JPS62258324A - 制ガン作用を有する糖蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、制ガン作用を有する新規な糖蛋白質に関する
。

従　　来　　の　　技　　術 カースウェル（（：、　ａｒｓｗｅｌ　ｌ　）らは、バ
チルスカルメツティ Ｑｕ６ｒｉｎ　、　ＢＣＧ）で感作したマウスに、１４
日目にエンドトキシンを投与すると、２時間後にその血
清中に、し＝細胞に対して細胞毒性を有する因子が産生
されることを見い出し、これをツーモア　ネクロシス　
ファクター（　Ｔｕｍｏｒ　　ｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃ
ｔｏｒ，　Ｔ　Ｎ　Ｆ　＞と名付けた（　Ｐ　ｒＯｃ．
　　Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ．、ＵＳＡ．７２巻，３６６６頁。

１９７５年〕。グリーン（　Ｇ　ｒｅｅｎ）らは、上記
物質を硫酸アンモニウムによる分画沈澱、ゲル濾過など
により部分精製し、上記ＴＮＦの分子量が約１　５００
００であると報告した（　ｐ　ｒＯｃ．Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７３巻、３８１頁。

１９７６年〕。その後マテイウース（Ｍ　ａｔｔｈｅｗ
ｓ　）らは、ウサギにＢＣＧを投与し、２′ｉＭ間後に
エンドトキシンを投与して、ＴＮＦを産生じ、ｙｉ製し
て、ゲル濾過法による分子量が３９０００で、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ−ａｍ
ｉｄｅ　ｇｅｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　
Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　）によれば６７０００であると報告し
た（Ｂｒ、Ｊ　、　Ｃａｎｃｅｒ　。

４２巻、４１６頁、１９８０年）。更に原生らは、プロ
ピオンバクテリウム　アクネス（Ｐ　ｒｏｐｉｏｎｉ−
ｂａｃｔｅｒｒｕｍ　ａｃｎｅｓ　）とエンドトキシン
を用いて、マウス及びウサギでＴＮＦを産生じ、その分
子量はゲル濾過法及びＰＡＧＥにより３９０００である
と報告した〔日本臨床、４０巻、１８７２頁、１９８２
年〕。

一方、ヒト培養株化細胞から、同様の生理活性物質を製
造する試みとして、例えばアミノ（Ａｍｉｎｏ）らは、
ヒト培養株化リンパ系細胞Ｍ−７００２又はＢ−７００
１に、アカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）を作用させ
ることにより、マウスし一細胞に対して細胞毒性作用を
有する可溶性因子（ＨＬＴ−ＬＣ：Ｌ）の誘導産生を報
告した（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　Ｏｆ　　１１１
１１１１ｔｌｎＯＩＯ！ｌｌＹ、ＶＯＩ。

１１３　　、Ｎｏ、４．１３３４〜１３４５（１９７４
））。

該報告によれば、上記可溶性因子の分子ｍはゲル濾過法
で６８０００〜１５００００の範囲とされた。

また最近、アガーウェル（Ａ　ｇｇａｒｗａｌ　）らは
、リンパ系細胞ＲＰＭＩ−１７８８に４β−ホルボール
−１２β−ミリステート−１３α−アセテートを用いて
、上記し一細胞に対して細胞毒性を有するリンホトキシ
ンを誘導産生させて、これを精製した結果、その分子量
は通常のゲルー過法では６００００で、ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＯ８
−ＰＡＧＥ）によれば２００００であり、等電点はｐＨ
５，８であると報告した（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅ
ｍ、、　２５９巻、６８６〜６９１頁、１９８４年）。

更に、アガーウェルらは、リンホトキシンの遺伝子を釣
り上げて、このアミノ酸組成を求めた結果、上記物質が
１７１個のアミノ酸よりなることを明らかにした（Ｎａ
ｔｕｒｅ　、　３１２巻、７２１〜７２４頁。

７２４〜７２９頁、１９８５年〕。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らも上記し一細胞に対してＩＩｌ胞毒性を有す
る物質の本体を究めるべり１２意研究を重ねてきた。そ
の結果、ヒト由来の培養株化リンパ系細胞から、上記生
理活性を有し、しかも報告された各種可溶性因子とは相
違する別個の糖蛋白質を単離精製することに成功し、こ
れが制ガン作用を有し、ヒトの治療上安全性の高いこと
を見出し、ここに本発明に到達した。

同　点を解決す　ための手段 本発明の新規な糖蛋白質は、以下の理化学的性質及び構
造的特徴を有することにより特徴付けられる。

（１）　分子量 ａ、　　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲル濾過法
による分子量（その測定法の詳細は、後記実施例に説明
する）は、１２０００±２０００である。

ｂ、　　ＳＯ３／ＰＡＧＥによる分子量（その測定法の
詳細は、後記実施例に説明する）は、１９０００±３０
００である。

（２）　等電点 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａ　ｍｐｈｏｌｉｎｅ）ポリアクリルアミド
ブレート（ｐＨ３，５〜９．５）（ＬＫＢ社製、アメリ
カ）を使用し、標準等電点測定マーカーキット（ファル
マシア社製、スエーデン）を使用し、本発明物質の等電
点を測定した。すなわち、濾紙片に本発明物質試料的５
μｇ　（蛋白ｍ）を吸収させ、ゲル上にのせ、８Ｗ定電
力にて、約１時間泳動させ、電流が一定となった時点で
泳動を終了した。ゲルは５１間隔で切り取り、緩衝液に
て溶出し、Ｌ−細胞に対する活性の測定に供した。等電
点は等電点マーカーを基準に算出した。

その結果、本発明物質の等電点は、ｐ　Ｈ６，８±０．
５と算出された。

く３）　アミノ酸配列 本発明物質試料のアミノ酸配列を、プロテインシークエ
ンサー（アブライドバイオシステムス（ＡＩ）ｐｌｉｅ
ｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）社製、モデル４７０Ａ
；各アミノ酸は逆相高速液体クロマトグラフィーにより
同定した）を用いて分析した。その結果、アミノ末端側
より２１〜２３個のアミノ酸は、以下の配列であること
が確かめられた。

