JPH03502930A - Ｔ細胞のサプレツサー活性を有するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞のサプレッサー活性を有するペプチド本発明は、一般に、サプレッサーＴ 細胞の活性を刺激することができる合成ペプチドに関する。さらに詳しくは、本 発明のペプチドは、分子のサイモポエチンに基づく、Ｃ末端にアミド置換基を有 するテトラペプチドである。

発明の背景 免疫調節タンパク質、サイモポイエチンおよびサイスプレニン（形式的には「ス プレン」）は、それぞれ、ウシおよびヒトの胸腺および肺臓から分離されてきた 。さらに、サイモポイエチンおよびサイスプレニンの生物学的活性をまねる小さ いペプチドは化学的に合成され、そしてさらに修飾されて、追加の寄与、例えば 、酵素作用に対する抵抗性を付与されてきた。参照、例えば、米国特許第４．５ ０５．８５３号および本出願人に係る同時係属中の米国特許出願第１９６．１３ ８号。

現在、このようなタンパク質および合成されたタンパク質に関する多数の文献お よび特許が発行されてきている。米国特許第４．１９０．６４６号は、サイモポ イエチンの活性部位であり、そして配列Ａｒｇ−Ｌｙ　５−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　Ｉ 　−Ｔｙ　ｒｃ有するペンタペプチドサイモペンチン、ならびに種々の置換がこ のペンタペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端になされているペ プチド組成物を開示している。サイモポイエチンおよびサイモペンチンの両者は 、２つのヒトＴ細胞系、ＣＥＭおよびＭＯＬＴ−４において生物学的変化を誘発 し、これによりＴ細胞のサプレッサーおよびヘルパー活性の両者の刺激における ある役割を示す。ペンタペプチド（配列中の５アミノ酸）より短いサイモペンチ ンの類似体はＯＥＭ細胞について活性であることが発見されていない。

本出願人の同時係属中の米国特許出願第５３１８６号は、ヒト解繊から分離され た４８アミノ酸の免疫調節タンパク質、スプレニン（以後「サイスプレニン」と 呼ぶ）を開示している。５Ｐ−５と呼ぶウシサイスプレニンの活性部位は、その アミノ酸残基３２〜３６にまたがりそして配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ −Ｔｙｒを有し、マウスにおいて生体内のヘルパーＴ細胞活性を刺激する。こう して、ヒトサイスプレニンはヒトにおいて類似の生物学的活性を示す。ヒトサイ スプレニンは、ヒトＴ細胞系ＭＯＬＴ−４において細胞内ｃＧＭＰの増加を誘発 するので、上に同定しＩ；応用において記載された。米国特許出願第５３１８６ 号において、ヒト配列の活性部位はＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒと して開示されｔ；。

サイスプレニンは、サイモポイエチンと異なり、０８Ｍ細胞の生物学的活性の変 化を生成する。こうして、サイスプレニンはＴ細胞のヘルパー活性の刺激に関係 するが、Ｔ細胞のサプレッサー活性には関係しない。

参照、また、米国特許第４，１９０．６４６号、米国特許第４．２６１゜８８６ 号、米国特許第４．３６１．６７３号、米国特許第４．４２０゜４２４号、およ び米国特許第４．６２９．７２３号。本発明に含まれる他のバックグラウンドの 材料および生物学的プロセスの説明については、前述の特許、出願および文献を 参照。

米国特許第４，４２８．９３８号（Ｋｉｓｆａｌｕｄｙら、１９８４年１月３１ 日発行）は、免疫調節を影響を与えるある種のペプチドを開示している。これの ペプチドのうちは、次のテトラペプチドが存在する：ｋｒｇ−Ｌｙｓ　　Ａｓｐ −Ｖａｌ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｖａ　Ｉ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉ　Ｉｅ Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａ　Ｉ Ｇｌｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ 米国特許第４，４２８．９３８号は、一般に、これらの配列の塩類、アミド、低 級アルキルエステルおよびｉｓされた誘導体は、また、免疫調節に影響を与える ことができる。しかしながら、これらの配列の特定のアミドはその中の特異的で 同定されていない。胸腺欠損による免疫学的疾患を処置するためにこれらの配列 を使用する方法は、また、説明されている。この特許において、ペプチドは生体 外Ｅロゼツトアッセイにおける活性について試験された。

本出願人の同時係属の米国特許出願第１９６．１３８号は、ＭＯＬＴ−４７細胞 系において生物学的活性を誘発することができる、ｌ系列のサイスプレニンペプ チド類似体を開示した。前に報告されたサイモベンチン類似体と異なり、長さが ５アミノ酸より小さくそしてサイスブレニンに関係するペプチドはＭＯＬＴ−４ 細胞、ならびにその中に記載されている応答のペンタペプチド類似体においてＴ 細胞ヘルパー活性を誘発するとき活性であった。その中に記載されているいくつ かのテトラペプチドは、次のものを包含した： Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−ＮＨｚホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓ ｐ−Ｖａ　１アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　１アセチル−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−ＮＨ。

アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａ　Ｉ　−ＮＨ２アセチル−Ａｒｇ−Ｐ ｒｏ−Ｄ−ｂｅｔａ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−ＮＨ２アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｕ−Ｖａ　１−ＮＨ。

アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖ’ａ　１アセチル−Ａｒｇ−Ａｉ　ｂ− Ａｌａ−Ｖａ　Ｉ−ＮＨＩアセチル−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨＩ アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ。

これらのペプチドはＭＯＬＴ−４アツセイにおけるサイスプレニンの作用をまね ることが発見されたが、０８Ｍ細胞細胞系のアッセイにおけるサイモペンチンの 活性をまねることができなかった。

種々のＴ細胞欠乏状態についてヒトの免疫系のサプレッサーおよびヘルパー活性 の刺激において有用である、追加のペプチドがこの分野において必要である。

発明の要約 カルボキシ末端の置換アミドを含有するある数のテトラペプチドは０８Ｍ細胞に ついての環状ＧＭＰアッセイにおいてサイモベンチンのＴ細胞サプレッサー活性 の特性を有することが、驚くべきことには発見された。この発見は驚くべきこと である。なぜなら、遊離カルボキシ末端をもつか、あるいは異なるＣ末端のアミ ド基でアミド化された同一テトラペプチドはこのようなＴ細胞サプレッサー活性 を生成しないからである。

テトラペプチド配列のいくつかは、従来、例えば、米国特許第４，４２８．９３ ８号において同定され、これらは遊離カルボキシ末端をもつがＴ細胞サプレッサ ー活性を生成しない。しかも、ある種のアミド置換が本発明に従いＣ末端になさ れるとき、これらの不活性のペプチドはＴ細胞サプレッサー活性を示さない。こ のような活性は先行技術のいずれによっても予測不可能である。

しＩ；がって、１つの面において、本発明は、次の式％式％ 式中、 ＲはＨ１低級アルキル、アセチル、ホルミル、または低級アルカノイルであり、 ＸはＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、　ヒドロキシル−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ。

ＡｉｂまたはＬｙｓであり、 Ｙはｃｒｙであるか、あるいはＶａｔ、Ａｌａ、Ｉ　Ｉｅｘ　Ｌｅｕ。

ＡＳｐｓ　Ｇｌ　ｕ％ＧｉｎまたはＬｙｓから選択されるアミノ酸のＤまたはＬ 型であり、 Ｒ１はＨであり、そして Ｒ１は１〜ｌＯ個の炭素原子を有する低級アルキルまたはアルケニノ１４〜８個 の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、アリールまたはＮ ＨＲ，であり、ここでＲ３は１−１０個の炭素原子を有する低級アルキル、４〜 ８個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、またはアリー ルであるか、あるいはＲ８およびＲ２は一緒になって４〜７個の炭素原子のメチ レン鎖を構成する、 のアミド化ペプチドを提供する。

これらのアミド化ペプチドおよびこれらのペプチドを含有する組成物ハ、驚くべ きことには、ＣＥＭ細胞へのヒ）・サイモペンチンの生物学的活性を保持する。

したがって、これらのペプチドはヒトにおいて同様な生体内生物学的活性を産生 することが推定される。大きい数のこれらのペプチドは、食道および血清におい てエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼおよびトリプシン様酵素による 攻撃に対する増大した抵抗性により特徴づけることができる。こうして、これら のペプチドは免疫欠損の処置において有意の利点を提供する。

本発明のそれ以上の面は、これらのペプチドを含有する製剤学的組成物および免 疫調節を必要とする種々の状態または病気においてこれらのペプチドを使用する 方法を包含する。

本発明の他の面および利点は、次の詳細な説明において開示する。

図面の簡単な説明 第１図はＣＥＭ　　ｃＧＭＰアッセイのグラフの表示であり、ペプチド濃度（ｇ ／ｍＱ）対ｃＧＭＰ濃度（ピコモル／ｍａ）をプロットし、そしてサイモペンチ ン（ＴＰ−５）および本発明のペプチド対対照のその中の活性を比較する。

発明の詳細な説明 本発明は、驚くべきことには、Ｔ細胞サプレッサー活性を有し、そして式Ｒ−Ａ ｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｙ−ＮＲ’Ｒ２式中、Ｒ，ＸＳＹ、Ｒ’およびＨｚは前述し た通りである、により表される化合物を提供する。

この開示を通じて、ペプチドのアミノ酸成分およびそれらの調製において使用す るある種の物質は賀宜上略号により識別する。アミノ酸について３文字の略号の 大部分はよく知られている。それほど知られていない略号は、ポリグルタミルに ついてのＧｌｐ　（また、ｇ−Ｇｌｕ）およびアミノイソ酪酸についてのＡｉｂ である。特記しない限り、すべてのアミノ酸はＬ−異性体の立体配置である。Ｄ −異性体の立体配置を望む場合、それはそのように示されるであろう。

