RU2060998C1 - Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента - Google Patents
Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента Download PDFInfo
- Publication number
- RU2060998C1 RU2060998C1 SU894743132A SU4743132A RU2060998C1 RU 2060998 C1 RU2060998 C1 RU 2060998C1 SU 894743132 A SU894743132 A SU 894743132A SU 4743132 A SU4743132 A SU 4743132A RU 2060998 C1 RU2060998 C1 RU 2060998C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- valine
- proline
- arginine
- peptide
- alanine
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/66—Thymopoietins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: в медицине. Сущность пептиды ф-лы 1: R - Arg - X - Y - Z - R1, где R= водород, ацетил, формил; X= пролин; Y= L - Ala, L - Asp, L - Val; Z= L - Val, L - Ala; R1= H, OH, NH2, NH(CH3), NHCH(CH3)2, при определенных буквенных значениях и способы их получения или твердофазным способом с использованием в качестве подложки полимера или сополимера, включающего целлюлозу, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, полистирол и полистиролдивинилбензол, или в растворе путем постадийного или блочного присоединения аминокислот или пептидных фрагментов, содержащихся в ф-ле 1, а также иммуномодулирующая композиция, содержащая в качестве активного начала по крайней мере один пептид ф-лы 1 в эффективном количестве. 5 с. и 5 з. п. ф-лы, 8 ил, 5 табл.
Description
Изобретение относится к синтетическим пептидам, способным стимулировать активность хелперов Т-клеток. Более конкретно, пептиды, полученные предлагаемым способом, представляют собой тетрапептиды, основанные на молекуле тиспленина.
Природные иммуномодулирующие протеины, тимопоиэтин и тиспленин (ранее называвшийся "спленин") были выделены из вилочковой железы и селезенки (соответственно бычьей и человечьей).
К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных подобным протеинам и синтезированным пептидам. В патенте США N 4190646 описан пентапептид тимопентин, который представляет собой зону активности (сайт) тимопоиэтина и содержит последовательность аминокислот аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин-тирозин, а также пептидные композиции, в которых различные группы замещены на амино и/или карбоксильные окончания указанного пентапептида. Как тимопоиэтин, так и тимопентин вызывают биологические изменения в двух линиях Т-клеток человека, GEM и MOL Т-4, что указывает на их роль в стимулировании биологической активности Т-клеток. Было обнаружено, что ни один из аналогов тимопентина, более коротких чем пентапептиды (т.е. пептиды, содержание 5 аминокислот в последовательности), не обладает активностью по отношению к GEM-клеткам.
В патенте США N 4428938 описаны некоторые пептиды, влияющие на иммунорегулирование. В число указанных пептидов входят перечисленные ниже тетрапептиды:
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин,
аргинин-лизин-аспарагин-валин,
аргинин-лизин-аланин-валин,
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-аланин,
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-изолейцин,
аргинин-лизин-глютаминовая кислота-валин,
пироглютамил-аргинин-лизин-аспара- гиновая кислота.
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин,
аргинин-лизин-аспарагин-валин,
аргинин-лизин-аланин-валин,
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-аланин,
аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-изолейцин,
аргинин-лизин-глютаминовая кислота-валин,
пироглютамил-аргинин-лизин-аспара- гиновая кислота.
Указанный патент включает также соли, амиды, сложные эфиры низших алкилов и защищенные производные указанных последовательностей, а также способы использования указанных последовательностей для лечения иммунологических нарушений, вызванных недостаточностями, связанными с функционированием тимуса (вилочковой железы). Согласно указанному патенту данные пептиды испытывались на наличие активности в проводимом in vitro Е-розеточном тесте.
Те же авторы сообщили о синтезе подобных тетрапептидов в работе Кисфалуди с сотр. Noppe-Seyler's L. Physid. Сhem. B. D. 364, с. 933-940 (1983). В этой работе сообщается, что последовательность аргинин-аланин-аспарагиновая кислота-валин является очень активным аналогом в проводимом in vitro Е-розеточном тесте и что последовательности аргинин-аланин-аспарагиновая кислота-валин и аргинин-лизин-аланин-валин значительно уменьшают активность.
Согласно имеющемуся уровню техники имеется необходимость в дополнительных пептидах, которые обладают способностью стимулировать деятельность иммунной системы у человека в условиях различных случаев недостаточности Т-клеток.
В настоящем изобретении описан ряд аналогов пептида тиспленина, обладающих биологической активностью по отношению к MOL Т-4 линии клеток. В отличие от описанного выше тимопентина и его аналогов данные аналоги пептидов содержат менее 5 аминокислот, обладая при этом действием, аналогичным тиспленину, т. е. проявляя активность по отношению к хелперам Т-клеток MOL Т-4, также как это имеет место в случае пентапептидных аналогов тиспленина.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к новым тетрапептидам, отвечающим следующей общей формуле
R-аргинин-Х-Y-Z-R1, где R водород, ацетил, формил;
Х пролин;
Y L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из аланина, аспарагиновой кислоты;
Z L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из валина или аланина,
R1 водород, гидроксил или группа NH2, NH(CН3), NHCH(CН3)2.
R-аргинин-Х-Y-Z-R1, где R водород, ацетил, формил;
Х пролин;
Y L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из аланина, аспарагиновой кислоты;
Z L-аминокислота, принадлежащая к ряду, состоящему из валина или аланина,
R1 водород, гидроксил или группа NH2, NH(CН3), NHCH(CН3)2.
Указанные пептиды и содержащие их композиции неожиданно проявляют биологическую активность, свойственную человеческому тиспленину. Большое число указанных пептидов также отличается улучшенной способностью противостоять воздействию эндо- и экзопептидаз и трипсиноподобных ферментов в пищеварительном тракте и сыворотке. Таким образом, указанные пептиды обладают значительными преимуществами при лечении иммунной недостаточности. В частности, тетрапептиды согласно настоящему изобретению, для которых Х представляют собой пролин или α -метилаланин, обладают неожиданной способностью противостоять разложению ферментами, например пептидазами сыворотки.
Еще один аспект настоящего изобретения включает способы получения пептидов и терапевтические композиции, содержащие указанные пептиды, а также способы использования указанных пептидов для лечения различных заболеваний, связанных с необходимостью иммунорегулирования.
Прочие аспекты и преимущества настоящего изобретения приведены далее.
На фиг.1 приведена иллюстрация циклического образования GMP в MOL Т-4 в виде графика в координатных осях: концентрация пептида (мкг/мл)-уровень циклического GMP (пг/мл); приводится также сравнение активности тимопентина (ТР-5) и пептидов согласно изобретению по отношению к контрольным образцам; на фиг.2 приведена графическая иллюстрация для циклического GMP в координатах: концентрация пептида (мкл/мл) уровень циклического GMP (пг/мл); приводится также сравнение активности тимопентина (ТР-5) и пептида ацетил-аргинин-пролин-валин-аланин-NH2 cогласно настоящему изобретению.
Пептиды согласно настоящему изобретению в общем случае могут быть получены согласно известным способам. Удобно проводить синтез полипептидов согласно изобретению в соответствии со способом синтеза в твердой фазе, описанным Меррифилдом в J.А.С.S. 85, 2149-2154 (1963). Этот способ получил широкое распространение и является общим способом получения пептидов.
Синтез в твердой фазе осуществляют путем эстерификации Z-аминокислоты, защищенной по своей аминогруппе, с нерастворимым полимером смолы с образованием ковалентных связей; у части Z-аминокислоты удаляют аминозащитную группу, проводят реакцию с Y-аминокислотой, защищенной по своим аминогруппам, с присоединением Y-аминокислоты к Z-смоле, удаляют α -аминозащитную группу из части Y-аминокислоты, производят реакцию с Х-аминокислотой, защищенной по своей аминогруппе, с присоединением Х-аминокислоты к Y-Z-смоле, удаляют аминозащитную группу из части Х-аминокислоты, производят реакцию с W-аминокислотой (аргинином), защищенной по своей аминогруппе, с присоединением W-аминокислоты к Х-Y-Z-смоле, удаляют аминозащитную группу у части W-аминокислоты; производят реакцию с N-R-замещенной V-аминокислотой, защищенной по своим аминогруппам, с присоединением N-R-замещенной V-аминокислоты к W-Х-Y-Z-смоле, расщепляют смолу и пептид при помощи кислоты (R1=OН), аммония (R1-NH3) или соответствующего амина и удаляют все защитные группы.
Аминокислоты могут быть присоединены к любому подходящему полимеру в виде смолы. Смола должна содержать функциональную группу, через которую первая защищенная аминокислота может быть прочно присоединена посредством ковалентной связи. Для этой цели подходят различные полимеры, например целлюлоза, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат и полистирол. В число подходящих защитных групп, которые могут использоваться в такого рода синтезах, входят трет-бутоксикарбонильная (ВОС), бензильная (BZL), трет-амилоксикарбонильная (АOC), тозильная (ТОЗ), о-бромфенилметоксикарбонильная (BrBz), 2,6-дихлорбензильная (BzLCl2) и фенилметоксикарбонильная (или СВ). Дополнительные примеры защитных групп приведены в указанном выше источнике, а также в книге Дж. Ф. В.Мак-Оми Защитные группы в органическом синтезе. Нью-Йорк, Пленум Пресс, 1973.
Общий способ получения пептидов согласно настоящему изобретению включает первоначальное присоединение защищенной С-терминальной аминокислоты к смоле. После указанного присоединения смолу фильтруют, промывают и удаляют защитную группу с альфа-аминогруппы С-терминальной аминокислоты. Удаление указанной защитной группы должно естественно протекать без разрыва связи между указанной аминокислотой и смолой. К полученному на смоле пептиду присоединяют предпоследнюю С-терминальную защищенную аминокислоту. Присоединение происходит в результате образования связи между свободной карбоксильной группой второй аминокислоты и аминогруппой первой аминокислоты, присоединенной к смоле. Подобная последовательность операций повторяется с последовательно присоединяемыми аминокислотами до тех пор, пока все аминокислоты не будут присоединены к смоле. Наконец защищенный пептид отщепляют от смолы и удаляют защитные группы, получая в результате целевой пептид. Методика отщепления, используемая для отделения пептида от смолы и для удаления защитных групп, известна специалистам в области синтеза пептидов приемом.
Кроме того, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием стандартного способа синтеза пептидов в растворе, который включает либо постадийно, либо блочное присоединение аминокислот или фрагментов пептида с использованием химических или ферментативных способов образования амидной связи.
