JPH0822879B2 - 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法 - Google Patents

冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法

Info

Publication number
JPH0822879B2
JPH0822879B2 JP61266504A JP26650486A JPH0822879B2 JP H0822879 B2 JPH0822879 B2 JP H0822879B2 JP 61266504 A JP61266504 A JP 61266504A JP 26650486 A JP26650486 A JP 26650486A JP H0822879 B2 JPH0822879 B2 JP H0822879B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ahf
solution
concentration
peg
containing supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61266504A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62181220A (ja
Inventor
マリア、アーリンダ、シー、サーノ
クリフォード、アール、グラーフ
ロドルフォ、エイ、バスケス
Original Assignee
バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25168481&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0822879(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド filed Critical バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド
Publication of JPS62181220A publication Critical patent/JPS62181220A/ja
Publication of JPH0822879B2 publication Critical patent/JPH0822879B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は、抗血友病因子（AHF）の精製および／また
は濃縮方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、冷沈
澱を使用して寒性沈澱した血漿から回収された最終AHF
製品の改良方法に関する。
血液凝固のプロセスは複雑な生物学的活動であり、そ
して正常な全血に見出されるいくつかの物質の相互作用
を含んでいる。血液凝固メカニズムに関連したある種の
因子がある種の個人には存在しないか、重大に欠乏して
いることが知られている。例えば、古典的血友病（血友
病Ａ）はAHF（因子VIII）の欠乏によっておこる病気で
ある。血友病Ｂとして知られる先天的血友病にかかって
いる個人では、血液は血漿トロンボプラスチン成分（PT
C,因子IX）が欠乏している。凝固メカニズムにおいて重
要であるいくつかの他の因子は因子II,VIIおよびＸであ
る。
過去において、血友病の治療は患者へ全血または血漿
を輸血することよりなっていた。より良い医学的プラク
ティスは、可能ならばいつでも患者へ彼が欠乏している
血液成分を投与すべきことを指示する。血液の全般的不
足のため、血液をその種々の成分に分画し、それによっ
て個々の成分を必要な時患者の処置に使用できることが
有利である。
血液および血漿をその別々の成分またはその濃縮物に
分画する種々の方法が知られている。アルコール分画方
法の発展についての業績は注目すべきものがある。特に
AHFの製造に関しては、最近の米国特許第4,383,989号、
4,386,068号、4,387,092号および第4,404,131号は高度
に精製されたAHFの濃縮物を得る改良された方法を例証
する。
不幸にも、AHFの単離に関連する多数の問題が存在す
る。AHFは、それ自体フィブリノーゲンおよびフィブロ
ネクチンのような、血漿中の他のタンパクと密接に関連
した糖タンパクである。フィブリノーゲンおよびフィブ
ロネクチンは最終AHF溶液中の夾雑物と考えられてい
る。それ故最終製品中にAHFの高い比活性を維持しなが
ら、血漿からできるだけ多くのフィブリノーゲンおよび
フィブロネクチンを沈澱除去することが必要である。ま
た、AHFの低溶解度は患者へ多量の流体の投与を必要と
するから、高い溶解度を持つ最終AHF製品を得ることが
有利である。多量の流体は患者の心臓および循環に対す
