JPH0320300A

JPH0320300A - 悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有する新規蛋白質

Info

Publication number: JPH0320300A
Application number: JP2129941A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Sakagami; 坂上　良男; Hobumi Manabe; 真鍋　穂文
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-05-19
Filing date: 1990-05-19
Publication date: 1991-01-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒトまたは動物の血液、血清または摘出臓器
抽出液より分別され、悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有す
る新規なる蛋白質を主とする物質に関するものである。

本発明者らは、悪性腫瘍細胞の増殖を抑制する物質とし
て動物生体より各種蛋白質を分離し研究した結果、血液
および臓器より分離される蛋白質がインビトロにおける
各種悪性腫瘍細胞の増殖を抑制する作用ならびにインビ
ボにおける悪性腫瘍細胞を植付けた動物に延命効果のあ
ることを見出した．当該蛋白質は、新規蛋白質であって、ヒトおよび動物、
就中噛乳動物の血液、血清、あるいは摘出臓器たとえば
肝臓、腎臓等の抽出液から得られ、悪性腫瘍細胞増殖抑
制作用を有し、悪性腫瘍細胞移植動物に顕著なる延命効
果を示す。特に悪性腫瘍細胞に対し強い増殖抑制阻害作
用を有しつつも、インビトロで殺悪性腫瘍細胞作用は示
さず、またヒトあるいは動物に対し無毒性で、正常細胞
に何ら認むべき阻害作用を示さぬ点において特異的な生
理活性を有するものというべきであり、医薬としてきわ
めて価値のあるものである．本発明にかかるこの新規なる蛋白質は、ヒトまたは動物
の血液、血清または摘出臓器抽出液から、その性状に基
づいて塩析、抽出、吸着、溶出、透析、分別、沈殿、ｒ
過、等電点沈殿、ゲルフィルトレーション、イオン交換
樹脂利用、電気泳動等の公知の操作を適宜組合わせるこ
とによって分離取得することができる。より具体的には
、まず血液、血清、あるいは臓器抽出液に硫酸アンモニ
ウム、食塩等を添加して有効戒分を塩析沈殿させ、この
沈殿を透析後乾燥すると新規蛋白質の粗粉末が得られる
．さらに進んだ精製には、イオン交換樹脂セファデツクス
活性炭、シリカゲルもしくはジェチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥと略す）およびセルロース等のカラムクロマトグ
ラフイーおよびポリアクリルアミドゲル、サツ力ロース
等を用いる電気泳動法あるいは等電点沈殿等を単独また
は組合わせることにより可能であり、さらにまた、この
新規なる蛋白質はシリカゲル、ベントナイト、酸性白土
または活性炭等の吸着体に吸着せしめて精製することが
できる．ヒトまたは動物の血液、血清あるいは摘出臓器抽出液か
ら上記のごとく分離された蛋白質物質は前述のごとくき
わめて特異的な生理作用を示し、制悪性腫瘍剤として有
用である。本発明者らは、この新規なる蛋白質につき、
さらに研究を進めた結果、これが単一の物質ではなく、
さらにいくつかの戒分に分離可能であり、それらがいず
れも悪性腫瘍細胞増殖抑制効果を有することを知り、こ
れらを以下新規蛋白質Ａ，Ｂ，Ｃと称する．すなわち、
前記の塩析に際し塩の飽和度をたとえば４０％、９０％
、１００％のごとく変化させ、分子量に応じて分別沈殿
させ、分子篩による吸着、溶出で純度を高めた後、カラ
ムクロマトグラフイーで注意深く分別を行うと、新規蛋
白質Ａ，ＢならびにＣが得られ、新規蛋白質Ｃの物性は
以下のとおりである．新規蛋白質Ｃ外　観：白色粉末触　点：２３５℃〜２４０℃分解性　質：蛋白質分子量：約１４０００　（１０％　ドデシル硫酸ナトリ
ウム電気泳動法による〉溶解性：水に易溶、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、
ヘキサン、クロロホルムに不溶アミノ酸組戒：アスパラ
ギン酸１ｏ．５％、スレオニン７．１％、セリン６．２