Было обнаружено, что пептиды согласно настоящему изобретению обладают биологической активностью, аналогичной человеческому тиспленину. Эта биологическая активность проявляется прежде всего при измерении степени индуцирования образования циклического GMP в MOL Т-4-линии человеческих Т-клеток в сравнении с человеческим тиспленином и человеческим тимопентином. Индуцирование образования циклического GMP пептидом согласно настоящему изобретению в этих опытах указывает на наличие у пептида способности связываться с рецепторной зоной (сайтом) человеческого тиспленина в клетке и вызывать появление биологической активности, аналогичной активности человеческого тиспленина.
Многие из тетрапептидов согласно изобретению обладают также дополнительными и значительными преимуществами по сравнению с человеческим тиспленином. Многие пептиды согласно настоящему изобретению отличаются резистентностью к ферментативному разложению ферментами, содержащимися в пищеварительном тракте или в сыворотке. В результате они обладают продолжительным полупериодом жизни in vivo при введении посредством инъекции биологическому объекту. Другим преимуществом многих из этих пептидов является возможность их перорального введения. Сам по себе человеческий тиспленин имеет слишком большую молекулу и должен перевариваться в пищеварительно-кишечном тракте.
До проведения испытаний пептидов согласно настоящему изобретению невозможно было предугадать, что могут быть получены аналоги человеческого тиспленина, обладающие такой же биологической специфичностью, поскольку последовательность аргинин-лизин-аланин-валинтирозин, которая является человеческим аналогом бычьего пентапептида SP=S (аргинин-лизин-глютаминовая кислота-валин-тирозин), является неактивной по отношению к клеткам MOL Т-4.
Таким образом, открытие тетрапептида, являющегося аналогом человеческого тиспленина и проявляющего активность, аналогичную биологической активности целой молекулы человеческого тиспленина, является неожиданным.
Вследствие иммуномодуляторных характеристик пептидов согласно настоящему изобретению они являются полезными с терапевтической точки зрения средствами для лечения человека и, возможно, животных, поскольку у них имеется способность индуцировать дифференциирование и созревание Т-клеток, которые способны к вовлечению в процессы иммунного отклика организма. В результате пептиды согласно настоящему изобретению можно рассматривать в качестве средств, предназначенных для многих вариантов терапевтического использования.
Пептиды согласно настоящему изобретению можно рассматривать в качестве средств, способствующих созданию иммунитета тела пациента, поскольку они увеличивают или способствуют терапевтическому стимулированию клеточного иммунитета. Следовательно, они могут быть полезными при лечении заболеваний, которым свойственна хроническая инфекция, например инфекционных грибковых заболеваний или инфекций, связанных с микоплазмой, туберкулеза, проказы, острых и хронических вирусных инфекций и подобных им заболеваний.
Пептиды согласно настоящему изобретению или композиции, содержащие указанные пептиды или их соли кислот или оснований, могут использоваться во всех областях, в которых требуется достижение клеточного иммунитета, в особенности в тех случаях, когда имеет место иммунодефицит. Так, в тех случаях, когда существует избыточное продуцирование антител вследствие отсутствия баланса по Т-клеткам, пептиды согласно изобретению могут скорректировать это состояние посредством стимулирования функций Т-клеток. Таким образом, следует ожидать, что они могут найти использование в терапии при некоторых автоиммунных заболеваниях, при которых образуются нежелательные антитела, например в случае красной волчанки (эритемы), ревматических артритов и им подобных заболеваний.
В таком широком варианте применения пептиды согласно настоящему изобретению или содержащие их фармацевтические средства могут использоваться для регулирования иммунной системы пациента, человека или животного, который нуждается в подобном регулировании. Термин "регулирование", как он используется в описании настоящего изобретения, означает, что соединения согласно изобретению заставляют иммунную систему возвратиться из ненормального, болезненного состояния в нормальное, сбалансированное состояние. Хотя регулирование подобного типа может найти широкое применение для коррекции иммунологических дефицитов (например синдрома Ди-Джорджа), возможны также и другие варианты применения для корректировки условий, соответствующих избытку иммунологической активности (например, в случае автоиммунных заболеваний).
Следовательно, настоящее изобретение включает способы регуляции иммунной системы человека или животного при необходимости в данной регуляции, включающие введение указанному человеку или животному по меньшей мере одного из указанных пептидов в количестве, эффективном с точки зрения регуляции иммунной системы, а также фармацевтические композиции для осуществления указанных способов. Предпочтительно эффективное количество составляет от 1 мкг до 100 мг/кг массы тела.
Изобретение предусматривает также способ лечения состояний, имеющих место при относительном или полном иммунном дефиците иммунной системы пациента, в особенности с точки зрения функционирования хелперов Т-клеток; указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного с терапевтической точки зрения количества по меньшей мере одного из пептидов согласно настоящему изобретению.
В том смысле, в котором он употребляется в настоящем описании, термин "эффективное с терапевтической точки зрения количество" означает такое количество препарата, которое эффективно в отношении лечения указанных выше состояний. Настоящее изобретение предусматривает также способ индуцирования дифференциации и созревания Т-клеток, включающий введение пациенту эффективного с точки зрения указанного индуцирования количества по меньшей мере одного из пептидов согласно настоящему изобретению.
Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции, предназначенные для реализации этого способа. Для получения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению пептид согласно настоящему изобретению объединяют в качестве активного компонента с пригодным для фармацевтического применения носителем посредством тщательного смешивания в соответствии с обычными способами получения фармацевтических композиций. Носитель может находиться в самых различных формах, в зависимости от того способа, которым предусматривается введение препарата, например перорально, ректально, парэнтерально через нос или под язык.
При получении композиций в предпочтительной форме для перорального введения можно использовать любые обычные фармацевтические среды. В случае жидких композиций для перорального введения (например, суспензий, эликсиров и растворов) можно использовать среды, содержащие например воду, масла, спирты, отдушки, консерванты, красители и им подобные агенты. Такие носители как крахмал, сахар, разбавители, гранулирующие агенты, смазочные агенты, связующие агенты, дезинтегрирующие агенты и им подобные компоненты могут использоваться для получения твердых композиций для перорального применения (например, порошков, капсул и таблеток). Можно использовать также рецептуры для управляемого введения (рецептуры прологнированного действия). Вследствие легкости их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные формы дозировок для перорального способа введения; очевидно, что в этом случае используют твердые фармацевтические носители. При желании таблетки могут быть покрыты сахаром или другим растворяющимся в кишечнике покрытием в соответствии с известными способами.
В случае продуктов для парэнтерального способа введения носитель обычно представляет собой стерильную воду, хотя такие композиции могут включать также и другие компоненты, например, способствующие растворению или обладающие свойствами консервантов. Могут быть получены также суспензии для инъекций; в этом случае можно использовать соответствующие жидкие носители, суспендирующие агенты и им подобные средства.
Как уже упоминалось, тетрапептиды согласно настоящему изобретению обычно активны при введении их в количествах, превышающих 1 мкг/кг массы тела, предпочтительно примерно от 0,001 до примерно 10 мг/кг массы тела. В общем случае дозировки в таких же пределах могут использоваться для лечения заболеваний, при которых наблюдается иммунная недостаточность. Большие количества (например, в пределах от примерно 10 до 100 мг/кг массы тела пациента) могут использоваться для подавления избыточной иммунной активности.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение, не ограничивая при этом пределов его применения. В примерах и в описании под частями понимаются массовые части, если не указано обратного. В примерах использованы следующие сокращения: ТFA (ТФУК) трифторуксусная кислота, НОАс(УК) уксусная кислота, СН2Сl2 хлористый метилен, СН3СN ацетонитрил, (ДМФ) диметилформамид, Н4OAc ацетат аммония, NH4OН гидрат окиси аммония, н-PrOН н-пропанол, н-BuOН н-бутанол, pyr-пиридин, DCC (ДЦК) дициклогексилкарбодиимид, НOBt (ОБТ) 1-оксибензотриазол, DMAP (ДМАП) диметиламинопиридин, НF фтористый водород, ТСА (ТХУК)-трихлоруксусная кислота, ВНА (БГА) бензгидриламин и MeOН метанол.
П р и м е р 1. Синтез тетрапептида: ацетил-аргинин-пролин-аланин-валин-NH2.
Указанный выше тетрапептид синтезируют с использованием способа твердофазного синтеза при постадийном связывании. Все аминокислоты защищены по α -аминогруппе посредством трет-бутилоксикарбонильной группы. Тозил (ТОЗ) используются для защиты боковой цепи аргинина. Защищенные аминокислоты используются в избытке, соответствующем 2,5 эквивалента на I эквивалент замещения смолы. Все операции связывания осуществляют с использованием дициклогексилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола в равном эквивалентном количестве по отношению к защищенной аминокислоте. Все аминокислоты растворяют в хлористом метилене, за исключением аргинина, который растворяют в диметилформамиде.
Промывку, снятие защиты и связывание проводят постадийно, в соответствии со следующей схемой, мин: 1. Хлористый метилен 2 · 3 2. 50% Трифторуксусной кислоты хлористый метилен 1 · 3 3. 50% Трифторуксусной кис- лоты хлористый метилен 1 · 30 4. Хлористый метилен 1 · 3 5. 40% Изопропанола хло- ристый метилен 2 · 3 6. Хлористый метилен 2 · 3 7. 10% диизопропилэтила- мина 2 · 10 8. Хлористый метилен 1 · 3 9. Аминокислота 1 · 3 10. 1-Оксибензотриазол 1 · 3 11. Дициклогексилкарбодии- мид 1 · 120 12. Хлористый метилен 2 · 3 13. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 · 3 14. Диметилформамид 1 · 3 15. Хлористый метилен 2 · 3
а) Синтез.
а) Синтез.
Защищенный пептид синтезируют с использованием синтезатора пептидов фирмы "Бекман", модель 990. Получаемая в результате смола с тетрапептидом соответствует 0,67 мег/г; синтез начинают с 5,0 г (3,35 ммоль) смолы. Получаемый при этом тетрапептид ацетилируют в результате обработки смолы в соответствии с приведенной ниже процедурой, мин: 1. Хлористый метилен 2 · 3 2. 50% трифторуксусной кислоты хлористый метилен 1 · 3 3. 50% трифторуксусной кис- лоты хлористый метилен 1 · 30 4. Хлористый метилен 1 · 3 5. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 · 3 6. Хлористый метилен 2 · 3 7. 10% диизопропилэтилами- на 2 · 10 8. Хлористый метилен 1 · 3 9. 50% уксусного ангидрида хлористый метилен, с катали- тическим количеством димети- ламинопиридина 1 · 120 10. Хлористый метилен 2 · 3 11. 40% изопропанола хло- ристый метилен 2 · 3 12. Диметилформамид 1 · 3 13. Хлористый метилен 2 · 3
Содержащую пептид смолу сушат при пониженном давлении после промывки 2 порциями этанола по 50 мл.
