JPS63215700A - 低分子量蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １東：の、ｌ旦厨 本発明は、抗腫瘍活性を有する新規な蛋白質に関する。

正−米一五一旦一■ カースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　）らは、バチルスカ
ルメツティ　グエリン（３ａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｎｍｅ
ｔｔｅＱｕｅｒｉｎ　、　ＢＣＧ＞で感作したマウスに
、１４日目にエンドトキシンを投与すると、２時間後に
その血清中に、Ｌ−細胞に対して細胞毒性を有する因子
が産生されることを見い出し、これを腫瘍壊死因子（ｌ
ｕｍｏｒ　　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　　ｆａｃｔｏｒ、　Ｔ
ＮＦ）と名付けた（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、、ＵＳＡ。

７２、　ｐ３６６６．１９７５年〕。グリーン（（３ｒ
ｅｅｎ）らは、上記物質を硫酸アンモニウムによる分画
沈澱、ゲル濾過等により部分精製し、上記下ＮＦの分子
量が約１５００００であると報告した（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　　７３゜ｐ３８
１．１９７６年〕。その後マティウス（Ｍ　ａｔｈｅｖ
ｓ）らは、ウサギにＢＣＧを投与し、２週間後にエンド
トキシンを投与して、ＴＮＦを産生じ、精製して、ゲル
濾過法による分子量が３９０００で、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ−ａｍｉｄｅ　
ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ。

ＰＡＧＥ）によれば６７０００であると報告した（３ｒ
、Ｊｏ、Ｑａｎｃｅｒ　、　　４２．　　Ｄ４１６．　
１９８０年〕。更に原生らは、プロピオンバクテリウム
アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃ
ｎｅｓ）とエンドトキシンを用いて、マウス及びウサギ
でＴＮＦを産生じ、その分子量はゲル濾過法及びポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により３９０
００であると報告した（日本臨床、４０１．１８７２頁
、１９８２年〕。

一方、ヒト培養株化細胞から、同様の生理活性物質を製
造する試みとして、例えばアミノ（Ａｍｉｎｏ）らは、
ヒト培養株化リンパ系細胞Ｍ−７００２又はＢ−７００
１に、アカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）を作用させ
ることにより、マウスＬ−細胞に対して細胞毒性作用を
有する可溶性因子（ＨＬＴ−ＬＣＬ）の誘導産生を報告
した（Ｊ、ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１３．１３３４〜１３
４５（１９７４＞）。

該報告によれば、上記可溶性因子の分子量はゲル濾過法
で６８０００〜１５００００の範囲とされた。

また最近、アガーウェル（Ａｇｇａｒｗａｌ　）らは、
リンパ系細胞ＲＰＭＩ−１７８８に４β−ホルボール−
１２β−ミリステート−１３α−アセテートを用いて、
上記し一細胞に対して細胞毒性を有するリンホトキシン
を誘導産生させて、これを精製した結果、その分子量は
通常のゲル濾過法では６００００で、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）によれば２００００であり、等電点はｐＨ５
，８でおると報告した（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、ｃｈｅｍ、
、　２５９゜６８６〜６９１．１９８４年〕。更に、ア
ガーウェルらは、リンホトキシン及びＴＮＦの遺伝子を
釣り上げて、之等のアミノ酸組成を求めた結果、リンホ
トキシンは１７１個のアミノ酸よりなり、ＴＮＦは１５
７個のアミノ酸よりなることを明らかにした（Ｎａｔｕ
ｒｅ　、　３１２．７２１〜７２４゜７２４〜７２９．
１９８５年〕。

及皿万邂１巳、に５ｋＶケ肌■尤 本発明者らも上記り一細胞に対して細胞毒性を有する物
質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねてきた。その結果
、ヒト由来の培養株化リンパ系細胞から、上記生理活性
を有し、しかも報告された各種可溶性因子とは相違する
別個の蛋白質を単離精製することに成功し、これが制癌
作用を有し、ヒトの治療上安全性の高いことを見出し、
ここに本発明に到達した。

問題点を解決するための手又 本発明の新規な蛋白質は、以下の理化学的性質及び構造
的特徴を有することにより特徴付けられる。

（１）　分子量 ａ、　　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲｎｔｔｒ
過法による分子量（その測定法の詳細は、後記実施例に
説明する）は、１９０００±２０００である ｂ、　　ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分子量（その測定法の
詳細は、後記実施例に説明する）は、１６０００±２０
００である。

（２）　等電点 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ＞ポリアクリルアミドプ
レート（ｐＨ３，５〜９．５＞（ＬＫＢ社製、アメリカ
）を使用し、標準等電点測定マーカーキット（ファルマ
シア社製、スエーデン）を使用し、本発明物質の等電点
を測定した。即ち、濾紙片に本発明物質試料的５μｑ（
蛋白量）を吸収させ、ゲル上にのせ、８Ｗ定電力にて、
約１時間泳動させ、電流が一定となった時点で泳動を終
了した。

ゲルは５ｍｍ間隔で切り取り、緩衝液にて溶出し、し−
細胞に対する活性の測定に供した。等電点は等電点マー
カーを基準に算出した。

その結果、本発明物質の等電点は、ｐＨ４，９±０．３
と算出された。

（３）紫外部吸収の測定 ダブルビーム分光光度計ＵＶ−３００（島津製作所製）
を使用し、０．１Ｍ　　ＮａＣＱ加０．０２Ｍトワスー
塩酸緩衝液（１）Ｈ７，８＞に溶解させた本発明物質試
料の紫外部吸収を測定した結果は、第５図に示す通りで
ある。

該図より、紫外部吸収極大値は２７７ｎｍであり、極小
値は２５０ｎｍであることが判る。

（４）溶解性、色及び性状 本発明物質試料を３１１１Ｃ１蛋白量／ｍＱ濃度となる
ように０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に
溶解した溶液は、無色透明である 該溶液にアセトン又はエタノールを７Ｑｖ／ｖ％以上加
えると沈澱を生じる。