本発明のある種の好ましいペプチドは、第２アミノ酸がＰｒｏまたはＡｉｂであ る式のものである。第２アミノ酸ＸがＰｒｏまｌ；はＡｉｂであるＣ末端アミド をもつテトラペプチドは、消化および血清の酵素に対する増加した抵抗性を有す ることが期待される。このような好ましいペプチドは、次のものを包含する： Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピルアミドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓ ｐ−Ｖａ　Ｉ−メチルアミドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−メチルアミド ホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−メチルアミド本発明の他の好ま しいペプチドは、次のものを包含する：Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−ア ニリンアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ− Ａｓｐ−Ｖａｌ−２−７ｘ＝ルヒドラジドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ− ピペリジンアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−シクロへキシルアミドＡ ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピルアミド置換したテトラペプチド の驚くべきかつ予期されない活性は、とくに先行技術と比較したとき、新規なか つ明らかでない化合物を提供する。

本発明のテトラペプチド配列は従来開示されている、例えば、米国特許第４．４ ２８．９３８号において配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ、が、本発明は 、驚くべきことには、それらのカルボキシ末端におけるこれらの配列の選択的ア ミド化がＴ細胞サプレッサー活性をもつ化合物を提供することを発見した。さら に、本発明は前述のペプチドのいくつかは、また、驚くべきことにはかつ予期せ ざることには、サイモベンチンに類似するＴ細胞サプレッサーおよびヘルパーの 両者の活性を示すことを発見した。これらのペプチドは、前述のＡｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミド、ホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ− Ｖａｌ−メチルアミド、およびＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピ ルアミドを包含する。

こうして、本発明は、それらの教示により、製剤学的使用のための新規な化合物 を提供する。前述のテトラペプチドの活性化合物の生成に必要な特定のアミド基 の選択は、先行技術において教示されておらず、また本発明の選択的アミド化が 生物学的に不活性な遊離Ｃ末端をもついくつかのテトラペプチドから生物学的活 性な化合物を生成するという事実は教示されていない。そのうえ、前述のテトラ ペプチド配列のすべては、それらのＣ末端においてアミド化したとき、サイモペ ンチンに類似するこのようなＴ細胞サプレッサーの生物学的活性を示すわけでは ない。アッセイするとき、ある数の先行技術のテトラペプチドは、アミド化する とき、このようなＴ細胞サプレッサー活性を示すことができない。本発明の化合 物は、このような配列のアミドが免疫系に影響を与えるか、あるいはＴ細胞ヘル パー活性を刺激する能力を示すという一般化した技術により予測されない。例え ば、次のペプチドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−モルホリノアミドＡｒｇ −Ｌｙ　５−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　Ｉ−ジメチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖ ａ　１−２−す７チルアミドアセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａ　Ｉ−１ チルアミドは、サイモベンチンのＴ細胞サプレッサー刺激活性を示さない。しか も、それらは米国特許第４，４２８，９３８号（Ｋｉｓｆａｌｕｄｙ）または本 出願人の同時係属米国特許出願環１９６．１３８号に記載されているのと同一の または同様な配列ををする。

本発明のペプチドは、一般に、次の既知の技術に従い調製することができる。便 利には、本発明のポリペプチドの合成の生成は、固相の合成方法まＩ；は標準の 溶液合成方法に従うことができる。例えば、メリリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ）、Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、、８５：２１４５−２１５４　（１９６３）に記載 されている固相台或はより理解されており、そしてペプチドの調製に普通の方法 である。固相方法は、固体の樹脂粒子への共有結合により結合された成長するペ プチド鎖への、保護されたアミノ酸の段階的添加を包含する。この手順により、 試薬および副生物は濾過により除去され、こうして中間体の精製の必要性を排除 する。

この方法の一般的概念は、鎖の第１アミノ酸の固体のポリマーへの共有結合によ り取り付けに依存する。連続する保護されたアミノ酸を、一度にか、あるいはブ ロックで、所望の配列が組み立てられるまで、段階的方法で添加する。最後に、 保護されＩ：ペプチドを固体樹脂の支持体から除去し、そして保護基を切り放す 。

アミノ酸を樹脂として適当なポリマーに取り付けることができる。樹脂は官能基 を含有し、これに第１保護されたアミノ酸を共有結合によりしっかり結合するこ とができなくてはならない。種々のポリマーはこの目的に適当であり、それらの 例はセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、Ｎ−アル キルベンズヒドリルアミンむよびポリスチレン樹脂である。このような合成にお いて使用可能な適当な保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）　、ベ ンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−アミロキシカルボニル（ＡＯＣ）、トシル（Ｔｏｓ）、 ０−ブロモフェニルメトキシカルボニル（ＢｒＺ）、およびフェニルメトキシカ ルボニル（ＺまたはＣＢＺ）を包含する。追加の保護基は上のテキスト、ならび にＪ、Ｆ、Ｗ、マクオミ−（ＭｃＯｍｉｅ）、「有機化学における保護基（Ｐｒ ｏｔｅｃｔｉｖｅ　　Ｇｒｏｕｐｓ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ）Ｊ、Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７３に同定さ れている。これらの本の両者をここに引用によって加える。

本発明のペプチドの調製の一般的手順は、最初に樹脂に保護されたＣ末端アミノ 酸を取り付けることを包含する。取り付は後、樹脂を濾過し、洗浄し、そしてＣ 末端Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−アニリンアミドのアルファアミノ基上 の保護基（望ましくはＢＯＣ）を除去する。この保護基の除去は、もちろん、ア ミノ酸と樹脂との間の結合を破壊せずになされなくてはならない。次いで、生ず る樹脂ペプチドに終わりから２番目のＣ末端保護されたアミノ酸を結合する。こ の結合は第２アミノ酸の遊離カルボキシ基と樹脂に取り付けられた第１アミノ酸 のアミノ基との間ののアミド結合の形成により起こる。この事象の配列は、すべ てのアミノ酸が樹脂に取り付けられるまで、連続するアミノ酸で反復される。

最後に、保護されＩ；ペプチドを樹脂からこの分野において知られている適当な 普通の技術、例えば、シクロへキシルアミドを使用するアミノ分解により除去し 、そして保護基を除去して所望のペプチドを得る。ペプチドを樹脂から分離しか つ保護基を除去するために使用する切り放し技術は、樹脂および保護基の選択に 依存し、そしてペプチド合成の分野において知られている。

ペプチド合成の別の技術は、ポダンスズキ−（ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）ら、「ペプ チド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔａｓｉｓ）Ｊ、第２版、Ｊｏｈｏｎ　　 Ｗｉｌｅｙ　　ａｎｄ　　５ｏｎｓ、１９７６に記載されてｌ／する。例えば、 本発明のペプチドは、また、標準の溶液ペプチド合成方法を使用して合成するこ とができ、この方法はアミド結合のホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　 Ｉ−メチルアミドの化学的または酵素的方法を使用するアミノ酸またはペプチド 断片の段階的またはブロックの結合を包含する。これらの溶液合成方法はこの分 野においてよく知られている。

本発明のペプチドは、上に参照した米国特許、出願および文献に記載されている ようにヒトサイモベンチンに類似する生物学的活性を示すことが発見された。こ の生物学的活性は、主として、ヒトサイモペンチンと比較して、ヒトＴ細胞系Ｃ ＥＭにおける環状ＧＭＰの誘発を測定するアッセイにより明らかにされる。この アッセイにおける本発明のペプチドによるｃＧＭＰの産生の誘発は、ペプチドが 細胞上のヒトサイモベンチン受容体部位へ結合し、そしてヒトサイモペンチン様 生物学的活性を誘発する能力を示す。

本発明のペプチドの多くは、それ以上の有意の利点を提供する。本発明の多くの ペプチドは、消化または血清による酵素の劣化に対する抵抗性により特性決定す ることができる。こうして、それらは、生物学的被検体中に注射することによっ て投与するとき、生体内の延長された半減期を実証する。これらのペプチドの多 くの他の利点は、経口的に投与するそれらの能力である。

本発明のペプチドの免疫調節特性のために、それらはヒト、および多分動物の処 理において治療的に有用である。なぜなら、それらは体の免疫調節を改良するこ とができるＴ細胞の分化および成熟を誘発する能力を有するからである。その結 果、本発明のペプチドは多数の治療学的用途を有すると考えられる。

本発明のペプチドは、細胞の免疫性の治療学的刺激を増加または促進するであろ うから、体の集合的免疫性の促進において有用であると考えられる。本発明のペ プチドまＩ；はペプチドを含有する製剤学的組成物は、一般に、細胞の免疫性が １つの結果である、とくに免疫性の欠乏が存在する分野において有用であると考 えられる。これにより、それらはアレルギー性反応、または自己免疫の反応の処 置において有用である。

こうして、バランスされないＴ細胞のために抗体の産生または細胞の免疫性が過 剰である場合、本発明のペプチドはサプレッサーＴ細胞の作用を刺激することに よってこの状態を補正することができる。それらは、損傷性抗体が産生されるあ る種の自己免疫病、例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチなどに おいて治療学的使用が期待される。

本発明のペプチドまたはそれらを含有する製剤学的組成物は、それらの最も広い 応用において、免疫系の調節が必要である被検体、ヒトまたは動物の免疫系を調 節するために有用である。ここで使用するとき、用語「調節」は、本発明の化合 物が免疫系を異常な、病気の状態を正常のバランスされた状態に戻させることを 意味する。この調節は免疫学的欠乏（例えば、ディ・ジョージ症候群）の補正に おいて大きい用途をよく見いだすが、また、過剰の免疫学的活性（例えば、自己 免疫病）の状態を補正するまえに適用することができる。

したがって、本発明は、免疫系の調節を必要とするヒトまたは動物に免疫調節的 に有効量のペプチドの少なくとも１種を投与することからなる、このような調節 を必要とするヒトまたは動物の免疫系を調節する方法、およびこれらの方法を実 施するための製剤学的組成物を包含する。

本発明は、また、被検体に治療学的にを動量の本発明のペプチドの少なくとも１ 種を投与することからなる、とくにＴ細胞サプレッサー機能において、被検体の 免疫系の相対的または絶対的な欠乏から生ずる状態を処置する方法を提供する。

ここで使用するとき、用語「治療学的に有効量」は、前述の状態を処置するため に有効な量を意味する。本発明は、また、被検体に有効誘発量の本発明のペプチ ドの少なくとも１種を投与することからなる、Ｔ細胞の分化および成熟を誘発す る方法を提供する。