Содержащую пептид смолу сушат при пониженном давлении после промывки 2 порциями этанола по 50 мл.
б) Расщепление НF.
Неочищенный тетрапептид получают в результате расщепления связи смола пептид посредством НF (25 мл) и анизола (25 мл) в течение 4 ч при 0оС. НF удаляют при пониженном давлении. К смеси добавляют 150 мл диэтилового эфира, раствор перемешивают и переводят в стеклянный фильтр, после чего промывают дополнительно 3 порциями по 100 мл диэтилового эфира. Пептид экстрагируют из смолы посредством 10% уксусной кислоты (3 · 100 мл), а водный раствор лиофилизируют, получая 1,20 г продукта.
в) Очистка.
Продукт очищают методом препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ПВЖХ) при следующих условиях: Колонка "Ватман", Партисил М-20 10/50 ODS-3, образцы по 300 мг, используется изократная система 15% ацетонитрила/0,01 М ацетата аммония (значение рН доводится до 5 посредством уксусной кислоты), скорость потока 15 мл/мин, длина волны, используемая для детектирования, 2120 нм. Все фракции, содержащие чистый продукт, собирают. Органический растворитель отгоняют и лиофилизируют водный раствор, получая в результате 258 мг белого твердого продукта.
Аминокислотный анализ: пролин 1,00, аланин 1,00, валин 1,00, аргинин 1,00, 83% пептида. Тонкослойная хроматография (двуокись кремния 60/Аналтек): Rf (I) 0,50 (бутанол: уксусная кислота: вода 3 1 1) Rf (II) 0,59 (бутанол: пиридин: уксусная кислота вода 4:1:1:2) Rf (III) 0,29 (бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1).
П р и м е р 2. Синтез тетрапептида: ацетил-аргинин-пролин-валин-аланин- Н
Тетрапептид получают с использованием пептидного синтезатора "Эпплайд Биосистемз-430А". Используют для этой цели стандартную циклическую процедуру I (вариант изготовления 1.40), посредством которой происходит связывание по одной аминокислоте единовременно, за исключением фрагмента трет-бутилоксикарбонил-тозил-аргинин, который связывается дважды. Для синтеза используют исходные продукты, приведенные в табл.1.
Тетрапептид получают с использованием пептидного синтезатора "Эпплайд Биосистемз-430А". Используют для этой цели стандартную циклическую процедуру I (вариант изготовления 1.40), посредством которой происходит связывание по одной аминокислоте единовременно, за исключением фрагмента трет-бутилоксикарбонил-тозил-аргинин, который связывается дважды. Для синтеза используют исходные продукты, приведенные в табл.1.
После того как трет-бутоксикарбонильные защитные группы аргинина удалены, а смола с пептидом подвергалась нейтрализации и промывке, соединение ацетилируют с использованием 10%-ного уксусного ангидрида в хлористом метилене (15 мл) в присутствии 4-диметиламинопиридина (20 мг). По истечении 60 мин пептид подвергают проверке на нингидринный тест, чтобы удостовериться в полноте ацетилирования. Смолу с пептидом промывают хлористым метиленом (3 порции по 15 мл) и сушат в вакууме (при комнатной температуре), получая 1,0 г продукта.
б) Расщепление НF:
Пептид отщепляют от смолы с использованием 10 мл НF в присутствии 1,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0оС в течение 1,5 ч, после чего НF удаляют при пониженном давлении. Смесь промывают диэтиловым эфиром (3 порции по 50 мл) и сушат на воздухе. Смесь смолы и пептида экстрагируют 25%-ным водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 50 мл).
Пептид отщепляют от смолы с использованием 10 мл НF в присутствии 1,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0оС в течение 1,5 ч, после чего НF удаляют при пониженном давлении. Смесь промывают диэтиловым эфиром (3 порции по 50 мл) и сушат на воздухе. Смесь смолы и пептида экстрагируют 25%-ным водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 50 мл).
в) Очистка.
Водный фильтрат лиофилизируют, получая 240 мг неочищенного продукта. Этот продукт пропускают через ионообменную смолу "Амберлит IRA-68 (ацетатная форма) в воде. Фракции, содержащие пептид, объединяют и лиофилизируют, получая 200 мг продукта.
Пептид подвергают очистке на колонке фирмы "Ватман", Партисил 20-М 10 ODS-3 (22 мм х 50 см) с использованием в качестве растворителей для элюирования 15% ацетонитрила (0,1% трифторуксусной кислоты) и 0,1%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты (скорость 10,0 мл/мин). За процессом элюирования наблюдают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответствующие фракции собирают, объединяют и отгоняют из их растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и лиофилизируют, повторяя процесс дважды, получая в результате 167 мг продукта с общим выходом 50%
Аминокислотный анализ: аргинин 1,04, пролин 1,02, валин 1,00, аналин 1,01, 72% пептида.
Аминокислотный анализ: аргинин 1,04, пролин 1,02, валин 1,00, аналин 1,01, 72% пептида.
Тонкослойная хроматография (пластинки с силикагелем CF-250 мкм):
Rf (I) 0,37 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1)
Rf (II) 0,15 (хлороформ: метанол: уксусная кислота 60:35:5)
Rf (III) 0,48 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1).
Rf (I) 0,37 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1)
Rf (II) 0,15 (хлороформ: метанол: уксусная кислота 60:35:5)
Rf (III) 0,48 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1).
П р и м е р 3. Синтез тетрапептида ацетил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH2.
а) Синтез.
Указанное соединение синтезируют с использованием стандартного способа синтеза в твердой фазе, применяя автоматический синтезатор фирмы "Бекман", модель 990. Синтез начинают с 5,0 г бензгидриламинной смолы (0,67 мэг/г). После завершения связывания трет-бутоксикарбонил-аргинин (тозила) трет-бутоксикарбонильную защитную группу удаляют посредством 50%-ной трифторуксусной кислоты в хлористом метилене и ацетилируют смолу с пептидом посредством 50% -ного уксусного ангидрида в хлористом метилене в присутствии каталитического количества диметиламинопиридина. Смолу с пептидом промывают этанолом (2 · 50 мл) и сушат при пониженном давлении в течение ночи перед осуществлением расщепления посредством НF. Сухая смесь смолы и пептида весит 6,5 г.
б) Расщепление НF.
Неочищенный тетрапептид получают посредством расщепления 6,5 г смеси смолы с пептидом с использованием 25 мл НF и 25 мл анизола при 0оС в течение 4 ч, HF отгоняют при пониженном давлении и добавляют диэтиловый эфир (150 мл) к по- лученной реакционной смеси. Неочищенный пептид в смеси со смолой переводят в стеклянный фильтр и промывают 3 порциями диэтилового эфира по 100 мл. Пептид экстрагируют 10% уксусной кислоты (2 · 100 мл) и полученный водный раствор лиофилизируют, получая 900 мг белого твердого вещества.
в) Очистка.
Неочищенный продукт (степень чистоты 98% по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) обессаливают на колонке Сефадекс LН-20 (100 г носителя, 2,5 · 89 см), используя 10% уксусной кислоты в качестве элюента. После лиофилизации продукт представляет собой снегоподобный белый твердый продукт весом 800 мг.
Аминокислотный анализ: аргинин f 0,99, валин f 1,00, пролин 1,05, аспарагиновая кислота 1,01.
Тонкослойная хроматография (двуокись кремния-60/"Мерк", 250 г):
RF (I) 0,51 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1)
RF (II) 0,60 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1)
Rf (III) 0,59 (н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода 4:1:1:2).
RF (I) 0,51 (н-бутанол: уксусная кислота: вода 3:1:1)
RF (II) 0,60 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: этилацетат 1:1:1:1)
Rf (III) 0,59 (н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода 4:1:1:2).
П р и м е р 4. Синтез N-α -формил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валина
а) Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил- β-бензил-аспаратил-валина.
а) Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил- β-бензил-аспаратил-валина.
3,23 г N-трет-бутилоксикарбонил-β -бензил-аспарагина и 3,97 г валин-бензилового эфира растворяют в 80 мл хлористого метилена. К раствору добавляют 1,74 мл диизопропилэтиламина и выдерживают раствор при 5оС. Затем к смеси добавляют 2,06 г дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при 5оС в течение 30 мин и затем еще 2 ч при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и экстрагируют фильтрат водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. После удаления растворителя получают масло, которое очищают методом хроматографирования на силикагеле-60 с применением смеси 97:3 хлористый метилен:хлороформ. Продукт в виде масла весит 3,46 г.
б) Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонил-пролил-β-бензил-аспаратил-валина.
После снятия защиты с 3,41 г указанного выше продукта посредством 60 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота в течение 30 мин получают соль (трифторацетат) в виде масла. Свободный амин получают нейтрализацией насыщенным водным раствором карбоната натрия с экстракцией хлористым метиленом. Объем экстракта уменьшают посредством упаривания; затем к нему добавляют 1,05 г N-трет-бутилоксикарбонил-пролина. К смеси затем последовательно добавляют раствор 0,73 г 1-оксибензотриазола в 2 мл диметилформамида и 0,99 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают в течение 2,5 ч, после чего фильтруют. Фильтрат экстрагируют водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и дважды насыщенным раствором бикарбоната натрия. После сушки растворитель удаляют, получая масло. Продукт подвергают очистке хроматографированием на силикагеле-60 с использованием смеси 9:1 хлористый метилен:ацетонитрил. Фракции, содержащие основной компонент, дают 2,31 г бесцветного масла. ИК-спектр 1740, 1695 и 1675 см-1.
в) Бензиловый эфир N-α -формил-N2-нитроаргинилпролил-β -бензил-аспаратил-валина.
К 2,23 г полученного ранее продукта добавляют 60 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого метилена 1:2. Раствор перемешивают в течение 30 мин, после чего растворитель удаляют при пониженном давлении, получая в остатке воскообразный твердый продукт, который промывают петролейным эфиром. В 15 мл диметилформамида растворяют 0,72 г N-α -формил-N2-нитроаргинина и 0,33 мл N-метилморфолина. Раствор охлаждают до -20оС и добавляют к нему по каплям 0,40 г изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивают при температуре от -20 до -10оС в течение 20 мин, после чего добавляют охлажденный раствор бензилового эфира пролил-β -бензил-аспартил-валина (трифторацетат) в 20 мл диметилформамида и 0,33 мл N-метилморфолина. Смесь перемешивают при -15оС в течение 20 мин, после чего баню для охлаждения убирают и продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 2 ч. Большую часть растворителя удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 50 мл хлористого метилена и экстрагируют водой, 10%-ным раствором лимонной кислоты и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат и отгоняют растворитель, по- лучая в результате 2,08 г продукта.
