numa centrífuga CEPA 101 a 30 litros/hora. Todas as condições de centrifugação com excepção do débito de alimentação foram idênticas às usadas na colheita de células, Regeitou-se o sobrenadante, 0 bolo pesando 2,46 kg (75 / de humidade) contém a bGH agregada e foi guardado.

Tampão para a primeira lavagem (20 mM Tris, pH 7,4):

Ajustaram-se a pH 7,4 com HCl concentrado 2,42 gramas de Tris em 750 mililitros de água desionizaâa, diluíu-se a um litro com água desionizada e reajustou-se a pH 7,4, se necessário.

Métodos de Ensaio: Varrimentos de gel quantificados sobre nadantes e bolos,

Rendimento da operação : 100 /

Rendimento global : 87,3 /

Volume de saída : 0,49 do volume da suspensão inicial de

células

Ensaio calculado: 77,3 gramaa de bGH/kg de bolo húmido Factor de enriquecimento: 1,2.

EXEMPLO 6

Lavagem com Sal

Suspendeu-se 0 bolo húmido (2,46 kg) da

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primeira operação de lavagem (Exemplo 5) em 0,6 litro de tampão 50 mM de Tris : 100 mM de NaCl a pH 7,4 por cada quilograma de células húmidas originais colhidas (total de

6,8 litros). Um misturador Polytron de elevado corte ajuda a dispersar o bolo. Submeteu-se a lama à acção de ultrassons sob um caudal de 18 litros / hora através do modelo Heat Systems de 370 watt a 65 $ de potência. A lama tratada por ultrassons £©i então centrifugada na centrífuga CEPA 101 a 30 litros/hora. Todas as condições de centrifugação excepto o débito de alimentação foram idênticas às usadas na colheita de células, Regeitou-se o sobrenadante, 0 bolo pesando 2,15 kg (75 $ de humidade) contém a bGH agregada e foi guardado.

Tempo para a lavagem com Sal (50 mM Tris : 100 mM NaCl, pH 7,4 ) :

Ajustou-se a pH 7,4 com HCl concentrado uma mistura de 6,06 gramas de Tris e 5,85 gramas de cloreto de sódio em 750 mililitros de água desionizada, diluíu-se até prefazer um litro com água desionizada e, caso necessário, reajustou-se a pH 7,4.

Métodos de ensaio : Varrimentos quantificados em gel sobre sobrenadantes e bolos.

Rendimento da operação : 100 $.

Rendimento global : 87,3

Volume de saída : 0,43 $ do volume inicial de suspensão de

células

Ensaio calculado : 88,4 gramas de bGH/kg de bolo

Factor de enriquecimento : 1,14

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EXEMPLO 7

Primeira Lavagem com Agua

Suspendeu-se o bolo húmido (2,15 kg) da operação de lavagem com sal (Exemplo 6) em 1,2 litros de água desionizada isenta de agentes pirogénicos por cada qui. lograma de células húmidas originais colhidas (total de

13,7 litros). Um misturador Polytron de elevado corte ajuda a dispersar o bolo. Submeteu-se a lama à acção de ultrassons com um caudal de 18 litros / hora através dum aparelho Heat Systems do modelo de 370 watt a 65 $ de potência, 0 pH da lama deve subir desde o valor de pH 6,2 da água de partida até cerca de pH 7,8 - 8,0. A lama tratada por ultrassons foi então centrifugada na centrífuga CEPA 101 a um ocaudal de 30 litros / hora. Todas as condições de centrifugação, excepto o caudal de alixnentação, foram idênticas às da colheita das células. Regeitou-se o sobrenadante. 0 bolo, pesando 1,90 kg (75 $ de humidade), contém a hGH agregada e foi guardado.

Métodos de ensaio: Varrimentos quantificados em gel sobrenadantes e bolos

Rendimento da operação : 99 $

Rendimento global ; 86,4 $

Volume de saída ; 0,38 $ de volume de suspensão de células inicial.

