JP2511631B2 - 因子ｖｉｉｉ製品の製造方法 - Google Patents

因子ｖｉｉｉ製品の製造方法

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JP2511631B2 JP5097532A JP9753293A JP2511631B2 JP 2511631 B2 JP2511631 B2 JP 2511631B2 JP 5097532 A JP5097532 A JP 5097532A JP 9753293 A JP9753293 A JP 9753293A JP 2511631 B2 JP2511631 B2 JP 2511631B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウイルス−安全な高純度
の因子ＶＩＩＩの製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】血液の凝固は一連の様々なタンパク質およ
び酵素の連続反応を引き金として起こる。もしも血液凝
固因子が欠如すると、フィブリノーゲンからのフィブリ
ンの形成が妨げられ、従って、傷の封鎖が妨げられ、結
果的に出血することになる。それが血友病Ａの場合であ
る。後者が最も多い出血性疾患であり、因子ＶＩＩＩ欠
損に起因する。因子ＶＩＩＩは血漿フォンビルブラント
因子（ｖＷＦ）と非共有結合的に結合した複合体（ＦＶ
ＩＩＩ／ｖＷＦ）として一緒に存在している。複合体Ｆ
ＶＩＩＩ／ｖＷＦと同様、タンパク質ＦＶＩＩＩおよび
ｖＷＦは血友病患者の置換治療に用いられる。効率およ
び安全性に関して適切な医薬製品が切望されている。
【０００３】そのような製品の製造出発物質は通常、ヒ
ト血漿であるが、それは因子ＶＩＩＩを極く微量しか含
まない（約０.１〜０.２μg／ml）。その結果、因子Ｖ
ＩＩＩを回収するために大量の血漿を処理しなければな
らないばかりか、その多くが同様の物理化学的性質を有
している、随伴する妨害性タンパク質をできるだけ分離
しなければならない。他の困難は、出発物質が例えば肝
炎ウイルスまたはＨＩＶを含有している可能性があるの
で、感染性物質に関して製品を不活化しなければならな
いということにある。これに加えて、個々の方法の各工
程、およびそれぞれの不活化法を、求める凝固因子の生
物活性を可能な限り、最大限保存するような方法で行わ
なければならない。
【０００４】古典的な製造方法では、プロトロンビンコ
ンプレックス因子類、フィブリノーゲンおよびフィブロ
ネクチン等の不純物質の除去を目的とする段階的な沈澱
法（例えば、低温沈殿または硫酸アンモニウムの添加に
よる沈殿）が適用される。得られる因子ＶＩＩＩ濃縮物
の純度は約１Ｕ／mgタンパク質であり、通常１０〜２０
Ｕ／mgタンパク質を越えない。因子ＶＩＩＩの製造方法
はＥＰ−Ａ−Ｏ３７８２０８によって既知であり、その
方法によれば、ウイルスを不活化するために、低温沈殿
溶液を可溶化剤ＴweenR８０の存在下、有機溶媒（トリ
ー（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ））処理に付
す。次いで、因子ＶＩＩＩを２段階精製沈殿に付し、凍
結乾燥し、乾燥状態で加熱する。ＥＰ−Ｂ−Ｏ０５００
６１には、生物的および薬理的生産物の０.２５〜１０
重量％の非−変性性両親媒性物質（デタージェント）に
よる処理が記載されている。
【０００５】タンパク質を所望によりデタージェントの
存在下、有機溶媒で処理する方法はＥＰ−Ｂ−０１３１
７４０に記載されている。この文献には、デタージェン
ト単独による処理がウイルス不活化に関してはあまり有
効でないことが示されている。しかしながら、膜で被わ
れたウイルスに対しては、有機溶媒単独で有効である。
そのような方法で不活化された、Ａ型肝炎で汚染された
因子ＶＩＩＩ濃縮物に関連する肝炎感染が既に起きてい
る。Ａ型肝炎ウイルスは脂質含有膜を持たないので、不
活化されない［マニュッキら(Manucci, P.M.), (1992)
The Lancet 339, 819 ("Outbreak of Hepatitis A Amon
g Italian Patients with Haemophilia"）］。
【０００６】因子ＶＩＩＩ含有画分の有機溶媒による処
理では、通常、処理後に、毒性的に活性な溶媒を手間の
かかる方法で分離しなければならない。ＥＰ−Ａ−０３
４３２７５は、この目的のために、因子ＶＩＩＩ含有画
