JPH0376292B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、トロンビ製剤のウイルス不活化のた
めの加熱処理方法に関するものである。 〔従来の技術〕 従来より、アルブミンなどの血漿蛋白につい
て、そこに混入してくる懸念のあるウイルスを不
活化する最も確実な方法として、水溶液状態での
加熱処理方法（以下、液状加熱法と称す）が、マ
レイ（Murray）ら（ザ ニユーヨーク アカデ
ミー オブ メデイスン（The New York
Academy of Medicine）、31(5)、341〜358
（1955）〕の報告に基づいてとられており、以来今
日に至るまで長年にわたり汎用され、疫学的にも
液状加熱法のウイルス不活化効果が立証されてい
る。 しかしながら、アルブミンのように液状加熱に
耐えるものは血漿蛋白の中でも極く限られてお
り、特に生理活性、又は生物活性を有する血漿蛋
白は熱に対し非常に敏感で、熱変性をおこし易
く、活性の低下、消失を招きやすい。 一方、液状加熱法とは別に、水分を含まない
か、またはほとんど含まない乾燥状態で、血漿蛋
白の加熱処理（以下、乾熱処理という）を行う
と、液状加熱法に比べ、その活性の低下が著しく
抑制されることが血液凝固第因子をモデルとす
る実験で明らかとなつた。しかし、一般に乾熱処
理においても、安定化剤を添加しなければ血漿蛋
白の活性低下はまぬがれ得ないし、また、水に対
する溶解性及び溶状が悪くなるというのが実情で
ある。 ところで、加熱によるウイルス不活化の作用機
序は、液状加熱では、主としてウイルスの蛋白質
成分の変性に基づいているのに対し、乾熱処理で
は、主にウイルスの脂質成分の酸化によつて傷害
を受け病原性が失われるといわれており、両方の
ウイルス不活化機構はお互いに重なり合う部分が
あるものの、基本的には異なることか示唆されて
いる〔ラーン、フイジカル メソツズ オブ ス
テリライゼーシヨン オブ マクロオーガニズム
ス バクテリオロジー レビユ．（Rahn
Physical Methods of Sterilization of
Macroorganisms Bact. Rev.）９，１−47
（1945）〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、トロンビン製剤を失活させる
ことなく、夾雑ウイルスを不活化する加熱処理方
法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、トロンビン製剤を、後記特定の
安定化剤の存在下に乾熱処理することによつてト
ロンビンの活性を失うことなく、ウイルスを不活
化できると、更にトロンビンが顕著に安定化さ
れ、しかもかかる条件下に乾熱処理を行つたトロ
ンビン製剤は水に対する溶解性及び溶状が良いこ
とを見い出して本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウイルスの夾雑が危惧される
人トロンビン製剤を実質的に乾燥状態にて、中性
アミノ酸および糖類から選ばれる少なくとも一種
の安定化剤の存在下にウイルスが不活化されるま
で加熱することを特徴とする人トロンビン製剤の
加熱処理方法に関するものであり、これによつて
夾雑するウイルスが不活化され、かつ、トロンビ
ンの安定性及び水溶解性が改善される。 本発明における加熱処理対象であるトロンビン
製剤は、トロンビンとしての生物活性または生理
活性を有するもの、たとえば血漿蛋白を分画して
得られるものである。 かかるトロンビン製剤としては、例えば日本薬
局方が規定する規格に適合したものが挙げられ
る。 本発明は、通常トロンビン溶液を凍結乾燥した
後、通常、含湿度0.05〜３％の条件下で加熱する
ことによつて実施されるが、その際、前記特定の
安定化剤を添加しておくことによつて、トロンビ
ンの安定が促進され、またトロンビンの溶解性お
よび液状が改善される。 本発明にて使用される安定化剤としての中性ア
ミノ酸は、たとえば、グリシン、アラニン等が挙
げられ、また、糖類としては、単糖類（たとえ
ば、グルコース、マンノース、マンニツト等）、
二糖類〔たとえば、マルトース、シヨ糖（白糖）、
乳糖等〕が挙げられる。 安定化剤の使用量は、トロンビン5000単位に対
して、中性アミノ酸を用いる場合には５〜500mg、
好ましくは５〜100mgであり、糖類を用いる場合
には５〜500mg、好ましくは50〜300mgである。こ
の程度の添加量において、安定化効果、水溶解
性、溶状と製剤化のバランスが最も良好である。 なお、この際従来から血漿蛋白分画製剤の安定
剤として用いられているクエン酸ナトリウムを併
用することによつて、その緩衝作用により液状で
の安定性を確保することができる。その添加量は
トロンビン5000単位に対して、通常10〜300mgで
あり、好ましくは30〜150mgである。 トロンビン製剤は、通常凍結乾燥品として使用
に供するが、安定化剤は、血漿蛋白の凍結乾燥処
理の前に添加しておくことが好ましい。前記安定
化剤は凍結乾燥時の安定化剤としても有用であ
る。 また、安定化剤は、本発明の乾熱処理後に除去
してもよいが、当該トロンビン製剤中にそのまま
配合しておくことが好ましい。 加熱処理における加熱処理は、通常30〜100℃、