本発明は、さらに、それらの方法を実施するための製剤学的組成物を提供する。

本発明の製剤学的組成物を調製するために、本発明のペプチドを、活性成分とし て、普通の配合技術に従い、製剤学的担体と緊密に混合して組み合わせする。こ の担体は、投与、例えば、経口的、下舌、直腸、花、または非経口的の投与に望 む調製物の形態に依存して、広範な種類の形態を取ることができる。

好ましい経口的投与形態の組成物を調製するとき、通常の媒質を使用することが できる。経口的液状調製物（例えば、懸濁液、エリキシル、および溶液）のため に、例えば、水、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤などを含有する媒質 を使用することができる。担体、例えば、澱粉、糖、希釈剤、造粒剤、滑剤、結 合剤、崩壊剤などを使用して経口的固体（例えば、粉末、カプセル剤、および錠 剤）を使用することができる。制御しｔ；解放の形態をまた使用することができ る。投与における容易さのために、錠剤およびカプセル剤は最も有利な経口的投 与単位形態を表し、この場合において固体の製剤学的担体は明らかに使用される 。

必要に応じて、錠剤は標準の技術により糖被覆または腸溶被覆することができる 。

非経口的生成物について、担体は通常無菌の水であるが、他の成分、例えば、溶 解を促進するまたは防腐の目的の成分を含めることができる。

注射可能な懸濁液を、また、調製することができ、この場合において適当な液状 担体、懸濁剤などを使用することができる。

本発明のペプチドは、一般に、約１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０゜００１〜約 ＩＯμｇ／ｍＱ体重の量で投与することができるが、これより少ない投与量が有 用であることがある。一般に、免疫欠損を処理すべき前述の病気または状態の処 置において、同一範囲の投与量を使用することができる。これより多い量（例え ば、約ｌＯ〜ｌｏＯｍｇ／ｋｇ体重）は過剰免疫活性の抑制に有用である。

次の実施例によって、本発明を説明する。これらは本発明を特別に限定しない。

実施例および明細書を通じて、特記しない限り、部は重量による。

実施例は次の略号を使用するニトリフルオロ酢酸についてＴＦＡ、酢酸について ＨＯＡＣ；塩化メチレンについてＣＨ，Ｃ１，；アセトニトリルについてＣＨ， ＣＮ、ジメチルホルムアミドについてＤＭＦ　、酢酸アンモニウムについてＮＨ ，ＯＡｃ　；　ｎ−ブタノールについてｎ−ＢｕＯＨ；ピリジンについてｐｙｒ ；ジシクロへキシルカーポジイミドについてＤＣＣ；１−ヒドロキシベンゾトリ アゾールについてＨＯＢｔ；ジメチルアミノピリジンについてＤＭＡＰ　、）ジ シクロ酢酸についてＴＣＡ、メタノールについてＭ　ａ　ＯＨ；薄層クロマトグ ラフィーについてＴＬ、Ｃ。

テトラヒドロフランについてＴＨＦ　、酢酸エチルについてＥｔＯＡｃ；重炭酸 ナトリウムについてＮａＨＣＯ，；硫酸マグネシウムについてＭｇ５Ｏ，；Ｎ− メチルモルホリンについてＮＭＭ、ジエチルエーテルについてＥｔ、ＯＨ高性能 液体クロマトグラフィーについてＨＰＬＣ。

炭素担持パラジウムについてＰｔ／Ｃ；ジイソプロピルエチルアミンについてＤ 　Ｉ　ＥＡ　；インブチルクロロホルメートについて１ＢｕＯｃＯｃｌ；ジイソ プロピルエーテルについて１−Ｐｒ２０；バラニトロフェニルエステルについて ＯＮｐ；組織培養培地についてＲＰＭｌ、およびリン酸塩緩衝液についてＰＢＳ 。

実施例１．Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピルアミドの金床 ４ｏｍＱのＣＨ，ＣＩ、中に、２．２５ｇのＢＯＣ−Ｐｒｏ　（Ｂｚ　Ｉ）Ａｓ ｐ−Ｖａｌを溶解した。この溶液を水浴中で冷却し、そして４ｍＱのＤＭＦ中の ０．６７ｇのＨＯＢｔおよび０．９０ｇのＤＣＣを添加した。１０分間撹拌した 後、５ｍ＋２のＣＨ，ＣＩ、中の０．３０ｇのイソプロピルアミンの溶液を添加 した。この混合物を水浴中で１５分間撹拌し、次いで室温に加温した。３時間後 、沈澱を濾過した。濾液を１０％のクエン酸溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ， 溶液で抽出した。有機層をＭｇ５Ｏ，で乾燥し、そして溶媒を減圧下に除去した 。生成物は灰色の固体、２．３２ｇ、であった。ＥｔＯＡｃ−ｉ−Ｐｒ、Ｏから 結晶化すると、１．６４ｇの生成物が得られた、融点１７９．５−１８１．５℃ 。

上の生成物のＯ−８４ｇに、５０ｍｆｆのＣＨ，ＣＩ、中の４０％のＴＦＡを添 加した。この溶液を３０分間撹拌した。残留物にエーテルを添加すると、固体の Ｐｒｏ−（Ｂｚ　１）Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピルアミトドリフルオロアセ テートが産生じた。

０．９３ｇのＢＯＣ−アルギニンを１０ｍＱのＤＭＦ中に溶解した。

この溶液を一２０℃に冷却し、そして０．１８ｒ１２のＮＭＭを添加し、次いで ０．２２ｇの１ＢｕＯｃＯｃ１を添加した。この混合物を一１５℃において２０ 分間撹拌し、次いで０．１８ｍ１２のＮＭＭおよび１０ｍＱのＤＭＦ中の上のト リフルオロアセテート塩の冷却した溶液を添加した。

３０分後、冷却浴を除去し、そして撹拌を２時間続けた。溶媒の大部分を減圧下 に除去した。ＥｔＯＡｃおよび水を残留物に添加した。層を分離し、そして有機 層をクエン酸溶液で抽出し、そして飽和ＮａＨＣＯ。

溶液で抽出した。溶媒を除去すると、無色のガラス、１−４４ｇ５が残った。生 成物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにかけて精製し、９８：２の ＣＨｔＣＩｚ：ＭｅＯＨで溶離した。最初に溶離する成分は所望の生成物であっ た；純粋な分画は０．５３ｇを生じた：わずかの不純物を含有する０、３２ガラ ス他の分画が得られた。

０．５３ｇの精製し保護されたテトラペプチド−アミドを、パラジウムブラック の存在下に２０ｍ４のＭ　ｅ　ＯＨ中の１ｍ＜＋のギ酸で水素化した。１時間後 、この混合物をセライト（ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、そして水で洗浄した。Ｍ　 ｅ　ＯＨを減圧下に除去した。残留物を水で希釈し、そして凍結乾燥すると、２ ８０ｍｇが得られた。生成物をＳＰ−セファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ 　ｅ　ｘ）のクロマトグラフィーにより精製し、０．３０モルＮＨ，ＯＡｃ　　 ｐＨ５で溶離した。主要なピークの中心を含有する分画を一緒にし、そして凍結 乾燥すると、１９０ｍｇのＡｒｇ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ−イソプロ ピルアミドの非晶質固体が得られた。アミノ酸分析：Ａｓｐ、１．０１　：Ｐｒ ｏｓ　　１．０３；Ｖａｌ。

０．９７；Ａｒｇ、Ｌ、００；９６％のペプチド。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０）Ｒ＋（１）　　−０，４４（ｎ−Ｂ ｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ／１５：３：１２：１０）Ｒｔｃ夏１）　　 −０，６５（ＥｔＯＡｃ：ｐｙｒ：ＨＯＡｃ：Ｈ，Ｏ１５：５：ｌ：３）Ｒ，（ １１１）−０，１６（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｔＯ／３：１：１）実施例２ ．Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−シクロへキシルアミドの車底 ＴＨＦ（２０ｍｇ）中のＢＯＣ−（Ｂｚ　１）Ａｓｐ−Ｖａ　１−ＯＮｐ（１， ０６ｇ、２．００ミリモル）およびシクロヘキシルアミン（０゜２７ｍｇ、１． ２当量）の溶液に、ＨＯＢｔ　（０，２７ｇ）を添加した。

生ずる黄色溶液を２４時間撹拌し、そして減圧下に蒸発させた。残留油をＥｔＯ Ａｃで希釈し、そして飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ、Ｈ，０１ｌＯ％のクエン酸および 飽和プラインで洗浄した。有機相をＭ、ＳＯ，で乾燥し、濾過し、そして蒸発す ると、保護されたジペプチドアミドが得られた。

４．２モルのＨＣＩジオキサン（１０ｍ１２）の撹拌した溶液に、保護されたジ ペプチド（０，７１ｇ、１．４ミリモル）を添加した。６０分後、この反応物を 減圧下に蒸発させると、無色の固体がジペプチドのＨＣｌ塩として得られた。

ＤＭＦ　（ｌ　ＯｍＱ）中のジペプチドのＨＣｌ塩、（ＣＢＺ）、Ａｒｇ−（Ｃ ＢＺ）−Ｌｙｓ−ＯＮｐ　（１，３４ｇ５　ｌ−４ミリモル）およびＨＯＢｔ　 （０，１９ｇ、１．０当量）をＮＭＭ　（０，１８ｍ（１）に添加した。１６時 間後、ゼラチン状沈澱が形成しｔ；。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯｓ溶液で急冷 し、濾過し、モしてＨ，０，１０％のクエン酸、Ｈ，ＯおよびＥｔ、Ｏで洗浄し た。４％のＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃから再結晶化すると、（ＣＢＺ）ｓＡｒｇ−（ ＣＢＺ）−Ｌｙ　５−（Ｂｚ　Ｉ）−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　１−シクロへキシルアミ ドが無色の固体として得られた、１．３６ｇ、７３％。

このテトラペプチド（１，３３ｇ）をＨＦ／アニソール（３０ｍ４／８ｍＱ）中 で０℃において６０分間脱保護した。残留物をＥｔ、Ｏ中で急冷し、そして濾過 した。集めた固体を１０％のＨＯＡｃ中に溶解し、そして凍結乾燥すると、Ａｒ ｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−シクロへキシルアミド、４６ｍｇ、が得られた。

