JPS6160614A - 第８因子製剤およびその製造方法 - Google Patents
第８因子製剤およびその製造方法Info
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- JPS6160614A JPS6160614A JP60189997A JP18999785A JPS6160614A JP S6160614 A JPS6160614 A JP S6160614A JP 60189997 A JP60189997 A JP 60189997A JP 18999785 A JP18999785 A JP 18999785A JP S6160614 A JPS6160614 A JP S6160614A
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- factor viii
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血液凝固第■因子の低温殺菌されそして精製さ
れた製剤の製法ＫｙＡする。この製剤は血液凝固障害の
治ｇＫ使用されうる。
れた製剤の製法ＫｙＡする。この製剤は血液凝固障害の
治ｇＫ使用されうる。
血液凝固は、数種の反応段階を経て進行しそしてそれＫ
はローマ数字で示される少くとも１３種の凝固因子（Ｆ
）が関与している複雑な過程である。凝固因子は主に蛋
白質％にプロテアーゼまたは促進剤の性質を備えたもの
であるヮ唯一の有効な基質はフイブリノゲンでラシ、こ
のものは損傷の際トロンビンによシその不溶性形態物で
あるフィブリンに変速され、このものが最初の１ｕ傷閉
鎖を形成する。１３ａ［の凝固因子のうちの１種が欠落
している場合、トロンビンおよびフィブリンの形成が起
らず、その結果は出血である。かかる例の一つは出血性
傾向を有する最も広く分布する疾患であシかり第■因子
の欠乏を特徴とするＡ型血友病である。Ａ型およびＢ型
（第■因子欠乏）血友病は欠落している因子を置換する
ことＫよってのみ有効に治療されうる。
はローマ数字で示される少くとも１３種の凝固因子（Ｆ
）が関与している複雑な過程である。凝固因子は主に蛋
白質％にプロテアーゼまたは促進剤の性質を備えたもの
であるヮ唯一の有効な基質はフイブリノゲンでラシ、こ
のものは損傷の際トロンビンによシその不溶性形態物で
あるフィブリンに変速され、このものが最初の１ｕ傷閉
鎖を形成する。１３ａ［の凝固因子のうちの１種が欠落
している場合、トロンビンおよびフィブリンの形成が起
らず、その結果は出血である。かかる例の一つは出血性
傾向を有する最も広く分布する疾患であシかり第■因子
の欠乏を特徴とするＡ型血友病である。Ａ型およびＢ型
（第■因子欠乏）血友病は欠落している因子を置換する
ことＫよってのみ有効に治療されうる。
特に患者の自己治療に必要であるような、良好な収量お
よび高い純度でのヒトの血漿からの第■因子の取得は今
なお最適には解決されていない問題である。このことは
慣用の商業上の製品とますます置き代わる低温殺菌され
た第■因子濃縮物に％に６てはまる、何故ならそれによ
って肝炎感染の危険が排除されうるからである。
よび高い純度でのヒトの血漿からの第■因子の取得は今
なお最適には解決されていない問題である。このことは
慣用の商業上の製品とますます置き代わる低温殺菌され
た第■因子濃縮物に％に６てはまる、何故ならそれによ
って肝炎感染の危険が排除されうるからである。
良好な収率で高度精製された第■因子を単離することは
、第■因子がクリオ沈ＩＩ （ｃｒｙｏｐｒａｃｉｐｉ
−１ａｔｅ ）中でさえ濃縮されるが、しかし第■因子
と類似した物理化学的性質を有する比較的高分子で難溶
性の２＆類の蛋白質フイブリノケ′ンおよびフィブロネ
クチンと会合しているという事実により特に困難である
。
、第■因子がクリオ沈ＩＩ （ｃｒｙｏｐｒａｃｉｐｉ
−１ａｔｅ ）中でさえ濃縮されるが、しかし第■因子
と類似した物理化学的性質を有する比較的高分子で難溶
性の２＆類の蛋白質フイブリノケ′ンおよびフィブロネ
クチンと会合しているという事実により特に困難である
。
第■囚子濃縮物はできるだけ純粋であるべきである、す
なわち望ましからぬ異種蛋白質そして特に同種凝集素を
含めた免疫グロブリンを含まざるべきである。というの
は非特異的な蛋白質の投与は細網内皮組織系（ＲＥＳ）
の過度緊張を来しそしてリンパ球集団および免疫グロブ
リンの組成における変化によシ明示される免疫防御の侵
害を生ずるからである。このことは、血友病がかかる第
ｖｍ因子濃縮物で終生治療されねばならないという事実
と組合わされると重要となる。このことから天然の、高
度精製され低温殺菌された（ ｐａｓｔｅｕｒｉＺθｄ
）第■因子濃縮物、すなわち肝炎ウィルスおよび他の感
染性物質の感染および同種抗原に対する感作が排除され
た生成物への要求が生ずる。
なわち望ましからぬ異種蛋白質そして特に同種凝集素を
含めた免疫グロブリンを含まざるべきである。というの
は非特異的な蛋白質の投与は細網内皮組織系（ＲＥＳ）
の過度緊張を来しそしてリンパ球集団および免疫グロブ
リンの組成における変化によシ明示される免疫防御の侵
害を生ずるからである。このことは、血友病がかかる第
ｖｍ因子濃縮物で終生治療されねばならないという事実
と組合わされると重要となる。このことから天然の、高
度精製され低温殺菌された（ ｐａｓｔｅｕｒｉＺθｄ