また、本発明物質の３ｍｏ蛋白滑／ｍＱ＊溶液は、弱酸
性を示す。

（５）呈色反応 ビュウレット反応、フォーリンローリ−反応法並びに塩
酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド結合
及びアミノ酸の呈色反応はいずれも陽性である。

（６）　アミノ酸配列 本発明物質のアミノ酸配列を、プロティンシークエンサ
ー（アプライドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　
１３ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）社製、モデル４７０Ａ；各
アミノ酸は逆相高速液体クロマトグラフィーにより同定
した）を用いて分析した。その結果、アミノ末端側より
１〜２４個のアミノ酸は、以下の配列でおることが確か
められた。

Ｈ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
　−Ａｓｎ−ＡＳり−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−ｖａｌ−Ａ
　Ｉａ−Ｓｅｒ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ−Ａ　１ａ−Ａｓ
ｎ　−Ｈ１ｓ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ　−ＧＩｕ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｎ−１ｅｕ　−尚、上記及び以下の本明
細書におけるアミノ酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより採択
されているアミノ酸命名法における略号乃至当該分野で
慣用されている略号によるアミノ酸残基の表示法に従う
ものとする。

また、本発明の蛋白質は、以下の生理活性を有する点に
おいて特徴付けられる。

（ａ）し−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　）らの方法及び
クロスターガード（Ｋ　ｌｏｓｔｅｒｇａａｒｄ）の方
法（Ｍｏ＋。

■ｍｍｕｎｏ１．．１７．　ｐ６１３．１９８０年〕に
準じて、本発明物質のし一細胞殺細胞効果を評価した。

即ち、Ｌ−細胞を２５０単位／ｍｌのペニシリンと１２
５μＣｌ／ｌ１１ｆ２のストレプトマイシンとを含むイ
ーグル　ミニマル　エッセンシャルメデイウム（Ｅａａ
ｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ＞培地に２Ｘ１０”’細胞／ｍＱと
なる濃度で懸濁させ、このＬ−細胞懸濁液各０．１１Ｔ
Ｉ１２及び適当濃度に希釈した本発明物質試料名０．１
１１１Ｑを、９６穴マイクロプレート（コースタ−社製
、アメリカ）の各ウェルに入れ、これを炭酸ガス培養器
内で、３７°Ｃで４８時間培養する。

培養細胞をニュートラル　レッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒ
ｅｄ　）で染色し、生細胞数をタイターチックマルチス
キャン（フローラボラトリーズ社製、アメリカ）により
比色定理する。活性はＬ−細胞を５０％殺す力を１単位
とし、これに試料の希釈倍数を乗する。

その結果、本発明物質のし一細胞に対する細胞毒性は、
約１．９５Ｘ１０８単位／ｍｃ＋蛋白質以上でおった。

（ｂ）メスＡ−ザルー１−マ（Ｍｅｔｈ　Ａ−ｓａｒｃ
ｏｍａ　）担ガンマウスによる抗腫瘍作用 ２Ｘ１０５個メスＡ−ザルコーマ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス腹部皮内に移植し、７日後腫瘍の大きざが直径７
〜６ｍｍとなったマウスの尾静脈より、上記り一細胞に
対する細胞毒性作用測定法（ａ）で１×１０４〜１×１
０５単位／戒ニ希釈した本発明物質試料の０．２ｍｌを
注射し、４８時間後、前記カースウェルらの方法に準じ
て、以下の判定基準により抗腫瘍作用を判定した。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （什）：中程度の出血性壊死（移植層表面の真ん中から
５０％以上にわたって壊死） （Ｕ＋）：顕著な出血性壊死（移植層の中央部が重度に
壊死し、周囲の癌組織かわずか に残った状態） 得られた結果を第１表に示す。

第　　１　　表 投与量　　　評　価 （ｒ＋ｃ＋蛋白量／マウス）　　　−−）−−Ｈ−）１
＋−（生理食塩水＞　　　　６０００ ５．０　　　　　　３　　３　　０　　０１０、Ｃ）　
　　　　　　２　　３　　１　　０２０．０　　　　　
　１　　１　　４　　０４０、Ｏ○　　１　２　３ 次に本発明の新規蛋白質を得る方法について記述する。

本発明物質は、基本的には公知の方法に従い、ヒト由来
の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍物質誘導剤を作用さ
せることによって誘導される。ここで培養株化リンパ系
細胞としては、特に限定がなく、既に確立されている公
知の各種リンパ系細胞株、或いは正常のリンパ系細胞を
各種のウィルス、薬剤、放射線等で処理し培養株化した
細胞株等を使用できる。その具体例としては、例えばｎ
ｍｍｕｎｏ１．　Ｃｏｍｍｕｎ、、　９　（８）　、Ｉ
）７３１〜７３４（１９８０）、「蛋白質・核酸・酵素
」、２３＠、６号、２９１〜３０５頁、及び生化学デー
ターブック■、ｐ８２９〜９０５、株式会社東京化学同
人、１９８０年６月２３日発行に記載のＴ−Ｈｌａ系、
Ｂ−細胞系、ミニロイド細胞系、ｎｏｎ　−Ｔ細胞系及
びｎｏｎ　−Ｂ細胞系等の各細胞株を例示することがで
きる。