るストレインであり、そして血友病患者を失われた血液
因子の連続的置換または注入に依存性とし、そして投与
のため医師の助けを必要とする。最終製品中の高いフィ
ブリノーゲンおよびフィブロネクチン含量は所望より低
い溶解度を招く。
種々の方法がこの分野でAHFを単離するために知られ
ているが、しかしこれらの方法はしばしば実施するのに
極端に高価であり、そして最終AHF製品に高い溶解度、
低いフィブリノーゲンおよびフィブロネクチン含量、AH
Fの高い比活性、および最初の血漿からの高いAHF収率の
最適な組合せを提供しない。それ故必要なのは、これら
すべての基準を満たし、そして禁止的に高価でないAHF
を単離する方法である。本発明はこれら要請を満足さ
せ、そして他の関連する利益を提供する。
本発明の概要 本発明は、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン
を含む夾雑物の冷沈澱、および得られた上清液からその
後の回収による、血漿の寒性沈澱溶液からAHFを単離す
る方法に存する。最初の冷沈澱ステップの間に寒性沈澱
へカルシウムイオン源の添加は、フィブリノーゲンおよ
びフィブロネクチンの所望の沈澱を助け、他方プロセス
中の種々のステップの一つにおいてポリエチレグリコー
ル（PEG）の添加は、最終AHF製品の溶解度を大きく増加
し、そしてPEGをいつ加えるかによってフィブリノーゲ
ンおよびフィブロネクチン含量を低下させるように作用
し得る。生成するAHF製品は、他の方法によって単離し
たAHF製品よりもより少ない夾雑物、より大きい溶解度
およびより高い比活性を有する。
本発明方法は冷凍血漿から寒性沈澱を形成することを
含む。寒性沈澱を蒸留水に溶解し、低イオン強度の溶液
をつくる。カルシウムイオン源、好ましくは塩化カルシ
ウムが、しかしカルシウムイオン濃度を非活性化強度に
するのに十分な量だけ添加される。カルシムウ塩が可溶
性であり、そして塩の陰イオン部分が無毒性でそしてキ
レーターでない限り、任意のカルシウム塩をカルシウム
イオン源として使用することができる。フィブリノーゲ
ンおよびフィブロネクチンが次にかきまぜながら溶液の
pHを調節し、そして温度を下げることによって沈澱させ
られる。次にAHFが沈澱およびロ過によって得られた上
清液から回収される。
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの沈澱の
後、得られた混合物が遠心され、沈澱が捨てられる。上
清液のpHが最初に調節され、そして限外ロ過によってあ
る比重量／容積％（w/v％）へ濃縮される。塩化ナトリ
ウムの添加によって溶液のナトリウム濃度を調節しそし
てpHを調節した後、溶液のpHを約80℃へ調節する。グリ
シンへ加え、温度を下方へ約２℃に調節し、AHFを沈澱
する。混合物を遠心し、そしてAHF沈澱をクエン酸添加
食塩水に懸濁し、その後pHを調節する。ロ過後、溶液を
所望の力価へ希釈し、再びロ過し、バルクAHF溶液を得
る。バルクAHF溶液を次に最終容器中へ小分けし、冷凍
乾燥し、加熱する。最終AHF製品を約５℃で貯蔵する。
PEGを回収プロセスの種々の段階で様々の結果をもっ
て添加することができる。もしPEGを最終ロ過ステップ
の直前に加えるならば、主要な利益は溶解度の増大であ
ろう。PEGを回収プロセスの間のある点で添加する限
り、それは最終AHF溶液中に存在し、溶解度が増加する
であろう。
PEGはグリシン添加ステップの直前に加えることもで
きる。この時点のPEGの添加は上清液からAHFの沈澱を助
け、そして最終AHF製品の増大した溶解度を与える。
代わりに、PEGは最初の冷沈澱の間、pHおよぞ温度調
節ステップの中間において添加することができる。プロ
セスのこの時点において添加されるPEGの量は、AHFがフ
ィブリノーゲンおよびフィブロネクチンと一所に沈澱し
ないように注意深く制御しなければならない。PEGが冷
沈澱の間に添加される時は、後のAHF回収ステップに対
し調節がなされなければならない。特に、生成する上清
液の濃度は添加したPEGの量に応じて低い重量／容積パ
ーセントとしなければならず、そしてナトリウム濃度は
最適結果のため高いレベルへ調節すべきである。その間
にPEGを添加することができるプロセスの三つの異なる
段階のうち、最終製品中に減少したフィブリノーゲンお
よびフィブロネクチン含量と、そして最終製品の増大し
た溶解度を与えるため、後二者が好ましい。
本発明の他の特徴および利益は、例示のため本発明の
原理を例証する以下の詳細な説明から明らかになるであ
ろう。
好ましい具体例の詳細な説明 本発明は、AHFを寒性沈澱した血漿から回収する方法
に具体化される。該方法は、一般に、フィブリノーゲン
およびフィブロネクチンのような夾雑タンパクを沈澱除
去するため、寒性沈澱の冷沈澱と、沈澱およびロ過によ
る生成した上清液からAHFの回収を含む。冷沈澱ステッ
