RU2064935C1 - Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью - Google Patents

Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью Download PDF

Info

Publication number
RU2064935C1
RU2064935C1 RU93046493A RU93046493A RU2064935C1 RU 2064935 C1 RU2064935 C1 RU 2064935C1 RU 93046493 A RU93046493 A RU 93046493A RU 93046493 A RU93046493 A RU 93046493A RU 2064935 C1 RU2064935 C1 RU 2064935C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
peptide
hexapeptide
lymphocytes
val
effect
Prior art date
Application number
RU93046493A
Other languages
English (en)
Other versions
RU93046493A (ru
Inventor
Р.В. Петров
А.А. Михайлова
Л.А. Фонина
С.А. Гурьянов
Л.А. Стрелков
Ж.Д. Беспалова
А.А. Азьмуко
Original Assignee
Михайлова Августа Алексеевна
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Михайлова Августа Алексеевна filed Critical Михайлова Августа Алексеевна
Priority to RU93046493A priority Critical patent/RU2064935C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2064935C1 publication Critical patent/RU2064935C1/ru
Publication of RU93046493A publication Critical patent/RU93046493A/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Использование: в медицине, а именно в онкологии, для создания препарата, применяемого в противоопухолевой терапии. Сущность изобретения: продукт, гексапептид формулы OHC-Leu-Va1-Va1-Tyr-Pro-Trp, C42H57N7O9. Указанный гексапептид отменяет токсический эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов, стимулирует продукцию эндогенных медиаторов /интерлейкина-2/ Т-лимфоцитами, нетоксичен. Гексапептид получают твердофазным методом, наращивая пептидную цепь по N-концу. Формилирование пептида после его снятия со смолы и деблокирования осуществляют муравьиной кислотой. Полученный пептид очищают обращенно-фазовой хроматографией. 3 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для создания препарата, применяемого в противоопухолевой терапии.
Известно, что опухолевые клетки независимо от их природы выделяют вещества, угнетающие или нарушающие нормальное функционирование имунной системы [1] Показано, например, что характерная для острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) дисфункция Т-лимфоцитов связана с супрессивным действием на них продуктов лейкозных клеток [2] Введение в организм известных медиаторов иммунной системы (интерферонов, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов), являющихся естественными продуктами иммунокомпетентных клеток, оказывает в ряде случаев выраженный противоопухолевый эффект [3] Указанные цитокины являются полипептидами с молекулярной массой 15 70 кДа. Их получают биотехнологическим, генно-инженерным способом. Введение в организм больного этих сравнительно крупных молекул (обычно используют интерлейкин-2) в лечебных дозах вызывает, как правило, тяжелые побочные эффекты [4] Поскольку терапевтическое, противоопухолевое действие большинства цитокинов основано на восполнении их активности в организме опухоленосителей, положительный эффект от их использования носит кратковременный, обратимый характер и для его поддержания требуется многократное введение препарата, что повышает вероятность неблагоприятного, порой летального исхода. Необходимо еще учесть, что время полужизни большинства цитокинов в организме составляет минуты и для достижения лечебного эффекта также требуется увеличение вводимых доз препарата, особенно, если необходим повторный курс лечения (для большинства онкологических больных этот курс, как правило, необходим).
Ближайшим аналогом по строению к заявленному соединению является гексапептид формулы I (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp), оказывающий модулирующее влияние на болевую чувствительность [5] Противоопухолевая его активность не известна.
Цель изобретения новое низкомолекулярное соединение, обладающее противоопухолевой активностью.
Поставленная цель достигается новым гексапептидом формулы II (OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp), отменяющим токсический эффект опухолевых клеток на функциональную активность Т-лимфоцитов.