分を大豆油またはヒマシ油のような油で抽出することを
提案している。その後、因子ＶＩＩＩをイオン交換物質
を用いるゲル透過クロマトグラフィーに付す。ＥＰ−Ａ
−００９４６１１によると、感染性を減少するために因
子ＶＩＩＩを乾燥状態で加熱する。ＥＰ−Ｂ−０１５９
３１１によると、存在し得るウイルスを不活化するため
に血液生産物を固体湿状態で加熱する。そのような“蒸
気加熱”された因子ＶＩＩＩ濃縮物に関しては、感染症
例の報告はない［マニュッキら(Manucci, P.M.), (199
2) Transfusion 32, 134-138 "Low Risk of Viral Infe
ction After Administration of Vapor-Heated Factor
VIII Concentrates"］。高純度の因子ＶＩＩＩの熱処理
が重要と考えられる。例えば、ＥＰ−Ａ−０１７３２４
２によると、クロマトグラフィー的に精製した因子ＶＩ
ＩＩを溶液中で加熱する前に、安定化剤混合物（炭化水
素およびアミノ酸）を加えねばならない。さもなくば、
クロマトグラフィー的精製の前に因子ＶＩＩＩ含有画分
をウイルス不活化処理に付すのが一般的であった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、有効なウイル
ス不活化処理の故にウイルス−安全と考えられる、精製
因子ＶＩＩＩを製造し得る方法を提供することを目的と
する。製造された製品の比活性は少なくとも２５Ｕ／mg
タンパク質であることが好ましい。本発明に従い、上記
の目的は下記の方法の組み合わせにより達成された： ａ）因子ＶＩＩＩ含有画分のクロマトグラフィー的な精
製、 ｂ）水溶液中での、因子ＶＩＩＩのテンシッド（tensid
e）／タンパク質比１：１から１０００：１におけるテ
ンシッド処理、および ｃ）因子ＶＩＩＩ製品の固体状態での熱処理。
【０００８】本発明によれば、因子ＶＩＩＩはＦＶＩＩ
Ｉ／ｖＦＷ複合体、ＦＶＩＩＩまたはｖＦＷとして製造
される。製造工程の間、ＦＶＩＩＩ／ｖＦＷ複合体の解
離は、例えば塩化カルシウムにより、容易に行える。本
発明のテンシッド処理によるウイルスの不活化は驚異的
な成功であることが分かった。例えば、TweenR80、Trit
onRX-100、TritonRX-114、ドデシルマルトシッドまたは
オクチルグリコシッド等の非イオン性テンシッド、ジメ
チルオクチルアミン−Ｎ−オキシドまたはＮ−ドデシル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホナートのような２イオン性テンシッド、およびデオ
キシコール酸ナトリウムまたはコール酸ナトリウムのよ
うなイオン性テンシッドをテンシッドとして用いること
ができる。テンシッド処理は原則として有機溶媒不含の
水溶液中で行われる。低温沈殿溶液を水溶液として用
い、所望により、さらにプロトロンビン複合体因子を吸
着させることで精製する。そのような溶液中でのテンシ
ッド／タンパク質の比率は１：１から１０：１が好まし
い。
【０００９】テンシッドはクロマトグラフィーの間に単
純な方法で分離することができるので、クロマトグラフ
ィー的な処理の前に、好ましくはテンシッド／タンパク
質の比率３.５：１から１０：１でテンシッド処理を行
うことが好ましい。他の態様では、テンシッド処理はま
たクロマトグラフィーの最中にも行い得る。この変法
は、凝集傾向があり、従って望ましくない共吸着を起こ
す傾向のあるタンパク質の存在下でも、特異的な方法で
吸着した因子ＶＩＩＩを得るという利益がある。因子Ｖ
ＩＩＩを低タンパク質含量の出発物質から回収する場
合、通常、水溶液中のテンシッド濃度を規定量に維持す
ることが適当である。このような方法でテンシッド／タ
ンパク質比率は１０００：１に達してもよい。
【００１０】例えば、組換え因子ＶＩＩＩを含有する細
胞培養上清のタンパク質含有量は少なくとも約１００mg
／ｌである。従って、この細胞培養上清中のテンシッド
濃度１０％は、テンシッド／タンパク質比約１０００：
１に相当するにすぎない。膜で被われていないウイルス
による感染に対する安全性を増すために、固体状態での
因子ＶＩＩＩの熱処理を用いる、本発明の組み合わせを
提供する。これは凍結乾燥製品について実行されるであ
ろうし、熱処理は、好ましくは製品が湿った状態で行
う。従って、本発明の好ましい態様は熱蒸気による熱処
理をも含み、そこでは、固形状態の因子ＶＩＩＩ製品
を、水、メタノール、およびエタノールの含有量を０.