Ｒ−５ｅｒ−８ｅｒ　−Ｐｒｏ　−１ｅｕ　−Ｔｙｒ　
−Ｌｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ−Ｑ　ｌｕ　−Ｖａｔ
−ＧＩｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐｈｅ　−８ｅｒ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ
　−Ｈｉｓ−Ｍｏｌ 〔但しＲ−はＨ−又はＡｌａ−Ｔｈｒ−を示す。〕尚、
上記及び以下の本明１書におけるアミノ酸の表示は、Ｉ
ＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法における
略号乃至当該分野で慣用されている略号によるアミノ酸
残基の表示法に従うものとする。

また、本発明の糖蛋白質は、以下の生理活性を有する点
において特徴付けられる。

（ａ）Ｌ−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　）らの方法及び
クロスターガード（Ｋｌｏｓｔｅｒ　　ｇａａｒｄ　）
の方法（Ｍｏｌ、、　Ｉ　ｍｍ、、　１７巻、６１３頁
、１９８０年〕に準じて、本発明物質のし一細胞殺細胞
効果を評価した。即ち、Ｌ−細胞を２５０単位／ｍＱの
ペニシリンと１２５μｇ／−のストレプトマイシンとを
含むイーグルス　ミニマル　エツセンシャルメデイウム
（Ｅａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ）培地に２Ｘ１０５細胞／
ｍ１２となる濃度で懸濁させ、このし−細胞懸濁液各０
．１−及び適当濃度に希釈した本発明物質試料台０．１
−を、９６穴マイクロプレート（コースタ−社製、アメ
リカ）の各ウェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気
中、３７℃で４８時間培養する。、培養細胞をニュート
ラル　レッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　）　Ｔ：染色
し、生細胞数をタイターチックマルチスキャン〈フロー
ラボラトリーズ社製、アメリカ）により比色定量する。

活性はＬ−細胞を５０％殺す力を１単位とし、これに試
料の希釈倍数を乗する。

その結果、本発明物質のし一細胞に対する細胞毒性は、
約１．９５Ｘ１０８単位／ｍ（ｌ蛋白質以上であった。

（ｂ）メスＡ−ザルコーマ（Ｍｅｔｈ　Ａ−ｓａｒｃｏ
ｍａ　）担ガンマウスによる抗腫瘍作用 ２Ｘ１０５個メスＡ−ザルコーマ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス腹部皮内に移植し、７８後腫瘍の大きさが直径７
〜８ｍｍとなったマウスの尾静脈より、上記し一細胞に
対する細胞毒性作用測定法（ａ）で１×１ｏ１〜１×１
０５単位／噌に希釈した本発明物質試料の０．２１１１
１を注射し、４８時間後、前記カースウェルらの方法に
準じて、以下の判定基準により抗腫瘍作用を判定した。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （＋＋）　：中程度の出血性壊死（移植病表面の真ん中
から５０％以上にわたって壊死） （＋＋）：顕著な出血性壊死く移植病の中央部が重度に
壊死し、周囲の癌組織がわずか に残った状態） 得られた結果を第１表に示す。

第　　１　　表 投　　与　　量　　　　　　　　　　　　評　　　　　
価（ｎ（Ｉ蛋白ｍ／マ　ス）−十　　　＋　　奸）−（
生理食塩水）　　　　６０００ ５０．０　　１　３　２　０ １００．０　　０　３　２　１ ２５０．０　　０　１　４　１ ５００．０　　０　１　２　３ 次に本発明の新規蛋白質を得る方法について記述する。

本発明の物質は、基本的には公知の方法に従い、ヒト由
来の培養株化リンパ系細胞に、抗腫瘍物質誘導剤を作用
させることによってｍＷ４される。ここで培養株化リン
パ系細胞としては、特に限定がなく、既に確立されてい
る公知の各種リンパ系細胞株、或いは正常のリンパ系細
胞を各種のウィルス、薬剤、放射線等で処理し培養株化
した細胞株等を使用できる。その具体例としては、例え
ば１ｍｍｕｎｏ１．Ｃｏｍｍｕｎ、、　９　（８）　、
ｐ７３１〜７３４（１９８０）、蛋白質核ｍ酵素、２３
巻、６号、２９１〜３０５頁、及び生化学データーブッ
ク■、ｐ８２９〜９０５、株式会社東京化学同人、１９
８０年６月２３日発行に記載のＴ−細胞系、Ｂ−細胞系
、ミニロイド細胞系、ｎｏｎ　−Ｔ細胞系及びｎｏｎ　
−Ｂ細胞系等の各細胞株を例示することができる。

また上記培養株化リンパ系細胞に作用させる抗腫瘍物質
誘導剤としては、公知の各種ウィルス、ダラム陰性菌由
来のエンドトキシン、植物由来のレクチン、免疫賦活作
用を有する物質等を使用することができる。その代表例
としては、例えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌等に由来す
るりボボリサツカライド（ＬＰＳ）等のダラム陰性菌由
来のエンドトキシン；タチナタマメレクチン（コンカナ
バリンＡ、Ｃ０ｎＡ）、ダイズマメレクチン（ＳＢＡ）
、アカインゲンマメレクチン（ＰＨＡ）等の植物由来の
レクチン；センダイウィルス（ＨＶＪ）等のウィルス及
びバチルス　カルメツティ　グエリン（ＢＣＧ）　、コ
リネバクテリウムパルハム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｐａｒｖｕｍ）　、プロピオニバクテリウム
　アクネス （ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｃｎｅｓ
　）　、ミコバクテリウム　ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　）コリネバク
テリウム　グラニュロサム（Ｃｏｒｙｎｅ−ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ＯｒａｎｕｌＯｓｕｍ）、ストレブトコツ
力スビロジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙ
ｒｏｇｅｎｅｓ　）、プラスモデイウム（Ｐ　Ｉａｓｍ
ｏｄｉｕｍ　）　、ザイモザン（Ｚ　ｙｍｏｓａｎ）　
、ノカルディア　アストロイデス（Ｎ　ｏｃａｒｄｉａ
　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）　、リステリア　モノサイト
ジェネス（ｌ　ｙｓｔｅｒｉａ　　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ
ｅｎｅｓ　）、グルカン（ｇｌｕｃａｎ）　、細胞膜骨
格（ｃｅｌｌ　　ｗａｌｌＳｋｅｌｔＯｎ　）　、デキ
ストラン硫酸（ｄｅｘｔｒａｎｓｕｌｒａｔｅ　）　、
ムラミルジペブタイド（ｍｕ　ｒａｍｙ　＋　−ｄｉｐ
ｅｐｔｉｄｅ　）　、クレスチン（県別工業社製）等の
免疫賦活作用を有する物質及び１２−Ｏ−テトラデカノ
イルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）等の発癌
プロモーター等を例示することができ、之等は組合せて
用いることもできる。