このペプチドをＨＰＬＣにより精製しｔ；：ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｍ− ２０１０１５００ＤＳ−３カラム、１０．０ｍ１２／分の流速、１０％のＣＨ， ＣＮ、０．０１モルのｐＨ５のＮＨ，０Ａｃｏ　３０ｍ１２の緩衝液中の１５０ ｍｇの３回の注入を使用し、そして３５．０および５１．６分の間で溶離する分 画を集めた。部分的に減圧下に蒸発させそして凍結乾燥すると、テトラペプチド アミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−シクロへキシルアミドが無色の固体と して得られた、４１０アミノ酸分析：Ａｒｇ、１．００；Ｌｙｓ、１．００；Ａ ｓｐｓ　　１．００；Ｖａｌ、０．８５゜ 薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｒ＋（１）　　−０，３９ （ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｒ２０：ＥｔＯＡｃ／１：ｌ：１：１）Ｒ１（ＩＩ ）　−０，６１（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ／１５：３：１２： １０）Ｒ，（Ｉ　Ｉ　Ｉ）　＝　０．９０（ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐ ｙｒ１５：　ｌ：３：５）実施例３．Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−ピペ リジンアミドの合成ＴＨＦ（ｌｏｍ（２）中のＢＯＣ−（Ｂｚ　１）−Ａｓｐ− Ｖａ　ｌ−ＯＮｐ（２，７２ｇ、５．００ミリモル）およびピペリジン（０，６ ｍＱ、１．２当量）の撹拌した溶液に、ＨＯＢｔ　（０，６８ｇ、１．０当量） を添加した。４８時間後、黄色溶液を減圧下に蒸発させた。油状残留物をＥｔＯ Ａｃ中に溶解し、そして飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ溶液、冷２モルのＮａＯＨの各々 で１回、Ｈ２Ｏで２回、１０％のクエン酸およびブラインで１回洗浄した。有機 相をＭｇＳＯ４で乾燥すると、無色の油、ＢＯＣ−（Ｂｚ　ｌ）　−Ａｓ　ｐ− Ｖａ　Ｉ−ピペリジンアミド、２．３６ｇ、が得られた。

Ｍ　ｅ　ＯＨ／　ＣＨｚ　Ｃｌ　ｘを使用するフラッシュクロマトグラフィーに より精製すると、保護されたジペプチドアミドが無色の固体として得られた、１ −６５ｇ、６７％。

４．２モルのＨＣｌ−ジオキサンに、保護されたジペプチドアミド（１，０６ｇ 、２．１７ミリモル）を添加した。１時間後、この溶液を減圧下に蒸発させ、Ｃ ＨｘＣＩｚ中に溶解し、そして再蒸発すると、ＨＣｌ塩が無色の油として得られ た。

ＤＭＦ　（ｌ　ＯｍＱ）中の（ＣＢＺ）ｎＡｒｇ−（ＣＢＺ）−Ｌｙｓ−ＯＮｐ 　（２，０８ｇ、２．１７ミリモル）前述の無色の油およびＨＯＢｔ　（０，２ ９ｇ）の撹拌した溶液に、ＮＭＭ　（０，２９ｇ）を添加した。

１時間後、沈澱が形成し始めた。１６時間後、反応混合物を水で急冷した。生成 物をＥｔＯＡｃで抽出し、そして飽和ＮａＨＣＯ，溶液、！（，０１１０％のク エン酸、Ｈ２ＯおよびＥｔ、Ｏで洗浄した。ＨＯＡ　ｃ　／ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２ ０から再結晶化すると、（ＣＢＺ）　３Ａｒｇ−（ＣＢＺ）−Ｌｙｓ−（Ｂｚ　 １）−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−ピペリジンアミドが無色の固体として得られた、２． ４０ｇ、９１％。

この保護されたテトラペプチド（１，８７ｇ、１．５５ミリモル）をＮ、パージ した１０％のＨＯＡｃ　（１００ｍ１２）中にスラリー化し、これに１０５のＰ ｔ／Ｃ（０，８ｇ）を添加した。この混合物をパール（ｐ　ａ　ｒ　ｒ）水素化 装置（５００ｍ４の容器、４３．５ｐｓｉ）で撹拌した。４８時間後、反応混合 物を０．４５ナイロンフイルターで濾過し、部分的に蒸発させ、Ｈ，Ｏで希釈し 、そして凍結乾燥すると、粗製のテトラペプチドが無色の固体として得られｔ； 、８９０ｍｇ。

このペプチドをＨＰＬＣにより精製した二ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｍ−２ ０１０１５００ＤＳ−３カラム、ｌｏ、ｏｍ（１／分の流速、１０％のＣＨ３Ｃ Ｎ、０．０１モルのｐ）Ｉ５のＮＨ，ＯＡＣ＋１３ｍ１２の緩衝液中の３００ｍ ｇの３回の注入を使用し、そして２３，０および４４゜０分の間で溶離する分画 を集めた。部分的に減圧下に蒸発させそして凍結乾燥すると、テトラペプチドア ミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−ピペリジンアミドが無色の固体として得 られた、４１０ｍｇ。

アミノ酸分析：Ａｒｇ、０．９５；Ｌｙｓ、１．００；Ａｓｐ、１．０２；Ｖａ ｔ、１．００゜５４．２のペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｒ＋（１）　　−０，３１ （ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ，Ｏ：ＥｔＯＡｃ／１：ｌ：ｌ：ｌ）Ｒ，（ＩＩ ）　−０，５３（ｎ−ＢｕＯＨ：）１０Ａｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ／１５：３：１２ ：１０）Ｒ＋（Ｊｌｌ）−０，６１ＣＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ１ ５：１：３：５）実施例４．Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−メチルアミド の合成１２　：　５ＣＨ，ＣＩ、：ＤＭＦ　（８５ｍＩ２）中のＢＯＣ−Ｖａ　 Ｉ　（１０゜８６ｇ、５０．０ミリモル）およびＤＩＥＡ　（８，７０ｍｇ、ｌ −０当量）、メチルアミンＨＣＩ　　（３，３８ｇ、１．０当量）およびＨＯＢ 　ｔ（７，６６ｇ、１．０当量）の撹拌した溶液に、ＤＣＣ（１０，３２ｇ。

５０．０ミリモル）を添加した。沈澱が形成した。２時間後、反応混合物を濾過 し、モして濾液を蒸発乾固した。油状残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解し、そして３ 回飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ溶液、Ｈ，ＯＳ　１０％のクエン酸および飽和ブライン で洗浄した。Ｎａ、Ｓｏ、で乾燥後、有機相を濾過し、そして蒸発すると、無色 の固体が得られた。熱ヘキサン中で粉砕すると、所望のアミド、ＢＯＣ−Ｖａ　 Ｉ−メチルアミド、７．９８ｇ、６９％、融点１２０−１２２℃、が得られた。

この投与（４，６０ｇ、２０．０ミリモル）に５０ＴＦＡ／ＣＨ，Ｃ１２（２０ ｍ１２）を添加した。３０分間撹拌後、この溶液を３０°Ｃ以下で蒸発させ、油 状残留物をＣＨ，Ｃ１，中に溶解し、２回飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。有 機相をＮａｔＳＯａで乾燥し、濾過し、そして蒸発させると、Ｖａｔ−メチルア ミド、１．９０ｇ、７３％が得られた。

ＤＭＦ　（２０ｍ１２　）中のＢＯＣ−Ｂｚｌ−Ａｓｐ　（４，７２ｇ、１４゜ ６ミリモノリ、Ｖａｌ−メチルアミド（１，９０ｇ、１４．６ミリモル）、ＨＯ Ｂｔ　（２，２４ｇ、１．Ｏ当量）の撹拌１．ｆ−溶液に、ＤＣＣ（３゜０１ｇ 、１４．６ミリモル）を添加した。５分後に沈澱が形成した。１６時間後、反応 混合物を濾過し、モして濾液を半分の飽和ＮａＨＣＯ。

溶液で急冷した。

生ずる固体を集め、Ｈ３Ｏ，１０％のクエン酸、Ｈ８０、およびＥ　ｔ、０で洗 浄し、そして空気乾燥すると、無色の固体が得られた。ＥｔＯＡｃから再結晶化 すると、所望のジペプチド、５．８５ｇ、９２％、ＢＯＣ−（Ｂｚ　Ｉ）−Ａｓ 　ｐ−Ｖａ　ｌ−メチルアミドが得られた。

このジペプチド（３，９４ｇ、９．０５ミリモル）に、５０％のＴＦＡ　／　Ｃ Ｈ！　Ｃｌ　ｔ　（２０ｍ　Ｑ　）を添加した。３０分間撹拌した後、この溶液 を３０℃以下において蒸発させ、モしてＥｔ、○で粉砕すると、ＴＦＡジペプチ ド、４．１０ｇ、１００％が無色のガラスとして得られた。

ＤＭＦ　（２０ｍＡ　）中のＢＯＣ−Ｐｒｏ　（１，９５ｇ−９−０５ミリモル ）、ＴＦＡジペプチド（４，１０ｇ、９．０５ミリモル）、ＤＩＥＡ　（１，７ ３ｍｇ、１．１当量）　、ＤＭＡＰ　（０゜２１ｇ、０．１当量）の撹拌した溶 液に、ＤＣＣ（１，８７ｇ、９．０５ミリモル）を添加した。沈澱は５分後形成 した。１６時間後、反応混合物を濾過し、そして半分の飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ溶 液で急冷した。生ずる固体を集め、Ｈ，０，１０％のクエン酸、Ｈ，Ｏｌおよび Ｅｔ、Ｏで洗浄し、そして空気乾燥すると、所望のトリペプチドアミド、４．１ ５ｇ１８６％、が得られた。これを精製しないで使用した。

このアミド（４，１５ｇ１７．７８ミリモル）に、５０％のＴＦＡ／ＣＨｘＣＩ 　！　（１５ｍＱ　）を添加した。３０分間撹拌後、この溶液を３０℃以下にお いて蒸発させ、モしてＥｔ、Ｏで粉砕すると、ＴＥＡトリペプチド、４−２５ｇ 、１００％が無色の固体として得られた。