）第■因子濃縮物、すなわち肝炎ウィルスおよび他の感
染性物質の感染および同種抗原に対する感作が排除され
た生成物への要求が生ずる。
本発明はかかる肝炎感染が排除されかつ同種凝集素を含
まない製剤およびその製法に関する。
まない製剤およびその製法に関する。
実際上プロトロンビン複金物の因子（第■、■、■およ
びＸ因子）を含まない第■因子含有溶液が、それ自体知
られた方法で、熱による不活性化に対し保護するために
安定剤を添加したのち低温殺菌し、この加熱された溶液
をｐＨ５〜＆５で陰イオン交換体で処理し、吸着された
第■因子から随伴蛋白質特にフイプリノゲン、フィブロ
ネクチンおよび同種凝集素を含む免疫グロブリンが除去
されるまで洗い、ハロゲンとのＮａ−１Ｋ−またはＣａ
−塩の濃厚溶液で溶離し゛そして例えば沈澱により溶出
液から取得されりることが見出された。
びＸ因子）を含まない第■因子含有溶液が、それ自体知
られた方法で、熱による不活性化に対し保護するために
安定剤を添加したのち低温殺菌し、この加熱された溶液
をｐＨ５〜＆５で陰イオン交換体で処理し、吸着された
第■因子から随伴蛋白質特にフイプリノゲン、フィブロ
ネクチンおよび同種凝集素を含む免疫グロブリンが除去
されるまで洗い、ハロゲンとのＮａ−１Ｋ−またはＣａ
−塩の濃厚溶液で溶離し゛そして例えば沈澱により溶出
液から取得されりることが見出された。
エクテオラ（Ｅｃｔｅｏｌａ）−セルロースおよびＱＡ
Ｅ（第四アミノエチル）基を担持する陰イオン交換体は
すてに第■因子の精製に使用された〔バフ−フレベルト
・ニス（ｖａｎ Ｃｒｅｖｅｌｄ、 Ｓ、 ）民地、「
トロンボ・シアｘ −ヘム（Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｄｉａｔ
ｈ、 Ｈａｅｍ、）Ｊ第■巻第２／３号第２８２頁（１
９６１年）およびバラ・アール（Ｂａｕｇｈ、 Ｒ−）
民地、［バイオケム・バイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈ、 Ｂｉｏｐｈｙ８． Ａｃ１ａ） Ｊ第３７１巻第
５６０頁（１９７４年）参照〕。しかしながら２イロツ
トプラントおよび灸造規模への移行は可能でなかった。
Ｅ（第四アミノエチル）基を担持する陰イオン交換体は
すてに第■因子の精製に使用された〔バフ−フレベルト
・ニス（ｖａｎ Ｃｒｅｖｅｌｄ、 Ｓ、 ）民地、「
トロンボ・シアｘ −ヘム（Ｔｈｒｏｍｂ、 Ｄｉａｔ
ｈ、 Ｈａｅｍ、）Ｊ第■巻第２／３号第２８２頁（１
９６１年）およびバラ・アール（Ｂａｕｇｈ、 Ｒ−）
民地、［バイオケム・バイオフイズ・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈ、 Ｂｉｏｐｈｙ８． Ａｃ１ａ） Ｊ第３７１巻第
５６０頁（１９７４年）参照〕。しかしながら２イロツ
トプラントおよび灸造規模への移行は可能でなかった。
唯予め分別された物質の高度精製ＶＣはイオン交換クロ
マトグラフィーが使用できた〔フエイ・７・ジエー（Ｆ
ａ７． Ｐｈ、 Ｊ、 ）民地の「ブロク・ナトル・ア
カド・サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
マトグラフィーが使用できた〔フエイ・７・ジエー（Ｆ
ａ７． Ｐｈ、 Ｊ、 ）民地の「ブロク・ナトル・ア
カド・サイ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 ３ｃｉ、） Ｊ第７９壱＠ ７２００頁（
１９８２年）参照〕。
１９８２年）参照〕。
高い特異性を以って吸着させるのはｐＨ約５．５でのみ
遂行される。しかしながら大抵のクリオ沈澱中に含有さ
れる蛋白質、なかんずくヒトフイフリノゲンはすでＫそ
して特にカラム中の吸着剤と接触すると沈澱する。さら
Ｋここに引用された操作法によれば比較的大量の吸着剤
が必要である。このことはま九明らかに第■因子の大量
の吸着剤への非特異的吸着−その生理学的仕事は、結局
、非生理学的表面に付着することである−に起因してわ
ずかであった収量に法外な影響を及はしていたと思われ
る。ＱＡＲ交換体で高度精製された物質はその活性を速
やかに失うことも見出された。それゆえ第■因子生成物
には陰イオン交換体は使用されなかった。
遂行される。しかしながら大抵のクリオ沈澱中に含有さ
れる蛋白質、なかんずくヒトフイフリノゲンはすでＫそ
して特にカラム中の吸着剤と接触すると沈澱する。さら
Ｋここに引用された操作法によれば比較的大量の吸着剤
が必要である。このことはま九明らかに第■因子の大量
の吸着剤への非特異的吸着−その生理学的仕事は、結局
、非生理学的表面に付着することである−に起因してわ
ずかであった収量に法外な影響を及はしていたと思われ
る。ＱＡＲ交換体で高度精製された物質はその活性を速
やかに失うことも見出された。それゆえ第■因子生成物
には陰イオン交換体は使用されなかった。
しかしながら今、驚くべきことに１塩基性イオン交換体
でのクロマトグラフィーが第■因子製剤の生産に完全く
適することが見出され尼。
でのクロマトグラフィーが第■因子製剤の生産に完全く
適することが見出され尼。
低温殺菌されたクリオ沈澱から出発して、陰イオン交換
クロマトグリフイーによ）高度精製された第■因子製剤
が一段階で得られうろことは驚くべきことであった。
クロマトグリフイーによ）高度精製された第■因子製剤
が一段階で得られうろことは驚くべきことであった。