上記培養株化リンパ系細胞は、抗腫瘍物質誘導剤の処理
に先立ら、必要に応じて適宜培養、増殖させることがで
きる。該培養条件としては、特に制限はなく常法に従う
ことができる。例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ
培地等の通常の栄養培地を牛胎児血清（Ｆｅ２）等の血
清補液で改質した培地中、インビトロで増殖させる方法
、又はヒト以外の哺乳動物に上記細胞を移植し、その体
内で増殖させる方法等を適宜採用できる。後者の方法で
は、移植する動物は、ヒト細胞に対し免疫反応を起こす
場合があり、好ましくは幼弱期の動物、２００〜６００
レム程度の放射線処理、抗血清処理、免疫抑制剤処理等
により免疫を抑制した動物、ヌードマウス等を使用する
のがよい。

上記の如くして増殖されたヒト由来の培養株化細胞は、
これを前記栄養培地（通常ｐＨ６，５〜８．０）にて、
細胞濃度がｌＸ１０４〜１×１０７個／諧程度に浮遊さ
せ、これに前記抗腫瘍物質誘導剤を作用させることによ
り、所望の本発明物質を誘導産生させることができる。

抗腫瘍物質誘導剤による処理は、例えばエンドトキシン
及び免疫賦活作用を有する物質の場合は、１〜１００μ
（１／ＩＴＩＱ程度の濃度で、レクチンの場合は、１０
〜５００μ（１／ｍＱ程度の濃度で、ウィルスの場合は
、５０〜５０００ＨＡ／−の程度の濃度で加え、通常３
７℃下、１〜６日間インキュベートすればよい。かくし
て、その栄養培地中に本発明物質が産生される（以下か
くして得られる液を粗製溶液と言う）。

上記で得た粗製溶液からの本発明物質の採取及び分離精
製は、得られる粗製溶液中に含有される当該物質の性質
を利用した物理化学的又は生化学的手段に従い実施され
る。例えば塩析、クロマトグラフィー、電気泳動法、抽
出法、遠心分離法、透析法等を適宜組合せることにより
行なわれる。

より好ましくは、上記粗製溶液を次の工程に付すことに
より実施される。

（１）　限外濾過濃縮及び熱処理 （２）　　ＤＥＡＥ−セファセル （３）　ウルトロゲルＡＣＡ４４ゲル？濾過クロマトグ
ラフィー （４）　ブチルトヨパールクロマトグラフィー（５）　
クロマトフオーカシングクロマトグラフィー （６）　レンチルレクチンセファロース４Ｂアフイニテ
イークロマトグラフイー （７）　　ＴＳＫゲノＬ、Ｇ３０００ＳＷゲ／ｌ／　ｉ
ｐ過クロマトグラフィー （８）　　Ｃｔ逆相クロマトグラフィー以下に、これら
工程の詳細を説明する。

精製工程１ 粗製溶液をベリコンカセット（ミリボア社製。

アメリカ）を用いて５〜１０倍に濃縮した後、６０℃で
３０分間程度の熱処理に付す。これを低温室（−２５℃
程度）に放置し、溶解後、遠心分離（３０００ｒｐｍｘ
２０分程度）を行なう。

得られた上清液を、１Ｍ酢酸溶液を用いてｐＨ５，０〜
５．５に調整し、加熱処理により除去できなかった不純
蛋白を等電点沈澱により除く。

ｐＨ調整後、低温空く４℃程度）で放置し、冷却遠心分
離（ア０００ｒｐｍ　Ｘ　２Ｑ分程度）を行ない、上清
を２Ｍトリス塩′Ｍ緩衝液でｐＨ８，０程度に調整する
。この操作による活性回収ｆＳ（前記り一細胞に対する
細胞毒性活性測定法による、以下同じ。）は約６０〜９
０％であり、精製度は約２〜８倍である。

精製工程２ 精製工程１で得られた生理活性画分の濃縮液を透析用チ
ューブ（牛丼化学薬品社製）を用い、５０〜１ｏＯ倍良
の０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，８＞に対し
て４℃で、数回外液を交換しながら透析する。透析液に
つき冷却遠心分離（４℃程度、７０００ｒｐｍ　ｘ２０
〜３０分程度）を行ない、清澄な上清を得る。次いでこ
の上清液をＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシア社製）
に吸着させ、０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（１）８７．
８）でＮａＣＱ溌度をＯ〜０．３Ｍまで連続的濃度勾配
法に従いもしくは段階的に濃度を上昇させて、生理活性
区分を溶離させる。得られた生理活性区分を限外濾過濃
縮又は硫安塩析により濃縮する。この方法による生理活
性区分の回収率は、約５０〜９０％であり、精製度は約
４〜１０倍である。

精製工程３ 精製工程２で得られた生理活性区分の濃縮液を、バイオ
ゲルＡ１．５ｍ　　（バイオ・ラド社製、アメリカ）あ
るいはウルトＯゲルＡｃＡ３４．４４又は５４（いずれ
もＬＫＢ社製、アメリカ）を充填したカラム（カラムサ
イズ５０Ｘ１００ｍｍ）を用いて、０．５Ｍ　　Ｎａ　
ＣＱを含む０．０２Ｍトリス塩Ｍ緩衝液系でゲル濾過を
行なう。この工程における活性回収率は約７０〜９０％
であり、精製度は約４〜１０倍である。

Ｍ製工程４ 精製工程３で得られた生理活性画分を、濃縮し、透析用
チューブに入れ、５０〜１００倍量の３０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液に対して
、４℃程度で数回外液を交換しながら透析する。透析液
をブチルトヨパール（東洋曹達社製）に付して吸着させ
、硫酸アンモニウム濃度を連続的に減少させて、生理活
性画分を溶離させる。この方法による活性回収率は約３
０〜７０％であり、ＭｗＪＪ度は約１０〜１００倍であ
る。