Ensaio calculado: 99,0 granas de bGH/kg de bolo Pactor de enriquecimento ; 1,12

EXEMPLO 8

Segunda Lavagem com Agua

Suspendeu-se o bolo húmido (1,90 kg) da

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operação de primeira lavagem com água (Exemplo 7) em 1,2 li. tros de água desionizada isenta de agentes pirogénicos por cada quilograma de células húmidas originais colhidas (total de 13,7 litros). Um misturador Polytron de elevado cor te ajuda a dispersar o bolo, 0 pH da lama deve ser igual a cerca de 8,4. A lama foi submetida à acção de ultrassons a um caudal de 18 litros / hora através do modelo de Heat Systems de 370 watt a 65 / da potência. A lama tratada com ultrassons foi então centrifugada na centrífuga CEPA 101 comum caudal de 30 litros / hora. Todas as condições de centrifugação excepto o caudal de alimentação foram idênticas às da colheita de células. 0 sobrenadante foi regeitado. 0 bolo, pesando 1,31 kg (75 / de humidade), contém a bGH agregada e foi guardado.

Métodos de ensaio : Rendimentos quantificados em gel sobre, nadantes e bolos.

Rendimento da operação : 99

Rendimento global : 85,6

Valor de saída : 0,26 fi do volume inicial de suspensão de

células.

Ensaio calculado : 160 gramas de bGH / kg de bolo

Factor de enriquecimento : 1,62 ,

EXEMPLO 9

Operaçao de Dissolução

Suspendeu-se o bolo húmido (1,31 kg) da

segunda lavagem com água (Exemplo 8) em 25 litros de água desionizada isenta de agentes pirogénicos por cada quilograma de bolo lavado (total de 32,6 litros). Um misturador Polytron de elevado corte ajuda a dispersar o bolo, A- 24

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justou-se o pH lentamente até 11,8 por adição de NaOH 10 normal, a bGH agregada dissolveu-se lentamente durante um período de tempo de uma hora. Depois de um período de incubação de uma hora, adicionou-se borato de sódio 1 M a pH

11,8 à solução até fazer a solução final de 10 mM em borato de sódio. Manteve-se a solução durante 30 minutos antes do tratamento com ultrassons através do modelo Heat Systems de 370 watt a 65 % de potência. 0 débito de alimentação ao aparelho de tratamento com ultrassons foi igual a 18 litros / hora. Se a solução estivesse muito nublada, foi centrifugada com o débito de 30 litros / hora através duma centrífuga CEPA 101; de outra forma, filtrou-se a solução em porções de 5 litros através de três folhas de papel Whatmnn No. 2 com o diâmetro de 24 cm num único filtro de Buchner, Ajustou-se o vácuo para evitar a formação de espumas durante a filtração. Havia apenas vestígios de material insolúvel. 0 filtrado (32,6 litros) contém a bGH em solução.

A absorvência da solução clarificada era igual a 9,1 de densidade óptica a 280 nm (célula de 1 cm). Se toda a absorção fosse devida a bGH, o que não acontece, isso correspondia a 14,3 gramas de bGH / litro. 0 teor verdadeiro de bGH é menor do que metade deste valor.

As impurezas que absorvem ultravioletas são os responsáveis desse facto. Uma absorvência de 1,0 a 280 nm (célula de 1 cm) é dada por uma solução de 1,57 gramas / litro de bGH pura a pH 9. (A absorvência de bGH altera-se com pH).

Tampão de Dissolução (borato de sódio 1 M a pH 11,8) :

Dissolvem-se 61,8 gramas de ácido bórico em 750 mililitros de água desionizada e ajusta-se a pH

11,8 % com NaOH a 50 Dilui-se até um volume final de 1 litro com água desionizada.

Métodos de ensaio : Varrimento quantifica- 25 56.527

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do era gel sobre bolo lavado a bGH dissolvida.

Rendimento da operação : 100 $

Rendimento global : 85,6 $

Volume de saída; 6,8 $ de volume inicial de suspensão de células.

Ensaio calculado: 6,2 gramas de bGH / litro.

