JPS632415B2

JPS632415B2 -

Info

Publication number: JPS632415B2
Application number: JP57103905A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Yoshimura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-06-18
Filing date: 1982-06-18
Publication date: 1988-01-19
Also published as: JPS58222026A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規な抗ガン物質に関する。更に詳し
くは溶血性連鎖球菌の菌体構成成分である抗ガン
物質に関する。溶血性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
は丹毒、敗血症、産褥熱等の病原菌である。しか
しながら溶血性連鎖球菌の一部が抗腫瘍活性を有
していることは古くから知られており、今日、臨
床的にも抗ガン剤として用いられるようになつて
いる。岡本らは、溶血性連鎖球菌の抗腫瘍活性は溶血
性連鎖球菌のストレプトリジンＳ（Streptolysin
Ｓ）の産生能と密接な関係があり、ストレプトリ
ジンＳの産生能を有する溶血性連鎖球菌をストレ
プトリジンＳ産生能を維持した培養条件で培養す
ることにより、抗腫瘍物質が産生されることを明
らかにしている。（GANN，55，225〜232，
June，1964；Japan J.Exp.Med.34(3)，109〜
118，1964；および金沢大学がん研究所年報、１
巻、141〜153，1967参照）。また、溶血性連鎖球菌から抗腫瘍物質を製造す
る方法としては、従来いくつかの方法が知られて
いる（特公昭38−1647号、特公昭48−43841号お
よび特公昭49−6096号公報、並びに英国特許第
1153113号明細書参照）。このうち、特公昭48−43841号は、溶血性連鎖
球菌を機械的手段により破砕して無細胞抽出液を
製造し、硫酸アンモニウムで塩析し、50〜80％飽
和硫酸アンモニウム濃度で沈殿を析出せしめ、次
いでイオン交換体あるいはゲル過剤と接触せし
め、精製された抗腫瘍物質を製造する方法を開示
している。同公報の記載によれば、この精製され
た抗腫瘍物質は蛋白質であつて糖を含まず、セフ
アデツクスＧ−200によつて測定した分子量は2.0
×10⁵の分子量を示し、そしてPH５で５℃に保つ
と24時間以内にかなり失活する。本発明の抗ガン物質は、溶血性連鎖球菌の菌体
（生菌又はペニシリン等により処理して死滅させ
た菌体のいずれでもよい）を機械的に破砕し、得
られた破砕物をPH約7.5の緩衝溶液で抽出して抽
出物を得、この抽出物から未破砕菌、破砕菌の細
胞膜、リボゾーム分画を分類除去し、得られた活
性成分を含む画分に、温度処理、DNA除去、透
析、遠心分離あるいは硫安分画等の操作を施し、
次いで得られた画分をハイドロホビツクインタラ
クシヨンクロマトグラフイー
（hydrophobicinteraction chromatagraphy）に
付すことにより製造することができる。かくして得られた本発明の抗ガン物質は、上記
操作につづいてさらにイオン交換クロマトグラフ
イー、ゲル過クロマトグラフイーに付すことが
でき、さらに蒸留水に対し透析することもでき、
それによつて更に活性の高められた状態で提供す
ることができる。本発明で提供される抗ガン物質は、糖蛋白質で
あつて（後記、パス染色の項(d)および糖分析の項
(g)参照）且つゲル過カラムクロマトグラフイー
によれば牛血清アルブミン（平均分子量67000）
よりも大きく牛γ−グロブリン（平均分子量
160000）よりも小さい分子量を持つている（後
記、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の項(b)参
照）。本発明の活性成分は例えば、第１表に示したよ
うに順次分離、精製し、取得される。【表】本発明の活性成分は、等電点が４よりも高く、
且つ５よりも低い両性物質であり、糖蛋白質の特
性を示し、ゲル過カラムクロマトグラフイーに
よれば、その分子量は牛血清アルブミン（平均分
子量67000）よりも大きく牛γ−グロブリン（平
均分子量160000）よりも小さい。また、ポリアク
リルアミド（7.5％）ゲル電気泳動法によれば0.5
〜0.6のRf値を示し、主たるアミノ酸成分として
アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、リジンおよびアルギニンを含
有する。本発明の活性成分は、in vitroおよびin vivo
の試験で優れた抗ガン活性を示し、そして毒性を
有さないかあるいは有していても非常に小さい。本発明の活性成分は、非経口的に又は経口的
に、好ましくは非経口的に例えば静脈内、皮下、
腹腔内、直腸内に投与することができる。本発明の活性成分は、患者の病状、年令、体重
等によつて異なるが、通常約１mg〜約100mg／Kg
体重、好ましくは約１〜約40mg／Kg体重の投与量
で、１日１回〜数回に分けて患者に投与すること
ができる。本発明の活性成分は単独で、又は薬学的に許容
される担体あるいは希釈剤等と一緒に投与するこ
とができる。例えば、注射剤として用いる場合に
は、生理的食塩水に溶解して用いることができ
る。注射剤は注射液として予めアンプルに詰めて
おくことができるが、注射の直前に本発明の活性
成分の凍結乾燥品を生理的食塩水に溶解して調製
することもできる。以下に実施例を記載し、本発明を更に詳細に説
明する。実施例菌体の培養溶血性連鎖球菌Su株をウツドおよびガンザラ
ス（Wood、A.J.and、Gunsalus I.C）の培地（J.