Тонкослойная хроматография (силикагель GF):
Rf (I) 0,56 (хлористый метилен: метанол= 9:1).
Rf (I) 0,56 (хлористый метилен: метанол= 9:1).
Rf (II) 0,72 (хлороформ: метанол: уксусная кислота 8:1:1).
г) N-α -формил-аргинил-пролил-аспартил-валин.
Защиту снимают посредством гидрогенизации с передачей с использованием 30 мл 5% -ной муравьиной кислоты-формиата аммония на палладии. Реакционную смесь перемешивают в колбе, помещенной в баллон, в течение 18 ч. После фильтрования смеси через Целит растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и лиофилизируют. Продукт подвергают очистке на колонке с ДЭАЭ-Сефадекс, 1,6 · 60 см. Элюирование начинают с использованием 0,02 М раствора бикарбоната аммония (рН 8,5), собирая фракции по 150 капель. После отбора 52 фракций начинают использовать градиентный раствор от 0,02 до 0,2 М бикарбоната аммония (более 2 л). Самый большой пик на хроматограмме элюированного продукта соответствует фракции 88. Фракции 75-100 объединяют и лиофилизируют, получая аморфное твердое вещество. Данные высокоэффективной жидкостной хроматографии: время удерживания 9,4 мин при 10% метанола 0,01 н. раствор ацетата аммония, рН 5 при скорости 1,5 мл/мин на колонке Бондпак-C18.
Тонкослойная хроматография (силикагель-60):
Rf (I) 0,16 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: 3:1:1).
Rf (I) 0,16 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: 3:1:1).
Rf (II) 0,27 (н-бутанол: уксусная кислота: вода: пиридин: 15:3:12:10).
Rf (III) 0,42 (этилацетат: пиридин: уксусная кислота: вода 5:5:1:3).
Аминокислотный анализ: аспарагин 0,99, пролин 0,97, валин 1,05, аргинин 1,00, 38% пептида.
П р и м е р 5. Синтез аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-изопропиламида.
В 40 мл хлористого метилена растворяют 2,25 г трет-бутоксикарбонил-пролин-(бензил) аспарагиновая кислота-валина. Раствор охлаждают в ледяной бане и добавляют 0,67 г 1-оксибензотриазола и 0,90 г дициклогексилкарбодиимида в 4 мл диметилформамида. После перемешивания в течение 10 мин добавляют раствор 0,30 г изопропиламина в 5 мл хлористого метилена. Смесь перемешивают на ледяной бане в течение 15 мин, а затем оставляют для нагрева до комнатной температуры. Через 3 ч осадок отфильтровывают. Фильтрат экстрагируют 10%-ным раствором лимонной кислоты, водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой высушивают на сульфате магния и удаляют растворитель при пониженном давлении. В результате получают грязно-белое твердое вещество весом 2,32 г. При кристаллизации из этилацетата -i- Pr2O получают 1,64 г вещества, имеющего температуру плавления 179,5-181,5оС.
К 0,84 г указанного выше вещества добавляют 50 мл 40%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. Раствор перемешивают в течение 30 мин, затем растворитель удаляют при пониженном давлении. К оставшемуся веществу добавляют диэтиловый эфир и получают твердое вещество трифторацетат пролин-(бензил) аспарагиновая кислота-валин-изопропиламида.
В 10 мл диметилформамида растворяют 0,93 г трет-бутилоксикарбонил-аргинина. Этот раствор охлаждают до -20оС и добавляют 0,18 мл N-метилморфолина, а затем 0,22 г изобутилхлорформиата. Смесь перемешивают при -15оС в течение 20 мин, затем добавляют 0,18 мл N-метилморфолина и охлажденный раствор вышеуказанной соли трифторацетата в 10 мл диметилформамида. Через 30 мин удаляют охлаждающую баню и продолжают перемешивание в течение 2 ч. Большую часть растворителя удаляют при пониженном давлении. К оставшемуся веществу добавляют этилацетат и воду. Слои разделяют и экстрагируют органический слой раствором лимонной кислоты и дважды насыщенным раствором бикарбоната натрия. После удаления растворителя остается бесцветное стекловидное вещество весом 1,44 г. Очистку вещества производят с использованием смеси 98:2 хлористый метилен: метанол. При элюировании первым выделяют указанное в заголовке вещество; выход чистой фракции составляет 0,53 г, а также получают 0,32 г вещества с небольшим содержанием примесей.
0,53 г очищенного защищенного тетрапептидамида гидрогенизируют 1 мл муравьиной кислоты в 20 мл метанола на палладиевой черни. Через 1 ч смесь фильтруют через Целит и промывают водой. Метанол удаляют при пониженном давлении. Осадок растворяют в воде и лиофилизируют с получением 280 г вещества. Очистку полученного вещества производят методом хроматографирования на SP-Сефадексе, элюирование производят ацетатом аммония 0,30 М, рН 5. Фракции, попадающие в центр основного пика, собирают и лиофилизируют с получением 190 мг аморфного твердого вещества аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-изопропиламида.
Аминокислотный анализ: аспарагиновая кислота 1,01; пролин 1,03; валин 0,97; аргинин 1,00; 96% пептида.
Тонкослойная хроматография (силикагель-60):
Rf (I) 0,44 (н-бутанол:уксусная кислота: вода: пиридин 15:3:12:10).
Rf (I) 0,44 (н-бутанол:уксусная кислота: вода: пиридин 15:3:12:10).
Rf (II) 0,65 (этилацетат пиридин уксусная кислота вода 5:5:1:3).
Rf (III) 0,15 (н-бутанол уксусная кислота вода 3:1:1).
П р и м е р 6. Синтез аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-N-метиламида.
К перемешанному раствору трет-бутоксикарбонил-валина (10,86 г, 50,0 ммоль) и диизопропилэтиламина (8,70 мл, 1,0 экв.), метиламина НСl (3,38 г, 1,0 экв.) и 1-оксибензотриазола (7,66 г, 1,0 экв.) в 85 мл хлористого метилена и диметилформамида, взятых в соотношении 12:5, добавляют дициклогексилкарбодиамид (10,3 г, 50,0 ммоль). Образуется осадок. Через 2 ч осадок фильтруют и фильтрат выпаривают до сухого состояния. Маслообразный остаток растворяют в этилацетате и трижды промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой, 10% -ной лимонной кислотой и насыщенным солевым раствором. После высушивания на сульфата натрия органическую фазу фильтруют и выпаривают до получения бесцветного твердого вещества. Его растворяют в порошок в горячих гексанах и получают 7,98 г 69%-ного требуемого амида: трет-бутоксикарбонил-валин-метиламида с температурой плавления 120-122оС.
К полученному амиду (4,60 г, 20,0 ммоль) добавляют 20 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривают при температуре менее 30оС, растворяют маслообразный остаток в хлористом метилене, дважды промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу высушивают на сульфате натрия, фильтруют и выпаривают с получением 1,90 г 73%-ного валин-метиламида.
К перемешанному раствору трет-бутоксикарбонил-бензил-аспарагиновой кислоты (4,72 г, 14,6 ммоль), валин-метиламида (1,90 г, 14,6 ммоль), 1-оксибензотриазола (2,24 г, 1,0 экв.) в диметилформамиде (20 мл) добавляют дициклогексилкарбодиамид (3,01 г, 14,6 ммоль). Через 5 мин образуется осадок. Через 16 ч осадок отфильтровывают и фильтрат гасят полунасыщенным раствором бикарбоната натрия.
Полученные твердые вещества собирают, промывают водой, 10%-ной лимонной кислотой, водой и диэтиловым эфиром и высушивают на воздухе с получением бесцветного твердого вещества. Рекристаллизацией из этилацетата получают 5,85 г 92%-ного требуемого дипептидамида: трет-бутоксикарбонил-(бензил)аспарагиновая кислота-валин-метиламида.
К этому дипептидамиду (3,94 г, 9,05 ммоль) добавляют 20 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривают при температуре менее 30оС и растирают в порошок с диэтиловым эфиром, получая 4,10 г 100%-ного дипептида трифторуксусной кислоты в виде бесцветного стекловидного вещества.
К перемешанному раствору трет-бутоксикарбонил-пролина (1,95 г, 9,05 ммоль), дипептида трифторуксусной кислоты (4,10 г, 9,05 ммоль), диизопропилэтиламина (1,73 мл, 1,1 экв.), диметиламидопиридина (0,12 г, 0,1 экв.) в диметилформамиде (20 мл) добавляют дициклогексилкарбодиамид (1,87 г, 9,05 ммоль). Через 5 мин образуется осадок. Через 16 ч продукты реакции фильтруют и фильтрат гасят полунасыщенным раствором бикарбоната натрия. Полученное твердое вещество собирают, промывают водой, 10%-ной лимонной кислотой, водой и диэтиловым эфиром и сушат на воздухе с получением 4,15 г 86%-ного трипептидамида. Его применяют без очистки.
К этому амиду (4,15 г, 7,78 ммоль) добавляют 15 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене. После перемешивания в течение 30 мин раствор выпаривают при температуре менее 30оС и растирают в порошок с диэтиловым эфиром, выход составляет 4,25 г 100%-ного трипептида трифторуксусной кислоты в виде бесцветного твердого вещества.
К перемешанному 86,9% -ному раствору АОС-тозил-аргинина (39,7 г, 7,78 ммоль), этого трипептидамида (4,25 г, 7,78 ммоль), N-метилморфолина (0,86 мл, 1,1 экв. ) и 1-оксибензотриазола (1,19 г, 1,0 экв.) в диметилформамиде (15 мл) добавляют дициклогексилкарбодиамид (1,61 г, 7,78 ммоль). Через 10 мин образуется осадок. Через 16 ч продукты реакции отфильтровывают и фильтрат гасят полунасыщенным раствором бикарбоната натрия.
Полученное твердое вещество собирают, промывают водой, 10%-ной лимонной кислотой, водой, эфиром и высушивают на воздухе с получением 4,82 г 72%-ного защищенного тетрапептидамида.
