JPS62195331A - 血液凝固第８因子製剤の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液凝固第■因子製剤の製造工程において、第
■因子を含む粗分画溶液を特定の安定剤の存在下で加熱
処理し、第■因子の活性を失うことな（製剤中に含まれ
る不安定な夾雑物を除去し、第■因子溶液の安定性を向
上させ、さらに液状でのウィルス不活化を実現する方法
に関する。

第■因子製剤は、血友病Ａの治療剤として、最も効果が
あり、患者は一生を通じてその補充療法を受けなければ
ならない。ところが、血液製剤一般と同様に第■因子製
剤の輸注により、人体由来の病原性微生物に感染する危
険性がある。これらの製剤を投与後の肝炎あるいはＡＩ
ＤＳ（後天性免疫不完症候群）等のウィルス性感染症は
、良く知られているところである。すなわち、市販の第
■因子濃縮製剤は数千人の供血者から提供された血漿を
プールして製造されるため、病原性微生物もプールされ
る結果となり、患者は製剤の輸注回数に比例してこれら
のウィルスによる感染症にかかるリスクが高くなる。そ
こで近年、夾雑するウィルスを不活化するために、種々
の方法が検討されている。すなわち、溶液状態での加熱
法である特開昭５９−１３４７３０、特願昭６０−０２
９３７０、凍結乾燥状態での加熱法である特開昭５８−
２１３７２１、仙薬剤等による処理法である特開昭５７
−８０３２３、特開昭５８−２２２０２３、特開昭５９
−１３０８１９、特開昭６０−１３２９１９等である。

熱によるウィルス不活化法は分画製剤に応用されている
最も一般的な方法である。例えばアルブミン製剤ではア
セチルトリプトファンナトリウムとカプリル酸ナトリウ
ムの存在下で溶液状態で６０℃１０時間の加熱を施すこ
とにより、肝炎等のウィルスが不活化されている。第■
因子製剤についても加熱法が試みられているが、第■因
子ｍ縮製剤は粗分面であるため熱に対して不安定であり
、溶液状態で加熱すると安定剤の存在下でも、回収率が
低い。

そこで凍結乾燥状態で加熱する方法が、広く行われてい
る。しかし凍結乾燥状態での加熱は、溶液状態での加熱
に比べてウィルスの不活化速度が著しく劣る（　Ｐｒｏ
ｃ、　４ｔｈ、　Ｉｎｔ、Ｓｙｍｐ、　Ｋ　Ｔ、ｐ１０
？（１９８４）　）。凍結乾燥後加熱した製剤では、肝
炎ウィルスの不活化が不充分であり、輸注によりＮｏｎ
　Ａ　ＮｏｎＢ肝炎に感染すると報告されている　（Ｃ
ｏｌｏｍｂｏ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ　２．１
　（１９８５）、およびＰｒｅｓｔｅｎ、Ｆ、Ｅ、　ｅ
ｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ　２，２１３　（１９８５）　
）。

以上述べたように、現在までに、第■因子製剤を高い回
収率で効率良く加熱する方法は未だ確立されていない。

本発明者らは、これらの不充分な点を改善する方法を検
討し、第■因子を含む分画を予備的に加熱処理すること
により熱安定性を増加させることが出来ることを見出し
た。すなわち、比較的低濃度の安定剤の存在下で短時間
加熱処理を行う。その後、特願昭６０−０２９３７０等
１の方法で６０℃１０時間加熱すれば効率良くウィルス
不活化第■因子製剤を製造することが可能となる。

表１に精製第■因子分画をｐＨ７，２で１．５Ｍサルコ
シンの存在下で５４℃２０分間加熱処理を施した後、３
Ｍサルコシン存在下で更に６０℃１０時間加熱した場合
の活性の回収率を、予備加熱せずに３Ｍサルコシン存在
下に６０℃１０時間加熱処理した場合の回収率と比較し
て示した。表から明らかなように、予備加熱することに
より、６０℃１０時間加熱処理における第■因子の収率
は著しく向上する。又、外観上も、直接加熱した場合は
多量の沈澱物が生じるが、予備加熱を行った場合は透明
度が保たれていた。

