JPS62209099A - 殺菌された抗プラスミン溶液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液、組織または細胞培養物からのα２−抗プ
ラスミンの単離法およびこのものの低温殺菌された生成
物の製法に関する。かかる製剤は治療目的に使用されう
る。

α２−抗プラスミンは以下抗プラスミンと表示する。

抗プラスミンは繊維素溶解系の阻害剤であって特にプラ
スミン阻害剤として作用する。このものは分子量約６５
０００ダルトンを有する糖蛋白質でありそして約７０■
／ｌの濃度で血液中に含有される。その性質ゆえに先天
性ならびに後天性疾病状態特に過繊維素溶解の治療にと
って強力で重要な治療剤となっている。血漿中の濃度が
低いことおよび分子の性質ゆえに今まで工業的に大規模
に単離できなかった。

しかしながら血漿からのこの阻害剤の単離法はすでに記
載されている（　「Ｂｉｏｏｈｅｍ、　、Ｔ、Ｊ　１５
９（１９７６）５４３〜５５３、「Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｏｈｅｍ、　Ｊ７Ｂ（１９７７）１９〜２６、「：
ｒ、　Ｂ、　Ｃ，Ｊ　２５１　　、ｊ≦１９（１９７６
）５９５６〜５９６５参照）。これらの方法はコンカナ
バリンＡ−セファロース（５ｅｐｈ＆ｒｏｓｅ■）また
はゲルヂ過の使用のような工業的に大規模に用いること
のできない工程を必要とする。

体液、組織または細胞培養物からの蛋白質を治療上使用
することはウィルス疾患感染の危険を伴なっている。血
漿蛋白質を６０℃で１０時間加熱処理することはウィル
ス不活化に適当であることが判明している。かかる不活
化はその蛋白質が安定であるかまたは安定化されつる場
合にのみ実行可能である。しかし蛋白質そして特に酵素
阻害剤は熱に不安定でありうることが知られている。

それゆえ本発明の目的は場合により低温殺菌された抗プ
ラスミン濃縮物を工業的に大規模に製造する方法を開発
することであった。

驚くべきことに、知られた精製工程を修正して透析工程
で沈澱させることにより夾雑した蛋白質を除去しそして
安定剤を添加して加熱処理することにより実質的に抗プ
ラスミンの活性損失を伴うことなくこの目的が達成され
うろことが見出された。

本発明は抗プラスミン溶液の精製法および場合により単
離および場合により低温殺菌する方法に関する。

精製するにはイオン強度の低い水溶液で透析しそして生
成した沈降物を除去する。

ＰＨ６〜９好ましくは６，５〜８．５、および導電率５
またはそれ以下好ましくは１〜２ｍＳｉ（２０℃）を有
する低濃度塩溶液を用い、透析された溶液において対応
する導電率に達するまで透析を行うことが好ましい。

沈澱した不純物は濾過または遠心分離により除去されう
る。

この透析により、労力がかかりそして収量損失があるゆ
えに不都合なことが判っていた他のいくつかの精製法の
みを用いた場合に得られうるような純度が改良される。

透析された溶液から抗プラスミンは中性塩、例えば０．
１〜０．７７に９／ｌ好ましくは０．１８〜０．５６Ｊ
ａｉ／ｌの硫酸アンモニウムを用いて沈澱されうる。

しかしまた透析された溶液はアニオン交換体と接触させ
そして抗プラスミンを段階的グラジェント溶離により随
伴蛋白質から分離しそして単離することもできる。

この目的には、抗プラスミン溶液をアニオン交換体、例
えばＤＫＡトセファデックス（８ｅｐｈａａｅｘ”）と
！で触させ、抗プラスミンを負荷されたアニオン交換性
を例えば０．０２モル／ｌの燐酸塩および０．０５モル
／ＬのＮａＣ４を含有しそしてｐＨ６〜９好ましくは６
〜８を有する緩衝液で洗いそして抗プラスミンを例えば
０．０２モル／Ｌの燐酸塩および０．１〜１モル／ｌの
ＮａＣｔ好ましくは０．２〜１モル／ｌのＮａＣｔを含
有するＰＨ６〜９の緩衝液を用いて溶離することかでき
る。

