JPH0253799A

JPH0253799A - 新規ペプチド及び抗菌剤

Info

Publication number: JPH0253799A
Application number: JP63203724A
Authority: JP
Inventors: Sadaaki Iwanaga; 岩永　貞昭; Toshiyuki Miyata; 敏行宮田; Hiroshi Nakajima; 浩中島; Seiji Kimura; 木村　省二
Original assignee: Taiyo Fishery Co Ltd
Current assignee: Maruha Nichiro Corp
Priority date: 1988-08-18
Filing date: 1988-08-18
Publication date: 1990-02-22
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: JP2641742B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野］本発明は、北米産カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　匹打餅
ｅｍｕｓ）から抽出、単離した抗菌作用を有する新規ペ
プチド及びその塩、並びにこれらを含有して成る抗菌剤
に関するものである。

［従来の技術］近年、有用な生理活性物質としてペプチド類が注目され
ている。プロティンエンジニアリングの発展に伴って、
従来の天然型のペプチド類のみならず、合成タイプのペ
プチド類の開発研究も積極的に進められており、有用な
ペプチド類の開発は、これまで医薬の分野を中心にかな
りの実績をあげている。

抗菌作用を有するペプチド類の開発も、従来かなり積極
的に行われており、これまで、比較的低分子のオリゴペ
プチド類を中心として数多くの報告がなされている。例
えば、ダラム陽性菌及びダラム陰性菌に対して抗菌作用
を有するホスホノトリペプチド類（特開昭５７−１０６
６８９）、ホスホノジペプチド誘導体（特開昭５８−１
３５９４）　、環状ペプチド誘導体（特開昭５８−２１
３７４４）、抗菌剤及び抗ウィルス剤として有用な１０
個のアミノ酸配列から成る新規ペプチド（特開昭５９−
５１２４７）、酵母類に対する抗菌剤として有用なポリ
ペプチド（特開昭６Ｏ−１３０５９９）、ダラム陽性菌
に対する抗菌剤として有用な糖ペプチド誘導体（特開昭
６０−１７２９９８）　、新規グリコペプチド誘導体（
特開昭６１−２５１６９９　、特開昭６３−４４５９８
）、ダラム陽性菌に対して有用なオリゴペプチド（特開
昭６２−２２７９８）　、ペプチド系抗生物質（特開昭
６２５１６９７、特開昭６３−１７８９７）等、多数報
告されている。

〔発明が解決しようとしている課題〕

しかしながら、従来技術の中には、必ずしも実用化に到
らず、基礎研究の域を出ないものも少なからず散見され
、ペプチド系の抗菌剤の開発がいまだ発展途上にあるこ
とが理解されるが、いずれにしても、優れた抗菌作用を
有し、抗菌剤として実用化し得る新規ペプチド類を開発
することは、ペプチド類の新しい応用領域を確立する上
できわめて重要なことと思われる。

〔課題を解決するための手段］このような見地から、本発明者らは、有用な新規ペプチ
ド類を種々探索した結果、北米産カブトガニ（Ｌ　ｉ　
ｍ　ｕ　ｌ　ｕ　ｓ　匹廿仙且旦）の血球中より抽出、
単離したペプチドが、強力な抗菌作用を有することを見
い出して本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の（１）　−’　（２）に記
載する技術的事項を含有するものとして認識される。

１）次の構造式（１）（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に結合してい
る。Ａｒｇ　　ＮｌＩ２は、アルギニンのカルボキシル
基がアミドであることを示す。）で表されるペプチド、
及びその塩。

２）次の構造式（Ｉ）（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に結合してい
る。八ｒｇ−ＮＩＩ２は、アルギニンのカルボキシル基
がアミドであることを示す。）で表されるペプチド、及
びその塩を有効成分とする抗菌剤。

このように、本発明は、強力な抗菌作用を有する新規ペ
プチド、及びその塩を提供すると共に、それらを有効成
分とする抗菌剤を提供することを目的とするものである
。

なお、この明細書においてこの新規ペプチドをポリフェ
ムシンＩ　（Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎ　Ｉ　）と称す
る。また、この明細書において、アミノ酸につき、ＩＵ
ＰＡＣＩＵＢ　ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに基づく略号
で表示する場合があるが、それらを例示すると次の通り
である。