０５（５重量％）以上、０.７０（７０重量％）以下、
好ましくは０.４０（４０重量％）以下に調整し、密閉
容器中、好ましくは不活性保護ガスの存在下、５０〜１
２１℃の範囲の温度で加熱する。
【００１１】因子ＶＩＩＩ凍結乾燥品はさらにアルブミ
ンおよび／またはクエン酸塩のような塩および／または
アミノ酸を含んでいてもよい。驚くべきことには、この
熱処理は実質的な活性の損失をもたらさないことが示さ
れ、従って、比較的不安定な高純度因子ＶＩＩＩを処理
することも可能である。クロマトグラフィー的な精製工
程で因子ＶＩＩＩは、随伴タンパク質から大いに遊離さ
れる。好ましい態様の製造方法は複数段階のクロマトグ
ラフィー精製を含み、ここでは、１つの段階で因子ＶＩ
ＩＩのための吸着物質を用い、後の段階で混在するタン
パク質のための吸着物質を用いる。即ち、まず、因子Ｖ
ＩＩＩの分離のために、まず最初に陰イオン交換樹脂を
用い、次いで、不溶性担体に固定化したゼラチン、ヘパ
リンのようなフィブロネクチンと高い親和性を有する物
質を用いることができる。この場合、因子ＶＩＩＩの親
和性担体への非特異的吸着を最小にするという観点か
ら、テンシッドの存在下でのクロマトグラフィーが好都
合である。
【００１２】アルブミン不含因子ＶＩＩＩ製品を製造す
るために、因子ＶＩＩＩ含有溶液の吸着を、染料リガン
ドゲル類（不溶性担体に固定化したCibacronR-Blue 3GA
（Bio-rad）；FractogelR TSK-AF-Blue (Merck), Blue-
SepharoseR-CL6B (Pharmacia)）上で行うことができ
る。そのようなゲルは高い選択性でアルブミンと結合す
ることができ；アルブミンは他の方法で定量的に因子Ｖ
ＩＩＩから分離することができず、アルブミンの含有が
安定化にとって望ましくない場合、それは因子ＶＩＩＩ
製品中の不純物となるものである。クロマトグラフィー
的な精製のためには、DEAE-SephadexR (Pharmacia)，QA
E-SepharoseR (Pharmacia)， DEAE-ToyopearlR (Tosoha
as)， TMAE-FractogelR (Merck)などのアクリレート、
シリケートまたはカーボハイドレートに基づく陰イオン
交換樹脂が好ましい。アクリレートに基づく陰イオン交
換樹脂は、好ましくは“テンタキュラーマトリックス(t
entacular matrices)”［ミューラー(Mueller W） (199
0) Journal of Chromatography 510, 133-140 "New Ion
Exchangers for the Chromatographyof Biopolymers"
参照］として形成される。そのようなマトリックスで、
交換基はマトリックス表面と結合しているポリマー側鎖
と一緒に存在する。その結果、高い負荷能力と改良され
た選択性とが得られる。
【００１３】本発明方法で製造された血液凝固因子ＶＩ
ＩＩはウイルスに関して安全であり、好ましくは少なく
とも２５Ｕ／mgタンパク質の高い比活性を示す。以下に
実施例を挙げ、本発明を詳しく説明する。
【００１４】
【実施例】実施例１ １０１リッターの血漿から得た低温沈澱１kgをバッファ
ー１（Ｔris−リジン緩衝化ＮaＣl溶液（８５mＭ／
Ｌ））３.５Ｌに溶解した。因子ＶＩＩＩ含有溶液の予
備精製のために、Ａｌ（ＯＨ）3を撹拌しながら溶解さ
せ、Ａｌ（ＯＨ）3を分離し、Ｂａ（ＳＯ）4を撹拌しな
がら溶解させた後、分離した。その後、上清のｐＨを
６.５に調節し、温度を４℃に下降させ、折出した沈澱
を遠心して分離し、捨てた。上清リッターあたり１１０
ｇのTritonRX-100を加え（テンシッド／タンパク質比；
５５：１）、２５℃で３０分間撹拌した。次いで、因子
ＶＩＩＩを、バッファー１でｐＨ６.８に平衡化した直
径９ｃｍのカラム内のＤＥＡＥ−ToyopearlR650M（Toso
haasによる）７５０ml上に吸着させた。因子ＶＩＩＩ含
有画分をバッファー２（クエン酸緩衝化５００mＭ Ｎa
Ｃl溶液）２.２５Ｌで溶離した。
【００１５】比活性はタンパク質１mgあたり因子ＶＩＩ
Ｉ ７６ＩＵであった。限外ろ過した因子ＶＩＩＩ含有
画分を凍結乾燥した後、因子ＶＩＩＩを７.５％ｗ／ｗ