好ましくは60℃程度であり、加熱時間は、通常10
分〜200時間、好ましくは10〜100時間程度であ
る。 本発明の加熱処理による不活化対象とされるウ
イルスは、ヒト血漿蛋白に夾雑が危惧されるウイ
ルスであり、特に肝炎ウイルスなどである。 また、本発明の加熱処理は不活性ガス雰囲気下
で行うことにより、加熱時の安定性をより高める
ことが出来る。不活性ガスとしては、たとえば窒
素ガス、アルゴン、ヘリウムなどが挙げられる。 本発明の加熱処理は、粉末バルクまたは最終製
剤等、トロンビン製剤精製工程のどの段階で行つ
てもよい。 本発明乾熱処理における乾燥状態は実質的に無
水の状態であり、可及的に水分の少ない状態であ
ることが好ましい。水分の含量は、通常３％以
下、好ましくは１％以下であり、通常は0.05〜３
％程度である。 本発明によるときは、貴重な血液製剤であるト
ロンビンの活性を大きく損失することなく、製剤
中に混入が危惧されるウイルスを不活化できるか
ら、血漿蛋白製剤の工業的製法として有益であ
る。 〔実施例〕 以下、本発明を実験例及び実施例により説明す
るが、本発明はこれらによつて何ら限定されるも
のではない。 実施例 １ 正常人血漿から、塩化バリウム吸着法とDEAE
−セフアデツクス カラムクロマトグラフイー法
〔バジヤ，エス．ピー．ら、ジヤーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Bajaj，S.P.，
et al.，J.Biol.Chem.）248，7729（1973）〕により
プロトロンビンを精製し、このプロトロンビンに
人胎盤より調整したトロンボプラスチン、人血漿
及び塩化カルシウム液を加え、トロンビン変換し
て、粗製トロンビン（１mg蛋白当たりのトロンビ
ン活性10単位）を得た。この粗製トロンビンを
SP−セフアデツクス カラムクロマトグラフイ
ー法〔ランドブラツド，アール．エル．，バイオ
ケミストリー（Lundblad，R.L.，
Biochemistry），10，2501（1971）により精製し、
この精製トロンビンを濃縮後、7.5％Ｄ−マンニ
トールを含む100ｍＭクエン酸緩衝液（PH7.0）に
対し透析し、トロンビン溶液（3500単位／ml、１
mg蛋白当たりのトロンビン活性500単位）を調整
した。このトロンビン溶液を除菌濾過した後、15
ml容バイアル瓶に２mlずつ小分け分注し、凍結乾
燥を行つた。凍結乾燥後のトロンビン活性は
6800u／Ｖ、含湿度は0.07％であつた。この凍結
乾燥されたトロンビン製剤を60℃で72時間加熱処
理し、加熱処理前のトロンビン製剤と比較しなが
ら、溶解性、トロンビン活性、セルロースアセテ
ート膜電気泳動、ゲル濾過の項目につき試験した
結果、加熱処理後でも著明な変化はみられず、本
加熱条件下ではトロンビン製剤は安定であること
がわかつた。 実験例 １ 実施例１に準じて調製した精製トロンビン（１
mg蛋白当たりのトロンビン活性550単位）より、
濃縮、透析、凍結乾燥の操作によつて第１表記載
の安定化剤量を含むトロンビン製剤（トロンビン
活性6000単位／瓶）を調製した。そのトロンビン
製剤を60℃で72時間加熱処理した後、トロンビン
活性について試験した。その結果を第１表に示
す。 この結果、安定化剤の使用により、無添加の場
合に比べて安定性が極めて改善されることが判つ
た。
めの加熱処理方法に関するものである。 〔従来の技術〕 従来より、アルブミンなどの血漿蛋白につい
て、そこに混入してくる懸念のあるウイルスを不
活化する最も確実な方法として、水溶液状態での
加熱処理方法（以下、液状加熱法と称す）が、マ
レイ（Murray）ら（ザ ニユーヨーク アカデ
ミー オブ メデイスン（The New York
Academy of Medicine）、31(5)、341〜358
（1955）〕の報告に基づいてとられており、以来今
日に至るまで長年にわたり汎用され、疫学的にも
液状加熱法のウイルス不活化効果が立証されてい
る。 しかしながら、アルブミンのように液状加熱に
耐えるものは血漿蛋白の中でも極く限られてお
り、特に生理活性、又は生物活性を有する血漿蛋
白は熱に対し非常に敏感で、熱変性をおこし易
く、活性の低下、消失を招きやすい。 一方、液状加熱法とは別に、水分を含まない
か、またはほとんど含まない乾燥状態で、血漿蛋
白の加熱処理（以下、乾熱処理という）を行う
と、液状加熱法に比べ、その活性の低下が著しく
抑制されることが血液凝固第因子をモデルとす
る実験で明らかとなつた。しかし、一般に乾熱処
理においても、安定化剤を添加しなければ血漿蛋
白の活性低下はまぬがれ得ないし、また、水に対
する溶解性及び溶状が悪くなるというのが実情で
ある。 ところで、加熱によるウイルス不活化の作用機
序は、液状加熱では、主としてウイルスの蛋白質
成分の変性に基づいているのに対し、乾熱処理で
は、主にウイルスの脂質成分の酸化によつて傷害
を受け病原性が失われるといわれており、両方の
ウイルス不活化機構はお互いに重なり合う部分が
あるものの、基本的には異なることか示唆されて
いる〔ラーン、フイジカル メソツズ オブ ス
テリライゼーシヨン オブ マクロオーガニズム
ス バクテリオロジー レビユ．（Rahn
Physical Methods of Sterilization of