У половины этого твердого вещества снимают защиту в 10 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 30 мин, выпаривают при пониженном давлении и растирают в порошок с диэтиловым эфиром. Полученное твердое вещество расщепляют при помощи смеси 30 мл НF и 8 мл анизола в течение 60 мин при 0оС. Из осадка приготовляют суспензию в этилацетате и дважды экстрагируют с 50 мл 10%-ной уксусной кислоты. Водные экстракты лиофилизируют с получением неочищенного аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-метиламида.
Очистку сырого пептида производят на Сефадексе SPO-25 (колонка 2,6 83 см, от 0,05 до 0,3 М ацетата аммония, рН 6,5, градиент: скорость потока 100 мл/ч, фракции по 9,5 мл, детектирование на длине волны 206 нм). Фракции 113-128 объединяют и лиофилизируют с получением 925 мг тетрапептидамида аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-метиламида.
Аминокислотный анализ: аргинин 1,06; пролин 0,99; аспарагиновая кислота 0,95; валин 1,00; содержание пептида 54%
Тонкослойная хроматография (силикагель G, 250 мкм):
Rf (I) 0,20 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:5).
Тонкослойная хроматография (силикагель G, 250 мкм):
Rf (I) 0,20 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:5).
Rf (II) 0,26 (н-бутанол уксусная кислота вода пиридин 15:3:12:10).
Rf (III) 0,26 (этилацетат уксусная кислота вода пиридин 5:1:3:5).
П р и м е р 7. Синтез N-формил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-метиламида.
К АОС-(тозил)-аргинин-пролин-(бензил)-аспарагиновая кислота-валин-метиламиду (1,00 г, 1,17 ммоль) добавляют 4,5 М диоксана НСl (10 мл). Через 60 мин продукт реакции выпаривают, растворяют в воде и лиофилизируют с получением 0,92 г 100%-ного тетрапептида НСl в виде бесцветного порошкообразного твердого вещества.
Это твердое вещество растворяют в диметилформамиде (10 мл) и диизопропилэтиламине (0,93 мл, 4,0 экв.), добавляют диметиламинопиридин (0,08 г) и р-нитрофенилформиат (200 мг, 1,02 экв.). Через 2 ч производят кислотную очистку смеси реакции 10%-ной лимонной кислотой. Полученное в результате реакции твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе с получением 0,41 г формилового пептидамида.
Это твердое вещество расщепляют смесью 30 мл НF и 8 мл анизола в течение 60 мин при 0оС. Из осадка приготовляют суспензию в этилацетате и дважды экстрагируют в 50 мл 1%-ного гидрата окиси аммония. Водные экстракты лиофилизируют и получают сырой пептид N-формил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-метиламид.
Этот сырой пептид подвергают очистке на DEAE-Сефадексе (колонка 2,6·90 см, 0,1 М гидрата окиси аммония без буферного раствора; скорость потока 100 мл/ч, фракции по 10 мл, детектирование на длине волны 206 нм). Фракции 38-43 объединяют и лиофилизируют с получением 80 мг амидного пептида.
Аминокислотный анализ: аргинин 1,00; пролин 1,00; аспарагиновая кислота 1,00; валин 1,00; содержание пептида 50%
Тонкослойная хроматография:
Rf (I) 0,32 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:5).
Тонкослойная хроматография:
Rf (I) 0,32 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:5).
Rf (II) 0,38 (этилацетат уксусная кислота вода пиридин 5:1:3:5).
Rf (III) 0,34 (трифторэтанол: гидрат окиси аммония 1:1).
П р и м е р 8. Синтез тетрапептида: ацетил-аргинин-пролин-валин- аланин-NH(CН3).
а) Синтез.
Тетрапептид получают с использованием синтезатора пептидов фирмы "Эпплайд Биосистемз" модели 430А. Для этого используют стандартную циклическую процедуру I (вариант изготовителя 1.40), посредством которой производят связывание по одной кислоте единовременно, за исключением трет-бутилоксикарбонилтозил-аргинина, который связывают дважды. Для синтеза используют исходные вещества, приведенные в табл.2.
После того как трет-бутоксикарбонильная группа аргинина удалена, а смола с пептидом подверглась нейтрализации и промывке соединение ацетилируют с использованием 10 мл 10%-ного раствора уксусного ангидрида в хлористом метилене с 4-диметиламинопиридином (15 мг). Смолу с пептидом промывают диметилформамидом (3 порции по 10 мл), а затем хлористым метиленом (3 порции по 10 мл) и сушат в вакууме, выход составляет 1,6 г вещества.
б) Расщепление с использованием НF.
Пептид отщепляют от смолы с использованием 30 мл НF в присутствии 1,5 мл анизола. Смесь перемешивают при 0оС в течение 1 ч и в течение 4 ч при температуре 23оС, после чего НF удаляют при пониженном давлении. Смесь промывают диэтиловым эфиром (3 порции по 50 мл) и высушивают на воздухе. Пептид экстрагируют из смолы 20%-ным водным раствором уксусной кислоты (3 порции по 50 мл).
в) Очистка.
Водный экстракт лиофилизируют и получают неочищенное твердое вещество. Это вещество пропускают через ионообменную смолу "Амберлит IR A 68" (ацетатная форма) в воде. Фракции, содержащие пептид, объединяют и лиофилизируют.
Этот пептид подвергают очистке на препаративной колонке с обратной фазой фирмы "Видак" модель 218ТР5022 С-18 с использованием градиентного раствора от 0 до 3,75% ацетонитрила в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты в течение 120 мин при скорости потока 14 мл/мин. Элюирование контролируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и соответствующие фракции объединяют и отгоняют из них растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл воды и лиофилизируют, в результате получают 218 мг чистого продукта.
Аминокислотный анализ: аргинин 1,00; пролин 0,98; валин 0,99; аланин 1,02; 68% пептида.
Тонкослойная хроматография (пластины силикагеля "Мерк"):
Rf (I) 0,31 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:1).
Rf (I) 0,31 (н-бутанол уксусная кислота вода 4:1:1).
Rf (II) 0,41 (н-бутанол уксусная кислота этилацетат вода 1:1:1:1).
Rf (III) 0,71 (н-бутанол пиридин уксусная кислота вода 5:4:4:2).
П р и м е р 9. Биологическая активность: опыт по циклическому GMP.
В результате этого опыта выясняется активность пептида согласно настоящему изобретению в отношении связывания рецепторов клеточных мембран неповрежденных клеток МOL Т-4 и в отношении селективного стимулирования продуцирования циклического GMP, что соответствует активности человеческого тиспленина и человеческого тимопентина.
Линию MOL Т-4 клеток получают из Американской коллекции типов культур, Роквилл, Мэриленд. Клетки MOL Т-4 высеивают заново и выращивают в течение 3 сут, используя способ культивирования, описанный Т.Аудья с сотр. Arch. Biochem. Biophys. 234, 167-177 (1984). Клетки трижды промывают в растворе фосфатного буфера и вновь переводят в суспензию в RPMI-1640 при концентрации 1,0 · 107 кл./мл, после чего уравновешивают при 37оС в течение 30 мин, вслед за чем добавляют к ним испытуемые тетрапептиды и пентапептиды (25 мкл) и контрольные пептиды. Инкубирование проводят в водяной бане при встряхивании в течение 4-5 мин и заканчивают в результате введения 1 мл охлажденной льдом трихлоруксусной кислоты (10%-ный раствор).
Клетки в трихлоруксусной кислоте гомогенизируют и обрабатывают ультразвуком для удаления циклических нуклеотидов. Суспензию центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин и температуре 4оС. Образующийся осадок растворяют в 0,1 н. растворе гидрата окиси натрия для определения содержания протеинов. Трихлоруксусную кислоту удаляют из верхней фракции посредством 4-кратного экстрагирования порциями по 5 мл насыщенного водой диэтилового эфира. После завершения экстракции остаточные следы эфира удаляют посредством нагревания в течение 10 мин в водяной бане при 50оС. После лиофилизирования образец вновь растворяют в 50 мМ ацетатного буфера (рН 6,2) для радиоиммунологического исследования на циклический GMP.
На фиг.1 приведены типичные кривые в координатах доза отклик, определенные в диапазоне от 1 до 1000 мкг/мл, полученные для активных пептидов ацетил-аргинин-пролин-β -D-аспарагиновая кислота-валин-NH2, аргинин-пролин-аланин-валин-тирозин и ацетил-аргинин-пролин-аланин-валин-NH2 в сравнении с тимопентином и неактивными пептидами ацетил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-пролин-NH2, аланин-лизин-аспарагиновая кислота-валин и лизин-лизин-аспарагиновая кислота-валин-NH2, для клеток MOL Т-4.
На фиг. 2 приведены кривые в координатах доза-отзыв, определенные в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл для активного пептида ацетил-аргинин-пролин-валин-аланин-NH2 в сравнении с тимопентином (для клеток MOL Т-4).
Пороговую активность определяют для каждого из исследованных пептидов. Пороговая активность определяется как самая низкая концентрация испытуемого пептида, которая вызывает появление внутриклеточного уровня циклического GMP, превышающего 2 стандартных отклонения для значения контрольного образца. Контрольные образцы имеют значения внутриклеточного циклического GMP менее 0,5 г моль/мл (среднее стандартное отклонение). Результаты теста рассматриваются как положительные в том случае, если уровень циклического GMP более чем в 2 раза превышает (превышает 2 стандартных отклонения) уровень, определенный для параллельного отрицательного контрольного образца.
Результаты по проведенным опытам на циклический GMB приведены на фиг.1 и в соответствующей ей таблице 3 и на фиг.2 и в соответствующей ей табл.4, в которых представители пептидов согласно настоящему изобретению испытывались в сравнении с тимопентином и контрольными пептидами. Полученные результаты сравниваются с результатами для тимопентина (аргинин-дизин-аспарагиновая кислота-валин-тирозин) на клетках MOL Т-4, поскольку пентапептид человеческого тиспленина SP-5 (аргинин-лизин-аланин-валин-тирозин) неактивен по отношению к клеткам MOL Т-4. Из результатов следует, что пептиды согласно настоящему изобретению проявляют биологическую активность при стимулировании активности хелперов Т-клеток в случае клеток MOL F-4.
Значения для нулевого контрольного пептидного образца лежат в пределах от 0 до 0,3 пг/мл.
П р и м е р 10. Устойчивость по отношению к действию ферментов.