Ａｒｇ：アルギニン、Ｔｒｐ：　）リプトファン、Ｃｙ
ｓ：１／２シスチン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｖａ
ｌ：バリン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙニゲリシン、Ｌ
ｙｓ　：リジン本発明の新規ポリフエムシン■は、１８
個のアミノ酸より構成され、その第４位と第１７位、及
び第８位と第１３位に存在する各システィン分子対間“
のジスルフィド結合により架橋された二環構造を有する
。また、Ｃ末端に存在するアルギニンは、そのカルボキ
シル基がアミド化（−ＣＯＮＩＩ２）され、アルギニン
アミドとして存在している。本発明のポリフエムシンＩ
は、塩の形をとることができ、例えば、アルカリ金属塩
、アルカリ土類金属塩アンモニウム塩、有機アミン塩等
の無機塩基、有機塩基との塩、及び、トリフルオロ酢酸
、メタンスルホン酸、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸等の有機
酸又は無機酸の付加塩が含まれる。

本発明の新規ポリフェムシン■及びその塩は、以下の方
法によって製造することができる。

すなわち、北米産カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ匹往餅堕
旦）の血球に、塩化ナトリウム及びベンズアミジン塩酸
塩を含むトリス塩酸緩衝液を加え粉砕し、これを遠心し
て沈澱物を得る。これに塩酸溶液を加え粉砕し、遠心し
て上澄を得る。これを５ｌｈａｄｅｘ＠Ｇ−５０に添加
して、塩酸溶液で溶出する。２８０ｎｍにおける吸光度
を測定して集めた溶出区分を、コスモシール［Ｆ］５０
１８に添加しアセトニトリルの濃度を変化させたトリフ
ルオロ酢酸溶液で溶出することにより、目的のポリフェ
ムシンＩ両分を得る。

また、本発明のポリフェムシンＩは、固相法による合成
も可能である。この方法を本発明に適用する場合、α−
アミノ基はいずれのアミノ酸についてもｔｅｒｔ−ブチ
ルオキシカルボニル基（Ｂｏｃｉ）で保護し、チロシン
の水酸基は、２．６−ジクロロベンジルｊＪ（Ｃ１ｚ−
Ｂｚｌ基）で、アルギニンのグアニジノ基はトシル基（
Ｔｏｓ基）で、それぞれ保護するのが好適である。まず
、Ｃ末端アミノ酸のアルギニンの保護誘導体をクロロメ
チル樹脂に導入し、以後順次アミノ酸鎖を延長し、保護
ペプチド樹脂を合成し、これをフッ化水素で処理するこ
とにより保護ペプチドを樹脂から切断し、同時に脱保護
し、これを還元し、以下、常法に従って合成ペプチドを
得る。得られた粗合成ペプチドは、ゲル濾過、逆相ＨＰ
ＬＣ等ペプチドの精製に常用される手段により精製し高
純度のポリフエムシンＩを得る。

なお、ペプチド合成に常用される固相法については、例
えば、日本生化学会場、「生化学実験講座（■）」蛋白
質の化学、４巻、２０８〜４９５頁、（ｌ＠東京化学同
人発行（１９７７）、及び、泉屋信夫ほか著、「ペプチ
ド合成」丸善■発行（１９７５）に記載されているメリ
フィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）等の方法に準じ
て行うことができる。

本発明のポリフエムシンＩの毒性は、極めて低いか又は
非毒性である。このポリフェムシンＩを医療用抗菌剤と
して投与する場合は経口投与法又は非経口的投与方法、
すなわち静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が好まし
い。そして、１投与単位当りのポリフェムシン■の使用
量は１００〜１０００■程度である。更に、本発明のポ
リフエムシンＩは医療用抗菌剤以外に防腐剤、抗生物質
、塗料用防腐剤として有効に使用することができる。

［発明の効果］本発明のポリフエムシンＩは、後記参考例に示すように
、例えば、グラム陽性細菌、ダラム陰性細菌及び真菌類
に対して強い抗菌作用を示し、これら細菌の抑制剤とし
て有用である。具体的には、医療用抗菌剤、防腐剤、抗
生物質、塗料用防腐剤等、広汎な分野で利用することが
可能であり、これらは、いずれも本発明の抗菌剤の範囲
に包含されることはいうまでもない。

