DK174066B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et faktor VIII-præparat - Google Patents

Description

i DK 174066 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et faktor VIII-præparat, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne, og opfindelsen angår tillige en sådan fremgangsmåde, der er ejendom-5 melig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne. Foretrukne udførelsesformer for disse fremgangsmåder er angivet i krav 3 og 4.

Det omhandlede præparat kan anvendes til behandling af blodkoagulationsforstyrrelser.

10 Blodkoagulationen er en kompleks proces, der forløber over flere reaktionstrin, og ved hvilken der er involveret mindst 13 koagulationsfaktorer (F), der betegnes med romertal. Ved koagulationsfaktorerne er der i overvejende grad tale om proteiner og specielt sådanne, som er 15 udstyret med egenskaberne for proteaser eller acceleratorer.

Det eneste virksomme stof er fibrinogen, som ved beskadigelser af thrombin omdannes til sin uopløselige form, fibrinet, der danner den primære sårtillukning. Når en af de 13 koagulationsfaktorer mangler, udebliver dannelsen af 20 thrombin og fibrin, og følgen er blødninger. Et sådant tilfælde foreligger ved hæmofili A, den mest udbredte blødningssygdom, der er karakteriseret ved en mangel på faktor VIII. Hæmofili A og B (F IX-mangel) kan kun behandles ved virksom terapi ved substitution af den manglende faktor.

25 Udvindingen af faktor F VIII fra humant plasma med godt udbytte og med høj renhed, således som dette specielt er nødvendigt til selvbehandling af patienter, udgør stadig et problem, der endnu ikke er blevet løst optimalt.

Dette gælder først og fremmest for pasteuriserede F Vlll-kon-30 centrater, der har fortrængt den gængse handelsvare i tiltagende grad, fordi man derved kunne eliminere risikoen for en hepatitisoverføring.

Isoleringen af en højrenset F VIII i godt udbytte vanskeliggøres først og fremmest ved, at F VIII ganske 35 vist koncentreres i kryopræcipitatet, men sammen med fibrinogen og fibronectin, der er to forholdsvis højmolekylære og DK 174066 B1 2 tungtopløselige proteiner med lignende fysisk-kemiske egenskaber som de, F VIII er forbundet med.

Et faktor VIII-koncentrat skal være så rent som overhovedet muligt, altså frit for uønskede andre proteiner 5 og specielt frit for immunoglobuliner, herunder isoagglutini-nerne, eftersom det findes angivet, at tilførslen af uspecifikke proteiner fører til for store krav til det retikulo-endotheliale system (RES), og til en forringelse af immunforsvaret, der er karakteriseret ved en ændring i sammensæt-10 ningen af lymfocyt-populationen og immunoglobulinerne. Dette får forøget betydning i forbindelse med den kendsgerning, at hæmofile skal behandles med sådanne F VIII-koncentrater i hele levetiden. Herudfra fremkommer kravet om et nativt, højrenset, pasteuriseret F Ill-koncentrat, dvs. et produkt, 15 som udelukker en overførsel af hepatitisvira og andet infek-tiøst materiale og en sensibilisering overfor alloantigener.

En fremgangsmåde til fremstilling af et sådant præparat, der udelukker en overføring af hepatitis og er isoagglu-tininfrit, er genstand for den foreliggende opfindelse.

20 Det har vist sig, at en F Vlll-holdig opløsning, der er praktisk taget fri for faktorer af prothrombinkom-plekset (F II, VII, IX og X), kan udvindes ved, at man på i og for sig kendt måde efter tilsætning af stabilisatorer til beskyttelse mod en termisk inaktivering, pasteuriserer og 25 behandler den opvarmede opløsning ved en pH-værdi på 5,5 med en anionbytter, vasker den absorberede F VIII fri for ledsageproteiner, især fibrinogen, fibronectin og immu-noglobuliner, herunder isoagglutininer, eluerer med en koncentreret opløsning af Na-, K- eller Ca-salte med et 30 halogen og f.eks. ved udfældning isolerer fra eluatet.

Ecteola-cellulose og en QAE- (Quaternaty Amino Ethyl-) gruppebærende anionbytter er allerede blevet anvendt til F VIII-rensningen, jf. S. van Creveld et al., Thromb.

Diath. Haem., VI, nr. 2/3, 282 (1961), og R. Baugh et al., 35 Bioch. Biophys. Acta, 371, 360 (1974). En overføring til teknisk eller produktionsmålestok var imidlertid ikke mulig.