それゆえ本発明は第■因子を含有する溶液を安定剤の存
在下に低温殺菌および精製することにより第■因子製剤
を製造するに当り、この溶液を炭水化物に基づく陰イオ
ン交換体で処理し、その交換体を洗滌しそして第■因子
を溶離することからなる方法に関する。
在下に低温殺菌および精製することにより第■因子製剤
を製造するに当り、この溶液を炭水化物に基づく陰イオ
ン交換体で処理し、その交換体を洗滌しそして第■因子
を溶離することからなる方法に関する。
出発物質としてはプール（Ｐｏｏｌ ）民地の「ネーチ
ャー（Ｎａｚｕｒｅ） Ｊ第２０３巻第３１２頁（１９
６４年）記載の方法によシ得られるクリオ沈澱、コーン
（Ｃｏｈｎ）フラクション１〔ミノット・ジー・アール
（Ｍｉｎｏｔ ａ、 Ｒ，）民地の「ジエ−・りＩ）７
−’（ンベスト（Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、
） Ｊ第２４巻第７０４頁（１９４５年）参照〕、血漿
、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子含有細胞培養基ならびにこれから
得られた第■因子含有５１１Ｊ ７ラクシヨンが適当で
ある。しかしながらクリオ沈澱またはコーンにクラクシ
ョンを直接使用するのが好都合である。
ャー（Ｎａｚｕｒｅ） Ｊ第２０３巻第３１２頁（１９
６４年）記載の方法によシ得られるクリオ沈澱、コーン
（Ｃｏｈｎ）フラクション１〔ミノット・ジー・アール
（Ｍｉｎｏｔ ａ、 Ｒ，）民地の「ジエ−・りＩ）７
−’（ンベスト（Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、
） Ｊ第２４巻第７０４頁（１９４５年）参照〕、血漿
、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子含有細胞培養基ならびにこれから
得られた第■因子含有５１１Ｊ ７ラクシヨンが適当で
ある。しかしながらクリオ沈澱またはコーンにクラクシ
ョンを直接使用するのが好都合である。
低温殺菌中第■因子を熱による不活性化から保護するた
めの安定剤としては炭水化物およびアミノ酸、好ましく
は蔗糖５５〜６０Ｉｌ／溶液１００９およびグリッツ１
〜３モル／溶液１ｔならびに場合によりカルシウムイオ
ンが使用されうる。例えば西ドイツ特許公開公報第２９
１６７１１号または３２３７５１２号の記載に従い操作
しうる。
めの安定剤としては炭水化物およびアミノ酸、好ましく
は蔗糖５５〜６０Ｉｌ／溶液１００９およびグリッツ１
〜３モル／溶液１ｔならびに場合によりカルシウムイオ
ンが使用されうる。例えば西ドイツ特許公開公報第２９
１６７１１号または３２３７５１２号の記載に従い操作
しうる。
第■因子を吸着させるための陰イオン交換体としては例
えばＤＥＡＥ、 Ｑｌまたはエクテオラ基を担持する交
換体そしてしかも特にセルロース、セファデックスまた
はセファロースに基くもの、が適当であるがしかし好ま
しくはＤＥＡＥ−セファロースが適当である。
えばＤＥＡＥ、 Ｑｌまたはエクテオラ基を担持する交
換体そしてしかも特にセルロース、セファデックスまた
はセファロースに基くもの、が適当であるがしかし好ま
しくはＤＥＡＥ−セファロースが適当である。
パン・フレベルト（ｖａｎ Ｃｒｅｖｅｌｄ ）および
バク（ｓａｕｇｈ） （前出）の方法と異なシこれらの
交換体は第■因子の精＃！に＄実適当であるが、しかし
これまで知られていすかつ以下に記載される条件下にお
いてである。
バク（ｓａｕｇｈ） （前出）の方法と異なシこれらの
交換体は第■因子の精＃！に＄実適当であるが、しかし
これまで知られていすかつ以下に記載される条件下にお
いてである。
吸着条件は決定的に重要であることが証明された。すな
わち第■因子は生理学的な食塩環境中、好ましくはｐＨ
５，５で実質上選択的にＤＥＡＥ −セファロースに結
合され、一方フイブリノゲンおよびフィブロネクチンの
ような随伴蛋白質は上澄み中に残留する（バッチ法）か
またはカラムを通過することが同様に驚くべきことに見
出された。終りに１これも驚くべきことに、クリオグロ
プリンの低温殺菌された溶液が一般にｐＨ５，５で生理
学的な食塩環境中においてクロマトグラフィーされうる
ことも見出された。というのはこの条件ですでにある極
のクリオグロプリンなかんずくフイブリノゲンが沈澱す
るからである。第■因子が陰イオン交換体に結合される
吸着そして特にその特異性は中性点に向うにつれて強く
低下する。しかしながら正常なりロマトグラフイ条件下
ではＤＥＡＲはｐＨ７，０以上ではじめて負荷される。
わち第■因子は生理学的な食塩環境中、好ましくはｐＨ
５，５で実質上選択的にＤＥＡＥ −セファロースに結
合され、一方フイブリノゲンおよびフィブロネクチンの
ような随伴蛋白質は上澄み中に残留する（バッチ法）か
またはカラムを通過することが同様に驚くべきことに見
出された。終りに１これも驚くべきことに、クリオグロ
プリンの低温殺菌された溶液が一般にｐＨ５，５で生理
学的な食塩環境中においてクロマトグラフィーされうる
ことも見出された。というのはこの条件ですでにある極
のクリオグロプリンなかんずくフイブリノゲンが沈澱す
るからである。第■因子が陰イオン交換体に結合される
吸着そして特にその特異性は中性点に向うにつれて強く
低下する。しかしながら正常なりロマトグラフイ条件下