精製工程５ 精製工程４で得られた生理活性画分を濃縮し、透析用チ
ューブに入れ、５０〜１００倍量の５０〜１００倍伍の
０．０２５Ｍイミダゾール−塩酸緩衝液（１）８７．４
）に対して、４℃程度で数回外液を交換しながら透析す
る。透析液をクロマトフオーカシング用ゲル（ファルマ
シア社製、スウェーデン）に付して吸着させ、ｐＨ勾配
を作成させ、生理活性画分を溶離させる。この方法によ
る生理活性区分の回収率は約３０〜７０％であり、精製
度は約４〜１０倍である。

精製工程６ 精製工程５で得られた生理活性区分を０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に対して透析する。これをレ
ンチルレクチン−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製
、スウェーデン）のカラム（カラム容量５戒）に付し、
生理活性画分を吸着させ、充分ｍの０．０２Ｍトリス塩
酸ｍｍ液で洗浄した後、メチル−α−Ｄ−マンノピラノ
シド（生化学工業社製）０．５Ｍを含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸（ｐＨ７，８）緩衝液で生理活性画分を溶離させ
る。この方法による活性回収率は、約３０〜８０％であ
り、精製度は約２〜１０倍である。

精製工程７ 精製工程６で得られた活性画分を、限外濾過により濃縮
し、バイオ・ゲルＡ１．５ｍあるいはウルトＯゲルＡＣ
Ａ４４又は５４を充填したカラム（１６Ｘ１０００ｍｍ
）に付し、ゲル濾過を行なう。

あるいはトーヨーソーダ高速液体りロマト用カラムＧ２
０００ＳＷ又はＧ３０００ＳＷ（東洋曹達社製）を用い
てゲル濾過を行なう。この工程における活性回収率は、
約２５〜７５％であり、精製度は約３〜１０倍である。

精製工程８ 精製工程７で得られた活性区分を集め、減圧濃縮装置マ
イクロプロディコン（ボクスイブラウン社製、アメリカ
）で少量に濃縮する。濃縮液をＣ４−逆相カラム（Ｈｉ
　−ｐｏｒｅ　　ＲｅｖｅｒｓｅＰｈａｓｅ　　Ｃｏｌ
ｕｍｎ　、　４．６Ｘ２５０ｍｌＲ，バイオφラド社製
）に付す。分画溶出はＡ液〔０，１％トリフルオＯ酢酸
（ＴＦＡ）　、和光純薬社製〕及びＢ液〔アセトニトリ
ル（和光純薬社製）：１％ＴＦＡ＝９　：　１　）を用
い、０〜５分はＡ液１００％を、５〜２０分はＢ液０〜
３０％を、２０〜８０分はＢ液３０〜６０％を、８０〜
８５分はＢ液６０〜１００％をそれぞれの濃度勾配で溶
離を行なう。流速は１−７分とし、１−づつ分取する。

精製工程１〜８を通しての活性回収率は、約２〜１０％
であり、精製度は約１．０Ｘ１０’〜１．０Ｘ１０７倍
である。

かくして得られた生理活性を有する本発明の糖蛋白質の
特性を測定した結果は、前記した通りであり、また後記
実施例に詳述する通りである。

かくして本発明の糖蛋白質が収得される。得られる本発
明物質は、前記した通り、Ｌ−細胞に対するインごトロ
での直接細胞毒作用及びインビボでの抗ｍ瘍作用を奏す
る特徴を有するに加え、以下の薬理試験例に示す通り、
ヒトガン細胞乃至メラノーマ細胞に対しても、ｌ服毒作
用乃至殺細胞作用を示し、しかも低毒性である特徴を有
している。尚、本発明の上記生理活性物質の有する生理
作用は、熱（６０℃、３０分間）に対して安定である。

薬理試験例工　細胞毒乃至殺細胞作用 （ａ）　　ヒトガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキットリンパ腫由来株Ｒａｊｉ　　（Ｊ。

Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、３７巻、５４
７頁、１９６６年〕、ヒト胃癌（印環細胞癌）由来株Ｋ
ａｔｏ　−ｍ　（Ｊｏｎ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、
、４８巻、６１頁、１９７８年〕及びヒト鼻咽腔癌由来
株Ｋ　３　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、１８巻、１０１
７頁、１９５８年〕の各細胞に対する本発明物質の殺細
胞効果を以下の通り評価した。

即ち、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株及びヒト胃癌
由来細胞株を、２５０単位／鵬のペニシリン、１２５μ
（１／ｌｌ１ｆ２のストレプトマイシン及び１０％非働
化牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で２Ｘ１０５
細胞／−に調整した。また、ヒト轟咽腔癌由来細胞株を
、２５０単位／ｍＱのペニシリン、１２５μａ／ｍＱの
ストレプトマイシン及び１０％非働化牛血清を含むイー
グルス　ミニマル　エッセンシャル　メディウム培地を
用いて２×１０５細胞／鵬に調整した。

上記各細胞調整液０．１鵬と各種濃度に希釈した本発明
物質試料０．１鵬とを、９６穴マイクロプレートの各ウ
ェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で
４８時間培養した。

培養４８時間後に細胞をトリパンブルーで染色し、顕微
鏡下でごルケルチュルク計算盤（エルマオブテイ力ルワ
ークス社製、日本）を使用して生細胞数を算出した。こ
の結果、本発明物質の各種細胞の増殖を５０％抑制する
濃度は、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞に対しては約
１５ｎ（］蛋白母母御−ヒト胃癌由来細胞に対しては約
４０ｎｏ蛋白ｆｆｌ／ｍＱ、ヒト轟咽腔癌由来細胞に対
しては約３０ｎｇ蛋白量／−であった。

＜ｂ）　　メラノーマ細胞に対する細胞毒性作用へルソ
ン（１−１８１ｓＯｎ）らの方法（Ｎ　ａｔｕｒｅ。

２５８巻、７３１頁、１９７５年）に準じて、本発明物
質のメラノー？Ａ−３７５（Ｊ、　Ｎａｔｌ。

（：ａｎｃｅｒ　ｌ　ｎｓｔ　、、５１巻、１４１７頁
、１９７３゛年〕細胞に対する細胞毒性作用を評価した
。

即ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、スト
レプトマイシン及び１０％非働化牛脂児血清を含むイー
グルス培地を用いてメラノーマＡ−３７５細胞５Ｘ１０
’細胞／ｍ！Ｑの懸濁液を調整した。この細胞懸濁液台
１−及び本発明物質試料を適当に希釈調整した試料溶液
１戒を、３．５ｃｍ径のシャーレに入れ、５％炭酸ガス
含有空気中下３７℃で培養した。