3 DK 174066 B1

Kun til højrensning af forfraktioneret materiale kunne der anvendes ionbytterchromatografi, jf. Ph. J. Fay et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7200 (1982).

Adsorptionen med højere specificitet finder 5 kun sted ved en pH-værdi omkring 5,5. Herved udfældes imidlertid allerede de fleste af de i kryopræcipitatet indeholdte proteiner, først og fremmest humanfibrinogenet, og specielt ved kontakten med adsorbehset i søjlen. Desuden kræves der ifølge de citerede litteratursteder forholdsvis 10 store mængder adsorbens. Dette synes igen at have haft en enorm indflydelse på udbyttet, som var minimalt, åbenbart betinget af en uspecifik adsorption af F VIII - dens fysiologiske opgave er jo at adhærere til en ufysiologisk overflade - på de store mængder adsorbens. Det er også blevet kon-15 stateret, at det på en QAE-bytter højtrensede materiale hurtigt mister aktivitet, og derfor er anionbyttere ikke blevet anvendt til F VIII-produktionen.

Ifølge opfindelsen har det imidlertid nu overraskende vist sig, at en chromatografi på basiske ionbyttere 20 er særdeles velegnet til produktion af F VHI-præparater.

Det er overraskende, at man ud fra et pasteuriseret kryopræ-cipitat i ét trin ved hjælp af en anionbytterchromatografi kan udvinde et høj renset F VHI-præparat.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til 25 fremstilling af et faktor VIII-præparat, som angivet i kravene, jf. ovenfor.

Som udgangsmateriale kommer et ifølge Pool et al., Nature, 203, 312 (1964) udvundet kryopræcipitat, Cohn--fraktion I, jfr. G.R. Minot et al., J.Clin. Invest., 2j4, 704 30 (1945), plasma, F VIII: C-holdigt cellekulturmedium samt ud fra dette udvundne F VIII-holdige bifraktioner i betragtning. Fortrinsvis anvender man dog direkte kryopræcipitat eller Cohn I-fraktion.

Som stabilisatorer til beskyttelse mod en termisk 35 inaktivering af F VIII under pasteuriseringen kan der anvendes carbonhydrater og aminosyrer, fortrinsvis 35-60 gram 4 DK 174066 B1 o saccharose pr. 100 gram opløsning og 1-3 mol glycin pr. liter opløsning samt eventuelt calciumioner. Der kan f.eks. gås frem i overensstemmelse med de tyske offentliggørelsesskrifter nr. 2.916.711 og 3.237.512.

5 Som anionbyttere til adsorptionen af F VIII kom mer f.eks. DEAE-, QAE- eller Ecteola-gruppebærende ionbyttere og således især sådanne på basis af cellulose, Sephadex eller Sepharose i betragtning, dog fortrinsvis DEAE-Sepharose.

Til forskel fra van Creveld og Baugh, jf. det 10 foregående, kommer disse ionbyttere dog i betragtning til F VIII-rensningen, men dog under betingelser, der ikke tidligere var kendt og som skal beskrives nærmere i det følgende .

Adsorptionsbetingelserne har vist sig at være 15 væsentlige. Det har nemlig ligeledes overraskende vist sig, at F VIII i fysiologisk saltmiljø, fortrinsvis ved en pH-værdi på 5,5, vidtgående bindes selektivt til DEAE-Sepharose, medens ledsageproteiner såsom fibrinogenet og fibronectinet forbliver i den ovenstående væske (ved batch-metoden) eller 2o passerer en søjle. Endelig har det også overraskende vist sig, at en pasteuriseret opløsning af kryoglobulinerne overhovedet kan chromatograferes ved en pH-værdi på 5,5 i fysiologisk saltmiljø, da der under disse betingelser allerede udfældes bestemte kryoglobuliner, først og fremmest fibri-25 nogenet. Adsorptionen og specielt den specificitet, med hvilken F VIII bindes til anionbytterne, aftager kraftigt til neutralpunktet. Under normale chromatograferingsbetin-gelser belastes DEAE dog først ved en pH-værdi på over 7,0. Udfældningen udebliver imidlertid ved den her beskrevne 30 fremgangsmåde, fordi carbonhydraterne, som fra pasteuriseringen foreligger i kryoopløsningen, holder fibrinogenet og Cig i opløsning i let surt medium.

En fordel ved den beskrevne fremgangsmåde består deri, at ved anionbytteradsorptionen af pasteuriseret 35 kryoglobulin forbliver fibrinogen og fibronectin i den ovenstående væske eller i gennemløbet og kan udvindes derfra o 5 DK 174066 B1 som pasteuriserede produkter. Fibronectin kan f.eks. udvindes ifølge det tyske offentliggørelsesskrift nr. 2.848.529.