Ｈ2Ｏの密閉容器内で、６０℃において１０時間加熱し
た。因子ＶＩＩＩ活性は非−加熱試料の７２％であっ
た。アルブミンの存在下で熱処理すると、因子ＶＩＩＩ
活性は非ー加熱試料の９２％であった。
【００１６】実施例２ 実施例１と同様の方法で低温沈澱１kgを得、溶解した。
予備精製はＡｌ（ＯＨ）3とＢａＳＯ4を用いて行った。
上清に、TweenR80（１２０ｇ）を加え（テンシッド／タ
ンパク質比；４：１）、２５℃で４５分間撹拌した。次
いで、バッファー１で１：３に希釈したのち、因子ＶＩ
ＩＩをＥＭＤ−ＴＭＡＥ−FractogelR (Merck)４００ml
に吸着させることで、溶液をクロマトグラフィー的に精
製した。この前に、ゲルをバッファー１で平衡化した。
結合しなかったタンパク質をバッファー１で分離し、次
いで因子ＶＩＩＩを含有する画分をバッファー２で溶離
した。比活性はタンパク質１mgあたり因子ＶＩＩＩ ４
５ＩＵであった。
【００１７】溶離液を限外ろ過で濃縮し、凍結乾燥し
た。因子ＶＩＩＩを、９.５％ｗ／ｗＨ2Ｏの存在下、密
閉容器内で、６０℃において１０時間加熱した。因子Ｖ
ＩＩＩ活性は非−加熱試料の８７％であった。欧州委員
会のDirective EC III/8115/89-ENによる全ウイルス減
少因子は、ＨＩＶ−１およびＦＳＭＥウイルスの例示方
法に従い、工程の間、数回、ウイルス懸濁液を加えるこ
とで測定した。全ウイルス減少因子は少なくとも１２に
達した。これは、理論上、全工程にわたって、少なくと
もウイルス力価１０12の減少に相当する。
【００１８】実施例３ 実施例２に従って製造された因子ＶＩＩＩ ３０００Ｉ
Ｕを含有する製品は、フィブロネクチン１２０Ｕ（３，
９６０μｇ）を含有していた。この不純物を除去するた
めに因子ＶＩＩＩ含有製品をヘパリン−セファロースカ
ラム（直径１.６ｃｍ）１５mlにより、２６０mＭ Ｎa
Ｃlバッファーを用い、クロマトグラフィー的に精製し
た。因子ＶＩＩＩは結合せず、因子ＶＩＩＩ含有画分に
はフィブロネクチンを検出し得なかった。比活性は因子
ＶＩＩＩ ４６ＩＵ／タンパク質mgであった。７５０m
Ｍ ＮaＣl溶液によってフィブロネクチンを回収でき
た。
【００１９】実施例４ 低温沈澱１kgを得、実施例１と同様の方法で溶解した。
予備精製はＡｌ（ＯＨ）3とＰＥＧ４０００を用いて行
った。０.１５％Ａｌ（ＯＨ）3を加え、２５℃で３０分
間撹拌した。次いでＡｌ（ＯＨ）3を遠心分離し、捨て
た。上清に、３.１５％ＰＥＧ４０００を加え、ｐＨを
６.６に調節し、温度を９℃まで下げた。３０分間撹拌
し、形成した沈澱を遠心分離し捨てた。さらに、上清１
ＬにTweenR80（１００ｇ）を加え（テンシッド／タンパ
ク質比；５０：１）、十分に撹拌した。バッファー１で
希釈（希釈率１：３）したのち、溶液をＱ−SepharoseR
Fast Flow (Pharmacia）１.７５Ｌでクロマトグラフし
た。因子ＶＩＩＩは吸着され、結合しなかったタンパク
質をバッファー１（７.９Ｌ）で分離した。クエン酸ナ
トリウム−緩衝化５００mＭ ＮaＣl溶液５.２５Ｌで溶
離することにより、因子ＶＩＩＩ含有画分を得た。比活
性は因子ＶＩＩＩ ８９ＩＵ／タンパク質mgであった。
濃縮した溶出液を凍結乾燥した後、８％ｗ／ｗＨ2Ｏの
存在下、密閉容器内で、６０℃において１０時間加熱し
た。因子ＶＩＩＩ活性は非−加熱試料の８１％であっ
た。
フロントページの続き (72)発明者 ヘルベルト・グリッチュ オーストリア、アー−1140ヴィーン、ハ インリッヒ−コリン−シュトラーセ８− 14／16／22番 (72)発明者 イェンドラ・リンナウ オーストリア、アー−1224ヴィーン、ラ ーフェンデルヴェーク24番 (72)発明者 オットー・シュヴァルツ オーストリア、アー−1190ヴィーン、セ ルテスガッセ５番 (72)発明者 ペーター・トゥレチェク オーストリア、アー−1190ヴィーン、フ ートヴァイデンガッセ41番 (72)発明者 ギュンター・ヴェーバー オーストリア、アー−2522オーバーヴァ ルターズドルフ、カロルスシュトラーセ 23番 (56)参考文献 特開 昭63−132899（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−502200（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高純度のウイルス−安全な因子ＶＩＩＩ