ではＤＥＡＲはｐＨ７，０以上ではじめて負荷される。
しかしながら沈澱はここに記載されている方法では起ら
ない。何故なら低温殺菌以来クリオ溶液中に存在する炭
水化物がフイブリノゲンおよび０１ｇを軽い酸性媒体中
で溶液中に保持するからである。
ない。何故なら低温殺菌以来クリオ溶液中に存在する炭
水化物がフイブリノゲンおよび０１ｇを軽い酸性媒体中
で溶液中に保持するからである。
すなわちここに記載される方法の長所は、低温殺菌され
たクリオグロプリンの陰イオン交換体への吸着に際しフ
ィブリノゲンおよびフィブロネクチンが上置み液中Ｋま
たは流出液中に存在しそしてそれらから低温殺菌された
生成物として取得されうるという点にある。フィブロネ
クチンは例えば西ドイツ特許公開公報第２８４８５２９
号記載の方法による。
たクリオグロプリンの陰イオン交換体への吸着に際しフ
ィブリノゲンおよびフィブロネクチンが上置み液中Ｋま
たは流出液中に存在しそしてそれらから低温殺菌された
生成物として取得されうるという点にある。フィブロネ
クチンは例えば西ドイツ特許公開公報第２８４８５２９
号記載の方法による。
例えばＤＥＡ３またはＱＡＥ交換体でのクロマトグラフ
ィーは軽い酸性媒体（ｐＨ５，５）中でそして適当に、
例えば０．１モル／ｌのリジンを含有する。０．１モル
／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡化された交換
体で遂行される。この緩衝液を用いて、低温殺菌された
第■因子を含有する溶液をそれがバッチ法またはカラム
法で交換体で処理される前に二倍量まで希釈することも
できる。好ましくは用いられるバッチにおける吸沼は、
吸着期間吊交換体への第■因子の結合を上澄み液中の第
■因子の機能測定により追跡できそして活性消失後吸着
されなかった因子を沈降または遠心分子ｆｉＫよりイオ
ン交換体から分離しそしてその直後に第■因子を負荷さ
れた交換体の洗滌を開始しうるという長所を有する。洗
滌はバッチ中例えば吸引濾過器上で実施されるのが好ま
しいが、一方溶離に′は交換体をカラム中に移すことが
推奨される、何故ならカラムクロマトグラフィーによる
溶離は第■因子が比較的濃縮されて得られるという長所
を有するからである。実験条件下で第■因子５０〜１０
０ＩＵ／−の準位である。
ィーは軽い酸性媒体（ｐＨ５，５）中でそして適当に、
例えば０．１モル／ｌのリジンを含有する。０．１モル
／Ｌの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡化された交換
体で遂行される。この緩衝液を用いて、低温殺菌された
第■因子を含有する溶液をそれがバッチ法またはカラム
法で交換体で処理される前に二倍量まで希釈することも
できる。好ましくは用いられるバッチにおける吸沼は、
吸着期間吊交換体への第■因子の結合を上澄み液中の第
■因子の機能測定により追跡できそして活性消失後吸着
されなかった因子を沈降または遠心分子ｆｉＫよりイオ
ン交換体から分離しそしてその直後に第■因子を負荷さ
れた交換体の洗滌を開始しうるという長所を有する。洗
滌はバッチ中例えば吸引濾過器上で実施されるのが好ま
しいが、一方溶離に′は交換体をカラム中に移すことが
推奨される、何故ならカラムクロマトグラフィーによる
溶離は第■因子が比較的濃縮されて得られるという長所
を有するからである。実験条件下で第■因子５０〜１０
０ＩＵ／−の準位である。
第■因子を負荷された交換体を洗滌するには、一方では
第■因子を解離させないが、しかし他方では非特異的な
蛋白質例えば免疫グロブリンおよび従って同種凝集素の
できるだけ定１・的な分離に適当である緩衝液が特に適
する。適当な緩衝液としては、驚くべきことに、吸着さ
せるための出発物質がその中１１’Ｃ溶解でき、そして
α１モル／ｌの酢酸ナトリウム、１１そル／ｌのリジン
および１１／ＬのＮａＣ６ｆ、ｐＨ５，５にて含有する
緩衝液が良いことが判明した。この緩衝液を用いて、第
■因子を負荷されたイオン交換体がその溶出液が同種凝
集素を含まなくなるまで洗滌された。試験するには不完
全抗体をも示す高感度のクームス試験（Ｃｏｏｍｓ ｔ
ｅｓｔ ）が用いられた。
第■因子を解離させないが、しかし他方では非特異的な
蛋白質例えば免疫グロブリンおよび従って同種凝集素の
できるだけ定１・的な分離に適当である緩衝液が特に適
する。適当な緩衝液としては、驚くべきことに、吸着さ
せるための出発物質がその中１１’Ｃ溶解でき、そして
α１モル／ｌの酢酸ナトリウム、１１そル／ｌのリジン
および１１／ＬのＮａＣ６ｆ、ｐＨ５，５にて含有する
緩衝液が良いことが判明した。この緩衝液を用いて、第
■因子を負荷されたイオン交換体がその溶出液が同種凝
集素を含まなくなるまで洗滌された。試験するには不完
全抗体をも示す高感度のクームス試験（Ｃｏｏｍｓ ｔ
ｅｓｔ ）が用いられた。
陰イオン交換体からの第■因子の脱着には例えばＮａＣ
１を含有する濃厚塩溶液が適当である。
１を含有する濃厚塩溶液が適当である。
しかしながらＮａ、ＫまたはＣａとハロゲンとの他の塩
、ＫＢｒＳＮａＢｒおよびＣａＣ６２がより好ましいこ
とが判明した。これらは第■因子が単位容量当シ高い活
性を有する比較的シャープなピークとして溶離されると
いう長所、すなわち沈澱にとって重要である長所を有す
る。
、ＫＢｒＳＮａＢｒおよびＣａＣ６２がより好ましいこ
とが判明した。これらは第■因子が単位容量当シ高い活