Chromatograferingen på f.eks. DEAE- eller QAE--ionbyttere sker i let surt miljø (pH=5,5) og på ionbyttere, 5 der er ækvilibreret tilsvarende, f.eks. med 0,1 mol Na-ace-tat-puffer pr. liter, der indeholder 0,1 mol lysin pr. liter.

Med denne puffer kan også den pasteuriserede F VIII-holdige opløsning fortyndes til det dobbelte rumfang, inden den behandles med ionbytteren ved batch- eller søjlemetoden. Adsorp-10 tionen efter batchmetoden, der fortrinsvis anvendes, har den fordel, at man under adsorptionen kan følge bindingen af F VIII til ionbytteren via den funktionelle bestemmelse af F VIII i den ovenstående væske og efter aktivitetens forsvinden kan adskille de ikke-adsorberede faktorer ved 15 sedimentering eller centrifugering fra ionbytteren og umiddelbart derpå kan påbegynde vaskningen af den med F VIII belastede ionbytter. Medens vaskningen fortrinsvis skal udføres batchvis, f.eks. på et Nutsch-filter, er det til elue-ringen anbefalelsesværdigt at overføre ionbytteren til en 20 søjle, eftersom den søjlechromatografiske eluering har den fordel, at F VIII fremkommer forholdsvis koncentreret, under forsøgsbetingelserne i størrelsesordenen fra 50 til 100 IE F VIII pr. ml.

Til vaskningen af den med F VIII belastede ion-25 bytter egner sig især sådanne puffere, som dels ikke frigør F VIII, men som dels er egnede til en såvidt muligt kvantitativ adskillelse af uspecifikke proteiner såsom imrnu-noglobulinerne og dermed også isoagglutininerne. Som en tilsvarende puffer har overraskende vist sig en puffer, i hvil-30 ken udgangsmaterialet kan opløses til adsorptionen, og som indeholder 0,1 mol Na-acetat pr. liter, 0,1 mol lysin pr. liter og 1 gram NaCl pr. liter ved en pH-værdi på 5,5.

Med denne puffer vaskes den med F VIII belastede ionbytter, indtil eluatet er frit for isoagglutininer. Til afprøvning 35 benyttes den høj følsomme Coombs-test, der også viser inkom-plette antistoffer.

6 DK 174066 B1 o

Til desorptionen af F VIII fra anionbytterne kommer koncentrerede saltopløsninger i betragtning, f.eks. sådanne indeholdende NaCl.

Som fordelagtige har imidlertid vist sig andre salte af halogener med Na, K eller Ca, f.eks. KBr, NaBr

O

og CaCl2· De har den fordel, at F VIII elueres som en forholdsvis skarp spids med en høj aktivitet pr. rumfang, en fordel, der er betydningsfuld for fældningen.

Koncentrationerne ligger i området fra 0,05 mol 10 pr. liter til mætningsgrænsen.

Udbyttet afhænger sluttelig også ganske væsentligt af elueringshastigheden, der skal være af en størrel- 2 sesorden på fra 1 til 10 ml pr. cm pr. time, fortrinsvis 2 fra 5 til 7 ml pr. cm pr. time.

15 Det F Viil-holdige eluat lader sig koncentrere ved anvendelse af de gængse metoder, nemlig ved fældning med neutralsalte, f.eks. ammoniumsulfat eller NaCl, med fordel med NaCl, som i modsætning til ammoniumsulfat hurtigere kan uddialyseres og heller ikke nødvendigvis skal 20 fjernes fuldstændigt.

Videreforarbejdningen af den F VHI-holdige fældning sker på den måde, at fældningsremanensen f.eks. opløses i en puffer med en pH-værdi på 6,9, der indeholder Na-citrat (0,02 mol pr. liter), NaCl (0,06 mol pr. liter), 25 glycin (20 gram pr. liter) og albumin (5 gram pr. liter) (dialysepuffer), og dialyseres mod den samme puffer uden albumin indtil opnåelse af ligevægt. Den dialyserede opløsning indstilles ved fortynding med den albuminholdige dialysepuffer på en aktivitet på 25-30 IE F VIII pr. ml og 30 aftappes efter sterilfiltrering, hvorefter den eventuelt frysetørres. Slutpræparatet er karakteriseret som et hvidt lyofilisat, der opløses i løbet af mindre end 1 minut, har en F Vin-aktivitet på 5-10 IE pr. mg protein, er pasteuriseret og isoagglutininfrit. I forhold til produkter 35 hørende til teknikkens stade har det den fordel, at det er frit for uønskede proteiner og specielt sådanne, der som 7 DK 174066 B1 alloantigener kunne føre til en sensibilisering. Blodgrup-pe-uforeneligheder fremkaldes ikke ved anvendelse af præparatet. En overførsel af virussygdomme, især de forskellige former for hepatitis, synes udelukket. Til fordelene ved 2 fremgangsmåden hører, at den er forholdsvis enkel og derfor problemfrit kan overføres til industriel målestok oq desuden består den af få arbejdstrin. Det ringe antal arbejds-trin dokumenteres i det gode udbytte, idet erfaringsmæssigt ethvert rensningstrin er forbundet med et større eller mindre 10 aktivitetstab.