    製品の製造方法であって、以下の工程： 因子ＶＩＩＩ含有画分を調製し、 該因子ＶＩＩＩ含有画分をクロマトグラフィー的に精製
    して因子ＶＩＩＩ製品を得、 該因子ＶＩＩＩ製品を、水溶液中、テンシッド／タンパ
    ク質比１：１から１０００：１でテンシッド処理するこ
    とにより、テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ製品を得、
    そして該テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ製品を固体状
    態で熱処理するの組み合わせを含む方法。
  2. 【請求項２】 高純度のウイルス−安全な因子ＶＩＩＩ
    製品の製造方法であって、以下の工程 因子ＶＩＩＩ含有画分を調製し、 該因子ＶＩＩＩ含有画分を、水溶液中、テンシッド／タ
    ンパク質比３.５：１から１０：１でテンシッド処理す
    ることにより、テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ含有画
    分を得、 該テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ含有画分をクロマト
    グラフィー的に精製してテンシッド処理した因子ＶＩＩ
    Ｉ製品を得、そして該テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ
    製品を固体状態で熱処理するの組み合わせを含む方法。
  3. 【請求項３】 高純度のウイルス−安全な因子ＶＩＩＩ
    製品の製造方法であって、以下の工程 因子ＶＩＩＩ含有画分を調製し、 該因子ＶＩＩＩ含有画分をクロマトグラフィー的に精製
    する間に、該因子ＶＩＩＩ含有画分を、水溶液中、テン
    シッド／タンパク質比１：１から１０００：１でテンシ
    ッド処理してテンシッド処理した因子ＶＩＩＩ製品を
    得、そして該テンシッド処理した因子ＶＩＩＩ製品を固
    体状態で熱処理するの組み合わせを含む方法。
  4. 【請求項４】 熱処理を、固体状態の該テンシッド処理
    した因子ＶＩＩＩ製品を、水、メタノール、およびエタ
    ノールの内の１つの含有量を０.０５（５重量％）以上
    ０.７０（７０重量％）以下に調整し、該テンシッド処
    理した因子ＶＩＩＩ製品を密閉容器中、５０〜１２１℃
    の間の温度で熱蒸気により熱処理することにより行う請
    求項１、２または３の方法。
  5. 【請求項５】 水、メタノール、およびエタノールの内
    の１つの該含有量が０.４０（４０重量％）以下に調節
    されている請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 該密閉容器に不活性な保護ガスが供給さ
    れている請求項４の方法。
  7. 【請求項７】 該クロマトグラフィー的な精製が因子Ｖ
    ＩＩＩ吸着物質を用いる工程、および混在タンパク質吸
    着物質を用いる工程を含む数工程によって行われる請求
    項１、２または３の方法。
  8. 【請求項８】 さらに、該クロマトグラフィー的な精製
    のためにアクリレート類、シリケート類、カーボハイド
    レート類のいずれか１つに基づく陰イオン交換樹脂を用
    いることを含む請求項１、２または３の方法。
  9. 【請求項９】 該クロマトグラフィー的な精製のため
    に、基本的に、陰イオン交換基を含むポリマー側鎖が結
    合しているマトリックスからなる陰イオン交換樹脂を用
    いることを含む請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 比活性が少なくとも２５Ｕ／タンパク
    質（mg）である凝固因子ＶＩＩＩ製品の製造のために請
    求項１、２または３に記載の方法を用いる方法。
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