プの間カルシウムイオン源の添加はフィブリノーゲンお
よびフィブロネクチンの沈澱を増加させ、それによって
最終AHF製品中のこれら夾雑物の最終濃度を低下させ
る。回収プロセスの段階の一つにおいて添加されたポリ
エチレングリコール（PEG）は最終AHF製品の溶解度を増
大するであろう。回収プロセスのどの段階でPEGが添加
されるかによって、それもフィブリノーゲンおよびフィ
ブロネクチンまたはAHFの沈澱を助けるであろう。この
方法は高い溶解度、高い比活性、低いフィブリノーゲン
およびフィブロネクチン濃度、そして高収率をもった最
終AHF製品を有利に与える。
さらに詳しくは、本発明方法は冷凍血漿のボトルから
出発することを含む。実施例１に述べるように、寒性沈
澱はこの分野で既知の技術に従って、冷凍血漿から制御
された環境において解凍することによって集められる。
寒性沈澱は20℃〜35℃，好ましくは約23℃において注
入のため水に溶解される。0.001mMと1.0mMの間の最小カ
ルシウム濃度を与えるのに十分な塩化カルシウムが添加
される。pHが約6.5±0.2へ調節され、そして溶液は混合
下５℃と15℃の間へ冷却される。
フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン夾雑物を含
んでいる生成する沈澱を遠心によって除去する。AHFを
含んでいる上清液のpHを7.0±0.2へ調節し、限外ロ過に
よって1.0w/v％および4.0w/v％の間のタンパク濃度へ濃
縮される。使用される限外ロ過ユニット、公称100,000
の分子量カットオフを有するポリスルホンまたは均等の
膜である。
限外ロ過後、リテネートを塩化ナトリウムで約150な
いし800mEq/lのナトリウム濃度へ調節され、そしてpHが
水酸化ナトリウムで7.3±0.2へ調節される。溶液ｌあた
り、1.0ないし11.0gのPEGが添加される。溶液は次に８
℃±0.5℃へ冷却され、グリシンが1.3Mないし2.5Mの濃
度へ添加される。溶液の温度はAHFを沈澱させるため混
合下２℃±２℃へ調節される。
生成した溶液を遠心し、今やAHFを含んでいる沈澱は
クエン酸添加食塩緩衝液（塩化ナトリウム0.12Mおよび
クエン酸ナトリウム0.2M）中に懸濁し、所望のAHF活性
へ希釈される。溶液はもし必要ならば所望のAHF活性へ
再調節され、そしてロ過によって滅菌される。
生成するバルク溶液は最終容器へ小分けされ、冷凍乾
燥され、無菌条件下でシールされる。シールされたバイ
アルは次に減少されたビールスリスクのため加熱され
る。
実施例１に使用したAHF回収方法の結果が表１に示さ
れている。該表に見られるように、最終AHF製品の溶解
度は非加熱形で53秒、加熱形で64秒であった。比較のた
め、表５においてPEGの添加なしの同じ方法によって製
造したAHFの溶解度は加熱後492秒であった。さらに表１
に示すように、最終AHF製品のフィブリノーゲン含量は4
18mg/dlと比較的低いレベルであり、他方AHFの比活性は
3.40u/mgタンパクと望ましく高いレベルであった。
冷沈澱ステップの間に添加されるカルシウムイオン源
は、該塩が可溶性で、そして陰イオン部分が無毒性でキ
レーターでない限り、任意のカルシウム塩でよい。使用
できないキレーターの例はクエン酸カルシウムおよびシ
ュウ酸カルシウムである。例示のため、そして限定では
なく、塩化カルシウムに加えて使用し得るカルシウム塩
は炭酸カルシウムおよびグルコン酸カルシウムである。
冷沈澱ステップの間にカルシウムイオンの添加はフィ
ブリノーゲンおよびフィブロネクチン夾雑物の増加した
沈澱をもたらす。しかしながら、溶液が非反応性を保っ
ているようにカルシウム塩の限定された量を添加しなけ
ればならない。反応性溶液は凝固を生じ、溶液を使用不
能にするであろう。
実施例１におけるようにAHF沈澱ステップの間にPEGを
加える代わりに、PEGは実施例２〜４に示すように、フ
ィブリノーゲンおよびフィブロネクチンの冷沈澱の間に
加えることができる。実施例2Aにおいて、AHF回収プロ
セスは、試薬および溶液の同じ割合およびパーセント
と、異なった絶対容積および重量をもって、しかしAHF
回収プロセスのどの点でもPEGの添加なしに、実施例１
に使用されたものと同じ前述の基本プロセスを用いて実
施された。実施例2Bにおいて、AHF回収プロセスは実施
例１に類似の実質上同様な態様で実施されたが、しかし
AHF沈澱ステップの間0.9w/v％PEG添加の代わりに、0.25
w/v％PEGがプロセスの冷沈澱段階のpH調節と温度調節ス
テップの間に添加された。限外ロ過濃縮とナトリウム濃
度調節は実施例１と同じに実施され、濃縮は3.0w/v％へ
実施され、そしてナトリウム濃度は160mEq/lへ調節され
た。表２に見える結果の比較は、AHF製品の比活性とフ
ィブリノーゲン含量に劇的な改善を示す。表２に示す結
果を得たテストは、充填、冷凍、凍結乾燥直前のバルク