Заявляемое соединение предлагается назвать бивалфором.
По сравнению с известным медиатором иммунитета интерлейкином-2, обладающим подобным эффектом [2] заявленный гексапептид имеет низкий молекулярный вес (927 Да). Он способен стимулировать продукцию эндогенных медиаторов (интерлейкина-2) Т-лимфоцитами. Наличие на N-конце пептида формильной группы повышает его устойчивость к действию аминопептидаз, что может обеспечить пролонгированный эффект. Все эти свойства дают возможность вводить его в малых дозах по сравнению с интерлейкином-2 и избежать нежелательных тяжелых побочных эффектов, сопровождающих лечение интерлейкином-2. Кроме того, синтетический способ изготовления гексапептида значительно дешевле генно-инженерного способа получения рекомбинантного интерлейкина-2, используемого в клинике.
Описываемый гексапептид, получают твердофазным методом, наращивая пептидную цепь по N-концу. Формилирование пептида после его снятия со смолы и деблокирования осуществляли муравьиной кислотой. Полученный пептид очищали обращенно-фазовой хроматографией.
Пример 1. Синтез бивалфора OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp.
Синтез пептида проводили на автоматическом синтезаторе пептидов Biosearch 9600 (США) на РАС-смоле, используя Fmoc/DIPCDI-метод по стандартной программе c FID, прилагаемой к прибору. Конденсацию Fmoc-аминокислот проводили карбодиимидным методом, для подавления рацемизации добавляли эквимолярные количества 1-оксибенэтриазола. Остаток тирозина вводили в виде его о-трет-бутилового эфира. Стартовую аминокислоту триптофан присоединяли к 10 г РАС-полимера в количестве 0,155 г (0,76 ммоль) аминокислоты на 1 г полимера. Далее Trp-полимер обрабатывали 0,4 М растворами соответствующих защищенных аминокислот, содержащими примерно 7-кратный избыток защищенной аминокислоты с диизопропилкарбодиимида. Отщепление Fmoc-группы после конденсации проводили смесью пиперидин толуол диметилформамида (30 35 35). После окончания синтеза пептид отщепляли от смолы трифторуксусной кислотой, содержащей 2,5 этандиола и 2,5 воды при охлаждении льдом в течение 1,5 ч. Полученный пептид выделяли и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Диасорб-130 С-16 Т, 10 мкм, размером (26 х 250 мм) в градиенте ацетонитрила в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0 и обессоливали на той же колонке. После лиофилизации получали 0,2 г (30) белого аморфного порошка, гомогенного по данным ВЭЖХ. Аналитическую хроматографию проводили на колонке Ультрасфера ODS-3 в градиенте ацетонитрила (20 80) в 0,05 М фосфатном буфере рН 3,0, детекцию осуществляли при 220 нм. Аминокислотный анализ кислого гидролизата (6 N HCl, 20 ч) показал наличие следующих аминокислот: Leu 1 (0,95) Val 2 (1,87), Tyr 1 (1,03), Pro 1 (0,96).
Далее 1 мг полученного пептида растворяли в 0,5 мл 98 муравьиной кислоты, добавляли 0,25 мл уксусного ангидрида и выдерживали 30 мин при 18oC. Раствор упаривали при комнатной температуре и очищали высокоэффективной хроматографией на колонке Ультрасфера С-18 ODS (4,6 х 250) в градиенте ацетонитрила (5 60) в 0,1 трифторуксусной кислоте. Получали 0,5 мг (47) формилированного пептида.
Пример 2. Способность синтетического гексапептида бивалфора восстанавливать активность Т-лимфоцитов, угнетенную опухолевыми клетками человека.
Известно, что опухолевые клетки больных ОМЛ, а также клетки линии HL-60, ведущей происхождение от лейкозных клеток костного мозга этих больных, продуцирующих белки, угнетающие функции Т-лимфоцитов, что выражается в резком снижении их способности отвечать пролиферацией на воздействие митогена (фитогемагглютинина, ФГА) [2]
Свежевыделенные Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров в концентрации 1•106 клеток/мл стимулировали к пролиферации ФГА (3 мкг/мл). В конце 3 суток инкубации Т-лимфоцитов с митогеном в инкубационную смесь вводили 3Н-тимидин (2 мкКи/ммоль), по включению которого в ДНК Т-лимфоцитов судили об их пролиферативной активности, и выдерживали 4 ч. Если в данную инкубационную смесь в начале инкубирования добавить 10 кондиционной среды (КС) от лейкозных клеток HL-60, то уровень пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на ФГА снижается в среднем на 50 по сравнению с контролем (100 инкубация без КС HL-60 (табл. 1). Как показано в работе [2] такая супрессия Т-лимфоцитов человека, вызванная действием на них продуктов лейкозных клеток, сопровождается резким спадом продукции Т-лимфоцитами интерлейкина-2 и возможно других лимфокинов.