Bacteriol.，44，333〜341（1942）参照）180中
で37℃で12時間培養した。菌体からの有効構成画分の分離培養後の培養液を連続遠心分離機（日立製作所
製20PR遠心機、RPRC−18ローターを使用）に
かけ437.8ｇの湿菌体を得た。泥状の湿菌体（菌
泥）を緩衝液MT−75（10mM酢酸マグネシウム
を含有する10mMトリスハイドロキシアミノメタ
ン緩衝液を濃塩酸でPH7.5としたもの）の充分量
で充分に洗滌した。得られた洗滌菌１容にガラス
ビーズ４容およびMT−7571容を加えて混合し軟
混合泥を得た。この軟混合泥を振動発生セル破砕
機（Vibrogen Cell Mill、西独国、Edmond−
Wehler社製）を用いて氷冷下、4600r.p.m.の条件
下で20分間機械的に破砕せしめた。得られた破砕
物を湿菌体量の４倍量のMT−75を用いてガラス
ブフナーロート上で洗滌し、菌破砕体液を分離し
た。この過液に17500×ｇ、20分間の遠心分離
を２回施し、未破砕菌および破砕菌の細胞膜を沈
殿せしめ上澄液を沈殿から分離した。この上澄液
にさらに105000×ｇ、２時間の遠心を施して
（Beckmann社製超遠心分離機L3−50）リボゾー
ム分画を取り除き、黄色透明な超遠心上澄液（以
下SCEという）3008mlを得た。このSCEを45℃で
30分間加熱処理し、生じた沈殿を31200×ｇ、30
分間の遠心分離で除去した、この上澄液に、20％
ストレプトマイシン（明治製菓(株)製）含有の
DBA−85〔Ｘ塩化ナトリウム0.14M、塩化カリウ
ム27mM、リン酸二ナトリウム12水塩8.1mMお
よびリン酸−カリウム1.5mMを含む水溶液（以
下、Dulb−ecco−基礎液Ａ液という）−「組織培
養」25〜27頁、1964年朝倉書店発行参照−を20％
水酸化カリウム水溶液で約PH8.0に調節したもの〕
を撹拌しながら徐々に上記上澄液の1/2容添加し、
一晩静置して生成した沈殿（主として、DNAと
ストレプトマイシンとの結合物）を、17500×ｇ
30分間の遠心分離により除去せしめた。得られた
上澄液をセルローズチユーブに入れ充分量の
DBA−75（Dulbecco−基礎液Ａ液）を外液とし
て透析を行つた。外液は数回交換した。この被透
析液に55％硫安飽和となるように細末硫安を添加
した。（Data for Biochemical Research，
edited by R.M.C.DA−WSOM et.al.1969年、第
２版、616頁の表参照）。２時間〜１晩放置後、こ
の55％硫安飽和被透析液を31200×ｇ、30分間の
遠心分離に付し、上澄液を分離した。この上澄液
に70％硫安飽和となるように細未硫安を再び添加
し、上記と同様に遠心分離を行ない、その沈殿画
分を得た。この沈殿画分を10mMリン酸カリウム
緩衝液（PH7.0）200mlに溶解せしめ、同じ緩衝液
に対して透析せしめた。ここに、189mlの黄色の
被透析液を得た。この189mlの被透析液（有効構
成画分）は、標準糖蛋白質として結晶牛血清アル
ブミン（ARMOUR Pharmaceutical Co.製）を
用いLowry等の方法（J.Biol.Chem.193，265
（1951）参照）に従つて含有総蛋白質を測定した
ところ4.3ｇの蛋白質（牛血清アルブミンの量と
して、以下同じ）を含有していた。有効構成画分からの有効構成成分の分離・精製 (1)；ハイドロホビツクインタラクシヨンクロマト
グラフイー（hydrophobic interaction
chromatography）：上記有効構成画分を蛋白質濃度が15mg／mlとな
るように希釈し、これに50％硫安飽和となるよう
に細末硫安を撹拌しながら徐々に２時間を要して