性を有する比較的シャープなピークとして溶離されると
いう長所、すなわち沈澱にとって重要である長所を有す
る。
濃度は０．０５モル／ｌから飽和限界までの範囲にある
。
。
終りに１収景はまた全く実質上溶離速度次第であり、こ
れは毎時１〜１０−／α２好ましくは５〜７ ｄ ／
ｃＲ２の準位にあるべきである。
れは毎時１〜１０−／α２好ましくは５〜７ ｄ ／
ｃＲ２の準位にあるべきである。
第■因子を含有する溶出液は慣用の方法、すなわち硫酸
アンモニウムまたはＮａＣ２のような中性塩、好ましく
は硫酸アンモニウムと比較してよシ速かに透析し出され
そしてその上完全には除去される必要のないＮｒｓＣを
を用いる沈澱により濃縮されうる。
アンモニウムまたはＮａＣ２のような中性塩、好ましく
は硫酸アンモニウムと比較してよシ速かに透析し出され
そしてその上完全には除去される必要のないＮｒｓＣを
を用いる沈澱により濃縮されうる。
第■因子を含有する沈澱をそれ以上処理する罠は沈澱残
留物を例えば、クエン酸ナトリウム（α０２モル／１）
、ＮａＣｔ（０，０６モル／ｌ）、グリシン（２０１！
／ｌ）およびアルブミン（５ｇ／ｌ）を含有するｐＨ６
，９の緩衝液（透析緩衝液）中に溶解させそしてアルブ
ミンを含まない同じ緩衝液で平衡となるまで透析する方
法で遂行される。
留物を例えば、クエン酸ナトリウム（α０２モル／１）
、ＮａＣｔ（０，０６モル／ｌ）、グリシン（２０１！
／ｌ）およびアルブミン（５ｇ／ｌ）を含有するｐＨ６
，９の緩衝液（透析緩衝液）中に溶解させそしてアルブ
ミンを含まない同じ緩衝液で平衡となるまで透析する方
法で遂行される。
透析された溶液はアルブミンを含有する透析緩衝液で希
釈することにより第■因子活性２５〜５０ ＩＵ／−に
調整しそして滅菌濾過したのち容器に充填しそして場合
によう凍結乾燥する。最終生成物は１分以内に溶解し、
蛋白５！１１ｖ当シ第■因子活性５〜１０１Ｕを有し、
低温殺菌されそして同ね凝集素を含まない白色の凍結乾
燥物である。現在技術水準による生成物に比較してこの
ものは何ら望まざる蛋白質そして特に同種抗原として感
受性化を招来しえた蛋白質子宮まないという長所を有す
る。この生成物は血液群非受容性を来さなかった。ウィ
ルス性疾患特に種々の形態の肝炎の感染は排除されてい
ると見られる。この方法の長所は、それが比較的簡単で
あることそしてそれゆえ工業的な規模に困難なく移行さ
れうろことおよびわずかな操作段階からなることである
。操作段階の数が少ないことは良好な収量を証明する、
何故なら経験によればあらゆる精製段階は多かれ少なか
れ活性損失と結びついているからである。
釈することにより第■因子活性２５〜５０ ＩＵ／−に
調整しそして滅菌濾過したのち容器に充填しそして場合
によう凍結乾燥する。最終生成物は１分以内に溶解し、
蛋白５！１１ｖ当シ第■因子活性５〜１０１Ｕを有し、
低温殺菌されそして同ね凝集素を含まない白色の凍結乾
燥物である。現在技術水準による生成物に比較してこの
ものは何ら望まざる蛋白質そして特に同種抗原として感
受性化を招来しえた蛋白質子宮まないという長所を有す
る。この生成物は血液群非受容性を来さなかった。ウィ
ルス性疾患特に種々の形態の肝炎の感染は排除されてい
ると見られる。この方法の長所は、それが比較的簡単で
あることそしてそれゆえ工業的な規模に困難なく移行さ
れうろことおよびわずかな操作段階からなることである
。操作段階の数が少ないことは良好な収量を証明する、
何故なら経験によればあらゆる精製段階は多かれ少なか
れ活性損失と結びついているからである。
それゆえ水元８Ａはまた免疫グロブリン、同種凝集素、
フィブロネクチンおよび凝固しうるフイブリノケ゛ンを
実際上含まずそして蛋白質１１ｎｇ当り約１００単位の
特異的な凝血（Ｃ）−活性（第ＶＩＩＩ：Ｃ因子）およ
び第ＶＩＩＩ：Ｃ因子対第■因子Ｒ： Ａｇ （関連抗
原）の比率が１以上であることからなる低温殺菌され、
高度精製された第■因子製剤にも関する。
フィブロネクチンおよび凝固しうるフイブリノケ゛ンを
実際上含まずそして蛋白質１１ｎｇ当り約１００単位の
特異的な凝血（Ｃ）−活性（第ＶＩＩＩ：Ｃ因子）およ
び第ＶＩＩＩ：Ｃ因子対第■因子Ｒ： Ａｇ （関連抗
原）の比率が１以上であることからなる低温殺菌され、
高度精製された第■因子製剤にも関する。
第■因子は下記の方法によ）測定されうる、すなわち例
えば西ドイツ特許公開公報筒２３１６４３０号の記載に
従い調製された１部例えば（１１−の部分トロンボプラ
スチンを第■因子欠乏血漿１部および希釈された正常血
漿１部と混合する。この混合物を３７℃Ｋ ６”分間保
持する。予め５７℃に加温されたα０２５モル塩化カル
シウム溶液の１部を添加したのち、塩化カルシウム溶液
の添加から凝血具が出現するまでに経過する時間を測定
する。量的に表示するＫは゛正常血漿の連続的希釈物を
用いて用意された検定曲線が用いられる。
えば西ドイツ特許公開公報筒２３１６４３０号の記載に
従い調製された１部例えば（１１−の部分トロンボプラ
スチンを第■因子欠乏血漿１部および希釈された正常血
漿１部と混合する。この混合物を３７℃Ｋ ６”分間保
持する。予め５７℃に加温されたα０２５モル塩化カル
シウム溶液の１部を添加したのち、塩化カルシウム溶液
の添加から凝血具が出現するまでに経過する時間を測定
する。量的に表示するＫは゛正常血漿の連続的希釈物を
用いて用意された検定曲線が用いられる。
第■因子１国際単位（−１Ｘａ）は第３回国際ＷＨＯ標