ＤＭＦ（１５ｍｇ）中の８６．９ＡＯＣ−Ｔｏｓ−Ａｒｇ　（３９，７ｇ、７． ７８ミリモル）、トリペプチドアミド（４，２５ｇ、７．７８ミリモル）、ＮＭ Ｍ（０，８６ｍ１２Ｓ　１．１当量）、およびＨＯＢ　ｔ（１，１９ｇ、１．Ｏ 当量）の撹拌した溶液に、ＤＣＣ（１，６１ｇ。

７．７８ミリモル）を添加した。沈澱は１０分後に形成した。１６時間後、反応 混合物を濾過し、そして半分の飽和ＮａＨＣＯ，溶液で急冷しＩこ。

生ずる固体を集め、Ｈ２０，１０％のクエン酸、Ｈ２０、およびＥｔ、０で洗浄 し、そして空気乾燥すると、保護されたテトラペプチドアミド、４．８２ｇ、７ ２％が得られた。

固体の半分を５０％のＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌｘ　（ｌ　ＯｍＱ）中で３０分間脱保 護し、減圧下に蒸発させ、モしてＥｔ、Ｏで粉砕した。生ずる固体をＨＦ／アニ ソール（３０ｍＱ　／　８　ｍ１２　）で０℃において６０分間切り放した。残 留物をＥｔＯＡｃ中にスラリー化し、そして１０％のＨＯＡｃ（５０ｍｆ２）で ２回洗浄した。水性抽出物を凍結乾燥すると、粗製のＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ− Ｖａ　Ｉ−メチルアミドが得られた。

粗製のペプチドを５ＰＣ−２５セフアデツクス（２−６Ｘ８３ｃｍのカラム、０ ．０５〜０．３モルのＮＨａＯＡｃ％ｐＨ６，５；勾配：１００ｍ（２／時間の 流速、９．５ｍ１２７分画、２０６ｎｍの検出器）で精製した。分画１１３〜１ ２８をプールし、そして凍結乾燥して９２５ｍｇのテトラペプチドアミド、Ａｒ ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−メチルアミドが得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇｓ　　１．０６；Ｐｒｏ、０．９９；Ａ３２％　０．９５ ；Ｖａｌ、ｌ　００；５４ペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｒ＋（１）　　−０，２０ （ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ２０：Ｕｐｐｅｒ　Ｐｈａｓｅ／４：ｌ：５）Ｒ ＋（ＩＩ）　−０，２６（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ／１５：３ ：１２：１０）Ｒ，（１１１）−０，２６（ＥｔＯＡｃ：）ＩＯＡｃ：Ｈ２Ｏ： Ｐｙｒ１５：ｌ：３：５）実施例５．Ｎ−ホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓ　　 −Ｖａｌ−メチルアミドの合成 ＡＯＣ−（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｂｚ　１）−Ａｓｐ−Ｖａ　１−メチ ルアミド（１，ＯＯｇ、１．１７ミリモル）に、４．５モルのＨＣ１ジオキサン （１０ｍｇ）を添加した。６０分後、反応の塊を蒸発させ、Ｈ，Ｏで希釈し、そ して凍結乾燥すると、ＨＣＩテトラペプチドが無色の粉末状固体、０．９２ｇ、 １００％が得られた。

固体をＤＭＦ　（ｌ　Ｏｍ（２）中に溶解し、そしてＤ　Ｉ　ＥＡ　（０−９３ ｍ１２゜４．０当量）およびｐ−ニトロフェニルホルメート（２００ｍｇ−１− ０２当量）を添加した。２時間後、反応混合物を１０％のクエン酸で処理した。

生ずる固体を濾過し、Ｈ，Ｏで洗浄し、そして空気乾燥すると、ホルミル化ペプ チドアミド、０．４１ｇが得られた。

この固体をＨＦ／アニソール（３０ｍ（１／８ｍ（２）で０℃において６０分間 切り放した。残留物をＥｔＯＡｃ中にスラリー化し、そして２回１％のＮ　Ｈ４ ０Ｈ（５０ｍ　Ｑ　）で抽出した。水性抽出物を凍結乾燥すると、粗製のペプチ ド、Ｎ−ホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−メチルアミドが得られ た。

粗製のペプチドをＤＥＡＥセファデックス（２−６Ｘ９０ｃｍのカラム、０．１ モルのＮＨ，ＨＣＯｔ、非緩衝化；１００ｍｆｆ／時間の流速、１０ｒ＋Ｊ／分 画、２０６ｎｍの検出器）で精製した。分画３８〜４３をプールし、そして凍結 乾燥すると、アミド化ペグチド、８０ｍｇが得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇ％　１．００；Ｐｒｏ％　１．００；Ａｓｐ、１．００； ＶａＬ　　１．００；５０％のペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｌ（１）　　−０，３２（ ｎ−ＢｕＯＨ：）ｉｏＡｃ：ＨｚＯ：Ｕｐｐｅｒ　Ｐｈａｓｅ／４：１：５）Ｒ ＋（ＩＩ）　−０，３８（ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ：ＨＩＯ：Ｐｙｒ１５：１：３ ：５）Ｒ，（Ｉ　ＩＩ）−０，３４（トリフルオロエタノール：ＮＨ４ＯＨ／１ ：ｌ）実施例６．Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ　　−Ｖａｌ−２−７ｚニルヒドラジド 立監度 ＴＨＦ　（４Ｑｍ（２’）中のＢＯＣ−Ｖａ　Ｉ　（４，３４ｇ、２０．０ミリ モル）ノ撹拌シタ溶液に、ＮＭＭ（２，３０ｍＱ）、次いでｉ　ＢｕＯＣＯＣ］ （２２６６４ｍ２）を添加した。生ずるスラリーを１５分間撹拌し、次いテフェ ニルヒトラジン（１，９８ｍ（２）を滴々添加した。このスラリーを一１Ｏ〜０ ℃において１時間撹拌し、次いで室温に加温した。反応混合物を濾過し、モして 濾液を減圧下に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解し、そして飽和Ｎ　ａ 　ＨＣＯｓ溶液、Ｈ８０および飽和ブラインで洗浄した。

有機相をＮａ、Ｓｏ、で乾燥し、濾過し、そして蒸発させると、黄オレンジ色の 固体が得られた。ＣＨｘＣＩ　２／石油エーテルから再結晶化すると、無色の固 体、融点１４１°Ｃ！、４．９６ｇ、７４％が得られた。

４．２モルのＨＣＩジオキサン（１０ｍＱ）の撹拌した溶液に、Ｂ。

Ｃ−Ｖａｌ−２−フェニルヒドラジド（１，１３ｇ、３．６８ミリモル）を添加 しＩ；。１時間後、反応混合物を減圧下に蒸発させ、Ｅｔ、Ｏ中でで粉砕すると 、Ｖａ　１−２−フェニルヒドラジドが２ＨＣ１塩が無色の固体として得られた 、１．０３ｇ。

ＴＨＦ（１０ｍ１２）中の２ＨＣ１塩（１，０３ｇ、３．６８ミリモル）、ＢＯ Ｃ−（Ｂｚ　］）−Ａｓｐ　（０，８８ｇ）およびＨＯＢｔ　（０，３８ｇ）の 撹拌した溶液に、ＮＭＭ　（０，６０ｍｆｆ　）　、次いでＤＣＣ（０゜５６ｇ ）を添加した。沈澱はほとんど１度に形成した。１６時間後、反応混合物を濾過 し、モして濾液を減圧下に蒸発させた。残留物をＥｔＯＡＣ中に溶解し、飽和Ｎ ａＨＣＯ，溶液および飽和ブラインで洗浄した。有機相をＮａ、Ｓｏ、で乾燥し 、濾過し、そして減圧下に蒸発させた。

ＥｔｏＡｃ／ヘキサンから再結晶化すると、ＢＯＣ−（Ｂ　ｚ　１）−Ａ　ｓ　 ｐ−Ｖａｔ−２−フェニルヒドラジドが無色の固体として得られた、０゜０７ｇ 、６４％。

４．２モルのＨＣＩジオキサン（１０ｍ１２）の撹拌した溶液に、ＢＯＣジペプ チドフェニルヒドラジド（１，０７ｇ５１．７５ミリモル）を添加した。６０分 後、この溶液を減圧下に蒸発させると、無色の油、（Ｂｚ　Ｉ）−Ａｓｐ−Ｖａ 　ｌ−２−フェニルヒドラジド塩酸塩が得られた。

ＤＭＦ（６ｍ（２）中の（ＣＢＺ）ｓＡｒｇ−（ＣＢＺ）Ｌｙｓ−ＯＮｐ（１， ６８ｇ）の撹拌した溶液に、ＮＭＭ　（０，６ｍＱ　）を添加しＩ；。

１６時間後、ゼラチン状沈澱が形成した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯｓ溶液で 急冷し、固体を集め、Ｈ２０，１０％のクエン酸、Ｈ２０およびＥｔ、Ｏで洗浄 した。２％のＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃから再結晶化すると、（ＣＢＺ）ｓＡｒｇ− （ＣＢＺ）−Ｌｙｓ−（Ｂｚ　Ｉ）−Ａｓｐ−Ｖａ　１−２−フェニルヒドラジ ドが無色の固体として得られたｓ　２−　１５ｇ−９２％。

保護されたペプチド（１，８８ｇ）をＨＦ／アニソール（３０ｍ＋２／８ｍＱ） で０℃に８いて６０分間切り放した。残留物をＥｔ、Ｏ中で急冷し、そして濾過 した。固体を１０％のＨＯＡｃ　（１００ｍＱ）で１時間抽出し、濾過し、そし て抽出液を凍結乾燥すると、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−２−７エニルヒ ドラジドが無色の固体として得られｔ；、８９０ｍｇ。

粗製のペプチドをＣＭセファデックス（２，６Ｘ８８ｃｍのカラム、０．３モル のＮＨ，ＯＡｃ、非緩衝化；１００ｍｆｆ／時間の流速、１２゜５ｍ４／分画、 ２２５ｎｍの検出器）で精製した。分画２７０−３１０をプールし、そして凍結 乾燥すると、３９０ｍｇの最終生成物、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−２ −７二：ルヒドラジドが得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇｓ　Ｏ−９８；Ｐｒｏ、１−０３　：Ａｓｐｓ　　ｌ−Ｏ Ｑ；Ｖａｌ、０．９９：８３ペプチド含量。