特に純粋な抗プラスミンを単離するにはプラスミノゲン
に結合するというその知られた性質を利用できる。この
目的には、プラスミノゲン含量が低くあるべき抗プラス
ミン含有溶液、好ましくはプラスミノゲン含量の低い血
漿を固相に結合したプラスミノゲンと接触させ、抗プラ
スミンを負荷された固相を洗い、抗プラスミンを溶離し
そして場合により抗プラスミンを中性塩を用いて溶液か
ら沈澱させることができる。

この後者措社は前記した透析の前または後に行われつる
。

抗プラスミンを含有する溶液例えば血漿または血漿フラ
クションから存在するプラスミノゲンの６０〜８０％を
除去するには、プラスミノゲンをリジン樹脂例えばりジ
ン−セファロースに吸着させることができる。次に抗プ
ラスミンを含有する溶液を担体に結合したプラスミノゲ
ン好ましくはプラスミノゲンーセファロースと４°Ｃ〜
３０℃で１０分〜２４時間接触させ、負荷された親和物
質を緩衝液例えばｐｇ　６〜９の０．０５モル／ｌ燐酸
塩溶液で洗浄することにより不純物を除去し、抗プラス
ミンを緩衝液、例えばｐＨ６〜９好ましくは７〜８およ
び導電率２０〜６０ｍＳｉ（２０℃）を有するＮａＣ２
含有燐酸塩緩衝液を用いて溶離することかできる。

本発明はさらに、抗プラスミン溶液をｐＨ６〜９５好ま
しくは７〜８．５に調整し、そして単糖類または三糖類
、糖アルコールまたは有機ジカルボン酸またはトリカル
ボン酸、および場合によりアミノ酸の存在下に少くとも
１時間好ましくは８〜２０時間４０〜９０℃好ましくは
５０〜７０℃に加熱することからなる抗プラスミン溶液
中におけるウィルス不活化法にも関する。

０．５〜２ｋｇ／ｌのスクロースまたは０．５〜２ｋｇ
／ｌのソルビトールまたは０．１〜４モル／ｌのクエン
酸カリウムおよび０．２〜１．５に９／ｌのスクロース
、および場合により水溶性アミノ酸好ましくは１〜１１
４り／ｌのグリシンを加えそして６０°Ｃに１０時間加
熱するのが好ましい。前記した添加剤の混合物も使用さ
れつる。

精製しそして場合により低温殺菌した抗プラスミン溶液
は次に場合により濃縮し、滅菌しそして凍結乾燥するこ
とができる。凍結乾燥に先立ち安定剤例えばグリシン、
アルブミン、糖またはゼラチンを添加することができる
。

ここに記載した方法により製造された生成物は従来法に
より製造された生成物より収モが２〜５倍高い。さらに
、かかる生成物は非常に安定でありそして高い活性を有
する。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例　１ コーン（Ｃｏｈｎ　）フラクションＩ上澄み１１０ｔを
透析物の導電体が０．５　ｍｓｉ　（２０℃）に達する
まで４°Ｃで１５時間水で透析した。生成した沈澱を遠
心分離により除去した。