（実施例］以下、本発明の実施例を記載して、さらに本発明の詳細
な説明する。

実施例１（１）ポリフエムシンＩの製造北米産カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ匹旦餅弘且）血ｈｉ
　３７　ｇに５０ｍＭ塩化ナトリウム及び５ｍＭベンズ
アミジン塩酸塩を含む２０ＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（
ｐｌ！８．０）１００ｍｌを加え粉砕し、４°Ｃで遠心
（７５００ｒｐｍ。

４０分）して沈澱を得た。さらにこの操作を２回くりか
えし沈澱を得た。得られた沈澱に２０ｍＭ塩酸溶液１０
０ｄを加え粉砕する。４°Ｃで遠心（７５００ｒｐｍ　
４０分）して上澄を得た。沈澱には２０ｒｔＭ塩酸溶液
１００ｄを加え再度粉砕し、４°ｃで遠心（７５００ｒ
ｐｍ　４０分）して上澄を得た。さらに２回同様の操作
を行い上澄を得た。得られた上澄は集め凍結乾燥した。

上記の凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶液に溶解し、４°Ｃ
で遠心（１２，００Ｏｒｐｍ　１５分）して上澄を得た
。

これを５ｅｐｈａｄｅｘ　＠　Ｇ−５０（ファルマシア
社製）カラム（３Ｘ８５ｃｍ）に添加し、２０ｍＭ塩酸
溶液で溶出した。これを１０　ｍｌづつ分画しながら同
時に２８０ｎｍにおける吸光度を測り、分画番号６６−
８７の両分を集め、これを凍結乾燥した。（第１図参照
）。

この凍結乾燥物を２０ｍＭ塩酸溶液１０ｍ１に溶解しコ
スモシール０５Ｃ＋ｅ（牛丼化学薬品社製）カラム（１
０Ｘ　２５０ｍｍ）に添加し、アセトニトリルの濃度を
２２〜３０２に変化させた０、１χトリフルオロ酢酸溶
液で溶出した。この溶出曲線を第２図に示す。このカラ
１、庖２８〜３０χアセトニトリル°で？容出し、得ら
れる溶出区分を集め凍結乾燥することにより本発明のポ
リフィムシンＩを得た。収量は２０ｍｇであった。

このポリフェムシンＩの赤外線吸収スペクトルは第３図
の通りであり、３，３００．１６５０．１５４０．１４
２０．１２４０、及び７４０　ｃｍ−’に吸収がある。

また、紫外吸収スペクトルは第４図の通りである。この
ポリフェムシンＩのアミノ酸組成は第１表の通りである
。

第　　１　　表（２）構造決定本物質の構造は以下の如くして決定された。

即ち、ジチオトレイトールを用いジスルフィド結合を切
断し、４−ビニルピリジンでピリジルエチル化したサン
プルを６Ｎ塩酸を用い加水分解しアミノ酸組成を決定し
た。また、このサンプルを気相シークエンサーを用いて
１７回のエドマン分解に附し、Ｎ末端のアルギニンから
１７番目のシスティンに至るアミノ酸の種類と結合の順
序を決定した。また、アミノエチル化したサンプルをリ
シルエンドペプチダーゼ処理してＣ末端残基を遊離させ
て得られた生成物のフェニルチオカルバミル誘導体の逆
相高速液体クロマトグラフィー上での溶出時間は、別に
合成したフェニルチオカルバミルアルギニンアミドのそ
れと一致した。さらに質量分析結果もＣ末端をアルギニ
ンアミドとした質量数を示したのでＣ末端はアルギニン
アミドであると決定した。