また上記培養株化リンパ系細胞に作用させる抗腫瘍物質
誘導剤としては、公知の各種ウィルス、ダラム陰性菌由
来のエンドトキシン、植物由来のレクチン、免疫賦活作
用を有する物質等を使用することができる。その代表例
としては、例えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌等に由来す
るりポボリサツカライド（ＬＰＳ）等のダラム陰性菌由
来のエンドトキシン；タチナタマメレクチン（コンカナ
バリンＡ、Ｃ０ｎＡ）　、ダイズマメレクチン（ＳＢＡ
）、アカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）等の植物由来
のレクチン；センダイウィルス（ＨＶＪ）等のウィルス
及びバチルス　カルメツティ　グエリン（ＢＣＧ）　、
コリネバクテリウムパルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｐａｒｖｕｍ）　、プロピオニバクテリウ
ム　アクネス （ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｃｎｅｓ
　＞　、ミコバクテリウム　ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、コリネバク
テリウム　グラニュロサム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）　、ストレプトコッ
力スピロジネス（３ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙ
ｒｏｇｅｎｅｓ　）　、プラスモディウム（ｐ　ｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ　＞　、ザイモザン（Ｚ　ｙｍＯ３ａｎ）
　、ノカルディア　アストロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ
　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）　、リステリア　七ノサイト
ジエネス（Ｌ　ｙｓｔｅｒｉａ　　ｍｏｎｏｃｙｔｏｑ
ｅｎｅｓ　）、グルカン（（ｌＩｕｃａｎ）　、細胞膜
骨格（ｃｅｌｌ　　ｖａｌｌｓｋｅｌｔｏｎ　）　、デ
キストランＩａ酸（ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ　）
　、ムラミルジペプタイド（ｍｕｒａｍｙｌｄｉｌ）ｅ
ｐｔｉｄｅ　）　、クレスチン（県別工業社製）等の免
疫賦活作用を有する物質及び１２−Ｏ−テトラデカノイ
ルホルボール− （ＴＰＡ＞等の発癌プロモーター等を例示することがで
き、之等は組合せて用いることもできる。

上記培養株化リンパ系細胞は、抗腫瘍物質誘導剤の処理
に先立ち、必要に応じて適宜培養、増殖させることがで
きる。該培養条件としては、特に制限はなく常法に従う
ことができる。例えばＲＰＭＩ−１’６４０培地、ＭＥ
Ｍ培地等の通常の栄養培地を牛胎児血清（ＦＣＳ）等の
血清補液で改質した培地中、インビトロで増殖させる方
法、又はヒト以外の哺乳動物に上記細胞を移植し、その
体内で増殖させる方法等を適宜採用できる。後者の方法
では、移植する動物は、ヒト細胞に対し免疫反応を起こ
す場合があり、好ましくは幼弱期の動物、２００〜６０
０レム程度の放射線処理、抗血清処理、免疫抑制剤処理
等により免疫を抑制した動物、ヌードマウス等を使用す
るのがよい。

上記の如くして増殖されたヒト由来の培養株化細胞は、
これを前記栄養培地（通常ｐＨ６．５〜８、０）にて、
細胞濃度が１Ｘ１０’〜１Ｘ１０７個／ｍ１２程度に浮
遊させ、これに前記抗腫瘍物質誘導剤を作用させること
により、所望の本発明物質を誘導産生させることができ
る。抗腫瘍物質誘導剤による処理は、例えばエンドトキ
シン及び免疫賦活作用を有する物質の場合は、１〜１０
０μｏ／ｍｆ２程度の濃度で、レクチンの場合は、１０
〜５００ＩｉＱ／鵬程度の濃度で、ウィルスの場合は、
５０　〜５０００ＨＡ／ｍ（２の程度の濃度で加え、通
常３７°Ｃ下、１〜６日間インキュベートすればよい。

かくして、その栄養培地中に本発明物質が産生きれる（
以下かくして得られる液を粗製溶液と言う）。

上記で得た粗製溶液からの本発明物質の採取及び分離精
製は、得られる粗製溶液中に含有される当該物質の性質
を利用した物理化学的又は生化学的手段に従い実施され
る。例えば塩析、クロマトグラフィー、電気泳動法、抽
出法、遠心分離法、透析法等を適宜組合せることにより
行なわれる。

より好ましくは、上記粗製溶液を次の工程に付すことに
より実施される。

（１）　限外濾過濃縮及び熱処理 （２）　　ＤＥＡＥ−セファセル （３）　ウルトロゲルＡＣＡ４４ゲルン濾過クロマトグ
ラフィー （４）　　ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（・５）
　ブチル・トヨパール （６）　　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷゲルン濾過クロマ
トグラフィー （７）　　Ｃ４逆相クロマトグラフィー以下に、これら
工程の詳細を説明する。

精製工程１ 粗製溶液をペリコンカセット（ミリボア社製。

アメリカ）を用いて５〜１０倍に濃縮した後、６０’Ｃ
で３０分間程度の熱処理に付す。これを低温室（−２５
℃程度）に放置し、溶解後、遠心分離（３０００ｒｐｍ
Ｘ２０分程度）を行なう。

得られた上滑液を、１Ｍ酢酸溶液を用いてｐＨ５、０〜
５．５に調整し、加熱処理により除去できなかった不純
蛋白を等電点沈澱により除く。

１）Ｈ調整後、低温室（４°Ｃ程度）で放置し、冷却遠
心分離（７０００ｒｐｍｘ２０分程度）を行ない、上清
を２Ｍトリス塩酸緩衝液でｐＨ８，０程度に調整する。

この操作による活性回収率（前記Ｌ−細胞に対する細胞
毒性活性測定法による、以下同じ。）は約６０〜９０％
であり、精製度は約２〜８倍である。

精製工程２ 精製工程１で得られた生理活性画分の濃縮液を透析用チ
ューブ（牛丼化学薬品社製）を用い、５０〜１００倍量
の０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８＞に対して
４°Ｃで、数回外液を交換しながら透析する。透析液に
つき冷却遠心分離（４°Ｃ程度、７０００ｒｐｍ　ｘ２
０〜３０分程度）を行ない、清澄な上清を得る。次いで
この上清液をＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシア社製
）に吸着させ、０．０２Ｍトリス塩＠緩衝液（ｐｌ−１
７，８）でＮ　ａＣＱ　１度をＯ−０，３Ｍまで連続的
濃度勾配法に従い、もしくは段階的に濃度を上昇させて
、生理活性区分を溶離させる。得られた生理活性区分を
限外濾過濃縮又は硫安塩析により濃縮する。この方法に
よる生理活性区分の回収率は、約５０〜９０％であり、
精製度は約４〜１０倍で必る。