％、グルタミン酸１２．５％、ブロリン５．２％、グリ
シン４．７％、アラニン８．０％、システイン１．７％
、バリン６．１％、メチオニン０．７％、インロイシン
２．７％、ロイシン１０．５％、チロシン３．１％、フ
ェニールアラニン５，７％、リジン８．５％、ヒスチヂ
ン２．８％、アルギニン４，１％呈色反応：ニンヒドリン反応陽性、アンスロン、モーリ
ッシュ、過沃素酸反応陰性赤外線吸収スペクトラム２第ｌ図参照［　ＫＢｒベレッ
トで測定〕紫外線吸収スペクトラム：　ＰＨ３の水中で２８０ｎｍ
に肩があり（第２図参照）、ＰＨ７の水中で２９０ｎｍ
に吸収極大（第３図参照）．ＰＨ１０．Ｏの水中で２７
７ｎｍに吸収極大を示す（第４図参照）なお、測定条件は下記のとおりである．融　点：顕微鏡
融点測定分子量：幅９ｃｍ、長さ２４ｃｍ、厚さ０．５ｃｍ、担
体ボリアクリルアミドゲル７％、展開溶剤　トリスーグ
リシン緩衝液（ＰＨ１３），展開時ｒｒ１３時間、電圧
　チュ一ブ当り５ｍＡ呈色反応：小試験管を使用紫外線吸収スペクトラム：（株）日立製紫外部吸収装置
を使用上記記載の新規蛋白質Ｃは、７％アクリルアミドゲル電
気泳動法でＰＨ６．５では原点より移動せず、ＰＨ８．
０，ＰＨ９．５、ＰＨ’ｌＯ．Ｏではいずれも原点より
移動し、単一バンドを示す．したがってクロマトグラフ
イーに代えてアクリルアミドゲル電気泳動法による分別
も可能である．このような精製法で得られる新規蛋白質
Ｃは勿論のこと、各段階で得られる粗粉末も各種悪性腫
瘍細胞増殖抑制剤として使用することが可能である．以
上のように、他成分を加えず純粋の形でもあるいは混合
物の形でも有効で、注射薬その他各種の剤形に調剤が可
能である．以下、実施例により本発明を説明する．実施例１．牛血清１０Ｚに、硫酸アンモニウムを飽和せしめて得ら
れる沈殿物を、ＰＨ７．３でセファデツクスＧ−５０　
　４０ｍｌ容に吸着せしめ、ＰＨ７．３の０．０５Ｍト
リス塩酸緩衝液３０ｍｌで溶出せしめ、新規蛋白質粗物
質１，１ｇを得た．次いでジエチルアミノエチル（ＤＥ
ＡＥ）セルロース（ワットマン社製）に吸着せしめ、０
．０２Ｍ〜０．０５Ｍのトリス塩＃Ｍ衝液（ＰＨ７．３
〉イオン強度勾配溶液４０ｍｌで溶出し、大きく３分画
に分ける．第２分画を透析し、脱塩し、凍結乾燥して粗
物質１１．６ｍｇを得た．これをさらにＰＨ７．３の０
．０２Ｍ｝リスＭｆ／ｌＩ液で平衡化したジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース（ワットマン社製）に
吸着せしめ、０．０２Ｍから０．０５Ｍのトリス塩酸緩
衝液（ＰＨ７．３）イオン強度勾配溶液４０ｍｌで溶出
し、６分画に分けて、第４分画を透析し、脱塩し、凍結
乾燥すると白色の新規蛋白質Ｃ２．９ｍｇが得られた．本物質は電気泳動法で単一バンドを示し、５０Ｑｍｃｇ
／ｍ１で組織培養におけるロイケミャＬ−１２１０細胞
の増殖曲線角度が１０度の遅れを示す活性を示した．実施例２．ヒト血清１１を用いて実施例１に示したと全く同様に処
理し、１４８ｍｃｇの新規蛋白質Ｃを得た．このものは実施例１と同様の組織培養におけるロイケミ
ャＬ−１２１０細胞増殖曲線角度抑制活性を示し、ポリ
アクリルアミドゲルを用いたＰＨ８．０，ＰＨ９．５、
ＰＨ１０．０の電気泳動法で、牛血清より分離された新
規蛋白質Ｃと全く同一物質であると同定された．実施例３．新鮮牛肝臓１ｋｇを粉砕し、０．０５Ｍ｝リス緩衝液（
ＰＨ７．４）２１で抽出した．肝臓抽出液を遠心分離に
かけ、澄明な抽出液約３１を得た．この肝臓抽出液を実
施例ｌに示したと全く同様に処理し、精製された新規蛋
白質Ｃ７１７ｍｃｇを得た．このものは実施例１と同様の組織培養におけるロイケミ
ャＬ−１２１０細胞に対する増殖曲線抑制活性を示し、
ポリアクリルアミドゲルを用いたＰＨ８．０、ＰＨ９．
５、ＰＨ１０．Ｏの電気泳動法で牛血清より分離された
新規蛋白質Ｃと同一物質であると同定された．実施例４実施例１，２．３で得られた、それぞれのヒトおよび牛
の血清また牛肝臓由来の新規蛋白質Ｃ５００ｍｃｇ／ｍ
ｌを用いた試験で、Ｉｆ培養におけるロイケミャＬ５１
８７Ｙ細胞に対し１度、ザルコーマＳ−１８０１１胞に
対し２０度、エーリツヒ力ルシノーマ細胞に対し１度の
細胞増殖曲線角度の遅れを示す活性を示した．しかし、
ラット肝臓由来の第１次組織培養に対しては全く増殖抑
制作用を示さなかった．また被検各種悪性腫＃ＩＩ細胞
は染色試験でいずれも生存を確認された。