Macroorganisms Bact. Rev.）９，１−47
（1945）〕。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、トロンビン製剤を失活させる
ことなく、夾雑ウイルスを不活化する加熱処理方
法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、トロンビン製剤を、後記特定の
安定化剤の存在下に乾熱処理することによつてト
ロンビンの活性を失うことなく、ウイルスを不活
化できると、更にトロンビンが顕著に安定化さ
れ、しかもかかる条件下に乾熱処理を行つたトロ
ンビン製剤は水に対する溶解性及び溶状が良いこ
とを見い出して本発明を完成した。 即ち、本発明は、ウイルスの夾雑が危惧される
人トロンビン製剤を実質的に乾燥状態にて、中性
アミノ酸および糖類から選ばれる少なくとも一種
の安定化剤の存在下にウイルスが不活化されるま
で加熱することを特徴とする人トロンビン製剤の
加熱処理方法に関するものであり、これによつて
夾雑するウイルスが不活化され、かつ、トロンビ
ンの安定性及び水溶解性が改善される。 本発明における加熱処理対象であるトロンビン
製剤は、トロンビンとしての生物活性または生理
活性を有するもの、たとえば血漿蛋白を分画して
得られるものである。 かかるトロンビン製剤としては、例えば日本薬
局方が規定する規格に適合したものが挙げられ
る。 本発明は、通常トロンビン溶液を凍結乾燥した
後、通常、含湿度0.05〜３％の条件下で加熱する
ことによつて実施されるが、その際、前記特定の
安定化剤を添加しておくことによつて、トロンビ
ンの安定が促進され、またトロンビンの溶解性お
よび液状が改善される。 本発明にて使用される安定化剤としての中性ア
ミノ酸は、たとえば、グリシン、アラニン等が挙
げられ、また、糖類としては、単糖類（たとえ
ば、グルコース、マンノース、マンニツト等）、
二糖類〔たとえば、マルトース、シヨ糖（白糖）、
乳糖等〕が挙げられる。 安定化剤の使用量は、トロンビン5000単位に対
して、中性アミノ酸を用いる場合には５〜500mg、
好ましくは５〜100mgであり、糖類を用いる場合
には５〜500mg、好ましくは50〜300mgである。こ
の程度の添加量において、安定化効果、水溶解
性、溶状と製剤化のバランスが最も良好である。 なお、この際従来から血漿蛋白分画製剤の安定
剤として用いられているクエン酸ナトリウムを併
用することによつて、その緩衝作用により液状で
の安定性を確保することができる。その添加量は
トロンビン5000単位に対して、通常10〜300mgで
あり、好ましくは30〜150mgである。 トロンビン製剤は、通常凍結乾燥品として使用
に供するが、安定化剤は、血漿蛋白の凍結乾燥処
理の前に添加しておくことが好ましい。前記安定
化剤は凍結乾燥時の安定化剤としても有用であ
る。 また、安定化剤は、本発明の乾熱処理後に除去
してもよいが、当該トロンビン製剤中にそのまま
配合しておくことが好ましい。 加熱処理における加熱処理は、通常30〜100℃、
好ましくは60℃程度であり、加熱時間は、通常10
分〜200時間、好ましくは10〜100時間程度であ
る。 本発明の加熱処理による不活化対象とされるウ
イルスは、ヒト血漿蛋白に夾雑が危惧されるウイ
ルスであり、特に肝炎ウイルスなどである。 また、本発明の加熱処理は不活性ガス雰囲気下
で行うことにより、加熱時の安定性をより高める
ことが出来る。不活性ガスとしては、たとえば窒
素ガス、アルゴン、ヘリウムなどが挙げられる。 本発明の加熱処理は、粉末バルクまたは最終製
剤等、トロンビン製剤精製工程のどの段階で行つ
てもよい。 本発明乾熱処理における乾燥状態は実質的に無
水の状態であり、可及的に水分の少ない状態であ
ることが好ましい。水分の含量は、通常３％以
下、好ましくは１％以下であり、通常は0.05〜３
％程度である。 本発明によるときは、貴重な血液製剤であるト
ロンビンの活性を大きく損失することなく、製剤
中に混入が危惧されるウイルスを不活化できるか
ら、血漿蛋白製剤の工業的製法として有益であ
る。 〔実施例〕 以下、本発明を実験例及び実施例により説明す
るが、本発明はこれらによつて何ら限定されるも
のではない。 実施例 １ 正常人血漿から、塩化バリウム吸着法とDEAE
−セフアデツクス カラムクロマトグラフイー法
〔バジヤ，エス．ピー．ら、ジヤーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Bajaj，S.P.，
et al.，J.Biol.Chem.）248，7729（1973）〕により
プロトロンビンを精製し、このプロトロンビンに
人胎盤より調整したトロンボプラスチン、人血漿
及び塩化カルシウム液を加え、トロンビン変換し
て、粗製トロンビン（１mg蛋白当たりのトロンビ
ン活性10単位）を得た。この粗製トロンビンを
SP−セフアデツクス カラムクロマトグラフイ
ー法〔ランドブラツド，アール．エル．，バイオ
ケミストリー（Lundblad，R.L.，
Biochemistry），10，2501（1971）により精製し、
この精製トロンビンを濃縮後、7.5％Ｄ−マンニ
トールを含む100ｍＭクエン酸緩衝液（PH7.0）に