実施例２ポリフェムシンＩの製剤化本発明のポリフェムシン■活性成分を含む経口又は非経
口投与用の製剤例を以下に示す。

（１）　２００ｍｇ錠剤ポリフェムシンＩ　　　　　　　２００ｍｇコーンスタ
ーチ　　　　　　　　４０＋ｎｇラクトース　　　　　
　　　　　　９８ｍｇステアリン酸マグネシウム　　　
８　ｍｇタルク　　　　　　　　　　　　　４■（２）
　１００ｍｇ注射用アンプル（ｑ、ｓ、ｐアンプル）ポ
リフェムシンＩ　　　　　　　　１００ｍｇ注射用蕉留
水　　　　　　　　　適量（３）　５００ｍｇカプセルポリフェムシン１　　　　　　５００ｍｇラクトース　
　　　　　　　　　　５０■ステアリン酸マグネシウム
　　　５　ｍｇ（４）　５００ｍｇ錠剤ポリフェムシンＩ　　　　　　　５００ｍｇコーンスタ
ーチ　　　　　　　　１０ｍｚポリビニルピロリドン　
　　　　３５ｍｇラクトース　　　　　　　　　　　７
４ｍｇステアリン酸マグネシウム　　　１４ｍｇタルク
　　　　　　　　　　　　７ｍｇ以下に、本発明のベプ
チドボリフエムシンＩの抗菌活性について検討した結果
を参考例として示す。

参考例（＋）グラム陽性細菌、ダラム陰性細菌に対する抗菌性
試験 ■実験材料Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ　ＡＴ
ＣＣ２５Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＩＡ
Ｍ　１０６９培地　：牛心臓侵出液　　　２５０ｇカザミノ酸　　　　　１５ｇＩ、−トリプトファン　０．０５ｇ精製水　　　　　　１０１００Ｏ ■実験方法害菌をＮｕｔｒｉｅｎｔ　ＢｒｏｔｈＯ（Ｄ汀ｉｃｏ社
製）培地で２０時間振とう培養後、菌の濃度を６６０ｎ
ｍの吸光度が約０．３になるように調整し、その０．１
ｍρを上記培地に加えたものを供試菌液とした。本物質
凍結乾燥品３００μｇを精製水１２ｍ２に溶解し２５０
　μｇ／ｄの溶液を得る。これを原液として２倍階段希
釈を行い１２．５．６．２５．３．１３．１．５６μｇ
／ｍｌの試料液を得た。

滅菌した試験管に各濃度の試料液を１　ｍｌずつ分注し
これに各菌液１戒ずつを加え混合し３７°Ｃで２０時間
培養し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。対照は試料液
のかわりに精製水を用い、本物質の各画に対する最小化
成育阻害濃度を決定した。その結果を第２表に示す。

（木頁以下余白）第２表Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｂ工ｌμ扛暉」鉦妊均１ｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｎｒｅｕｓ　ＡＴＣＣ２５９２３３，１３６，２５（２）真菌類に対する抗菌性試験 ■実験材料供試菌：顛近」山比隠Ｐｓｎｉｃｉｌｌｉｕｍ培地　：ポリペプトン麦芽エキスブドウ糖寒天精製水１１匹ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ１ｇ０ｇ０ｇ０ｇ０００ｍ１ ■実験方法本物質の凍結乾燥品５００１１ｇを２　ｍｌの精製水に
溶き２５０　μｇ／ｄの試料液を得た。これを二倍階段
希釈し１２５．６２．５．３１．３ｕｇ／ｍｌの試料液
を作成した。

上記培地９雁に各濃度の試料液を１　ｍｉずつ加え、こ
れを５　ｒｒｒｌずつ滅菌した試験管に分注し斜面培地
を作成した。この斜面培地上に上記菌の分生子を付着さ
せた白金耳で直線をひき、３０’Ｃで４８時間培養し、
その生育を調べた。その結果を第２表に示す。

酸溶液抽出物の溶出曲線を示す図、第２図はコスモシー
ル■５ＣＩｌｌカラムにおける０、１％トリフルオロ酢
酸溶液の溶出曲線を示す図、第３図はポリフェムシンＩ
の赤外吸収スペクトルの図、第４図はポリフェムシンＩ
の紫外吸収スペクトルを示す図である。

第３表

Claims

【特許請求の範囲】１）次の構造式（ I ）【遺伝子配列があります】（式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）で表されるペプチド及びその塩。２）次の構造式（ I ）【遺伝子配列があります】（式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
直接に結合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）で表されるペプチド又はその塩を有効成分とする抗菌剤
。