AHFサンプルについて実施された。PEGサンプルの比活性
は3.21u/mgタンパクであり、他方PEGなしのサンプルの
比活性はたった2.38u/mgタンパクであった。同様に、PE
Gサンプルのフィブリノーゲン含量は実質的により低い9
37.4mg％であった。
本発明のプロセスは冷沈澱ステップ中0.25％PEGを使
用し、そしてAHF沈澱ステップの間ナトリウム濃度の調
節なしで実施し得るが、冷沈澱ステップの間のPEGの添
加は上清液中の低タンパク濃度をもたらし、これは代わ
りにナトリウム濃度調節を示唆する。このように、実施
例３において、AHF回収プロセスは実施例２におけるの
と同じに実施されたが、しかしAHF沈澱ステップの間の
ナトリウム濃度は160mEq/lではなく600mEq/lへ調節され
る。充填、冷凍および凍結乾燥直前のバルクAHFのテス
トから得られた表３に示した結果は、AHFサンプルの比
活性およびフィブリノーゲン含量の両方の改善を示し、
それらはそれぞれ3.48u/mgおよび565.1mg％であった。
一般に、AHF沈澱ステップの間のナトリウム濃度は150mE
q/lないし約800mEq/lの範囲内に調節することができ
る。
冷沈澱ステップ中より高い濃度のPEGの添加は、実施
例４および表４に示すように、もっと有利な結果を提供
する。実施例４において、0.5g％のPEGが実施例３にお
いて加えられた0.25g％の代わりに冷沈澱の間に添加さ
れた。AHF沈澱ステップの間AHF溶液を3.0w/v％ではなく
2.0w/v％へ濃縮したことを除き、AHF沈澱の間ナトリウ
ム濃度を600mEq/lへ調節することを含む、プロセスの残
りを通じ濃度およびステップは同じであった。フィブリ
ノーゲンおよびフィブロネクチンの冷沈澱の間添加され
たPEGのより高いパーセントにおいて、AHF沈澱ステップ
の間AHF溶液の濃度は最適結果のため減少されなければ
ならない。表４に示すバルクAHFについて実施されたテ
スト結果は、AHF製品の比活性5.04u/mgと、フィブリノ
ーゲン含量281mg％を示し、両者とも実施例３で得られ
た結果よりも良い。
最終AHF製品中のPEGの存在はAHF製品の溶解度を改善
する。厳格に溶解度観察からは、その存在は最終AHF製
品に至るプロセスを通じ残るから、PEGを添加する時は
問題ではない。実施例５および表５は、最終AHF製品中
の存在の溶解度に対する影響を示す。実施例５において
実施されたテストは、所望の力価への希釈の直後そして
最終ロ過プロセスの間の無菌ロ過ステップの直前にAHF
沈澱した溶液へ0.2g％PEGの添加を含んでいた。表５は
実施例５に使用した方法と、そしてPEG添加なしの同じ
方法の実施例2Bに使用した方法との間の比較結果を示
す。PEGを含有するAHF製品の溶解度は、PEGを添加しな
いAHF溶液の351秒に比較して、加熱前301秒であった。
同様に、加熱後のPEG溶液の溶解度は、PEG添加剤を含ま
ない溶液の492秒に比較し、234秒であった。勿論この段
階において溶液へPEGを添加することはPEG無添加に比較
して有利であるが、フィブリノーゲンおよびフィブロネ
クチンの増加した沈澱の利益は、PEGが冷沈澱ステップ
の間に添加される実施例２〜４におけるように実現され
ないであろう。従って実施例2,3および４の方法が好ま
しく、実施例４に示した方法が最も好ましい。
AHF回収プロセスにおける種々の段階におけるPEGの添
加の利益を例証したが、PEG添加なしの、しかし冷沈澱
ステップ中溶解した寒性沈澱へカルシウムイオン源を添
加した実施例2Aに記載した方法は、それ自体この分野に
おいて既知の現今のAHF回収技術を上廻る有意な前進で
あることが強調されなければならない。
以下の実施例は、ここに論じた具体例に従った本発明
を例証するであろう。
以下の実施例および特許請求の範囲においてPEGの添
加量につき「ｇ％」で示しているのは、PEG添加前の溶
液の単位体積に対するPEGの重量％を意味し、その場合P
EG添加後の溶液の体積はPEG添加前の溶液の体積と異な
る場合があるので厳密にはw/v％と一致するものではな
いが、ほぼそれに等しい。
実施例１ 冷凍血漿75lがこの分野で既知の技術に従って制御さ
れた環境において解凍された。遠心後、寒性沈澱に乏し
い血漿をジャケットつきステンレス鋼反応タンクへ集め
た。
得られた寒性沈澱6.0kgを23℃で水24kgに溶解した。
0.68mM塩化カルシウム溶液2.4kgを最小カルシウム濃度5
0μＭを与えるように加えた。溶液のpHを酢酸110mlの添
加によって6.5へ調節した。次に溶液を混合しながら循
環水浴中において９℃へ冷却した。
生成した沈澱をベックマンモデルJ6Bバケット遠心機
中において遠心によって除去した。NaOH37mlの添加によ
って上清液のpHを7.0へ調節し、そして溶液を限外ロ過
によって3w/v％のタンパク濃度へ濃縮した。使用した限
外ロ過ユニットは、100,000の公称分子量カットオフを