培養３日目に上記（ａ）と同様にして細１抱をトリパン
ブルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチュルク計算盤を
使用して生ａｒｍ数を算出した。この結果、本発明物質
のメツラーマＡ−３７５細胞の増殖を５０％抑制するの
に必要な量は約４５ｎｏ蛋白量／ｍ１ｌｌであった。

薬理試験例■　急性毒性 ８週令のｄｄＹ系雌雄マウスを各々１０匹用い、本発明
物質を５００μｇ蛋白ｍ、Ｚｋｇの割合で静脈内投与し
、急性毒性を調べた。

その結果死亡例は認められず、ＬＤｓｏは５００μ（１
／ｋｏ以上であることが確認された。また、観察期間中
、本発明物質に起因すると考えられる明らかな中毒症状
は認められなかった。

以上の通り、本発明物質は各種細胞に対し細胞毒作用乃
至殺細胞作用を秦し、また低毒性であるところからヒト
及び他の動物の抗腫瘍剤として有用である。

本発明物質はこれを抗腫瘍剤として利用するに当っては
、その有効回を、慣用される薬理的に許容される無毒性
製剤担体と共に含有する各種形態に調整され、該形態に
応じた各種投与経路により投与される。その製剤形態と
しては通常液状溶液、懸濁液、乳濁液等を例示でき、こ
れらは一般に単独で又はリンゲル液、ブドウ糖液等の補
液と併用して静脈内、皮下、皮肉、腹腔内又は筋肉内に
投与される。これらはまた使用前に適当な担体の添加に
よって液状になし得る乾燥品として提供することもでき
る。該抗腫瘍剤中に配合される有効成分としての本発明
物質の配合量及び該製剤の投与ｍは、製剤の投与経路、
投与形態、疾患の程度、患者の年齢、性別等により適宜
選択され、一定ではないが、通常、有効成分約１〜８０
重量％（蛋白量として）を含む製剤形態に調整して、こ
の製剤をこれに含有される有効成分蛋白量が約１．０〜
１０μＱ／ｋＱ１日となる範囲で１〜数回に分けて投与
するのが好ましい。

実　　　施　　　例 以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ 各個においては、以下の細胞及び抗１ｈｉ瘍物質誘導剤
を各々使用した。

（１）抗腫瘍物質誘導剤 センダイウィルス（ＨＶ　Ｊ　：　Ｓ　ｅｎｄａｉ　ｖ
ｉｒｕｓ　。

）−１ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　
ｏｆ　　Ｊａｐａｎ）は、カンチル（Ｋ、　Ｃａｎｔｅ
ｌｌ）より供与されたもので、１０〜１２日目の受精鶏
卵に接種し、３日後に漿尿液を採取した。漿尿液を連続
超遠心 （３５０００ｒｐｍ　）Ｌ、てＨＶＪを精製し、その沈
渣をＰＢＳ　（−）で浮遊させた。精製ＨＶＪは、使用
時まで適当に分注し、−８０℃にて凍結保存した。

他に、抗腫瘍物質誘導剤としてＰＨＡ　（ディフコ社、
アメリカ）、Ｃ０ｎＡ（和光Ｉｉ！ｉ薬社）、ＬＰＳ　
（大腸菌０５５　：Ｂ５、ディフコ社）、コリネバクテ
リウム・パルバム（ウェル−カム社、イギリス）及びＴ
ＰＡを使用した。、 （２）　　細　　胞 本発明物質の産生に利用した細胞は、ヒト由来の培養株
化リンパ系細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＤＮＤ−４１，７
ＡＬＬ−１、ＲＰＭＩ−８４０２、ＣＣＲＦ−Ｈ３Ｂ−
２細胞、いずれも１ｍｍｕｎｏｌ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、
　９　（８）　、Ｅ）７３１〜７３４（１９８０）記載
のものである）を、１ｏ％ＦＣ３加ＲＰＭＩ−１６４０
培地を用いて、３７℃にて５％炭酸ガスインキュベータ
ー内で静置培養して調整した。

また上記各ヒトリンパ系細胞の各々１Ｘ１０７個を、自
家繁殖させた生後２４時間以内の新生ハム°スター（ゴ
ールデン・ハムスター）に皮下移植し、週に２回の割で
家兎抗ハムスター胸腺リンパ球血清（ＡＬＳ）を０．１
ｍＧ投与して、４〜５週間後に生着腫瘍塊をｇＪ出し、
これをイーグルスＭＥＭ培地で洗浄後、細断器で細断し
、細胞濾過器を通して調製したものも使用した。

実施例１ 上記参考例１−（２）で調製した各ヒト由来培養株化リ
ンパ系細胞を、イーグルスＭＥＭ培地にて遠心洗浄後、
１０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ−１６４０培地で２．５Ｘ１０
”個／−に１４製した二上記細胞浮遊液に、前記参考例
１−（１）に示した各抗腫瘍物質誘導剤の所定ｆｆｉ　
（ＰＨＡは５０μ（］／ｌ１ｌｆ２、ＣｏｎＡは１　Ｃ
１（１／ｍ１２．　ＨＶＪは５００ＨＡ／ｍｆ２ＳＬＰ
Ｓは１０μｇ／ｍＱ、ＴＰＡは１０ｎｇ／鵬）を添加し
、３７℃で１〜６日間撹拌培養し、得られる培養上清を
遠心分離（１００００ｒｐｍ）により採取し、−２０℃
にて凍結保存した（粗製溶液）。

かくして得られた粗製溶液のＬ−細胞に対する細胞毒性
作用（力価、単位／戒）を、下記第２表に示す。

尚、上記力価の測定は、培養上清を無菌濾過後に行なっ
た。またＨＶＪを含む培養上清は、ＨＶＪを不活性化す
るためにＵ■処理（１５ＷＵＶランプ、２０ｃｍ下、３
０分処理）後、力価測定を行なった。

第　　２　　表 ＤＮＤ−４１２４１５９０２０− ＴＡＬＬ−１６０１５６３１５− ＰＭＩ− ＣＣＲＦ− １−（ＢＳ−２６０１０６０２０− ＣＣＲＦ− ＣＥＭ　６０　１０１３０　２０　３０（２）　上記（
１）と同様にして、５Ｘ１０６個／ｍＱＲＰＭＩ−１６
４０培地単独、のＣＣＲＦ−ＣＥＭに１００〜４０００
ＨＡ／ｍ１２のＨＶＪを添加し、２４時間培養して、同
様に粗製溶液を得た。