添加し、一夜静置した。この液を31200×ｇ、20
分間の遠心分離に付し、上澄液87ml（総蛋白質量
1000mg）を得た。この上澄液を、50％飽和の硫安
を含有した10mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）
で予め平衡化しておいたオクチル−セフアローズ
CL−4B（Octyl−Sepharose CL−4B，
Pharmacia Fine Chemicals社製）のカラム（エ
クセルクロマトカラム；2.6×40cm）上に添加し、
硫安濃度を下げ、一方エチレングリコール（和光
純薬社製）濃度を上げるいわゆるクラジエント溶
出法（最終濃度は硫安０％、エチレングリコール
50％、総容積２）で溶出した。流速はポンプ
（10200PERPEX PERISTALTIC PUMP，
LKB社製）で13.5ml／hr／cm²に調節し、溶出液
は10mlずつに分画した。（ULTRORAC
FRACTION COLLECTOR 7000，LKB社製）。溶出終了後、各画分の280nmにおける吸光度
（DBS−70 SPECTROPHOTO−METER
Beckman−Toshiba社製、１cmセル使用）と伝
導度（EXPANDOMATIC SS2，Beckman−
Toshiba社製使用）を測定した。また、適宜に溶
出試験管を取りその内容の一部をDBA−75に対
して透析し、被透析液について、Lowry法によ
る蛋白質量、および組織培養法による抗ガン活性
を測定した。その結果を添付図面の第１図に示し
た。比較的高い活性を示した画分（フラクシヨン
番号84〜90）を集め、限界過器（UHP−62型、
東洋ろ紙社製）と東洋ウルトラフイルターUK−
10を用い３Kg／cm²の窒素ガス加圧下で濃縮した。
濃縮中にできた僅かの浮遊物を17500×ｇ、20分
間の遠心分離によつて取り除き、得られた溶液を
10mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）に対して
透析した。かくして、上記189mlの有効構成画分
（総蛋白質量4.3ｇ）から被透析液（１段精製画
分）45.5ml（総蛋白質量407mg）が得られた。なお、組織培養による抗ガン活性は次のように
して求めた。：Eagle MEM培地（日水製薬(株)製）
に、馬血清及び牛胎児血清（いずれもGIBCO社
製）を加えた培地を用い、また細胞としては、ハ
ムスター胎児肺臓由来の株化THEL細胞を用い
た。試験液（各画分の透析液）をリン酸緩衝塩類
溶液（PBS）に溶解させた後孔径0.22μのミリポ
アフイルターで過除菌し、５mlの培地と１×
10⁵個の細胞とを入れたシヤーレ（Falcon
Plastic dish）に、蛋白質の終濃度が0.5μｇ／ml
となるように加えた。別に対照のため試験液を加
えず細胞のみを入れたシヤーレも用意した。これ
らのシヤーレを炭酸ガス培養器（池本理化工業
(株)）、Ｂ型）中に入れ、37℃で約72時間培養した。
培養終了後、トリプシン処理によつて細胞をはが
し、10mlのPBSに懸濁させて、コールターカウ
ンター（Coulter Electronics Inc.製）で細胞数
を計測した。対照シヤーレの細胞数から増殖阻止
率（％）として結果を表示した。２イオン交換DEAE−セルローズクロマトグラ
フイー： DE−52セルローズ（（Wattman社製）のカラ
ム（1.5×26cm）を10mMのリン酸カリウム緩衝
液（PH7.0）で充分に平衡化せしめた。このカラ
ム上に、１段精製画分20〜25ml（蛋白質量179〜
224mg；約５mg蛋白質／１mlゲル）を添加し、
10mM〜0.5Mリン酸緩衝液（PH7.0）のグラジエ
ント溶出法で溶出せしめた。流速を15ml／hr／cm²
とし、５mlずつに分画した。全溶出液は600mlで
あつた。溶出終了後、上記(1)のクロマトグラフイーの場
合と同様にして、各画分について280nmにおける
吸光度と伝導度を測定し、適宜の分画試験管の内
容の一部をDBA−75に対して透析し、被透析液
について、Lowry法による蛋白質量および組織
培養法による抗ガン活性を測定した。なお、抗ガ
ン活性は試験液の蛋白質終濃度が0.1μｇ／mlとな
るようにして癌細胞に作用させた。その結果を添
付図面の第２図に示した。比較的高活性を示した画分（フラクシヨン番号
43〜49）を集め、上記(1)のクロマトグラフイーの
場合と同様にして、濃縮し、17500×ｇ、15分間
の遠心分離を行なつた。かくして、１段精製画分45.5ml（総蛋白質量
407mg）から、２段精製画分7.4ml（総蛋白質量67
mg）が得られた。 (3) ゲル過クロマトグラフイー： 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）で予め、
平衡化させたセフアデツクスＧ−200
（SephadexG−200，Pharmacia Fine
Chemicals）のカラム（2.6×97cm）に、上記２
段精製画分7.4mlを通過させ、同じ緩衝液で溶出
せしめた。溶出は上昇法で行ない、流速を3.4
ml／hr／cm²とし、溶出液を５mlずつ分画した。溶出終了後、各画分の280nmにおける吸光度を
測定した。また前回同様に適宜の分画溶液の一部
をとり、DBA−75に対して透析し、得られた被
透析液について、Lowry法による蛋白質量およ
び、組織培養法による抗ガン活性を測定した。な
お、抗ガン活性は試験液の蛋白質終濃度が0.05μ
ｇ／mlとなるようにして癌細胞に作用せしめた。
その結果を添付図面の第３図に示した。比較的高活性を示した画分（フラクシヨン番号
46〜56）を集め、上記(1)のクロマトグラフイーと
同様にして濃縮した。かくして、２段精製画分7.4ml（総蛋白質量67
mg）から、３段精製画分5.2ml（総蛋白質量33.8
mg）が得られた。 (4) 蒸留水に対する透析：３段精製画分5.2mlを、蒸留水を外液とし、数
回これを交換しながら42〜48時間透析せしめた。
生成した白色沈殿を17500×ｇ、20分間の遠心分
離により除去した。かくして、無色透明の最高精
製溶液（４段精製画分）5.0ml（総蛋白質量15mg）
を得た。本発明の有効構成成分の物理的、化学的性質 (a) ラウリル酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法上記(4)の操作で得られた最終精製溶液は、
SDS−ポリアクリルアミド（7.5％）ゲル電気
泳動法に従つてシー・アイ・アシツドプルー83
（C.I.Acid Blue83，C.I.42660Coomassie
Brilliant Blue R.以下同じ）により染色した
際、0.4〜0.5の間のRf値、多くの場合約0.46の
Rf値を示す１本のみのバンドを与える。分子量既知の蛋白質すなわちチトクロームＣ
（分子量12400）、ミオグロビン（分子量17800）、
キモトリプシノーゲンＡ（分子量24700）、オバ
ルブミン（分子量45000）および牛血清アルブ
ミン（分子量67000）についてRf値を同じ方法
で求め、分子量とRf値との関係を示す検量線
（片対数グラフ）を作成し、この検量線を用い
て上記0.46のRf値を示すバンドの成分の分子量
を求めると約50000であつた。 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は
ウエーバーおよびオスボーン（Weber and
Osborn）の方法に従つて行つた（J.Biol.
Chem.，244，4406（1969）参照）。すなわち、
SDSを0.1％の割合で含む高さ５cmの7.5％ポリ
アクリルアミドゲルカラムを作成した。別に上
記最終精製溶液の希釈液を１％SDSと５％メル
カプトエタノールの存在下で、100℃で３分間
加熱処理し、0.01％のブロムフエノールブルー
１滴を加えた。この処理液50μを上記カラム
上に重積した。このカラムを電気泳動装置（ミ
ツミ科学機器製）に取り付け、そして泳動槽に
0.1％SDS−0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH
7.2）を満たし、カラム１本あたり1mAで30分
間続いて8mAで泳動せしめた。ブロムフエノ
ールブルーのバンドがゲル下方0.5cmの位置に
達した時点で泳動を終了した。泳動終了後カラ
ムからゲル柱を取り出し、0.02％Coomassie
Brilliant Blue Ｒによりよく知られた方法で
染色した（Charambach、et al.Anal.
Biochem.20，150（1967）参照）。 (b) ポリアクリルアミドゲル電気泳動法上記(a)で用いたと同じ最終精製溶液は、ポリ
アクリルアミド（7.5％）ゲル電気泳動法に従
つてCoomassie Brilliant Blue Ｒにより染色
した際、0.5〜0.6の間にRf値、多くの場合約
0.54のRf値を示す１本のバンドと0.65〜0.75の
間のRf値、多くの場合約0.70のRf値を示す１
本のバンドとの合計２本のバンドを与える。一方、泳動終了後、ゲル柱を取り出しドライ
アイスで直ちに凍結させ、ゲル・スライサーで
２mm間隔で細断した。各１個のゲル切片につい
て0.5mlのDBA−75緩衝液を用いて該ゲルから
蛋白質を抽出し、抽出液について組織培養法に
よる抗ガン活性を調べた。0.5〜0.6の間のRf値
を示すバンドの成分が優れた抗ガン活性を示し
た。この実験(b)における0.5〜0.6の間のRf値のバ
ンドは、上記(a)の実験結果を合せ考えるとき、
0.65〜0.75の間のRf値のバンドの成分の二量体
または三量体であると考えられた。ポリアクリルアミド電気泳動法はオルンスタ
イン（Ornstein）の方法（Ann.N.Y.Acad.Sci.
121，321（1964）参照）およびデイビス
（Davis）の方法（Ann.N.Y.Acad.Sci.121404
（1964）参照）に従つて行つた、すなわち、５
mm×７cmのガラス管に先ず7.5％アクリルアミ
ド分離用ゲル（PH8.9）を５cm高さまで充填し、
その上にさらに2.5％アクリルアミド濃縮用ゲ
ル（PH6.8）を１cmの高さで充填し、ポリアク
リルアミドゲルカラムを作製した。上記最終精
製溶液の希釈液に同容の50％サツカロース溶液
と0.01％ブロムフエノールブルーを１滴加え
た。この溶液0.1〜0.4mlを上記のゲルカラム上に
重積し電気泳動装置に取付け、泳動槽にPH8.9
のトリス・グリシン（Tris−Glycin）（0.38M）
緩衝液を満たし、カラム１本あたり2mAの定
電流で２〜３時間泳動せしめた。泳動終了後、
カラムからゲル柱を取り出し、0.02％の
Coomassie Brilliant Blue Ｒにより染色し
た。余分な染色は、25％エタノールおよび10％
酢酸混液を用いて脱色した。一方、活性成分の分子量は、セフアデツクス
Ｇ−200を用いるゲル過クロマトグラフイー
（上記した有効構成画分からの有効構成成分の
分離・精製の(3)参照）によれば、牛血清アルブ
ミン（平均分子量67000）と牛γ−グロブリン
（平均分子量160000）との間の分子量、多くの
場合、約140000の分子量を示すことが明らかに
された。すなわち、チトクロームＣ（平均分子量
12400）、牛血清アルブミンおよび牛γ−グロブ
リンの分子量既知の蛋白質の混液をセフアデツ
クスＧ−200を通過させて溶出し、それぞれ蛋
白質の分子量と溶出時の液量（Ve）との関係
を検量線（片対数にプロツト）として作成し
た。活性成分のVeは260であり（第３図参照）、
これから上記分子量が求められた。 (c) 等電点分画法松尾らの方法（「化学の領域」増刊88号、別
冊、新しい液体クロマトグラフイー参照）に従
つて行つた。その結果、３段精製画分の活性成
分の等電点はPH４〜５の間、多くの場合にPH約
4.3であることが明らかとなつた。次のようにして等電点分画を行つた。等電点分画カラムには110ml用分画カラム
8100型（LKB社製）を使用した。充填液は、
下記の如くして調製した濃溶液および淡溶液を
用い、両性担体（LKB社製、Ampholine（40％
Ｗ／Ｖ）使用）の濃度が１％となるように調製
した。濃溶液：両性担体の混液（PH3.5〜5.0のもの
とPH3.5〜10.0のものとをこの順で５対１の割
合で混合して調製した）2.25mlに蔗糖水溶液
（50％Ｗ／Ｖ，Eastman Organic Chemicals
社製）を加えて60mlとしたもの。淡溶液：上記と同じ両性担体混液0.75mlに水
を加えて60mlにしたものと、上記３段精製画分
を蒸留水で透析して得た溶液20ml（蛋白質含量
７mg）に上記PH3.5〜5.0のAmpholine混液0.25
mlを加えたものとの２種類。上記濃溶液と２種類の淡溶液とを用いて、公
知の密度勾配の調製法に従つて、蔗糖について
濃度の異なる24種の混液（いずれも4.6ml）を
24本の試験管内に作つた。蔗糖濃度の高い方か
ら低い方へ順次試験管にNo.１〜No.24を付した。
試験管No.１は濃溶液そのものであり、試験管No.
24は淡溶液そのものであり、試験管No.２〜No.７
およびNo.17〜No.24には淡溶液として３段精製画
分を含まない上記淡溶液を用い、試験管No.８〜
16には淡溶液として３段精製画分を含む上記淡
溶液を用いた。その他、試験管No.０（濃リン酸
0.05mlを添加した50％蔗糖溶液８ml）、No.25（濃
リン酸0.05mlを添加した蔗糖溶液5.0ml）およ
びNo.26（水６ml）を調製した。分画カラムに、陰極側から順次試験管No.０〜
24までを重層し、陽極側から順次試験管No.25お
よび26を重層し、700Vの定電圧で冷却下に48
時間通電した。通電終了後、２ml／minの流速
で２ml又は1.0mlずつに分取し、直ちに氷冷下
でPHを測定した（Beckman EXPANDO−
MATIC SS−２、複合電極：Radiometer
electrode GK2302Cを使用）。PH測定後、各画
分の280nmにおける吸光度を測定し、また
Ampholineを除去するため各画分を蒸留水に
対して透析し、この被透析液について、
Lowry法による蛋白質量と組織培養法による
抗ガン活性を測定した。 (d) パス（PAS；Periodic acid Schiff
staining）染色、４段精製画分を(b)に記述した
と同じ方法で、ポリアクリルアミド電気泳動法
に付し、泳動後のゲル柱２本を得た。これらの
ゲル柱をそれぞれPASおよび、Coomassie
Brilliant、Blue Ｒで染色した。Coomassie
Brilliant Blue Ｒで青色に染色されたバンド
の位置と、PAS染色法で紅色に染色されたバ
ンドの位置とが一致した。この結果から、本発
明の活性成分は、糖蛋白質であることが確認さ
れた。 (e) アスパラギナーゼ（Asparaginase）活性J.
Robertsらの方法（J.Bac.95，2117（1968）参
照）に従い、上記の如くして得た種々の活性画
分についてアスパラギナーゼ活性を調べた。そ
の結果、SCE（菌体からの有効構成画分の分離
参照、リボゾームを除いた超遠心分離上澄液）
菌体からの有効構成画分の分離で得られた有効
構成画分および４段精製画分のいずれにもアス
パラギナーゼ活性を認めることはできなかつ
た。アスパラギナーゼ活性は、Ｌ−アスパラギナ
ーゼ（Sigma Chemical社製）を対照として測
定した。すなわち試験液とＬ−アスパラギナー
ゼ１〜5μｇとを含む0.1mlに、１％Ｌ−アスパ
ラギン（Asparagine）溶液0.3mlを加え、37℃
で15分間インキユベートした。これに、1.5Mトリクロル酢酸溶液を加え、
生じた沈殿を3000rpm、15分間の遠心分離で除
去し、上澄液の0.1mlに蒸留水4.7mlと、ネスラ
ー試薬（和光純薬(株)製）0.2mlを加えた。15分
後、450nmの吸光度（１cmセル）を測定し、ア
スパラギナーゼ活性の有無を調べた。 (f) アミノ酸分析上記(a)のSDS−ポリアクリルアミド電気泳動
法により一本のバンドとして確認された等電点
分離後の活性画分（上記(c)参照）について、ア
ミノ酸分析を行つた。試料1.6mgを３分し、そ
れぞれ、24時間、48時間および72時間、6N−
塩酸で110℃で加水分解し、得られた試料につ
きアミノ酸分析機（日立製作所製、日立KLA
−５）により分析した。（カラム１：日立樹脂、
50×0.9cm；開始：PH3.25，0.20Nクエン酸緩衝
液、温度55℃次いで95ml時でPH4.25，0.20Nク
エン酸緩衝液、温度55℃に変更；カラム２：日
立樹脂、７×0.9cm；PH5.28，0.35Nクエン酸緩
衝液、分子量55℃）。結果を第２表に示した。【表】注：表中−は未検索を示している
上記のとおり、アスパラギン酸、グルタミン酸
の含量が特に高く、その他、バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、リジンおよびアルギニン含量も高
い。アミノ酸の回収率が低いのは等電点分離時の
Ampholineの除去が充分でなかつたためであろ
う。 (g) 構成糖および糖含量の分析４段精製画分について、ガスクロマトグラフ
イー法によつて構成糖の同定および糖含量の分
析を行つた。この画分には構成糖としてアロー
ス（allose）が約1.5重量％含有されていること
が明らかとなつた。ガスクロマトグラフイーによる分析のための
試料の調製は次のようにして行つた。４段精製
画分の減圧乾燥（P₂O₅，KOH存在下）品250μ
ｇに2N−HClを１ml加えた試験管を用意し、
減圧下封管し、100℃で３時間加熱した。放冷
後開封し、得られた試料を減圧下で濃縮し、こ
れに水１mlを加えて再び濃縮した。この水を加
えて濃縮する操作をさらに２回（全部で３回）
くりかえし、塩酸を留去した。濃縮液に、飽和
炭酸水素ナトリウム200μと無水酢酸100μ
を加え、３時間室温に放置したあとDowex50
（H⁺）（0.5×３cm）に通過させ、樹脂をH₂O10
mlで洗つた。溶出液を減圧濃縮し、0.05N
NaOH100μ，NaBH₄0.5mgを加え、３時間室
温に放置した。次に酢酸数滴を添加し、この液
をDowex50（H⁺）（0.5×３cm）に通過させ、樹
脂を10mlのH₂Oで洗つた。溶出液を減圧濃縮
し、メタノール１mlを加えて濃縮することを３
回くりかえし、減圧乾燥品を得た。このものに
ピリジン100μ、無水酢酸50μを加え80℃で
２時間加熱したのち、トルエン１mlを加えて濃
縮した。トルエンを加えて濃縮する操作を３回
繰り返し、その濃縮残渣に酢酸エチルエステル
30μを加え、その5μをガスクロマトグラフ
イーに付した。Ｄ−アロース（allose）20μｇについて上記
と同様にして調製したガスクロマトグラフイー
用試料について得られたガスクロマトグラフと
比較することにより、上記本発明の４段精製画
分はアロースについてのピークと同じ位置（同
じ保持時間）にピークを有していたことからア
ロースを構成糖として含有していることが明ら
かとなつた。また、Ｄ−マンノースを内部標準物質として
４段精製画分中のアロースの定量を、上記と同
様にして試料を調製しそして実施した。その結
果、４段精製画分中のアロースの含量は約1.5
重量％であつた。なお、ガスクロマトグラフイーは、島津製作
所製GC−7A型機器により、ガスクロムＱ
（Gaschrom Ｑ、担体）に液相としてのOV−
17を１％担持した充填剤（80〜100メツシユ）
を充填したカラム（直径３mm、長さ1.5m）を
用い、キヤリヤーガスとしての窒素を52ml／分
で通じて行つた。カラムは160℃で16分間保持したのち、３
℃／分で昇温し、210℃に到達した後はこの温
度に保持した。検出器の温度は240℃に保持し
た。本発明の有効構成成分の生物学的活性 (イ) 組織培養法による各画分のin Vitro抗ガン活
性、すでに前述した方法に従い、各画分に適当
な終濃度で細胞増殖阻止率（％）を求め、その
結果を活性曲線に表わし、そしてその活性曲線
から50％増殖阻止率（ID₅₀（μｇ／ml）を求め
た。結果を第３表に示した。【表】 (ロ) SCEおよび３段精製画分のin ViVO抗ガン
活性、動物は、体重約25ｇのICR雌マウスを用い
た。試験液は、SCEおよび３段精製画分を
DBA−75に対して透析したものを用いた。マウスに10⁶個のエールリツヒ腹水ガン細胞
を腹腔内移植し、その24時間後から試験液を１
日１回0.5ml又は0.3mlずつ連続４日間腹腔内に
投与した。対照群には同体積量の生理食塩水を
与えた。細胞移植後60日間観察した。結果を第
４表に示した。【表】上記のとおり、本発明の活性成分は明らかに
抗ガン活性を示す。 (ハ) 毒性６週令、体重約23〜25ｇのDDY、雌マウス
を用いた。４段精製画分の凍結乾燥粉末20mgを
DBA−75，6.0mlに溶解した。除菌のためこの
溶液を0.20μメンブランフイルター（東洋紙
社製）を用いて過した。マウスへの注射に際
しては上記凍結乾燥品として100mg／Kgとなる
ように注射液量（0.70〜0.76ml）を決めた。 12匹のマウスを４匹ずつ３群に分け、各群を
腹腔内注射用、静脈内注射用および皮下注射用
とした。各群４匹のマウスのうち２匹には過
滅菌したDBA−75液を注射し（対照用）、他の
２匹には上記試料液を注射した。注射後のマウ
スの状態を、第１日目は経時的に、第２日目以
降は１日１回定時に観察し、また体重の測定を
行つた。７日後剖検を行つた。各群の実験条件
を第５表に示した。【表】上記Ａ，Ｂ，Ｃ各群は、注射後７日間の観察中
試料処置を受けたマウスは対照マウスと全く同様
の挙動を示し何等の異常も示さなかつた。また、Ａ群およびＢ群では試料処置を受けたマ
ウスはいずれも僅かに体重の減少を示したが、Ａ
群では６日目に、Ｂ群では４日目に正常の体重に
戻り、Ｃ群の試料処置を受けたマウスは体重減少
を何ら示さなかつた。さらに、各群のマウスを解剖した結果、肺、
肝、腎臓および胃、腸管等並びに胸、腹腔内臓器
等の様子は、試料処置を受けたマウスと対照マウ
スとで異なるところは何ら認められなかつた。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図、第２図および第３図は、そ
れぞれ、オクチルーセフアローズクロマトグラフ
イー、DEAE−セルローズカラムクロマトグラフ
イーおよびセフアデツクスＧ−200クロマトグラ
フイーによる各溶出曲線を示している。第１図、
第２図および第３図において、横軸はフラクシヨ
ン番号であり、線ａは280nmにおける吸光度
（A¹cm₂₈₀）線ｂは蛋白質量（μｇ／ml）、線ｃは抗
ガン活性（％）である。また、第１図および第２
図において線ｄは伝導度（ｍ）である。

Claims

【特許請求の範囲】１溶血性連鎖球菌の菌体の機械的破砕物を抽出
して得られる該菌体の構成成分であつて、Ａゲル過カラムクロマトグラフイーによる分
子量が牛血清アルブミン（平均分子量67000）
よりも大で且つ牛γ−グロブリン（平均分子量
160000）よりも小さい値を示し、Ｂ等電点が４より高く、且つ５よりも低い値を
示し。Ｃ PAS染色法に従つて紅色に染色される糖蛋
白質の特性を有し、且つＤ 7.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
従つてシー・アイ・アシツドブル−83染色を施
して測定した場合に0.5〜0.6の間のRf値を示すことを特徴とする抗ガン物質。２上記菌体の構成成分がアミノ酸分析によつて
アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、イソロ
イシン、ロイシン、リジンおよびアルギニンを主
たるアミノ酸成分として含有する特許請求の範囲
第１項の記載による抗ガン物質。