Pactor de enriquecimento : 0,039,

EXEMPLO 10

Ultrafiltração 100 K

Dividiu-se a solução de proteína clarificada (32,6 litros, 297.000 unidades de densidade óptica) era porções separadas (6 x 5,4 litros) tendo cada uma uma absorvência de 50.000 - 60,000 unidades de densidade óptica. Cada porção foi ultrafiltrada separadamente através do ultrafiltro do Sistema de Cassette Pellicon^ (Millipore, Bedford, MA) equipado com três cassettes de corte de 100.000 peso molecular (tipo PTHE) de 0,46 metros quadrados (5 pés quadrados) de área cada uma. Concentrou-se a primeira parte até 1 litro de volume de produto de retenção. Colectou-se o ultrafiltrado, ensaiou-se com ultravioletas e guardou -se. Diluíu-se o produto de retenção até ao seu volume original com tampão 10 mM de borato de sódio recente a pH 11,8 e misturou-se bem. Concentrou-se a carga de novo até 1 litro de volume de produto de retenção, Colectou-se o ultrafiltrado e combinou-se com o primeiro ultrafiltrado. Quando um ensaio total da absorvência de densidade óptica nos ultrafiltrados igualou 20$ da absorvência de densidade óptica da carga inicial alimentada ao ultrafiltro, o volume do pro duto de retenção na concentração seguinte foi tomado para 0,5 litro em vez de 1 litro. Continuou-se o ciclo de concen

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tração e diluição com tampão de borato de sódio 10 mM até que 0 ultrafiltrado de um volume de produto de retenção de 0,5 litro tivesse uma absorvância a 280 nm (célula de 1 cm) menor do que 0,1. Isto normalmente demora entre 9 e 12 ciclos de ultrafiltração e diluição, Regeitou-se o produto de retenção final. Os débitos para a ultrafiltração são indicados na Tabela 1.

Todos os ultrafiltrados foram então combinados e ajustados a pH 9,0 com HC1 6 narmal. As outras porções de 5,4 litros foram processadas através do Sistema Pelli-

filtrados com o pH ajustado. Uma experiência típica produziu um total de 380 litros de ultrafiltrado com uma absorvância de 0,26 densidade óptica/ml, equivalente a um total do valor de densidade óptica de 100,000 (pH 12) e necessitou de 24 a 40 horas para se completar.

Tabela 1

Débitos dos caudais de alimentação para

ultrafiltração de 100 K de peso molecular ¹

Débito com 3 cassettes

Condições

p

Débito por unidade (1,39 m )

2

de área de membrana (15 pé )

Débito de ultrafiltração quando o pro duto de retenção é o mais concentrado:

24 litros/h

Débito de ultrafiltração quando 0 pro duto de retenção é 0 mais diluído:

2,4 litros/h 0,09 m²(p«²)

36 litros/h

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Tabela 1 - Continuação

Condições	Débito por unidade de área de membrana	Débito com 3 cassettes (1,39 ra²) (15 pé²)
Débito de recircu-	72 litros/h 0,09 m²
lação quando 0 pro duto de retenção é
0 mais concentrado:	(pé²)	18 litros/mir
Débito de recirculação quando 0 pro duto de retenção é 0 mais diluído:	36 litres/h 0,09 m²(pé²)	9 litros/mir

^χ A uma pressão de entrada igual a 3,5 kg/cm relativos (50 psig) e uma contrapressao de 0,35 kg/cm relativos (5 psig)

Métodos de ensaio: Varrimento quantificado em gel sobre a entrada e absorvência a 280 nm (célula de 1 cm) sobre a saída; cromatografia qualitativa em gel

Rendimento da operação: 75,5$.

Rendimento global; 64,6$.

Volume de salda? 76$ do volume inicial da suspensão de células

Ensaio calculado: 0,4 grama de bGH/Litro

Factor de enriquecimento: 0,065

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A alimentação, o produto de retenção e o ultrafiltrado foram examinados cada um por cromatografia em íS)

gel de Sepharose ^w CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscata way, NJ) a fim de se determinar a extensão e a qualidade da separação.

As condições da coluna de gel são:

2,6 cm de diâmetro x 100 cm de comprimento

Volume total: 500 mililitros

Volume de vazios: 150 mililitros

Débito do caudal: 40 a 60 ml/hora

Carregamento: 50 unidades de densidade óptica por 5 mililitros

Eluente: borato de sódio 10 mM a pH 12

Tempo do ensaio normal: 5 horas

Detecção: UV a 280 nm.