その力価（１１１位／−）を下記第３表に示す。

第　　３　　表 粗製溶液　ＨＶＪ添加全　　粗製溶液力価Ｎｏ、　　　
（ＨＡ／ｍ１２）　　　　　（単位／鵬）（３）　　１
０％ＦＣ３加ＲＰＭｔ−１６４０培地を用いて５Ｘ１０
６個／−に調製したＣＣＲＦ−ＯＥＭに５０〜２００μ
ｇ／ｌ′ｌｌＩ２のＰＨＡを添加し、７２時間培養し、
前記（１）と同様に粗製溶液（Ｎ　ｏ、　７〜９）を得
た。

また、上記においてＰＨＡ５０μＩＪ／ＩＩＩＱの添加
４８時間培養後、更にＰＨＡの５０μｏ／ｍＱ（粗製溶
液Ｎ０．１０　）　、Ｃ８ｐａｒｖｕｍ（７）５０１１
Ｑ　／ｍＱ（粗製溶液Ｎ０．１１）、又はＨＶＪの５０
０ＨＡ／−（粗製溶液Ｎｏ、１２）を添加して更に４日
間培養して粗製溶液を得た。それらの力価（単位／１Ｔ
ＩＩ２）を下記第４表に示す。

Ｍ４表 粗製溶　　　抗腫瘍物質誘導剤　　　　力　両液Ｎｏ、
　　　（μり又はＨＡ／鵬）　　　（単位／諧）７　　
　ＰＨＡ　　　（５０）　　　　　　６９８　　　ＰＨ
Ａ　　（１００）　　　　　　６５９　　　ＰＨＡ　　
（２００）　　　　　　８０１０　　　ＰＩ−ＩＡ　　
＋ＰＨＡ （５０）　　　　（５０）’　　　　　８０１１　　　
ＰＨＡ　　＋Ｃ，ｐａｒｖｕｍ１２　　　ＰＨＡ　　＋
ＨＶＪ （５０）　　　＜５００）　　　　　１５０（４）　本
発明物質の１離 上記（２）において、ＣＣＲＦ−ＣＥＭにＨＶＪ　（５
００ＨＡ／ｍ１２）を作用させて得た粗製溶液（７０単
位／ｍＱ）をペリコンカセット（ミリボア社製、アメリ
カ）で１０倍に濃縮する。これに６０”Ｃ１３０分間の
熱処理を行なってウィルスを失活させた。上記熱処理後
、粗精！１１！１３縮液を一夜、−２５℃で放置し、翌
日溶解後、発生した不溶物を３０００ｒｐｍ　、２０分
間遠心分離を行なって除去した。

次いで該溶液に１Ｎ酢酸を加え、ｐＨ５，５に調整した
。これを７０００　ｒｐａ＋で２０分間冷却遠心分離（
４℃）し、不溶物を除去し、その上清を２Ｍトリス塩酸
緩衝液にて直ちにｐＨ８，０に調整した。

次いで、この溶液を０．０２Ｍトリス塩酸（ｐ　Ｈ７，
８）１１衝液に対して透析した。この透析活性区分を、
予め０．０２Ｍトリス塩酸（１）ｌ−１７，８）緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシア社製
）に付した。流速１２０噌／時間、５鵬／分画の条件下
に同緩衝液で充分に洗浄り、　ｔｃ後、０．０２ＭトＩ
Ｊス塩１（ｐＨ７，８）１０００ｍＧ及び０．３Ｍ　　
Ｎａ　ＣＱを含む０．０２Ｍト！Ｊス１酸（ｐ　Ｈ７，
８）　を使用ｔ、、Ｔ、連続的に濃度勾配を上昇させて
、吸着物質を溶離した。この方法では非吸着区分に活性
は認められず、全ての活性は吸着された。吸着した活性
は、ＮａＣＱの０．０２Ｍ　〜０．１Ｍの間に溶出され
た。活性区分を集め、限外濾過濃縮装置ＴＣＦ−１０（
アミコン社製、アメリカ）を用いて、４℃で限外濾過濃
縮した。

この方法による活性回収率は８０％であり、精製度は４
倍であった。全工程を通じての活性回収率は６４．４％
で、精製度は１２倍であった。

上記方法で得られた活性区分を０．５ＭＮａＣＱを含む
０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したウルトＯゲル
ＡｃＡ４４　（カラムサイズ５０Ｘ１０００ｍｍ）を用
いて、ゲル濾過を行なった。活性区分は４００ｍ〜５６
０戒の門に溶出した。活性区分を集め、限外濾過濃縮装
置を用いて、４℃で濃縮を行なった。

この方法による活性回収率は７８％であり、精製度は５
倍であった。全工程を通じての活性回収率は５０．０％
で、精製度は６０倍であった。

活性濃縮液を、透析用チューブに入れ、５０〜１００（
８Ｎｕの３０％飽和硫酸アンモニウムを含む０．０２Ｍ
トリス塩Ｆｉ（ｐＨ７，８）緩衝液に対して、４℃で数
回外液を交換しながら透析して、充分に平衡化させた。

透析液をブチルトヨバールカラム（１６Ｘ２００！＋＋
ｍ）に付し、硫酸アンモニウムの飽和度３０％から０％
（０，０２Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７，８）までの濃
度勾配で溶出させた。流速１５鵬／時間で、該生理活性
は硫酸アンモニウム飽和度２〜５％の間に溶出されてき
た。

この方法による活性回収率は６７％であり、精製度は９
５倍であった。全工程を通じての活性回収率は３３．４
％で、精製度は５．７Ｘ１０３倍であった。

活性画分を集め、減圧濃縮装置マイクロプロディコンに
入れ、外液を０．０２５Ｍイミダゾール−塩酸（ＥＩＨ
７，４）に対して、減圧濃縮及び透析を行なった。

活性濃縮液を０．０２５Ｍイミダゾール−塩酸（ｐＨ７
，４＞で［ｉ化したクロマトフオーカシング用ゲル（フ
ァルマシア社製、スウェーデン）に吸着させた。溶出は
ポリバッファー７４（ファルマシア社製、スウェーデン
）−塩Ｍ　（ｐＨ４，０）でｐＨ勾配を作成して溶出さ
せた。活性はｐＨ７，５〜６．２の間に溶出された。