この透析により比活性が３倍となりそして双環損失は２
％であった。

実施例　２ コーンフラクションエ上澄み液１０Ａにリジン−セファ
ロース（スウェーデン、Ｐｈａｒｍａｏｉａ社製）１に
９を加えそして室温で８０分間攪拌した。このプラスミ
ノゲン含量の低い上澄み液にプラスミノゲンーセファロ
ース０．４に９を加えそして４℃で２時間攪拌した。次
にこの親和物質をｐＨ７の０．０５モル／ｌ燐酸塩で洗
いそして０．０５モル／ｌの燐酸塩および０．５モル／
ｌのＮａＣＡを含有するｐＨ７の溶液を用いて抗プラス
ミンを溶離した。溶出物に０．５に９／ｌの硫酸アンモ
ニウムを加えそして生成した沈澱をｐＨ７を有するα０
５モル／ｌの燐酸塩中にとりそしてｌ１ＩＨ７の０，０
２モル／ｌの燐酸塩および０．０５モル／ｌのＮａＣＬ
を含有する溶液を用い４℃で１５時間透析した。この溶
液に０．０３５に９のＤＫＡＩＣ−セファデックスｔ−
混合した。アニオン交換体を分離し、０．０２モル／Ｌ
の燐酸塩および０．０５モル／ｌのＮａＣ２を含有する
ｐＨ７の溶液で洗いそして抗プラスミンを０．０２モル
／ｌの燐酸塩および０．２モル／ｌのＮａｃＬｔ’含有
するｐＨ７の緩衝液を用いて溶離した。

溶出液を濃縮し、滅菌ヂ過しそして凍結乾燥した。

実施例　６ 実施例１または２により得られた燐酸塩緩衝された（０
．０２モル／ｌ）抗プラスミン溶液に１　ｋｇ／ｌのス
クロースおよび３７９／ｌのグリシンを加え、ｐＨ８に
調整しそして６０℃に１０時間加熱した。

当初活性の８３％が残存していた。

実施例　４ 抗プラスミン溶液を０．０２モル／ｌの燐酸塩および０
．１５モル／ｌのＮａＣ２を用いｐＨ７，５に調整し、
０．５モル／ｌのグリシンおよび１．５に９＃のスクロ
ースを加え、そしてこの混合物を６０℃に１０時間加熱
した。加熱後も当初の活性が残存していた。スクロース
の代りに同じ濃度のソルビトールを用いるかまたはグリ
シンおよび１．５に９／ｌのスクロースの代りに４モル
／ｌのクエン酸カリウムおよび０．５に９／ｌのスクロ
ースを使用した場合にも、同様に活性が残存していた。

実施例　５ 緩衝された抗プラスミン溶液に１　ｋｇ／ｌのスクロー
スおよび５７９／Ｌのグリシンを加えそしてＰＨ６，５
，７，７，５，８，８，５，９または９５に調整しそし
て６０℃に１０時間加熱した。

加熱後に下記の結果が見出された。

加熱前活性＝　　　　　１００　％ 加熱後の活性：ｐＨ６，５４６，８％ ｐＨ７，０５１，１％ １１Ｈ７，５７１，１％ ｐＨ８，０８３，３％ ｐＨ８，５６３，８，、％ ｐＨ９，０５６，４％ ｐＨ９，５５６，９％ 実施例　６ Ｃ２−抗プラスミン溶液を０．０２モル／ｌの燐酸塩お
よび０．１５モル／ｌのＮａＣ６を含有する緩衝液を用
いてｐＨ７，５に調整し、０．５モル／ｌのグリシン、
種々の量のスクロース、ソルビトールまたはクエン酸カ
リウムを加えそしてこの混合物を６０℃で１０時間加熱
した。