精製工程３ 精製工程２で得られた生理活性区分の１農縮液を、バイ
オゲルＡ１．５ｍ（バイオ・ラド社製、アメリカ）おる
いはウルシトロゲルＡｃＡ３４．４４又は５４（いずれ
もＬＫＢ社製、アメリカ）を充填したカラム（カラムサ
イズ５０ｘ１００ｍｍ＞を用いて、０．５Ｍ　　ＮａＣ
９を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液系でゲル済過を行
なう。この工程における活性回収率は約７０〜９０％で
あり、精製度は約４〜１０倍である 精製工程４ 精製工程３で得られた生理活性画分を、濃縮し、透析用
チューブに入れ、５０〜１００倍量の０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液に対して、４°Ｃ程度で数回外液を交換しな
がら透析する。透析後、予め同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０（、ファルマシア社製、
スエーデン）に付して吸着させ、食塩濃度を連続的に増
加させて、生理活性画分を溶離させる。この方法による
活性回収率は約３０〜７０％であり、精製度は約４〜１
０倍である 精製工程５ 精製工程４で得られた生理活性画分を濃縮し、透析用チ
ューブに入れ、５０〜１００倍量の３０％飽和Ｅｌアン
モニウムを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液に対して、
４℃程度で＠回外液を交換しながら透析する。透析液を
ブチル・トヨパール（東洋曹達社製）に付して吸着させ
、ｔＩｔｒ１ｉアンモニウム濃度を連続的に減少させて
、生理活性画分を溶離させる。この方法による活性回収
率は約３０〜７０％であり、精製度は約１０〜１００倍
である 精製工程６ 精製工程５で得られた生理活性区分を濃縮し、透析用チ
ューブに入れ、５０〜１００倍量の０．２Ｍ　　Ｎａｃ
Ｑを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液に対して４°Ｃ程度で
数回外液を交換しながら透析する。透析後、予め同緩衝
液で平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（東洋曹達
社製）に付し、高速液体クロマトグラフィーを行なう。

この工程における活性回収率は、約７０〜９０％であり
、精製度は約２〜８倍である。

精製工程７ 精製工程６で得られた生理活性画分を集め、減圧′ａ縮
装置マイクロプロティコン（ボクスイブラウン社製、ア
メリカ）で少量に濃縮する。濃縮液をＣ４−逆相カラム
（１−１ｉ　−Ｐｏｒｅ　　Ｒｅｖｅｒｓｅｐｈａｓｅ
　　Ｃｏｌｕｍｎ　、　４．６Ｘ２５０ｍｍ、バイオ・
ラド社製）に付す。分画溶出はＡ液〔０，１％トリフル
オロ酢！　（ＴＦＡ＞　、和光紬薬社製〕及びＢ液（ア
セトニトリル（和光紬薬社製）：１％ＴＦＡ＝９　：　
１　）を用い、０〜５分はＡ液１００％を、５〜２０分
はＢ液Ｏ〜３０％を、２０〜８０分はＢ液３０〜６０％
を、８０〜８５分はＢ液６０〜１００％をそれぞれの濃
度勾配で溶離を行なう。流速はｎｍ１２／分とし、ｌ　
ｍＱづつ分取する。

上記精製工程１〜７を通しての活性回収率は、約２〜１
０％であり、精製度は約１．０Ｘ１０５〜１．０Ｘ１０
７倍である かくして得られた生理活性を有する本発明の蛋白質の特
性を測定した結果は、前記した通りであり、また１変記
実施例に詳述する通りである。

かくして、本発明の蛋白質が収得される。得られる本発
明物質は、前記した通り、Ｌ−細胞に対するインビトロ
での直接細胞毒作用及びインビボでの抗腫瘍作用を奏す
る特徴を有するに加え、以下の薬理試験例に示す通り、
ヒトガン細胞乃至メラノーマ細胞に対しても、細胞毒作
用乃至殺細胞作用を示し、しかも低毒性である特徴を有
している。尚、本発明の上記生理活性物質の有する生理
作用は、熱（６０’Ｃ１３０分間）に対して安定である 薬理試験例工　細胞毒乃至殺細胞作用 （ａ）　　ヒトガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキットリンパ腫由来株Ｒａｊｉ　　（Ｊ。

Ｎａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、３７巻、５
４７頁、１９６６年〕、ヒト胃癌（印環細胞癌）由来法
Ｋａｔｏ　−ｍ　（Ｊｏｎ、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅ
ｄ、、４８巻、６１頁、１９７８年）及びヒト鼻咽腔癌
由来株ＫＢ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　１８巻、１
０１７頁、１９５８年〕の各細胞に対する本発明物質の
殺細胞効果を以下の通り評価した。

即ち、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株及びヒト胃癌
由来細胞株を、２５０単位／ｍＱのペニシリン、１２５
μＣＪ／ｍｆ２のストレプトマイシン及び１０％非働化
牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で２Ｘ１０５細
胞／−に調整した。また、ヒト鼻咽腔病由来細胞株を、
２５０単位／ＩＩＩＱのペニシリン、１２５μＱ　／　
ｍＱのストレプトマイシン及び１０％非働化牛血清を含
むイーグル　ミニマルエッセンシャル　メディウム培地
を用いて２Ｘ１０”細胞／ｍｆ２に調整した。

上記各細胞調整液０．ｎｍｌと各種濃度に希釈した本発
明物質試料０．ｎｍ１２とを、９６穴マイクロプレート
の各ウェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３
７°Ｃで４８時間培養した。

培養４８時間後に細胞をトリパンブルーで染色し、顕微
鏡下でビルケルチュルク計算盤（エルマオプティ力ルワ
ークス社製、日本）を使用して生細胞数を算出した。こ
の結果、本発明物質の各種細胞の増殖を５０％抑制する
濃度は、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞に対しては約
１．Ｏｎｇｌ白量／　ｍＱ　、ヒト胃癌由来細胞に対し
ては約２．５１ｇ蛋白量／鵬、ヒト鼻咽腔病由来細胞に
対しては約２．０ｎｇ蛋白量／ｍｌであった。

（ｂ）　　メラノーマ細胞に対する。Ｆｌ胞毒性作用へ
ルソン（１−１ｅｌｓｏｎ　）らの方法（Ｎ　ａｔｕｒ
ｅ。

２５８巻、７３１頁、１９７５年〕に準じて、本発明物
質のメラノー？Ａ−３７５（Ｊ、　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、５１　Ｌ　１４１７頁
、１９７３年〕細胞に対する細胞毒性作用を評価した。

即ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、スト
レプトマイシン及び１０％非働化牛脂児血清を含むイー
グル培地を用いてメラノーマＡ−３７５細胞５Ｘ１０’
細胞／ｍＱの懸濁液を調整した。この細胞懸濁液各ｎｍ
１２及び本発明物質試料を適当に希釈調整した試料溶液
１　ｍＱを、３．５ｃｍ径のシャーレに入れ、炭酸ガス
培！！！器内で３７°Ｃで培養した。

培養３日目に上記（ａ）と同様にして細胞をトリパンブ
ルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチュルク計算盤を使
用して生細胞数を算出した。

この結果、本発明物質のメツラーマＡ−３７５細胞の増
殖を５０％抑制するのに必要な量は約２．８ｎｇ蛋白量
／ｍＱでめった。

薬理試験例■　急性毒性 ８週令のｄｄＹ系雌雄マウスを各々１０匹用い、本発明
物質を５００μｇ蛋白量／ｋｇの割合で静脈内投与し、
急性毒性を調べた。

その結果死亡例は認められず、ＬＤ５ｏは５００μＣＩ
／ＩＵＩ以上でおることが確認された。また、観察期間
中、本発明物質に起因すると考えられる明らかな中毒症
状は認められなかった。

以上の通り、本発明物質は各種細胞に対し細胞毒作用乃
至殺細胞作用を秦し、また低毒性であるところからヒト
及び他の動物の抗腫瘍剤として有用である 本発明物質はこれを抗腫瘍剤として利用するに当っては
、その有効量を、慣用される薬理的に許容される無毒性
製剤担体と共に含有する各種形態に調整され、該形態に
応じた各種投与経路により投与される。その製剤形態と
しては通常液状溶液、懸濁液、乳濁液等を例示でき、こ
れらは一般に単独で又はリンゲル液、ブドウ糖液等の補
液と併用して静脈内、皮下、皮肉、腹腔内又は筋肉内に
投与される。これらはまた使用前に適当な担体の添加に
よって液状になし得る乾燥品として提供することもでき
る。該抗腫瘍剤中に配合される有効成分としての本発明
物質の配合量及び該製剤の投与量は、製剤の投与経路、
投与形態、疾患の程度、患者の年齢、性別等により適宜
選択され、一定ではないが、通常、有効成分約１〜８０
重量％（蛋白量として）を含む製剤形態に調整して、こ
の製剤をこれに含有される有効成分蛋白量が約１．０〜
１０μＣｌ／ｋＭ日となる範囲で１〜数回に分けて投与
するのが好ましい。

丈−一厘一一別 以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ 各側においては、以下の細胞及び抗腫瘍物質誘導剤を各
々使用した。

（１）抗腫瘍物質誘導剤 センダイウィルス（ＨＶＪ　：　５ｅｎｄａｉ　ｖｉｒ
ｕｓ　。

Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ
　　Ｊａｐａｎ＞は、カンチル（Ｋ、　Ｃａｎｔｅｌｌ
）より供与されたもので、１０〜１２日目の受精鶏卵に
接種し、３日後に漿尿液を採取した。漿尿液を連続超遠
心 （３５０００ｐｐｍ　）ＬｒＨＶＪを精製し、その沈渣
をＰＢＳ　（−）で浮遊させた。精￥ＡＨＶＪは、使用
時まで適当に分注し、−８０’Ｃにて凍結保存した。

他に、抗腫瘍物質誘導剤としてＰＨＡ　（ディフコ社、
アメリカ）、Ｃ０ｎＡ（和光純薬社）、ＬＰＳ　（大腸
菌０５５：Ｂ５、ディフコ社）、コリネバクテリウム・
バルバム（ウェルカム社、イギリス）及びＴＰＡを使用
した。

（２）細胞 本発明物質の産生に利用した細胞は、ヒト由来の培養株
化リンパ系細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＤＮＤ−４１、Ｔ
ＡＬＬ−１、ＲＰＭＩ−８４０２、ＣＣＲＦ−Ｈ８Ｂ−
２細胞、いずれもＩｍｍｕｎｏｌ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、
　９　（８）　、ｐ７３１〜７３４（１９８０）記載の
ものでおる）を、１０％ＦＣ３加ＲＰＭＩ−１６４０培
地を用いて、３７℃にて５％炭酸ガスインキュベーター
内で静置培養して調整した。

また上記各ヒトリンパ系細胞の各々１Ｘ１０７個を、自
家繁殖させた生後２４時間以内の新生ハムスター（ゴー
ルデン・ハムスター）に皮下移植し、週に２回の割で家
兎抗ハムスター胸腺リンパ球血清（ＡＬＳ＞を０．ｎｍ
Ｑ投与して、４〜５週間後に生着腫瘍塊をり］出し、こ
れをイーグルＭＥＭ培地で洗浄後、細断器で細断し、細
胞濾過器を通して調製したものも使用した。

実施例１ 上記参考例１−（２）で調製した各ヒト由来培養株化リ
ンパ系細胞を、イーグルＭＥＭ培地にて遠心洗浄後、１
０％ＦＣ３７１０ＲＰＭＩ−１６４０培地で２．５×１
０６個／ｍＱに調製した。

上記細胞浮遊液に、前記参考例１−（１）に示した抗腫
瘍物質誘導剤のいずれか１種の所定伍（ＰＨＡは５ＣＩ
Ｃ１／ｒｌｔＱ、ＣＯｎ△は１０μｇ／ｍＱ、ＨＶＪは
５００ＨＡ／ｍ１２．ＬＰＳは１０μＣＪ／ｍＱ、ＴＰ
Ａは１０ｎＭｍＱ）を添加し、３７℃で１〜６日間撹拌
培養し、ｊｑられる培養上清を遠心分離（１００００ｒ
ｐｍ　＞により採取し、−２０’Ｃにて凍結保存した（
粗製溶液〉。

かくして得られた粗製溶液のし一細胞に対する細胞毒性
作用（力価、単位／　ｍＱ　＞を、下記第２表に示す。

尚、上記力価の測定は、培養上清を無菌濾過後に行なっ
た。またＨＶＪを含む培養上清は、ＨＶＪを不活性化す
るためにＵＶ！２！！理（１５ＷＵＶランプ、２０Ｃｍ
下、３０分処理）後、力価測定を行なった。