Для иллюстрации устойчивости пептидов согласно настоящему изобретению по отношению к разложению ферментами, содержащимися в сыворотке и пищеварительном тракте, взятый в качестве примера пептид ацетил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH2 инкубируют при 37оС в желудочном соке крысы и человеческой сыворотке в течение 120 мин. Для сравнения аналогичной обработке подвергают тетрапептид арганин-лизин-аспарагиновая кислота-валин и тимопентин. Анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии показывает, что пептид аргинин-лизин-аспарагиновая кислота-валин полностью распадается по истечении 25 с. Тимопентин подвергается 50%-ному распаду в течение примерно 20 с. Пептид согласно настоящему изобретению остается практически нетронутым как в сыворотке, так и в желудочном соке в течение по меньшей мере 120 с.
П р и м е р 11. Биологическая активность: анализ на подавление опухоли.
Анализ проводится с использованием нормальных здоровых лабораторных мышей СЗН. В организм мышей (группы по 12-20 шт.) вводят путем подкожной инъекции либо 30 мг, либо 30 мкг пептида, отвечающего данному изобретению, один раз в неделю. Этот пептид (ацетил-Arg-Pro-Val-Alа-NH2), называемый спленоралином, вводят в цитратном буфере, содержащем 1% глицина и 2% пентагидрата-раффинозы. В организм мышей контрольной группы вводят путем аналогичной инъекции 30 мкг глицино-раффинозного носителя без пептида.
Через 4 недели после начала этих еженедельных инъекций каждую мышь инокулируют внутрикожно опухолевыми клетками мышей 5·10 ВР8, ВР8 является обычной индуцированной бензопиреном опухолью мышей. Затем раз в каждую неделю в организм каждой мыши вводят путем инъекции то же количество либо пептидной композиции, либо одного только носителя.
На фиг. 3 показано процентное количество мышей в каждой группе, которые проявляют отрицательную реакцию на присутствие ВР8 опухоли, в дни после инокулирования опухолевых клеток. На фиг.4 показан для того же самого эксперимента максимальный размер опухолей у тех мышей, у которых опухоли действительно проявляются.
Результаты этого эксперимента показывают, что ввод пептида, отвечающего настоящему изобретению, дает мышам возможность сопротивляться распространению и росту опухолевых клеток. Было показано, что у мышей, обработанных плацебо, обнаруживаются развитые ВР8 опухоли. Таким образом, обнаруживается, что пептид активирует иммунную систему животного, подавляя рост опухоли, показывая таким образом усиление активности Т-клеточного фага-помощника.
П р и м е р 12. Биологическая активность: анализ на подавление вируса.
Осуществляя анализ с использованием нормальных здоровых лабораторных мышей без родственного сваривания CDI), в мышей группами по 30 шт. сначала вводят путем подкожной инъекции летальную дозу 50 адаптированного мышами вируса гриппа А/HK/68. Через 2 дня после инфекционного заражения в организм каждой мыши вводят 0,03 мкг пептида, отвечающего данному изобретению, путем подкожной инъекции. Этот пептид (ацетил-Arg-Pro-Val-Alа-NH2), называемый спленоралином, вводят в рецептуре, описанной выше, содержащей глицин и раффинозу. В мышей контрольной группы вводят путем аналогичной инъекции 0,03 мкг глицино-раффинозного носителя без пептида.
В организм каждой мыши вводят ту же дозу либо пептида, либо одного лишь носителя пять раз в неделю.
Результаты данного анализа представлены на фиг.5, на котором показаны кривые зависимости общего процента смертности от числа дней после вирусного заражения. Данный график показывает, что те мыши, которые обработаны пептидом, отвечающим настоящему изобретению, имеют более низкую степень смертности через 12 дней, чем мыши, обработанные плацебо. Таким образом, данный пептид проявляет терапевтический или активирующий эффект на иммунную систему обработанных мышей, что дает возможность большему числу мышей сопротивляться вирусной инфекции.
П р и м е р 13. Биологическая активность: испытание на больных диабетом мышах.
Выведен штамм неожиревших (NOD), страдающих диабетом лабораторных мышей, находящихся в Nopital Necker, Париж, Франция. У самок самопроизвольно развивалось аутоиммунное заболевание поджелудочной железы. При обычном протекании данного заболевания мышей клетки поджелудочной железы разрушались, что приводило в результате к потере продуцирования инсулина и сахарному диабету. Таким образом, этот мышиный штамм является моделью, близкой к юношескому диабету типа I, который обычно лечится путем восполнения инсулина, но который обычно может замедляться посредством иммуноподавляющих лекарств, например циклоспорина.
В данном анализе в организм мышей самок NOD в группах по 1-12 шт. вводят путем инъекции 2 мг/мг массы тела пептида, отвечающего данному изобретению, один раз в неделю. Данный пептид (ацетил-Arg-Pro-Val-Alа-NH2), называемый спленоралином, вводят в указанной выше рецептуре, содержащей глицин и раффинозу. В организм мышей контрольной группы вводят путем аналогичной инъекции 1 мг глицино-раффинозного носителя без пептида один раз в неделю.
На фиг.6 показаны результаты данного лечения на кривых зависимости снижения диабета (в процентах) от возраста (в неделях) исследуемых мышей. Поразительно, что обработка пептидом, отвечающим данному изобретению, сохраняет иммунную функцию и обеспечивает выживание большего числа животных, чем обработка плацебо, что показывает положительный эффект, например стимуляцию или восстановление неполной клеточной функции суппрессора Т этих животных.
П р и м е р 14. Нейромышечный анализ.
Этот анализ измеряет способность пептида снижать холинергетическую трансмиссию нейромышечной функции. Известно, что тимопентин и тимопентин вызывают такое снижение нейромышечной трансмиссии.
Растворяют различные дозы испытуемого пептида в фосфатном буферном солевом растворе и вводят подкожно или орально самкам мышей, весящим 25-30 г (линия СДI). Проводят электромиографический анализ согласно Г.Гольдштейну с сотр. j. Neurosurg. Psychlat. 31, 453-459 (1968) через 24 или 48 ч после введения пептида. Мышей анестезируют 0,5 мл 10%-ного уретанового раствора. Нерв стимулируют Грасс S-48 стимулятором и Грасс SIU-5А, изолирующим стимул устройством (Грасс медикал инструментс, Квинси, МА), и регистрируют электромиографический отклик на Тектроникс накапливающем осциллоскопе-SIII, соединенном с 5А21N дифференциальным усилителем и 5В10N cчетчиком времени (Тектроникс, Бивертон, ОР).
При супрамаксимальной нервной стимуляции-30 импульсов в секунду высоту десятого потенциала мышечного действия выражают как процент от первого. Р-величины для определения статистической разницы между контрольными и испытуемыми соединениями вычислены с помощью двуразмерного t-теста Даннета. Результаты, полученные в нейромышечном анализе с испытуемым пептидом, сравнивают с результатами с тимопоетином и тимопентином, которые приведены в табл.5.
П р и м е р 15. Регулирование Анти-СД-3 cтимулированных Т-cупрессорных клеток.
Мыши: Cамки NZB х NZW FI мышей закуплены в Джексон Лабораториз (Бар Харбур, МЕ) и помещены в клетках размером с обувную коробку на подстилках, по пять животных в клетке, в IRI вивариуме. Пищи и воды дают вдоволь. Животных гуманно умерщвляют СО2 по завершении периода испытаний.
Испытания. Мышей обрабатывают испытуемыми пептидами перед умерщвлением по одному из двух протоколов обработки. В протоколе А мыши получают пептиды, растворенные в бактериостатической воде для инъекций (Эбботт) 1 мг/кг подкожно один раз в неделю в течение четырех недель, начиная с четырех недель по возрасту. В протоколе В семинедельным мышам делают четыре инъекции 1 мг/кг подкожно последовательно четыре дня. Всех животных умерщвляют для анализа активности Т-супрессорных клеток на следующий день после последней инъекции.
Селезеночный препарат.
Асептически удаляют селезенки, готовят суспензию единичных клеток для каждого индивидуального животного путем пропускания через сито 60 меш (Сигма) и суспендирования в среде для культуры ткани, содержащей RPMI 1640 c 25 мМ Гепес-буфера 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2% пирувата натрия, 1% NEN необязательных аминокислот, 1% α -глютамина (все из Гибко, Гранд Исленд, N.Y.), 1% β -меркаптоэтанола (Сигма, Сент, Луис, МО) и 0,05% гентамицина (Флоу, МакЛин, VА).
Анти-СДЗ генерированные супрессорные клетки.
Супрессорные клетки для пролиферативных ответов митоген стимулированных Т клеток генерируют в ячейках 35 мм с культурой ткани (Корнинг, Корнинг, N. Y.), покрытых анти-СДЗ (Клон 145-2СII, Боерингер Манхейм, Индианаполис, IN), разбавленным боратным буферным солевым раствором рН 8,5 при концентрации 0,5 нг/мл. Эти пластины инкубируют при комнатной температуре в течение 4 ч и три раза промывают сбалансированным солевым раствором Ханкса перед добавлением клеток. Добавляют 2 мл сплентоцитов от индивидуальных животных при 5·106 кл. /мл и культуры инкубируют в течение 48 ч в 5% СО2 при 37оС. Собирают стимулированные культуры и доводят количество клеток до 1,25·106 кл./мл добавлением культуры анализа на подавление при 25% от числа отвечающих клеток. Подавление пролиферации Т-клеток измерено в 48-часовых митоген-стимулированных культурах (0,25 нг/мл анти-СДЗ, Боерингер Маннхейм), содержащих 5·105 свежих сингенейных сплентоцитов и 1,25·105испытуемых клеток в трипликатных культурах в пластинах на 96 ячеек. Ячейки встряхивают в течение последних 7 ч с 1 нКю (3Н) тимидином (NEN Рисерч Продактс, Чаддс, Форд, ПА), собирают на фильтровальных пластинках (Фармациа, Турку, Финляндия) и подсчитывают на бетаплат-жидкостном сцинцилляционном счетчике ЛКБ 1205 (см.фиг.7).
П р и м е р 16. Мыши NZB х NZW FI: Тест на выживание и изучение протеинурии.
Мыши: самок NZB х NZW FI (BW) трехнедельного возраста закупают в Джексон Лабораториз (Бар Харбур, МЕ). Животных выдерживают на подстилках в клетках размером с обувную коробку по 5 мышей в клетке, им дают воду и питье вдоволь. После 1 недели карантинного периода животных помещают на изучение в одну из трех испытуемых групп; по 30 животных на группу (6 клеток). Контрольные животные остаются необработанными, а экспериментальные мыши получают IRI-780 1 мг/кг подкожно, растворенный в бактериостатической воде для инъекций (Эбботт). Обработку проводят один раз в неделю или три раза в неделю, начиная с 4-недельного возраста.
Контроль. Животных каждый день проверяют на выживание.
Тесты на протеинурию проводят ежемесячно в течение первых шести месяцев и еженедельно после того, как были отмечены начальные изменения.
У NZB х NZW FI мышей спонтанно развилось аутоиммунное заболевание, которое приводит к их преждевременной смерти от заболевания почек. Поскольку IRI-780 восстанавливает дефицит генерации супрессорных клеток, проявившийся у этих мышей, его периодически вводят чтобы определить, повлияет ли такая обработка на их аутоиммунное заболевание.
Результат. Хотя не имеется статистически значимой разницы между тремя группами относительно продолжительности жизни, имеется значительное (р 0,007) количество животных, обработанных IRI-780 (Ас-RPЕv-NH2) 3х1 неделю, у которых не развилась протенурия по сравнению с контрольной группой (см.фиг. 8). Это предполагает подавление аутоиммунного процесса, вызывающего заболевание почек, которое определяется протеинурией.
Claims (9)
1. Способ получения пептидов общей формулы I
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил, формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из ряда: аланин, аспарагиновая кислота, валин;
Z L-аминокислота, выбранная из ряда: валин, аланин;
R1 H, OH, NH2, NH(CH3), NHCH(CH3)2,
отличающаяся тем, что а) соответствующую аминокислоту, входящую в соединение формулы I, защищают по амино-гидрокси-, индолимидазольной группе; б) затем осуществляют этерификацию аминозащищенного пептилного фрагмента, содержащего C-концевую аминокислоту, со смолой, выбранной из группы, состоящей из полимера или сополимера, включающего целлюлозу, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, полистирол и полистиролдивинилбензол; c) удаляют защитную группу из полученного аминозащищенного соединения, d) к полученному продукту присоединяют следующую аминозащитную C-концевую аминокислоту или второй фрагмент пептида; e) удаляют защитную группу из полученного аминозащищенного пептидного производного; f) повторяют стадии (d) и (e) для остальных аминокислот соединения общей формулы I; g) отщепляют пептид от полученного пептидилполимера и в случае необходимости удаляют защитные группы.
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил, формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из ряда: аланин, аспарагиновая кислота, валин;
Z L-аминокислота, выбранная из ряда: валин, аланин;
R1 H, OH, NH2, NH(CH3), NHCH(CH3)2,
отличающаяся тем, что а) соответствующую аминокислоту, входящую в соединение формулы I, защищают по амино-гидрокси-, индолимидазольной группе; б) затем осуществляют этерификацию аминозащищенного пептилного фрагмента, содержащего C-концевую аминокислоту, со смолой, выбранной из группы, состоящей из полимера или сополимера, включающего целлюлозу, поливиниловый спирт, полиметилметакрилат, полистирол и полистиролдивинилбензол; c) удаляют защитную группу из полученного аминозащищенного соединения, d) к полученному продукту присоединяют следующую аминозащитную C-концевую аминокислоту или второй фрагмент пептида; e) удаляют защитную группу из полученного аминозащищенного пептидного производного; f) повторяют стадии (d) и (e) для остальных аминокислот соединения общей формулы I; g) отщепляют пептид от полученного пептидилполимера и в случае необходимости удаляют защитные группы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве защитных групп используют t-бутилоксикарбонил и тозил.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пептид выбирают из группы: формил-аргинин-пролин аспаргиновая кислота-валин-OH, ацетил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH2, ацетил-аргинин-пролин -валин-аланин-NH2, ацетил-аргинин -пролин-аланин-валин -NH2, аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NHCH(CH3)2, формил-аргинин-пролин-аспаргиновая кислота-валин-NH(CH3), ацетил-аргинин-пролин -валин-аланин-NH(CH3),
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептид представляет собой ацетил-аргинин-пролин -валин-аланин NH(CH3).
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что пептид представляет собой ацетил-аргинин-пролин -валин-аланин NH(CH3).
5. Способ получения пептидов общей формулы I
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил или формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из ряда: аланин, аспарагиновая кислота, валин;
Z L-аминокислота, выбранная из ряда: валин, аланин;
R1 H, OH, NH2, NH(H3)NHCH (CH3)2,
отличающийся тем, что в растворе проводят постадийное или блочное присоединение аминокислот или пептидных фрагментов, содержащихся в приведенной выше формуле, с образованием соответствующих амидных связей.
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил или формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из ряда: аланин, аспарагиновая кислота, валин;
Z L-аминокислота, выбранная из ряда: валин, аланин;
R1 H, OH, NH2, NH(H3)NHCH (CH3)2,
отличающийся тем, что в растворе проводят постадийное или блочное присоединение аминокислот или пептидных фрагментов, содержащихся в приведенной выше формуле, с образованием соответствующих амидных связей.
6. Пептиды общей формулы I
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил или формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из аланина, аспаргиновой кислоты или валина;
Z L-форма аминокислоты, выбранной из валина или аланина;
R1 H, OH, NH2, NH(CH3), NHCH(CH3)2.
R Arg X Y Z R1,
где R водород, ацетил или формил;
X пролин;
Y L-аминокислота, выбранная из аланина, аспаргиновой кислоты или валина;
Z L-форма аминокислоты, выбранной из валина или аланина;
R1 H, OH, NH2, NH(CH3), NHCH(CH3)2.
7. Пептиды по п.6, отличающиеся тем, что выбраны из группы: формил-аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-OH, ацетил-аргинин- пролин-аспарагиновая кислота -валин-NH2, ацетил-аргинин -пролин-аланин- валин-NH2, аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NACH(CH3)2, аргинин-пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH(CH3), ацетил-аргинин -пролин-аспарагиновая кислота-валин-NH(CH3), аргинин-пролин- валин-аланин-NH2, формил-аргинин -пролин-аспарагиновая кислота- валин-NH(CH3), ацетил-аргинин-пролин -валин-аланин-NH(CH3).
8. Иммуномодулирующая композиция, содержащая активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного начала по крайней мере один пептид формулы I по п.7 в эффективном количестве.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что она предназначена для орального введения, а эффективное количество пептида формулы I по п.7 составляет от 1 мкг до 100 мг/кг веса тела.
10. Способ регуляции недостаточной или избыточной функции Т-клеток у пациента путем введения пептида, отличающийся тем, что вводят пептид общей формулы I по п.7 в дозе от 1 мкг до 100 мг/кг веса тела.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US19613888A | 1988-05-19 | 1988-05-19 | |
US07/196138 | 1988-05-19 | ||
US26869288A | 1988-11-08 | 1988-11-08 | |
US07/268692 | 1988-11-08 | ||
PCT/US1989/001967 WO1989011289A1 (en) | 1988-05-19 | 1989-05-08 | Peptides having t cell helper activity |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2060998C1 true RU2060998C1 (ru) | 1996-05-27 |
Family
ID=26891685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894743132A RU2060998C1 (ru) | 1988-05-19 | 1989-05-08 | Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5298490A (ru) |
EP (3) | EP0602003A1 (ru) |
JP (1) | JPH03504013A (ru) |
KR (1) | KR900701296A (ru) |
CN (2) | CN1037711A (ru) |
AR (1) | AR246352A1 (ru) |
AT (1) | ATE124956T1 (ru) |
AU (1) | AU625598B2 (ru) |
BR (1) | BR8906988A (ru) |
DE (1) | DE68923401T2 (ru) |
DK (1) | DK14890D0 (ru) |
ES (1) | ES2075050T3 (ru) |
FI (1) | FI94350C (ru) |
GR (1) | GR3017451T3 (ru) |
HU (1) | HU205142B (ru) |
IE (1) | IE62555B1 (ru) |
IL (1) | IL90229A (ru) |
NZ (1) | NZ229004A (ru) |
PT (1) | PT90596B (ru) |
RU (1) | RU2060998C1 (ru) |
WO (1) | WO1989011289A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA010575B1 (ru) * | 2006-05-30 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Пептид, обладающий иммуногеропротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения |
Families Citing this family (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU201095B (en) * | 1988-06-14 | 1990-09-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | New peptides inhibiting the activity of the immune system and pharmaceutical compositions comprising same, as well as process for producing these peptides and compositions |
JPH03502930A (ja) * | 1988-09-30 | 1991-07-04 | イミユノバイオロジー・リサーチ・インスチチユート・インコーポレーテツド | T細胞のサプレツサー活性を有するペプチド |
US5332726A (en) * | 1989-09-29 | 1994-07-26 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Antithrombotic peptides and pseudopeptides |
US5053392A (en) * | 1989-12-01 | 1991-10-01 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Novel arginine, glycine, aspartic acid derivatives as platelet-aggregation inhibitors |
DD292382B5 (de) * | 1990-03-06 | 1994-03-24 | Berlin Chemie Ag | Verfahren zur herstellung eines parenteral applizierbaren lagerbestaendigen immunstimulierenden praeparats |
DE4011207A1 (de) * | 1990-04-06 | 1991-10-10 | Stiefel Thomas | Humane splenopentinderivate und verfahren zu deren herstellung |
JPH06507402A (ja) * | 1991-03-20 | 1994-08-25 | ワーナー−ランバート・コンパニー | 治療活性を有するα−置換ポリペプチド |
WO1993004080A1 (en) * | 1991-08-26 | 1993-03-04 | Japan Tobacco Inc. | Pseudopentapeptides with immunomodulating activity |
US5554638A (en) * | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Duke University | Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders |
US5612310A (en) * | 1993-05-24 | 1997-03-18 | Duke University | Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders |
US5639729A (en) * | 1993-08-26 | 1997-06-17 | Immunobiology Research Institute, Inc. | Tripeptides useful in immune and CNS therapy |
GB9425582D0 (en) * | 1994-12-19 | 1995-02-15 | Iaf Biochem Int | Peptides having immunomodulatory activity |
BR9609883A (pt) * | 1995-08-08 | 1999-03-23 | Fibrogen Inc | Composto tendo efeito inibidor em proteinase c composição farmacéutica e processo para tratar doenças relacionadas com a produção inapropriada ou desregulada de colágeno |
US5843462A (en) | 1995-11-30 | 1998-12-01 | Regents Of The University Of Minnesota | Diphtheria toxin epitopes |
EP1037663A2 (en) | 1997-12-16 | 2000-09-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods to treat undesirable immune responses |
US8568766B2 (en) * | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