Ｒ，（１）　　＝０．３９（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：ＥｔＯＡｃ／１ ：１：１：ｌ）Ｒ＋（ＩＩ）　−０，５１（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ： Ｐｙｒ／１５：３：１２：１０）Ｒ＋　（Ｉ　ＩＩ）　−０−５９（ＥｔＯＡｃ ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ１５：　１　：３：５）実施例７．Ａｒｇ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−アニリンアミドの合成室温においてＤＭＦ中のＢＯＣ−Ｖ ａ　Ｉ　Ｃ４，３５ｇ、２０−０ミリモル）、アニリン（３，０ｍＱ、１．０５ 当量）およびＨＯＢｔ　（３，０９ｇ％　１．０当量）の撹拌した溶液に、ＤＣ Ｃ（４，１２ｇ、２０．０ミリモル）を添加しｔ；。濃厚な沈澱が５分以内に形 成した。４時間後、反応混合物を濾過し、モして濾液を半分の飽和ＮａＨＣＯ， 溶液（５００ｍＱ）中に注いだ。沈澱が形成し、これを集めた。固体をＨＩＯ（ １：ｌ）で洗浄し、そして空気乾燥した。ヘキサン／イソプロパツールから再結 晶化すると、アニリドＢＯＣ−Ｖａ　ｌ−アニリンアミドが得られた、３．７６ ｇ、６４％。

ＢＯＣ−Ｖａ　Ｉ−アニリンアミド（２，５０ｇ、８．５５ミリモル）を５０％ のＴ　Ｆ　Ａ　／　ＣＨ２Ｃ＋　２　（１０ｍ　Ｑ　）中に溶解し、そして３０ 分間撹拌した。反応混合物を室温において減圧下に蒸発させ、そして残留物をＣ Ｈ，Ｃ１，中に溶解した。この溶液を２回飽和ＮａＨＣＯ，溶液で洗浄し、Ｍｇ ５ｏ４で乾燥し、そして蒸発させると、Ｖａｌ−アニリンアミドが淡黄色消とし て得られた、１．４２ｇ、８８％。

ＤＭＦ　（７，５ｍ（１）中のＢＯＣ−（Ｂｚ　Ｉ）−Ａｓｐ　（２−３８ｇ。

１．０当量）、ｖａｌ−アンアミド、およびＨＯＢｔ　（１，１３ｇ）の撹拌し た溶液に、ＤＣＣ（１，５２ｇ％　１．０当量）を添加した。沈澱が形成し、そ して反応混合物を３時間撹拌した。この混合物を濾過し、そして濾液を飽和Ｎａ ＨＣＯ，溶液で急冷した。生ずる固体を集め、Ｈ，０で洗浄し、そして空気乾燥 した。ＥｔＯＡｃ／石油エーテルから再結晶化すると、無色のＢＯＣジペプチド アミド、融点１２１−１２２℃、ＢＱＣ−（Ｂｚ　１）−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　１− アニリンアミドが得られた。

ＢＯＣジペプチド（１，７１ｇ、３．４４ミリモル）を５０％のＴＦＡ／　ＣＨ ｔｃ　Ｉ　ｘ　（ｌ　ＯｍＱ　）中に溶解し、そして３０分間撹拌した。反応混 合物を室温において減圧下に蒸発させ、そして残留物をエーテル中で粉砕し、濾 過し、そして空気乾燥した。

ＤＭＦ　（ｌ　０ｍ１２　）中のＢＯＣ−（ＣＢＺ）−Ｌｙｓ　（１，３３ｇ。

３．５０ミリモル）の撹拌した溶液に、−２０℃においてＮＭＭ（０゜４６ｍＱ 、１．２当量）を添加し、次いで１ＢｕＯｃＯｃ１　（０，４６ｍ１＋、１．０ １当量）を添加しｔ：。生ずるスラリーを３０分間撹拌し、そしてジペプチドＴ ＦＡ塩を次いで添加し、次いでＮＭＭ　（０，４６ｍＱ＞を添加した。反応混合 物を撹拌し、そして室温に加温した。１時間後、反応混合物を半分の飽和ＮａＨ ＣＯ，溶液（２００ｍｆｆ）中に注いだ。

無色の固体が形成した。これを集め、そして空気乾燥した。ＥｔＯＡｃ／１−Ｐ ｒ２０から再結晶化すると、ＢＯｃトリペプチドアミド、２゜０５ｇ、７８％、 融点１６４−１６７℃が得られた。

ＢＯＣトリペプチドアミド（２，００ｇ、２．６３ミＵ−Ｆ−ノリヲ５０％のＴ ＦＡ／ＣＨ＊ＣＩｚ（６ｍＱ）中に溶解し、そして３０分間撹拌した。反応混合 物を室温において減圧下に蒸発させ、残留物をエーテル中で粉砕し、濾過し、そ して空気乾燥すると、ＴＦＡ塩が得られた。

−２０°ＣにおいてＤＭＦ中の（ＣＢＺ）ｓＡｒｇ　（１，５２ｇ、２゜６３ミ リモル）の撹拌した溶液に、ＮＭＭ　（０，３５ｍＱ、１．２当量）、次いで１ ＢｕＯｃＯｃｔ　（０，３５ｒｒ＋４，１．０１当量）を添加した。

生ずるスラリーを３０分間撹拌した。次いで、ＮＭＭ　（０，３５ｍ１２　）を 添加し、次いでＴＦＡ塩を添加した。反応混合物を室温に１時間加温した。この 混合物を飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ溶液中に注ぎ、そして生ずる固体を濾過し、Ｈ， Ｏで洗浄し、そして空気乾燥した。熱ＥｔＯＨ中で粉砕すると、保護されたテト ラペプチド、ＢＯＣ−（ＣＢＺ）−Ｌｙ　５−（Ｂｚ　１）−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　 ｌ−アニリンアミド、２．５５ｇ１７８％が得られた。

テトラフルオロエタノール（５０ｍＱ）およびギ酸（９７％、５ｍ１２）中のテ トラペプチド（２，３０ｇ、１．８９ミリモル）の撹拌したスラリーに、パラジ ウムブラック（０，９５ｇ）を添加した。１時間後、この溶液をセライトで濾過 し、そしてＨ２Ｏで洗浄した。濾液を部分的に減圧下に蒸発させ、そして残留物 を凍結乾燥すると、無色の固体、０゜８９ｇが得られｔ； 粗製のペプチドを５ＰＣ−２５セフアデツクス（２，６Ｘ８９ｃｍのカラム、０ ．１−０．３モルのＮＭ、ＯＡｃ　：　ｐＨ５の勾配；１００ｍ１２／時間の流 速；１５＋ｎＱ／分画、２０６％ｍの検出器）で精製した。分画２５３〜２８５ をプールし、そして凍結乾燥すると、６８０　ｍ　ｇ　ｓＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−アニリンアミドが得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇ、１．００；Ｌｙｓ、０．９８；ＡＳＩ）％　　１．００ ；Ｖａｌ、Ｌ、０１；１００％のペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｒ＋（１）　　＝０．４２ （ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：Ｐｙｒ１５：ｌ：３：５）Ｒ＋（ＩＩ）　− ０，３２（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：ＥｔＯＡｃ／ｌ：１：ｌ：ｌ）Ｒ ｔ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）＝　０．５４（ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ　：Ｈ２Ｏ：Ｐｙｒ ／１５：３：　１２：１０）実施例８．生物学的活性：環状ＧＭＰアッセイこの アッセイは、ヒトサイモベンチンのように、本発明のペプチドの完全なＯＥＭ細 胞の細胞膜受容体に結合し、そして環状ＧＭＰの産生を選択的に刺激する能力を 測定する。

ＯＥＭ細胞系はマリイランド州ロックビレのアメリカン・タイプ・カルチャー中 フレクション（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　ＣｕＩｔｕｒｅ　 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手した。ＯＥＭ細胞を、Ｔ。

アウハヤ（Ａｕｄｈｙａ）ら、アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アン ド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）ｓ２３４：１６７−１７７　（１９ ８４）に記載されているように、新しく接種し、そして３日間増殖させて収穫し た。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてＲＰＭＮ６４０中に１．０ＸＩＯ’細 胞／ｍｆ２の濃度で再懸濁し、そして３７℃において３０分間平衡化しＩ；後、 試験ペプチド（２５μＱ）および対照ペプチドを添加した。インキュベーション を震盪水浴中で４〜５分間進行させ、次いで１ｍ１２の氷冷ＴＣＡ（ＩＱ％）の 添加により停止させた。

ＴＣＡ中のｌｌＢ胞を均質化し、そして超音波処理して環状ヌクレオチドを解放 した。懸濁液を３０００Ｘｇで２０分間４℃において遠心した。

生ずる沈澱をＯ，ＩＮのＮａＯＨ中に溶解してタンパク質含量を決定した。ＴＣ Ａを上澄み液の分画から５ｍｄの水飽和したＥｔ、Ｏで抽出して除去した。最後 の抽出後、残留する微量のエーテルを水浴で５０℃に１０分間加熱して除去した 。凍結乾燥後、試料を環状ＧＭＰのラジオイムノアッセイのために５０ミリモル のアセテート緩衝液（ｐＨ６，２）で再構成した。

例えば、ｌ−１０００μｇ　／　ｍ　Ｑのペプチドからの投与量応答曲線を各化 合物について評価した。第１図は、ＯＥＭ細胞中のサイモベンチンおよび不活性 ペプチド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ジメチルアミドおよびＡｒｇ−Ｌ ｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−２−ナフチルアミドと比較した、活性ペプチドＡｒｇ −Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖ ａ　Ｉ−アニリンアミド、Ａｒｇ−Ｌｙ　５−Ａｓ　ｐ−Ｖａ　ｌ−シクロへキ シルアミド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−ピペリジンアミドおよびＡｒｇ −Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−フェニルヒドラジドについての典型的な投与量応答 曲線（６回の実験の複合から）を示す。限界の活性は試験しｔ；各ペプチドにつ いて決定した。これは、対照より２標準偏差大きい環状ＧＭＰの細胞内レベルを 誘発した、試験ペプチドの最低濃度として定義する。対照は０．９ピコモル／ｍ （ｌより小さい細胞内環状ＧＭＰレベルを有した（平均上標準偏差）。