表１６０℃１０時間加熱時の第■因子の安定性に対する
予備加熱処理の影響 ＊１　１．５Ｍサルコシン存在下、５４’Ｃ２０分間加
熱した。

＊２３Ｍサルコシン（ｐＨ７，３）を添加して行った。

本発明では粗製あるいは部分精製第■因子濃縮分画の溶
液に、サルコシン、グリシン、リジン、アミノ酪酸等の
アミノ酸あるいはクエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有
機酸のうち１種類かあるいは２種類以上を併用し、終濃
度０．０５〜２Ｍを加えて、５０〜７０℃で３〜６０分
間、ｐＩ（５〜８で加熱処理を行なう。その結果、溶液
中の第■因子の熱安定性が向上し、夾雑するウィルスの
不活化のための加熱処理が容易となる。本発明において
使用される原料は、献血者より、ＣＰＤ。

ＡＣＤなどの抗凝固剤の存在下で採血され分離された、
あるいはアフェレーシス採漿により得られた新鮮血漿、
あるいはこれらを凍結融解して得られたクリオプレシピ
テート、あるいはこれを更にポリエチレングリコール等
の分別沈殿法、Ａｅ（ＯＨ）、等の吸着処理、イオン交
換、アフィニティー等クロマトグラフィーなど種々の方
法で精製した第■因子分画等が考えられるが、人由来の
第■因子を含有する分画であれば特に限定されない。

本発明の加熱処理の際に用いる第■因子溶液中の第■因
子の濃度は、特に規定されない。しかし、これに続くウ
ィルス不活化加熱処理、安定剤除去処理などを考慮すれ
ば、１０〜５０単位／−が望ましい。溶液のｐＨは一般
に６〜８であり、好ましくは６．８〜７．５が望ましい
。

以上述べてきた方法で、加熱処理した第■因子溶液は一
度１０〜１５℃に冷却し、遠心分離によって沈殿分画を
除去する。得られた上澄を特願昭６０−０２９３７０等
の適当な方法でウィルス不活化処理を行う。その後、ゲ
ル口過等の方法により安定剤を除去する。必要であれば
更に、分別沈殿、吸着処理、クロマトグラフィーなどの
精製操作を行なう。この様にして得られた第■因子分画
を限外口過により、第■因子の濃度を調節し、ｐＨ１塩
強度を調節し、少量の安定剤が必要であればこれを加え
ガラスバイアルに分注し、凍結乾燥して、第■因子濃縮
製剤を製造する。

以下に本発明を実施例、により説明する。なお、本発明
は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ ＡＣＤあるいはＣＰＤ等の抗凝固剤の存在下に採血した
新鮮な人血液より遠心分離して人血漿を得た。血液バッ
グを使用して一４０℃のメタノール槽中で凍結した後、
４℃の恒温水槽中で融解し、生じたクリオプレシピテー
トを遠心分離して回収した。これに等量の蒸留水を加え
て３０℃の恒温水槽中で溶解し、ガラスフラスコ中に移
した。この溶液に表２に示すように、各種のアミノ酸お
よび有機酸を加えて、５０〜７０℃で３〜６０分間加熱
した。加熱終了後検体はただちに水冷し、１０．００Ｏ
ｒｐｍ、１５℃、１０分間遠心し、上澄を回収した。更
にこれに終濃度３Ｍのサルコシンを添加し、ｐＨを７．
０に調製し６０℃１０時間加熱した。この操作前後の第
■因子活性の変化を観察した。表２に示されるように予
備加熱処理を施した検体では未処理の検体に比べて第■
因子の回収率が高値であった。又、予備加熱の際の安定
剤が比較的高濃度の場合は高い温度で長時間加熱処理が
必要であることがわかった。予備加熱処理により６０℃
加熱処理の際の第■因子活性の回収率が４０％から５２
〜７３９６と改善した。