下記の結果が得られた。

添　　加　　剤 ０．１　９７−スクロース ０．２５ｇ／ｌｄ　　　１ ０．５　９１ｍ１　　　＃ ０．７５り／ｒｙｔ　　　ｚ １０９７ｒｄ１ １．５　　り／−〃 ０．１　　ｇ／−ソルビトール ０．２５９１ｍ１　　　　＃ ０．５　　り／−〃 ０．７５９／ｒｒｔｌ　　　　’ １．０　　ｇ／ｄ＃ １．５　７１ｙｔ　　　　＃ ０．１　ｍａｔ／ｌクエン酸カリウム＋１１０、５　ｍ
ｏｌ／ｌ　　　　　　　　　　　１１１　　ｍｏｌ／Ｌ
　　　　　　　　　　　　１’２　　ｍｏｌ／Ｌ　　　
　ｇ　　　　　　Ｑ、５゜３　　ｍｏｔ／ｌ　　　　　
　　　　　Ｏ，５４ｍｏｌ／ｌ　　　　　　　　　　　
Ｏ，５加熱後の活性％ （加熱前＝１００％） ０％ ０％ ０％ ３５％ ６６％ １００％ ０％ ０％ ２０％ ４５％ ６０％ １００％ ｌＩＰ／−スクロース　　　３０％ 呼／ｒｎｔ　　７３３％ ッ／ｍ／＃３４％ ツ／ｒｎｔｌ　　　　　　　５０％ ｒＱ／ｍｔ　　ｌ　　　　　　　８２％Ｗ／ｄ＃１００
％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗プラスミン溶液をイオン強度の低い水溶液で透析
   し、生成した沈降物を除去し、そして場合により上澄み
   液をさらに精製しそして場合により低温殺菌しそして場
   合により乾燥させることからなる抗プラスミンの精製お
   よび場合により単離および場合により低温殺菌する方法
   。 ２）ｐＨ６〜９好ましくは６．５〜８．５、および導電
   率５またはそれ以下好ましくは１〜２ｍＳｉ（２０℃）
   を有する低濃度塩溶液を用い、透析された溶液において
   対応する導電率に達するまで透析を行うことからなる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）プラスミノゲン含量の低い抗プラスミン溶液を使用
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）抗プラスミンの溶液をアニオン交換体と接触させそ
   して抗プラスミンを段階的グラジエント溶離により随伴
   蛋白質から分離しそして単離することからなる抗プラス
   ミン溶液の精製法。 ５）抗プラスミン溶液をアニオン交換体と接触させ、抗
   プラスミンが負荷されたアニオン交換体をｐＨ６〜９を
   有する緩衝液で洗いそして抗プラスミンを０．１〜１モ
   ル／ｌ好ましくは０．２〜１モル／ｌの中性塩を含有す
   るｐＨ６〜９の緩衝液を用いて溶離することからなる特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）抗プラスミンを含有しプラスミノゲン含量の低い溶
   液を固相に結合されたプラスミノゲンと接触させ、抗プ
   ラスミンを負荷された固相を洗い、抗プラスミンを溶離
   し、場合により抗プラスミンを中性塩を用いて溶液から
   沈澱させ、低濃度塩溶液で透析しそして沈降物を除去す
   ることからなる抗プラスミン溶液の精製法。 ７）抗プラスミンを含有しプラスミノゲン含量の低い溶
   液を固相に結合したプラスミノゲンと接触させ、負荷さ
   れた親和物質をｐＨ６〜９の緩衝液で洗浄することによ
   り不純物を除去しそして抗プラスミンをｐＨ６〜９好ま
   しくは７〜８および導電率２０〜６０ｍＳｉ（２０℃）
   を有する緩衝液を用いて溶離することからなる特許請求
   の範囲第６項記載の方法。 ８）抗プラスミン溶液をｐＨ６〜９．５好ましくは７〜
   ８．５に調整しそして単糖類または二糖類、糖アルコー
   ルまたは有機ジカルボン酸またはトリカルボン酸、およ
   び場合によりアミノ酸の存在下に少くとも１時間好まし
   くは８〜２０時間４０〜９０℃好ましくは５０〜７０℃
   に加熱することからなる抗プラスミン溶液の低温殺菌法
   。 ９）抗プラスミン溶液を低温殺菌するのに０．５〜２ｋ
   ｇ／ｌのスクロースまたは０．５〜２ｋｇ／ｌのソルビ
   トールまたは０．１〜４モル／ｌのクエン酸カリウムお
   よび０．２〜１．５ｋｇ／ｌのスクロース、および場合
   により水溶性アミノ酸好ましくは１〜１１４ｇ／ｌのグ
   リシンを加えそして８〜２０時間４０〜９０℃に加熱す
   ることからなる特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０）精製し場合により低温殺菌した抗プラスミン溶液
   を場合により安定剤例えばグリシン、アルブミン、糖ま
   たはゼラチンを添加して乾燥、好ましくは凍結乾燥する
   ことからなる特許請求の範囲１項記載の方法。 １１）特許請求の範囲第１項記載の方法により得られた
   α＿２−抗プラスミンの治療目的への使用。