準に対するサブ標準としての正常血漿１−の第■因子活
性に相当する。
準に対するサブ標準としての正常血漿１−の第■因子活
性に相当する。
低温殺菌されそして同種凝集素を含まない第■因子製剤
の取得法を以下に説明する。
の取得法を以下に説明する。
実施例
（１） 出発物質
粗製クリオ沈澱２５０１をグリシン（０，２５モル／１
）およびヘパリン（１，２５０ＳＦ一単位／ｖｄ ）を
含有するＮａＣ６溶液（０，０８％ル／ ｔ ） ７５
０−中に３０〜３７℃に加温しながら溶解させる。
）およびヘパリン（１，２５０ＳＦ一単位／ｖｄ ）を
含有するＮａＣ６溶液（０，０８％ル／ ｔ ） ７５
０−中に３０〜３７℃に加温しながら溶解させる。
それによシα０６モル／ｌのＮａＣｔｓ ０．２ ％
ル／ ｔのグリシンおよびヘパリン約Ｉ ＵＳＦ一単位
／−の濃度を有する溶液１０００−が得られた。この溶
液のｐＨ値はＩ Ｎ ＨＣをを用いてｐＨ６，５にｉＪ
整した。
ル／ ｔのグリシンおよびヘパリン約Ｉ ＵＳＦ一単位
／−の濃度を有する溶液１０００−が得られた。この溶
液のｐＨ値はＩ Ｎ ＨＣをを用いてｐＨ６，５にｉＪ
整した。
（２）水、酸化アルミニウム吸着
前記（１）項で得られた溶液１０００．ｄＫ １０１／
！。
！。
の水酸化アルミニウムを含有する懸濁液（ベージング（
Ｂｅｈｒｉｎｇ ）社製品、マールブルグ（Ｍａｒｂｕ
ｒｇ））８０ＷＬｔを加えそしてこの混合物を１５分間
攪拌した（＠度約３０℃）。次に３０００Ｘ＃で１５分
間遠心分離し、残留物を捨てそして上澄み液に安定剤を
添加したのち低温殺菌した。
Ｂｅｈｒｉｎｇ ）社製品、マールブルグ（Ｍａｒｂｕ
ｒｇ））８０ＷＬｔを加えそしてこの混合物を１５分間
攪拌した（＠度約３０℃）。次に３０００Ｘ＃で１５分
間遠心分離し、残留物を捨てそして上澄み液に安定剤を
添加したのち低温殺菌した。
（３） 低温殺菌
前記（２）項で得られた上澄み液１０００−に下記安定
剤をこの順序で加えた。
剤をこの順序で加えた。
１モル／Ｌ ＣａＣ２２溶液５−（５ミリモル／ｌ）蔗
糖１ｏｏｏＦ（溶液１ｋｌｉｌ当り５００Ｉ）グリシン
１５０ＩＩ（溶液１ｔＫ対し２モル）ｐＨ値は２ Ｎ
ＮａＯＨを用いてｐＨ７，５に調整した。
糖１ｏｏｏＦ（溶液１ｋｌｉｌ当り５００Ｉ）グリシン
１５０ＩＩ（溶液１ｔＫ対し２モル）ｐＨ値は２ Ｎ
ＮａＯＨを用いてｐＨ７，５に調整した。
添加によシ容量は１７００−に増大した。この溶液を水
浴中６０℃で１０時間保持した。
浴中６０℃で１０時間保持した。
゛（４）イオン交換体処理
前記（６）項で得られた溶液１７００−を、ｐＨ５，５
の０．２モル／Ｌの酢酸ナトリウムおよびα２モル／ｌ
のリジンを含有する溶液１７００−で希釈した。ｐＨ値
を希酢酸を用いて５．５に調整しそしてｐＨ５，５（７
）酢酸ナトリウＡ （［１１％ル／ｌ ）、リジン（０
，１モル／Ａ）およびＮａＣｔ（１１／Ｌ ）を含有す
る溶液を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファロース６Ｂ
Ｃ４７０−を加えた。この混合物を室温で２〜５時間攪
拌しそして第■因子の結合を上澄み液中における活性′
ｊｋ測定することくより測定した。第■因子活性が４１
０／ａｔから０．１１υ／−まで低下したら、吸着剤を
遠心分離により除去した。
の０．２モル／Ｌの酢酸ナトリウムおよびα２モル／ｌ
のリジンを含有する溶液１７００−で希釈した。ｐＨ値
を希酢酸を用いて５．５に調整しそしてｐＨ５，５（７
）酢酸ナトリウＡ （［１１％ル／ｌ ）、リジン（０
，１モル／Ａ）およびＮａＣｔ（１１／Ｌ ）を含有す
る溶液を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファロース６Ｂ
Ｃ４７０−を加えた。この混合物を室温で２〜５時間攪
拌しそして第■因子の結合を上澄み液中における活性′
ｊｋ測定することくより測定した。第■因子活性が４１
０／ａｔから０．１１υ／−まで低下したら、吸着剤を
遠心分離により除去した。
上澄み液を注ぎ出しそして吸着剤を上澄み液の残シから
分離した。ｐＨ５，ｓのα１モル／ｌの酢酸ナトリウム
、（１１モル／ｌのリジンおよびＩ ＶｔのＮａＣｔを
含有する溶液で洗滌することによりセファロースから捕
捉された蛋臼質を除去しそして次に同じ緩衝液中のスラ
リーとしてカラムに移した（寸法：１０Ｘ３ｃｌＩＬ）
。
分離した。ｐＨ５，ｓのα１モル／ｌの酢酸ナトリウム
、（１１モル／ｌのリジンおよびＩ ＶｔのＮａＣｔを
含有する溶液で洗滌することによりセファロースから捕
捉された蛋臼質を除去しそして次に同じ緩衝液中のスラ
リーとしてカラムに移した（寸法：１０Ｘ３ｃｌＩＬ）
。
カラム中で２８０ ｎｍで何らの光線吸収も、も・はや
測定され得すそして同種凝集素値がクームス試験で検出
限界となるまで洗滌した。
測定され得すそして同種凝集素値がクームス試験で検出
限界となるまで洗滌した。
（５）溶離
前記（４）項で得られた交換体を０．１モル／Ｌの酢酸
ナトリウム、Ｑ、１モル／ｌのリジンおよび（Ｌ３モル
／ＬのＣａＣｌ２を含有するｐｌｉ ５．５の溶液を用
いて溶離した。その際波長２８０ｎｍで測定しうるピー
クが現われた。相当するフラクションを集めそして第■
因子４０ ＩＵ／−を有するもの１８〇−量が得られた
。
ナトリウム、Ｑ、１モル／ｌのリジンおよび（Ｌ３モル
／ＬのＣａＣｌ２を含有するｐｌｉ ５．５の溶液を用