対し透析し、トロンビン溶液（3500単位／ml、１
mg蛋白当たりのトロンビン活性500単位）を調整
した。このトロンビン溶液を除菌濾過した後、15
ml容バイアル瓶に２mlずつ小分け分注し、凍結乾
燥を行つた。凍結乾燥後のトロンビン活性は
6800u／Ｖ、含湿度は0.07％であつた。この凍結
乾燥されたトロンビン製剤を60℃で72時間加熱処
理し、加熱処理前のトロンビン製剤と比較しなが
ら、溶解性、トロンビン活性、セルロースアセテ
ート膜電気泳動、ゲル濾過の項目につき試験した
結果、加熱処理後でも著明な変化はみられず、本
加熱条件下ではトロンビン製剤は安定であること
がわかつた。 実験例 １ 実施例１に準じて調製した精製トロンビン（１
mg蛋白当たりのトロンビン活性550単位）より、
濃縮、透析、凍結乾燥の操作によつて第１表記載
の安定化剤量を含むトロンビン製剤（トロンビン
活性6000単位／瓶）を調製した。そのトロンビン
製剤を60℃で72時間加熱処理した後、トロンビン
活性について試験した。その結果を第１表に示
す。 この結果、安定化剤の使用により、無添加の場
合に比べて安定性が極めて改善されることが判つ
た。
【表】
実験例 ２
実施例１で調製したトロンビン溶液（除菌濾過
ずみ）にリン酸緩衝食塩液（PH7.1）のウイルス
懸濁液を加え、均一に混和した後、ガラス瓶中に
て小分け、分注し、凍結乾燥を行つた。凍結乾燥
終了後、窒素ガスにて平圧に戻して密栓し、60℃
の温浴中に浸漬、加熱した。尚、瓶内の温度が60
℃に達するまで10〜15分要するので、実際は30分
間それぞれ加熱時間を延長して行つた。 各ウイルスの感染性はプラーク（plaque）法
にて測定した。 結果は第２表に示す通りである。
ずみ）にリン酸緩衝食塩液（PH7.1）のウイルス
懸濁液を加え、均一に混和した後、ガラス瓶中に
て小分け、分注し、凍結乾燥を行つた。凍結乾燥
終了後、窒素ガスにて平圧に戻して密栓し、60℃
の温浴中に浸漬、加熱した。尚、瓶内の温度が60
℃に達するまで10〜15分要するので、実際は30分
間それぞれ加熱時間を延長して行つた。 各ウイルスの感染性はプラーク（plaque）法
にて測定した。 結果は第２表に示す通りである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ウイルスの夾雑危惧される人トロンビン製剤
を実質的に乾燥状態にて、中性アミノ酸、単糖類
および二糖類から選ばれる少なくとも一種の安定
化剤の存在下にウイルスが不活化されるまで加熱
することを特徴とする人トロンビン製剤の加熱処
理方法。 ２ 含湿度３％以下の条件下で加熱することを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 安定化剤としてクエン酸ナトリウムを併用す
る条件下で加熱することを特徴とする特許請求の
範囲第１項または第２項記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60222453A JPS6281327A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
| KR1019860008265A KR950010321B1 (ko) | 1985-10-04 | 1986-10-02 | 인간 트롬빈 제제의 가열처리방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60222453A JPS6281327A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6281327A JPS6281327A (ja) | 1987-04-14 |
| JPH0376292B2 true JPH0376292B2 (ja) | 1991-12-05 |
Family
ID=16782647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60222453A Granted JPS6281327A (ja) | 1985-10-04 | 1985-10-04 | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6281327A (ja) |
| KR (1) | KR950010321B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0225927B1 (en) * | 1985-06-07 | 1991-10-02 | Somar Corporation | Method and device for boring films for film pasting apparatuses |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6281327A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-04-14 | Green Cross Corp:The | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