Tampão para a cromatografia em gel (borato de sódio 10 mM a pH 12):

Preparou-se como se descreveu no Exemplo 9

EXEMPLO 11

Cromatografia com Permuta de Ião

Os ultrafiltrados combinados (380 litros, com uma absorvência de 100.000 unidades de densidade óptica) da ultrafiltração de 100 K do Exemplo 10 foram carregados numa coluna de permuta de ião de Sepharose ® GL-6B DEAE (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) com uma velocida de linear de 93 cm/hora (100 litros/hora). Lavou-se a coluna com 37 cm de diâmetro e 15 cm de altura com dois volumes do leito (32 litros) de tampão 10 mM de borato de sódio a

pH 9,0 e regeitou-se o eluído das operações de carga e lava

gem. Uma operação de modificação do eluente para borato de sódio 10 mM: cloreto de sódio 100 mM a pH 9 deslocou a bGH

da coluna. A velocidade do caudal de eluição foi igual a 93

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cm/hora, Controlou-se o progresso da eluição seguindo a absorvência do eluído a 280 nm. Colectou-se o pico de bGH em 4 a 5 volumes do leito (84 litros com uma absorvência total de 43.000 unidades de densidade óptica) e guardou-se. A con centração média da fracção de bGH foi igual a 0,8 grama de bGH/Litro,

Regenerou-se a coluna lavando o leito a uma velocidade de 93 cm/hora da seguinte maneira; aplicou-se um volume do leito de acetato de sódio 1 ffi ajustado a pH 3,0 com HC1 à coluna seguido por um volume e meio de leitos de NaOH 0,5 normal. Depois de se tratar com a NaOH, deixou-se repousar a coluna durante duas horas, depois do que se lavou a coluna com um volume e meio do leito de acetato de só dio 1 M ajustado a pH 3,0 com HC1. Equilibrou-se depois o leito com borato de sódio 10 mM (pH 9) fazendo passar pelo menos três volumes do leito de tampão através do leito de permuta de ião. A condutividade e o pH do eluído deve ser verificado em comparação com a solução de entrada,

Métodos de ensaio: Absorvência a 280 nm (aé

lula de 1 cm)

Rendimento da operação: 43%*

Rendimento global· 27,7%.

Volume de saída; 16,8% do volume inicial de suspensão de células.

Ensaio calculado: 0,8 grama de bGH/litro.

Factor de enriquecimento: 2

Tampão para lavagem da coluna (borato de sódio 10 mM, pH 9)

Ajustou-se a pH 10 0,62 grama de ácido bóri co em 750 mililitros de água desionizada com HC1 concentrado, diluíu-se a 1 litro com água desionizada e, caso necessário, reajustou-se a pH 9,0.

Tampão para eluição (borato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 9)

Ajustaram-se a pH 9,0 com HGl concentrado

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3,81 gramas de borato de sódio deca-hidratado e 5,85 gramas de cloreto de sódio em 750 mililitros de água desioniza da e, caso seja nacessário, reajustou-se a pH 9,0.

Tampão para regeneração (acetato de sódio

1 M, pH 3,0)

Ajustou-se a pH 3,0 com HCl concentrado

136,09 gramas de acetato de sódio. 3 HgO em 750 mililitros de água desionizada, diluíu-se até perfazer 1 litro com água desionizada e, caso seja necessário, reajustou-se a pH

3,0.

EXEMPLO 12

Concentração e Diálise

Ajustou-se a pH 10,5 com NaOH 1 normal a

fracção de bGH da operação de permuta de ião (84 litros, 43.000 unidades de densidade óptica) (Exemplo 11). Concentrou-se a solução ajustada mediante ultrafiltraçao através dum ultrafiltro Millipore Pellicon ® equipado com três cassetes de corte a 10.000 peso molecular (tipo PTGC) de 0,46

1 cm) calculada do produto de retenção ser igual a 10. 0 ultrafiltrado não devia conter bGH e foi rejeitado. 0 produ to de retenção estava geralmente concentrado por um factor de aproximadamente 20 (4,2 litros de produto de retenção). Os débitos são indicados na Tabela 2.