持ったポリスルホン膜であった。
限外ロ過後、リテネートをNaCl49.4gの添加によって1
60mEq/lのナトリウム濃度へ調節した。次に1N水酸化ナ
トリウム7mlの添加によってpHを7.3へ調節した。PEG60g
（9.0g/l）を添加し、溶液を循環水浴中で８℃へ冷却し
た。グリシン0.85kgを加え、その濃度を1.7Mとした。次
に溶液の温度を混合しながら循環水浴内において２℃へ
調節した。
得られた溶液をベックマン遠心機内において遠心し、
沈澱をクエン酸添加食塩緩衝液（塩化ナトリウム0.12M
およびクエン酸ナトリウム0.02M）1.9kg中に懸濁し、溶
液を60AHF単位/mlへ希釈した。溶液のpHを1N酢酸2mlの
添加によって6.8へ調節し、そして溶液をロ過によって
清澄化した。溶液をクエン酸添加食塩緩衝液3lの添加に
よって40AHF単位/mlのAHF活性へ再調節し、そして得ら
れた溶液をロ過によって滅菌した。
得られたバルクAHF溶液7.8lは30ml容器へ小分けさ
れ、AHF溶液10mlが各容器へ収容された。次に容器が冷
凍され、凍結乾燥され、そして熱処理された。
実施例2A 実施例１に述べた同じプロセスを使用し、溶液中の試
薬の同じ割合およびパーセントであるが、しかし物質の
異なる絶対容積および重量をもってAHFの回収を実施し
た。しかしながらAHF沈澱ステップは実施しなかった。A
HF回収プロセスを通じPEGは添加しなかった。
実施例2B 実施例１に述べた同じプロセスを使用し、溶液中の試
薬の同じ割合およびパーセントであるが、しかし物質の
異なる絶対容積および重量をもってAHFの回収を実施し
た。しかしながらAHF沈澱ステップ中溶液ｌ当たりPEG9.
0gの添加の代わりに、フィブリノーゲンおよびフィブロ
ネクチンの最初の冷沈澱ステップの間6.5へのpH調節と
９℃への温度調節ステップの間にPEG0.25g％を加えた。
実施例2Aおよび2Bにおいて回収された製品の比活性お
よびフィブリノーゲン含量テストの結果は表２に見られ
る。
実施例３ AHF沈澱ステップ中ナトリウム濃度を160mEq/lではな
く600mEq/lへ調節したことを除き、実施例2Bに述べたよ
うにAHFを回収した。充填し、冷凍し、凍結乾燥直前
に、バルクAHF溶液をテストした。結果は表３に見られ
る。
実施例４ 冷沈澱ステップ中0.25g％PEGではなく、0.50g％PEGを
添加し、AHF沈澱ステップ中溶液は3.0w/v％総タンパク
ではなく、2.0w/v％総タンパクへ濃縮されたことを除
き、実施例３に述べたようにAHFが回収された。実施例
３におけるように、AHF沈澱ステップ中のナトリウム濃
度は600mEq/lへ調節された。実施例４において得られた
バルクAHF溶液について実施されたテスト結果は表４に
見られる。
実施例５ 冷沈澱ステップ中0.25g％PEGを加える代わりに、所望
力価へ希釈直後そして無菌ロ過ステップが最終ロ過プロ
セスの間に実施される直前に0.2g％PEGがAHF沈澱溶液へ
加えられたことを除き、実施例2Bに述べたようにAHFが
回収された。次に0.2g％PEGの代わりに0.1g％PEGを添加
する同様な態様の他のAHF回収テストが次に実施され
た。回収プロセスのどの段階でもPEGが添加されない、
二つの他のAHF回収テストも実施例2Aに述べたように実
施された。実施例５において実施された四つの異なる実
験において得られた製品の溶解度テストの結果を、凍結
乾燥製品の加熱前および凍結乾燥した製品の加熱後にお
いて表５に示す。
前出の実施例および説明は、本発明の理解を助けるた
めに提供され、そして例示のみである。それらは本発明
をどのような形でも限定することを意図しない。当業者
は、特定の状況に応じて他の方法および／または材料を
使用することができ、そしてなお本発明の範囲および精
神内にとどまることを認識するであろう。従って、本発
明は請求の範囲を除き、限定されることを意図しない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロドルフォ、エイ、バスケス アメリカ合衆国カリフォルニア州 90650、 ノーウォーク、シブリーストリート 11503

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）寒性沈澱した血漿を水中に溶解し、 （ｂ）該溶液中のイオン化したカルシウムの濃度を0.00
    1mMないし1.0mMの濃度へ調節するようにカルシウムイオ
    ン源を添加し、 （ｃ）該溶液をpH約6.0ないし約7.0へ調節し、 （ｄ）該溶液の温度を、約５℃から約15℃へ沈澱とAHF
    含有上清液を生成するのに十分な時間調節し、 （ｅ）前記AHF含有上清液を回収し、 （ｆ）AHFを前記AHF含有上清液から回収することを含
    む、血漿または血漿分画からAHFを精製および濃縮する
    方法。