この方法による活性回収率は６５％であり、精製度は６
．５倍であった。全工程を通じての活性回収率は２１．
７％で、精製度は３．７Ｘ１０’倍であった。

活性画分を集め、外液に０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，８＞を入れたマイクロプロティコンに付し、減
圧濃縮及び透析を行なった。

次いで、濃縮、透析した生理活性画分を、予め０．０２
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で平衡化したレンチ
ルレクチンセファロース４Ｂ（カラム容ｆｔ１５ｎ＋２
）に付し、吸着させた。吸着後、カラムを充分ｍの同一
緩衝液で洗浄し、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラ
ノシド（生化学工業社製）を含む０．０２Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８）、流速１０鵬／時間で生理活性画
分を溶離させた。

この方法による活性回収率は６５％であり、精製度は４
倍であった。全工程を通じての活性回収率は１４．１％
で、精製度は１．４８Ｘ１０５倍であった。

次いで、この活性区分をマイクロプロディコンを用いて
濃縮し、予め０．２ＭＮａＣＱを含む０．０５Ｍホウ酸
緩衝液で平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　（東洋
曹達社製）カラムに付し、高速液体クロマトグラフィー
によるゲル濾過を行なった。

この方法による活性回収率は４５％であり、精製度は４
倍であった。全工程を通じての活性回収率は６．３４％
で、精製度は５．９２Ｘ１０５倍であった。

上記生理活性画分を集め、マイクロプロディコンを用い
て濃縮し、Ｃ４−逆相カラム（４，６ｘ２５０ｍｌｌｌ
）に付加した。分画溶出は、Ａ液（０，１％ＴＦＡ）及
びＢ液（アセトニトリル：１％ＴＦＡ−９：　１の混液
）を用い、０〜５分はＡ液１００％で、５〜２０分はＢ
液０〜３０％で、２０〜８０分はＢ液３０〜６０％で、
８０〜８５分はＢ液６０〜１００％で、各々の濃度勾配
による溶出を行なった。流速１戒／チユ一ブ／分で溶出
を行なって、試験管番号５０〜６ｏ番目（フラクション
Ｎｏ、５０〜６０）に目的とする生理活性画分を溶出さ
せた。かくして、本発明の′ｖＩ蛋白質を得た。

この工程での活性回収率は２０％であり、精製度は２＠
であった。全工程を通じての活性回収率は１．２７％で
、精製度は１．１８Ｘ１０６倍であった。

得られた本発明物質（′糖蛋白質）は、前記した（及び
以下に詳述する）生理活性及び物理的性状を示した。ま
たその比活性は１．９５Ｘ１０日単位／＋ｎｏ蛋白質で
あった。

（５）　前記（１）において、ＤＮＤ−４１にＰＨＡを
作用させて得た粗製溶液（２４単位／鵬）を用いて、上
記（４）と同様にして、本発明糖蛋白質を得た。全工程
を通じての活性回収率は１．２７％であり、精製度は１
．１８Ｘ１０’倍であり、比活性は１．９５Ｘ１０８単
位／ｍｇ蛋白質であった。

（６）　前記（１）において、ＴＡＬＬ−１にＨＶＪを
作用させて得た粗製溶液（６３単位／鴨）を用いて、上
記（４）と同様にして、本発明糖蛋白質を得た。全工程
を通じての活性回収率は３．８１％であり、精製度は４
．５２ｘ１０６倍であり、比活性は１．２５Ｘ１０’単
位／ｍｇ蛋白質であった。

（７）　前記（１）において、ＲＰＭＩ−８４０２にＣ
ｏｎＡを作用させて得た１ｆｆｌ製溶液（１２単位／ｍ
Ｑ）を用いて、上記（４）と同様にして、本発明糖蛋白
質を得た。全工程を通じての活性回収率は２，６５％で
あり、精製度は６．８５ｘｌＯ６倍であり、比活性は２
．９０Ｘ１０８単位／ｍｇ蛋白質であった。

（８）　前記（３）において、ＣＣＲＦ−ＯＥＭに２０
０ｍ（１／＋１１１２のＰＨＡを作用させて得た粗製溶
液（８０単位／鵬）を用いて、上記（４）と同様にして
、本発明糖蛋白質を得た。全工程を通じての活性回収率
は２．４％であり、精製度は１．３５Ｘ１０７倍であり
、比活性は３．１０Ｘ１０８単位／Ｉｇ蛋白質であった
。

（９）上記（４）〜（８）で得られた本発明糖蛋白質試
料の分子帯、等電点、アミノ酸組成、アミノ酸配列を以
下のごとくして測定した。

ａ）　　ＴＳＫゲ／Ｌ、　Ｇ　３０００　Ｓ　Ｗを用イ
タ’ｊ　）Ｌｔ　濾過法による分子量測定 ファルマシアＦＰＬＣシステムに、ＴＳＫゲルＧ３ｏ０
Ｏ８Ｗカラム（カラムサイズ７．５×６０Ｑｍｍ）を接
続し、０．１％ＳＤＳ及び０．２ＭＮａ　Ｃ１２を含む
５０ｍＭホウ酸／ホウ砂（ｐＨ７，８）の緩衝液を用い
て、本発明物質試料５０μｇ　（蛋白量として）をゲル
濾過に付して、標準分子量キット（ファルマシア社製）
から求めた標準曲線を用いて該試料の分子量を算出した
。

上記、（４）で得た本発明物質試料について得られた結
果を第１図に示す。図において、横軸はリテンションタ
イム（分）を、縦軸は分子量をそれぞれ示し、図中（１
）〜（４）は標準分子量キットの結果であり、（１）は
牛血清アルブミン（ＢＳＡ、分子量６７０００）を、（
２）は卵白７　）Ｌｔ　７　ミン（Ｏｖａｌｂｕｎ＋ｉ
ｎ、分子ｆｉ４３０００）を、（３）はキモトリプシノ
ーゲンＡ（分子量２５０００）を、（４）はりボヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ、分子量１３７００）を示し、（５
）が本発明物質試料の結果である。

第１図より、本発明物質はりボヌクレアーゼ（４）の後
に溶出し、その分子量は約１２０００±２０００である
と算出された。

ｂ）　　ＳＯ８／ＰＡＧＥ電気泳動法による分子量の測
定 レメリー（Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉ　）らの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ。