実施例５実施例１で得られた新規蛋白質Ｃを用いて動物試験を行
った．それぞれＢＤＦ，マウス（体重１８．５ｇ＞５匹よりな
る試験動物群を用いた，第１群では、新規蛋白質Ｃｌ．ｌｍｇ／匹を腹腔注射し
、同時にロイケミャＬ−１２１０細胞１×１０５を腹腔
注射した．また第２群では、第１群と同様の実験を行っ
たのち、さらに第１回注射後４日目に新規蛋白質Ｃｏ．
０８ｍｇ／匹を腹腔注射した．対照は平均１０．０日で
死亡したが、第１群第２群ともに全数６０日迄生存し、
体重増加も無処理のＢＤＦ，マウスと同様の曲線を示し
た。６０日目に断頭し、開腹したが、いずれのマウスに
も腹水の存在は見られなかった．１群のマウスに新規蛋
白質０４ｍｇ／匹腹腔内投与したが、６０日間死亡例は
みられなかった．

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の新規蛋白質Ｃの赤外線吸収スペクトラ
ムを、第２図、第３図および第４図はそれぞれ新規蛋白
質ＣのＰＨ３．０，ＰＨ７．０およびＰＨ１０．Ｏでの
紫外線吸収スペクトラムを示す．

Claims

【特許請求の範囲】

融点２３５〜２４０℃（分解）の白色粉末であり；１０
％ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動法による分子量が約
１４０００で；水に易溶性、アセトン、酢酸エチル、ベ
ンゼン、ヘキサン、クロロホルムに不溶性であり；アス
パラギン酸１０．５％、スレオニン７．１％、セリン６
．２％、グルタミン酸１２．５％、プロリン５．２％、
グリシン４．７％、アラニン８．０％、システイン１．
７％、バリン６．１％、メチオニン０．７％、イソロイ
シン２．７％、ロイシン１０．５％、チロシン３．１％
、フェニールアラニン５．７％、リジン８．５％、ヒス
チヂン２．８％、アルギニン４．１％のアミノ酸組成を
有し；ニンヒドリン反応陽性、アンスロン、モーリツシ
ユおよび過沃素酸反応陰性で；第１図の赤外線吸収スペ
クトラム［ＫＢｒペレット］を示し；紫外線吸収スペク
トラムがＰＨ３水中で２８０ｎｍに肩を有し、ＰＨ７水
中で２９０ｎｍに吸収極大を、またＰＨ１０．０水中で
２７７ｎｍに吸収極大を示し、ヒトまたは動物の血液、
血清または摘出臓器抽出液から分別され、悪性腫瘍細胞
増殖抑制作用を有する蛋白質。