Der kan ifølge opfindelsen opnås et pasteuriseret, højrenset faktor VIII-præparat, der er praktisk taget frit for immunoglobuliner, isoagglutininer, fibronectin og koa-gulerbart fibrinogen og er karakteriseret ved en specifik 15 clotting (C)-aktivitet (F VIII:C) på ca. 100 E/mg protein og et forhold mellem F VIII:C og F VIII R:Ag (Related Antigen) større end 1.

F VIII kan bestemmes ved den følgende fremgangsmåde: 1 del, f.eks. 0,1 ml partielt thromboplastin, f.eks.

20 fremstillet ifølge det tyske offentliggørelsesfkrift nr. 2.316.430, blandes med 1 del F VIII-mangelplasma og 1 del fortyndet normalplasma. Denne blanding holdes i 6 minutter ved 37°C. Efter tilsætning af 1 del til 37°C forvarmet 0,025 molær calciumchloridopløsning bestemmes den tid, der 25 går fra tilsætningen af calciumchloridopløsningen til fremkomsten af et koagulat. Til kvantitativ bestemmelse anvendes der en med en normalplasma-fortyndingsrække opnået måle- eller kalibreringskurve.

1 international enhed (= 1 IE) af F VIII svarer 30 til F VIII-aktiviteten af 1 ml normalplasma som substandard til den 3. internationale WHO-Standard.

I det følgende eksempel illustreres fremgangsmåden til udvinding af et pasteuriseret og isoagglutininfrit F VIIl-præparat.

35 8 DK 174066 B1 o

Eksempel 1. Udgangsmateriale.

250 gram rå-kryopræcipitat opløses i 750 ml af en NaCl-opløsning (0,08 mol pr. liter), der indeholder 5 glycin (0,25 mol pr. liter) og heparin (1,25 USP-enheder pr. ml), under opvarmning til 30-37°C. Herved fås der 1000 ml opløsning med en koncentration på 0,06 mol NaCl pr. liter, 0,2 mol glycin pr. liter og ca. 1 USP-enhed heparin pr. ml. Opløsningens pH-værdi indstilles på 6,5 10 med 1 N HC1.

2. Aluminiumhydroxid-adsorption.

Til 1000 ml opløsning fra 1. sættes der 80 ml af en suspension indeholdende 10 gram aluminiumhydroxid pr. liter (Behringwerke, Marburg), og der omrøres i 15 15 minutter (temperatur ca. 30°C). Derpå centrifugeres der i 15 minutter ved 3000 G, remanensen bortkastes, og den afhældte væske pasteuriseres efter tilsætning af stabilisatorer.

3. Pasteurisering.

20 1000 ml afhældt væske fra 2, tilsættes følgende stabilisatorer i denne rækkefølge: 5 ml CaCl2“opløsning, 1 mol pr. liter (5 mmol pr. liter) 1000 gram saccharose (500 gram pr. kg. opløsning) 150 gram glycin (2 mol til 1 liter opløsning).

25 pH-værdien indstilles på 7,3 med 2 N NaOH. Ved tilsætningerne forøges rumfanget til 1700 ml. Opløsningen holdes i 10 timer ved 60°C i vandbad.

4. Ionbytter-behandling.

1700 ml opløsning fra 3. fortyndes med 1700 ml 30 af en opløsning, der indeholder 0,2 mol Na-acetat pr.

liter, pH=5,5, og 0,2 mol lysin pr. liter. pH-værdien indstilles på 5,5 med fortyndet eddikesyre, og der tilsættes 70 ml med en opløsning, indeholdende Na-acetat (0,1 mol pr. liter), pH=5,5, lysin (0,1 mol pr. liter) og NaCl 35 (1 gram pr. liter), ækvilibreret DEAE-Sepharose 6B Cl. Der omrøres i 2-3 timer ved stuetemperatur, og bindingen af o 9 DK 174066 B1 F VIII bestemmes ved bestemmelse af aktiviteten i den ovenstående væske. Når F VIII-aktiviteten er faldet fra 4 IE til 0,1 IE pr. ml, fraskilles adsorbensen ved centrifugering.