表２　種々の安定剤添加予備加熱処理の第■因子活性の
安定性に対する影響 −５４℃　１’０ｍ１ｎ　　　　　　　　　　２７サル
コシン　　０．５Ｍ　　　５４℃　　５ｍ１ｎ　　　　
　　　　５８１Ｍ　　　５４℃　１０ｍ１ｎ　　　　　
　　　　　６７１．６Ｍ　　　５４℃　２０ｍ１ｎ　　
　　　　　　　　７３２Ｍ　　　６０℃　３０ｍ１ｎ　
　　　　　　　　６５グリシン　０．１Ｍ　　５４℃　
３ｍ１ｎ　　　　　　６１０．５Ｍ　　　５４℃　　５
ｍ１ｎ　　　　　　　　　　７２１Ｍ　５６℃　７ｍ１
ｎ　　　　　　　７１リ　　ジ　　ン　　　　　ＩＭ　
　　　６０℃　　　３ｍ１ｎ　　　　　　　　　　　　
６２１Ｍ　　７Ｑ℃　３ｍ１ｎ　　　　　５？４−アミ
ノ酪酸　　　ＩＭ　　　５４℃　　８ｍ１ｎ　　　　　
　　　　　６８クエンＮ１　０．５Ｍ　　　５０℃　１
０ｍ１ｎ　　　　　　　　５２１Ｍ　　５０℃　（ｉＱ
ｍｉｎ　　　　　　　　　５４コハク酸　０．５Ｍ　　
５２℃　１０　ｍｉｎ　　　　　　　５８リンゴ酸　０
．５Ｍ　　５３℃　１０　ｍｉｎ　　　　　　　６０グ
リンン　　２Ｍ　　６０’０　２０ｍ１ｎ　　　　　　
６８＋リンゴＭｌ　　０．５Ｍ １６０℃１０時間加熱前の■Ｃを１００％とした。

実施例２ 市販第■因子濃縮製剤（非加熱２５０単位人）を０．２
Ｍグリシン水溶液（ｐＨ７，０）　１０−に溶解し、６
０℃で５分間加熱し、ただちに水冷した。次に１５，０
００　ｒｐｍ、　１０分間、１２℃で遠心し上澄を得た
。

これに等量の８Ｍサルコシン溶液（ｐＨ７，３）　ヲ加
え６０℃で１０時間加熱し、水冷した。１５．００Ｏｒ
ｐｍ　、２０分間、１０℃で遠心分離し上澄を得、０．
２９６クエン酸ナトリウムを含む０．１　Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＩ（６，８）で平衡化したセフィデックスＧ−
２５カラム（Ｂｅｄ　Ｖｏｌ、　５０ｍｊ　）に１５℃
で３Ｔｎ１／ｍｉｎの流速で負荷し、脱塩した。この様
な操作で第■因子１３７単位およびタンパク質１５．６
Ｔｒ１ｇを含む溶液３４−が得られた。同様な操作を５
回くり返し、得られた第■因子を限外口過器（アミコン
社ＰＭ５０膜）により濃縮後、ガラスバイアルに分注、
凍結乾燥し２５０単位人加熱ウィルス不活化処理第■因
子濃縮製剤２本を調製した。

実施例３ アフエレーシス採漿によりＡＣＤ存在下で採漿した人血
漿２００ｅをドライアイス−メタノールで凍結し、４℃
の恒温水槽で融解しクリオプレシビテーｚＫｐ（湿重）
を回収し実施例１に記載の方法で溶解した。これに終濃
度１．５Ｍの８Ｍサルコシン溶液を加え、ｐＨを７．３
に調整して５４℃で２０分間加熱し、１０℃の恒温水槽
中で、緩やかに撹拌しながら冷却した後、遠心分離し、
上澄２．７３ｅを回収した。この上澄にサルコシン粉末
を終濃度３Ｍになるように少量づつ、３０分間程度かけ
て加え溶解した。６０℃１０時間加温し、冷却後、５．
００Ｏｒｐｍ、　３０分間１２℃で遠心し、上澄２．３
８ｅを採取した。この溶液を０６１Ｍの塩化ナトリウム
を含む５０ｒｎＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラム（Ｂｅｄ　Ｖｏｌ。