いて溶離した。その際波長２８０ｎｍで測定しうるピー
クが現われた。相当するフラクションを集めそして第■
因子４０ ＩＵ／−を有するもの１８〇−量が得られた
。
＋６） ｊｇ■因子の沈澱
前記（５）項で得られた溶出液１８０ａ４に２．２’モ
ル／ＬのグリシンならびＫ １５０１ ／ ｔ（１）
ＮａＣＬを加えそして室温で３０分間攪拌した。
ル／ＬのグリシンならびＫ １５０１ ／ ｔ（１）
ＮａＣＬを加えそして室温で３０分間攪拌した。
沈澱は明らかな混濁によ＃）認められ得た。この沈澱を
超遠心器中ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏ Ｘ 、Ｓｌで３０分間
遠心分離することにより分離しそして上澄み液を注ぎ出
したのち４℃で一夜保持した。
超遠心器中ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏ Ｘ 、Ｓｌで３０分間
遠心分離することにより分離しそして上澄み液を注ぎ出
したのち４℃で一夜保持した。
（７）後処理
前記（６）で得られた沈澱を０．０２モル／ｌのクエン
酸トリナトリウム、α０６モル／ｌのＮａＣ６゜Ｉ Ｑ
ｌ／ｌのグリシンおよび５１／ｌのヒト−アルブミン
を含有するｐＨ７，０の緩衝液（溶解緩衝液）１４５−
中にとった。この溶液については第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活
性４０ ＩＵ／ＷＬｔが測定された。
酸トリナトリウム、α０６モル／ｌのＮａＣ６゜Ｉ Ｑ
ｌ／ｌのグリシンおよび５１／ｌのヒト−アルブミン
を含有するｐＨ７，０の緩衝液（溶解緩衝液）１４５−
中にとった。この溶液については第ＶＩＩＩ：Ｃ因子活
性４０ ＩＵ／ＷＬｔが測定された。
これを何らアルブミンを含有しない上記緩衝液で５時間
室温で透析し、透析物を３０℃に加温しそして５０，０
００：）ｌおよび２５ Ｃテ３０分間遠心分離した。３
６ＩＵ／−を示す第■因子測定後、この溶液を溶解緩衝
液を用いて３０１０７ｍ １７調整し、この溶液を５７
℃に加温しそしてメンブランフィルタ−で滅菌濾過した
。
室温で透析し、透析物を３０℃に加温しそして５０，０
００：）ｌおよび２５ Ｃテ３０分間遠心分離した。３
６ＩＵ／−を示す第■因子測定後、この溶液を溶解緩衝
液を用いて３０１０７ｍ １７調整し、この溶液を５７
℃に加温しそしてメンブランフィルタ−で滅菌濾過した
。
これをバイアル瓶中に充填し、凍結させそして凍結乾燥
した。
した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）第VIII因子を含有する溶液を安定剤の存在下に場合
により低温殺菌することにより第VIII因子製剤を製造す
るに当り、この溶液を炭水化物に基づく陰イオン交換体
で処理し、この交換体を洗滌しそして第VIII因子をカオ
トロピツク溶液またはＣａＣｌ＿２を用いて溶離するこ
とからなる方法。 ２）クリオ沈澱を蔗糖およびグリシン、好ましくは蔗糖
３５〜６０ｇ／１００ｍｌおよびグリシン１〜３モル／
ｌを添加して溶解させ、カルシウムイオン好ましくは１
〜２０ミリモル／をを加え、場合により低温殺菌し、冷
却し、希釈しそしてｐＨ５．５で第VIII：Ｃ因子を炭水
化物に基づく陰イオン交換体に吸着させそして吸着剤を
異種蛋白質特に同種凝集素がなくなるまで洗いそして第
VIII：Ｃ因子を緩衝された濃厚塩溶液を用いて溶離する
ことにより溶出させ、透析しそして凍結乾燥することか
らなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）第VIII因子を含有する溶液がクリオ沈澱の溶液であ
ることからなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）第VIII因子を含有する溶液が血漿、コーン（Ｃｏｈ
ｎ）フラクシヨン I または第VIII因子を合成する細胞
の培養液であることからなる前記特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ５）陰イオン交換体からの溶出液にアミノ酸、炭水化物
およびカルシウムを添加した後低温殺菌することからな
る前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６）陰イオン交換体としてセルロース、セフアデツクス
またはセフアロースのＤＥＡＥ、ＱＡＥ、アミン樹脂ま
たはエクテオラ（Ｅｃｔｅｏｌａ）誘導体が使用される
ことからなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７）吸着剤を緩衝された希塩溶液で洗滌することからな
る前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）ナトリウム、カリウムまたはカルシウムとハロゲン
との塩の緩衝された濃厚水溶液を用いて溶離が行われる
ことからなる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）免疫グロブリン、同種凝集素、フイブロネクチンお
よび凝固しうるフイブリノゲンを実際上含まずそして蛋
白質１ｍｇ当り約１００単位の特異的な凝血（Ｃ）−活
性（第VIII：Ｃ因子）を有しかつ第VIII：Ｃ因子対第V
III因子Ｒ：Ａｇ（関連抗原）の比率が１以上であるこ