US7199102B2 (en) * | 2000-08-24 | 2007-04-03 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides synergize statin activity |
US7723303B2 (en) * | 2000-08-24 | 2010-05-25 | The Regents Of The University Of California | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response |
US7144862B2 (en) * | 2000-08-24 | 2006-12-05 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis |
US7148197B2 (en) * | 2000-08-24 | 2006-12-12 | The Regents Of The University Of California | Orally administered small peptides synergize statin activity |
US7166578B2 (en) | 2000-08-24 | 2007-01-23 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides synergize statin activity |
WO2002060390A2 (en) * | 2001-01-04 | 2002-08-08 | Yale University | Induction of immune responses to isoaspartyl-modified antigens |
JP2008513479A (ja) * | 2004-09-16 | 2008-05-01 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | アテローム性動脈硬化症および他の病理を改善するためのg型ペプチドおよび他の薬剤 |
EP1827472A4 (en) | 2004-12-06 | 2012-09-05 | Univ California | METHOD FOR IMPROVING THE STRUCTURE AND FUNCTION OF ARTERIOLS |
US20080293639A1 (en) * | 2005-04-29 | 2008-11-27 | The Regents Of The University Of California | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response |
EA012440B1 (ru) * | 2005-04-29 | 2009-10-30 | Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифонье | Пептид, композиция на его основе для лечения патологий, связанных c воспалительными процессами |
US8299214B2 (en) * | 2006-03-13 | 2012-10-30 | Keio University | Influenza infection-inhibiting peptide, influenza virus infection inhibitor, liposome, and influenza preventive/therapeutic agent |
US7842662B2 (en) | 2006-11-10 | 2010-11-30 | Cara Therapeutics, Inc. | Synthetic peptide amide dimers |
US8236766B2 (en) | 2006-11-10 | 2012-08-07 | Cara Therapeutics, Inc. | Uses of synthetic peptide amides |
WO2008057608A2 (en) | 2006-11-10 | 2008-05-15 | Cara Therapeutics, Inc. | Synthetic peptide amides |
US8906859B2 (en) | 2006-11-10 | 2014-12-09 | Cera Therapeutics, Inc. | Uses of kappa opioid synthetic peptide amides |
US7713937B2 (en) | 2006-11-10 | 2010-05-11 | Cara Therapeutics, Inc. | Synthetic peptide amides and dimeric forms thereof |
DK2195331T3 (da) * | 2007-08-28 | 2014-02-03 | Uab Research Foundation | Syntetiske polypeptider, der efterligner apolipoprotein e, og anvendelsesmetoder |
CA2697957A1 (en) | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein e mimicking polypeptides and methods of use |
JP7081923B2 (ja) | 2014-07-31 | 2022-06-07 | ユーエイビー リサーチ ファンデーション | アポe模倣ペプチド及び血漿コレステロールを取り除くためのより高い効果 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1237918A (ru) * | 1967-08-08 | 1971-07-07 | ||
US4190646A (en) * | 1975-11-11 | 1980-02-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Polypeptide compositions and methods |
US4190647A (en) * | 1979-01-26 | 1980-02-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Polypeptides and methods |
CA1157466A (en) * | 1979-04-12 | 1983-11-22 | Gideon Goldstein | Peptides having thymopoietin-like activity |
US4261886A (en) * | 1980-03-13 | 1981-04-14 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Peptides having thymopoietin-like activity |
FR2460290A1 (fr) * | 1979-06-29 | 1981-01-23 | Rhone Poulenc Ind | Nouveaux tetra- ou pentapeptides, leur preparation et les medicaments qui les contiennent |
DE2938420A1 (de) * | 1979-09-22 | 1981-04-09 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Neue peptide und verfahren zu ihrer herstellung |
US4309340A (en) * | 1980-03-31 | 1982-01-05 | American Home Products Corporation | Polypeptide compositions |
US4298523A (en) * | 1980-06-17 | 1981-11-03 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods and compositions for preparation of H-ARG-X-Z-Y-TYR-R |
US4361673A (en) | 1980-09-19 | 1982-11-30 | American Home Products Corporation | Polypeptide compositions |
HU185263B (en) * | 1981-06-12 | 1984-12-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing peptides effective on the immuncontroll analogous with the tp5 |
DE3146598A1 (de) * | 1981-11-25 | 1983-07-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "neue peptide und verfahren zu ihrer herstellung" |
US4614517A (en) * | 1982-08-04 | 1986-09-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
DE3401545A1 (de) * | 1983-08-03 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue peptide mit immunstimulierender wirkung, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
US4505853A (en) * | 1983-11-18 | 1985-03-19 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Enzyme-resistant immunomodulatory peptides |
DE3421614A1 (de) * | 1984-06-09 | 1985-12-12 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von pentapeptiden mit wirkung auf das immunsystem und zwischenprodukte dieses verfahrens |
US4547489A (en) * | 1984-06-11 | 1985-10-15 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Conformationally restricted thymopentin-like compounds |
US4629723A (en) * | 1984-06-27 | 1986-12-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Potent thymopentin analogs |
IT1216908B (it) * | 1987-03-19 | 1990-03-14 | Eniricerche Spa | Analoghi retro-inversi della timopentina e dei suoi frammenti, il metodo per la loro sintesi ed il loro impiego per la preparazionedi composizioni farmaceutiche. |
US5097013A (en) * | 1988-07-14 | 1992-03-17 | Kao Corporation | Novel peptides possessing a macrophage chemotactic activity |
-
1989
- 1989-05-04 NZ NZ229004A patent/NZ229004A/xx unknown
- 1989-05-08 IL IL9022989A patent/IL90229A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-08 WO PCT/US1989/001967 patent/WO1989011289A1/en active IP Right Grant
- 1989-05-08 AU AU37455/89A patent/AU625598B2/en not_active Ceased
- 1989-05-08 JP JP1506291A patent/JPH03504013A/ja active Pending
- 1989-05-08 BR BR898906988A patent/BR8906988A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-05-08 HU HU893392A patent/HU205142B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-05-08 RU SU894743132A patent/RU2060998C1/ru active
- 1989-05-11 IE IE154289A patent/IE62555B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-17 EP EP94101394A patent/EP0602003A1/en not_active Withdrawn
- 1989-05-17 ES ES89304998T patent/ES2075050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-17 EP EP89304998A patent/EP0342962B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-17 DE DE68923401T patent/DE68923401T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-17 EP EP94101395A patent/EP0602004A1/en not_active Withdrawn
- 1989-05-17 AT AT89304998T patent/ATE124956T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-18 PT PT90596A patent/PT90596B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-05-19 AR AR89313972A patent/AR246352A1/es active
- 1989-05-19 CN CN89103398A patent/CN1037711A/zh not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-01-09 US US07/462,743 patent/US5298490A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-17 FI FI900267A patent/FI94350C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-01-18 DK DK014890A patent/DK14890D0/da not_active Application Discontinuation
- 1990-01-18 KR KR1019900700093A patent/KR900701296A/ko not_active Application Discontinuation
-
1994
- 1994-07-21 CN CN94108155A patent/CN1104217A/zh active Pending
-
1995
- 1995-09-20 GR GR950402578T patent/GR3017451T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Патент США N 4190646. кл. C 07C103/52, опублик. 1980. Патент США N 4428438, C 07C103/52, опублик. 1984. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA010575B1 (ru) * | 2006-05-30 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Пептид, обладающий иммуногеропротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0602004A1 (en) | 1994-06-15 |
FI94350C (fi) | 1995-08-25 |
US5298490A (en) | 1994-03-29 |
NZ229004A (en) | 1993-09-27 |
IE891542L (en) | 1989-11-19 |
CN1104217A (zh) | 1995-06-28 |
IL90229A (en) | 1995-12-08 |
BR8906988A (pt) | 1990-12-18 |
ATE124956T1 (de) | 1995-07-15 |
CN1037711A (zh) | 1989-12-06 |
FI900267A0 (fi) | 1990-01-17 |
HU205142B (en) | 1992-03-30 |
AU3745589A (en) | 1989-12-12 |
EP0342962A2 (en) | 1989-11-23 |
JPH03504013A (ja) | 1991-09-05 |
DE68923401D1 (de) | 1995-08-17 |
DK14890A (da) | 1990-01-18 |
IL90229A0 (en) | 1989-12-15 |
DK14890D0 (da) | 1990-01-18 |
GR3017451T3 (en) | 1995-12-31 |
AR246352A1 (es) | 1994-07-29 |
DE68923401T2 (de) | 1996-02-01 |
PT90596B (pt) | 1994-09-30 |
WO1989011289A1 (en) | 1989-11-30 |
AU625598B2 (en) | 1992-07-16 |
EP0342962B1 (en) | 1995-07-12 |
EP0602003A1 (en) | 1994-06-15 |
IE62555B1 (en) | 1995-02-08 |
PT90596A (pt) | 1989-11-30 |
ES2075050T3 (es) | 1995-10-01 |
HU893392D0 (en) | 1990-09-28 |
EP0342962A3 (en) | 1990-12-27 |
FI94350B (fi) | 1995-05-15 |
KR900701296A (ko) | 1990-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2060998C1 (ru) | Способ получения пептидов, пептиды, иммуномодулирующая композиция и способ регуляции недостаточной или избыточной функции т-клеток у пациента | |
US4190646A (en) | Polypeptide compositions and methods | |
JP2638666B2 (ja) | 血液調節ペプチド | |
AU705418B2 (en) | Peptides having immunomodulatory activity | |
EP1309613B1 (en) | Pharmaceutical composition comprising an analgesic peptide | |
EP0527803B1 (en) | Composition for macrophage activation | |
US5744452A (en) | γ-L-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith | |
CA1120031A (en) | Tetrapeptides and methods | |
RU2503684C2 (ru) | Иммуномодулирующие олигопептиды | |
HU205143B (en) | Process for producing peptides having t cell suppressor activity and pharmaceutical compositions comprising same | |
EP0723454B1 (en) | Novel tripeptides useful in immune and cns therapy | |
AU721261B2 (en) | Peptide inhibitors of hematopoietic cell proliferation | |
Tomašić et al. | Peptidoglycan monomer originating from Brevibacterium divaricatum—its metabolism and biological activities in the host | |
RU2120298C1 (ru) | Иммуностимулятор и препарат на его основе | |
WO1997019691A1 (en) | Gamma-l-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith | |
JPH0137400B2 (ru) | ||
EP0517464A1 (en) | Peptides useful in regulating the immune and nervous systems | |
US5656601A (en) | Acylated splenopentins, methods for their synthesis and their use | |
US4258152A (en) | Pentapeptide modified resin | |
RU2142958C1 (ru) | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и препарат на его основе | |
AU682898C (en) | Novel tripeptides useful in immune and CNS therapy |