５ｅ）に数回に分けて負荷し、１５℃流速２．Ｏｅ／ｈ
ｒで脱塩した。次に、同様に０．１Ｍ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化し
たゼラチンセファロースカラム（Ｂｅｄ　Ｖｏｌ、５０
０　ｒｎｔ、ファルアシア社）を１５℃で３００ｄ／ｈ
ｒの流速で通過させた。得られた第■因子濃縮分画は、
限外口過により濃度を調整し、５ｍｇ／−クエン酸ナト
リウムと１０　ｍ９／−グリシンを添加し、ガラスバイ
アルに分注後、凍結乾燥した。上記の操作によって、２
５０単位入り加熱ウィルス不活化処理第■因子濃縮製剤
が１３６本製造された。製品の比活性は１．６４単位／
”ＩＦ　ｐｒｏｔｅ＋ｎであった〇実施例４ 以下の操作は特に指定のない場合は１５℃の恒温室中で
行った。実施例２に示した方法で採取したクリオプレシ
ピテート１．５Ｋｆを０．２９６クエン酸ナトリウムを
含む０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＩ（６，８）　、１．
５　ｅに溶解した。これに４０艷の予め同波で洗浄した
水酸化アルミニウムゲルを加え、緩やかに２時間撹拌し
、５．００　Ｏｒｐｍ　、３０分間遠心分離し沈殿を除
去した。この溶液のｐＨを希塩酸で６，５に調整し、ポ
リエチレングリコール４．０００　（和光純薬社）を終
濃度１．５９りとなるように加え３０分分間中かに撹拌
後、５，０００ｒｐｍ、３０分間遠心し上澄を１．７ｅ
回収した。次にＱ、２９６クエン酸ナトリウムを含む０
．１Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６，８）で平衡化した
セファデックスＧ−２５力５　ム（Ｂｅｄ　Ｖｏｌ、５
　ｅ　）を使用シテ実施例３に記載の方法で脱塩した。

得られた第■因子分画に終濃度０．５Ｍクエン酸ナトリ
ウムおよび２Ｍリジン塩酸を加え、ｐＨを７．０に調整
し、６０℃１０分間加熱した。加熱終了後ただちに水冷
し、実施例３に記載の方法で遠心分離して沈殿を除去し
た。更に上澄に３Ｍサルコシンを加え６０℃１０時間加
熱処理を行い、溶液を冷却し遠心分離して上澄を分取し
た。前出のセファデックスＧ−２５カラム（Ｂｅｄ　Ｖ
ｏｌ、　５１！　）を使用して脱塩し、サルコシンを除
去し２．２ｅの第■因子濃縮分画を得た。限外口過で１
．７ｅに濃縮後、５ｑ／−のグリシンを加え、０．２２
μｍのメンブランフィルタ−で無菌口過し、ガラスバイ
アルに分注し凍結乾燥した。以上の操作で、５００単位
入り、加熱ウィルス不活化処理策■因子濃縮製剤８９本
を製造した。この製剤の比活性はｌ、９２単位／ｍｙ　
ｐｒｏ−ｔｅ　ｉｎであった。

手続補正ＩＦ（方式） ％式％ １、事件の表示　昭和６１年特許願第３７２８４号２、
発明の名称　血液凝固第■因子製剤の製法３、補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 住所（居所）東京都港区芝大門１丁目１番３号４、代理
人 住所（居所） 氏名（名称）　　　　　　　　　　　　　　　［相］５
、補正命令の日付（発送日）昭和６１年４月２２日６、
補正の対象　明細書（特許請求の範囲の項目の記載）記
載した事項以外内容に変更なし。

７、補正の内容　明細書　特許請求の範囲の項目の記載
１ペ一ジ３行目に「♀、特許請求の範囲」を挿入する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液凝固第VIII因子製剤の製造工程において、血液
   凝固第VIII因子を含む粗分画溶液に対し、安定剤を加え
   加熱処理を施すことにより、第VIII因子の活性を失なう
   ことなく該溶液の安定性を向上させ該溶液の加熱ウィル
   ス不活化処理の効率を高めることを特徴とする血液凝固
   第VIII因子製剤の製法。 ２、安定剤として、サルコシン、グリシン、リジン、ア
   ミノ酪酸等のアミノ酸あるいは、クエン酸、コハク酸、
   リンゴ酸等の有機酸を単独あるいは２種類以上を併用す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、加熱処理を５０ないし７０℃で、３ないし６０分間
   行なう特許請求の範囲第１項ないし第２項記載の方法。 ４、加熱処理をｐＨ６ないし８の範囲で行なう特許請求
   の範囲第１項ないし第３項のいづれかの項に記載の方法
   。