Установлено, что предлагаемый гексапептид бивалфор способен восстанавливать редуцированный ФГА-ответ Т-лимфоцитов до нормального уровня (табл. 1).
Важно отметить, что способность бивалфора восстанавливать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов обнаруживала четкую дозовую зависимость в интервале концентраций от 1 до 100 мкг/мл. Дозы пептида, меньшие 1 мкг/мл, не обладали этой способностью.
Пример 3. Способность синтетического гексапептида бивалфора усиливать продукцию интерлейкина-2.
С целью выявления влияния бивалфора на продукцию интерлейкина-2 была использована модель продукции IL-2 клетками селезенки мыши, активированными конкановалином А (Кон К). К свежевыделенным клеткам селезенки мышей (СВАхС57BL)F1 в концентрации 5•106 клеток/мл добавляли Кон А (5 мкг/мл) и исследуемый пептид в концентрации 0,001 мкг/мл. Клетки инкубировали при 37oC во влажной атмосфере, содержащей 5 СО2, в течение 36 ч. После этого в надосадочной жидкости определяли содержащие IL-2 по способности поддерживать пролиферативную активность IL-2-зависимой клеточной линии цитотоксических Т-лимфоцитов CTLL-2. Для этого в лунки 96-луночного пластикового планшета помещали суспензию клеток CTLL-2 (1•104 клеток в 100 мкл) и триплетами добавляли тестируемый материал так, чтобы в конечном объеме 200 мкл его объемные концентрации составляли 1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64 и 1/128. В контрольные лунки добавляли супернатант Кон А стимулированных спленоцитов, культивированных без пептидов.
Пролиферативный ответ клеток оценивали колориметрическим методом по степени восстановления краски МТТ до формазона [6] Для этого за 4 ч до окончания культивирования в каждую лунку добавляли 20 мкл краски МТТ с концентрацией 5 мг/мл. По окончании инкубации планшеты центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли из лунок, осадок растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида при непрерывном встряхивании в течение 15 мин. Оптическую плотность содержимого лунок измеряли на приборе Multiscan при длине волны 540 нм. По полученным данным строили кривые зависимости оптической плотности от log2 серии разведений исследуемых супернатантов с использованием пакета программ обработки экспериментальных данных Statgraf и определяли степень разведения супернатанта, обеспечивающую 50 -ный пролиферативный ответ. Данная величина считалась показателем количества IL-2, присутствующего в супернатанте. В таблице 2 приведены величины IL-2 продукции Кон А стимулированными спленоцитами мыши при добавлении бивалфора по сравнению с его продукцией в контроле без добавления пептида.
Из данных таблицы 2 следует, что синтетический пептид бивалфор усиливает продукцию IL-2 стимулированными Кон А спленоцитами в 1,5 раза.
Таким образом, гексапептид бивалфор обладает способностью отменять ингибирующее действие продуктов лейкозных клеток HL-60 на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов человека, что может быть связано с его стимулирующим эффектом на продукцию IL-2 Т-лимфоцитами.
Пример 4. Изучение токсичности гексапептида бивалфор.
Бивалфор вводили подопытным мышам (СВАхС57BL)F1 внутрибрюшинно в терапевтических дозах (исходя из эффективных доз используемых в клинике тимусных пептидов) и в дозах, в 30 раз превышающих таковые (0,5 4 мг/кг и 120 мг/кг соответственно). Введение были одно-, двух- и пятикратные с интервалами 0,96 и 24 ч. Выживаемость животных оценивали на 10-й день после окончания курса введения бивалфора. Результаты опыта представлены в таблице 3.
Из данных таблицы следует, что синтетический пептид бивалфор, введенный животным в терапевтических зонах, а также в дозе, в 30 раз превышающей терапевтическую, практически не вызывает их гибели.