環状ＧＭＰのレベルが平行の陰性の対照について決定されｔ；ものの２倍より大 きい場合、試験結果は陽性であると考えた。活性ペプチドは１〜ｌｏｇ／１２の 範囲の活性の限界を有しＩ；。

環状ＧＮＰアッセイの結果を第１図に示し、ここで本発明の代表的ペプチドをサ イモベンチン大きい対照ペプチドと比較してアッセイした。

これらの結果は、ＣＥＭ細胞におけるＴ細胞サプレッサーの活性の刺激における 本発明のペプチドの生物学的活性を実証する。

実施例９．酵素の安定性 腸および血清の酵素による劣化に対する本発明のペプチドの安定性を実証するｔ ；めに、例示のペプチドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−イソプロピルアミ ドをラットの胃液およびヒトの血清中で３７℃において１２０分間インキュベー ションした。ペプチド、例えば、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ジメチルア ミドおよびサイモペンチンを比較のため、同様に処理した。ＨＰＬＣは、Ａｒｇ −Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ　−ジメチルアミドが数秒後完全に消化されること を明らかにすることが期待される。サイモペンチンはこれらの条件下に約２０秒 で５０％消化される。本発明のペプチドは血清および胃液中でサイモベンチンま たは対照ペプチドよりかなり長い間、寅質的に劣化しないままであることが期待 される。

実施例ＩＱ、Ａｒｇ　　Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドの合成Ａ、Ｎσ −ｔ−ブチルオキシカルボニル−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）リシル−（ β−ベンジル）アスパルチル−バリンメチルアミド５０ｍＱの８５％の酢酸中に 、３．２１ｇのＮ　ａ　−ｔ−ブチルオキシカルボニル− ル）アスパルチル−バリン７エナシルエステルを溶解した。５．２ｇの亜鉛ダス トを添加し、そして混合物を１時間激しく撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液 を水で希釈し、そして３回酢酸エチルで抽出した。−緒にした有機層を水および 飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次い無水ＭｇＳ○、で乾燥した。エーテルお よび引き続くヘキサン添加は、ガム状沈澱を生成した。この物質を乾燥した白色 固体となるまでヘキサンで粉砕すると、１．７５ｇが得られた。この生成物を１ ４ｍ（２の酢酸エチルおよび１ｍＱのジメチルホルムアミド中に溶解した。

この溶液を一２０°Ｃに冷却後、０．３０ｍｇのＮ−メチルモルホリンを添加し 、次いで（１３６ｇのイソブチルクロロホルメートを滴々添加した。反応混合物 を−１５℃において２０分間撹拌し、次いで０．２９ｍｇのＮ−メチルモルホリ ンおよび１０ｍ１２の９５％のエタノール中のメチルアミン塩酸塩の冷却しＩ； 溶液を添加した。濃厚な沈澱が形成した。

５ｍＱのＤＭＦを添加して撹拌を促進し、そして混合物を０℃において９０分間 撹拌し、次いで室温において３０分間撹拌した。反応混合物を７５ｍ４の水に添 加した。

有機相は混合物を撹拌するとワックス状固体の小球体となった。この固体を濾過 し、モして濾液を酢酸エチルで抽出した。有機相の蒸発からの残留物を固体の生 成物と一緒にし、そしてそれを酢酸エチル−イソプロピルエーテルから結晶化し た。収量は１．５３ｇであっＩ；、融点１８３．５−１８４．５℃。元素分析： Ｃ−６１，５７（６１，９６）、Ｈ−７，２１（７，３７）、Ｎ−９，８１（１ ０，０４７）。

ルアミド １．４６ｇの部Ａの生成物を、５０ｍ１２の塩化メチレン中の５０％のトリフル オロ酢酸に添加した。２５分間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、そしてエーテルを 残留物に添加すると、白色固体が生成した。この物質を濾過し、そしてエーテル で洗浄した。

トリベンジルオキシカルボニル−アルギニンＤＭＦ中に溶解した。この溶液を２ ０℃冷却し、そして０．２５ｍｇのＮ−メチルモルホリンを添加し、次いで２ｍ ＋２のＤＭＦ中の０．３１ｇのインブチルクロロホルメートを添加した。この混 合物を一２０℃において２０分間撹拌し、次いでＮ−メチルモルホリンおよび１ ０ｍｇのＤＭＦ中のトリペプチドトリプルオロアセテートの冷却した溶液を添加 した。反応混合物を一り０℃〜−ｌＯ℃において３０分間、次いで室温において 一夜撹拌した。１６時間後、この混合物を１２５ｍ１２の水に添加した。沈澱を 濾過により集め、加温したメタノールおよび酢酸エチルで洗浄した。収量は１． ７４ｇであった、融点１１８−１２０℃。アミノ酸分析：Ａｓｐ−０．９９、Ｖ ａｌ−１．０３、Ｔｙｒ−０．９９、Ｌｙｓ−０．９８、Ａｒｇ−１．００；６ ７、７％のペプチド。

Ｃ．アルギニル−リシル−アスパルチル−バリンメチルアミド上の部Ｂの生成物 の１．７２ｇの脱保護は、４Ｑｍｆｆのトリフルオロエタノール中でＩｇのパラ ジウムブラックの存在下に２ｍ１２のギ酸で還元することによって達成した。こ の混合物を１．５時間バルーンの栓を有するフラスコ内で急速に撹拌した。パラ ジウムをセライトで濾過して除去し、水で洗浄しｔ；。トリフルオロエタノール の大部分を濾液から回転蒸発器で除去した。残留物を５％の酢酸で希釈し、そし て凍結乾燥した。生成物は６７６ｍｇであった。

ペプチドをＳＰ−セファデックスの２−　６Ｘ８５ｃｍのカラムのクロマトグラ フィーにより精製し、０．２０　〜０．５ＮのＮＨ４０ＡＣ　　ｐＨ５、５の勾 配で３Ｌにわたり溶離した。１０ｍｇの分画を集め、２０６ｎｍにおいて監視し た。主要なピークは分画１８５〜２２０に現れた：３つのカットを取った：１８ ５〜１９０、１９１〜２０５および２０６〜２２０。凍結乾燥すると、それぞれ 、２１ｍｇ，４９７ｍｇおよび２３５ｍｇを生じた。第１カツトは不純物を含有 し、他方の２つは９９。

５％より大きい純度であった。

ＨＰＬＣ，ｐ−Ｂｏｎｄａｐａｋ　　Ｃ，ａ：ｒｔ−８．５分、０．０１モルの Ｎ　Ｈ　４　０　Ａ　ｃ　　ｐ　Ｈ　５、２．０ｍ４／分。

アミノ酸分析：Ａｓｐ−１．０１、Ｖａｌ−０．９５、Ｌｙｓ−１．０１ＳＡｒ ｇ　　ｌ−　０２；５６％のペプチド。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０）Ｒ＋−０．１９（ｎ−ＢｕＯＨ：Ｈ ＯＡｃ：Ｈ＊Ｏ：ビリジン／１５：３：１２：１０）Ｒ＋−０．１５（ＥｔＯＡ ｃ：Ｐｙｒ：ＨｚＯ１５：５：１：３）Ｒ１−０．４５（ＴＦＡ：ＮＨ４０Ｈ／ ２：ｌ）室温において８５　ＨＯＡｃ（１００ｍ１２）中のａ　−　Ｂ　Ｏ　Ｃ 　　（　Ｃ　ｂ　Ｚ　）−Ｌｙｓ−（β−Ｂｚ　ｌ）Ａｓｐ−Ｖａ　１７エナシ ルエステル（８．０２ｇ，１０．０ミリモル）の急速に撹拌した溶液に、酸エツ チングした亜鉛ダスト（１２．４ｇ）を添加した。１時間後、反応混合物を濾過 し、そして濾液を真空蒸発させた。生ずる油状残留物をＥｔ，Ｏ中で粉砕した。

形成する固体を集め、Ｅｔ２０およびＨ，Ｏで洗浄し、そして４０℃において真 空乾燥すると、４．９５ｇ１　７２％が得られた。

−１５℃においてＴＨＦ　（５ｍ＋２）中のＢｏＣトリペプチド（１．００ｇ， １．４６ミリモル）の撹拌した溶液に、ＮＭＭ（１７０μ（２，１。

０６当量）およびｉＢｕＯｃＯｃＩ　（１９５μα、１．０３当量）を添加した 。生ずるわずかに濁った溶液を１５分間撹拌し、次いで２−グロビルアミン（１ ５０μｆｆＳ　１．１当量）を添加した。ゼラチン状固体が形成し、次いで反応 混合物を室温に加温した。１６時間後、反応混合物を３０℃において真空蒸発さ せ、そして固体の残留物を１０％のクエン酸、Ｈ，Ｏ，飽和ＮａＨＣＯ，溶液お よびＨ．Ｏで洗浄した。空気乾燥すると、無色のＢＯＣ　ｌ−リペプチドアミド が得られた、２．５８ｇ，５５％。

ＢＯＣト！Ｊペプチドアミド（０．５５ｇ，０．フロミリモル）を４。

４モルのＨＣＩジオキサン（５ｍ１２）中に溶解し、そして４５分間撹拌した。

この溶液を真空蒸発させ、そして固体をＥｔ，Ｏ中で粉砕した。

濾過すると、無色のＨＣＩトリペプチドアミドが得られた、０．５１ｇ。

１００％。

室温においてＤＭＦ（５ｍ４）中のＨＣＩＩ−リペプチドアミド、（ＣＢＺ）ｓ Ａｒｇ　　ｐ−ニトロフェニルエステル（０．５３ｇ，１。

０当量）およびＨＯＢＴ　（０，１２ｇ１１．０当量）の撹拌した溶液に、ＮＭ Ｍ（９２μＱ、１．１当量）を添加した。沈澱は１６時間にわたりゆっくり形成 しｔ；。ゼラチン状混合物を飽和ＮａＨＣＯ，溶液とともに撹拌し、そして濾過 した。固体の残留物をＨ，０１１０％のクエン酸、Ｈ，ＯおよびＥｔ、Ｏで洗浄 した。生ずる保護されたテトラペプチドをＩＨＯＡｃ／ＥｔＯＡｃから再結晶化 すると、無色の固体が得られた、７４３ｍｇ、８３％。