第　　２　　表 ＤＮＤ−４１２４１５９０２０− ＴＡＬＬ−１６０１５６３１５− ＰＭＩ− ＣＣＲＦ− ＨＢＳ−２６０１０６０２０− （２）　上記（１）と同様にして、５×１０６個／戒Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地単独、のＣＣＲＦ−ＣＥＭに１０
０〜４０００　ＨＡ／ｍＱのＨＶＪを添加し、２４時間
培養して、同様に粗製溶液を得た。

その力価（単位／ｍｌ）を下記第３表に示す。

第３表 粗製溶液　ＨＶＪ添加量　　粗製溶液力価Ｎｏ、　　　
（ＨＡ／ｍＱ）　　　　　（単位／ｍＱ＞２　　　　　
２５］　　　　　１００ （３＞　　１０％ＦＣ３加ＲＰＭＩ−１６４０培地を用
いて５×１０６個／ｍ１２に調製したＣＣＲＦ−ＯＥＭ
に５０〜２００μｇ／ｍＱのＰＨＡを添加し、７２時間
培養し、前記（１）と同様に粗製溶液（Ｎｏ、７〜９）
を得た。

また、上記においてＰＨＡ５０μΩ／ｍｉ２の添加４８
時間培養後、更にＰＨＡの５０μＱ／ｍ１２（粗製溶液
Ｎｏ、　１０　＞　、Ｃ，ｐａｒＶｕｍの５ＣＩＱ／ｍ
Ｑ（粗製溶液Ｎｏ、１１　＞　、又はＨＶＪ（７）５０
０ＨＡ／ｍ１１２（粗製溶液ＮＯ，’＋２＞を添加して
更に４日間培養して粗製溶液を得た。それらの力価（単
位／ｍ１２）を下記第４表に示す。

第４表 粗製溶　　　抗腫瘍物質誘導剤　　　　力　両液Ｎｏ、
　　　（μＯ又はＨＡ　／　ｍＱ　）　　　（単位７／
回）７　　　ＰＩ−（Ａ　　　（５０）　　　　　　６
９８　　　ＰＨＡ　　（１００）　　　　　　６５９　
　　ＰＨＡ　　（２００＞　　　　　　８０１０　　　
ＰＨＡ　　＋ＰＨＡ １１　　　ＰＨＡ　　＋Ｃ，ｐａｒｖｕｍ１２　　　Ｐ
ＨＡ　　＋ＨＶＪ （４）　本発明物質の単離 上記（２）において、ＣＣＲＦ−ＣＥＭにＨＶＪ　（５
００ＨＡ／ｍＱ＞を作用させて得た粗製溶液（７０単位
／−）をペリコンカセット（ミリボア社製、アメリカ）
で１０倍に濃縮する。これに６０°Ｃ１３０分間の熱処
理を行なってウィルスを失活させた。上記熱処理後、粗
精製濃縮液を一夜、−２５°Ｃで放置し、翌日溶解後、
発生した不溶物を３００Ｏｒｐｍ　、２０分間遠心分離
を行なって除去した。

次いで該溶液に１Ｎ酢酸を加え、ｐＨ５，５に調整した
。これを７００　Ｏｒｐｍで２０分間冷却遠心分＠（４
°ｃ＞ｂ、不溶物を除去し、その上清を２Ｍトリス塩酸
緩衝液にて直ちにｐＨ８，０に調整した。

次いで、この溶液を０．０２Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，８
＞緩衝液に対して透析した。この透析活性区分を、予め
０．０２Ｍトリス塩ｔｔ　（ｐＨ７，８）緩衝液で平衡
化したＤＥＡＥ−セフ７セル（ファルマシア社製）に付
した。流速１２０ｍＱ／時間、５−／分画の条件下に同
緩衝液で充分に洗浄した後、０．０２Ｍトリス塩酸（ｐ
Ｈ７，８）１０００ｍｌｌｉ及び０．３Ｍ　　ＮａＣＱ
を含む０．０２Ｍ＋−リス塩酸（ｐＨ７，８＞を使用し
て、連続的に濃度勾配を上昇させて、吸着物質を溶離し
た。この方法では非吸着区分に活性は認められず、全て
の活性は吸着された。吸着した活性は、ＮａＣＱの０．
１６Ｍ〜０．２０Ｍの間に）８出された。活性区分を集
め、限外濾過濃縮装置丁ＣＦ−１０（アミコン社製、ア
メリカ）を用いて、４°Ｃで限外濾過濃縮した。

この方法による活性回収率は８０％であり、精製度は４
倍でめった。全工程を通じての活性回収率は６４％で、
精製度は８倍であった。

上記方法で得られた活性区分を０．５ＭＮａＣＱを含む
０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したウルトロゲル
ＡｃＡ４４　（カラムサイズ５　Ｑｘ　１０００ｍｍ＞
を用いて、ゲル濾過を行なった。活性区分は４００　ｍ
Ｑ〜５６０ｍ１２の間に溶出した。活性区分を集め、限
外濾過濃縮装置を用いて、４°Ｃで濃縮を行なった。

この方法による活性回収率は８２％であり、精製度は５
倍であった。全工程を通じての活性回収率は５２．５％
で、精製度は４０倍でおった。

活性画分を集め、限外濾過濃縮装置を用いて濃縮後１、
透析用チューブに入れ、外液を０．０５Ｍトリス塩酸（
ｐＨ７，８＞緩衝液に対して透析した。

活性透析液を０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８
＞で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０に吸
着させた。溶出はＮａＣＱによる直線濃度勾配法によっ
た。活性は食塩濃度０．２５〜０．３０Ｍの間に溶出さ
れた。