Claims (1)

  1. Гексапептид формулы OHC-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, обладающий противоопухолевой активностью.
RU93046493A 1993-09-30 1993-09-30 Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью RU2064935C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93046493A RU2064935C1 (ru) 1993-09-30 1993-09-30 Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU93046493A RU2064935C1 (ru) 1993-09-30 1993-09-30 Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2064935C1 true RU2064935C1 (ru) 1996-08-10
RU93046493A RU93046493A (ru) 1996-09-10

Family

ID=20147925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU93046493A RU2064935C1 (ru) 1993-09-30 1993-09-30 Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2064935C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053626A1 (fr) * 1999-03-11 2000-09-14 Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni Akademikov M.M.Shemyakina I Ju.A.Ovchinnikova Rossiiskoi A Kademii Nauk Peptide ayant une activite antitumorale, protectrice et de normalisation, et composition pharmaceutique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Miescher S., Whiteside T.L., Carrel S., Eliedner V. J.Immunol.- 1986, v.136, N 5, p.1899 - 1907. 2. Chiao J.W., Heil M., Arlin Z., Lutton J.D., Choi Y.S., Leung K. Proc.Natl.Acad.Sci.- 1986, v.83, p.3432 - 3446. 3. Mule J.J., Rosenberg S.A. Immune. Responses to Metastases.- 1987, v.11, N 2, p.69 - 94. 4. Fridman W.H., Michon J. Leukemia Res.- 1990, v.14, N 8, p.675 - 677. 5. Фонина Л.А., Гурьянов С.А., Назимов И.В. и др. ДАН, 1991, N 319, с. 755 - 757. 6. Mosmann T.J.Immunol. Methods.- 1986, 65, p.55 - 63. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000053626A1 (fr) * 1999-03-11 2000-09-14 Institut Bioorganicheskoi Khimii Imeni Akademikov M.M.Shemyakina I Ju.A.Ovchinnikova Rossiiskoi A Kademii Nauk Peptide ayant une activite antitumorale, protectrice et de normalisation, et composition pharmaceutique

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2409988B1 (en) Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins
RU2060998C1 (ru) Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента
HU211958A9 (en) Modified polypeptide
US5736519A (en) Peptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the peptide
Scher et al. Dissociation of cell division stimulating capacity for Balb/c-3T3 from the insulin-like activity in human serum
KR101176890B1 (ko) 단백질 결합 메토트렉사트 유도체 및 상기 유도체를 포함하는 약제
US8372406B2 (en) Antitumoral and antiviral peptides
DE69108392T2 (de) Zusammensetzung zur aktivierung der makrophagen.
US5114926A (en) Tetrapeptide inhibiting the entry into cycle of hemopoietic stem cells processes for its preparation, and its uses
US20040110678A1 (en) Novel drug delivery system
RU2064935C1 (ru) Гексапептид(бивалфор), обладающий противоопухолевой активностью
RU2141337C1 (ru) Соединения на основе реакции амадори, их применение, способ получения и составы на их основе
Soma et al. Biological Activities of Novel Recombinant Tumor Necrosis Factor Having N-Terminal: Amino Acid Sequences Derived from Cytotoxic Factors Produced by THP-1 Cells
US8080522B2 (en) Polyethlene glycol modifications of thymosin alpha-1
WIECZOREK et al. The immunomodulatory diversity of the proteins of the transforming growth factor β (TGFβ) family
JPS62126199A (ja) ペプチドおよび該ペプチドを含有する医薬組成物
NZ199752A (en) Glycoproteins and immunoactive compositions
RU2136695C1 (ru) Сывороточный гликопротеин, обладающий биологической активностью в сверхмалых дозах
RU2067870C1 (ru) Противоопухолевое средство
RU2283663C1 (ru) Иммуномодулятор с противоопухолевой активностью и лекарственное средство на его основе
US4524026A (en) Novel proteinous cancer-cell proliferation inhibitory factors
LV10109B (en) New oligopeptides selectively inhibiting haemopoietic stem cells, pharmaceutical composition on their base and method for preparing thereof
KR102163568B1 (ko) 지방산 항균펩타이드 및 이를 함유하는 항균 조성물
US5656601A (en) Acylated splenopentins, methods for their synthesis and their use
RU2136308C1 (ru) Стимулятор роста костно-мозговых клеток человека