5 Den ovenstående væske frahældes, og adsorptions midlet skilles fra resten af den ovenstående væske. Ved vaskning med en opløsning indeholdende 0,1 mol Na-acetat pr. liter, pH=5,5, 0,1 mol lysin pr. liter og 1 gram NaCl pr. liter befries Sepharosen for indesluttet protein og 10 opslæmmes derpå med den samme puffer i en søjle (mål: 10 cm x 3 cm).

I søjlen vaskes ionbytteren så længe, at der ikke længere kan måles nogen lysabsorption ved 280 nm, og isoagglutinin-værdierne ved Coombstest ligger ved påvis-15 ningsgrænsen.

5. Eluering.

Ionbytteren fra 4. elueres med en opløsning, pH=5,5, der indeholder 0,1 mol Na-acetat pr. liter, 0,1 mol lysin pr. liter og 0,3 mol CaCl2 pr. liter. Herved frem-20 kommer der en ved en bølgelængde på 280 nm målelig spids.

De tilsvarende fraktioner samles, og der fås et rumfang på 180 ml med 40 IE F VIII pr. ml.

6. Fældning af F VIII.

180 ml eluat fra 5. tilsættes 2,2 mol glycin 25 pr. liter samt 150 gram NaCl pr. liter og omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur.

Fældningen kan erkendes ved hjælp af en tydelig uklarhed. Fældningen skilles fra ved 30 minutters centrifugering ved 30.000 G i en ultracentrifuge og holdes efter 30 frahældning af den ovenstående væske natten over ved 4°C.

7. Oparbejdning.

Fældningen fra 6. optages i 145 ml puffer, pH=7,0, der indeholder 0,02 mol tri-Na-citrat pr. liter, 0,06 mol NaCl pr. liter, 10 g glycin pr. liter og 5 g 35 human-albumin (opløsningspuffer) pr. liter. For opløsningen bestemmes der en aktivitet på 40 IE F VIII:C pr. ml. Opløs- DK 174066 B1 o 10 ningen dialyseres i 3 timer ved stuetemperatur mod den ovennævnte puffer, der ikke indeholder noget albumin, og dialysatet opvarmes til 30°C og centrifugeres i 30 minutter ved 30.000 G og 25°C. Efter en P VHI-bestemmelse, der 5 giver et resultat på 36 IE pr. ml, indstilles opløsningen ved hjælp af opløsningspufferen på 30 IE pr. ml, og opløsningen opvarmes til 37°C og sterilfiltreres på et membran-filter .

Der fyldes på småkolber, indfryses og lyofili- 10 seres.

15 20 25 30 35

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et faktor VIII-præparat, kendetegnet ved, at en pasteuriseret opløsning indeholdende faktor VIII fra et kryopræcipitat 5 fra humant plasma i nærværelse af et carbonhydrat og en aminosyre behandles med en ionbytter, der bærer DEAE-, QAE-eller Ecteola-grupper, på basis af cellulose, Sephadex® eller Sepharose® ved en pH-værdi på 5,5, ionbytteren vaskes, og faktor VIII elueres med chaotrope opløsninger, fortrinsvis 10 med en opløsning af CaCl2·

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et faktor VIII-præparat, kendetegnet ved, at kryopræcipitat opløses under tilsætning af saccharose og glycin, fortrinsvis 35-60 gram saccharose pr. 100 ml og 1-3 mol glycin pr. liter, 15 calciumioner tilsættes, fortrinsvis 1-20 mmol pr. liter, hvorpå der eventuelt pasteuriseres, afkøles og fortyndes, og F VIII :C absorberes ved en pH-værdi på 5,5 på en ionbytter, der bærer DEAE-, QAE- eller Ecteola-grupper, på basis af cellulose, Sephardex® eller Sepharose®, og absorbensen 20 vaskes, indtil den er fri for fremmedproteiner, specielt isoagglutininer, og F VIII:C elueres ved eluering med en pufret koncentreret chaotrop saltopløsning, fortrinsvis med en opløsning af CaCl2, dialyseres og lyofiliseres.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at adsorbensen vaskes med en pufret fortyndet saltopløsning.

4. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kendeteg-3 0 net ved, at der som ionbytteren anvendes DEAE-Sepharose®.