Depois de a bGH ter sido concentrada, a solução foi dessalificada por diálise contra NH^OH usando 0 Sistema Pellicon ® com a cassette de corte a 10 K peso mole cular (diafiltração). Ao produto de retenção adicionou-se continuamente solução 3 mM de NH^OH (25 volumes por volume de produto de retenção ou 105 litros de NH^OH 3 mM neste ca so) a um débito precisamente suficiente para compensar a perda de volume por diafiltração, 0 diafiltrado foi então rejeitado. Contém sais e 10/ da bGH de entrada tal como me31 -

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dida por absorvência, O retido contendo a bGH dessalificada é esgotado do Sistema Pellicon^ e lavou-se 0 ultrafiltro com uma pequena quantidade de NH^OH 3 mM que se combinou com 0 produto de retenção. 0 volume do produto de retenção antes da adição do líquido de lavagem era igual a 4,2 litros (39.000 unidades de densidade óptica) a uma concentração de 14,6 gramas de bGH/litro. Os débitos são indicados na Tabela 3.

Tabela 2

Débitos para a UItrafiltração de 10 K peso molecular ¹

Condições	Débito por unidade de área da membrana	Débito com 3 cassettes (1,39 m²) (15 pé²)
Débito de ultrafiltraçao	1,8 1/h 0,09 m²
quando 0 produto de re-
tenção é 0 mais concen-
trado	(pé²)	27 1/h
Débito de ultrafiltraçao
quando 0 produto de re-	2,4 l/h 0,09 m
tenção é 0 mais diluído	(pé²)	36 lA
Débito de recirculaçao
quando 0 produto de re-
tenção é 0 mais concen-	9 1/h 0,09 nT
trado	(pé²)	2,25 1/min
Débito de recirculaçao
quando 0 produto de re-	6 1/h 0,09 nr
tenção é 0 mais diluído	(pé²)	1,5 1/min

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1 2

A uma pressão de entrada de 1,4 kg/cm relativos (20

rt 2

psig) e uma contrapressao igual a 0,7 kg/m relativos (10 psig).

Tabela 3

Débitos para a Diafiltração³" contra NH^OH 3 mM

Condições	Débito por unidade de área da membrana	Débito com 3 cassettes 1,39 m²(15 pé²)
Débito de ultrafiltração	2,4 1/h 0,09 m²(pé²)	36 1/h
Débito de recirculação	9 1/ 0,09 m²	2,25 l/min

2

A uma pressão de entrada de l,05hg/cm relativos (15

Λ» 2

psig) e uma contrapressao de 0,35 kg/cm relativos (5 psig)

Método do ensaio: Absorvência a 280 nm (célula de 1 cm)

Rendimento da operação: 90/

Rendimento global: 25/

Volume de saída: 0,84/ do volume inicial de suspen são de células

Ensaio calculado: 14,6 gramas de bGH/Litro.

Factor de enriquecimento: 18,3.

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Ref: 385.154

EXEMPLO 13

Secagem com Congelação

0 produto de retenção e a lavagem da operação de diálise (4,2 litros, 39.000 unidades de densidade ój> tica a uma concentração de 14,6 gramas de bGH/Litro) foram congelados num vaso de vidro alto, 0 vaso foi ligado a um secador laboratorial de liofilização durante 24 a 48 horas até ao seu conteúdo ser liofilizado até à secura. A superfí cie exterior do vaso foi exposta à temperatura ambiente durante todo o ciclo de secagem. Não se verificou a perda detectável de bGH. A bGH (61,3 gramas) foi colectada como um pó branco leve.

Método de ensaio: Absorvência na entrada e ensaios de libertação na bGH seca.

Rendimento da operação: 100$

Rendimento global: 25$

Volume de saída: 0,012$ do volume inicial de suspensão de células

Ensaio calculado: 100$ do volume da mistura

Pactor de enriquecimento: 68

0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da Améri ca, em 27 de Agosto de 1984 sob o ns. 644.435 e em 15 de Maio de 1985 sob ο η^δ. 734.450.