| IL86417A (en) * | 1987-05-22 | 1992-09-06 | Armour Pharma | Process for the inactivation of pathogens in biological or pharmaceutical material by mixing with aqueous solution containing a sugar(alcohol)and neutral salts as stabilizers |
| JPS6440433A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Green Cross Corp | Aqueous liquid composition of thrombin |
| JP2847160B2 (ja) * | 1987-11-04 | 1999-01-13 | 吉富製薬株式会社 | トロンビン含有医薬組成物 |
| JP2715104B2 (ja) * | 1988-08-18 | 1998-02-18 | 株式会社ミドリ十字 | トロンビン乾燥製剤 |
| GB0207092D0 (en) * | 2002-03-26 | 2002-05-08 | Sod Conseils Rech Applic | Stable pharmaceutical composition containing factor VIII |
| DK1954308T3 (da) * | 2005-09-16 | 2011-10-24 | Merial Ltd | Stabiliseringsmidler til frysetørrede vacciner |
| JP4914115B2 (ja) * | 2006-05-12 | 2012-04-11 | 積水化学工業株式会社 | 血液検査用容器 |
| SG190136A1 (en) | 2010-11-05 | 2013-07-31 | Baxter Int | A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity |
| CN105879038B (zh) * | 2016-05-27 | 2020-03-27 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种制备人凝血酶原复合物的干热处理稳定剂及其用途 |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| JPS6089428A (ja) * | 1983-10-19 | 1985-05-20 | Green Cross Corp:The | 血漿蛋白の加熱処理方法 |
| JPS6122022A (ja) * | 1983-12-28 | 1986-01-30 | Green Cross Corp:The | 血漿蛋白の加熱処理方法 |
| JPS6281327A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-04-14 | Green Cross Corp:The | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
-
1985
- 1985-10-04 JP JP60222453A patent/JPS6281327A/ja active Granted
-
1986
- 1986-10-02 KR KR1019860008265A patent/KR950010321B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6089428A (ja) * | 1983-10-19 | 1985-05-20 | Green Cross Corp:The | 血漿蛋白の加熱処理方法 |
| JPS6122022A (ja) * | 1983-12-28 | 1986-01-30 | Green Cross Corp:The | 血漿蛋白の加熱処理方法 |
| JPS6281327A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-04-14 | Green Cross Corp:The | 人トロンビン製剤の加熱処理方法 |
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|---|---|---|---|---|
| EP0225927B1 (en) * | 1985-06-07 | 1991-10-02 | Somar Corporation | Method and device for boring films for film pasting apparatuses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR950010321B1 (ko) | 1995-09-14 |
| JPS6281327A (ja) | 1987-04-14 |
| KR870003790A (ko) | 1987-05-04 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |