JPH0826072B2 - 生理活性ポリペプチド、その製法および用途 - Google Patents

生理活性ポリペプチド、その製法および用途

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JPH0826072B2 JP62014807A JP1480787A JPH0826072B2 JP H0826072 B2 JPH0826072 B2 JP H0826072B2 JP 62014807 A JP62014807 A JP 62014807A JP 1480787 A JP1480787 A JP 1480787A JP H0826072 B2 JPH0826072 B2 JP H0826072B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な生理活性ポリペプチド、その製法並び
に用途に係る。
（従来の技術） 昆虫等の無脊椎動物にワクチンを接種すると、その体
液中に抗菌性を有する活性物質の出現することが知られ
ている（「Eur.J.Biochem.」第106巻第７頁、1980年
等）。
本発明者も、センチニクバエ（Sarcophaga peregrin
a）に関して、その幼虫では体表に障害を与える場合
に、抗菌性を有するポリペプチドが体液中に出現するこ
とを見い出し、このポリペプチドを精製すると共に、そ
の理化学的性質を明らかになした（特開昭59-13730及び
同61-122299公報参照）。
（発明が解決しようとする問題点及び発明の目的） センチニクバエ由来の上記抗菌性ポリペプチドは広い
抗菌スペクトルを示し、且つ蛋白質であるために可食性
の抗菌剤として期待されているが、抽出法により得られ
ているものであるために、その生産に難点を有してお
り、従って廉価に且つ大量に生産する方法の開発が望ま
れていた。
従って、本発明の基本的目的は、センチニクバエ由来
のものであって、他の生理活性、即ち抗ウイルス活性を
有するポリペプチドを廉価に且つ工業的規模で生産し得
る方法を開発することにある。
（問題点を解決するための手段及び及びその作用） 本発明によれば、上記の問題点はセンチニクバエ胚由
来の細胞を培養し、培養上清をイオン交換クロマトグラ
フィー、熱処理及び分子篩クロマトグラフィーにより分
離及び分画処理し、次いでHPLCにより吸着、分離及び分
画処理して精製することにより解決されると共に、上記
の基本的目的が達成される。
この場合に得られる生理活性ポリペプチドは文献未記
載の新規物質であって、そのアミノ酸配列は H-Ala-Thr-Cys-Asp-Leu-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-lle-Asn-
His-Ser-Ala-Cys-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Leu-Arg-Gly-As
n-Arg-Gly-Gly-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Ala-Val-Cys-Val-
Cys-Arg-Asn であり、抗ウィルス作用を有している。
従って、本発明は当該生理活性ポリペプチド自体及び
抗ウイルス剤としてのその使用をも対象とするものであ
る。
本発明による上記の生理活性ポリペプチドは、その製
造工程において熱処理が含まれていることから明らかな
ように、熱安定性に優れている。
（医薬品とする場合の剤型及び投与量） 本発明による生理活性ポリペプチドは、センチニクバ
エ由来の従来の生理活性ポリペプチドと同様に、毒性は
殆ど有していない。
医薬品になす場合に、剤型的制限はなく、経口投与用
又は非経口投与用となすことができる。
治療目的での投与量は、成人を対象とする場合に、1-
500mg/日の範囲内、例えば5mg/日が好ましい。
（実施例等） 次に、製造剤、薬理試験例及び製剤例に関連して本発
明を更に詳細に説明する。
製造例 ａ）細胞培養 Mitsuhashi等の培地（塩化ナトリウム7g/l、塩化カリ
ウム0.2g/l、塩化カルシウム二水和物0.2g/l、塩化マグ
ネシウム六水和物0.1g/l、燐酸水素ナトリウム−水和物
0.2g/l、炭酸水素ナトリウム0.12g/l、グルコース4g/
l、ラクトアルブミンハイドロライゼート6.5g/l及びイ
ーストレート5.0g/lとを含有、pH6.5）を滅菌処理した
後に、センチニクバエ胚由来の株化細胞（「NIH Sape-4
細胞」と命名されている）を１×106個/ml培地となるよ
うに植え込み、25℃において7-10日間培養し、細胞数が
約２×107個/mlになった時点で継代を行い、遠心分離に
より上清（培地）を回収した。
ｂ）抗菌性ポリペプチドの分離精製 上記のａ）項で得られた培地500mlに燐酸緩衝液（pH
6.0）を1500ml添加してpH及び塩濃度を調整する。得ら
れた溶液をCMセルロースカラム（3.4×20.0cm）に導通
させ、上記と同様の燐酸緩衝液で洗浄した。このカラム
に520mM-NaCl含有燐酸緩衝液を導通し、溶出液を5mlづ
つ分取し、280nmにおける吸光度と、OKADA等の方法
（「Biochem.J.」第211巻第724-734頁、1983年）に従い
大腸菌（K12 594株）を用いて抗菌活性を測定し、又650
nmでの吸光度を測定した。
このようにして抗菌活性の認められる画分を同定し、
これらの活性画分を集め、100℃で10分間維持した後
に、生じた沈澱を遠心分離により除去した。得られた溶
液を限外濾過により濃縮させ、この濃縮液をセファデッ
クスG-50カラム（1.5×60.0cm）により処理し、溶出液
を2mlづつ分取し、280nmにおける吸光度を測定し、又上
記と同様にして抗菌活性の測定を行った［この際の緩衝
液は130mMの塩化ナトリウムを含有する燐酸緩衝液（pH
6.0）を用いた］。結果は第１図に示される通りであっ
た。
このようにして抗菌活性の認められる画分を同定し、
これらの活性画分を集めて10mM燐酸緩衝液により５倍に
稀釈した後に、この溶液を再びCMセルロースカラム（2.
0×4.0cm）にかけ、25mM-400mMの塩化ナトリウム含有燐
酸緩衝液のリニアグラジェントにより溶出させた。この
溶出液について280nmでの吸光度を測定し、又上記と同
様にして抗菌活性の測定を行った結果は第２図に示され
る通りであった。
第２図から抗菌活性が認められる画分である画分１及
び２の内で、画分１を分取し、HPLC逆相クロマトグラフ
ィー（シンクロパックRPP-C18カラム）を用いた分画処
理した結果は第３図に示される通りであった。
この第３図に示されるメインピーク部分を分取して所
望の生理活性ポリペプチド（「KM-2」と命名）を得た。
尚、HPLCの条件は下記の通りであった。
Ａ液:0.05％ トリフルオロ酢酸／水 Ｂ液:0.05％ トリフルオロ酢酸/99％アセトニトリル グラジェント： Ａ液中に５％のＢ液、Ａ液中に43％のＢ液のリニアグ
ラジェント 流速:2ml/分 ｃ）KM-2のアミノ酸配列 気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシ
ステムズ社製の470Aプロテインシークエンサー）を用い
て、KM-2のアミノ酸配列を決定した処、次の通りであっ
た。
H-Ala-Thr-Cys-Asp-Leu-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-lle-Asn-
His-Ser-Ala-Cys-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Leu-Arg-Gly-As
n-Arg-Gly-Gly-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Ala-Val-Cys-Val-
Cys-Arg-Asn 薬理試験例（抗ウィルス活性の測定） レーラー等の方法（「J.Virology」第54巻第467-472
頁、1985年）に従い、KM-2の抗ウィルス活性（ヘルペス
単純ウィルスに対する直接的な中和活性）を調べた結果
は第４図に示される通りであった。
この第４図に示されるグラフから、ウィルスのプラー
ク形成能がKM-2により、直線的に抑制されることが判
る。
製剤例（注射用粉末） 製造例に記載の方法により得た生理活性ポリペプチド
（KM-2）を常法により滅菌処理し、バイアルに5mg宛無
菌的に分配し、凍結乾燥させて粉末状になし、次いでバ
イアルを密封する。
この粉末は、用時には注射用蒸留水又は生理食塩水に
溶解せしめられる。
（発明の効果） 本発明による生理活性ポリペプチドは抗ウイルス作用
を有し、毒性は殆ど有していない。従って、抗ウイルス
剤の有効成分として有用である。更に、本発明による生
理活性ポリペプチドは、蛋白質であり可食性を有してい
るので、抗菌性食品添加物として用いるのに適してい
る。しかも、このポリペプチドは熱安定性に優れている
ので、加工工程に熱処理を必要とする食品用の抗ウイル
ス性食品添加物として殊に有用である。
一方、本発明方法によれば、センチニクバエ胚由来の
細胞、例えば既に株化されている細胞を培養した培養上
清から、上記の有用なポリペプチドを得ることができる
ので、培養規模を拡大することにより該ポリペプチドの
商業的大量生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明による生理活性ポリペプチドの精製段階
でセファデックスG-50カラムを用いた際の溶出パターン
を示すクロマトグラム、第２図は第１図と同様の、但し
CMセルロースカラムを用いた際の溶出パターンを示すク
ロマトグラム、第３図は本発明による生理活性ポリペプ
チドの最終精製段階であるHPLCによる溶出パターンを示
すクロマトグラム、第４図は本発明による生理活性ポリ
ペプチドの抗ウィルス活性を測定した結果を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸配列が H-Ala-Thr-Cys-Asp-Leu-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-lle-Asn-
    His-Ser-Ala-Cys-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Leu-Arg-Gly-As
    n-Arg-Gly-Gly-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Ala-Val-Cys-Val-
    Cys-Arg-Asn であることを特徴とする、生理活性ポリペプチド。
  2. 【請求項２】センチニクバエ胚由来のものであることを
    特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の生理活性ポ
    リペプチド。
  3. 【請求項３】センチニクバエ胚由来の細胞を培養し、培
    養上清をイオン交換クロマトグラフィー、熱処理及び分
    子篩クロマトグラフィーにより分離及び分画処理し、次
    いでHPLCにより吸着、分離及び分画処理して精製するこ
    とを特徴としており、アミノ酸配列が H-Ala-Thr-Cys-Asp-Leu-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-lle-Asn-
    His-Ser-Ala-Cys-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Leu-Arg-Gly-As
    n-Arg-Gly-Gly-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Ala-Val-Cys-Val-
    Cys-Arg-Asn である生理活性ポリペプチドの製法。
  4. 【請求項４】アミノ酸配列が H-Ala-Thr-Cys-Asp-Leu-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-lle-Asn-
    His-Ser-Ala-Cys-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Leu-Arg-Gly-As
    n-Arg-Gly-Gly-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Ala-Val-Cys-Val-
    Cys-Arg-Asn である生理活性ポリペプチドを有効成分としていること
    を特徴とする、抗ウイルス剤。
JP62014807A 1987-01-23 1987-01-23 生理活性ポリペプチド、その製法および用途 Expired - Lifetime JPH0826072B2 (ja)

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