２２７巻、６８０頁、１９７０年）に従い、リン酸ナト
リウム／ＳＤＳ　（ｐ　Ｈ７，２）で、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルに、本発明物質試料５μｇ　（蛋白量
として）を付与し、４０ｍＡで７時間電気泳動を行ない
、標準分子量キットを用いて、その電気泳動パターンを
記録し、これより分子量曲線を作成し、該図より、本発
明物質試料の分子量を算出した。

上記（４）で得られた本発明物質試料についての電気泳
動パターンを第２図（横軸は電気泳動の距離（ｃｍ）を
、縦軸はｌｏｇで表示された分子量を示す）に、また分
子量曲線を第３図に各々示す。

標準分子Ｒキットにおける標準物質は、各図においてそ
れぞれ次の記号により表示する。

（１）　−＊ス＊　！Ｊ　７−ｔ’　ｂ　（分子ｊｉ９
４０００）（２）・・・牛血清アルブミン（分子ｆｆ１
６７０００）（３）・・・卵白アルブミン（分子ｆｆ１
４３０００）（４）・・・炭酸脱水酵素（分子量３００
００）（５）・・・トリプシンインヒビター （分子量２０１００） （６）・・・α−ラクトアルブミン （分子量１４４００） また本発明物質試料は（７）として示す。

第３図より、本発明物質試料の分子量は、約１９０００
±３０００と算出される。

Ｃ）　等電点測定 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａ　ｍｐｈｏｌ　１ｎｅ）ポリアクリルアミ
ドゲルプレート（９）４３．５〜９．５）（ＬＫＢ社製
、アメリカ）を使用し、標準等電点測定マーカーキット
（ファルマシア社製、スウェーデン）を使用し、本発明
物質の等電点を前述した方法に従って測定した。

前記（４）で得られた本発明物質試料についての結果を
第４図に示す。図において横軸はフラクションＮＯ，を
、縦軸はＬ−細胞に対する細胞毒性活性（×１０５単位
／鵬、曲線（１）で示す）及びｐＨ（曲線（２）で示す
）を示す。

第４図より、本発明物質の等電点はｐＨ６，８±０．５
と算出された。

ｄ）　アミノ酸配列の決定 本発明物質試料のアミノ酸配列を、プロテインシークエ
ンサー（アブライドバイオシステムズ社製、モデル４７
０Ａ）を用いて分析した。但し各アミノ酸は逆相高速液
体クロマトグラフィーにより同定した。

尚、本発明物質試料としては、前記（４）の逆相高速液
体クロマトグラフィーにて、リテンションタイム５５分
に溶出したフラクション（試料■）及び同５６分に溶出
したフラクション（試料■）の２つを用いた。これらの
各々について上記方法に従い求めたアミノ酸配列の分析
の結果、各試料のアミノ末端側部分（２１個又は２３個
）は、それぞれ次の通りであることが確認された。

（試料■） Ａｌａ−丁ｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　−３ｅｒ　−ｐ　ｒｏ　
−１ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−
３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔ、ｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−
Ｖ　ａｌ−−−−−−− （試料■） Ｓ　ｅｒ−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　
ｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐｈｅ　−５ｅｒ−
８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｔ　−ｅ）　アミノ酸組成比の決定 本発明物質試料（前記ｄ項で用いた試料工及び試料■）
の各々について、之等を４Ｎメタンスルホン酸で１１０
℃、２４時間加水分解（減圧封管中）後、アミノ酸アナ
ライザー（８３５−５０形、日立高速アミノ酸分析計、
日立製作新製）により分析した。

その結果は下記第５表に示す通りであり、各物質試料の
アミノ酸組成比は、ｐｈｅを基準（６，００＞として、
それぞれ以下の通りであることが確認された。

第　　５　　表 アミノ酸　　　　　試料工　　　試料■Ｐ　ｈｅ　　　
　　　　６，００　　　　６．００ＡＳＤ又はＡｓｎ　
　　　６．２±　０．８　　５．２±　０．５Ｔｈｒ　
　　　　　４．２±　０．５　４．４±０．５Ｓ　ｅｒ
　　　　　　１１．４±　１．１　１１．０±　１．１
Ｑｌｕ又はＧｌｎ　　　　８，６±　０．９　８．５±
　０．９ｐｒｏ　　　　　　　　Ｏ０ Ｇｌｙ　　　　　　６．６±　０．７　６．６±０．６
Ａ　ｌａ　　　　　　７．２±　０．７　６．５±０．
７ＣｙＳ　　　　　　　０　　　　０ Ｖａｔ　　　　　　５，１±　０．５　４．８±０．５
Ｍ　ｅｔ　　　　　　２．１±　０．５　１．６±０．
５Ｉｌｅ　　　　　　２．３±　０．５　１．５±０．
５１　ｅＵ　　　　　　１２．５±　１．２　１２．５
±　１．３Ｔ　ｙｒ　　　　　　４．９±　０．５　４
．０±０．５Ｌ　ｙｓ　　　　　　　　　　３．２±　
０．５　　２．４±　０．５Ｈｉｓ　　　　　　　　　
４．４±　０．５　　４．９±　０．５Ｔｒｐ　　　　
　　　　　Ｏ，２±　０．５　　　　　０Ａｒｇ　　　
　　　　　　１，６±　０．５　　０．９±　０．５以
下、本発明物質を用いた製剤例を挙げる。

製剤例１ 本発明物質１×１０８単位を含む生理食塩水溶液１０ｉ
を調整し、これを無菌）濾過後、その２回ずつを容器に
分注し、凍結乾燥して、注射用抗ｌｌｌ５剤を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ゲル清適法による本発明物質の分子量測定結
果を示すグラフ、第２図及び第３図は、ゲル電気泳動法
による同物質の分子間測定結果を示すグラフ及び第４図
は等電点電気泳動法による同物質の溶出挙動を示すグラ
フである。 （以　上） ＠３図 電鉄体動距離（ｃｍ） 茅４図 フラクションＮｏ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質及び構造的特徴を有する糖蛋
   白質。 ａ）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲルろ過法によ
   る分子量：１２０００±２０００ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
   による分子量測定による分子量：１９０００±３０００ ｃ）等電点：ｐＨ６．８±０．５ ｄ）プロテインシークエンサーによるアミノ末端側より
   ２１〜２３個のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 〔但しＲ−はＨ−又はＡｌａ−Ｔｈｒ−を示す。〕