  2. 【請求項２】その中に前記寒性沈澱した血漿が溶解され
    る水は、約20℃ないし約35℃の温度である第１項の方
    法。
  3. 【請求項３】前記水の温度は約23℃である第２項の方
    法。
  4. 【請求項４】前記カルシウムイオン源はカルシウム塩で
    ある第１項の方法。
  5. 【請求項５】前記カルシウム塩は塩化カルシウムである
    第４項の方法。
  6. 【請求項６】前記溶液へ添加される塩化カルシウムの濃
    度は約0.05mMである第５項の方法。
  7. 【請求項７】前記溶液のpHはステップ（ｃ）において約
    6.5へ調節される第１項の方法。
  8. 【請求項８】前記溶液の温度はステップ（ｄ）において
    約９℃に調節される第１項の方法。
  9. 【請求項９】前記ステップ（ｅ）および（ｆ）は、 （ｉ）前記沈澱を前記AHF含有上清液から分離し、 （ii）前記AHF含有上清液を所望の総タンパクレベルへ
    濃縮し、 （iii）前記AHF含有上清液のナトリウム濃度を所望レベ
    ルへ調節し、 （iv）前記AHF含有上清液へ所望のグリシン濃度を得る
    ようにグリシンを沈澱剤として添加し、 （ｖ）前記AHF含有上清液の温度をAHFを含む沈澱の生成
    を制御するために所望のレベルへ調節し、 （vi）前記AHFを含む沈澱を回収することよりなる第１
    項の方法。
  10. 【請求項１０】ステップ（ｉ）における前記分離は遠心
    またはロ過によって行われる第９項の方法。
  11. 【請求項１１】ステップ（ii）における前記濃縮は限外
    ロ過によって行われる第９項の方法。
  12. 【請求項１２】ステップ（ii）における前記所望の総タ
    ンパクレベルは約1.0w/v％ないし約4.0w/v％である第９
    項の方法。
  13. 【請求項１３】ステップ（ii）における前記所望の総タ
    ンパクレベルは約2.5w/v％ないし約3.0w/v％である第12
    項の方法。
  14. 【請求項１４】前記ナトリウム濃度はステップ（iii）
    において約150mEq/lないし約800mEq/lへ調節される第９
    項の方法。
  15. 【請求項１５】前記ナトリウム濃度はステップ（iii）
    において約160mEq/lへ調節される第14項の方法。
  16. 【請求項１６】ステップ（iv）におけるグリシンの所望
    濃度は約1.3Mないし約2.5Mである第９項の方法。
  17. 【請求項１７】ステップ（iv）におけるグリシンの所望
    濃度は約1.7Mである第16項の方法。
  18. 【請求項１８】ステップ（ｖ）において温度は約０℃な
    いし約４℃に調節される第９項の方法。
  19. 【請求項１９】前記温度は約２℃に調節される第18項の
    方法。
  20. 【請求項２０】ステップ（vi）における前記AHFを含む
    沈澱は遠心またはロ過によって前記上清液から分離され
    る第９項の方法。
  21. 【請求項２１】（ａ）寒性沈澱した血漿を水中に溶解
    し、 （ｂ）該溶液中のイオン化したカルシウムの濃度を0.00
    1mMないし1.0mMの濃度へ調節するようにカルシウムイオ
    ン源を添加し、 （ｃ）該溶液をpH約6.0ないし約7.0へ調節し、 （ｄ）該溶液の温度を、約５℃から約15℃へ沈澱とAHF
    含有上清液を生成するのに十分な時間調節し、 （ｅ）前記AHF含有上清液を回収し、 （ｆ）AHFを前記AHF含有上清液から回収することを含
    み、更に 上記ステップ（ａ）乃至（ｆ）のいずれかの最中、前ま
    たは後において溶液にポリエチレングリコールを添加す
    ることを含む、血漿または血漿分画からAHFを精製およ
    び濃縮する方法。
  22. 【請求項２２】前記ステップ（ｅ）および（ｆ）は、 （ｉ）前記沈澱を前記AHF含有上清液から分離し、 （ii）前記AHF含有上清液を所望の総タンパクレベルへ
    濃縮し、 （iii）前記AHF含有上清液のナトリウム濃度を所望レベ
    ルへ調節し、 （iv）前記AHF含有上清液へ所望のグリシン濃度を得る
    ようにグリシンを沈澱剤として添加し、 （ｖ）前記AHF含有上清液の温度をAHFを含む沈澱の生成
    を制御するために所望のレベルへ調節し、 （vi）前記AHFを含む沈澱を回収することよりなる、第2
    1項の方法。
  23. 【請求項２３】PEGが、前記AHFを含む沈澱を回収するス
    テップ（vi）において添加される、第22項の方法。
  24. 【請求項２４】添加されるPEGの量は約0.01g％ないし約
    0.5g％である第23項の方法。
  25. 【請求項２５】PEGが第22項のステップ（iii）と（iv）
    との間に添加される、第22項の方法。
  26. 【請求項２６】PEGはPEG濃度が約0.1w/v％ないし約1.1w