この方法による活性回収率は６０％であり、精製度は６
．７倍でめった。全工程を通じての活性回収率は３１．
５％で、精製度は２６８倍であった。

活性濃縮液を、透析用チューブに入れ、５０〜１００倍
量の３０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸（ｐＨ７，８＞緩衝液に対して、４°Ｃで数回外
液を交換しながら透析して、充分に平衡化させた。透析
液をブチルトヨパールカラム（１６Ｘ２００ｍｍ＞に付
し、５Ａ酸アンモニウムの飽和度３０％から５０％（０
，０２Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７，８＞までの濃度勾
配で溶出させた。流速１５ｍｆ２／時間で、該生理活性
は硫酸アンモニウム飽和度１６〜１８％の間に溶出され
てきた。

この方法による活性回収率は６０％であり、精製度は１
００倍であった。全工程を通じての活性回収率は１８．
９％で、精製度は２．６８Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記活性区分をマイクロプロティコンを用いて
濃縮し、予め０．２Ｍ　　ＮａＣＱを含む０．０５Ｍホ
ウ酸緩衝液で平衡化したＴＳＫゲル３０００ＳＷに付し
、高速液体クロマトグラフィーによるゲル濾過を行なっ
た。

この方法による活性回収率は４５％であり、精製度は４
倍でめった。全工程を通じての活性回収率は８．５％で
、精製度は１．０２Ｘ１０５倍であった。

上記生理活性画分を集め、マイクロプロティコンを用い
て濃縮し、Ｃ４−逆相カラム（４，６Ｘ２５０ｍｍ＞に
付加した。分画溶出は、Ａ液（０，１％ＴＦＡ＞及びＢ
液（アセトニトリル：１％ＴＦＡ＝９　：　１の混液）
を用い、０〜５分はＡ液１００％で、５〜２０分はＢ液
Ｏ〜３０％で、２０〜８０分はＢ液３０〜６０％で、８
０〜８５分はＢ液６０〜１００％で、各々の濃度勾配に
よる溶出を行なった。流速ｎｍＱ／チューブ／分で溶出
を行なって、試験管番＠５５〜５８番目（フラクション
Ｎ０．５５〜５８）に目的とする生理活性画分を溶出さ
せた。かくして、本発明の蛋白質を得た。

この工程での活性回収率は２０％であり、精製度は２倍
でめった。全工程を通じての活性回収率は１．７％で、
精製度は２．１４Ｘ１０”でめった。

得られた本発明物質は、前記したく及び以下に詳述する
）生理活性及び物理的性状を示した。またその比活性は
５．０Ｘ１０８単位／ｍｑ蛋白質でおった。

（５）　前記（１）において、ＤＮＤ−４１にＰＨＡを
作用させて得た粗製溶液（２４単位／ｌＴ１２）を用い
て、上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を得た。全
工程を通じての活性回収率は１．７％であり、精製度は
２．１４Ｘ１０５倍であり、比活性は５．０ＯＸＩＯ８
単位／ｍｃ＋蛋白質であった。

（６〉　前記（１）において、ＴＡＬＬ−１にＨＶＪを
作用させて得た粗製溶液（６３単位／ｍｆ２＞を用いて
、上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を得た。全工
程を通じての活性回収率は５．１１％であり、精製度は
８．１４Ｘ１０５倍であり、比活性は３．２０Ｘ１０８
単位／ｍｃｉ蛋白質でめった。

（７）　前記（１）において、ＲＰＭＩ−８４０２にＣ
０ｎＡを作用させて得た粗製溶液（１２単位／　ｍＱ　
＞を用いて、上記（４）と同様にして、本発明蛋白質を
得た。全工程を通じての活性回収率は３．５５％であり
、精製度は１．２３Ｘ１０６倍であり、比活性は７．４
０Ｘ１０Ｂ単位／ｍｃ＋蛋白質であった。

（８）　前記（３）において、ＣＣＲＦ−ＯＥＭに２０
０ｍＭｍ２のＰＨＡを作用させて得た粗製溶液（８０単
位／ｍＱ＞を用いて、上記（４）と同様にして、本発明
蛋白質を得た。全工程を通じての活性回収率は３．２％
であり、精製度は２．４３Ｘ１０６倍であり、比活性は
７．９４Ｘ１０８単位／ｍｇ蛋白質でめった。

（９）上記（４）〜（８）で得られた本発明蛋白質試料
の分子量、等電点、アミノ酸組成、アミノ酸配列を以下
のごとくして測定した。

ａ＞　　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたグル濾過法
による分子量測定 ファルマシアＦＰＬＣシステムに、ＴＳＫゲルＧ３００
０ＳＷカラム（カラムサイズ５．０×６００ｍｍ＞を接
続し、０．１％ＳＤＳ及び０．２Ｍ　　ＮａＣＱを含む
５０ｍＭホウ酸／ホウ砂（ｐＨ７，８＞の緩衝液を用い
て、本発明物質試料５０μｇ（蛋白量として）をゲル濾
過に付して、標準分子量キット（ファルマシア社製）か
ら求めた標準曲線を用いて該試料の分子量を算出した。

上記（４）で得た本発明物質試料について得られた結果
を第１図に示す。図において、横軸はリテンションタイ
ム（分）を、縦軸は分子量をそれぞれ示し、図中（１）
〜（３）は標準分子量キットの結果であり、（１）は生
血清アルブミン（ＢＳＡ、分子量６７０００）を、（２
）は卵白７）Ｉ、ｔ７ミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、分子
量４３０００）を、（３）はチトクロームＣ（Ｃｙｔｏ
Ｃｈｒｏｍｅ　Ｃ１分子量１４４００）をそれぞれ示し
、（４）は本発明物質試料の結果である 第１図より、本発明物質は卵白アルブミン（２）とチト
クロームＣ（３）との間に溶出し、その分子量は約１９
０００±２０００でおると算出された。

ｂ）　　ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動法による分子量の測
定 レメリー（Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉ　）らの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ　。

２２７、ｐ６８０，１９７０年〕に従い、トリス塩酸／
ＳＤＳ　（ｐＨ７，２＞で、５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルに、本発明物質試料５μｇ（蛋白量として）を付
与し、４０ｍＡで７時間電気泳動を行ない、標準分子量
キットを用いて分子量曲線を作成し、該曲線より、本発
明物質の分子量を算出した。