-

Claims

REIVINDICAÇÕES1® - Processo para arecuperação duma hormona de crescimento eucariótica purificada ou dum seu análogo a partir de uma célula bacteriana em que a hormona de cres34 56.527

Ref: 385.154

Μ

cimento eucariótica ou o seu análogo foi produzida por meio de expressão duma sequência de ADN que codifica a hormona ou o seu análogo, caracterizado pelo facto de compreender as seguintes operações:

a. rompimento da parede celular da célula hacteriana ou dos seus fragmentos para produzir um lisato;

b. separação dum precipitado contendo partículas e material insolúvel do lisato;

c. preparação duma suspensão do precipitado separado numa solução tampão apropriada;

d. tratamento da suspensão para efectuar o contacto entre líquido e sólidos;

e. separação de material parcial ou completamente precipita do da suspensão resultante do contacto líquido-sólidos;

f. solubilização do precipitado separado numa quantidade su ficiente de solução aquosa e ajustamento do pH a um pH alcalino apropriado para se formar uma solução;

g. separação da hormona solubilizada ou do seu análogo proveniente de outros componentes celulares, por ultrafiltração sob condições apropriadas para produzir um ultrafiltrado contendo a hormona ou o seu análogo e um produto de retenção; e

h. tratamento da hormona solubilizada ou do seu análogo de maneira a purificar e a concentrar mais a hormona ou o seu análogo e a recuperar por este meio a hormona purifi cada ou o seu análogo.

26 - Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo facto de a hormona ou o seu análogo ser uma hormona de crescimento animal ou um seu análogo.

36 - Processo de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo facto de a hormona ou o seu análogo ser hormona de crescimento bovina ou um seu análogo.

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Ref: 385.154

1 ítõj US&ll

4β - Processo de acordo com a reiviridicação 3, caracterizado pelo facto de o análogo compreender a sequência de aminoácidos Met-Asp-Gln adicionada à extremidade N da forma de fenilalanina de hormona de crescimento bovina natural e a célula bacteriana ser a estirpe de Escherichia coli com o NS da ATGC 39806.

5® - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o análogo compreender um resíduo de metionina adicionado à extremidade N da forma de fenilalanina da hormona de crescimento bovina natural e a célula bacteriana ser a estirpe de Escherichia coli com o NS da ATCC 39785.

6s - Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado pelo facto de a hormona ou 0 seu análogo ser hormona de crescimento humana ou um seu análogo.

7® - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de 0 análogo compreender a sequência de aminoácidos da hormona de crescimento humana natural que começa em Met e a célula bacteriana ser uma es tirpe de Escherichia coli com o NS da ATCG 39386.

8e - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de 0 análogo compreender a sequência de aminoácidos da hormona de crescimento humana natural precedida por metionina na extremidade N e a célula bacteriana ser uma estirpe de Escherichia coli com 0 N^e da ATGC 39384.

9§ - Processo de acordo com a reivindicação

2, caracterizado pelo facto de a hormona ser hormona de crescimento porcina ou um seu análogo.

10ô - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de 0 análogo compreender um resíduo de metionina adicionado à extremidade N da forma de fenilalanina de hormona de crescimento porcina natural e a célula bacteriana ser uma estirpe de Escherichia coli com 0 NS da ATCG 39804.

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11® - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a hormona ou 0 seu análo go ser hormona de crescimento de frangos ou um seu análogo.

12® - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de 0 análogo compreender um resíduo de metionina adicionado à extremidade N da forma de fenilalanina de hormona de crescimento de frangos natural e a célula bacteriana ser uma estirpe de Escherichia co· li com ο Νδ da ATCC 39792.

13® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, antes da operação a), a célula bacteriana ou os seus fragmentos serem mantidos em suspensão na mistura de fermentação ou serem suspensos numa solução tamponada apropriada a um pH neutro.

14® - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o pH neutro ser igual a cerca de 7,4.

15® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, na operação a) as células serem rompidas mecanicamente.

16® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se diluir 0 lisado com uma quantidade apropriada de água desionizada antes de se separar 0 material em partículas.

17® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a separação na operação

b) ou na operação e) compreender centrifugação.

18® - Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a separação na operação

b) ou na operação e) compreender ultrafiltração,

19® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de 0 tratamento na operação

d) compreender, adicionalmente, 0 contacto da suspensão durante um período de tempo apropriado com uma enzima adequa- 37 56.527

Ref; 385Λ54

da capaz de digerir polissacaridos presentes na suspensão.

20® - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de a enzima apropriada ser lisózima.

21® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de 0 tratamento na operação

d) para efectuar 0 contacto entre o líquido e sólidos compreender a acção de ultrassons.

22® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição à suspensão duma quantidade adequada dum agente tensioactivo apropriado e se incubar a suspensão durante um perío do de tempo apropriado anteriormente ã efectivação do contacto líquido-sólidos da suspensão na operação d).

23® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de 0 material precipitado separado parcial ou completamente da suspensão submetida a contacto líquido-sólidos na operação e) ser novamente suspensa numa quantidade adéquada dum meio apropriado, a suspensão assim preparada ser submetida a um contacto de liqui. do-sólidos sob condições apropriadas e 0 material precipita do resultante ser separado da suspensão em que se realiza o contacto líquido-sólidos antes da solubilização na operação f).

24® - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de 0 meio apropriado ser uma solução aquosa tamponada ou não tamponada.

250 - Processo de acordo com a reivindicação 23, earaeterizado pelo facto de se suspender novamente 0 precipitado resultante, se submeter a suspensão a contacto líquido-sólidos e se separar pelo menos, mais uma vez.

26® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de 0 pH alcalino apropriado para se efectuar a solubilização na operação f) ser um pH de cerca de 9,0-12,0.

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Ref: 385.154

/

27® - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de, depois de se ter solubilizado 0 precipitado a um pH igual a cerca de 9,0-12,0, 0 pH ser feito baixar para cerca de 10,5.

28® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar uma quantidade adequada duma solução aquosa de borato de sódio apropriadamente concentrada à solução obtida na operação f).

29® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda a clarificação da solução obtida na operação f) por contacto líquido-sólidos da solução sob condições apropriadas, a centrifugação da solução submetida a contacto líquido-sólidos sob condições apropriadas, a separação do líquido sobrenadante e a filtraçao do líquido para se produzir uma solução clarificada contendo a hormona ou o seu análogo.

30® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a separação por ultrafil tração na operação g) se efectuar com uma membrana apropria da tendo um ponto de corte de cerca de 100 K do peso molêcu lar,

31® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o produto retido obtido na operação g) ser submetido novamente a ultrafiltração pelo menos uma vez, antes ou depois do tratamento da operação

h).

32® - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de se diluir 0 produto retido com um tampão apropriado a um pH alcalino apropriado antes de ser novamente submetido a ultrafiltração.

33® - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de 0 pH alcalino apropriado ser igual a cerca de 9,0-12,0.

34® - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de se repetirem a diluição

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Ref: 385.154

e a ultrafiltração pelo menos uma vez.

356 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de se manter o produto retido com um volume substancialmente constante durante a ultrafiltração.

366 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facta de a ultrafiltração com um volume do produto retido substancialmente constante ser repetida pelo menos uma vez,

37® ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tratamento da hormona solubilizada na operação h) compreender cromatografia com permuta de iões.

38s - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de se efectuar a cromatografia com permuta de iões com uma resina de permuta de iões contendo amina.

39® - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de a resina de permuta de iões contendo amina ser dietilaminoetil-dextrano ou dietilaminoetil-sefarose.

40® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se concentrar a hormona purificada ou o seu análogo por ultrafiltração.

41® - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se purificar ainda a hor mona purificada ou o seu análogo por meio de diálise seguida de secagem.

42® - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a diálise se efectuar em relação a uma solução contendo uma concentração adequada dum sal apropriado.

43® - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo facto de o sal apropriado ser hidróxido de amónio ou bicarbonato de amónio.

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44® - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a secagem se efectuar por liofilização.

45® - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se efectuar a secagem por meio de pulverização sob condições apropriadas.