とからなる低温殺菌され、高度精製された第VIII因子製
剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843432083 DE3432083A1 (de) | 1984-08-31 | 1984-08-31 | Pasteurisierte, isoagglutininfreie faktor viii-praeparation und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3432083.0 | 1984-08-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6160614A true JPS6160614A (ja) | 1986-03-28 |
| JPH0580455B2 JPH0580455B2 (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=6244387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60189997A Granted JPS6160614A (ja) | 1984-08-31 | 1985-08-30 | 第８因子製剤およびその製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0173242B2 (ja) |
| JP (1) | JPS6160614A (ja) |
| AT (1) | ATE73666T1 (ja) |
| CA (1) | CA1265051A (ja) |
| DE (2) | DE3432083A1 (ja) |
| DK (1) | DK174066B1 (ja) |
| ES (1) | ES8702146A1 (ja) |
| IL (1) | IL76260A (ja) |
Cited By (2)
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| JPS6413099A (en) * | 1987-03-31 | 1989-01-17 | Baxter Int | Ultra-purification for polypeptide |
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| ES2053619T3 (es) * | 1988-05-27 | 1994-08-01 | Centre Regional De Transfusion | Procedimiento para la fabricacion de un factor antihemofilico de gran pureza y libre de virus mediante cromatografia. |
| AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
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| DE3926034C3 (de) * | 1989-08-07 | 1996-11-21 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung eines stabilen Faktors VIII |
| DE4001451A1 (de) * | 1990-01-19 | 1991-08-01 | Octapharma Ag | Stabile injizierbare loesungen von faktor viii und faktor ix |
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-
1985
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- 1985-08-21 DE DE8585110499T patent/DE3585649D1/de not_active Expired - Fee Related
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- 1985-08-30 IL IL76260A patent/IL76260A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 DK DK198503981A patent/DK174066B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-08-30 CA CA000489738A patent/CA1265051A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-30 JP JP60189997A patent/JPS6160614A/ja active Granted
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| EP0173242A3 (en) | 1987-10-07 |
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