上記（４）で得られた本発明物質試料についての上記電
気泳動のパターンを第２図（横軸は電気泳動の距＠（Ｃ
ｍ）を、縦軸はｌｏｇで表示された分子量を示す）に、
また分子量曲線を第３図に各々示す。標準分子量キット
における標準物質は、各図においてそれぞれ次の記号に
より表示する。

（１）・・・ホスホリラーゼｂ（分子針９４０００）（
２〉・・・生血清アルブミン（分子１６７０００）（３
）・・・卵白アルブミン（分子ｆｆ１４３０００）（４
）・・・炭酸脱水素酵素（分子量３００００）（５）・
・・トリプシンインヒビター （分子量２０１００＞ （６）・・・α−ラクトアルブミン （分子針１４４００） また本発明物質試料は（７）として示す。

第３図より、本発明物質試料の分子量は、約１６０００
±２０００と算出される。

Ｃ〉　等電点測定 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａ　ｍｐｈｏｌ　１ｎｅ）ポリアクリルアミ
ドゲルプレート（ｐＨ３，５〜９．５＞（ＬＫＢ社製、
アメリカ）を使用し、標準等電点測定マーカーキット（
ファルマシア社製、スウェーデン）を使用し、本発明物
質の等電点を前述した方法に従って測定した。

前記（４）で得られた本発明物質試料についての結果を
第４図に示す。図において横軸はフラクションＮｏ、を
、縦軸はＬ−細胞に対する細胞毒性活性（×１０５単位
／ｍｌ、曲線（１）で示す）及びｐＨ（曲線（２）で示
す）を示す。

第４図より、本発明物質の等電点は１１４．９±０．３
と算出された。

ｄ）　アミノ酸配列の決定 本発明物質試料のアミノ酸配列を、プロティンシークエ
ンサー（アプライドバイオシステムス社製、モデル４７
０Ａ＞を用いて分析した。但し各アミノ酸は逆相高速液
体クロマトグラフィーにより同定した。

尚、本発明物質試料としては、前記（４）の逆相高速液
体クロマトグラフィーにて、リテンションタイム５６分
に溶出したフラクションの８００μＱを用いた。

上記方法に従い求めたアミノ酸配列の分析の結果、該試
料のアミノ末端側部分２４個のアミノ酸配列は次の通り
であることが確認された。

Ｈ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−５ｅｒ
−Ａｓｎ−Ａｓｔ）−ＬｙＳ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ
　１ａ−Ｓｅｒ　−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−■ａｌ−ＧＩＵ−（３ｌｕ　−Ｑ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−ｅ）　アミノ酸組成比の決定 本発明物質試料（前記ｄ項で用いた試料）について、そ
の２００ｔＩＱを４Ｎメタンスルホン酸で１１０’Ｃ１
２４時間加水分解く減圧封管中）後、アミノ酸アナライ
ザー（８３５−５０型、日立高速アミノ酸分析計、日立
製作断裂）によりアミノ酸組成比を分析した。

その結果は、ｐｈｅを基準（４，００）として、下記第
５表の通りであることが確認された。

第５表 ア　　ミ　　ノ　　酸　　　　　組　　成　　比ｐｈｅ
　　　　　４ ＡＳｐ又はＡｓｎ　　　　　１３±２ 丁ｈｒ　　　　　　　　　　４±２ Ｓｅｒ　　　　　１３±１ Ｑｌｕ又はＱｌｎ　　　　　２０±１ ｐｒｏ　　　　　１０±１ Ａ１８　　　　１２±１ ＣＶＳ　　　　　　　　　　　　　２±１ｖａｌ　　　
　　　　　　　　　１２±１Ｑｌｕ　　　　　　　　　
　　１０±１■１０　　　　　　　　　　６±２ １ｅａ　　　　　　　　　　　　１９±１丁Ｖｒ　　　
　　　　　　　　７±１ ）−１ｉｓ　　　　　　　　　　　　Ｊ±１Ｌｙｓ　　
　　　　　　　　　　　７±１Ｔｒｐ　　　　　　　　
　　　　ａ±１Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　４±１
以下、本発明物質を用いた製剤例を挙げる。

製剤例１ 本発明物質ＩＸ”１０８単位を、ヒト血清アルブミンを
含む生理食塩水１００１１１２に溶解して溶液を調整し
、これを無菌濾過後、その２鵬ずつを容器に分注し、凍
結乾燥して、注射用抗腫瘍剤を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ゲル濾過法による本発明物質の分子量測定結
果を示すグラフ、第２図及び第３図は、ゲル電気泳動法
による同物質の分子量測定結果を示すグラフ、第４図は
等電点電気泳動法による同物質の溶出挙動を示すグラフ
及び第５図は本発明物質の紫外部吸収曲線を示すグラフ
である。 （以　上） 第５図 ３皮長（ｎｍ） 第１図 リテンションタイム　（分） 第２図 −−〜１ １　　　　０〜２ ＃ＩＩｈ　　　　　Φ〜３ −　　　　　　　　　　　　・−−４ −・〜５ 第３図 耽凱汰す距離（ｃｍ） 第４図 フラクション　Ｎ０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］下記の理化学的性質及び構造的特徴を有する低分
   子量蛋白質。 ａ）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲルろ過法によ
   る分子量：１９０００±２０００ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
   による分子量測定による分子量：１６０００±２０００ ｃ）等電点：ｐＨ４．９±０．３ ｄ）０．１Ｍ　ＮａＣｌ加０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
   液（ｐＨ７．８）中での紫外部吸収極大値は２７７ｎｍ
   であり、極小値は２５０ｎｍである。 ｅ）３ｍｇ蛋白量／ｍｌの０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
   液（ｐＨ７．８）溶液において、無色透明であり、アセ
   トン又はエタノールを該溶液に７０ｖ／ｖ％以上加える
   と沈澱を生じる。 ｆ）水溶液は弱酸性を示す。 ｇ）ビュウレット反応、フォーリンローリー反応法並び
   に塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド
   結合及びアミノ酸の呈色反応を示す。 ｈ）プロティンシークエンサーによるアミノ末端側より
   １〜２４個のアミノ酸配列： Ｈ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ
   −Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
   Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇ
   ｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−