    /v％になるように添加される第25項の方法。
  27. 【請求項２７】PEGはPEG濃度が約0.9w/v％になるように
    添加される第26項の方法。
  28. 【請求項２８】PEGがステップ（ｃ）と（ｄ）の間に添
    加される第21項の方法。
  29. 【請求項２９】添加されるPEGの量は約0.1g％ないし約
    0.6g％である第28項の方法。
  30. 【請求項３０】添加されるPEGの量は約0.5g％である第2
    9項の方法。
  31. 【請求項３１】ナトリウム濃度はステップ（iii）にお
    いて約150mEq/lないし約800mEq/lに調節される第22項の
    方法。
  32. 【請求項３２】前記ナトリウム濃度は約600mEq/lに調節
    される第31項の方法。
  33. 【請求項３３】（ａ）寒性沈澱した血漿を水中に溶解
    し、 （ｂ）該溶液中のイオン化したカルシウムの濃度を0.00
    1mMないし1.0mMの濃度へ調節するようにカルシウムイオ
    ン源を添加し、 （ｃ）該溶液をpH約6.0ないし約7.0へ調節し、 （ｄ）該溶液の温度を、約５℃から約15℃へ沈澱とAHF
    含有上清液を生成するのに十分な時間調節し、 （ｅ）前記AHF含有上清液を回収し、 （ｆ）AHFを前記AHF含有上清液から回収することを含
    み、 前記ステップ（ｅ）および（ｆ）は、 （ｉ）前記沈澱を前記AHF含有上清液から分離し、 （ii）前記AHF含有上清液を所望の総タンパクレベルへ
    濃縮し、 （iii）前記AHF含有上清液のナトリウム濃度を所望レベ
    ルへ調節し、 （iv）前記AHF含有上清液へ所望のグリシン濃度を得る
    ようにグリシンを沈澱剤として添加し、 （ｖ）前記AHF含有上清液の温度をAHFを含む沈澱の生成
    を制御するため所望のレベルへ調節し、 （vi）前記AHFを含む沈澱を回収することよりなり、 さらに前記ポリエチレングリコールの添加は、前記ステ
    ップ（vi）において回収した沈澱を水溶液とし、これに
    約0.01w/v％ないし約0.5w/v％濃度のPEGを含有させるこ
    とよりなる第21項の方法。
JP61266504A 1985-11-08 1986-11-07 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法 Expired - Lifetime JPH0822879B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79655985A 1985-11-08 1985-11-08
US796559 1985-11-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62181220A JPS62181220A (ja) 1987-08-08
JPH0822879B2 true JPH0822879B2 (ja) 1996-03-06

Family

ID=25168481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61266504A Expired - Lifetime JPH0822879B2 (ja) 1985-11-08 1986-11-07 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4739039A (ja)
EP (1) EP0221566B1 (ja)
JP (1) JPH0822879B2 (ja)
AT (1) ATE79266T1 (ja)
AU (1) AU6487286A (ja)
CA (1) CA1293941C (ja)
DE (1) DE3686390T2 (ja)
ES (1) ES2051686T3 (ja)
ZA (1) ZA868516B (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8505882D0 (en) * 1985-03-07 1985-04-11 Central Blood Lab Authority Purification of blood coagulation factor viii
DE3806562A1 (de) * 1988-03-01 1989-09-14 Alpha Therapeutic Gmbh Zweikammerspritze mit einer fuellung aus aktivitaetsempfindlichem humanen protein als wirkstoff
ES2042138T3 (es) * 1989-05-24 1993-12-01 Miles Inc. Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente.