Ｄ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−ＮＨＣＨ（ＣＨ，）。

保護されｔ；テトラペプチド（０，７０ｇ、０．５９ミリモル）を８０％のＨＯ Ａｃ　（５０ｍ（２）中でスラリー化した。この混合物をＮ２でパージし、そし て１０％のＰ　ｔ／Ｃ（０，４ｇ）を供給した。パール製置装置（２５０ｍｆｆ の容器、Ｐ＋−５２，Ｏｐ　ｓ　ｉ）内で６４時間水素化し、０，４５μのナイ ロンフィルターで濾過し、部分的に蒸発および凍結乾燥すると、粗製のテトラペ プチドが得られｆ’、３８５ｍｇ。

粗製のペプチドをＣＭ−セファデックス（２，６Ｘ９３ｃｍのカラム、０．２モ ル、次いで０．３モルのＮＨ４０Ａｃ、非緩衝化；１００ｍ＜１／時間の流速、 ｌｏｍＱ／分画、２２５ｎｍの検出器）で精製した。分画３３５〜３７０をプー ルし、そして凍結乾燥すると、２３１ｍｇが得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇ−１，００、Ｌｙｓ−１，０２、Ａｓｐ−０，９８、Ｖａ ｔ−１，００；８０．３％のペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｐ＋−０，２４（ｎ−Ｂｕ ＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：ＥｔＯＡｃ／ｌ：ｌ：ｌ：ｌ）Ｐ＋　＝　０．５２（ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：ＨｓＯ：ビリジン／１５：３：１２：１０）Ｒ，−０ ，６１（ＥｔＯＡｃ：ＨＯＡｃ：ＨｓＯ：ビリジン１５：ｌ：３：５）実施例１ ２．Ｎ−アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−メチルアミドの合成 Ａｏ　ｃ＃　（Ｔｏ　ｓ）　’Ａｒ　ｇ−Ｐ　ｒ　ｏ−（β−Ｂｚ　ｌ）　Ａｓ 　ｐ−Ｖａ　ＩＮＨｓ（１，５０ｇ５１．７５ミリモル）に、４．５モルのＨＣ Ｉジオキサン（１０ｍＱ）を添加した。４５分後、反応の塊を蒸発させ、Ｎ２０ で希釈し、そして凍結乾燥すると、ＨＣｌテトラペプチドが無色の粉末の固体と して得られた、１．３８ｇ、９９％。

この固体をＤＭＦ　（ｌ　ＯｍＱ）中に溶解し、そしてＤＩＥＡ　（１，４ｍＱ ｓ４当量）　、ＤＭＡＰ　（０，１１ｇ）　、およびＡｃ２０　（１，０ｒｎＱ ）を添加しｔ；。１時間後、反応混合物を１０％のクエン酸で処理した。生ずる 固体を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、そして空気乾燥した。熱Ｅ　ｔＯＡｃで粉砕す ると、保護されたアセチルテトラペプチドが得られた、１．４２ｇ、１００％。

この固体をＨＦ／アニソール（３０ｍ１２／８ｍ４　）で０℃において６０分間 切り放した。残留物をＥｔＯＡｃ中でスラリー化し、そして２回１０　　ＨＯＡ ｃ（５０ｍＱ）で抽出した。水性抽出液を凍結乾燥すると、粗製のＡｃ−Ａｒｇ −Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＶａｌＮＨＣＨ３が得られた。

粗製のペプチドをＤＥＡＥ−セファデックス（２，６Ｘ９０ｃｍのカラム、０． １モルのＮＨ，ＨＣＯ！、非緩衝化；１００ｍ１２７時間の流速、１０ｍＩ２／ 分画、２０６ｎｍの検出器）で精製した。分画３２−４０をプールし、そして凍 結乾燥すると、３４５ｍｇ１３２％が得られた。

アミノ酸分析：Ａｒｇ−０，９８、Ｐｒｏ−０，９７、Ａｓｐ−１，ＱＯｌＶａ ｌ−１，０５；８７．０のペプチド含量。

薄層クロマトグラフィー（２５０μのシリカゲルＧ）Ｒ，−０，７６（ＥｔＯＡ ｃ：ＨＯＡｃ：ＨｚＯ：ピリジン１５：１：３：５）上の実施例は例示を目的と してのみ提供され、そして下の請求の範囲に記載されている、本発明の範囲を限 定しない。

ＴＰ−５蚤準 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＴ細胞系ＣＥＭにおけるｃＧＭＰ活性を増加する能力を有し、そして式 Ｒ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｙ−ＮＲ１Ｒ２式中、 ＲはＨ、低級アルキル、アセチル、ホルミル、または低級アルカノイルであり、 ＸはＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシル−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｉｂま たはＬｙｓであり、 ＹはＧｌｙであるか、あるいはＶａｌ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌ ｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓから選択されるアミノ酸のＤまたはＬ型であり、 Ｒ１はＨであり、そして Ｒ２は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキルまたはアルケニル、４〜８個 の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、アリールまたはＮ ＨＲ３であり、ここでＲ３は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキル、４〜 ８個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、またはアリー ルであるか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって４〜７個の炭素原子のメチ レン鎖を構成する、 のペプチドから成る群より選択されるペプチド。 ２、ＸはＰｒｏまたはＬｙｓであり、そしてＹはＶ、ａ１である、上記第１項記 載のペプチド。 ３、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミドからなる、上記第１ 項記載のペプチド。 ４、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−アニリンアミドからなる、上記第１項記 載のペプチド。 ５、ホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドからなる、上記 第１項記載のペプチド。 ６、アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドからなる、上記 第１項記載のペプチド。 ７、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドである、上記第１項記載の ペプチド。 ８、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドからなる、上記第１項記載 のペプチド。 ９、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−２−フェニルヒドラジドからなる、上記 第１項記載のペプチド。 １０、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ピペリジンアミドからなる、上記第１ 項記載のペプチド。 １１、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−シクロヘキシルアミドからなる、上記 第１項記載のペプチド。 １２、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミドからなる、上記第 １項記載のペプチド。 １３、製剤学的に許容されうる配合物中の上記第１〜１２項のいずれかに記載の ペプチドの少なくとも１種の治療学的に有効量からなる製剤学的組成物。 １４、経口的投与に適当する上記第１３項記載の製剤学的組成物。 １５、被検体に上記第１〜１２項のいずれかに記載のペプチドの少なくとも１種 の治療学的に有効量を投与するからなる、Ｔ細胞機能の欠乏または過剰を被検体 において調節する方法。 １６、ヒトＴ細胞系ＣＥＭにおけるｃＧＭＰ活性を増加する能力を有し、そして 式 Ｒ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｙ−ＮＲ１Ｒ２式中、 ＲはＨ、低級アルキル、アセチル、ホルミル、または低級アルカノイルであり、 ＸはＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシル−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｉｂま たはＬｙｓであり、 ＹはＧｌｙであるか、あるいはＶａｌ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌ ｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓから選択されるアミノ酸のＤまたはＬ型であり、 Ｒ１はＨであり、そして Ｒ２は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキルまたはアルケニル、４〜８個 の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、アリールまたはＮ ＨＲ３であり、ここでＲ３は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキル、４〜 ８個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、またはアリー ルであるか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって４〜７個の炭素原子のメチ レン鎖を構成する、 のペプチドから成る群より選択されるペプチドを調製する方法であって、前記ペ プチドを固相において合成することからなる前記方法。 １７、前記ペプチドにおいてＸはＰｒｏまたはＬｙｓであり、そしてＹはＶａｌ である、上記第１６項記載の方法。 １８、前記ペプチドは、 Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −Ｖａｌ−アニリンアミドホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチル アミドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −Ｖａｌ−メチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−２−フェニルヒドラ ジドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＶａＩ−ビベリジンアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−シクロヘキシルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロ ピルアミドから成る群より選択される、上記第１６項記載の方法。 １９、ヒトＴ細胞系ＣＥＭにおけるｃＧＭＰ活性を増加する能力を有し、そして 式 Ｒ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｙ−ＮＲ１Ｒ２式中、 ＲはＨ、低級アルキル、アセチル、ホルミル、または低級アルカノイルであり、 ＸはＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシル−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｉｂま たはＬｙｓであり、 ＹはＧｉｙであるか、あるし、はＶａｌ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、ＧｌｎまたはＬｙｓから選択されるアミノ酸のＤまたはＬ型であり、 Ｒ１はＨであり、そして Ｒ２は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキルまたはアルケニル、４〜８個 の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、アリールまたはＮ ＨＲ３であり、ここでＲ３は１〜１０個の炭素原子を有する低級アルキル、４〜 ８個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、またはアリー ルであるか、あるいはＲ１およびＲ２は一緒になって４〜７個の炭素原子のメチ レン鎖を構成する、 のべプチＦから成る群より選択されるペプチドを調製する方法であって、前記ペ プチドを溶液中で合成することからなる前記方法。 ２０、前記ペプチドにおいてＸはＰｒｏまたはＬｙｓであり、そしてＹはＶａ１ である、上記第１９項記載の方法。 ２１、前記ペプチドは、 Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロピルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −Ｖａｌ−アニリンアミドホルミル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチル アミドＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−メチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ −Ｖａｌ−メチルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−２−フェニルヒドラ ジドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ピペリジンアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ｖａｌ−シクロヘキシルアミドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−イソプロ ピルアミドから成る群より選択される、上記第１６項記載の方法。 ２２、ヒトの免疫系を調節するための製剤学的組成物の調製における上記第１〜 １２項のいずれかに記載のペプチドの使用。 ２３、ヒトのＴ細胞の機能の欠乏または過剰を調節するための製剤学的組成物の 調製における上記第１〜１２項のいずれかに記載のペプチドの使用。