DE3926034C3 (de) * 1989-08-07 1996-11-21 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung eines stabilen Faktors VIII
IT1248723B (it) * 1990-06-12 1995-01-26 Scalvo S P A Processo per la purificazione del fattore viii e fattore viii ottenuto con tale processo
US5259971A (en) * 1992-03-02 1993-11-09 Cryolife, Inc. Method of preparing fibrinogen
US5330974A (en) * 1993-03-01 1994-07-19 Fibratek, Inc. Therapeutic fibrinogen compositions
US5523893A (en) * 1994-08-24 1996-06-04 Northrop Grumman Corporation Strain free temperature-compensated optical mounts
GB9424732D0 (en) * 1994-12-08 1995-02-08 Common Services Agency Heat treated blood plasma proteins
US5659017A (en) * 1995-11-07 1997-08-19 Alpha Therapeutic Corporation Anion exchange process for the purification of Factor VIII
JP5149470B2 (ja) 1999-02-22 2013-02-20 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 新規のアルブミンを含有していない第ｖｉｉｉ因子処方物
CA2742328C (en) 2008-11-07 2019-02-26 Baxter International Inc. Factor viii formulations
SG11201603028SA (en) 2013-10-18 2016-05-30 Universität Für Bodenkultur Wien Purification of proteins

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE713764A (ja) * 1967-05-01 1968-09-16 Baxter Travenol Lab
US3652530A (en) * 1967-08-28 1972-03-28 American Nat Red Cross Antihemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glycol
GB1507198A (en) * 1974-04-12 1978-04-12 Squibb & Sons Inc Antihemophilic factor
US4069216A (en) * 1975-06-16 1978-01-17 Edward Shanbrom, Inc. Simplified methods for preparation of very high purity Factor VIII concentrate
CA1054052A (en) * 1976-08-14 1979-05-08 Edward Shanbrom Simplified method for preparation of high yield, high purity factor viii concentrate
US4104266A (en) * 1977-04-14 1978-08-01 American National Red Cross Method for preparation of antihemophilic factor
FR2460305A2 (fr) * 1979-06-29 1981-01-23 Merieux Inst Procede de preparation d'un concentre de facteur viii
US4289691A (en) * 1980-01-18 1981-09-15 The Canadian Red Cross Society Method of obtaining intermediate purity factor VIII
US4386068A (en) * 1980-02-26 1983-05-31 Cutter Laboratories, Inc. Antihemophilic factor concentrate and method for preparation
US4294826A (en) * 1980-05-07 1981-10-13 Armour Pharmaceutical Company Process for the preparation of highly purified antihemophilic factor
AT369263B (de) * 1980-08-27 1982-12-27 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines faktor viii(ahf) -hochkonzentrates
US4406886A (en) * 1983-01-14 1983-09-27 University Patents, Inc. Purification of antihemophilia factor VIII by precipitation with zinc ions
DE3318521A1 (de) * 1983-05-20 1984-11-22 Lentia GmbH Chem. u. pharm. Erzeugnisse - Industriebedarf, 8000 München Verfahren zur herstellung eines antihaemophiliefaktor-konzentrats
US4543210A (en) * 1984-10-04 1985-09-24 Miles Laboratories, Inc. Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate

Also Published As

Publication number Publication date
EP0221566B1 (en) 1992-08-12
EP0221566A2 (en) 1987-05-13
EP0221566A3 (en) 1987-10-07
ZA868516B (en) 1987-08-26
DE3686390D1 (de) 1992-09-17
CA1293941C (en) 1992-01-07
ES2051686T3 (es) 1994-07-01
ATE79266T1 (de) 1992-08-15
DE3686390T2 (de) 1993-03-04
US4739039A (en) 1988-04-19
JPS62181220A (ja) 1987-08-08
AU6487286A (en) 1987-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU590546B2 (en) Purification of blood coagulation factor viii by precipitation
US4188318A (en) Simplified method for preparation of high yield, high purity Factor VIII concentrate
US3682881A (en) Fractionation of plasma using glycine and polyethylene glycol
EP0440483B1 (en) Process for purifying immune serum globulins
USRE29698E (en) Stabilization of AHF using heparin
EP0047216B1 (en) Method of selectively increasing yield and purity of certain cryoprecipitate proteins
US4216205A (en) Process of preparing a serum protein composition for intravenous application
US4386068A (en) Antihemophilic factor concentrate and method for preparation
EP0176926B1 (en) Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate
JPH0822879B2 (ja) 冷沈澱により抗血友病因子を製造し且つ得られる抗血友病因子製品の溶解度を改善するための方法
JPH04243899A (ja) 第ｖｉｉｉ因子の精製およびこの方法で得られた第ｖｉｉｉ因子
GB1473548A (en) Bovine immunoglobulin isolation process
US4087415A (en) Antithrombin III
US4404131A (en) Method of producing a factor-VIII(AHF)-high-concentrate
JPS6160614A (ja) 第８因子製剤およびその製造方法
JPH0348888B2 (ja)
CA1054052A (en) Simplified method for preparation of high yield, high purity factor viii concentrate
US4057628A (en) Removal of hepatitis associated antigen from plasma
EP0011739A1 (en) Process for obtaining blood coagulation factor XIII derived from human placenta
US4302445A (en) Method for concentrating and purifying antihemophilic factor or factor VIII
US4478825A (en) Warm ethanol method for preparation of low fibrinogen antihemophilic factor
JPS6242887B2 (ja)
JP2931319B2 (ja) 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子の製造法
JPH0788309B2 (ja) 抗血友病因子濃縮物
EP0126789B1 (en) Antihemophilic factor concentrate and process for its preparation

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term